特許 6581985 ｇｐＡ３３及びＣＤ３に結合二重特異性１価ダイアボディ、並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6581985

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】ｇｐＡ３３及びＣＤ３に結合二重特異性１価ダイアボディ、並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20190912BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190912BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20190912BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20190912BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20190912BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20190912BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20190912BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20190912BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   !C07K19/00

   !C07K16/18

   !C07K16/28

   !C12P21/08

   !C12N15/13

   !C12N15/62 Z

【請求項の数】15

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2016-536401(P2016-536401)

(86)(22)【出願日】2014年8月20日

(65)【公表番号】特表2017-504578(P2017-504578A)

(43)【公表日】2017年2月9日

(86)【国際出願番号】US2014051793

(87)【国際公開番号】WO2015026894

(87)【国際公開日】20150226

【審査請求日】2017年8月18日

(31)【優先権主張番号】13198859.4

(32)【優先日】2013年12月20日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/907,691

(32)【優先日】2013年11月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/869,528

(32)【優先日】2013年8月23日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504438727

【氏名又は名称】マクロジェニクス，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100123858

【弁理士】

【氏名又は名称】磯田 志郎

(72)【発明者】

【氏名】ムーア ポール エー．

(72)【発明者】

【氏名】リー ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】チェン フランシーヌ ジーフェン

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン レスリー エス．

(72)【発明者】

【氏名】シャー カルパナ

(72)【発明者】

【氏名】ボンビニ エツィオ

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１６２０６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１６２０６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０１８６８７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる、二重特異性１価ダイアボディであって、前記二重特異性１価ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されている、ドメイン２と
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されており、かつ前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する、ダイアボディ。

【請求項2】

前記第１のポリペプチド鎖は、アルブミン結合ドメイン（配列番号３４）を含み、前記アルブミン結合ドメインが、前記ドメイン２のＣ末端に配置され、リンカー３（配列番号３２）によって前記ドメイン２から分離されている、請求項１に記載のダイアボディ。

【請求項3】

ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧのＦｃドメインを保有する、二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、前記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、前記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、前記第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されている、ドメイン２と、
ｉｉｉ．ドメイン３であって、システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及びＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、前記ドメイン３及び前記ドメイン２はＧＧＧという配列を有するスペーサペプチド（リンカー５）によって互いから分離されている、ドメイン３と
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されており、かつ前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
Ｃ．第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン３を含み、ドメイン３は、
（１）システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及び
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、
かつ、
（ａ）前記第１及び第３のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインの前記ポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し、
（ｂ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｃ）前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する、ダイアボディ。

【請求項4】

ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧのＦｃドメインを保有する、二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、前記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、前記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、前記第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン３であって、システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及びＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含む、ドメイン３と
ｉｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されており、前記ドメイン１及び前記ドメイン３はスペーサペプチド（リンカー４）（配列番号３８）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されている、ドメイン２と、
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、前記サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、また前記ドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によって前記ドメイン１から分離されており、かつ前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
Ｃ．第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン３を含み、ドメイン３は、
（１）システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及び
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、
かつ、
（ａ）前記第１及び第３のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインの前記ポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し、
（ｂ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｃ）前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメイン及び前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する、ダイアボディ。

【請求項5】

前記第１のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）が、前記第３のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）の配列とは異なる配列を含む、請求項３又は４に記載のダイアボディ。

【請求項6】

前記第１のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）が配列番号４０のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）が配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のダイアボディ。

【請求項7】

前記第１のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）が配列番号４１のアミノ酸配列を有し、前記第３のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（３Ｂ）が配列番号４０のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のダイアボディ。

【請求項8】

前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン３及び／又は前記第３のポリペプチド鎖の前記ドメイン３が、Ｆｃγ受容体に対する結合の変化を示す改変体ＣＨ２−ＣＨ３の配列を含む、請求項３又は４に記載のダイアボディ。

【請求項9】

前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２がＥコイルドメイン（配列番号３）を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２がＫコイルドメイン（配列番号４）を含む、請求項１乃至８の何れか１項に記載のダイアボディ。

【請求項10】

前記第１のポリペプチド鎖の前記ドメイン２がＫコイルドメイン（配列番号４）を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記ドメイン２がＥコイルドメイン（配列番号３）を含む、請求項１乃至８の何れか１項に記載のダイアボディ。

【請求項11】

ＣＤ３のエピトープ及びｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性１価ダイアボディに関し、前記二重特異性１価ダイアボディは、
（１）配列番号２８のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、又は
（２）配列番号３５のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、前記第１及び第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する、ダイアボディ。

【請求項12】

ＣＤ３のエピトープ及びｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、前記二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、
（１）配列番号４２のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、配列番号４４のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチド鎖、又は
（２）配列番号４８のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、配列番号２８のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチド鎖
を含み、前記第１及び第２のポリペプチド鎖は、第１のジスルフィド結合によって互いに共有結合し、前記第１及び第３のポリペプチド鎖は、第２のジスルフィド結合によって互いに共有結合する、ダイアボディ。

【請求項13】

請求項１乃至１２の何れか１項に記載のダイアボディ及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。

【請求項14】

ｇｐＡ３３の発現を特徴とする癌を治療するための薬剤の製造における、請求項１乃至１２の何れか１項に記載のダイアボディ又は請求項１３に記載の医薬組成物の使用。

【請求項15】

前記癌は、大腸癌、結腸癌、胃癌又は膵臓癌である、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６１／８６９，５２８号（２０１３年８月２３日出願；係属中）、米国特許出願第６１／９０７，６９１号（２０１３年１１月２２日出願；係属中）、並びに欧州特許出願第１３１９８８５９号（２０１３年１２月２０日出願）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。

【0002】

［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、書類及びコンピュータ可読媒体の両方において開示されており、上記書類及びコンピュータ可読型開示は、参照によりその全体が本出願に援用される。

【0003】

本発明は、２本のポリペプチド鎖を含み、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的な１つの結合部位とＣＤ３のエピトープに特異的な１つの結合部位を保有する二重特異性１価ダイアボディ（すなわち、「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。また、本発明は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む二重特異性の一価のダイアボディ（「二重特異性の一価のＦｃダイアボディ」）であって、３つのポリペプチド鎖から構成され、かつｇｐＡ３３のエピトープに特異的な１つの結合部位とＣＤ３のエピトープに特異的な１つの結合部位を保有するダイアボディ（すなわち、「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）も対象とする。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価ＦｃダイアボディはｇｐＡ３３及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、上記二重特異性一価ダイアボディまたは上記二重特異性一価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明はさらに、癌及び他の疾患及び状態の治療における上記二重特異性抗体を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

Ｉ．ｇｐＡ３３
結腸直腸癌は、西欧諸国の最も一般的な悪性腫瘍であり、癌による死亡の主な原因である（非特許文献１）。大腸癌に対する潜在的に有用なターゲットは、４３ｋＤの膜貫通糖タンパク質Ａ３３である（ｇｐＡ３３）（非特許文献２、３）。ｇｐＡ３３は、最初のヒト膵臓癌由来細胞株ＡＳＰＣ１に対するモノクローナルマウス抗体の培養を通じて発見された。ある抗体（ＭＡｂ Ａ３３）は、４３ｋＤａの表面細胞タンパク質と反応することが発見されたため、「ｇｐＡ３３」と命名された（非特許文献４）。

【0005】

ｇｐＡ３３は、接合部接着分子ファミリーの膜貫通タンパク質である（非特許文献５〜７）。Ａ３３抗原の機能的意義はまだ解明されていないが、大腸炎の動物モデルにおいて結腸粘膜修復を媒介することが示されており、全大腸癌の＞９５％で均一に発現される。Ａ３３発現は、病期及び組織学的分化度の両方にわたって不変であり、この抗原は、血流に検出可能に分泌または流れていない（非特許文献７、８）。逆に、非胃腸Ａ３３抗原発現のわずか数例が同定されている（非特許文献９）。

【0006】

Ａ３３抗原の非常に限定された発現を踏まえ、研究者らは、抗体を用いたＡ３３関連癌の治療の可能性を探求してきた（非特許文献８、１０〜１９）。同様に、このような抗体のフラグメントも、それらの潜在的な治療的役割のために評価されてきた（非特許文献２０）。

【0007】

ＩＩ．ＣＤ３
ＣＤ３は、４つの別個の鎖で構成されたＴ細胞補助受容体である（非特許文献２１、２２）。

【0008】

哺乳類において、このＣＤ３複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知である分子と連動して、Ｔリンパ球の活性化信号を生成する。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（非特許文献２３）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しないことが知られている（非特許文献２４、２５、２６）。

【0009】

ＩＩＩ．二重特異性ダイアボディ
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬ及びＶＨドメイン）の存在に左右される。ダイアボディの設計は、単鎖Ｆｖ構造（ｓｃＦｖ）に基づく（例えば非特許文献２７、特許文献１、２、非特許文献２８、２９、特許文献３、非特許文献３０〜３４参照）。

【0010】

抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。対照的に、ｓｃＦｖ構造は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、２価分子を形成し、この２価分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと関連する（非特許文献３５において概説されている）。

【0011】

天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち単一特異性）が、これらはその種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を呈する）。本技術分野は、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えば非特許文献２７、特許文献１、２、非特許文献２８、２９、特許文献３、非特許文献３６、非特許文献３１〜３４参照）。

【0012】

非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（co‐ligate）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って二価のダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原に対するアビディティーの上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献３７）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献３８、非特許文献３９）。

【0013】

ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４等のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基も指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（非特許文献３９、４０、特許文献４〜８）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従って、これに関して、本発明のダイアボディ分子は、（例えば、当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えば非特許文献４１参照）。

