特許 6582314 ３次元像構築方法、画像処理装置、および電子顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6582314

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】３次元像構築方法、画像処理装置、および電子顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G01N 23/04 20180101AFI20190919BHJP

【ＦＩ】

   G01N23/04

【請求項の数】6

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-544270(P2016-544270)

(86)(22)【出願日】2015年8月21日

(86)【国際出願番号】JP2015073604

(87)【国際公開番号】WO2016027895

(87)【国際公開日】20160225

【審査請求日】2018年2月22日

(31)【優先権主張番号】特願2014-169003(P2014-169003)

(32)【優先日】2014年8月22日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000004271

【氏名又は名称】日本電子株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(72)【発明者】

【氏名】藤吉 好則

(72)【発明者】

【氏名】石川 勇

(72)【発明者】

【氏名】細木 直樹

【審査官】 越柴 洋哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１３４２１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６６０４０５２（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 MICHAEL RADERMACHER，Three-Dimensional Reconstruction of Single Particles FromRandom and Nonrandom Tilt Series，JOURNAL OF ELECTRON MICROSCOPY TECHNIQUE，２００５年 ２月，Vol. 9 No.4，pp.359-394

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２３／００−２３／２２７６

Ｈ０１Ｊ ３７／００−３７／２９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

膜タンパク質の３次元像を構築する３次元像構築方法であって、
脂質膜内に存在する前記膜タンパク質を含む試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された、前記試料の第１透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料に、前記脂質膜の膜面に対して垂直に前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第２透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記第１透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを、前記第２透過電子顕微鏡像において対応する前記膜タンパク質の前記脂質膜に垂直な軸に対する回転角から特定する工程と、
前記第１透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の粒子像を取り出し、取り出した前記粒子像を、前記膜タンパク質の向きを特定する工程で特定された前記膜タンパク質の向きで分類し、分類された前記粒子像を平均化して、前記膜タンパク質の３次元像を構築する工程と、
を含み、
前記第１透過電子顕微鏡像の撮影の後に、前記第２透過電子顕微鏡像の撮影が行われ、
前記第２透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量よりも大きい、３次元像構築方法。

【請求項2】

請求項１において、
前記試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して前記第１透過電子顕微鏡像の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第３透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記第２透過電子顕微鏡像に基づいて、前記第３透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを特定する工程と、
を含み、
前記膜タンパク質の３次元像を構築する工程では、特定された前記膜タンパク質の向きの情報に基づいて、前記第１透過電子顕微鏡像および前記第３透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の３次元像を構築する、３次元像構築方法。

【請求項3】

請求項１または２のいずれか１項において、
前記第２透過電子顕微鏡像を撮影するときの前記試料に対する前記電子線のドーズ量は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときの前記試料に対する前記電子線のドーズ量よりも多い、３次元像構築方法。

【請求項4】

膜タンパク質の３次元像を構築する画像処理装置であって、
脂質膜内に存在する前記膜タンパク質を含む試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された、前記試料の第１透過電子顕微鏡像を取得する第１像取得部と、
前記試料に、前記脂質膜の膜面に対して垂直に前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第２透過電子顕微鏡像を取得する第２像取得部と、
前記第１透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを、前記第２透過電子顕微鏡像において対応する前記膜タンパク質の前記脂質膜に垂直な軸に対する回転角から特定する向き特定部と、
前記第１透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の粒子像を取り出し、取り出した前記粒子像を、前記膜タンパク質の向きを特定する工程で特定された前記膜タンパク質の向きで分類し、分類された前記粒子像を平均化して、前記膜タンパク質の３次元像を構築する３次元像構築部と、
を含み、
前記第２透過電子顕微鏡像は、前記第１透過電子顕微鏡像の撮影の後に撮影されたものであり、
前記第２透過電子顕微鏡像は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量よりも大きいデフォーカス量で撮影されたものである、画像処理装置。

【請求項5】

請求項４において、
前記試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して前記第１透過電子顕微鏡像の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第３透過電子顕微鏡像を取得する第３像取得部を含み、
前記向き特定部は、前記第２透過電子顕微鏡像に基づいて、前記第３透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを特定し、
前記３次元像構築部は、特定された前記膜タンパク質の向きの情報に基づいて、前記第１透過電子顕微鏡像および前記第３透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の３次元像を構築する、画像処理装置。

【請求項6】

請求項４または５に記載の画像処理装置を含む、電子顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、３次元像構築方法、画像処理装置、および電子顕微鏡に関する。

【背景技術】

【0002】

電子顕微鏡を用いた生物試料の構造解析方法としては、電子線結晶学による２次元結晶を用いた構造解析方法、単粒子解析法、電子線トモグラフィー法、の３つの方法が知られている。

【0003】

電子線結晶学による２次元結晶を用いた構造解析方法では、様々な傾斜角度（例えば、０度、２０度、４５度、６０度等）に傾斜した試料から電子線回折像および電子顕微鏡像（明視野像）を取得し、電子線回折像の回折点の強度から振幅情報を求め、電子顕微鏡像から位相情報を求めることによって立体的な構造が解析される。電子線結晶学を用いることで、良好な２次結晶が得られる場合には、１．９Åという高い分解能での解析が可能であり、膜タンパク質の構造のみならず、脂質分子や、水分子などを含む詳細な構造も解析することができる。

【0004】

単粒子解析法は、タンパク質など生体高分子の単離した一分子の粒子から得た電子顕微鏡像から画像処理によってその立体構造を再構成する手法である（例えば、特許文献１参照）。

【0005】

単粒子解析法では、近年、ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルのような膜タンパク質の構造が３．４Åの分解能で構造解析されている。単粒子解析では、結晶を作製することなく、膜タンパク質の立体構造を原子モデルが作製できるレベルの高い分解能で解析できる。

【0006】

近年の単粒子解析法の発展は、安定な低温電子顕微鏡の開発に加えて、画像を記録する装置における革新的な進展によってもたらされた。これまでは、電子顕微鏡用フィルムに電子顕微鏡像を記録するか、電子線を蛍光剤で光に変換し、それをＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）などで記録するカメラが用いられてきた。これに対して、近年、電子線を直接ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＭＯＳ）カメラ等に記録する装置が開発され、記録方法の改良がなされた。これにより、ＤＱＥ（Ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が大きく向上すると共にＭＴＦ（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）も大きく向上した。このような装置の発展によって極めて高効率に高分解能の画像を記録することができるようになった。このような技術発展によって、膜タンパク質についても、単粒子解析法を用いて結晶を作製することなく高分解能の構造解析ができるようになった。

