特許 6584466 養子移入Ｔリンパ球における副刺激リガンドの構成性発現

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6584466

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】養子移入Ｔリンパ球における副刺激リガンドの構成性発現

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20190919BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20190919BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20190919BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190919BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20190919BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190919BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12N5/10

   A61K35/17 Z

   A61K38/19

   A61K38/20

   A61P35/00

   A61P37/02

   A61P43/00 121

【請求項の数】40

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2017-179657(P2017-179657)

(22)【出願日】2017年9月20日

(62)【分割の表示】特願2015-138565(P2015-138565)の分割

【原出願日】2008年3月31日

(65)【公開番号】特開2018-50620(P2018-50620A)

(43)【公開日】2018年4月5日

【審査請求日】2017年10月19日

(31)【優先権主張番号】60/921,144

(32)【優先日】2007年3月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100158872

【弁理士】

【氏名又は名称】牛山 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(72)【発明者】

【氏名】マイケル サデレイン

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス シュテファン

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２３０８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Cell Mol Immunol., 2004, Vol.1, p.357-366

【文献】 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1994, Vol.91, p.12659-12663

【文献】 The Journal of Immunology, 1998, Vol.161, p.513-519

【文献】 AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, 2001, Vol.17, p.233-242

【文献】 International Immunology, 1997, Vol.9, p.1259-1269

【文献】 Cancer Res, 2006, Vol.66, p.6793-6799

【文献】 Mol Ther，２００６年，Vol.13, Supplement 1，p.S103, Abstract No.269

【文献】 Blood，２００５年，Vol.106, No.11，p.372a, Abstract No.1278

【文献】 The EMBO Journal, 1987, Vol.6, p.2705-2709

【文献】 Journal of Experimental Hematology, 2000, Vol.8, p.118-121

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び
ｂ）組換え副刺激リガンドをコードする核酸
を含有し、該副刺激リガンドがサイトカインである、免疫応答性細胞。

【請求項2】

免疫応答性細胞が、Ｔ細胞である、請求項１に記載の免疫応答性細胞。

【請求項3】

サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１からなる、請求項１又は２に記載の免疫応答性細胞。

【請求項4】

サイトカインが、ＩＬ−１２である、請求項１〜３の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項5】

免疫応答性細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からなる、請求項１〜４の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項6】

核酸が、組換え核酸である、請求項１〜５の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項7】

核酸が、ベクターに含有される、請求項１〜６の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項8】

ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７に記載の免疫応答性細胞。

【請求項9】

ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項８に記載の免疫応答性細胞。

【請求項10】

レトロウイルスベクターが、ガンマ−レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項９に記載の免疫応答性細胞。

【請求項11】

抗原が、腫瘍抗原である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項12】

腫瘍抗原が、固形腫瘍で発現される、請求項１１に記載の免疫応答性細胞。

【請求項13】

固形腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、請求項１２に記載の免疫応答性細胞。

【請求項14】

腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、Ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、及びメソセリンからなる群より選択される、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項15】

腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、Ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、又はメソセリンを発現する腫瘍によって発現される、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項16】

ＣＡＲが、ζ鎖シグナル伝達ドメインを含有してなる、請求項１〜１５の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項17】

ＣＡＲが、さらにＣＤ２８シグナル伝達エレメント及び／又は４−１ＢＢシグナル伝達エレメントを含有してなる、請求項１〜１６の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項18】

ＣＡＲが、ＣＤ２８シグナル伝達エレメントを含有してなる、請求項１〜１７の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項19】

ＣＡＲが、Ｐ２８ｚである、請求項１８に記載の免疫応答性細胞。

【請求項20】

免疫応答性細胞がＴ細胞であり、サイトカインがＩＬ−１２からなり、抗原が前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される固形腫瘍で発現される、請求項１〜１９の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項21】

請求項１〜２０の何れか一項に記載の免疫応答性細胞の有効量、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有してなる、医薬組成物。

【請求項22】

請求項２に記載のＴ細胞の有効量、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有してなる、医薬組成物。

【請求項23】

請求項２０に記載のＴ細胞の有効量、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有してなる、医薬組成物。

【請求項24】

請求項１〜２０の何れか一項に記載の免疫応答性細胞を含有してなる、腫瘍、自己免疫障害又は同種移植に関連する症状の治療又は予防に使用するためのキット。

【請求項25】

腫瘍が、固形腫瘍である、請求項２４に記載のキット。

【請求項26】

固形腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、請求項２５に記載のキット。

【請求項27】

対象における免疫応答の調節に使用するための、請求項１〜２０の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項28】

免疫応答性細胞が、免疫応答を増大若しくは低下させる、又は、臓器移植に対する自己寛容若しくは耐性を増大させる、請求項２７に記載の使用のための免疫応答性細胞。

【請求項29】

対象における免疫応答の調節に使用するための、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の医薬組成物。

【請求項30】

医薬組成物が、免疫応答を増大若しくは低下させる、又は、臓器移植に対する自己寛容若しくは耐性を増大させる、請求項２９に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項31】

対象における腫瘍の治療又は予防に使用するための、請求項１〜２０の何れか一項に記載の免疫応答性細胞。

【請求項32】

腫瘍が、固形腫瘍である、請求項３１に記載の使用のための免疫応答性細胞。

【請求項33】

固形腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、請求項３２に記載の使用のための免疫応答性細胞。

【請求項34】

対象における腫瘍の治療又は予防に使用するための、請求項２に記載のＴ細胞。

【請求項35】

対象における腫瘍の治療又は予防に使用するための、請求項２０に記載のＴ細胞。

【請求項36】

腫瘍が、固形腫瘍である、請求項３４又は３５に記載の使用のためのＴ細胞。

【請求項37】

固形腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、請求項３６に記載の使用のためのＴ細胞。

【請求項38】

対象における腫瘍の治療又は予防に使用するための、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の医薬組成物。

【請求項39】

腫瘍が、固形腫瘍である、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項40】

固形腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、請求項３９に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本出願は米国仮特許出願第６０／９２１，１４４号（２００７年３月３０日出願）の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

この本文において引用される特許出願及び特許のそれぞれ、同様にまた、（それぞれの発行された特許の審査手続き期間中を含めて）特許出願及び特許のそれぞれにおいて引用されるそれぞれの文書又は参考文献（「出願引用文献」）、また、これらの特許出願及び特許のいずれかに対応するＰＣＴ及び国外の特許出願又は特許、ならびに／あるいは、これらの特許出願及び特許のいずれかの優先権を主張するＰＣＴ及び国外の特許出願又は特許のそれぞれ、また、出願引用文献のそれぞれにおいて引用又は参照される文書のそれぞれが、本明細書により参照によって本明細書中に特に組み込まれ、また、本発明の手続きにおいて用いられる場合がある。より一般には、様々な文書又は参考文献が、この本文において、すなわち、請求項の前の参考文献リストで、又は、本文自体で、そのどちらかで引用されており、また、これらの文書又は参考文献（「本明細書中引用参考文献」）のそれぞれ、同様にまた、（製造者の何らかの仕様書、説明書などを含めて）本明細書中引用参考文献のそれぞれにおいて引用されるそれぞれの文書又は参考文献が、本明細書により参照によって本明細書中に特に組み込まれる。

【0003】

（連邦政府援助の研究のもとでなされた発明に対する権利の言及）
合衆国政府は補助金番号ＰＯ１ＣＡ５９３５０によって本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

前立腺癌は合衆国において男性における最も頻発する癌であり、毎年ほぼ３１，０００人の死亡の原因である。早期に診断されたとき、癌は手術又は放射線によって効果的に治療することができる。手術後の残存疾患は放射線治療及び／又はホルモン治療を必要とし、これらにより、腫瘍の進行及び転移を防止することができる。現在、ホルモン不応性の転移性前立腺癌の完全な治療法は存在しない。免疫療法は、原理的にはそのような癌の治療法を提供する標的療法である。癌組織への到達を可能とするための細胞傷害性Ｔリンパ球の十分な数の増殖を必要とする腫瘍免疫療法を行うためには、多くの障害が依然として残されている。効果的なＴ細胞プライミングの制限及び腫瘍の拒絶反応の機構の１つには、多くの悪性腫瘍における副刺激リガンドが生来的に存在していないことがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、抗原認識受容体及び副刺激リガンドの少なくとも１つを発現する免疫応答性細胞（Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む）、ならびに、腫瘍、感染性疾患及び他の病状を治療するためのその使用方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

１つの態様において、本発明は、抗原と結合する受容体と、外因性の副刺激リガンド（costimulatory ligand）とを含む免疫応答性細胞を提供する。

【0007】

別の態様において、本発明は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０及びＣＤ３０Ｌのいずれか１つ又はそれ以上から選択されるポリペプチドをコードするベクター（例えば、発現ベクター）を発現するウイルス特異的Ｔ細胞を提供する。その態様の１つとしては、ウイルス特異的Ｔ細胞は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びインフルエンザウイルスからなる群から選ばれるウイルスの抗原のいずれか１つ又はそれ以上から選択されるウイルスを認識する。

【0008】

さらに別の態様において、本発明は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択されるポリペプチドをコードするベクターを発現する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を提供する。その態様の１つとしては、この細胞はＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを発現する。別の態様においては、ベクターはレトロウイルス（例えば、γ−レトロウイルス又はレンチウイルス）からなる。ベクターはまた、非ウイルス性であってもよい。

【0009】

さらに別の態様において、本発明は、いずれかの前記態様の免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法を提供する。その態様の１つとしては、この方法は免疫応答を増大又は低下させる。別の態様としては、この方法は、臓器移植に対する自己寛容を増大させるか、又は、臓器移植に対する耐性を増大させる。

【0010】

さらに別の態様において、本発明は、腫瘍抗原と結合する受容体、及び副刺激リガンドをコードするベクターとを含む免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象における腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。その態様の１つとしては、腫瘍は、前立腺癌、結腸癌、乳癌及び神経膠芽細胞腫のいずれか１つ又はそれ以上から選択される。別の態様としては、腫瘍の抗原は、前立腺特異的膜抗原、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ又はメソセリンである。

【0011】

別の態様において、本発明は、抗原と結合する受容体、及び副刺激リガンドをコードするベクターとを含む免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象における耐性を強化する方法を提供する。その態様の１つとしては、この方法は、自己免疫疾患、又は、同種移植に関連する疾患を予防又は軽減する。

【0012】

さらに別の態様において、本発明は、ウイルス抗原と結合する受容体、及び副刺激リガンドをコードするベクターとを含む免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象における病原体感染を治療又は防止する方法を提供する。その態様の１つとしては、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物又は寄生虫である。別の態様において、ウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びインフルエンザウイルスのいずれか１つ又はそれ以上から選択される。さらに別の態様において、当該細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。

【0013】

さらに別の態様において、本発明は、免疫応答性細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインと共役している抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を、免疫応答性細胞に導入することを含む抗原特異的な免疫応答性細胞を産生するための方法を提供する。その態様の１つとしては、当該免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、ＣＴＬ又はＮＫ細胞である。別の態様としては、抗原結合ドメインは腫瘍抗原結合ドメインである。さらに別の態様としては、腫瘍抗原は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。さらに別の態様としては、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞又はＮＫ細胞を活性化するものである。さらに別の態様としては、細胞内シグナル伝達ドメインはζ鎖シグナル伝達ドメインである。

【0014】

別の態様において、本発明は、腫瘍抗原、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含有してなるＴ細胞の有効量を対象に投与することからなる、治療が必要な対象における腫瘍を治療する方法を提供する。

【0015】

別の態様において、本発明は、腫瘍抗原、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せのいずれか１つ又はそれ以上から選択される少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含有してなるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の治療有効量を対象に投与することからなる、対象における腫瘍を治療する方法を提供する。その態様の１つとしては、当該ＴＮＦリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される。別の態様としては、Ｉｇスーパーファミリーリガンドは、ＣＤ８０又はＣＤ８６から選択される。さらに別の態様としては、細胞は少なくとも２つの副刺激リガンドを発現し、その１つがＴＮＦリガンド（例えば、４−１ＢＢＬ）であり、他のひとつがＩｇスーパーファミリーリガンド（例えば、ＣＤ８０）である。

【0016】

別の態様において、本発明は、ウイルス抗原に対して特異的な受容体、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体とを含むＴ細胞の治療有効量を対象に投与することからなる、治療の必要がある対象における感染性疾患を治療する方法を提供する。

【0017】

さらに別の態様において、本発明は、ウイルス抗原に対して特異的な受容体、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体とを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の治療有効量を対象に投与することからなる、対象における感染性疾患を治療する方法を提供する。その態様の１つとしては、対象は、免疫が低下している対象である。別の態様としては、ＴＮＦリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される。さらに別の態様としては、Ｉｇスーパーファミリーリガンドは、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される。さらに別の態様としては、そのような少なくとも２つの副刺激リガンドが、ＴＮＦリガンド及びＩｇスーパーファミリーリガンドである。別の態様としては、ＴＮＦリガンドが４−１ＢＢＬであり、ＩｇスーパーファミリーリガンドがＣＤ８０である。別の態様としては、抗原認識複合体が細胞の表面に構成的に発現される。別の態様としては、ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はインフルエンザウイルスに対して特異的な抗原である。別の態様としては、そのような少なくとも２つの副刺激リガンドは細胞の表面に構成的（constitutively）に発現される。

【0018】

別の態様において、本発明は、前記態様のいずれかの免疫応答性細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物を提供する。