【0014】

しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチドを提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（非特許文献３３）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような（即ちホモ二量体形成を防止するような）方法で達成しなければならない（非特許文献３３）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的関連を教示している（例えば非特許文献３０、３２、３３、２９参照）。

【0015】

しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に関連したポリペプチドで構成される二重特異性１価ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えば非特許文献２９参照）。

【0016】

この課題に直面して、本技術分野は、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば特許文献４〜８、非特許文献４２〜４４、特許文献９、１０参照）。このようなアプローチは、１つ又は複数のシステイン残基を、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。

【0017】

ダイアボディ及び他の免疫グロブリンにおいて、ｇｐＡ３３及びＣＤ３のいずれかまたは両方に対する特異性を有すると称する報告がある（例えば特許文献１１〜２０参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００４／００５８４００号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００４／０２２０３８８号明細書

【特許文献3】国際公開第０２／０２７８１号

【特許文献4】国際公開第２００６／１１３６６５号

【特許文献5】国際公開第２００８／１５７３７９号

【特許文献6】国際公開第２０１０／０８０５３８号

【特許文献7】国際公開第２０１２／０１８６８７号

【特許文献8】国際公開第２０１２／１６２０６８号

【特許文献9】米国特許出願公開第２０１２／０２９４７９６号明細書

【特許文献10】米国特許出願公開第２０１３／０１４９２３６号明細書

【特許文献11】米国特許出願公開第２０１２／００１４９５７号明細書

【特許文献12】米国特許出願公開第２０１２／００３４１６０号明細書

【特許文献13】米国特許出願公開第２０１２／００８７８５８号明細書

【特許文献14】米国特許出願公開第２０１２／０１８９５４１号明細書

【特許文献15】米国特許出願公開第２０１２／０１９５９００号明細書

【特許文献16】米国特許出願公開第２０１２／０２０１７４６号明細書

【特許文献17】米国特許出願公開第２０１２／０２３７４４２号明細書

【特許文献18】米国特許出願公開第２０１２／０２６３７２２号明細書

【特許文献19】米国特許出願公開第２０１２／０２５８１０８号明細書

【特許文献20】米国特許出願公開第２０１２／０２７６６０８号明細書

【非特許文献】

【0019】

【非特許文献1】Silverberg, E. et al. (1989) “Cancer Statistics, 1989,” CA Cancer J Clin. 39(1):3-20)

【非特許文献2】Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474

【非特許文献3】Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686

【非特許文献4】Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263

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【非特許文献10】Ackerman, M.E. et al. (2008) “A33 Antigen Displays Persistent Surface Expression,” Cancer Immunol. Immunother. 57(7):1017-1027

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【非特許文献12】Carrasquillo, J.A. et al. (2011) “(124)I-huA33 Antibody PET Of Colorectal Cancer,” J. Nucl. Med. 52(8):1173-1180

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【非特許文献14】Deckert, P.M. et al. (2000) “Pharmacokinetics And Microdistribution Of Polyethylene Glycol-Modified Humanized A33 Antibody Targeting Colon Cancer Xenografts,” Int. J. Cancer. 87(3):382-390

【非特許文献15】Johnston, A.P. et al. (2012) “Targeting Cancer Cells: Controlling The Binding And Internalization Of Antibody-Functionalized Capsules” ACS Nano. 6(8):6667-6674

【非特許文献16】Koppe, M.J. et al. (2005) “Radioimmunotherapy And Colorectal Cancer,” Br. J. Surg. Mar:92(3):264-276

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【非特許文献18】Scott, A.M. et al. (2005) “A Phase I Trial Of Humanized Monoclonal Antibody A33 In Patients With Colorectal Carcinoma: Biodistribution, Pharmacokinetics, And Quantitative Tumor Uptake,” Clin. Cancer Res. 11(13):4810-4817

【非特許文献19】Tschmelitsch, J. et al. (1997) “Enhanced Antitumor Activity Of Combination Radioimmunotherapy (131I-Labeled Monoclonal Antibody A33) With Chemotherapy (Fluorouracil),”Cancer Res. 57(11):2181-2186

【非特許文献20】Coelho, V. et al. (2007) “Design, Construction, And In Vitro Analysis Of A33scFv::CDy, A Recombinant Fusion Protein For Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy In Colon Cancer,” Int. J. Oncol. 31(4):951-957

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【非特許文献22】Chetty, R. et al. (1994) “CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice,” J. Pathol. 173:303-307

【非特許文献23】Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177

【非特許文献24】Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216

【非特許文献25】Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913-923

【非特許文献26】Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139

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【非特許文献28】Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94

【非特許文献29】Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672

【非特許文献30】Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des Sel. 17(1):21-27

【非特許文献31】Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033

【非特許文献32】Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992

【非特許文献33】Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588

【非特許文献34】Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944).

【非特許文献35】Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658

【非特許文献36】Mertens, N. et al., “New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives,” In: Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use, A. VanBroekhoven et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), pages 195-208;

【非特許文献37】Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221

【非特許文献38】Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631

【非特許文献39】Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305

【非特許文献40】Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916

【非特許文献41】Cao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197

【非特許文献42】Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449;

【非特許文献43】Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943;

【非特許文献44】Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551;

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

このような成功にもかかわらず、安定した機能性ヘテロ二量体の非単一特異性ダイアボディは、採用したポリペプチド鎖のドメインに関する注意深い考察及びその配置によって、更に改善できる。従って本発明は、ｇｐＡ３３及びＣＤ３と同時に結合できる、共有結合を介したヘテロ二量体ダイアボディ及びヘテロ二量体Ｆｃダイアボディを形成するために特別に設計された特異的ポリペプチドの提供に関する。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明は、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディに関する。特定の実施形態では、本発明のダイアボディは更に、免疫グロブリンＦｃドメイン（すなわち「Ｆｃドメイン」）を有するダイアボディ（「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）又はアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を有するダイアボディ（「ＡＢＤ含ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）であり、これによりインビボでの半減期が延長される。本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及び本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、２つの異なるポリペプチド鎖を含み、これらはヘテロ二量体として互いに関連して、ｇｐＡ３３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する。従って、本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及び本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ｇｐＡ３３のエピトープの１つのみの複製及びＣＤ３のエピトープの１つのみの複製に結合できるという点で１価であるが、単一のダイアボディがｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに対して同時に結合できるという点で二重特異性である。

【0022】

本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖（「第１」及び「第２」のポリペプチド鎖）からなり、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖（「第１」、「第２」及び「第３」のポリペプチド鎖）からなり、第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合する。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ｇｐＡ３３及びＣＤ３と同時に結合できる。本発明は、上記ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び上記ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、癌及び他の疾患及び状態の治療における上記ダイアボディを使用する方法に関する。

【0023】

詳細には、本発明は、ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる、二重特異性１価ダイアボディを提供し、この二重特異性１価ダイアボディは、互いに共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されている、ドメイン２と
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されており、かつ第１のポリペプチド鎖のドメイン２及び第２のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
（ａ）第１のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｂ）第２のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。

【0024】

本発明は更に、上述の二重特異性１価ダイアボディの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖が更に、リンカー３（配列番号３２）を介して、Ｃ末端においてドメイン２に、又はＮ末端においてドメイン１に連結した、アルブミン結合ドメイン（配列番号３４）を含む。

【0025】

さらに、本発明は、ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧのＦｃドメインを保有する、二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、この二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されている、ドメイン２と、
ｉｉｉ．ドメイン３であって、システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及びＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、ドメイン３及びドメイン２はスペーサペプチド（リンカー５）（ＧＧＧ）によって互いから分離されている、ドメイン３と
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されており、かつ第１のポリペプチド鎖のドメイン２及び第２のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
Ｃ．第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン３を含み、ドメイン３は、
（１）システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及び
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、
かつ、
（ａ）第１及び第３のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し、
（ｂ）第１のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｃ）第２のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。

【0026】

さらに、本発明は、ｇｐＡ３３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに特異的に結合でき、ＩｇＧのＦｃドメインを保有する、二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、この二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、
Ａ．第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン３であって、システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及びＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含む、ドメイン３と
ｉｉ．ドメイン１であって、ｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されており、ドメイン１及びドメイン３はスペーサペプチド（リンカー４）（配列番号３８）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＥコイルドメイン（配列番号３）又はＫコイルドメイン（配列番号４）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されている、ドメイン２と、
を含み、
Ｂ．第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
ｉ．ドメイン１であって、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）を含むサブドメイン（１Ａ）、及びｇｐＡ３３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）を含むサブドメイン（１Ｂ）を含み、サブドメイン（１Ａ）及び（１Ｂ）はペプチドリンカー（配列番号１）によって互いから分離されている、ドメイン１と、
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２はＫコイルドメイン（配列番号４）又はＥコイルドメイン（配列番号３）であり、またドメイン２はペプチドリンカー（配列番号２）によってドメイン１から分離されており、かつ第１のポリペプチド鎖のドメイン２及び第２のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方がＥコイルドメインではなく、又は両方がＫコイルドメインではない、ドメイン２と
を含み、
Ｃ．第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン３を含み、ドメイン３は、
（１）システイン含有ペプチド（ペプチド１）（配列番号３９）を含むサブドメイン（３Ａ）、及び
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する、ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（３Ｂ）を含み、
かつ、
（ａ）第１及び第３のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し、
（ｂ）第１のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、
（ｃ）第２のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及び第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。

【0027】

本発明は更に、上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディのいずれかの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）が、第３のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）の配列とは異なる配列を含む。

【0028】

本発明は更に、上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）が配列番号４０のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）が配列番号４１のアミノ酸配列を有する。