【0007】

しかし、単粒子解析を用いたＴＲＰの構造解析においては、界面活性剤を用いるとミセルが深刻なバックグラウンドノイズとなるという問題がある。そのため、ＴＲＰの構造解析では、界面活性剤をａｍｐｈｉｐｏｌｓに置き換えることによってミセルを取り除いていた。ＴＲＰの場合には、界面活性剤をａｍｐｈｉｐｏｌｓに置き換えることができたが、必ずしもこの置き換えは一般的に可能ではない。

【0008】

電子線トモグラフィー法は、試料を連続的に近い少ない角度変化で傾斜させて撮影した多数の電子顕微鏡像を画像処理し、３次元構造を再構成する手法である（例えば特許文献２参照）。電子線トモグラフィー法を用いると、複雑な構造体の立体構造を解析することができる。しかし、電子線結晶学を用いた構造解析方法や単粒子解析法のように、多くの分子を平均化してＳＮ比を向上させることはできないため、現状では３０Åより高い分解能での解析が困難である。

【0009】

以上のように、電子顕微鏡を用いた高分解能の構造解析には、３種類の方法が用いられているが、特に、単粒子解析法が大きな注目を浴びつつある。単粒子解析法が注目される理由は、成功するか否かわからない結晶化の努力を行わなくても立体構造が解析でき、また、その分解能が原子モデルを作製できるレベルの３．５Åより高い分解能での解析が可能となってきたことによる。それゆえ、単粒子解析法は、基礎生物学研究の発展のみならず、創薬のための構造研究をはじめとする多くの応用を含む研究分野において大きな期待と注目を得るようになってきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２００７−４１７３８号公報

【特許文献2】特開２０１２−２０９０５０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

しかし、単粒子解析法を用いて、創薬の標的として重要な膜タンパク質の構造を解析しようとした場合には、重要な問題点が残されている。

【0012】

膜タンパク質の単粒子解析法を用いた構造解析では、膜タンパク質の疎水的な部分を界面活性剤で覆うことで可溶化し、あるいは界面活性剤をａｍｐｈｉｐｏｌｓに置き換えて、構造解析が行われる。すなわち、膜タンパク質が本来機能している脂質膜内には存在しない状態で構造が解析されることになる。これまでに行われた膜タンパク質の構造解析研究から、膜タンパク質の構造を本来機能している脂質膜内に存在する状態で構造解析する重要性が明らかになってきた。

【0013】

例えば、脳に多くの発現が確認されている水チャネル、アクアポリン−４の構造が電子線結晶学を用いた構造解析方法により２．８Åの分解能で解析され、水チャネル内の水分子が明確に分離して観察されている。ところが、Ｘ線結晶構造解析で解析された同じアクアポリン−４の構造では、分解能がより高い１．８Åで解析されたにもかかわらず、水分子の位置はぼやけて水分子を分離して観察することができなかった。

【0014】

その理由は、Ｘ線結晶構造解析では、界面活性剤により脂質分子を溶かし去った状態で構造が解析されたために、脂質膜の特徴的な静電分布（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が無くなってしまい、短いヘリックスの双極子（ｈｅｌｉｘ ｄｉｐｏｌｅ）による静電場が弱くなって、水チャネル内での水分子の配向が崩れてしまったことが原因と考えられる。なお、このような短いヘリックスが形成する静電場は、水チャネルに見られるだけでなく、他のイオンチャネルにおいても重要な役割を果たしている。

【0015】

また、膜タンパク質は、脂質膜の横からの圧力の中にある状態で、構造を形成しているので、その脂質膜による圧力がない場合には、構造が変化してしまう、あるいは、変性してしまう恐れがある。

【0016】

以上のように、膜タンパク質は、本来それらが働いている脂質膜の中での構造を知る必要があるが、単粒子解析法では、上述のように膜タンパク質の疎水的な部分を界面活性剤で覆うことによって可溶化し、バッファー内に分散した状態の像を撮影して、構造を解析する。そのため、単粒子解析法では、電子線結晶学法で解析されるような、本来の機能構造を解析することは困難である。

【0017】

図１３は、界面活性剤を用いて可溶化して単粒子解析を行う際の膜タンパク質４の状態を示す図である。界面活性剤を用いて膜タンパク質４の単粒子解析を行う場合には、図１３に示すように、界面活性剤ｄがミセルｍを形成して、高いバックグラウンドノイズを与えるために、膜タンパク質４の正確な構造解析が困難である。そのため、高分解能での構造解析に成功した近年の単粒子解析では、上述したように、界面活性剤をａｍｐｈｉｐｏｌｓに置き換えている。ただし、この置き換えが困難な膜タンパク質も存在しており、このような置き換えが困難な膜タンパク質の単粒子解析を進めるために、新たな手法が望まれている。

【0018】

また、そもそも多くの膜タンパク質は、界面活性剤で脂質膜から溶かしだして精製すると変性してしまい構造解析が困難になる。このような不安定な膜タンパク質の構造研究を行うためには、界面活性剤で可溶化することなく構造解析ができることが望ましい。

【0019】

本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、脂質膜内に存在する膜タンパク質の３次元像を構築することができる３次元像構築方法および画像処理装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記画像処理装置を含む透過電子顕微鏡を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0020】

（１）本発明に係る３次元像構築方法は、
膜タンパク質の３次元像を構築する３次元像構築方法であって、
脂質膜内に存在する前記膜タンパク質を含む試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された、前記試料の第１透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料に、前記脂質膜の膜面に対して垂直に前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第２透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記第１透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを、前記第２透過電子顕微鏡像において対応する前記膜タンパク質の前記脂質膜に垂直な軸に対する回転角から特定する工程と、
前記第１透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の粒子像を取り出し、取り出した前記粒子像を、前記膜タンパク質の向きを特定する工程で特定された前記膜タンパク質の向きで分類し、分類された前記粒子像を平均化して、前記膜タンパク質の３次元像を構築する工程と、
を含み、
前記第１透過電子顕微鏡像の撮影の後に、前記第２透過電子顕微鏡像の撮影が行われ、
前記第２透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量よりも大きい。

【0021】

このような３次元像構築方法では、脂質膜の膜面に対して垂直に電子線を入射して撮影された第２透過電子顕微鏡像に基づいて、脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された第１透過電子顕微鏡像の膜タンパク質の向きを特定して、膜タンパク質の３次元像を構築することができる。したがって、このような３次元像構築方法では、脂質膜内に存在する膜タンパク質の３次元像を構築することができる。