【0019】

別の態様において、本発明は、前記態様のいずれかの腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。

【0020】

別の態様において、本発明は、前記態様のウイルス特異的Ｔ細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる病原体感染を治療するための医薬組成物を提供する。その態様の１つとしては、組成物はさらに、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、α−インターフェロン又はβ−インターフェロン又はγ−インターフェロン、及び、エリスロポエチンからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択されるサイトカインを含有している。

【0021】

別の態様において、本発明は、抗原と結合する受容体と、外因性の副刺激リガンドとを含む免疫応答性細胞を含むキットを提供する。その態様の１つとしては、当該キットはさらに、腫瘍、病原体感染、自己免疫障害又は同種移植に関連する症状を有する対象の治療のために前記細胞を使用するための文書化された説明書を含む。

【0022】

いずれかの前記態様においては、本発明の方法はさらに、免疫応答性細胞又は副刺激リガンドを得る工程を含む。
前記態様のさらに他の態様においては、副刺激リガンドは構成的又は誘導的に発現される。前記態様のさらに他の態様において、少なくとも２つの副刺激リガンドは構成的に発現される。
前記いずれかの態様においては、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び調節性Ｔ細胞からなる群から選ばれる１つ又はそれ以上から選択される。
前記態様のさらに他の態様においては、抗原は腫瘍抗原又は病原体抗原であり、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、及びメソセリンからなる群から選ばれるいずれか１つ又はそれ以上である。
前記態様のさらに他の態様においては、当該細胞は組換え抗原受容体及び／又は内因性抗原受容体を発現する。
前記態様のさらに他の態様においては、副刺激リガンドは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド（例えば、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌ）又は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド（例えば、ＣＤ８０及びＣＤ８６）である。
前記態様のさらに他の態様においては、免疫応答性細胞は少なくとも１つのＴＮＦリガンド及び少なくとも１つのＩｇスーパーファミリーリガンドを発現する。
前記態様のさらに他の態様においては、当該細胞は４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０を発現する。
前記態様のさらに他の態様においては、抗原提示複合体及び／又は副刺激リガンドはＴ細胞の表面に構成的（constitutively）又は誘導的(inducibly)に発現される。
前記態様のさらに他の態様においては、副刺激リガンドはレトロウイルスベクターで発現される。
別の態様においては、腫瘍抗原は、前立腺特異的膜抗原、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１又はｈＴＥＲＴである。
さらに他の態様においては、細胞は、そのような抗原に対する組換え受容体又は内因性受容体を発現する。
さらに他の態様においては、副刺激リガンドは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド又は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドである。
さらに他の態様においては、ＴＮＦリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌからなる群から選ばれるいずれか１つ又はそれ以上から選択される。
これらの態様においては、細胞内シグナル伝達ドメインは、ζ鎖シグナル伝達ドメインである。
他の態様においては、１つの副刺激シグナルが、遺伝子改変抗原受容体を介して提供され、もう一方の副刺激シグナルが、副刺激リガンドを過剰発現することによって提供される。
さらに他の態様においては、Ｉｇスーパーファミリーリガンドは、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群より選択される。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（７４）に関する。
（１） 抗原と結合する受容体、及び外因性の副刺激リガンドとを含有してなる免疫応答性細胞。
（２） 前記副刺激リガンドが、構成的又は誘導的に発現される、前記（１）に記載の方法。
（３） 少なくとも２つの副刺激リガンドが構成的に発現される、前記（１）に記載の方法。
（４） 当該細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び調節性Ｔ細胞からなる群より選択される、前記（１）に記載の免疫応答性細胞。
（５） 前記抗原が、腫瘍抗原又は病原体抗原である、前記（１）に記載の免疫応答性細胞。
（６） 前記抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、及びメソセリンからなる群より選択される、前記（３）に記載の免疫応答性細胞。
（７） 当該細胞が、Ｐｚ１又はＰ２８ｚである組換え抗原受容体又は内因性抗原受容体を発現する、前記（１）に記載の免疫応答性細胞。
（８） 前記副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド又は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドである、前記（１）に記載の免疫応答性細胞。
（９） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択される、前記（８）に記載の免疫応答性細胞。
（１０） 前記Ｉｇスーパーファミリーリガンドが、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群より選択される、前記（８）に記載の免疫応答性細胞。
（１１） 当該免疫応答性細胞が、ＴＮＦリガンド及びＩｇスーパーファミリーリガンドを発現する、前記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（１２） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬであり、そして前記ＩｇスーパーファミリーリガンドがＣＤ８０である、前記（１１）に記載の免疫応答性細胞。
（１３） 内因性抗原受容体、組換え抗原受容体又は抗原提示複合体が、Ｔ細胞の表面に構成的に発現される、前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（１４） 前記副刺激リガンドが、Ｔ細胞の表面に構成的に発現される、前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の細胞。
（１５） 前記副刺激リガンドが、レトロウイルスベクターで発現される、前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（１６） ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択されるポリペプチドをコードするベクターを発現するウイルス特異的Ｔ細胞。
（１７） 当該Ｔ細胞が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びインフルエンザウイルスの抗原からなる群より選択されるウイルスを認識する、前記（１６）に記載のウイルス特異的Ｔ細胞。
（１８） ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択されるポリペプチドをコードするベクターを発現する、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞。
（１９） 当該細胞が、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを発現する、前記（１５）に記載の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞。
（２０） 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、前記（１５）に記載の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞。
（２１） 前記（１）〜（１７）のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法。
（２２） 免疫応答を増大させるか又は低下させる、前記（２１）に記載の方法。
（２３） 臓器移植に対する自己寛容を増大させるか、又は、臓器移植に対する耐性を増大させる、前記（２１）に記載の方法。
（２４） 腫瘍抗原と結合する受容体と、副刺激リガンドをコードするベクターとを含有してなる免疫応答性細胞の有効量を投与することを包含する、対象における腫瘍を治療又は予防する方法。
（２５） 前記腫瘍が、前立腺癌、結腸癌、乳癌及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される、前記（１８）に記載の方法。
（２６） 前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ及びメソセリンである、前記（１８）に記載の方法。
（２７） 抗原と結合する受容体と、副刺激リガンドをコードするベクターとを含有してなる免疫応答性細胞の有効量を投与することを包含する、対象の耐性を強化する方法。
（２８） 自己免疫疾患、又は同種移植に関連する疾患を予防又は軽減する、前記（２７）に記載の方法。
（２９） ウイルス抗原と結合する受容体と、副刺激リガンドをコードするベクターとを含有してなる免疫応答性細胞の有効量を投与することを包含する、対象における病原体感染を治療又は予防する方法。
（３０） 前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、原生動物又は寄生虫である、前記（２９）に記載の方法。
（３１） 前記ウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群より選択される、前記（２９）に記載の方法。
（３２） 前記細胞が、自己ドナー又は同種ドナーから集められるかあるいは、遺伝子的に組み換えられた始原体細胞又は幹細胞からインビトロで生じたもののいずれかである、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、前記（２１）〜（３０）のいずれか一項に記載の方法。
（３３） 前記細胞が、前記抗原に対する組換え受容体又は内因性受容体を発現する、前記（２１）〜（３０）のいずれか一項に記載の方法。
（３４） 前記副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド又は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドである、前記（２１）〜（３０）のいずれか一項に記載の方法。
（３５） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択される、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３６） 前記Ｉｇスーパーファミリーリガンドが、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群より選択される、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３７） 前記免疫応答性細胞が、ＴＮＦリガンド及びＩｇスーパーファミリーリガンドを発現する、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３８） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬであり、そして前記ＩｇスーパーファミリーリガンドがＣＤ８０である、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３９） 組換え抗原受容体、内因性抗原受容体又は抗原提示複合体が、Ｔ細胞の表面に構成的に発現される、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（４０） 前記副刺激リガンドが、Ｔ細胞の表面に構成的に発現される、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（４１） 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、前記（２１）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（４２） キメラな抗原受容体をコードする核酸配列を免疫応答性細胞に導入することを含み、キメラな抗原受容体が、免疫応答性細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインと結合する抗原結合ドメインを包含する、抗原特異的な免疫応答性細胞を産生する方法。
（４３） 前記免疫応答性細胞が、Ｔ細胞、ＣＴＬ、又はＮＫ細胞である、前記（４２）に記載の方法。
（４４） 前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原結合ドメインである、前記（４２）に記載の方法。
（４５） 前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、前記（４２）に記載の方法。
（４６） 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞又はＮＫ細胞を活性化する、前記（４２）に記載の方法。
（４７） 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ζ鎖シグナル伝達ドメインである、前記（４２）に記載の方法。
（４８） １つの副刺激シグナルが、遺伝子改変抗原受容体を介して提供され、他の一つの副刺激シグナルが、副刺激リガンドを過剰発現することによって提供される、前記（４２）に記載の方法。
（４９） 腫瘍抗原、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群より選択される１つ又はそれ以上からばれる少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含有してなるＴ細胞の有効量を対象に投与することを包含する、治療を必要とする対象における腫瘍を治療する方法。
（５０） 腫瘍抗原、並びに、少なくとも１つの共刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群より選択される１つ又はそれ以上から選ばれる少なくとも２つの共刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含有してなるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の治療有効量を対象に投与することを包含する、対象における腫瘍を治療する方法。
（５１） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群より選択される、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５２） 前記Ｉｇスーパーファミリーリガンドが、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群より選択される、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５３） 前記少なくとも２つの副刺激リガンドがＴＮＦリガンド及びＩｇスーパーファミリーリガンドである、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５４） 前記ＴＮＦリガンドが４−１ＢＢＬであり、前記ＩｇスーパーファミリーリガンドがＣＤ８０である、前記（５２）に記載の方法。
（５５） 抗原認識複合体が前記細胞の表面に構成的に発現される、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５６） 前記腫瘍抗原が前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５７） 前記少なくとも２つの副刺激リガンドが前記細胞の表面に構成的に発現される、前記（４８）〜（５０）に記載の方法。
（５８） ウイルス抗原に対して特異的な受容体、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群より選択される１つ又はそれ以上から選ばれる少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体とを含むＴ細胞の治療有効量を前記対象に投与することを包含する、治療の必要がある対象における感染性疾患を治療する方法。
（５９） ウイルス抗原に対して特異的な受容体、並びに少なくとも１つの副刺激リガンドが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンド、及びそれらの組合せからなる群より選択される１つ又はそれ以上から選ばれる少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体とを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の治療有効量を前記対象に投与することを包含する、対象における感染性疾患を治療する方法。
（６０） 前記対象が、免疫が低下している対象である、前記（５８）又は（５９）に記載の方法。
（６１） 前記ＴＮＦリガンドが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌからなる群より選択される、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６２） 前記Ｉｇスーパーファミリーリガンドが、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群より選択される、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６３） 前記少なくとも２つの副刺激リガンドがＴＮＦリガンド及びＩｇスーパーファミリーリガンドである、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６４） 前記ＴＮＦリガンドが４−１ＢＢＬであり、前記ＩｇスーパーファミリーリガンドがＣＤ８０である、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６５） 抗原認識複合体が前記細胞の表面に構成的に発現される、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６６） 前記ウイルス抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はインフルエンザウイルスに対して特異的な抗原である、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６７） 前記少なくとも２つの副刺激リガンドが前記細胞の表面に構成的に発現される、前記（５７）又は（５８）に記載の方法。
（６８） 前記（１）〜（２０）のいずれか一項に記載される免疫応答性細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物。
（６９） 前記（１５）〜（１７）のいずれか一項に記載される腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる、腫瘍を治療するための医薬組成物。
（７０） 前記（１４）に記載されるウイルス特異的Ｔ細胞の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる、病原体感染を治療するための医薬組成物。
（７１） ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、α−インターフェロン又はβ−インターフェロン又はγ−インターフェロン、及び、エリスロポエチンからなる群より選択されるサイトカインをさらに含有してなる、前記（６７）〜（６９）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（７２） 抗原と結合する受容体と、外因性の副刺激リガンドとを含有している免疫応答性細胞を含有してなる、腫瘍、病原体感染、自己免疫障害又は同種移植に関連する症状を治療するためのキット。
（７３） 腫瘍、病原体感染、自己免疫障害又は同種移植に関連する症状を有する対象の治療のために前記細胞を使用するための文書化された説明書をさらに含有してなる、前記（７１）に記載のキット。
（７４） 前記免疫応答性細胞又は副刺激リガンドを得る工程をさらに含有してなる、前記（２１）〜（６７）のいずれか一項に記載の方法。

【0023】

（定義）
「ＣＤ８０ポリペプチド」とは、Ｉｇスーパーファミリーリガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００５１８２又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0024】

「ＣＤ８０核酸分子」とは、ＣＤ８０ポリペプチドをコードする何れかのポリヌクレオチドを意味する。１つの例示的なＣＤ８０核酸分子はＮＭ＿００５１９１である。

【0025】

「４−１ＢＢＬポリペプチド」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４１２７３又は同ＮＰ＿００１５５２あるいはそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0026】

「４−１ＢＢＬ核酸分子」とは、４−１ＢＢＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0027】

「ＯＸ４０Ｌポリペプチド」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドである、ＮＣＢＩ参照番号：ＢＡＢ１８３０４又は同ＮＰ＿００３３１７あるいはそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0028】

「ＯＸ４０Ｌ核酸分子」とは、ＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0029】

「ＣＤ７０ポリペプチド」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２４３又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0030】

「ＣＤ７０核酸分子」とは、ＣＤ７０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0031】

「Ｌｉｇｈｔポリペプチド」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７４２０１１又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0032】