【0029】

本発明は更に、上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）が配列番号４１のアミノ酸配列を有し、第３のポリペプチド鎖のサブドメイン（３Ｂ）が配列番号４０のアミノ酸配列を有する。

【0030】

本発明は更に、上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のドメイン３及び／又は第３のポリペプチド鎖のドメイン３が、Ｆｃγ受容体に対する結合の変化を示す改変体ＣＨ２−ＣＨ３の配列を含む。

【0031】

本発明は更に、上述した二重特異性１価ダイアボディのいずれか又は上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディのいずれかの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のドメイン２がＥコイルドメイン（配列番号３）を含み、第２のポリペプチド鎖のドメイン２がＫコイルドメイン（配列番号４）を含む。

【0032】

本発明は更に、上述した二重特異性１価ダイアボディのいずれか又は上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディのいずれかの実施形態に関し、第１のポリペプチド鎖のドメイン２がＫコイルドメイン（配列番号４）を含み、第２のポリペプチド鎖のドメイン２がＥコイルドメイン（配列番号３）を含む。

【0033】

本発明は更に、ＣＤ３のエピトープ及びｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性１価ダイアボディに関し、この二重特異性１価ダイアボディは、
（１）配列番号２８のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、又は
（２）配列番号３５のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合する。

【0034】

本発明は更に、ＣＤ３のエピトープ及びｇｐＡ３３のエピトープに特異的に結合できる二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関し、この二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、
（１）配列番号４２のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、配列番号４４のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、又は
（２）配列番号４８のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖、配列番号２８のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は、第１のジスルフィド結合によって互いに共有結合し、第１及び第３のポリペプチド鎖は、第２のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。

【0035】

本発明は更に、上述した二重特異性１価ダイアボディのいずれか又は上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディのいずれか、及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物に関する。

【0036】

本発明は更に、ｇｐＡ３３の発現を特徴とする癌の治療における、上述の医薬組成物の使用に関し、特に、大腸癌、結腸癌、胃癌又は膵臓癌の治療における使用に関する。

【0037】

本発明は更に、上述した二重特異性１価ダイアボディのいずれか又は上述した二重特異性１価Ｆｃダイアボディのいずれかのポリペプチド鎖を発現する細胞に関し、同様に、そのような発現したポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドに関する。

【0038】

本発明は更に、抗体又はポリペプチド部分又はそのフラグメントを発現する細胞に関し、抗体はｇｐＡ３３と結合し、抗体又はポリペプチド部分又はそのフラグメントは、
（１）抗ヒトｇｐＡ３３抗体の軽鎖のＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号１５）及びＣＤＲ３（配列番号１６）、
（２）抗ヒトｇｐＡ３３抗体の重鎖のＣＤＲ１（配列番号１８）、ＣＤＲ２（配列番号１９）及びＣＤＲ３（配列番号２０）、又は
（３）（１）及び（２）の両方
を含む。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１は、本発明の２鎖ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖の構造を示す。

【図2】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の３鎖ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の各バージョンの構造を示す（バージョン１が図２Ａ、バージョン２が図２Ｂ）。

【図3】図３は、本発明のダイアボディがＣＤ３及びｇｐＡ３３に同時に結合できることを示す。

【図4】図４は、本発明のダイアボディの癌を治療する能力を示す。大腸癌又は膵臓癌細胞をｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝２５：１）又は活性化したヒトＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）のいずれかの存在下でインキュベートし、細胞毒性を測定した（図４Ａ（結腸ＣＳＣＬ大腸細胞）、図４Ｂ（Ｃｏｌｏ２０５大腸細胞）、及び図４Ｃ（ＡＳＰＣ−１膵臓癌細胞））。

【図5】図５Ａ〜５Ｆは、癌細胞の存在下におけるＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）の存在によって発生したＣＤ８Ｔ細胞の活性を示す。図５Ａ〜Ｃ：ＣＤ８Ｔ細胞＋ｃｏｌｏ２０５細胞（図５Ａ）、ＣＤ８Ｔ細胞＋ＡＳＰＣ−１細胞（図５Ｂ）、ＣＤ８Ｔ細胞単独（図５Ｃ）、図５Ｄ〜Ｆ：ＣＤ４Ｔ細胞＋ｃｏｌｏ２０５細胞（図５Ｄ）、ＣＤ４Ｔ細胞＋ＡＳＰＣ−１細胞（図５Ｅ）、ＣＤ４Ｔ細胞単独（図５Ｆ）。

【図6】図６Ａ〜６Ｄは、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１およびＤＡＲＴ−２）が、ＳＷ９４８結腸直腸腺癌細胞（図６Ａ）、ｃｏｌｏ２０５細胞（図６Ｂ）、Ｃｏｌｏ２０５−Ｌｕｃ細胞（図６Ｃ）について同等の細胞毒性を媒介したこと、及びｇｐＡ３３陰性癌細胞株ＨＣＴ１１６（図６Ｄ）について、いずれのダイアボディも細胞毒性を媒介しなかったことを実証する。

【図7】図７Ａ〜Ｄは、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２）、アルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＡＢＤ含ＤＡＲＴ−２、「ｗ／ＡＢＤ」）及び免疫グロブリンＦｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（Ｆｃ含ＤＡＲＴ−２、「ｗ／Ｆｃ」）がヒト又はカニクイザルＰＢＭＣの存在下における癌細胞の細胞毒性を促進する能力を実証する。

【図8】図８は、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）のマウスのｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルにおける腫瘍体積を減少するインビボ能力を実証する。

【図9】図９Ａ〜Ｄは、Ｃｏｌｏ２０５細胞を埋入したＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスのビヒクルを受容した後２日目（図９Ａ）、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）を受容した後２日目（図９Ｂ）、ビヒクルを受容した後１２日目（図９Ｃ）、ＤＡＲＴ−１を受容した後１２日目（図９Ｂ）の腫瘍画像データを示す。

【図10】図１０は、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）のマウスのＡＳＰＣ−１膵臓癌モデルにおける腫瘍体積を減少するインビボ能力を実証する。。

【図11】図１１は、免疫グロブリンＦｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）のインビボ結腸癌モデルにおける劇的な減少を媒介する能力を示す。

【図12】図１２は、免疫グロブリンＦｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）の極微量の用量でインビボ結腸癌モデルにおける減少を媒介する能力を示す。

【図13】図１３は、カニクイザルにおけるｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２）、及び免疫グロブリンＦｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）の薬物動態を示す。

【図14】図１４Ａ〜１４Ｂは、固定化されたヒト及びカニクイザルＣＤ３へのＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の結合のＳＰＲ分析を示す。黒破線は、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭにおいて得られた、結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。

【図15】図１５Ａ〜１５Ｂは、捕捉されたヒト及びカニクイザルｇｐＡ３３へのＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の結合のＳＰＲ分析を示す。黒破線は、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃｃバージョン１の濃度０、６．２５、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭにおいて得られた、結合曲線の１：１ラングミュアモデルに対するグローバルフィットを表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本発明は、２つのポリペプチド鎖を含み、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに特異的な１つの結合部位を保有する二重特異性１価ダイアボディ（すなわち、「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）に関する。また、本発明は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む二重特異性１価ダイアボディ（「二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）であって、３つのポリペプチド鎖からなり、ｇｐＡ３３のエピトープに特異的な１つの結合部位及びＣＤ３のエピトープに特異的な１つの結合部位を保有する二重特異性１価ダイアボディ（すなわち、「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）に関する。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価ＦｃダイアボディはｇｐＡ３３及びＣＤ３と同時に結合できる。本発明は、上記二重特異性一価ダイアボディまたは上記二重特異性一価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明はさらに、癌及び他の疾患及び状態の治療における上記二重特異性抗体を使用する方法に関する。

【0041】

本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖からなり、これらは互いに関連して、ｇｐＡ３３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する。このダイアボディの個々のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。各ポリペプチド鎖は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体化ドメインを含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから分離する。第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちｇｐＡ３３又はＣＤ３）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてｇｐＡ３３又はＣＤ３）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ｇｐＡ３３及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。

【0042】

本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖からなる。第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに関連して、ｇｐＡ３３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する。第１のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は互いに関連して、免疫グロブリンＦｃドメインを形成する。二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。第１及び第３のポリペプチド鎖は、例えば各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。第１及び第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体化ドメインを含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから分離する。第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちｇｐＡ３３又はＣＤ３）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ３又はｇｐＡ３３）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ｇｐＡ３３及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、システイン含有ペプチド（ペプチド１）配列番号３９、及び完全な免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体、並びにシステイン含有ペプチドを含有する。ＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体は、関連して、本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディの免疫グロブリンＦｃドメインを形成する。本発明の二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、例えばポリペプチド鎖のシステイン含有ペプチド内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって互いに共有結合する。

【0043】

二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体化ドメインによって開始させることができる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖上にＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号５４）（又はＶＥＰＫＳＣ；配列番号５５）、及び他方のポリペプチド鎖上にＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号５６）（又はＦＮＲＧＥＣ；配列番号５７）を含む（米国特許第２００７／０００４９０９号）。あるいはこのようなドメインは、反対の電荷のコイルを含有するように加工できる。ポリペプチド鎖のうちの一方のヘテロ二量体化ドメインは、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも８個の正荷電アミノ酸の配列を含み、他方のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化ドメインは、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも８個の負荷電アミノ酸の配列を含む。例えば第１又は第２のヘテロ二量体化ドメインは好ましくは、８個の正荷電アミノ酸の配列を含んでもよく、他方のヘテロ二量体化ドメインは好ましくは、８個の負荷電アミノ酸の配列を含んでもよい。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。