【0024】

（２）本発明に係る３次元像構築方法において、
前記試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して前記第１透過電子顕微鏡像の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第３透過電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記第２透過電子顕微鏡像に基づいて、前記第３透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを特定する工程と、
を含み、
前記膜タンパク質の３次元像を構築する工程では、特定された前記膜タンパク質の向きの情報に基づいて、前記第１透過電子顕微鏡像および前記第３透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の３次元像を構築してもよい。

【0025】

このような３次元像構築方法では、互いに電子線の入射角度の異なる第１透過電子顕微鏡像および第３透過電子顕微鏡像から、３次元像を構築することができるため、より高分解能の３次元像を構築することができる。

【0026】

（３）本発明に係る３次元像構築方法において、
前記第２透過電子顕微鏡像を撮影するときの前記試料に対する前記電子線のドーズ量は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときの前記試料に対する前記電子線のドーズ量よりも多くてもよい。

【0027】

このような３次元像構築方法では、高いコントラストを達成するために第１透過電子顕微鏡像とは異なる焦点条件で撮影することができる第２透過電子顕微鏡像を得ることができ、かつ、試料損傷の少ない第１透過電子顕微鏡像を得ることができる。

【0030】

（４）本発明に係る画像処理装置は、
膜タンパク質の３次元像を構築する画像処理装置であって、
脂質膜内に存在する前記膜タンパク質を含む試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された、前記試料の第１透過電子顕微鏡像を取得する第１像取得部と、
前記試料に、前記脂質膜の膜面に対して垂直に前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第２透過電子顕微鏡像を取得する第２像取得部と、
前記第１透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを、前記第２透過電子顕微鏡像において対応する前記膜タンパク質の前記脂質膜に垂直な軸に対する回転角から特定する向き特定部と、
前記第１透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の粒子像を取り出し、取り出した前記粒子像を、前記膜タンパク質の向きを特定する工程で特定された前記膜タンパク質の向きで分類し、分類された前記粒子像を平均化して、前記膜タンパク質の３次元像を構築する３次元像構築部と、
を含み、
前記第２透過電子顕微鏡像は、前記第１透過電子顕微鏡像の撮影の後に撮影されたものであり、
前記第２透過電子顕微鏡像は、前記第１透過電子顕微鏡像を撮影するときのデフォーカス量よりも大きいデフォーカス量で撮影されたものである。

【0031】

このような画像処理装置では、脂質膜の膜面に対して垂直に電子線を入射して撮影された第２透過電子顕微鏡像に基づいて、脂質膜の膜面の垂線に対して傾いた方向から電子線を入射して撮影された第１透過電子顕微鏡像の膜タンパク質の向きを特定して、膜タンパク質の３次元像を構築することができる。したがって、このような画像処理装置では、脂質膜内に存在する膜タンパク質の３次元像を構築することができる。

【0034】

（５）本発明に係る画像処理装置において、
前記試料に、前記脂質膜の膜面の垂線に対して前記第１透過電子顕微鏡像の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から前記電子線を入射して撮影された、前記試料の第３透過電子顕微鏡像を取得する第３像取得部を含み、
前記向き特定部は、前記第２透過電子顕微鏡像に基づいて、前記第３透過電子顕微鏡像の前記膜タンパク質の向きを特定し、
前記３次元像構築部は、特定された前記膜タンパク質の向きの情報に基づいて、前記第１透過電子顕微鏡像および前記第３透過電子顕微鏡像から前記膜タンパク質の３次元像を構築してもよい。

【0035】

このような画像処理装置では、互いに電子線の入射角度の異なる第１透過電子顕微鏡像および第３透過電子顕微鏡像から、３次元像を構築することができるため、より高分解能の３次元像を構築することができる。

【0036】

（６）本発明に係る電子顕微鏡は、
本発明に係る画像処理装置を含む。

【0037】

このような電子顕微鏡では、本発明に係る画像処理装置を含むため、脂質膜内に存在する膜タンパク質の３次元像を構築することができる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１は、試料を模式的に示す斜視図である。

【図2】図２は、試料を模式的に示す平面図である。

【図3】図３は、第１実施形態に係る画像処理装置を含む電子顕微鏡の構成を模式的に示す図である。

【図4】図４は、第１実施形態に係る画像処理装置の３次元像構築部の処理を説明するための図である。

【図5】図５は、第１実施形態に係る３次元像構築方法の一例を示すフローチャートである。

【図6】図６は、６０°傾斜像を撮影する際の試料の状態を模式的に示す斜視図である。

【図7】図７は、非傾斜像を撮影する際の試料の状態を模式的に示す斜視図である。

【図8】図８は、非傾斜像の膜タンパク質を模式的に示す図である。

【図9】図９は、精製されていない膜タンパク質を含む試料の、６０°傾斜像を撮影する際の状態を模式的に示す斜視図である。

【図10】図１０は、精製されていない膜タンパク質を含む試料の、非傾斜像を撮影する際の状態を模式的に示す斜視図である。

【図11】図１１は、第２実施形態に係る画像処理装置を含む電子顕微鏡の構成を模式的に示す図である。

【図12】図１２は、第２実施形態に係る３次元像構築方法の一例を示すフローチャートである。

【図13】図１３は、界面活性剤を用いて可溶化して単粒子解析を行う際の膜タンパク質の状態を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

【0040】

１． 第１実施形態
１．１． 試料
まず、構造解析（３次元像構築）の対象となる試料について説明する。図１は、構造解析の対象となる試料２を模式的に示す斜視図である。図２は、試料２を模式的に示す平面図である。なお、図２では、便宜上、脂質膜３の図示を省略している。

【0041】

試料２は、脂質膜（脂質二重膜）３内に存在する膜タンパク質４を含む。膜タンパク質４は、図１に示すように、脂質膜３内において脂質膜３の膜面３ａ（例えば脂質膜３の上面）に垂直に存在する。膜タンパク質４は、脂質膜３を、脂質膜３の膜面３ａに垂直な方向に貫通している。また、膜タンパク質４の各粒子は、図１および図２に示すように、様々な方向を向いている。すなわち、膜タンパク質４の各粒子は、脂質膜３の膜面３ａに垂直な軸に対する回転がランダムであり隣り合う粒子との間隔もランダムである。なお、図２の矢印は、膜タンパク質４の各粒子の向きを表している。例えば、図２に示すように、膜タンパク質４の各粒子の向きを示す軸（矢印）と、任意の方向の軸Ａと、がなす角度θは、様々な大きさとなる。角度θは、膜タンパク質４の各粒子の、脂質膜３の膜面３ａに垂直な軸に対する回転角ということもできる。膜タンパク質４の向き（各粒子の向き）は、回転角θで表すこともできる。