「Ｌｉｇｈｔ核酸分子」とは、Ｌｉｇｈｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0033】

「ＣＤ３０Ｌポリペプチド」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＢ９７８７７又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0034】

「ＣＤ３０Ｌ核酸分子」とは、ＣＤ３０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0035】

「ＣＤ８６ポリペプチド」とは、Ｉｇスーパーファミリーリガンドとして作用する、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４２０８１又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0036】

「ＣＤ８６核酸分子」とは、ＣＤ８６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0037】

「Ｐｚｌポリペプチド」とは、Gong et al.,（Neoplasia, 1:123-7, 1999）に記載されるタンパク質又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。

【0038】

「Ｐ２８ｚポリペプチド」とは、Maher et al.， (Nature Biotechnology， Vol 20， Jan 2002， 70-75）に記載されるタンパク質又はそのフラグメントに対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質を意味する。ζ鎖シグナル伝達ドメインもまた、Maher et al.， (Nature Biotechnology、 Vol 20， Jan 2002， 70-75）に記載される。

【0039】

本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする何れかの核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はなく、しかし、典型的には、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイゼーションすることができる。「ハイブリダイゼーションする」とは、二本鎖分子を、様々なストリンジェントな条件のもとで、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載される遺伝子）又はその一部分との間で対形成させることを意味する。（例えば、Wahl，G.M. and S.L.Berger(1987) Methods Enzymol.，152:399; Kimmel，A.R.(1987)、Methods Enzymol.，152:507を参照のこと）。

【0040】

例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは、約５００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは、約２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の非存在下で得ることができ、一方で、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションは少なくとも約３５％のホルムアミドの存在下で得ることができ、より好ましくは少なくとも約５５％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約３０℃の温度を含み、より好ましくは少なくとも約３７℃の温度を含み、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。様々なさらなるパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、及び、キャリアＤＮＡを含むこと、又は、キャリアＤＮＡを除くことなどが、当業者には周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。１つの好ましい態様において、ハイブリダイゼーションが、３０℃で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい態様において、ハイブリダイゼーションが、３７℃で、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において行われる。１つの最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションが、４２℃で、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいて行われる。これらの条件に対する様々な有用な変更を、当業者は容易に見出せるだろう。

【0041】

ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄のストリンジェントな条件を塩濃度によって、また、温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーを、塩濃度を低下させることによって、又は、温度を上げることによって増大させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは、約１５ｍＭのＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃の温度を含み、より好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含み、一層より好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。１つの好ましい態様において、洗浄工程が、２５℃で、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい態様において、洗浄工程が、４２℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて行われる。１つのより好ましい態様において、洗浄工程が、６８℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％のＳＤＳにおいて行われる。これらの条件に対するさらなる様々な有用な変更を、当業者は容易に見出せるだろう。ハイブリダイゼーション技術が当業者には周知であり、例えば、Benton and Davis (Science、196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961， 1975); Ausubel et al.， (Current Protocols in Molecular Biology， Wiley Interscience， New York、 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques， 1987， Academic Press， New York); 及び Sambrook et al.， (Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York)に記載されている。

【0042】

「実質的に同一」とは、ポリペプチド又は核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書中に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）又は参照核酸配列（例えば、本明細書中に記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すことを意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベル又は核酸において、少なくとも６０％が同一であり、より好ましくは８０％又は８５％が同一であり、より好ましくは、９０％、９５％又は９９％までもが同一である。
配列同一性は典型的には、配列分析ソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、ＢＬＡＳＴプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラム又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウエアは、相同性の度合いを、様々な置換、欠失及び／又は他の修飾に対して割り当てることによって同一配列又は類似配列を一致させる。同類置換には、典型的には、下記の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及び、フェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を求めるための１つの例示的な方法において、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３〜ｅ−１００の間における確率スコアにより、近い関係にある配列が示される。

【0043】

「類似（アナログ）」とは、参照ポリペプチド又は参照核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチド又は核酸分子を意味する。

【0044】

本明細書中で使用される用語「リガンド」は、受容体に結合する分子を示す。具体的には、リガンドは別の細胞における受容体と結合し、これにより、細胞−細胞の認識を可能にする。

【0045】

本明細書中で使用される用語「構成的発現」は、すべての生理学的条件のもとでの発現を示す。

【0046】

本明細書中で使用される用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合される腫瘍抗原結合ドメインを示す。最も一般的には、ＣＡＲの細胞外の結合ドメインがマウスモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体に由来する。

【0047】

「疾患」とは、細胞、組織又は器官の正常な機能を損なうか、又は、妨害する何れかの状態又は障害を意味する。疾患の例には、腫瘍、又は、細胞の病原体感染が含まれる。

【0048】

「有効量」とは、腫瘍の継続した増殖、成長又は転移（例えば、侵入又は移動）を停止し、改善し、又は阻害するために十分な量を意味する。

【0049】

「耐性を強化する」とは、移植された器官又は組織を標的とする自己反応性細胞又は免疫応答性細胞の活性を妨げることを意味する。

【0050】

「外因性」とは、細胞に内因的に存在しない核酸分子又はポリペプチド、あるいは、過剰発現したときに得られる機能的影響をもたらすために十分なレベルで存在しない核酸分子又はポリペプチドを意味する。従って、用語「外因性」は、細胞において発現される何れかの組換え核酸分子又は組換えポリペプチド（例えば、外来、異種など）、ならびに、過剰発現された核酸分子及びポリペプチドを包含する。

【0051】

「異種の核酸分子又はポリペプチド」とは、細胞又は細胞から得られるサンプルに通常の場合には存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）又はポリペプチドを意味する。この核酸は別の生物に由来してもよく、あるいは、この核酸は、例えば、細胞又はサンプルにおいて通常の場合には発現されないｍＲＮＡ分子であってもよい。

【0052】

「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、あるいは、その前駆体又は子孫を意味する。

【0053】

「単離された細胞」とは、自然界においてその細胞に付随する分子成分及び／又は細胞成分から分離される細胞を意味する。

【0054】

本明細書中で使用される用語「腫瘍抗原結合ドメイン」は、腫瘍表面に存在する特定の抗原決定基又は１組の抗原決定基と特異的に結合することができるドメインを示す。

【0055】

「薬剤を得る」におけるような用語「得る」は、薬剤（あるいは示された物質又は材料）を購入すること、合成すること、又は、そうでない場合には獲得することを含むように意図されている。

【0056】

「調節する」とは、正又は負に変えることを意味している。例示的な調節には、１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の変化が含まれる。

【0057】

「腫瘍」とは、細胞又は組織の病理学的増殖、及び、他の組織又は器官へのそのその後の移動又は侵入によって特徴づけられる疾患を意図している。腫瘍の成長は典型的には抑制されず、進行性であり、また、正常な細胞の分裂増殖を誘発しない条件、又は、正常な細胞の分裂増殖の停止を生じさせる条件のもとで生じる。腫瘍は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮及び膣からなる群より選択される器官、あるいは、その組織又は細胞タイプ（これらに限定されない）を含む、様々な細胞タイプ、組織又は器官を冒し得る。腫瘍は、肉腫、癌腫又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）のような、様々な癌を含む。本発明で利用できる例示的な腫瘍には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び、肉腫並びに癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、ナイル管（nile duct）癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）のような固形腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。１つの態様において、本発明のスクリーニング方法は、乳癌又は肺癌を治療するために有用な組成物を特定する。

【0058】

「受容体」とは、１つ又はそれ以上のリガンドと選択的に結合する、細胞膜上に存在するポリペプチド又はその一部を意味する。

【0059】

「認識する」とは、標的と選択的に結合することを意味する。ウイルスを認識するＴ細胞は典型的には、そのウイルスによって発現される抗原と結合する受容体を発現する。

【0060】

「病原体」とは、疾患を引き起こし得るウイルス、細菌、真菌、寄生虫又は原生動物を意味する。

【0061】

例示的なウイルスには、レトロウイルス科（retroviridae）（例えば、ＨＩＶ−１（これはまた、ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、あるいは、ＨＩＶ−ＩＩＩとしても示される）、及び、ＨＩＶ−ＬＰのような他の単離体のような、ヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（Picornaviridae）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Calciviridae）（例えば、胃腸炎を引き起こす系統）；トガウイルス科（Togaviridae）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビリダエ（Flaviridae）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（Coronaviridae）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Filoviridae）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガビリダエ（Bungaviridae）（例えば、ハンターンウイルス、ブンガ（bunga）ウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（Arenaviridae）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Reoviridae）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Parvoviridae）（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（Papovaviridae）（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Adenoviridae）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）（１型及び２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Poxviridae）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（Iridoviridae）（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、デルタ型肝炎の媒介因子（これは、Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の媒介因子（クラス１＝体内感染型；クラス２＝非経口感染型（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノーウォークウイルス及び関連ウイルス、ならびに、アストロウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。

【0062】

例示的な細菌には、パスツレラ属（Pasteurella）、ブドウ球菌属（Staphylococci）、連鎖球菌属（Streptococcus）、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）菌種及びサルモネラ属（Salmonella）の菌種が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体的な例には、ヘリコバクター・ピロリス（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリウム属（Mycobacteriasps）の菌種（例えば、M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansaii、M.gordonea)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)（Ａ群連鎖球菌)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalacｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌属（嫌気性菌種）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター・エスピー（Campylobacter sp.）、エンテロコッカス・エスピー（Enterococcus sp.）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus antracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・エスピー（Corynebacterium sp.）、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringers）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイデス・エスピー（Bacteroides sp.）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、フランベジアトレポネーマ（Treponema pertenue）、レプトスピラ属（Leptospira）、リケッチア属（Rickettsia)及びイスラエル放線菌（Actinomyces israelli）が含まれるが、これらに限定されない。

【0063】

「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを自然の状態で含むサンプル（例えば、生物学的サンプル）において、目的とするポリペプチドを認識し、かつ、これと結合するが、他の分子を実質的に認識し、かつ、これと結合しないポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。

【0064】

本明細書中で使用される用語「腫瘍抗原」は、免疫応答を誘導することができる、腫瘍によって発現される何れかのポリペプチドを示す。

【0065】

「ウイルス抗原」とは、免疫応答を誘導することができる、ウイルスによって発現される任意のポリペプチドを意味する。

【0066】

用語「含む」（「comprises」及び「comprising」など）は、米国特許法においてそれらに認められる幅広い意味を有することが意図され、「包含する（含む）」（「includes」及び「including」など）を意味することができる。

【0067】

本明細書中で用いられているような、「治療」は、治療されている個人又は細胞の疾患経過を変化させようとすることにおける臨床的介入を示し、予防のために、又は、臨床病理学の経過中において、そのどちらかで行うことができる。治療の治療的効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の緩和、疾患の何らかの直接的又は間接的な病理学的結果の軽減、転移を防止すること、疾患進行の速度を低下させること、疾患状態の改善又は軽減、及び、寛解又は改善された予後が含まれる。疾患又は障害の進行を妨げることによって、治療は、罹患している対象又は診断された対象、あるいは、障害を有することが疑われる対象において障害に起因する悪化を防止することができるが、治療により、障害又は障害の症状の発症が、障害についての危険性を有する対象において、又は、障害を有することが疑われる対象において防止されることもある。

【0068】

本明細書中で使用される用語「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを示す。

【0069】

本明細書中で使用される用語「免疫が低下している」は、免疫不全を有する対象を示す。そのような対象は、日和見感染症、すなわち、免疫系が健全である人では通常、疾患を引き起こさないが、免疫系が良好に機能しないか、又は、免疫系が抑制された人々を冒し得る生物によって引き起こされる感染症に非常に罹りやすい。

【0070】

本発明の他の態様が下記の開示において記載され、これらは本発明の範囲内である。

【0071】

下記の詳細な説明は、本発明を記載された具体的な態様に限定するために意図されるのではなく、例として示されるものであり、添付されている図面と併せて理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0072】

【図1】図１ａ〜図１ｆは、ヒトＴ細胞におけるＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの共発現が、周期的な刺激の後における顕著な増殖応答を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりもたらされる副刺激を伴うことなく、それらの内因性のＴ細胞受容体を介して、又は、キメラ抗原受容体を介して誘発することを示す。 ０．４×１０^６個の精製されたヒトＴリンパ球を、ＣＤ３に対する抗体（ＯＫＴ３）により活性化し、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、これら２つの組合せ、又は、対照ベクターがレトロウイルスにより形質導入されたＴリンパ球の増大を定量化した（図１ａ、図１ｂ）。 形質導入の効率を遺伝子移入後４８時間でＦＡＣＳ分析によって評価した（図１ａ）。 示された副刺激リガンドが形質導入され、１０μｇ／ｍｌのプレートに結合されたＯＫＴ３により毎週刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数が図１ｂにグラフで示されている。 検討をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的な記憶ドナーＴ細胞（図１ｃ、図１ｄ）及び遺伝子的にリダイレクトした自己Ｔ細胞（図１ｅ、図１ｆ）に拡大した。 ＣＭＶ−ｐｐ６５特異的Ｔリンパ球をＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｐｐ６５^＋人工ＡＰＣ上で短時間に増大させ、これに、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、又は、これら２つの組合せを形質導入した（図１ｃ）。 ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｐｐ６５を提示するＣａｃｏ−２腫瘍細胞による毎週の再刺激の後の、ｃに記載されるように富化及び形質導入されたＣＤ８^＋ｐｐ６５^＋Ｔ細胞の絶対数が、図１ｄに示されている。 前立腺癌反応性のヒトＴリンパ球を迅速に産生するために（図１ｅ、図１ｆ）、末梢血Ｔ細胞に、キメラ抗原受容体Ｐｚ１（Gade et al.， Cancer Res.，65:9080~9088、2005）、すなわち、腫瘍抗原ＰＳＭＡに対して特異的なＨＬＡ非制限の抗原受容体をレトロウイルスにより形質導入した。Ｐｚ１受容体は、ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されたＰＳＭＡ結合性単鎖抗体フラグメントを含む。 図１ｅにおいて、初代ヒトＣＤ３^＋Ｔリンパ球に、Ｐｚ１を単独で、又は、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬとの組合せでレトロウイルスにより形質導入した。 形質導入の効率をＦＡＣＳ分析によって評価した。ＬＮＣａＰ腫瘍の単層物と毎週共培養される、Ｐｚ１が形質導入されたヒトＴリンパ球のＴ細胞増殖が、図１ｆに示されている。 副刺激リガンドがＴ細胞（上段）又は腫瘍細胞（下段）において発現された。それぞれの活性化条件が、ｂ、ｄ及びｆの右側図に示される模式図で描かれる。データは３つの独立した実験を表す。ｂ、ｄ及びｆにおける各点は、３つのランダムに選ばれたウエルの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。^＊は１０^４個未満の細胞を示す。