【0044】

本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、上述のような第１及び第２のポリペプチド鎖が、その長さに沿ってシステイン残基を介して互いに共有結合するように、加工される。このようなシステイン残基は、ポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインを分離する介在リンカーに導入してよい。あるいは更に好ましくは、第２のペプチド（リンカー２）を各ポリペプチド鎖に、例えばポリペプチド鎖のアミノ末端に、又はヘテロ二量体化ドメインと軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインとの間の位置に導入する。

【0045】

上述したとおり、ｇｐＡ３３は大腸細胞において発現される。ｇｐＡ３３に免疫特異的に結合できる抗体は、そのような細胞に結合できる。ＣＤ３はＴ細胞上に発現される。従って、ｇｐＡ３３及びＣＤ３の両方に免疫特異的に結合できる抗体は、Ｔ細胞を大腸癌及び他のｇｐＡ３３が発現する癌細胞（例えば、結腸癌細胞、膵臓癌細胞等）にターゲッティングさせることができ、それ故に、それらの癌について改善した療法を提供できる。

【0046】

Ｉ．好ましい本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ
Ａ．ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ
本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの一実施形態は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖からなり、そられの配列は、ｇｐＡ３３及びＣＤ３の両方と同時に結合できる共有結合性複合体を形成するために互いに共有結合することが可能である。

【0047】

好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３又はｇｐＡ３３のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬ_CD3又はＶＬ_gpA33のいずれか）、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）、ｇｐＡ３３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_CD3を含む場合）又はＣＤ３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_gpA33を含む場合）のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進性ドメイン及びＣ末端を含む（図１）。

【0048】

好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３又はｇｐＡ３３のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖について選択されたＶＬドメインにより決まるＶＬ_gpA33又はＶＬ_CD3のいずれか）、介在スペーサペプチド（リンカー１）、ＣＤ３（当該第２のポリペプチド鎖がＶＬ_gpA33を含む場合）又はｇｐＡ３３（当該第２のポリペプチド鎖がＶＬ_CD3を含む場合）のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進性ドメイン及びＣ末端を含む（図１）。

【0049】

好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原に特異的である第１の機能的な抗原結合部位（すなわち、ＣＤ３又はｇｐＡ３３のいずれか）を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原に特異的である第２の機能的な抗原結合部位（すなわち、第１の抗原が特定されることにより決まるｇｐＡ３３又はＣＤ３のいずれか）を形成する。従って、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインの選択は、好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が共同でｇｐＡ３３及びＣＤ３に結合し得るＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むように調整される（すなわち、それらは、ＶＬ_CD3／ＶＨ_CD3およびＶＬ_gpA33／ＶＨ_gpA33を含む）。

【0050】

最も好ましくは、介在するリンカーペプチド（ＶＬドメインおよびＶＨドメインを隔てるリンカー１）の長さは、ポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインが互いに結合することを実質的にまたは完全に妨げるように選択される。従って、第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、お互いに対して実質的にまたは完全に結合できない。同様に第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、お互いに対して実質的にまたは完全に結合できない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）はGGGSGGGGという配列（配列番号１）を有する。

【0051】

システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１、２、３またはそれ以上のシステイン残基を含む。好ましいシステイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２）は配列番号２：GGCGGGの配列を有する。

【0052】

互いに異なる第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドのヘテロ二量体促進性ドメインは、お互いと会合するように設計され、それによって、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖の会合を促進する。従って、好ましい実施形態では、これらのポリペプチド鎖のうちの１つは、残基がｐＨ７では負の荷電を形成するヘテロ二量体促進性「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）：
EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
を含むように設計され、２つのポリペプチド鎖のうちの他方は、残基がｐＨ７では正の荷電を形成するヘテロ二量体促進性「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）：
KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
を含むように設計される。このような荷電されたドメインの存在は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の会合を促進し、これによってヘテロ二量体化が助長される。第一および第二のポリペプチド鎖で使用されるコイルが異なっており、これによってこれらのポリペプチド鎖の間のヘテロ二量体化が助長される限りは、どちらのコイルがどちらの鎖に提供されるかは重要ではない。

【0053】

１．ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ「ＤＡＲＴ−１」
「ＤＡＲＴ−１」と称する、好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、以下の配列を有するポリペプチドドメインを含む。

【0054】

ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG

【0055】

ＶＬ_CD3の抗原結合ドメインは、RSSTGAVTTSNYANという配列（配列番号６）を有するＣＤＲ１、GTNKRAPという配列（配列番号７）を有するＣＤＲ２、及びALWYSNLWVという配列（配列番号８）を有するＣＤＲ３を含む。

【0056】

ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号９）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY
NNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS
WFAYWGQGTLVTVSS

【0057】

ＶＨ_CD3の抗原結合ドメインは、TYAMNという配列（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、RIRSKYNNYATYYADSVKDという配列（配列番号１１）を有するＣＤＲ２、及びHGNFGNSYVSWFAYという配列（配列番号１２）を有するＣＤＲ３を含む。

【0058】

ｇｐＡ３３に結合するマウス抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号１３）：
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLAS
GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELK

【0059】

ＶＬ_gpA33の抗原結合ドメインは、SARSSISFMYという配列（配列番号１４）を有するＣＤＲ１、DTSNLASという配列（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、及びQQWSSYPLTという配列（配列番号１６）を有するＣＤＲ３を含む。

【0060】

ｇｐＡ３３に結合するマウス抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号１７）：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGD
GETNYNGKFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGNNVYFDVWG
AGTTVTVSS

【0061】

ＶＨ_gpA33の抗原結合ドメインは、GSWMNという配列（配列番号１８）を有するＣＤＲ１、RIYPGDGETNYNGKFKDという配列（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、及びIYGNNVYFDVという配列（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含む。

【0062】

第１の介在スペーサペプチド(リンカー１)はGGGSGGGGという配列（配列番号１）を有する。システイン含有スペーサペプチド(リンカー２)はGGCGGGという配列（配列番号２）を有する。

【0063】

第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進性ドメインは「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）である。第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進性ドメインは「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0064】

従って、ＤＡＲＴ−１の第１のポリペプチド鎖は次の配列（配列番号２１）を有する。
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGN
NVYFDVWGAGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

【0065】

上記の内容からわかるように、配列番号２１の残基１〜１１０は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）であり、配列番号２１の残基１１１〜１１８は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号２１の残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３に結合するマウス抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号１７）であり、配列番号２１の残基２３８〜２４３は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、及び配列番号２１の残基２４４〜２７１は、ヘテロ二量体促進性「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）である。

【0066】

ＤＡＲＴ−１の第１のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号２２）を有する。
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga
ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg
ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa
agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg
ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct
gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga
ggtggtggatccggcggaggtggacaggtccagctgcagcagtctggacctgagc
tggtgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaagcttcaggctacacatt
cagtggctcttggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtgg
attggacggatctaccctggagatggagaaactaactacaatgggaagtttaagg
acaaggccacactgactgcagacaaatcatccaccacagcctacatggagctcag
cagcctgacctctgtggactctgcggtctatttctgtgcaagaatctatggtaat
aacgtttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtgtcttccggag
gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa
ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

【0067】

ＤＡＲＴ−１の第２のポリペプチド鎖は次の配列（配列番号２３）を有する。
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLAS
GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELKRGGG
SGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVAR
IRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFG
NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

【0068】

上記の内容からわかるように、配列番号２３の残基１〜１０７は、ｇｐＡ３３に結合するマウス抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号１３）であり、配列番号２３の残基１０８〜１１５は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号２３の残基１１６〜２４０は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号９）であり、配列番号２３の残基２４１〜２４６は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、及び配列番号２３の残基２４７〜２７４は、ヘテロ二量体促進性「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0069】

ＤＡＲＴ−１の第２のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号２２）を有する。
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaggg
tcaccatgacctgcagtgccaggtcaagtataagtttcatgtactggtaccagca
gaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttct
ggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaa
tcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtag
ttacccactcacgttcggttctgggaccaagctggagctgaaacggggtggagga
tccggcggaggcggagaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagc
ctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcaacacata
cgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttgcaagg
atcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggata
gattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacag
cctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggc
aattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgt
cttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgc
tttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

【0070】

２．ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ「ＤＡＲＴ−２」
「ＤＡＲＴ−２」と称する、第２の好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、以下の配列を有するポリペプドドメインを含む。

【0071】

ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG

【0072】

ＶＬ_CD3の抗原結合ドメインは、RSSTGAVTTSNYANという配列（配列番号６）を有するＣＤＲ１、GTNKRAPという配列（配列番号７）を有するＣＤＲ２、及びALWYSNLWVという配列（配列番号８）を有するＣＤＲ３を含む。

【0073】

ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKY
NNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVS
WFAYWGQGTLVTVSS

【0074】

ＶＨ_CD3の抗原結合ドメインは、TYAMNという配列（配列番号１０）を有するＣＤＲ１、RIRSKYNNYATYYADSVKDという配列（配列番号１１）を有するＣＤＲ２、及びHGNFGNSYVSWFAYという配列（配列番号１２）を有するＣＤＲ３を含む。

【0075】

上述したヒトｇｐＡ３３に結合するマウス抗体は、好ましいダイアボディＤＡＲＴ−２のＶＬおよびＶＨドメインを提供するためにヒト化される。これらのヒト化ドメインは次のとおりである。

【0076】

ｇｐＡ３３に結合するヒト化抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK

【0077】

ＶＬ_gpA33の抗原結合ドメインは、SARSSISFMYという配列（配列番号１４）を有するＣＤＲ１、DTSNLASという配列（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、及びQQWSSYPLTという配列（配列番号１６）を有するＣＤＲ３を含む。

【0078】

ｇｐＡ３３に結合するヒト化抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGD
GETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWG
QGTTVTVSS