【0042】

試料２は、例えば、界面活性剤を用いて膜タンパク質４を精製し、精製された膜タンパク質４に脂質分子を加えて透過法で界面活性剤を除き、脂質膜３に再構成して脂質膜３の中に疎に分散した状態の膜タンパク質４を含む脂質膜断片を作製することで得られる。

【0043】

試料２としては、上記のように、膜タンパク質４が精製されて、膜タンパク質４が疎に脂質膜３内に分散した試料が望ましい。膜タンパク質４の分散の程度は、脂質とタンパク質の混合比（ＬＰＲ： ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒａｔｉｏ）を調整することによって制御することができる。

【0044】

また、試料２は、膜タンパク質４が互いに比較的近い状態で分散しているが、結晶性は示さない状態の膜断片であってもよい。また、試料２は、界面活性剤で精製していない膜タンパク質であってもよい。

【0045】

試料２は、カーボン膜５で支持されている。カーボン膜５は、原子レベルで平坦であることが望ましい。

【0046】

試料２は、例えば、氷包埋される。具体的には、まず、スパークを飛ばすことなく雲母劈開面上に真空蒸着して作製されたカーボン膜５に試料２を吸着させて、余分なバッファー液をろ紙で吸い取る。そして、カーボン膜５に吸着された試料２を、液体エタンに落下させて急速凍結を行うことにより、試料２を氷包埋する。氷包埋された試料２は、電子顕微鏡の試料ステージ（冷却ステージ）に装着される。

【0047】

１．２． 画像処理装置および電子顕微鏡
次に、第１実施形態に係る画像処理装置を含む電子顕微鏡１０００について図面を参照しながら説明する。図３は、第１実施形態に係る画像処理装置１００を含む電子顕微鏡１０００の構成を模式的に示す図である。

【0048】

電子顕微鏡本体１０は、透過電子顕微鏡である。電子顕微鏡本体１０は、試料２を透過した電子で結像して、透過電子顕微鏡像を得る装置である。ここでは、電子顕微鏡本体１０は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）である例について説明するが、電子顕微鏡本体１０は、走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）であってもよい。

【0049】

電子顕微鏡１０００では、試料２を低温に冷やすことができる。これにより、電子線ＥＢが照射されることによる試料２の損傷を低減することができる。すなわち、電子顕微鏡１０００は、いわゆる低温電子顕微鏡システムである。

【0050】

電子顕微鏡１０００は、図３に示すように、電子顕微鏡本体１０と、画像処理装置１００と、を含む。

【0051】

電子顕微鏡本体１０は、電子線源１１と、集束レンズ１２と、対物レンズ１３と、傾斜機構を有する試料ステージ１４と、試料ホルダー１５と、中間レンズ１６と、投影レンズ１７と、撮像部１８と、を含む。

【0052】

電子線源１１は、電子線ＥＢを発生させる。電子線源１１は、陰極から放出された電子を陽極で加速し電子線ＥＢを放出する。電子線源１１としては、例えば、電子銃を用いることができる。電子線源１１として用いられる電子銃は特に限定されず、例えば熱電子放出型や、熱電界放出型、冷陰極電界放出型などの電子銃を用いることができる。

【0053】

集束レンズ（コンデンサーレンズ）１２は、電子線源１１の後段（電子線ＥＢの下流側）に配置されている。集束レンズ１２は、電子線源１１で発生した電子線ＥＢを集束して試料２に照射するためのレンズである。集束レンズ１２は、図示はしないが、複数のレンズを含んで構成されていてもよい。

【0054】

対物レンズ１３は、集束レンズ１２の後段に配置されている。対物レンズ１３は、試料２を透過した電子線ＥＢで結像するための初段のレンズである。対物レンズ１３は、図示はしないが、上部磁極（ポールピースの上極）、および下部磁極（ポールピースの下極）を有している。対物レンズ１３では、上部磁極と下部磁極との間に磁場を発生させて電子線ＥＢを集束させる。

【0055】

試料ステージ１４は、試料２を保持する。図示の例では、試料ステージ１４は、試料ホルダー１５を介して、試料２を保持している。試料ステージ１４は、例えば、対物レンズ１３の上部磁極と下部磁極との間に試料２を位置させる。試料ステージ１４は、試料ホルダー１５を移動および静止させることにより、試料２の位置決めを行うことができる。試料ステージ１４は、試料２を水平方向（電子線ＥＢの進行方向に対して直交する方向）や鉛直方向（電子線ＥＢの進行方向に沿う方向）に移動させることができる。試料ステージ１４は、さらに、試料２を傾斜させることができる。試料ステージ１４は画像処理装置１００との連結が行われ、画像処理装置１００は試料が移動、傾斜するように試料ステージ１４を制御する。

【0056】

試料ステージ１４は、図示の例では、対物レンズ１３のポールピース（図示せず）の横から試料２を挿入するサイドエントリーステージである。なお、図示はしないが、試料ステージ１４は、ポールピースの上方から試料２を挿入するトップエントリーステージであってもよい。

【0057】

試料ステージ１４は、試料２を冷却することが可能な冷却ステージである。試料ステージ１４では、例えば、試料ホルダー１５に液体窒素や、液体ヘリウムを導入して試料２を冷却することができる。

【0058】

中間レンズ１６は、対物レンズ１３の後段に配置されている。投影レンズ１７は、中間レンズ１６の後段に配置されている。中間レンズ１６および投影レンズ１７は、対物レンズ１３によって結像された像をさらに拡大し、撮像部１８に結像させる。電子顕微鏡１０００では、対物レンズ１３、中間レンズ１６、および投影レンズ１７によって、結像系が構成されている。中間レンズ１６は、図示はしないが、複数のレンズを含んで構成されていてもよい。

【0059】

撮像部１８は、結像系によって結像された透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ像）を撮影する。撮像部１８は、例えば、ＣＣＤカメラや、ＣＭＯＳカメラ等のデジタルカメラである。撮像部１８は、撮影した透過電子顕微鏡像の情報を画像処理装置１００に出力する。