【図2】図２ａ〜図２ｃは、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬが形質導入されたＰｚ１^＋Ｔ細胞によるＳｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおける確立された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）前立腺癌腫瘍の根絶を示す。 図２ａは、４×１０^６個の腫瘍細胞による全身接種（Ｔ細胞処置の０日目）の４週間後、及び、４×１０^６個のＣＤ８^＋Ｐｚ１^＋Ｔリンパ球又はＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球の養子移入の後１８日でのＳｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおけるホタルルシフェラーゼ^＋ＰＣ３−ＰＳＭＡ腫瘍のインビボ生物発光画像化及び対応する冠状面ＭＲＩスキャンを示す。ヒトＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体１９ｚを保有するＴ細胞の等しい数を対照群に注入した。従来の写真に重ねられた擬似カラー画像が示される。生物発光画像化及びＭＲＩを使用して治療前及び後に画像化された同じ動物が示される。この２匹のマウスは、ｎ＝１０の全体を代表している。 図２ｂは３つのグラフを示す。生物発光の腫瘍シグナルを２８日間にわたって２日毎に1動物あたりで定量化した。画素が飽和している取得値は、群間の直接的な目視比較を可能とするために図に含められるが、より短い取得時間で繰り返された場合を除いて、光子の定量化のためには使用しなかった。グラフは、Ｔ細胞注入後の日数に対する光子数／秒／ｃｍ^２／表面半径（ｓｒ）を示す。どの線も１匹の動物に対応しており、各ドットが、いずれかの示された時点における動物あたりの腹側取得及び背側取得の平均光子カウント数を表す。 生存率が図２ｃにおいてカプラン・マイヤー曲線で例示される。

【図3】図３ａ〜図３ｄは、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球の顕著であるが、腫瘍抗原に依存するインビボ増殖を示す。 図３ａは、４×１０^６個の、ＣＤ８^＋の、コメツキムシルシフェラーゼ（click-luc）を発現するＰｚ１形質導入Ｔリンパ球又はＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋形質導入Ｔリンパ球の注入後０日目、８日目及び１８日目でのＰＣ３−ＰＳＭＡ腫瘍保有Ｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおける養子移入Ｔ細胞の比較用のインビボ生物発光の画像化を示す。抗原特異性対照として、等しい数の１９ｚ^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞を注入した。Ｔ細胞による処置を、４×１０^６個のＰＣ３−ＰＳＭＡ腫瘍細胞を全身注入した４週間後に図２と同様に開始した。それぞれの図に示される1群あたり５匹のマウスは、ｎ＝８／群の全体を代表している。画素が飽和している取得値は、直接的な目視比較を可能とするために図に示されるが、より短い取得時間で繰り返された場合を除いて、光子の定量化のためには使用していない。 図３ｂは、３つのグラフを示す。連続する生物発光の画像化から得られるコメツキムシルシフェラーゼのシグナル強度をＴ細胞移入後１６日間にわたって２日毎に集めた。どの線も１匹の動物を表しており、各ドットが、いずれかの示された時点における動物あたりの腹側取得及び背側取得の平均光子カウント数を表す。 図３ｃは、Ｔ細胞移入後６日目の、Ｐｚ１^＋Ｔリンパ球又はＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球のどちらかが注入された代表的な動物から調製された肺の単一細胞懸濁物の擬似カラーＦＡＣＳ分析を示す。細胞を、キメラ抗原受容体Ｐｚ１に対して特異的なイディオタイプ抗血清により染色した。 図３ｄにおいて、肺のＰｚ１^＋Ｔ細胞の絶対数を（トリパンブルー陰性細胞の生存細胞総数×Ｐｚ１^＋Ｔ細胞の百分率）を示す。示される棒グラフは３匹のマウスの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。

【図4】図４ａ〜図４ｆは、誘導されたＴ細胞／腫瘍細胞クラスター形成の後における免疫学的シナプス内への、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、及び、それらの受容体（ＣＤ２８及び４−１ＢＢ）の共局在化の結果としてのシス作用でのＴ細胞の副刺激を示す。 図４ａ〜図４ｄにおいて、末梢血ヒトＴリンパ球にＰｚ１を形質導入し、これを、ｄｓＲｅｄ−単量体−４−１ＢＢＬ融合タンパク質及びＣＤ８０をコードする二シストロンベクターによる２回目の遺伝子移入の前にＬＮＣａＰ−ＣＤ８０細胞により再刺激した。ＣＤ８^＋を陰性磁化分離した後、Ｔ細胞をＦＩＴＣ−コレラトキシンＢ（ＣＴＢ）により標識し、改変されていないＬＮＣａＰ腫瘍細胞とともに、又は、単独でインキュベーションした。固定化したコンジュゲートを透過処理し、指示された抗血清で染色し、共焦点顕微鏡観察によって可視化した。３つの独立した実験から得られるＴ細胞−ＬＮＣａＰ細胞クラスターを無作為に選んだ。スケールバーは１０μｍである。分析したクラスター総数に対する、Ｔ細胞−ＡＰＣ接合部における示された副刺激リガンド又は受容体の明確な濃度を有するクラスターの数が、図４ａ及び図４ｂの下段右の図に示されている。 図４ａは、４−１ＢＢＬ（これは、ＣＤ８^＋のＰｚ１形質導入Ｔ細胞の表面にＣＤ８０との組合せでｄｓ−Ｒｅｄ融合タンパク質として発現される）の免疫学的シナプス内への分極を例示する１０枚の共焦点顕微鏡写真の１組である。Ｔ細胞／ＬＮＣａＰ腫瘍クラスターを、固定化、透過処理、及び、抗４−１ＢＢＬ抗血清とのインキュベーションの前に５０分間インキュベーションした。 図４ｂでは、固定化したＴ細胞−腫瘍細胞クラスターを抗ＣＤ８０抗血清及び抗ＣＤ２８抗血清とインキュベーションした。ここでも、腫瘍抗原遭遇後の免疫学的シナプスにおける、ＣＤ８０の、その受容体（ＣＤ２８）との共局在化を可視化している。 図４ｃは、免疫学的シナプスにおけるグランザイム−Ｂの増大した蓄積を例示する。この蓄積は、４−１ＢＢの、同じＴ細胞表面に発現されるそのリガンド（４−１ＢＢＬ）による機能的結合に依存している。初代ヒトＴリンパ球を、図４ａ、図４ｂの場合と同様に遺伝子組み換えを行った。示されるように、Ｐｚ１をコードするレトロウイルスベクターはまた、対照のｓｈＲＮＡ又は４−１ＢＢ標的化ｓｈＲＮＡを、本明細書中に下記のような、それらの３’ＬＴＲにおけるＵ６プロモーターの制御下で発現する。上段の細胞コンジュゲート（Ｐｚ１^＋対照ｓｈＲＮＡ）及び中段の細胞コンジュゲート（及びＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋ｄｓｒｅｄ４−１ＢＢＬ^＋対照ｓｈＲＮＡ）は、同じウエルにおいて培養され、同じガラススライドにおいてＬｎＣａＰにコンジュゲート化されたＣＤ８０^＋のｄｓｒｅｄ４−１ＢＢＬ非形質導入Ｔリンパ球及びｄｓｒｅｄ４−１ＢＢＬ形質導入Ｔリンパをそれぞれ表す。 図４ｄは、Ｔ細胞−抗原提示細胞の界面相におけるグランザイム−Ｂ−Ａｌｅｘａ６４７の本明細書中に下記するように計算された相対的集合指数（ＲＲＩ）及び相対的強度を示す。それぞれの群におけるデータ点は、３５個の分析されたコンジュゲートの計算値（記号）、及び、３つの独立した実験のそれらの平均（−）を示す。^＊Ｐ＝０．０００１；^＊＊Ｐ＜０．０００１。 図４ｅ、４ｆには、単離した単一Ｔ細胞クローンにおけるＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼアッセイが示されている。これらの結果は、副刺激シグナルを送達するオペラント機構としての自己副刺激を裏付けている。ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターが安定的にトランスフェクトされたＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋の４−１ＢＢ−Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンに、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０を共発現する三シストロンベクター、又は、対照ベクターをレトロウイルスにより形質導入した。バイスタンダー副刺激を排除するために、形質導入したＴリンパ球を、コードされたタンパク質の最初の検出可能な表面発現の前に、ＯＫＴ３被覆の９６ウエルプレートにサブクローン化した。活性化後２４時間で、ウエルにおけるＴ細胞だけの存在を顕微鏡観察で確認し、生物発光シグナルを個々の細胞レベルで測定した。 図４ｅは、Adobe Illustratorソフトウエアにより整理された、形質導入した単一Ｔ細胞の３６個の生物発光取得値を示す。 個々の細胞でのそれぞれの生物発光シグナルを定量化して、バックグランドの生物発光に対して正規化し、図４ｆにおいてプロットした。

【図5】図５ａ〜図５ｅは、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを呈示するＴリンパ球が、改変されていない抗原特異的なバイスタンダーＴ細胞を物理的接触によってトランス副刺激することを示す。 図５ａは、ＣＤ８０及びｄｓＲｅｄ−４−１ＢＢＬが形質導入されたバイスタンダーＰｚ１^＋Ｔリンパ球との物理的なＴ細胞−Ｔ細胞接触が行われている間にＬＮＣａＰ腫瘍細胞を巻き込むＰｚ１^＋Ｔ細胞の４枚の共焦点顕微鏡写真の１組を示す。細胞クラスターを、図４ａ、図４ｂに記載されるように誘導し、分析した。スケールバーは１０μｍである。 図５ｂ〜図５ｄでは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清陽性のＨＬＡ Ａ２．１^＋ドナーの末梢Ｔリンパ球にＰｚ１を形質導入したか、又は、Ｐｚ１、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共形質導入した。並行して、同じドナーに由来するＣＭＶ特異的な遺伝子改変されていない細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、本明細書中下記で記載されるような人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）の共培養によって濃縮した。これらの細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）により標識した。ビーズで分類したＰｚ１^＋Ｔリンパ球（図５ｂ）又はＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球（図５ｃ）を、増大されたＣＭＶ反応性ｐｐ６５^＋ＣＴＬに１：１の比率で混合して、表面ｐｐ６５をＨＬＡ Ａ２．１依存的な様式で、同様にまた、ＰＳＭＡをＨＬＡ非依存的な様式で提示させるためにレトロウイルスにより形質導入した放射線照射Ｃａｃｏ−2腫瘍細胞に曝した。或いは、ともにＣａｃｏ−２腫瘍と結合しているＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞とｐｐ６５^＋Ｔ細胞をトランスウエル膜で分離した（図５ｄ）。それぞれの共培養条件が、左側に示される漫画で描かれる。腫瘍抗原接触後２日目に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞上にゲート処理した細胞内のグランザイムＢレベルをＦＡＣＳ分析によって定量化した（中央の図）。ＣＦＳＥ⁻（Ｐｚ１^＋）Ｔ細胞亜集団及びＣＦＳＥ^＋（ｐｐ６５^＋）Ｔ細胞亜集団のグランザイムＢ抗原提示細胞（ＡＰＣ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）がそれぞれのプロフィルの上部にまとめられている。７日目に、ｐｐ６５^＋Ｔ細胞画分と比較したＣＦＳＥ希釈物及びＰｚ１^＋を、ｐｐ６５四量体及びＣＤ８の染色後、フローサイトメトリーによって分析した（右側の図）。それぞれのプロフィルの上部に示されるＣＦＳＥ−ＭＦＩはＣＤ８^＋ゲーティング後のｐｐ６５^＋集団に基づいている。 ７日間の培養の後におけるＣＤ８^＋ｐｐ６５^＋Ｔ細胞の細胞総数が（図５ｅ）にグラフで示される。それぞれの棒グラフは３つの無作為に選ばれたウエルの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。データは２つの独立した実験を表す。外因性サイトカインは共培養のどの時点においても添加しなかった。