【0079】

ＶＨ_gpA33の抗原結合ドメインは、GSWMNという配列（配列番号１８）を有するＣＤＲ１、RIYPGDGETNYNGKFKDという配列（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、及びIYGNNVYFDVという配列（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含む。

【0080】

第１の介在スペーサペプチド(リンカー１)はGGGSGGGGという配列（配列番号１）を有する。システイン含有スペーサペプチド(リンカー２)はGGCGGGという配列（配列番号２）を有する。

【0081】

第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進性ドメインは「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）である。第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進性ドメインは「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0082】

従って、ＤＡＲＴ−２の第１のポリペプチド鎖は次の配列（配列番号２８）を有する。
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

【0083】

上記の内容からわかるように、配列番号２８の残基１〜１１０は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）であり、配列番号２８の残基１１１〜１１８は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号２８の残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）であり、配列番号２８の残基２３８〜２４３は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、及び配列番号２８の残基２４４〜２７１は、ヘテロ二量体促進性「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）である。

【0084】

ＤＡＲＴ−２の第１のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号２９）を有する。
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga
ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg
ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa
agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg
ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct
gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga
ggtggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag
tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt
tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg
atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag
accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag
ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac
aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag
gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa
ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

【0085】

ＤＡＲＴ−２の第２のポリペプチド鎖は次の配列（配列番号３０）を有する。
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGS
GGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRI
RSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGN
SYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

【0086】

上記の内容からわかるように、配列番号３０の残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）であり、配列番号３０の残基１０７〜１１４は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号３０の残基１１５〜２３９は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）であり、配列番号３０の残基２４０〜２４５は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、及び配列番号３０の残基２４６〜２７３は、ヘテロ二量体促進性「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0087】

ＤＡＲＴ−２の第２のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号３１）を有する。
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgag
tgactattacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagca
gaagcccggcaaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctcc
ggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaa
ttagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcag
ctatcctctgaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatcc
ggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctg
gagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgc
tatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatc
aggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagat
tcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcct
gaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat
tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtctt
ccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgcttt
gaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

【0088】

３．アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（「ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤ」）
本発明の他の実施形態において、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディはアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むことができる（ＡＢＤ含有ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ）。

【0089】

国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディ分子のインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディ分子を、ダイアボディ分子の末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディ分子のＣ末端に配置されることになる。この目的のために特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が特に好ましい。

【0090】

連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。

【0091】

従って、アルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖は、第３のリンカー（リンカー３）を含有し、これは上記ポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）をアルブミン結合ドメインから分離する。このようなリンカー３に関する好ましい配列は、GGGS（配列番号３２）又はGGGNS（配列番号３３）である。好ましいアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、以下の配列（配列番号３４）を有する。
LAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP

【0092】

このような本発明の形態を例示するために、上述のＤＡＲＴ−２の第１のポリペプチド鎖を、アルブミン結合ドメインを含有するように修飾し、「ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤ」と称する、アルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディとした。

【0093】

ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤの第１のポリペプチド鎖は次のアミノ酸配列（配列番号３５）を有する。
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGS
LAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP

【0094】

上記の内容からわかるように、配列番号３５の残基１〜２７１は、ＤＡＲＴ−２の残基１〜２７１と同一であり、従って、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）、ヘテロ二量体促進性「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）及びＣ末端を備える。残基２７２〜２７５はリンカー３（配列番号３２）であり、及び残基２７６〜３２１はアルブミン結合ドメイン（配列番号３４）である。

【0095】

ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤの第１のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号３６）を有する。
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga
ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg
ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa
agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg
ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct
gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga
gggggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag
tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt
tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg
atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag
accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag
ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac
aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag
gatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaa
ggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtct
ctggcccaggcaaaagaggcagccatccgcgaactggataaatatggcgtgagcg
attattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagcact
gattgatgaaattctggccgccctgcct

【0096】

ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤの第２のポリペプチド鎖は上述したＤＡＲＴ−２の第２のポリペプチド鎖と同じである（配列番号３０）。

【0097】

Ｂ．ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（「ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃ」）
さらに他の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを提供する。このようなダイアボディは、「ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」と引用することもある。本発明のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全なＦｃ領域（例えば、完全なＩｇＧのＦｃ領域）であっても、または完全なＦｃ領域のフラグメントのみであってもよい。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ以上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ（単数または複数））に結合する能力を保有し得、さらに好ましくはこのようなＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全なＦｃ領域のいくつかのもしくは全てのＣＨ２ドメインおよび／またはいくつかのもしくは全てのＣＨ３ドメインを含んでもよいし、あるいは改変体ＣＨ２および／または改変体ＣＨ３の配列（これは、例えば、完全なＦｃ領域のＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインに対して、１つ以上の挿入および／または１つ以上の欠失を含んでもよい）を含んでもよい。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、非−Ｆｃポリペプチド部分を含んでもよく、または天然ではない完全なＦｃ領域の一部を含んでもよく、またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインの天然には存在しない方向性を含んでもよい（例えば、２つのＣＨ２ドメインもしくは２つのＣＨ３ドメイン、またはＮ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＨ２ドメインに連結されたＣＨ３ドメインなど）。

【0098】

バージョン１と表記され、図２Ａに示された第１の実施形態において、例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ｇｐＡ３３又はＣＤ３のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬ_gpA33又はＶＬ_CD3のいずれか）、介在スペーサペプチド（リンカー１）、ｇｐＡ３３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_CD3を含む場合）又はＣＤ３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_gpA33を含む場合）のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進性ドメイン、スペーサペプチド（リンカー５）、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、ＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全部又は一部）、及びＣ末端を含むことができる。

【0099】

バージョン２と表記され、図２Ｂに示された第２の実施形態において、例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、ＩｇＧ Ｆｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全部又は一部）、介在スペーサペプチド（リンカー４）、ｇｐＡ３３又はＣＤ３のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬ_gpA33又はＶＬ_CD3のいずれか）、介在スペーサペプチド（リンカー１）、ｇｐＡ３３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_CD3を含む場合）又はＣＤ３（当該第１のポリペプチド鎖がＶＬ_gpA33を含む場合）のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進性ドメイン、及びＣ末端を含むことができる。

【0100】

好ましくは、いずれかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く。
そのような変更された結合を媒介できるＦｃ変異及び突然変異型は、当該分野で周知であり、位置２３４および２３５のアミノ酸置換、位置２６５のアミノ酸置換、または位置２９７のアミノ酸置換を含む（例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，６２４，８２１号を参照）。好ましい実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、位置２３４でアラニンによる置換、および位置２３５でアラニンによる置換を含む。

【0101】

例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（バージョン１及びバージョン２）の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、ＣＤ３又はｇｐＡ３３のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖について選択されたＶＬドメインにより決まるＶＬ_gpA33又はＶＬ_CD3のいずれか）、介在スペーサペプチド（リンカー１）、ＣＤ３（当該第２のポリペプチド鎖がＶＬ_gpA33を含む場合）又はｇｐＡ３３（当該第２のポリペプチド鎖がＶＬ_CD3を含む場合）のいずれかに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）、ヘテロ二量体促進性ドメイン（好ましくは、Ｋコイルドメイン）及びＣ末端を含むことができる。

【0102】

例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（バージョン１及びバージョン２）は、さらに第３のポリペプチド鎖を含むことができ、第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、第１のポリペプチド鎖のＦｃドメインのものと同じアイソタイプを有するＩｇＧのＦｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全部又は一部）、及びＣ末端を含む。好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖において上述したように、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型のＦｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインが、このような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く。

【0103】

任意に存在する介在スペーサペプチド（リンカー４）は、APSSSというアミノ酸配列（配列番号３７）を含むことが好ましく、APSSSPMEというアミノ酸配列（配列番号３８）を含むことがさらに好ましい。

【0104】

第１及び第３のポリペプチド鎖のシステイン含有ペプチド（ペプチド１）は、同じアミノ酸配列から構成されても、または異なるアミノ酸配列から構成されてもよく、１、２、３またはそれ以上のシステイン残基を含む。特に好ましいペプチド１は、DKTHTCPPCPというアミノ酸配列（配列番号３９）を有する。

【0105】

介在スペーサペプチド（リンカー１）は、上記のとおり配列番号１の配列を有することが好ましい。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、上記のとおり、配列番号２の配列を有することが好ましい。

【0106】

ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第一及び第二のポリペプチドのヘテロ二量体促進性ドメインは、上述したＥコイルドメイン（配列番号３）及びＫコイルドメイン（配列番号４）であり、上述したとおり、一方のポリペプチド鎖にＥコイルドメインが選択されると、他方がＫコイルドメインを保有する。

【0107】

好ましいスペーサペプチド（リンカー５）はＧＧＧという配列を有する。

【0108】

第１及び第３のポリペプチドのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の錯体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」とペアにすることができる。このような一連の変化は、二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えば、Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然ＩｇＧのＦｃ領域のＦｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧのＦｃ領域のＦｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含んでいる最終の二重特異性１価Ｆｃダイアボディから第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を精製することを補助するために、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのプロテインＡ結合部位を、好ましくは、アミノ酸置換によって変異する。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。

【0109】

第１のポリペプチド鎖中に存在する抗体ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、以下の配列番号４０である。
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

【0110】

第３のポリペプチド鎖中に存在する抗体ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、以下の配列番号４１である。
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK

【0111】

１．ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１
「ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１」と称する、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖は、以下の配列を有するポリペプチドドメインを含む。

【0112】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第１のポリペプチド鎖は次のアミノ酸配列（配列番号４２）を有する。
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGS
GGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRI
RSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGN
SYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGG
GDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK

【0113】

上記の内容からわかるように、配列番号４２の残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）であり、配列番号４２の残基１０７〜１１４は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号４２の残基１１５〜２３９は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）であり、配列番号４２の残基２４０〜２４５は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、配列番号４２の残基２４６〜２７３は、ヘテロ二量体促進性「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３）であり、配列番号４２の残基２７４〜２７６は、スペーサペプチドＧＧＧ（リンカー５）であり、配列番号４２の残基２７７〜２８６は、ペプチド１（配列番号３９）であり、配列番号４２の残基２８７〜５０３は、抗体のＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインについての配列（配列番号４０）である。

【0114】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第１のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号４３）を有する。
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgag
tgactattacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagca
gaagcccggcaaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctcc
ggggtgccatctcggttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaa
ttagctccctggaggctgaagatgccgctacctactattgccagcagtggagcag
ctatcctctgaccttcggacaggggactaaactggaaatcaagggtggaggatcc
ggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctg
gagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgc
tatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatc
aggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagat
tcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcct
gaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat
tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtctt
ccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgcttt
ggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggc
ggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggac
cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac
ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag
ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggg
aggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacca
ggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca
gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacagg
tgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtg
gtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat
gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggct
ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaa
cgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag
agcctctccctgtctccgggtaaa

【0115】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第２のポリペプチド鎖は次のアミノ酸配列（配列番号４４）を有する。
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK
RAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
GGGSGGGGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEW
IGRIYPGDGETNYNGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGN
NVYFDVWGQGTTVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

【0116】

上記の内容からわかるように、配列番号４４の残基１〜１１０は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_CD3）（配列番号５）であり、配列番号４４の残基１１１〜１１８は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号４４の残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_gpA33）（配列番号２７）であり、配列番号４４の残基２３８〜２４３は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、及び配列番号４４の残基２４４〜２７１は、ヘテロ二量体促進性「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0117】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第２のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号４５）を有する。
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtga
ccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattg
ggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaa
agggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccg
ctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctct
gtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctggga
gggggtggatccggcggaggtggacaggtccagctggtccagagcggggccgaag
tcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgcaaagcatcaggctatacatt
tacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccaggacagggactggagtgg
atcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatggaaagttcaaag
accgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggagctgag
ctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac
aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggag
gatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaaga
gaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

【0118】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第３のポリペプチド鎖は次のアミノ酸配列（配列番号４６）を有する。
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKS
LSLSPGK

【0119】

上記の内容からわかるように、配列番号４６の残基１〜１０は、ペプチド１（配列番号３９）であり、配列番号４６の残基１１〜２２７は、抗体のＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号４１）である。

【0120】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の第３のポリペプチド鎖をエンコードする好ましいポリヌクレオチドは次の配列（配列番号４７）を有する。
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgt
cagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccc
tgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg
agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagga
ctggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc
cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt
acaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttg
cgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg
cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct
tcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt
cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagc
ctctccctgtctccgggtaaa

【0121】

２．ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２
「ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２」と称する、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖は、以下の配列を有するポリペプチドドメインを含む。その他の違いとしては、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１は、ポリペプチド鎖のＣＨ２およびＣＨ３の配列の位置がＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２と異なり、これらの配列がＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１ではＶＬ及びＶＨ配列のＣ末端側に配置されているのに対し、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２ではＶＬ及びＶＨ配列のＮ末端側に配置されている。

【0122】

そのようなＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２の第１のポリペプチド鎖は次のアミノ酸配列（配列番号４８）を有する。
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGKAPSSSPMEDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPG
KAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPL
TFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNW
VRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTE
DTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEK
VAALKEKVAALKE

【0123】

上記の内容からわかるように、配列番号４８の残基１〜１０は、ペプチド１（配列番号３９）であり、配列番号４８の残基１１〜２２７は、抗体のＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインについての配列（配列番号４０）である。配列番号４８の残基２２８〜２３５は、介在スペーサペプチド（リンカー４）（配列番号３８）であり、配列番号４８の残基２３６〜３４１は、ｇｐＡ３３に結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬ_gpA33）（配列番号２６）であり、配列番号４８の残基３４２〜３４９は、第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号１）であり、配列番号４８の残基３５０〜４７４は、ＣＤ３に結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨ_CD3）（配列番号２５）であり、配列番号４８の残基４７５〜４８０は、システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）（配列番号２）であり、配列番号４８の残基４８１〜５０８は、ヘテロ二量体促進性「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４）である。

【0124】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２の第２のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ−２の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（すなわち、配列番号２８（既出））を有する。

【0125】

ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン２の第３のポリペプチド鎖は、配列番号４６（既出）のアミノ酸配列を有する。

【0126】

［医薬組成物］
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の上記のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ及び追加の治療剤、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の１つ又は複数の分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。

【0127】

本発明はまた、上記のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、及び特定の癌に関連した抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば癌抗原特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物も包含する。

【0128】

ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。

【0129】

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。

【0130】

本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0131】

本発明はまた、上述の薬学的に許容可能なキャリアと併せて、上記のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（単独又は追加の治療剤と共に）で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。

【0132】

本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。一実施形態において、キットは、１つ又は複数の本発明の分子を含む。他の実施形態において、キットは更に、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含む。さらに他の実施形態において、キットは更に、癌に関連する１つ又は複数の抗原に結合する１つ又は複数の抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。

【0133】

［本発明の組成物の使用］
本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ｇｐＡ３３の発現に関連する又はｇｐＡ３３の発現を特徴とするいずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。従って、このような分子を含む医薬組成物は、限定するものではないが、結腸癌、大腸癌、及び膵臓癌の診断又は治療において採用してよい。

【0134】

［投与方法］
本発明の組成物は、有効量の医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。

【0135】

例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。

【0136】

本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；５，９８５，３２０号；５，９８５，３０９号；５，９３４，２７２号；５，８７４，０６４号；５，８５５，９１３号；５，２９０，５４０号；４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；９７／３２５７２号；９７／４４０１３号；９８／３１３４６号；９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）。

【0137】

本発明はまた、本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３Ｆｃダイアボディは、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。

【0138】

凍結乾燥された本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このような二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディの液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。

【0139】

障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。

【0140】

本発明が包含するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関して、患者に投与される投薬量は、典型的には、被験者の体重に対して、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、少なくとも約３μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約３０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上である。

【0141】

本発明の二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディ配列の投与の投薬量及び頻度は、例えば脂質化等の修飾によって、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの取り込み及び組織貫通を増進することにより、低減又は変更してよい。

【0142】

一実施形態において、患者に投与される本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの用量は、単一作用剤療法としての使用に関して計算してよい。他の実施形態において、本発明の二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、他の治療用組成物と併用され、患者に投与される用量は、上記二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディを単一作用剤療法として使用する場合よりも低い。

【0143】

ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜（sialastic）等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。

【0144】

他の実施形態において、組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327参照）。

【0145】

さらに他の実施形態において、組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際公開第９１／０５５４８号、国際公開第９６／２０６９８号、Ning et al. (1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189, Song et al. (1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleek et al. (1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton, (1987) “Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240、Buchwald et al. (1980) “Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516、及びSaudek et al. (1989) “A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574-579参照）。別の実施形態では、抗体の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)、Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)、Levy et al. (1985) “Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192、During et al. (1989) “Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,”Ann. Neurol. 25:351-356、Howard et al. (1989) “Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112）、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、国際公開第９９／１５１５４号、及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態において、放出制御系は、治療標的（例えば、肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照）。他の実施形態において、放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、ダン他（米国特許第５，９４５，１５５号参照）に従って使用する。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。

【0146】

放出制御系については、Langer (1990, “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号、Ning et al. (1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Song et al. (1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleek et al. (1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0147】

ある特定の実施形態において、本発明の組成物が、本発明の二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディをエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードする二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディの発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えば、Joliot et al. (1991) “Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

【0148】

治療的又は予防的有効量の本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、本発明の分子を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与する。他の実施形態において、この医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与する。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。

【0149】

ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。

【実施例】

【0150】

実施例１ 抗ヒトｇｐＡ３３モノクローナル抗体
ヒトｇｐＡ３３に特異的に結合できるマウスモノクローナル抗体をキメラ化およびヒト化した。元のマウス抗体のＶＬ及びＶＨ鎖は、それぞれ配列番号１３及び１７の配列を有する。ヒト化抗体のＶＬ及びＶＨ鎖は、それぞれ配列番号の配列２６及び２７を有する。

【0151】

ＶＬ_gpA33の抗原結合ドメインは、SARSSISFMYという配列（配列番号１４）を有するＣＤＲ１、DTSNLASという配列（配列番号１５）を有するＣＤＲ２、及びQQWSSYPLTという配列（配列番号１６）を有するＣＤＲ３を含む。

【0152】

ＶＨ_gpA33の抗原結合ドメインは、GSWMNという配列（配列番号１８）を有するＣＤＲ１、RIYPGDGETNYNGKFKDという配列（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、及びIYGNNVYFDVという配列（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含む。

【0153】

表１は、上記変化による結合の反応速度論的な影響を示す。

【0154】

【表1】

【0155】

データは、抗体のＶＬ及びＶＨドメインのヒト化に至る修飾が、実質的にｇｐＡ３３結合反応速度に影響を与えなかったことを示している。

【0156】

実施例２ ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＦｃダイアボディ並びに対照ダイアボディの構築
表２は、発現及び精製後の好ましいｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディ及びｇｐＡ３３×ＣＤ３Ｆｃダイアボディのポリペプチド鎖の配列のリストを含む。例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、ＤＡＲＴ−１及びＤＡＲＴ−２、並びに例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（ＤＡＲＴ‐２ｗ／Ｆｃ）による同時結合の検出結果から判断して、ダイアボディは、ｇｐＡ３３及びＣＤ３に同時に結合できることが分かった。さらに、対照二重特異性１価ダイアボディ（「対照ＤＡＲＴ」）を産生した。対照ＤＡＲＴは、ＣＤ３及びＦＩＴＣに対して二重特異性１価であり、ＣＤ３及びＦＩＴＣに同時に結合できることが分かった。