【0060】

電子顕微鏡本体１０は、図示の例では、除振器２０を介して架台２２上に設置されている。

【0061】

画像処理装置１００は、電子顕微鏡本体１０で撮影された試料２の透過電子顕微鏡像に基づいて、膜タンパク質４の３次元像を構築するための装置である。画像処理装置１００は、図３に示すように、処理部１１０と、操作部１２０と、表示部１２２と、記憶部１２４と、情報記憶媒体１２６を、を含む。

【0062】

操作部１２０は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、処理部１１０に送る処理を行う。操作部１２０は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイクなどである。

【0063】

表示部１２２は、処理部１１０によって生成された画像を表示するものであり、その機能は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどにより実現できる。表示部１２２は、例えば、処理部１１０で生成された膜タンパク質４の投影像、および、３次元像を表示する。

【0064】

記憶部１２４は、処理部１１０のワーク領域となるもので、その機能はＲＡＭなどにより実現できる。記憶部１２４は、処理部１１０が各種の計算処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部１２４は、処理部１１０の作業領域として用いられ、処理部１１０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。

【0065】

情報記憶媒体１２６（コンピューターにより読み取り可能な媒体）は、プログラムやデータなどを格納するものであり、その機能は、光ディスク（ＣＤ、ＤＶＤ）、光磁気ディスク（ＭＯ）、磁気ディスク、ハードディスク、磁気テープ、或いはメモリ（ＲＯＭ）などにより実現できる。処理部１１０は、情報記憶媒体１２６に格納されるプログラム（データ）に基づいて本実施形態の種々の処理を行う。情報記憶媒体１２６には、処理部１１０の各部としてコンピューターを機能させるためのプログラムを記憶することができる。

【0066】

処理部１１０は、記憶部１２４に記憶されているプログラムに従って、各種の計算処理を行う。処理部１１０は、記憶部１２４に記憶されているプログラムを実行することで、以下に説明する、第１像取得部１１２、第２像取得部１１４、向き特定部１１６、３次元像構築部１１８として機能する。処理部１１０の機能は、各種プロセッサ（ＣＰＵ、ＤＳＰ等）、ＡＳＩＣ（ゲートアレイ等）などのハードウェアや、プログラムにより実現できる。なお、処理部１１０の少なくとも一部をハードウェア（専用回路）で実現してもよい。処理部１１０は、第１像取得部１１２と、第２像取得部１１４と、向き特定部１１６と、３次元像構築部１１８と、を含む。

【0067】

第１像取得部１１２は、撮像部１８から出力された像情報を取り込むことで、試料２に脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された透過電子顕微鏡像（第１透過電子顕微鏡像、以下「傾斜像」ともいう）を取得する。例えば、第１像取得部１１２は、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して６０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された６０°傾斜像を取得する。なお、第１像取得部１１２が取得する傾斜像を撮影するときの電子線ＥＢの傾きは、６０°に限定されない角度であり、例えば、０°から７０°の任意の角度である。

【0068】

第２像取得部１１４は、撮像部１８から出力された像情報を取り込むことで、試料２の傾斜像を撮影した試料２の領域と同じ領域に脂質膜３の膜面３ａに対して垂直に電子線ＥＢを入射して撮影された透過電子顕微鏡像（第２透過電子顕微鏡像、以下「非傾斜像」ともいう）を取得する。

【0069】

向き特定部１１６は、非傾斜像に基づいて、傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する。向き特定部１１６は、傾斜像の膜タンパク質４の各粒子の向きを、非傾斜像において対応する膜タンパク質４の粒子の向きから特定する。膜タンパク質４の向きは、例えば、膜タンパク質４の各粒子の、脂質膜３の膜面３ａに垂直な軸に対する回転（回転角θ、図２参照）として表わされる。すなわち、向き特定部１１６は、膜タンパク質４の向きの情報として、膜タンパク質４の各粒子の回転角θの情報を生成する。

【0070】

３次元像構築部１１８は、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。

【0071】

図４は、３次元像構築部１１８の処理を説明するための模式図である。３次元像構築部１１８は、まず、傾斜像から膜タンパク質４の各粒子の像（粒子像）を取り出す。そして、向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の各粒子の向きの情報（回転角θの情報など）を加味して、取り出した粒子像を膜タンパク質４の向き（回転角θなど）で分類する（クラス分けする）。そして、分類された同一の投影粒子像、すなわち、膜タンパク質４の向きが同じまたは向きが近い粒子像（同じクラスに属する粒子像）を、平均化する。これにより、膜タンパク質４の向きごとに（すなわち、投影方向ごとに）平均化された粒子像４ｍ_１，４ｍ_２，４ｍ_３，・・・、４ｍ_ｎ（ｎは２以上の整数、図示の例ではｎ＝１２）が得られる。３次元像構築部１１８は、平均化された粒子像４ｍ_１，４ｍ_２，４ｍ_３，・・・、４ｍ_ｎを用いて、単粒子解析法と同様に逆投影法によって、膜タンパク質４の３次元像を構築する。この模式図（図４）は描画の都合上平面的に描写されているが、立体的に再構成するものである。

【0072】

１．３． ３次元像構築方法
次に、第１実施形態に係る画像処理装置１００を含む電子顕微鏡１０００を用いた、膜タンパク質４の３次元像を構築する方法について、図面を参照しながら説明する。図５は、第１実施形態に係る３次元像構築方法の一例を示すフローチャートである。

【0073】

まず、低い倍率条件（例えば、デフォーカスした回折像条件）で試料を非傾斜にした条件で、最適視野（撮影する試料）を選択する（ステップＳ１）。次に、その選択した試料位置の６０°傾斜像が撮影できるように、試料を６０°傾斜させる。そして、試料２に、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の傾斜像を取得する（ステップＳ１０）。なお、ここでは、６０°傾斜像を取得する例について説明する。

【0074】

図６は、６０°傾斜像を撮影する際の試料２の状態を模式的に示す斜視図である。なお、図６に示す矢印は、電子線ＥＢの入射方向を表している。６０°傾斜像は、図６に示すように、試料ステージ１４によって試料ホルダー１５に保持された試料２を６０°傾斜させた状態で撮影される。これにより、試料２に、脂質膜３の膜面３ａに対して６０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射することができ、６０°傾斜像が得られる。