【図6】図６ａ及び図６ｂは、腫瘍部位における養子移入したＰＳＭＡ再命令Ｔリンパ球の蓄積が、Ｓｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスにおいて、１９ｚ^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞によってではなく、Ｐｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞によって増強されることを示す。 図６ａは、腫瘍標的化Ｔ細胞におけるコメツキムシルシフェラーゼ（Click-luc）に加えて、ＲＭ１．ＰＧＬＳ腫瘍及びＲａｊｉ腫瘍における外因性ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ（ｘ−ｇａｕｓ−ｌｕｃ）の二重インビボ生物発光画像化を示す。１×１０^６個のＣＤ１９^＋ｘ−ｇａｕｓ−ｌｕｃ^＋Ｒａｊｉ腫瘍を全身注入した２週間後、及び、続いて５×１０^５個のＰＳＭＡ^＋ｘ−ｇａｕｓ−ｌｕｃ^＋ＲＭ１．ＰＧＬＳ腫瘍細胞を同じ動物に注入した２日後に、骨髄における確立された腫瘍（Ｒａｊｉ）及び肺における確立された腫瘍（ＲＭ１）を、提示のように形質導入したＴ細胞の３つの細胞集団の組合せを用いて処置した。それぞれの動物が合計で１２×１０^６個のＣＤ８^＋キメラ抗原受容体^＋Ｔ細胞を受けた（４×１０^６個のＴ細胞／形質導入条件）。特に、３番目に示されるＴ細胞集団（Ｐｚ１^＋、Ｐｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋、１９ｚ^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋、をそれぞれ、左側、中央、右側の列に）は、選択的腫瘍抗原結合の結果としてではなく、密集することに起因して、肺におけるＴ細胞／Ｔ細胞の相互作用を避けるために、１番目及び２番目に示されるＴ細胞を混合注入した１２時間後に注入した。提示される時点で、ｘ−ｇａｕｓ−ｌｕｃ^＋腫瘍細胞又はｃｌｉｃｋ−ｌｕｃ^＋Ｔ細胞を生物発光画像によって観測した。０日目及び４日目において、腫瘍画像化とＴ細胞画像化との間で少なくとも４時間の時間により、生物発光シグナルがバックグラウンドレベルに戻ることが保証された。処置群あたり総数でｎ＝５のＳｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスを画像化した。 図６ｂは、４日間にわたるＴ細胞移入後１日毎の連続する生物発光画像化から得られるコメツキムシルシフェラーゼのシグナル強度を定量化する一連の６つのグラフである。どの線も１匹の動物を表しており、各ドットが、いずれかの示された時点における肺領域（上段）又は両方の大腿骨（下段）について測定された平均光子計数をそれぞれ表す。

【図7】図７は、Ｔ細胞で二重発現するＣＤ８０及び４−１ＢＢＬが、Ｐｚ１キメラ抗原受容体のζ鎖シグナル伝達ドメインと直列に融合されたＣＤ２８シグナル伝達エレメント及び／又は４−１ＢＢシグナル伝達エレメントと比較して、優れたＴ細胞増殖を誘発することを示す。初代Ｔ細胞に、Ｐｚ１、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインをζ鎖との直列で含有するＰ２８ｚ（Maher et al.， Nature Biotechnology， Vol20， Jan 2002， 70-75）、又は、両者（ＣＤ２８及び４−１ＢＢのシグナル伝達領域）を含むＰ２８４−１ＢＢｚを形質導入した。或いは、Ｔリンパ球にＰ２８ｚ及び４−１ＢＢＬを共形質導入した（これはＰ２８Ｚ＋４−１ＢＢＬと示される）。Ｐｚ１＋ＣＤ８０＋４−１ＢＢＬは、両方のリガンド（ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬ）を共発現するＰｚ１＋Ｔ細胞を示す。形質導入されたＴ細胞を、図１のもとで詳しく概説している条件下で、ＬＮＣａＰ腫瘍単層上で毎週刺激した（矢印によって示される）。ＣＤ８^＋のＰｚ１を形質導入したヒトＴリンパ球集団の増殖倍率がグラフに示されている。

【図8-1(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-1(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-1(3)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-2(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-2(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-2(3)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-3】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-4(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-4(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-4(3)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-5(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-5(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-5(3)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-5(4)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-6(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-6(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(1)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(2)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(3)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(4)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(5)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(6)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【図8-7(7)】図８は、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌについてのアミノ酸配列を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0073】

本発明は、抗原認識受容体及び副刺激リガンドの少なくとも１つを発現する遺伝子工学的に修飾された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞）を包含する細胞類、及び、抗原特異的な免疫応答の増強が望まれる腫瘍又はその他の病変の治療のための、それらの使用方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、前立腺特異的膜抗原を標的とする共形質導入されたヒトＴ細胞におけるＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの構成的なレトロウイルス発現が、インビボにおける散在する十分に確立された前立腺癌腫瘍をほぼ全面的に根絶できること、及び顕著な腫瘍抗原依存的なＴ細胞増殖を開始させることができたということを見出したことに基づいている。さらには、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを発現するＴ細胞により、バイスタンダー（bystander）Ｔ細胞を腫瘍部位において接触依存的かつ抗原特異的な様式でのトランス作用で副刺激することができた。まとめると、腫瘍の微小環境における免疫原性を高めることに加えて、最適に自己副刺激するための副刺激リガンドの構成的プールとしての遺伝子組み換えＴ細胞により、従来の養子Ｔ細胞療法を上回る著しい進歩が示される。さらには、富化されたＣＭＶ特異的Ｔリンパ球を使用してエクスビボで明らかにされるように、この方法は腫瘍の治療に限定されず、抗原特異的な免疫応答における増強が望まれる広範囲の様々な適用に対して適しており、そのような適用には、腫瘍の治療だけでなく、病原体感染又は感染性疾患に対する免疫応答の強化、及び、自己免疫又は同種移植の関連での調節性Ｔ細胞における免疫寛容を強化することもまた含まれる。

【0074】

造血系細胞系譜
哺乳動物の造血系（血液）細胞は、様々な生理学的活性を提供する。造血細胞は、リンパ系系譜、骨髄系系譜及び赤血球系系譜に分けられる。リンパ系系譜は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含み、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液における外来性病原体の検出、宿主にとって異物である細胞の検出などに備える。本明細書中で使用される用語「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟し、細胞媒介性免疫を主に担うリンパ球を示す。Ｔ細胞は適応免疫系に関与する。本明細書中で使用される用語「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」は、細胞媒介性免疫の一部であり、かつ、先天性免疫応答の期間中に作用するリンパ球を示す。これは、標的細胞に対するその細胞毒性効果を発揮するために事前の活性化を必要としない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞又はキラーＴ細胞）は、感染を受けた体細胞又は腫瘍細胞の死を誘導することができるＴリンパ球のサブセットである。

【0075】

本発明の方法において使用される細胞
本発明は、抗原認識受容体及び副刺激リガンドの少なくとも１つを発現する細胞、ならびに、強化された免疫応答を必要とする、疾患の治療のためにそのような細胞を使用する方法を提供する。１つの取り組みにおいて、腫瘍抗原特異的なＴ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞又は他の免疫応答性細胞が、腫瘍の治療又は防止のための１つ又は複数の副刺激リガンドを選択的に富化するためのシャトルとして使用される。例えば、副刺激リガンドの４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０を発現するＴ細胞が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を認識し、これと結合するキメラ抗原受容体ＰＺ１を発現するＴ細胞において構成的に共発現される。そのような細胞が、前立腺癌を治療又は防止するために、その必要性のあるヒト対象に投与される。別の取り組みにおいて、ウイルス抗原特異的なＴ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞を、ウイルス疾患を治療するために使用することができる。例えば、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬが、ＣＭＶを治療するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球において発現される。

【0076】

腫瘍抗原特異的なＴリンパ球（及びＮＫ細胞）
本発明の方法において使用することができるタイプの腫瘍抗原特異的なヒトリンパ球には、限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するために遺伝子組み換え末梢ドナーリンパ球（Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45）、α及びβヘテロダイマーを含む全長の腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するために遺伝子組み換え末梢ドナーリンパ球（Morgan, R.A., et al. 2006 Science, 314:126-129）、腫瘍生検物における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物（Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504; Panelli, M.C., et al. 2000 J. Immunol 164:4382-4392）、及び人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）又はパルス処理された樹状細胞を用いて選択的にインビトロで増殖された抗原特異的な末梢血白血球（Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427; Papanicolaou, G.A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505）が含まれる。Ｔ細胞は自家、あるいは同種であるか、又はインビトロでの遺伝子組み換え前駆細胞又は幹細胞由来であってよい。

【0077】

好適な腫瘍抗原（抗原性ペプチド）の何れも、本明細書中に記載される腫瘍関連の態様における使用に好適である。抗原の供給源には、様々な癌タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。抗原を、ペプチドとして、あるいは、無傷のタンパク質又はその一部として発現させることができる。無傷のタンパク質又はその一部は野生型であってもよく、又は、変異させることもできる。１つの好適な抗原が前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。

【0078】

ウイルス抗原特異的なＴリンパ球（及びＮＫ細胞）
例えば、免疫低下している対象における病原体感染又は他の感染性疾患の治療において使用される好適な抗原には、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原が含まれる。

【0079】

ＣＴＬの非精製供給源は、骨髄、胎児、新生児もしくは成人又は他の造血系細胞供給源、例えば、胎児肝臓、末梢血又は臍帯血のような、当該技術分野で公知の何れかのものであってよい。様々な技術を、この細胞を分離するために用いることができる。例えば、負の選択方法により、非ＣＴＬを最初に除くことができる。ｍＡｂは、正及び負の選択の両方のための特定の細胞系譜及び／又は分化段階に関連するマーカーを同定するために特に有用である。

【0080】

最終分化した細胞の大きな集団を比較的粗い分離によって最初に除くことができる。例えば、磁石ビーズ分離を、非常に多数の無関係な細胞を除くために最初に使用することができる。好ましくは、全造血系細胞の少なくとも約８０％、通常的には、全造血系細胞の少なくとも７０％が細胞単離の前に除かれる。

【0081】

分離のための手法には、密度勾配遠心分離；リセッティング；細胞密度を変える粒子へのカップリング；抗体被覆された磁石ビーズによる磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー；ｍＡｂに連結されるか、又は、ｍＡｂとの併用で使用される細胞毒性剤（これには、補体及び細胞毒素が含まれるが、これらに限定されない）；及び、固体マトリックス、（例えば、プレート、チップ）に結合された抗体によるパンニング、水簸、又は、他の好都合な技術の何れかが含まれるが、これらに限定されない。

【0082】

分離及び分析のための技術には、フローサイトメトリーが含まれるが、これに限定されない。この場合、フローサイトメトリーは様々な程度の精巧さを有することができ、例えば、複数のカラーチャンネル、低角度光散乱検出チャンネル及び鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルを有することができる。

【0083】

細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のような、死細胞と会合する色素を用いることによって、死細胞に対する選択をすることができる。好ましくは、細胞が、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地において、あるいは、他の何れかの好適な、好ましくは無菌の等張性培地において集められる。

【0084】

従って、本発明は一般には、抗原と結合する受容体と、外因性の副刺激リガンド（例えば、ＣＤ８０、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０及びＣＤ３０Ｌ）とを含むウイルス特異的又は腫瘍特異的なＴ細胞のような、免疫応答性細胞を提供する。

【0085】

ベクター
免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子組み換えは、実質的に均一な細胞組成物に組換えＤＮＡ構築物を形質導入することによって達成できる。好ましくは、レトロウイルスベクター（ガンマ−レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターのどちらか）が、ＤＮＡ構築物を細胞に導入するために用いられる。例えば、副刺激リガンドタンパク質（例えば、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ及びＣＤ３０Ｌのような、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、又は、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような、Ｉｇスーパーファミリーリガンド）をコードするポリヌクレオチド、あるいは、抗原又はその変異体又はそれらのフラグメントと結合する受容体をコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクターにクローン化することができ、発現を、その内因性プロモーターから、又は、レトロウイルスの長末端反復から、又は、目的とする標的細胞タイプに対して特異的なプロモーターから行わせることができる。非ウイルスベクターを同様に使用することができる。

【0086】

副刺激リガンド
少なくとも１つの副刺激リガンドとの相互作用により、Ｔ細胞の完全な活性化のために必要とされる抗原非特異的なシグナルがもたらされる。副刺激リガンドには、限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ２１など）、及び、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが含まれる。

【0087】

ＴＮＦリガンド
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主要な役割は免疫細胞の調節にある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドは数多くの共通する特徴を共有している。これらのリガンドの大部分が、短い細胞質セグメント及び比較的長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦリガンドには、限定されないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）／リンホトキシン−α（ＬＴα）、リンホトキシン−β（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ−１、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が含まれる。

【0088】

Ｉｇスーパーファミリーリガンド
免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識プロセス、結合プロセス又は接着プロセスに関与する細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな一群である。これらのタンパク質は構造的特徴を免疫グロブリンと共有する（それらは免疫グロブリンドメイン（ｆｏｌｄ）を有する）。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドには、限定されないが、ＣＤ８０及びＣＤ８６（これらはともに、ＣＤ２８に対するリガンドである）が含まれる。

【0089】

腫瘍抗原特異的又はウイルス抗原特異的な細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子組み換えのために、レトロウイルスベクターが一般には形質導入のために用いられるが、他の何れかの好適なウイルスベクター又は送達システムを使用することができる。少なくとも２つの副刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含む細胞を提供するための細胞のその後の遺伝子組み換えのために、レトロウイルスによる遺伝子移入（形質導入）が同様に効果的であることが判明している。レトロウイルス及び適切なパッケージング系統の組合せもまた効果的であり、この場合、カプシドタンパク質が、ヒト細胞に感染するために機能的である。様々な両種指向性のウイルス産生細胞株が知られており、これらには、ＰＡ１２（Miller, et al. (1985) Mol.Cell.Biol. 5:431-437）；ＰＡ３１７（Miller, et al. (1986) Mol.Cell.Biol. 6:2895-2902）；及びＣＲＩＰ（Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464）が含まれるが、これらに限定されない。両種指向性でない粒子もまた好適である（例えば、ＶＳＶＧエンベロープ、ＲＤ１１４エンベロープ又はＧＡＬＶエンベロープによる偽型粒子、及び他の当該技術分野で公知の何れかのもの）。