【0157】

【表2】

【0158】

ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは２つのポリペプチド鎖（挙げられている各配列の鎖）からなるヘテロ二量体であり、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは３つのポリペプチド鎖（挙げられている各アミノ酸配列の鎖）からなるヘテロ二量体である。二重特異性１価ダイアボディを形成するための方法は、国際公開第２００６／１１３６６５号、国際公開第２００８／１５７３７９号、国際公開第２０１０／０８０５３８号、国際公開第２０１２／０１８６８７号、国際公開第２０１２／１６２０６８号、国際公開第２０１２／１６２０６７号において提供される。

【0159】

対照ＣＤ３×ＦＩＴＣ二重特異性１価ダイアボディは、ＣＤ３及びＦＩＴＣに同時に結合できることが分かった。上述したｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ｇｐＡ３３及びＣＤ３に同時に結合できることが分かった。このような同時結合を実証するため、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１を固体支持体に固定された可溶性ＣＤ３フラグメントの存在下でインキュベートした。結合の検出は、固体化抗体のｇｐＡ３３追加結合能力によって評価した。結果から、上述したｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ＦｃダイアボディがｇｐＡ３３及びＣＤ３との同時結合を媒介する能力が確認された（図３）。

【0160】

実施例３ 癌細胞に対するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの細胞毒性
本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの癌を治療する能力は、大腸癌又は膵臓癌細胞をｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝２５：１）又は活性化したヒトＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）のいずれかの存在下でインキュベートすることによって示される。ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１は、５０％の最大活性（ＥＣ５０）を達成するために必要なサブｎｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度を用いて、潜在的な再指向殺滅能力を呈した。対照的に、ｇｐＡ３３陰性癌細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６）を採用した時は、細胞毒性は観察されなかった。調査の結果を図４Ａ（大腸癌幹様細胞（結腸ＣＳＣＬ細胞））、図４Ｂ（Ｃｏｌｏ２０５大腸細胞）、及び図４Ｃ（ＡＳＰＣ−１膵臓癌細胞）に示す。結果を表３にまとめる。

【0161】

【表3】

【0162】

実施例４ ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの存在下におけるＴ細胞活性化
本発明のダイアボディの癌を治療する能力をさらに実証するために、癌細胞（ｃｏｌｏ２０５又はＡＳＰＣ−１）の存在下又は不存在下で、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ‐１と共に休止ヒトＴ細胞をインキュベートした。ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐１）媒介性再指向殺滅プロセス中のＴ細胞活性化を特性決定するために、再指向殺滅アッセイからのＴ細胞を、Ｔ細胞活性化マーカＣＤ２５に関して染色し、ＦＡＣＳで分析した。ＣＤ２５は、ＣＤ８（図５Ａ〜５Ｂ）及びＣＤ４（図５Ｄ〜５Ｅ）Ｔ細胞中において用量依存的に発現増加され、これはｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディが、再配向殺滅のプロセスにおいてＴ細胞活性化を誘発することを示している。対照的に、標的細胞の不在時、ＣＤ８（図５Ｃ）及びＣＤ４（図５Ｆ）Ｔ細胞の活性化は発生せず（図５パネルＣ）、これは、ｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディが、標的細胞の不在時にＴ細胞を活性化させないことを示している。同様に、ＣＤ８又はＣＤ４Ｔ細胞は、標的細胞及び対照二重特異性１価ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）を用いてインキュベートした場合に活性化されず（それぞれ、図５Ａ〜５Ｂ及び図５Ｄ〜５Ｆ）、これは、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを用いてＴ細胞及び標的細胞を架橋する必要があることを示している。

【0163】

実施例５ マウス抗ヒトｇｐＡ３３可変ドメイン配列を有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−１）とヒト化抗ヒトｇｐＡ３３可変ドメイン配列を有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２）の同等性
上述したとおり、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１は、マウスモノクローナル抗体のＶＬ_gpA33及びＶＨ_gpA33ドメインを含むが、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−２は、同一のマウス抗体のヒト化ＶＬ_gpA33及びヒト化ＶＨ_gpA33ドメインを含む。
ヒト化ＶＬ_gpA33及びＶＨ_gpA33ドメインのＴ細胞をｇｐＡ３３発現癌細胞へのターゲッティングを促進する能力を実証するため、休止Ｔ細胞（ＬＤＨアッセイ；Ｅ：Ｔ＝１０：１）が存在し、ＤＡＲＴ−１、ＤＡＲＴ−２又は対照二重特異性１価ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）のいずれかの存在下でｇｐＡ３３を発現する癌細胞をインキュベートした。この分析の結果（図６Ａ〜６Ｄに示す）は、ＤＡＲＴ−１及びＤＡＲＴ−２が、ＳＷ９４８結腸直腸腺癌細胞（図６Ａ）及びｃｏｌｏ２０５細胞（図６Ｂ）について同等の細胞毒性を媒介したことを実証している。ＤＡＲＴ−１及びＤＡＲＴ−２は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２）が安定に導入されたルシフェラーゼ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞株（Ｃｏｌｏ２０５−Ｌｕｃ）について、発光の減少が測定されたことから、両方とも細胞毒性を媒介した（図６Ｃ）。ＤＡＲＴ−１及びＤＡＲＴ−２は、ｇｐＡ３３陰性癌細胞株ＨＣＴ１１６について、いずれも細胞毒性を媒介しなかった（図６Ｄ）。表４に示すように、ＤＡＲＴ−１及びＤＡＲＴ−２は、複数の腫瘍細胞株に対して類似の同等な生物活性を呈した。

【0164】

【表4】

【0165】

実施例６ ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、アルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディと、カニクイザルＰＢＭＣとの交差反応性
上述したとおり、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−２のヒト化ＶＬ_gpA33及びヒト化ＶＨ_gpA33ドメインは、ヒトＴ細胞の存在下において、ｇｐＡ３３発現癌細胞の細胞毒性を媒介する。本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディのＶＬ_gpA33及びＶＨ_gpA33ドメインは、予想外にもカニクイザルＴ細胞のＣＤ３とも結合する能力があり、それらの細胞をｇｐＡ３３発現細胞の殺滅に再指向することが分かった。

【0166】

図７Ａ〜７Ｄに示すように、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−２、アルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤ） 及びＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃ）は全て、ヒト又はカニクイザルＰＢＭＣの存在下における癌細胞の細胞毒性を促進できることが分かった。図７Ａ〜７Ｂは、ＬＤＨアッセイ（図７Ａ）又はルシフェラーゼ（図７Ｂ）の測定により、上記３つのダイアボディが、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートされたＣｏｌｏ２０５−Ｌｕｃ細胞の細胞毒性を媒介する能力を示す。図７Ｃ〜７Ｄは、ＬＤＨアッセイ（図７Ｃ）又はルシフェラーゼ（図７Ｄ）の測定により、上記３つのダイアボディが、ヒトＰＢＭＣと共にインキュベートされたＣｏｌｏ２０５−Ｌｕｃ細胞の細胞毒性を媒介する同様の能力を示す。

【0167】

表５に示すように、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−２及びアルブミン結合ドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／ＡＢＤ）は、同等なＣＴＬ活性を示した。二重特異性１価ダイアボディは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＰＢＭＣエフェクタ細胞の両方で一貫して活性を呈した。

【0168】

【表5】

【0169】

実施例７ マウス結腸癌モデルにおけるｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディのインビボ反応性
本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディの癌の治療を提供するインビボ能力を実証するため、活性化Ｔ細胞と共にｃｏｌｏ２０５細胞が免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ）マウスに共埋入（co-implanted）された（Agliano, A. et al. (2008) “Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-Related Strains,” Int. J. Cancer 123(9):2222-2227、Sanchez, P.V. et al. (2009) “A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia,” Leukemia 23(11):2109-2117、Racki, W.J. et al. (2010) “NOD-Scid IL2rgamma(Null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection,” Transplantation 89(5):527-536、Choi, B. et al. (2011) “Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/SCID/IL-2Rγ(Null) (NSG) Mice Conditioned By Busulfan,” J. Clin. Immunol. 31(2):253-264、Sartelet, H. et al. (2012) “Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/Il2rg Null (NSG) Mice,” In Vivo 26(1):19-29、Spranger, S. et al. (2012) “NOD/scid IL-2Rg(null) Mice: A Preclinical Model System To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo,” J. Transl. Med. 10:30、von Bonin, M. et al. (2013) “in vivo Expansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice,” PLoS One. 8(4):e60680）。

【0170】

ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１は、マウスに、１日１回、埋入時から開始して４日間（ＱＤｘ４）静脈投与された。ｃｏｌｏ２０５腫瘍体積は、ビヒクル対照を受容したマウスにおいて増加することが見出された（図８）。しかし、ＤＡＲＴ−１を受容した動物は、ｃｏｌｏ２０５腫瘍体積がより少ない又は存在しないことが示されている
（図８）。

【0171】

Ｃｏｌｏ２０５細胞を埋入したＮＳＧマウスの画像は、処理２日目では、ビヒクル（図９Ａ）又はｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１（図９Ｂ）を受容したマウスが有意な腫瘍を有することを示した。しかし、処理１２日目では、ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１を受容したマウスは劇的に少ない腫瘍体積であった（図９Ｄ）。処理１２日目では、ビヒクルを受容したマウスは増大した腫瘍体積を示した（図９Ｃ）。