【0075】

第１像取得部１１２は、このようにして撮影された６０°傾斜像の像情報を取り込み、６０°傾斜像を取得する。

【0076】

次に、試料２の６０°傾斜像を撮影した領域に、脂質膜３の膜面３ａに対して垂直に電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の非傾斜像を取得する（ステップＳ１２）。

【0077】

図７は、非傾斜像を撮影する際の試料２の状態を模式的に示す斜視図である。なお、図７に示す矢印は、電子線ＥＢの入射方向を表している。非傾斜像は、図７に示すように、試料ステージ１４によって試料ホルダー１５に保持された試料２を傾斜させずに、例えば水平な状態で撮影される。これにより、試料２に脂質膜３の膜面３ａに垂直な方向から電子線ＥＢを入射することができる。非傾斜像は、６０°傾斜像と同じ視野で撮影される。なお、６０°傾斜像と非傾斜像とは、完全に同じ視野でなくてもよく、６０°傾斜像と非傾斜像に、試料２の同じ領域が含まれていればよい。

【0078】

非傾斜像を撮影するときの試料２に対する電子線ＥＢのドーズ量は、６０°傾斜像を撮影するときの試料２に対する電子線ＥＢのドーズ量と同じか、あるいは多くなるような条件で撮影される。

【0079】

なお、膜タンパク質４が比較的分子量が小さい膜タンパク質の場合には、非傾斜像のコントラストが低くなってしまう場合がある。その場合には、非傾斜像を、傾斜像よりも大きいデフォーカス（ｄｅｆｏｃｕｓ）条件で撮影する。これにより、非傾斜像において高いコントラストを得ることができる。

【0080】

ただし、３次元像の構築に用いられる傾斜像は、比較的小さい（例えば非傾斜像よりも小さい）デフォーカス（ｄｅｆｏｃｕｓ）条件で撮影する。これは、大きなデフォーカス（ｄｅｆｏｃｕｓ）条件では、コントラスト伝達関数の振動が高分解能側で激しくなるためである。

【0081】

第２像取得部１１４は、このようにして撮影された非傾斜像の像情報を取り込み、非傾斜像を取得する。図８は、非傾斜像の膜タンパク質４を模式的に示す図である。図８に示すように、非傾斜像は、膜タンパク質４を脂質膜３の膜面３ａから垂直な方向から撮影した像となる。

【0082】

このように、画像処理装置１００では、同じ視野で撮影された６０°傾斜像と非傾斜像のペアを取得する。なお、画像処理装置１００は、６０°傾斜像と非傾斜像のペアを１つ取得してもよいし、６０°傾斜像と非傾斜像のペアを複数取得してもよい。なお、６０°傾斜像および非傾斜像の撮影は、オペレーターによって手動で行われてもよいし、電子顕微鏡本体１０を制御する制御部（図示せず）によって自動で行われてもよい。

【0083】

次に、向き特定部１１６が、非傾斜像に基づいて、６０°傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する（ステップＳ１４）。

【0084】

向き特定部１１６は、６０°傾斜像の膜タンパク質４の各粒子の向きを、非傾斜像において対応する膜タンパク質４の粒子の向きから特定する。ここで、非傾斜像は、図８に示すように、膜タンパク質４を脂質膜３の膜面３ａに垂直な方向から撮影した像である。そのため、非傾斜像から、膜タンパク質４の各粒子の向き、すなわち、膜タンパク質４の各粒子の、脂質膜３の膜面３ａに垂直な軸に対する回転（回転角θ）を正確に特定することができる。

【0085】

次に、３次元像構築部１１８が、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、６０°傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。

【0086】

具体的には、３次元像構築部１１８は、まず、６０°傾斜像から膜タンパク質４の各粒子の像（６０°粒子像）を取り出す。そして、向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の各粒子の向きの情報を加味して、取り出した６０°粒子像を膜タンパク質４の各粒子の向きで分類する（クラス分けする）（ステップＳ１６）。そして、分類された６０°粒子像、すなわち、膜タンパク質４の粒子の向きが同じまたは向きが近い６０°粒子像を、平均化する（ステップＳ１７）。これにより、膜タンパク質４の粒子の向きごとに（投影方向ごとに）、平均化された６０°粒子像が得られる。３次元像構築部１１８は、平均化された６０°粒子像を用いて、単粒子解析法と同様に逆投影法などによって、膜タンパク質４の３次元像を構築することができる（ステップＳ１８）。次に、３次元像構築部１１８は、構築した３次元像に対して精密化を行う必要があるか否かを判定する（ステップＳ１９）。精密化が必要と判定した場合（ステップＳ１９でＹｅｓの場合）、ステップＳ１４に戻り、ステップＳ１４〜ステップＳ１９の処理を行う。そして、精密化が必要ないと判定した場合（ステップＳ１９でＮｏの場合）、処理を終了する。

【0087】

以上の工程により、膜タンパク質４の３次元像を得ることができる。

【0088】

第１実施形態に係る３次元像構築方法および画像処理装置１００は、例えば、以下の特徴を有する。

【0089】

第１実施形態に係る３次元像構築方法では、試料２の傾斜像を取得する工程（ステップＳ１０）と、試料２の非傾斜像を取得する工程（ステップＳ１２）と、非傾斜像に基づいて、傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する工程（ステップＳ１４）と、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する工程（ステップＳ１８）と、を含む。このように、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、非傾斜像に基づいて傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定して、膜タンパク質４の３次元像を構築することができる。したがって、脂質膜３内に存在する膜タンパク質４の３次元像を構築することができる。なお、必要に応じて、３次元像を構築した結果をステップＳ１４に繰り返しフィードバックさせて、膜タンパク質の向きの特定をさらに精密化することができる。これにより、解像できる分解能と解析精度を向上させることができる。

【0090】

また、非傾斜像は、膜タンパク質４を脂質膜３の膜面３ａに垂直な方向から撮影した像であるため、例えば傾斜像と比べて、膜タンパク質４の各粒子の向きを正確に特定することができる。したがって、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、高分解能の３次元像を得ることができる。

【0091】

このように、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、脂質膜３内に存在する膜タンパク質４の３次元像を得ることができるため、例えば界面活性剤で可溶化しようとすると変性してしまう膜タンパク質の３次元像を得ることができる。すなわち、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、膜タンパク質４を可溶化して精製することなく、３次元像を構築することができる。