【0090】

形質導入の可能な方法には、細胞を、例えば、Bregni, et al ((1992) Blood 80:1418-1422）の方法によって、産生細胞と直接に共培養すること、あるいは、例えば、Xu, et al. ((1994) Exp. Hemat. 22:223230）の方法、及び、Hughes, et al. ((1992) J. Clin. Invest. 89:1817）の方法によって、適切な増殖因子及びポリカチオンを用いて、又は、それらを用いることなく、ウイルス上清単独又は濃縮されたベクターストックと培養することも含まれる。

【0091】

他の形質導入用ウイルスベクターを、本発明の副刺激リガンドを免疫応答性細胞において発現させるために使用することができる。好ましいことに、選択したベクターは、高い感染効率、並びに安定な組込み及び発現を示す（例えば、Cayouette et al.， Human Gene Therapy 8:423-430， 1997; Kido et al.， Current Eye Research 15:833-844， 1996; Bloomer et al.， Journal of Virology 71:6641-6649， 1997; Naldini et al.， Science 272:263-267， 1996;及び Miyoshi et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319， 1997を参照のこと）。使用可能な他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又は、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン・バールウイルスなど）が含まれる（同様にまた、例えば、下記文献のベクターを参照のこと、Miller， Human Gene Therapy 15-14， 1990; Friedman， Science 244:1275-1281， 1989; Eglitis et al.， BioTechniques 6:608-614， 1988; Tolstoshev et al.， Current Opinion in Biotechnology 1:55-61， 1990; Sharp， The Lancet， 337:1277-1278， 1991; Cornetta et al.， Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322， 1987; Anderson， Science 226:401-409， 1984; Moen， Blood Cells 17:407-416， 1991; Miller et al.， Biotechnology 7:980-990， 1989; Le Gal La Salle et al.， Science 259:988-990、1993;及びJohnson， Chest 107:77S-83S， 1995）。レトロウイルスベクターが特によく開発され、臨床環境で使用されている（Rosenberg et al.， N. Engl. J. Med 323:370， 1990; Anderso et al.， 米国特許第５，３９９，３４６号）。

【0092】

非ウイルス法もまた、細胞におけるタンパク質の発現のために用いることができる。例えば、核酸分子は、核酸をリポフェクションの存在下で投与することによって（Feigner et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413， 1987; Ono et al.， Neuroscience Letters 17:259， 1990; Brigham et al.， Am. J. Med. Sci. 298:278， 1989; Staubinger et al.， Methods in Enzymology 101:512 1983）、核酸をアシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲート化の存在下で投与することによって（Wu et al.， Journal of Biological Chemistry 263:14621， 1988; Wu et al.， Journal of Biological Chemistry 264:16985， 1989）、又は、外科的条件下での顕微注入によって（Wolff et al.， Science 247:1465 1990）、細胞内に導入することができる。遺伝子移入のための他の非ウイルス的手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション及びプロトプラス融合を使用するインビボでのトランスフェクションが含まれる。リポソームもまた、ＤＮＡを細胞内に送達するために潜在的に有益であり得る。正常な遺伝子を対象の患部組織に移植することもまた、正常な核酸をエクスビボでの培養可能な細胞タイプ（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に移入することによって達成することができ、その後、その細胞（又はその後代）が、標的化組織に注入されるか、又は、全身に注入される。

【0093】

ポリヌクレオチド療法において使用されるｃＤＮＡ発現を、いずれかの好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター又はメタロチオネインプロモーター）から誘導することができて、また、いずれかの好適な哺乳動物調節エレメントによって調節することができる。例えば、所望により、特異的な細胞型における遺伝子発現を優先的に誘導することが知られているエンハンサーを、核酸の発現を誘導するために使用することができる。使用するエンハンサーには、限定されないが、組織特異的又は細胞特異的なエンハンサーとして特徴づけられるエンハンサーが含まれてもよい。あるいは、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合には、調節は同族の調節配列によって媒介されてもよく、又は、所望により、上記で記載されたプロモーター又は調節エレメントのいずれかを含む、異種の供給源に由来する調節配列によって媒介されてもよい。

【0094】

得られる細胞は、その後、組み換えられていない細胞のための条件と類似する条件のもとで成長させることができ、それにより、組み換え細胞を様々な目的のために増殖及び使用することができる。

【0095】

ポリペプチド及びアナログ
本発明はまた、免疫応答性細胞で発現されるとき、それらの抗腫瘍活性を高める様式で改変される、ＰＺ１、Ｐ２８ｚ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、及びＣＤ３０Ｌのポリペプチド又はそれらのフラグメントを含んでいる。本発明は、アミノ酸配列又は核酸配列を、配列の変化を起こすことによって最適化する方法を提供する。そのような変化には、いくつかの変異、欠失、挿入又は翻訳後修飾が含まれてよい。本発明はさらに、本発明のいずれかの天然に存在するポリペプチドのアナログを含んでいる。アログは、本発明の天然に存在するポリペプチドと、アミノ酸配列の違いによって、又は、翻訳後修飾によって、又は、その両方によって異なる場合がある。本発明のアナログは一般には、本発明の天然に存在するアミノ酸配列のすべて又は一部と少なくとも８５％の同一性を示し、より好ましくは９０％の同一性を示し、最も好ましくは９５％の同一性又は９９％までもの同一性を示す。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５又は２０のアミノ酸残基であり、好ましくは少なくとも２５、５０又は７５のアミノ酸残基であり、より好ましくは１００超のアミノ酸残基である。ここでも、同一性の程度を確認する１つの例示的な方法では、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアにより、関連性の高い配列が示される。改変には、ポリペプチドのインビボ及びインビトロでの化学的誘導体化が含まれ、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化又はグリコシル化が含まれる；そのような改変を、ポリペプチドの合成又はプロセシング、あるいは、その後に続く、単離された修飾酵素による処理の期間中に生じさせることができる。アナログはまた、本発明の天然に存在するポリペプチドとは、一次配列における様々な変化によって異なる場合がある。これらには、遺伝子変異体（天然型及び誘導型の両方）（例えば、放射線照射又は硫酸エタンメチルへの暴露によって、あるいは、Sambrook， Fritsch and Maniatis， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.)(CSH Press， 1989)、又は、Ausubel et al.， supra）に記載されるような部位特異的変異誘発によるランダム変異から生じる変異体）が含まれる。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸又は合成アミノ酸（例えば、β−アミノ酸又はγ−アミノ酸）を含有する環化されたペプチド、分子及びアナログもまた含まれる。

【0096】

全長のポリペプチドに加えて、本発明はまた、本発明のポリペプチド又はペプチドドメインのいずれか１つのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される用語「フラグメント」は、少なくとも５個、１０個、１３個又は１５個のアミノ酸を意味する。他の態様において、フラグメントは、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、少なくとも３０個の連続するアミノ酸、又は少なくとも５０個の連続するアミノ酸であり、また、他の態様では、少なくとも６０個〜８０個、１００個、２００個、３００個又はそれ以上の連続するアミノ酸である。本発明のフラグメントは、当業者に公知の方法によって産生することができ、又は通常のタンパク質処理（例えば、生物学的活性のために必要としないアミノ酸の新生ポリペプチドからの除去、あるいは選択的ｍＲＮＡスプライシング事象又は選択的タンパク質処理事象によるアミノ酸の除去）からもたらされてもよい。

【0097】

非タンパク質アナログは、本発明のタンパク質の機能的活性を模倣するために設計された化学構造を有する。そのようなアナログは本発明の方法に従って投与される。そのようなアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超える場合がある。アナログ設計の方法は当該技術分野で周知であり、アナログの合成は、得られるアナログが免疫応答性細胞で発現されたとき、元のポリペプチドの抗腫瘍活性を増大するように化学構造を修飾することによるそのような方法に従って実施できる。これらの化学的修飾には、代替となるＲ基を置換すること、及び基準ポリペプチドの特定の炭素原子における飽和度を変化させることが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、タンパク質アナログはインビボでの分解に対して比較的耐性であり、これにより、投与時により長期に及ぶ治療効果がもたらされる。機能的活性を測定するためのアッセイには、下記の実施例において記載されるものが含まれるが、それらに限定されない。

【0098】

投与
本発明の遺伝子組み換え免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞又はそれらの前駆体）を含む組成物を、腫瘍、病原体感染、又は感染性疾患を治療するために対象に全身的又は直接に与えることができる。１つの態様において、本発明の細胞が、目的とする器官（例えば、腫瘍に冒された器官）に直接に注入される。あるいは、、遺伝子組み換え免疫応答性細胞を含む組成物が、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的とする器官に間接的に与えられる。増殖剤及び分化剤を、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞の産生をインビトロ又はインビボで増大させるために、細胞の投与前、投与中又は投与後に与えることができる。

【0099】

組み換えられた細胞を、何れかの生理学的に許容される賦形剤中で、通常の場合には血管内に投与することができるが、組み換えられた細胞を、骨、又は、細胞が再生及び分化のための適切な部位を見出し得る他の好都合な部位（例えば、胸腺）に導入してもよい。通常、少なくとも１×１０^５個の細胞が投与され、これは最終的には１×１０^１０個以上に達する。本発明の遺伝子組み換え免疫応答性細胞は、精製された細胞集団を含むことができる。当業者は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）のような、様々な周知の方法を使用して、集団における遺伝子組み換え免疫応答性細胞の割合を容易に決定することができる。遺伝子組み換え免疫応答性細胞を含む集団における純度の好ましい範囲は、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、及び約６５％〜約７０％である。より好ましくは、純度は約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％である；さらにより好ましくは、純度は、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％である。投与量を、当業者は容易に調節することができる（例えば、純度の低下が、投与量の増大を必要とする場合がある）。細胞を注射、カテーテルなどによって導入することができる。所望により、様々な因子も含めることができ、これらには、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＩＬ−１１、ならびに、それ以外のインターロイキン）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなど）、インターフェロン（例えば、γ−インターフェロンなど）、及び、エリスロポエチンが含まれるが、これらに限定されない。

【0100】

本発明の組成物には、遺伝子組み換え免疫応答性細胞又はその前駆体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が含まれる。投与は自己又は異種であることが可能である。例えば、免疫応答性細胞又は前駆体を１人の対象から得て、同じ対象に、又は異なる適合し得る対象に投与することができる。
本発明の末梢血由来の免疫応答性細胞又はその子孫（例えば、インビボ、エクスビボ又はインビトロ由来）を、局所注入（カテーテル投与を含む）、全身注入、局所注入、静脈内注入又は非経口投与によって投与することができる。本発明の治療用組成物（例えば、遺伝子組み換え免疫応答性細胞を含有する医薬組成物）を投与するとき、治療用組成物は一般には、単位投与量の注入可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化される。

【0101】

製剤化
遺伝子組み換え免疫応答性細胞を含む本発明の組成物は、都合良くは、選択されたｐＨに緩衝化されてよい無菌の液体製剤、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散物又は粘性組成物として与えることができる。液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物及び固体組成物より、調製することが容易である。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与することが幾分より便利である。他方で、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲において配合することができる。液体組成物又は粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散用媒体であってよい担体を含むことができる。

【0102】

無菌の注射溶液を、本発明を実施する際に利用される遺伝子組み換え免疫応答性細胞を、所望のように、その他の成分の様々な量とともに、適切な溶媒の必要とする量に配合することによって調製することができる。そのような組成物は、好適な担体、希釈剤、又は賦形剤（例えば、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなど）との混合であってよい。組成物はまた、凍結乾燥することができる。組成物は、所望の投与経路及び製剤に依存して、様々な補助物質を含有できて、例えば、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤又は粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などを含有できる。標準的教本、例えば、“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”, 17th edition, 1985、これは参照により本明細書中に組み込まれる）などを、好適な製剤を、過度な実験を伴うことなく調製するために参考にすることができる。

【0103】

抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を包含する、組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤を加えることができる。微生物の作用を防止することを、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証することができる。注射用医薬品形態の長期に及ぶ吸収を、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）の使用によってもたらすことができる。しかしながら、本発明により、使用する何れかの賦形剤、希釈剤又は添加剤は、遺伝子組み換え免疫応答性細胞又はその前駆体との適合性を有していなければならない。

【0104】

組成物は等張性にしてもよい。すなわち、組成物は、血液及び涙液と同じ浸透圧を有することができる。本発明の組成物の所望の等張性を、塩化ナトリウム、又は他の薬学的に許容される物質（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいは、他の無機溶質又は有機溶質など）を使用して達成することができる。塩化ナトリウムが、特にナトリウムイオンを含有する緩衝液については好ましい。

【0105】

所望により、組成物の粘度を、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルで維持することができる。容易かつ経済的に入手可能であり、また、共同して機能することが容易であるので、メチルセルロースが好ましい。他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された物質に依存する。重要な点は、選択した粘度を達成するであろう量を使用することである。明白ではあるが、好適な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び具体的な投与形態、例えば、液体投与形態の性質（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲル又は徐放性形態又は液体充填形態のような、別の液体形態に配合されることになるかどうか）に依存する。