【0172】

本発明のｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディの癌の治療を提供するインビボ能力をさらに証明するため、ＡＳＰＣ−１膵臓腫瘍細胞及び活性化ヒトＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１）を用いて上述した腫瘍モデルを実施した。ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＤＡＲＴ−１、対照二重特異性１価ダイアボディ（対照ＤＡＲＴ）、又はビヒクルを１日１回、埋入時から開始して９日間（ＱＤｘ９）静脈投与した。ＡＳＰＣ−１腫瘍体積は、ビヒクル対照を受容したマウスにおいて増加することが見出された（図１０）。しかし、ＤＡＲＴ−１を受容した動物は、用量依存的に、より少ない腫瘍体積を呈することが見出された（図１０）。

【0173】

実施例８ ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディのバージョン１（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）の効能判定
ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３ダイアボディのバージョン１（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）の効能を実証するため、マウスは、様々な投薬量レベルで上述のＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１を７日間（浸透圧ポンプを使用して）注入された。ポンプ注入から４８時間後（すなわち、定常状態となったＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の循環濃度の存在下）、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞及びＴ細胞の混合物をマウスに皮下埋入し、腫瘍成長の程度を監視した。表６は、研究の設計をまとめたものであり、各グループは８匹のメスのマウスが含まれる。

【0174】

【表6】

【0175】

研究の結果は図１１に示され、ＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）の投与が、全ての試験した投薬量において、腫瘍体積の劇的な低下を媒介したことを示している。

【0176】

上記研究で得られた腫瘍体積の劇的な低下を踏まえ、より低用量での効能を評価する追加研究を実施した。表７は、追加研究の設計をまとめたものであり、各グループは８匹のメスのマウスが含まれる。

【0177】

【表7】

【0178】

この追加研究の結果は図１２に示されている。図１２において、各記号は、上述したＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）またはビヒクルの指示用量を受容した動物を意味している。

【0179】

実施例９ カニクイザルにおけるｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２）及びＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃ）の薬物動態プロファイル
カニクイザルのＣＤ３に結合する本発明のダイアボディのＶＬ_CD3 及びＶＨ_CD3ドメインの能力は、本発明のダイアボディのインビボ薬物動態を測定するために、このような動物の使用を可能にする。

【0180】

このような薬物動態を測定するために、上述したｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２）又はＩｇＧ Ｆｃドメインを有するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）をカニクイザルに（１０μｇ／ｋｇ／日）注入し、循環中に残っている上記分子の濃度を監視した。図１３は、本研究の結果を示すものであり、ＤＡＲＴ−２及びＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１が１次の脱離速度を呈することを示している。

【0181】

実施例１０ ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（ＤＡＲＴ−１ｗ／Ｆｃバージョン１）のヒト及びカニクイザルのＣＤ３及びｐＡ３３への結合のＳＰＲ分析
ヒト及びカニクイザルのＣＤ３受容体の可溶性バージョンに結合するｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性Ｆｃダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）が、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００バイオセンサ（GE, Healthcare ）でＳＰＲ分析された。受容体は、製造元が推奨した手順に従って、ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。要約すると、センサーチップ表面上のカルボキシル基は、０．２ＭのＮ‐エチル‐Ｎ‐（３ジエチルアミノ‐プロピル）カルボジイミド、及び０．０５ＭのＮ‐ヒドロキシ‐スクシンイミドを含有する溶液の注射によって活性化された。可溶性ＣＤ３受容体（１μｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０、流量５μＬ／分）中で、活性化されたＣＭ５表面全体に亘って注射し、続いて不活性化のために１Ｍエタノールアミンを注射した。

【0182】

かかる分析に採用されたカニクイザル及びヒトのＣＤ３の可溶性バージョンは、ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体などの哺乳動物細胞で発現させ、Ｃ末端の逆帯電したヘテロ促進Ｅコイル及びＫコイル配列ににより安定化される。可溶性カニクイザルＣＤ３εは、Ｖ３５対立遺伝子（ＦＮ１８＋）であるカニクイザルＣＤ３εの最初の１１８アミノ酸残基と、そのカルボキシ末端に続く上述したＥコイルドメイン（配列番号３）を含む。カニクイザルＣＤ３εのＶ３５対立遺伝子（ＦＮ１８＋）のアミノ酸配列は、配列番号４９である。
MQSGTRWRVL GLCLLSIGVW GQDGNEEMGS ITQTPYQVSI SGTTVILTCS
QHLGSEAQWQ HNGKNKEDSG DRLFLPEFSE MEQSGYYVCY PRGSNPEDAS
HHLYLKARVC ENCMEMDVMA VATIVIVDIC ITLGLLLLVY YWSKNRKAKA
KPVTRGAGAG GRQRGQNKER PPPVPNPDYE PIRKGQQDLY SGLNQRRI

【0183】

可溶性カニクイザルＣＤ３δは、カニクイザルＣＤ３δの最初の１０１アミノ酸残基と、そのカルボキシ末端に続く上述したＫコイルドメイン（配列番号４）を含む。カニクイザルＣＤ３δのアミノ酸配列は配列番号５０である。
MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPVEELE DRVFVKCNTS VTWVEGTVGT
LLTNNTRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESAVQVHY RMCQNCVELD
PATLAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ
PLRDRDDAQY SRLGGNWARN K

【0184】

２つのタンパク質は、哺乳動物のＣＨＯ−Ｓ細胞中で共発現（co-expressed）し、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）に結合した抗Ｅ／ＫコイルｍＡｂを使用して精製した。

【0185】

可溶性ヒトＣＤ３εは、Ｃ１１９Ｓ及びＣ１２２Ｓを備えたヒトＣＤ３εの１〜１２７残基と、そのカルボキシ末端に続く上述したＥコイルドメイン（配列番号３）を含む。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は配列番号５１である。
MQSGTHWRVL GLCLLSVGVW GQDGNEEMGG ITQTPYKVSI SGTTVILTCP
QYPGSEILWQ HNDKNIGGDE DDKNIGSDED HLSLKEFSEL EQSGYYVCYP
RGSKPEDANF YLYLRARVCE NCMEMDVMSV ATIVIVDICI TGGLLLLVYY
WSKNRKAKAK PVTRGAGAGG RQRGQNKERP PPVPNPDYEP IRKGQRDLYS
GLNQRRI

【0186】

可溶性ヒトＣＤ３δは、ヒトＣＤ３δの１〜１０１残基と、そのカルボキシ末端に続く上述したＫコイルドメイン（配列番号４）を含む。２つのタンパク質は、哺乳動物のＣＨＯ−Ｓ細胞中で共発現（co-expressed）し、抗Ｅ／Ｋコイルアフィニティカラムを使用して精製した。ヒトＣＤ３δのアミノ酸配列は配列番号５２である。
FKIPIEELE DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT LLSDITRLDL GKRILDPRGI
YRCNGTDIYK DKESTVQVHY RMCQSCVELD PATVAGIIVT DVIATLLLAL
GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SHLGGNWARN
K

【0187】

可溶性ヒトｇｐＡ３３は、カルボキシ末端に配列番号５３のHHHHHH（「６Ｈｉｓ」）反復を備えたヒトｇｐＡ３３の１〜２３５残基を含む。可溶性カニクイザルｇｐＡ３３は、カルボキシ末端に６Ｈｉｓ反復を備えたカニクイザルｇｐＡ３３の１〜３１４残基（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｎ３１４）を含む。タンパク質は哺乳動物のＣＨＯ−Ｓ細胞中で共発現し、Ｎｉ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を使用して精製した。

【0188】

１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４，１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０界面活性剤を含有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で結合実験を実施した。０、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｎＭの濃度、３０μＬ／分の流量で１２０秒間注射時のＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１の結合を（二重に）分析した。

【0189】

固定化された受容体表面の再生成を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５のパルス注射によって実施した。基準曲線は、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃの各希釈物をタンパク質が固定化されていない処理表面全体に亘って注射することによって得た。ゼロ濃度での結合曲線は、ブランクとして差し引いた。ＫＤ値は、ラングミュア１：１結合モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアｖ４．１）に対する結合曲線のグローバルフィットによって決定した。

【0190】

ｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ（ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１）のヒト及びカニクイザルのＣＤ３及びｐＡ３３への結合のＳＰＲ分析は、２つの異なる種からの分子についてかなり類似することを実証した（図１４Ａ〜１４Ｂ、図１５Ａ〜１５Ｂ）。表８は、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃ相互作用に関する１：１ラングミュアモデルのアフィニティ及び速度定数に対するグローバルフィットにより算出した平衡解離定数（KDs）を提供する。ヒト及びカニクイザルＣＤ３に関するＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１のＫＤ値は、２つの抗原間における最大結合応答の違いにもかかわらず、それぞれ２３及び２６ｎＭと略同一である。表面上に直接固定化された異なるアミノ酸配列を有する抗原のランダム配向は、表面上の利用可能な結合部位の密度を異ならせる原因となる。ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１のヒト及びサルｇｐＡ３３との相互作用に関するＫＤ値は、それぞれ２．２ｎＭ及び１２ｎＭである（表８）。アフィニティの差は、ＤＡＲＴ−２ｗ／Ｆｃバージョン１のカニクイザルｇｐＡ３３との相互作用に関して、相対的に、会合速度定数がわずかに小さく、解離速度定数が大きいためである（表８）。データは、それぞれ二重に実施された３回の独立した実験の平均である（ＳＤ＝標準偏差、ｈはヒト、ｃｙｎｏはカニクイザル）。

【0191】

【表8】

【0192】

本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]