【0092】

図９は、精製されていない膜タンパク質４を含む試料２の、６０°傾斜像を撮影する際の状態を模式的に示す斜視図である。図１０は、精製されていない膜タンパク質を含む試料２の、非傾斜像を撮影する際の状態を模式的に示す斜視図である。図９および図１０に示すように、標的以外の多くの膜タンパク質４ｂがある状態でも、非傾斜像から標的膜タンパク質４ａを選択して３次元像を構築することができる。非傾斜像では、多様な膜タンパク質が存在する場合でも、傾斜像と比べて、標的膜タンパク質４ａを選択しやすいため、標的膜タンパク質４ａの３次元像の構築が容易である。

【0093】

第１実施形態に係る３次元像構築方法では、膜タンパク質４の３次元像を構築する工程（ステップＳ１８）では、傾斜像から複数の膜タンパク質４の粒子像を取り出し、取り出した粒子像を膜タンパク質４の向きで分類し、分類された粒子像を平均化して、膜タンパク質４の３次元像を構築する。このように、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、分類された粒子像を平均化して３次元像を構築するため、３次元像を構築するための粒子像のＳＮ比を向上させることができ、高分解能の３次元像を構築することができる。

【0094】

ここで、非傾斜像は、３次元構築には用いられないため、傾斜像に比べて試料損傷が許容されるが、膜タンパク質４の向きを特定するために高いコントラストであることが望ましい。また、傾斜像は、３次元構築に用いられるため、試料損傷が少ないことが望ましい。第１実施形態に係る３次元像構築方法において、非傾斜像を撮影するときの試料２に対する電子線ＥＢのドーズ量は、傾斜像を撮影するときの試料２に対する電子線ＥＢのドーズ量よりも多くすれば、高いコントラストと高いＳＮ比の非傾斜像を得ることができ、かつ試料損傷の少ない傾斜像を得ることができる。

【0095】

また、第１実施形態に係る３次元像構築方法では、傾斜像を撮影した後に、非傾斜像を撮影するため、非傾斜像を撮影した後に傾斜像を撮影する場合と比べて、試料損傷の少ない傾斜像を得ることができる。

【0096】

画像処理装置１００では、向き特定部１１６が脂質膜３内に存在する膜タンパク質４を含む試料２の非傾斜像に基づいて、傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定し、３次元像構築部１１８が向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、試料２の傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。このように画像処理装置１００では、非傾斜像に基づいて傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定して、膜タンパク質４の３次元像を構築することができる。したがって、脂質膜３内に存在する膜タンパク質４の３次元像を構築することができる。

【0097】

画像処理装置１００では、３次元像構築部１１８は、傾斜像の複数の膜タンパク質４の粒子像を取り出し、取り出した粒子像を膜タンパク質４の向きで分類し、分類された粒子像を平均化して、膜タンパク質４の３次元像を構築する。そのため、画像処理装置１００では、高分解能の３次元像を構築することができる。

【0098】

電子顕微鏡１０００では、画像処理装置１００を含むため、脂質膜３内に存在する膜タンパク質４の３次元像を構築することができる。

【0099】

２． 第２実施形態
２．１． 画像処理装置および電子顕微鏡
次に、第２実施形態に係る画像処理装置を含む電子顕微鏡について図面を参照しながら説明する。図１１は、第２実施形態に係る画像処理装置２００を含む電子顕微鏡２０００の構成を模式的に示す図である。以下、第２実施形態に係る画像処理装置および電子顕微鏡において、第１実施形態に係る画像処理装置１００および電子顕微鏡本体１０の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。

【0100】

画像処理装置２００では、図１１に示すように、処理部１１０は、第３像取得部２１０を含んで構成されている。

【0101】

第３像取得部２１０は、撮像部１８から出力された像情報を取り込むことで、試料２に脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して、第１像取得部１１２が取得した傾斜像（以下、「第１傾斜像」ともいう）の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された傾斜像（第３透過電子顕微鏡像、以下「第２傾斜像」ともいう）を取得する。

【0102】

例えば、第１像取得部１１２は、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して６０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された６０°傾斜像を取得し、第３像取得部２１０は、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して２０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された２０°傾斜像を取得する。

【0103】

第３像取得部２１０が取得する第２傾斜像は、第１傾斜像と異なる視野である。このとき、第２像取得部１１４は、第１傾斜像と同じ視野の非傾斜像と、第２傾斜像と同じ視野の非傾斜像と、を取得する。なお、第３像取得部２１０が取得する第２傾斜像は、第１傾斜像と同じ視野であってもよい。また、第１像取得部１１２が取得する第１傾斜像を撮影するときの電子線ＥＢの傾き、および第３像取得部２１０が取得する第２傾斜像を撮影するときの電子線ＥＢの傾きは、６０°、２０°に限定されない。

【0104】

向き特定部１１６は、非傾斜像に基づいて、第１傾斜像の膜タンパク質４の向きおよび第２傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する。向き特定部１１６は、第２傾斜像の膜タンパク質４の各粒子の向きを、第２傾斜像と同じ視野の非傾斜像において対応する膜タンパク質４の粒子の向きから特定する。

【0105】

３次元像構築部１１８は、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、第１傾斜像および第２傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。

【0106】

３次元像構築部１１８は、まず、第１傾斜像から膜タンパク質４の各粒子の像（粒子像）を取り出す。そして、向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の各粒子の向きの情報を加味して、取り出した粒子像を膜タンパク質４の向きで分類する。そして、分類された粒子像、すなわち、膜タンパク質４の向きが同じまたは近い粒子像を、平均化する。

【0107】

次に、３次元像構築部１１８は、第２傾斜像から膜タンパク質４の各粒子の像（粒子像）を取り出す。そして、向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の各粒子の向きの情報を加味して、取り出した粒子像を膜タンパク質４の向きで分類する。そして、分類された粒子像、すなわち、膜タンパク質４の向きが同じまたは近い粒子像を、平均化する。

【0108】

これにより、膜タンパク質４の向きごとに（投影方向ごとに）、平均化された粒子像が得られる。３次元像構築部１１８は、平均化された粒子像を用いて、単粒子解析法と同様に逆投影法によって、膜タンパク質４の３次元像を構築する。

【0109】

２．２． ３次元像構築方法
次に、第２実施形態に係る画像処理装置２００を含む電子顕微鏡２０００を用いた、膜タンパク質４の３次元像を構築する方法について、図面を参照しながら説明する。図１２は、第２実施形態に係る３次元像構築方法の一例を示すフローチャートである。図１２に示すフローチャートにおいて、図５に示すフローチャートの同様のステップについては、同じ符号を付して詳細な説明は省略する。