【0106】

組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されなければならないこと、又本発明に記載されるような遺伝子組み換え免疫応答性細胞の生存性又は効力に影響を及ぼさないことを、当業者は認識されるだろう。このことは、化学及び薬学の原理に熟練した当業者には何ら問題とならず、あるいは、様々な問題を、標準的な教本を参照することによって、又は、本開示、及び、本明細書中に引用される文書から、（過度な実験を伴わない）簡単な実験によって容易に避けることができる。

【0107】

本発明の遺伝子組み換え免疫応答性細胞の治療的使用に関する１つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。投与されるべき細胞の量は、治療されている対象に対して変化する。１つの態様において、１０^４個〜１０^１０個の、１０^５個〜１０^９個の、又は１０^６個〜１０^８個の本発明の遺伝子組み換え免疫応答性細胞がヒト対象に投与される。好ましい態様において、少なくとも約１×１０^８個の、２×１０^８個の、３×１０^８個の、４×１０^８個の、及び５×１０^８個の本発明の遺伝子組み換え免疫応答性細胞がヒト対象に投与される。どのくらいが効果的な用量であると見なされるかを正確に決めることは、具体的な対象のサイズ、年齢、性別、体重及び状態を含めて、それぞれの対象に対する個別的な要因に基づいてもよい。当業者は、投与量を本発明の開示及び当該技術分野における知識から容易に確認することができる。

【0108】

当業者は、本発明の組成物における細胞、ならびに、最適な添加剤、賦形剤及び／又は担体の量、また、本発明の方法において投与されるべき細胞、ならびに、最適な添加剤、賦形剤及び／又は担体の量を容易に決定することができる。典型的には、（活性な幹細胞（複数を含む）及び／又は薬剤（複数を含む）に加えて）任意の添加剤が、０．００１〜５０％（重量）の量でリン酸塩緩衝生理食塩水中に存在して、有効成分が、約０．０００１ｗｔ％〜約５ｗｔ％（好ましくは約０．０００１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、さらにより好ましくは約０．０００１ｗｔ％〜約０．０５ｗｔ％）のように、マイクログラムからミリグラムの程度で存在する。従って、当然のことではあるが、動物又はヒトに投与される何れかの組成物について、及び何れかの特定の投与方法について、、好適な動物モデル（例えば、齧歯類、例えば、マウスなど）における致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を確認することによるような、毒性を、並びに、好適な応答を誘発する、組成物（複数を含む）の投薬量、それにおける成分の濃度、及び組成物（複数を含む）の投与時期を決定することが好ましい。そのような決定には、当業者の知識、本発明の開示及び本明細書中に引用される文書から、過度な実験を必要としない。また、連続投与のための期間を、過度な実験を伴うことなく確認することができる。

【0109】

治療方法
本明細書には、対象における腫瘍を治療する方法が提供される。本明細書には、免疫不全のヒト対象のような、対象における病原体感染又は他の感染性疾患を治療する方法も包含される。これらの方法は、所望の効果が現状の緩和又は再発の防止であるならば、本発明のＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＴＬ細胞の、所望の効果に到達するための有効量を投与することを含む。治療のために、投与される量は、所望の効果を生じるための有効な量である。有効量を単回で、又は一連の投与で提供できる。有効量をボーラス剤で、又は連続灌流によって提供できる。

【0110】

「有効量」（又は「治療有効量」）は、治療において有益な又は所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。有効量を単回又はそれ以上の投与量で対象に投与できる。治療に関して、有効量は、疾患の進行を緩和する、改善する、安定化する、反転する、又は遅延するために、あるいは、疾患の病理的帰結を減少させるために十分な量である。有効量は一般に症例毎に医師によって決定され、当業者の技能の範囲内である。有効量に到達するための適切な用量を決定する際に、典型的にはいくつかの因子を考慮に入れる。これらの因子には、対象の年齢、性別及び体重、治療する疾患、疾患の重篤度、ならびに、投与する抗原結合フラグメントの形態及び有効濃度を含む。

【0111】

抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法について、典型的には１０^９個の範囲の細胞用量を注入する。遺伝子組み換え細胞を宿主に投与してその後分化が生じることにより、Ｔ細胞は特異的な抗原に対して特異的に指向するよう誘導される。Ｔ細胞の「誘導」には、抗原特異的Ｔ細胞を、例えば、欠失又はアネルギーによって不活性化することが含まれてもよい。不活性化は、例えば自己免疫障害において、耐性を確立又は再確立するために特に有用である。組み換え細胞は、当該技術分野で公知の方法の何れかによって投与でき、そのような方法は、これらに限定されないが、静脈内、皮下、鼻腔内、腫瘍内、クモ膜下、胸膜内、腹腔内、及び、胸腺へ直接を含んでいる。

【0112】

治療的方法
本発明は、その必要のある対象において免疫応答を増大させるための方法を提供する。１つの態様において、本発明は、対象において腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。本発明は、従来の治療的介入に従順しない前立腺癌又は転移性前立腺癌を有する対象を治療するために特に有用な治療法を提供する。治療に対する好適なヒト対象は、典型的には臨床基準により区別される２つの治療群を含む。「進行した疾患」又は「高い腫瘍負荷」を有する対象が、臨床的に測定可能な腫瘍を有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラム又はＸ線；それら自身ではこの集団を同定するには十分ではない、陽性の生化学的又は組織病理学的マーカーによる）腫瘍の質量に基づいて検出可能な腫瘍である。本発明において具体的に例示される医薬組成物が、対象の疾患を緩和するという目的において、抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの対象に投与される。理想的には、結果として腫瘍質量の減少がもたらされるが、何らかの臨床的改善は利益となる。臨床的改善には、腫瘍のリスク又は進行速度の低下、あるいは、病理的帰結の減少が含まれる。

【0113】

好適な対象の第２群は、「アジュバント群」として当該技術分野で公知である。これは、腫瘍の病歴を有したことがあるが、別の治療法に対して応答性であった個人である。先の治療法には、これらに限定されないが、外科的切除、放射線療法及び従来の化学療法が含まれる。結果的に、これらの個人は、臨床的に測定可能な腫瘍を何ら有していない。しかしながら、これらの個人は、最初の腫瘍部位の近くであるか、又は、転移によるかのどちらかで、疾患進行のリスクがあることが疑われる。この群はさらに、高リスク個人及び低リスク個人に細分化することができる。この細分化は、最初の治療の前又は後で観測される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は臨床技術分野で公知であり、それぞれの異なる腫瘍について適切に定義される。高リスクのサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に侵入しているか、又はリンパ節の関与を示す個人である。

【0114】

別の一群は、腫瘍に対する遺伝的素因を有しているが腫瘍の臨床的徴候を未だ明白に示していない群である。例えば、乳癌に関連する遺伝子突然変異について検査で陽性であるが未だ出産可能な年齢である女性は、予防的手術の実施に該当する程度にまで腫瘍が発生するのを防止するための治療において、本明細書中に記載される１つ又はそれ以上の抗原結合フラグメントの受容を望むことができる。

【0115】

下記の腫瘍のいずれかを有するヒト腫瘍対象が、特に好適な対象である：神経膠芽細胞腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟組織肉腫及び様々な癌腫（前立腺癌及び小細胞肺癌を含む）。好適な癌腫にはさらに、腫瘍学の分野で公知のいずれかが含まれ、これらには、星状膠細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞肺腺癌及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌、並びに、それらの肝臓転移物、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、ヘパトーム、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭状癌、脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びに、重鎖病、乳腫瘍（例えば、導管腺癌及び小葉腺癌など）、子宮頸部の扁平上皮癌及び腺癌、子宮及び卵巣の上皮癌、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮癌、Ｂ細胞リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びびまん性）、形質細胞腫、急性白血病及び慢性白血病、悪性メラノーマ、軟組織肉腫及び平滑筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0116】

対象が、疾患の進行した形態を有する場合、治療の目的には、疾患進行の緩和又は逆行、及び／あるいは、副作用の改善が含まれてもよい。対象が、それについて既に治療を受けている疾患の病歴を有する場合、治療の目的には典型的には、再発のリスクの低下又は遅延が含まれる。

【0117】

従って、本発明は、腫瘍抗原と結合する受容体と、副刺激リガンドをコードするベクターとを含む免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象において腫瘍を治療又は防止する方法を提供する。１つの態様において、腫瘍は、前立腺癌、結腸癌、乳癌及び神経膠芽細胞腫からなる群より選択される。別の態様において、腫瘍抗原は、前立腺特異的膜抗原、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１又はｈＴＥＲＴである。

【0118】

別の取り組みにおいて、本発明は、抗原と結合する受容体と、副刺激リガンドをコードするベクターとを含む免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象において耐性を増強する方法を提供する。１つの態様において、この方法は、自己免疫応答疾患、又は、同種移植に関連する疾患を予防又は軽減する。

【0119】

副刺激リガンドの構成的表面発現の結果として、養子移入されたヒトＴ細胞又はヒトＮＫ細胞には、副刺激リガンドを欠いている本質的に免疫抗原性が低い又は免疫不全の環境において、増強された増殖能、細胞溶解能及び生存能が賦与される。さらには、腫瘍又はウイルス感染へのそれらの局在化、及び、それらの増殖の後、副刺激リガンドを発現するＴ細胞は、腫瘍部位又はウイルス感染部位を、生理学的な抗腫瘍応答又は抗ウイルス応答に関与する広範囲の免疫細胞（腫瘍浸潤性のリンパ球、ＮＫ-、ＮＫＴ-細胞、樹状細胞及びマクロファージ）のための伝導性の高い環境に変える。

【0120】

他の態様において、本発明は、病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染又は原生動物感染）を有する対象を治療するための方法を提供する。本発明は、免疫低下している対象において免疫応答を高めるために特に有用である。本発明の方法を使用する治療の影響を受けやすい例示的なウイルス感染には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びインフルエンザウイルスの感染が含まれるが、これらに限定されない。

【0121】

従って、本発明は、本明細書中に記載されるような免疫応答性細胞の有効量を投与することを含む、対象において病原体感染を治療又は防止する方法を提供する。

【0122】

キット
本発明は、腫瘍、病原体感染、免疫障害又は同種移植に関連する症状を治療又は防止するためのキットを提供する。１つの態様において、キットは、１つ又はそれ以上の副刺激リガンドを含む免疫応答性細胞の有効量を単位用量形態で含有する治療用又は予防用組成物を含む。いくつかの態様において、キットは、治療用又は予防用ワクチンを含有する減菌容器を含み、そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック又は当該技術分野で公知の他の好適な容器形態が可能である。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、メタルフォイル又は薬剤を保持するために好適な他の材料から産生することができる。

【0123】

所望により、免疫応答性細胞は、腫瘍、病原体感染、免疫障害又は同種移植に関連する症状を有する、あるいはこれらを発症する危険性がある対象にこの細胞を投与するための説明書と一緒に提供される。説明書は一般には、腫瘍、病原体感染、免疫障害又は同種移植に関連する症状の治療又は防止のために組成物を使用することについての情報を含む。他の態様において、説明書は下記のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；腫瘍、病原体感染、免疫障害又は同種移植、あるいは、それらの症状を治療する又は防止するための投与計画及び投与；注意；警告；適応症；使用禁忌；過量情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；及び／又は参考文献。説明書は、（存在するときには）容器に直接に印刷されるか、又は容器に添付されるラベルとして、あるいは、容器内又は容器とともに供給される別個のシート、パンフレット、カード又はフォルダーであってよい。
組換え方法は当該技術分野で周知である。本発明の実施では、別途示されない限り、当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は、文献において、例えば、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”second edition(Sambrook et al.,1989); ”Oligonucleotide Synthesis”(Gait,ed.,1984); ”Animal Cell Culture”(Freshney,ed.,1987); “Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.); ”Handbook of Experimental Immunology”(Wei&Blackwell,eds); ”Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller&Calos,eds,1987); “Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubelet al.,eds.,1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”(Mulliset al., eds.,1994);及び”Current Protocols in Immunology”(Coligan et al., eds.,1991)などにおいて詳しく説明される。これらの技術はポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用することができ、また、そのようなものとして、本発明を組み立てる際に、また、本発明を実施する際に考慮することができる。特に有用な技術が下記の欄において検討される。

【0124】

（実施例）
下記の実施例は本発明をさらに説明するものであり、これらの例示により本発明がこれに限定されるものではない。

【実施例1】

【0125】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）による副刺激無しで、内因性Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を介する周期的な刺激により、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴ細胞は、顕著な増殖応答をもたらす。
Ｔ細胞における副刺激リガンドの構成的発現が、ＡＰＣが媒介する副刺激の代わりになり得るかどうかを評価するために、ヒト初代Ｔ細胞のＴ細胞の応答を３つの実験系において最初に調べた。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）が媒介するＴ細胞活性化を使用して、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを形質導入した末梢血Ｔリンパ球の増加を定量化した（図１ａ）。ここで、この形質導入したＴリンパ球を、どちらかのリガンドを単独で形質導入したＴ細胞、又は何ら形質導入していないＴ細胞と比較した。副刺激リガンド非存在下の反復性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激のみでは、最初の再刺激の後、Ｔ細胞を増殖できず、Ｔ細胞数の急速な減少をまねいた（図１ｂ）。際立って対照的に、ＯＫＴ３に刺激されたＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞は、２１日間にわたる平均して２３７倍より高い増殖を誘発した。これに対して、どちらかのリガンドを単独で形質導入したＴ細胞の増殖は、平均して１／８．１に低下した（ｐ＜０．０００１）。これらの結果に基づいて、副刺激によるＴ細胞のコンセプトを臨床的に関連する養子Ｔ細胞療法の応用に拡張するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な記憶ドナーＴ細胞（memory doner T cell）、及び分化抗原に特異的な、遺伝子的にリダイレクトした自己Ｔ細胞（genetically redirected autologous T cell）の２種のＴ細胞に適用した。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｐｐ６５^＋人工ＡＰＣ^２４の上で一時的に増殖させたＣＭＶ−ｐｐ６５に特異的なＴリンパ球に、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを形質導入した（図１ｃ）。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｐｐ６５を形質導入した結腸腫瘍細胞株Caco−２に曝した後、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの両方の副刺激リガンドを有するＴ細胞は、減少し続ける対照群のＴ細胞数と比較して、著しく高い（２０９倍、ｐ＜０．０００１）増殖を示した（図１ｄ）。