【0110】

まず、最適視野が選択される（ステップＳ１）。この最適視野の選択は、上述した第１実施形態におけるステップＳ１の処理と同様に行われる。そして、その選択した試料位置の６０°傾斜像が撮影できるように、試料を６０°傾斜させる。次に、第１像取得部１１２が、試料２に、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の第１傾斜像（例えば６０°傾斜像）を取得する（ステップＳ１０）。

【0111】

次に、第２像取得部１１４が、試料２の６０°傾斜像を撮影した領域に、脂質膜３の膜面３ａに対して垂直に電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の非傾斜像を取得する（ステップＳ１２）。

【0112】

次に、観察視野を移動してステップＳ１の処理と同様にして最適視野の選択を行う（ステップＳ２０）。試料ステージ１４によって試料２を移動させて、観察視野を移動（変更）する。これにより、次のステップＳ２２で試料２の６０°傾斜像を撮影した領域とは異なる領域を撮影することができる。

【0113】

次に、第３像取得部２１０が、試料２の６０°傾斜像を撮影した領域とは異なる領域に、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して２０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の第２傾斜像（例えば２０°傾斜像）を取得する（ステップＳ２２）。

【0114】

２０°傾斜像は、試料ステージ１４によって試料ホルダー１５に保持された試料２を２０°傾斜させた状態で撮影される。これにより、試料２に、脂質膜３の膜面３ａに対して２０°傾いた方向から電子線ＥＢを入射することができ、２０°傾斜像が得られる。

【0115】

第３像取得部２１０は、このようにして撮影された２０°傾斜像の情報を取り込み、２０°傾斜像を取得する。

【0116】

次に、第２像取得部１１４が、２０°傾斜像を撮影した領域に、脂質膜３の膜面３ａに対して垂直に電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の非傾斜像を取得する（ステップＳ２４）。

【0117】

なお、６０°傾斜像と２０°傾斜像とは同じ視野であってもよい。

【0118】

次に、向き特定部１１６が、非傾斜像に基づいて、６０°傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する（ステップＳ１４）。

【0119】

次に、向き特定部１１６が、非傾斜像に基づいて、２０°傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する（ステップＳ２６）。ステップＳ２６の処理は、ステップＳ１４の処理と同様に行われる。

【0120】

次に、３次元像構築部１１８は、まず、取得した６０°傾斜像から膜タンパク質４の各粒子の像（６０°粒子像）を取り出す。そして、向き特定部１１６で特定された膜タンパク質４の各粒子の向きの情報を加味して、取り出した６０°粒子像を膜タンパク質４の各粒子の向きで分類する（クラス分けする）（ステップＳ２８）。そして、分類された６０°粒子像、すなわち、膜タンパク質４の粒子の向きが同じまたは向きが近い６０°粒子像を、平均化する（ステップＳ３０）。３次元像構築部１１８は、同様にして、取得した２０°傾斜像（第２傾斜像）に対してクラス分け（ステップＳ３２）と平均化（ステップＳ３４）を行う。次に、３次元像構築部１１８は、膜タンパク質４の粒子の向きごとに平均化された６０°粒子像と２０°粒子像を用いて、膜タンパク質４の３次元像を構築する（ステップＳ１８）。次に、３次元像構築部１１８は、構築した３次元像に対して精密化を行う必要があるか否かを判定する（ステップＳ１９）。精密化が必要と判定した場合（ステップＳ１９でＹｅｓの場合）、ステップＳ１４に戻り、ステップＳ１４〜ステップＳ１９の処理を行う。そして、精密化が必要ないと判定した場合（ステップＳ１９でＮｏの場合）、処理を終了する。なお、３次元像構築部１１８は、取得した６０°傾斜像と２０°傾斜像とを比較することにより、わずかに構造が変化した膜タンパク質４を含む場合でも、正確に傾斜像のクラス分けを行うことができる。

【0121】

以上の工程により、膜タンパク質４の３次元像を得ることができる。

【0122】

第２実施形態に係る３次元像構築方法および画像処理装置２００は、第１実施形態に係る３次元構築方法および画像処理装置１００と同様の効果に加えて以下の効果を有する。

【0123】

第２実施形態に係る３次元像構築方法は、試料２に、脂質膜３の膜面３ａの垂線に対して第１傾斜像の撮影のときとは異なる角度で傾いた方向から電子線ＥＢを入射して撮影された、試料２の第２傾斜像を取得する工程（ステップＳ２２）と、非傾斜像に基づいて、第２傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定する工程（ステップＳ２４）と、を含み、膜タンパク質４の３次元像を構築する工程（ステップＳ１８）では、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、第１傾斜像および第２傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。そのため、第２実施形態に係る３次元像構築方法では、傾斜角度（電子線ＥＢの入射角度）の異なる複数の傾斜像を用いて、３次元像を構築することができるため、より高精度で、高分解能の３次元像を構築することができる。

【0124】

画像処理装置２００では、試料２の第２傾斜像を取得する第３像取得部２１０を含み、向き特定部１１６は、非傾斜像に基づいて、第２傾斜像の膜タンパク質４の向きを特定し、３次元像構築部１１８は、特定された膜タンパク質４の向きの情報に基づいて、第１傾斜像および第２傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築する。そのため、画像処理装置２００では、より高分解能の３次元像を構築することができる。

【0125】

なお、第２実施形態では、６０°傾斜像、２０°傾斜像から膜タンパク質４の３次元像を構築したが、その他の角度の傾斜像も含めて３次元像を構築してもよい。例えば、６０°傾斜像、４５°傾斜像、２０°傾斜像、０°傾斜像（非傾斜像）から３次元像を構築してもよい。

【0126】

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

【符号の説明】

【0127】

２…試料、３…脂質膜、４…膜タンパク質、５…カーボン膜、１０…電子顕微鏡本体、１１…電子線源、１２…集束レンズ、１３…対物レンズ、１４…試料ステージ、１５…試料ホルダー、１６…中間レンズ、１７…投影レンズ、１８…撮像部、２０…除振器、２２…架台、１００…画像処理装置、１１０…処理部、１１２…第１像取得部、１１４…第２像取得部、１１６…向き特定部、１１８…３次元像構築部、１２０…操作部、１２２…表示部、１２４…記憶部、１２６…情報記憶媒体、２００…画像処理装置、２１０…第３像取得部、１０００…電子顕微鏡、２０００…電子顕微鏡

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】