【0126】

腫瘍反応性のヒトＴリンパ球を迅速に産生するために、末梢血Ｔ細胞に、キメラ抗原受容体Ｐｚ１（Gade et al., Cancer Res. 65:9080-9088,2005）、すなわち腫瘍抗原ＰＳＭＡに対して特異的な非ＨＬＡ制限抗原受容体をレトロウイルスにより形質導入した。Ｐｚ１受容体は、ヒトＣＤ３ζシグナリングドメインと融合するＰＳＭＡ結合性単鎖抗体フラグメントを含み、臨床試験において現在使用されている他のキメラ抗原受容体と構造的に類似している。ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＰｚ１^＋Ｔ細胞（図１ｅ）は、ＰＳＭＡ^＋、ＣＤ８０⁻、ＣＤ８６⁻、４−１ＢＢＬ⁻ＬＮＣａＰ細胞による週３回の刺激の後、顕著な増殖応答を示した（平均して１０４２倍の増殖、図１ｆの上段のグラフ）。この増大は、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを、Ｔ細胞においてではなく、腫瘍細胞において発現させたときに得られた増加（図１ｆの下段のグラフ）よりも９倍大きかった（ｐ＜０．０００１）。さらなる分析では、従来法で刺激したＴリンパ球と比較して、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴ細胞をＰＳＭＡに曝すことによるＩＬ−２及びＩＦＮ−γのより増大した誘導、更にはより大きいそれらの抗原特異的な細胞溶解能及び低下したアポトーシス感受性が観察された（データは示さず）。同時に、ＣＤ８０の存在又は不存在で、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）又はＣＤ３０Ｌを含むＴＮＦリガンドファミリー^５をの他のメンバーを検討した結果、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの組合せが、最も強力であることが見出された（データは示さず）。

【0127】

全体として、これらのインビトロでの検討は、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴリンパ球が、不十分なＴＣＲ活性化を強力に促進でき、さらにＡＰＣが提供する副刺激の欠如の代用になり得ることを明らかにしている。

【実施例2】

【0128】

ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴ細胞は、確立された全身性腫瘍を根絶する。
本発明者らのＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞の効力をインビボで調べるために、ＰＳＭＡ^＋ＰＣ−３腫瘍細胞（Gong et al., Neoplasia 1:123-7,1999、これはその全体を参照により本明細書に取り込まれる）を利用して、多病巣性の確立された前立腺癌のモデルを作成した。養子Ｔ細胞療法を開始する前に、腫瘍を静脈内に接種し、４週間後に、二形態の生物発光及び磁気共鳴画像化を使用して可視化した。肺、頸部リンパ節、骨髄及び肝臓を主要疾患部位として同定した（図２ａ）。このモデルにおいて、腫瘍を接種した後、ＣＤ８０又は４−１ＢＢＬのいずれか又は両者を発現するか、あるいはどちらも発現しない、８×１０^６個のそれぞれのＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞の単回静脈注射により、４週間処置した。

【0129】

形質導入していないＴ細胞と同様に、標的のＰＳＭＡ^＋腫瘍をインビトロで溶解できなかったＣＤ１９標的化Ｔ細胞の８×１０^６個で処置された対照マウスは、腫瘍組織量がマウスを屠殺しなければならなくなるまで絶え間なく増大した（図２ｂ、図２ｃ）。Ｐｚ１^＋Ｔ細胞による処置では、短期間で腫瘍組織量の減少をもたらしたが、その後は末期腫瘍への進行が続き（図２ｂ）、これにより、１２日間のわずかながらの延命効果しかなかった（ｐ＝０．０００１、図２ｃ）。ＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞におけるＣＤ８０又は４−１ＢＢＬのどちらか単独での構成的発現は、この治療において、ほんのわずかに増強しただけであり、生存期間の中央値をそれぞれ６３日及び６６日に延長した（それぞれ、ｐ＝０．０７７、ｐ＝０．０５６）。ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴ細胞は、有意な応答を誘導し、養子Ｔ細胞導入後４日目に腫瘍組織量を１／３．３に減少させた（ｐ＝０．００２８）。Ｐｚ１^＋Ｔ細胞処置群と比較して、１６日後に１／１３７５への減少が得られた（ｐ＝０．０００２）。１０匹中７匹の処置動物が、Ｐｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球を注入した後２００日間、腫瘍を有しないままであり、他の処置群又は対照群の全てにおいて、腫瘍を有しない動物は０匹であった（図２ｃ）。治療効果が十分ではなかった３匹のマウスは最初、再発する前に顕著な腫瘍退行を示し（図２ｂ）、１００日間生存した（図２ｃ）。

【実施例3】

【0130】

インビボでのＴ細胞の増殖は顕著で、抗原特異的である。
インビボでのＴ細胞の遊走及び蓄積を腫瘍局在化及び腫瘍組織量に関連して追跡及び定量化するために、養子移入したＴ細胞をさらに、コメツキムシＲｅｄ−ルシフェラーゼ（Ponomarev et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2004 May; 31(5):740-51）で標識した（CBR-luc、図３ａ）。Ｐｚ１^＋Ｔ細胞で処置したマウスの連続画像化は、Ｔ細胞注入後４日目にピークに達するシグナルを示し、優れた増加が示された（図３ｂ）。その後、低レベルのシグナルが１８日目まで検出可能であった。Ｐｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞の場合には、ピークシグナルが８日目に検出され（Ｐｚ１^＋Ｔ細胞よりも４１倍高い低位光子計数（nadir photon count）、ｐ＝０．０００９）、その後、徐々にシグナルが低下したが、いくつかの動物では、生物発光が１００日目まで依然として検出できた（図３ｂ）。１９ｚｌ^＋Ｔリンパ球には無いＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの共発現の効果（図３ｂ）が、増殖を生じさせるために抗原刺激を必要とするということと一致していることは、重要である。１群あたり３匹の処置マウスにおける肺の単一細胞懸濁物のフローサイトメトリー分析及びＴ細胞計数では、実際のＴ細胞数が、得られた生物発光シグナル強度と極めてよく一致していることが確認された（図３ｃ、図３ｄ）。従って、これらの結果は、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを共発現するＴ細胞は、完全でないとしても、最終的な減衰状態に入る前に、抗原依存的に実質的なＴ細胞クリアランスを拡張させることを明らかにした。

【実施例4】

【0131】

副刺激リガンドＣＤ８０及び４−１ＢＢＬのそれぞれの受容体であるＣＤ２８及び４−１ＢＢとの免疫学的シナプス（immunological synapse）における接触が、機能的Ｔ細胞の自己副刺激に先行する。
構成的に発現した副刺激リガンドがＴ細胞をシス作用で活性化するかどうかを検討するために、これらのリガンドがＴ細胞の活性化においてそれらのコグネイト受容体とともに共局在化するかという問題を最初に検討した。ＣＤ２８及び４−１ＢＢはともに、免疫学的シナプスの中心膜区画へ集められた後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達を増幅する^{３１〜３３}。従って、Ｔ細胞と腫瘍細胞の接触領域へのＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの共局在化が、自己副刺激のための必要条件であると推察される。４−１ＢＢＬの分布を共焦点顕微鏡によって可視化するために、細胞質ドメインを単量体ｄｓＲｅｄと融合し、このタンパク質をＰｚ１を形質導入したＣＤ８^＋Ｔリンパ球においてＣＤ８０と共発現させた。改変されていないＣＤ２８⁻４−１ＢＢＬ⁻ＬＮＣａＰ細胞と混合する直前に、Ｔ細胞を、シナプス形成後の脂質ラフトクラスターを可視化するためにフルオレセインイソチオシアナート複合化コレラトキシンβサブユニット（ＦＩＴＣ−ＣＴＢ）で標識化した。ＬＮＣａＰ腫瘍との結合に続いて、４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０、更には４−１ＢＢ及びＣＤ２８が、コレラトキシン−ＦＩＴＣ陽性Ｔ細胞と腫瘍細胞の接触領域に集められた（図４ａ、図４ｂ）。この相互作用の機能的結果を調べるために、グランザイムＢ（ＧＲＢ）の共局在化を観察した。まばらではあるが、明確なＧＲＢ凝縮が、Ｐｚ１発現ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びその同族腫瘍標的のクラスターにおける接触域の近くに局在化した（図４ｃ、図４ｄ）を分析して、定量化した。Ｔ細胞と腫瘍細胞の接合部へのＧＲＢに集められた中央値は、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞において２．２倍に増幅された（ｐ＝０．０００１）。これらの観測の差異が、実際に同じ細胞内の４−１ＢＢＬと４−１ＢＢとの結合の結果であったことを確認するために、４−１ＢＢの発現を、４−１ＢＢＬ及び４−１ＢＢ特異的ｓｈＲＮＡの安定的共発現によってノックダウンさせた（データは示さず）。４−１ＢＢのノックダウンは、すべての画像化された細胞クラスターにおけるＴ細胞接合部での４−１ＢＢＬの存在にもかかわらず、シナプスの近くにおけるＧＲＢ密度を著しく低下させた（１／２．０２に低下、ｐ＜０．０００１）。これらの知見は、免疫学的シナプスにおける抗原誘導的な接触の後に、副刺激リガンドが、同じＴ細胞表面上でその受容体と機能的に結合することを強く示唆している。

【0132】

自己副刺激をさらに明らかにするために、内因性の４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬ相互作用を、直近に形質導入したＴ細胞における４−１ＢＢＬの最も初期の発現後に分析することができる、単一細胞アッセイを行った。これを実施するために、ホタルルシフェラーゼを、ＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋４−１ＢＢ⁻のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＪＮＬ）のクローンにおいてＮＦ−κＢ（４−１ＢＢシグナル伝達の重要な下流側のエフェクター）の転写制御下で最初に発現させた。散発的なバイスタンダー副刺激によるＮＦ−κＢ誘導を排除するために、ＪＮＬ細胞を、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０をコードするレトロウイルスベクターに曝し、その４時間後、すなわち、最初の検出可能な表面遺伝子発現のかなり前に（データは示さず）、限界希釈によってサブクローン化し、プレートに結合されたＯＫＴ３によって直ちに刺激した。図４ｅに示されるように、単離されたＣＤ８０^＋ＣＤ２８^＋４−１ＢＢＬ^＋４−１ＢＢ^＋Ｔ細胞は、対照ベクターを形質導入したＪＮＬ細胞とは対照的に、ＮＦ−κＢを顕著に上向き調節した。発光シグナルを、（製品仕様書の）Methodsに記載されるように、単一の多重形質導入細胞を含有している３６ウエルで観察した。２つのリガンド対の共発現はＮＦ−κＢ依存的シグナルを３．８倍に増大させた（対照ＪＮＬと比較して；ｐ＜０．０００１；図４ｆ）。このアッセイの何れの時点でも副刺激リガンドの唯一の供給源は単離されたＴ細胞自身の表面であったのだから、このＮＦ−κＢによる上向き調節は自己副刺激の影響だけを反映したものであった。

【実施例5】

【0133】

抗原特異的なバイスタンダー（bystander）Ｔ細胞のインビトロでのトランス副刺激
副刺激リガンドの構成的発現は、遺伝子組み換えＴ細胞をトランス作用で副刺激Ｔ細胞へすることも可能にする。注目すべきことに、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞及びＣＤ８０⁻４−１ＢＢＬ⁻Ｔ細胞とを含む三細胞クラスターが、図４に示される共焦点による検討において時々確認された（図５ａ）。トランス副刺激の機能的証拠を提供するために、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを発現するＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞を、ＣＤ８０又は４−１ＢＢＬを形質導入していないカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識のＴ細胞と混合する共培養系を考案した。これらのＣＦＳＥ標識したＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞が自己のバイスタンダーＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球によって効果的に副刺激されたことを見出した（図５ｂ、図５ｃ）。トランスウエル膜によるそれらの分離が、細胞の接触依存的メカニズムと一致して、ＧＲＢの強力な誘導及びｐｐ６５キラー細胞において開始された顕著なＴ細胞の増殖を大きく低下させているので（図５ｄ）、２つのＴ細胞集団の間での物理的接触は、ＣＭＶ反応性の細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖のための必要条件であった。

【実施例6】

【0134】

腫瘍浸潤Ｔ細胞のインビボでのトランス副刺激
本発明者らは、これらの観測から、Ｔ細胞媒介のトランス副刺激がインビボで作用するかを調べることに到った。この目的のために、次の公知の２つの動物モデルを組み合わせた。腫瘍が肺に限定されるＲＭ１−ＰＳＭＡ腫瘍モデル（Gade et al., Cancer Res. 65:9080-9088, 2005）、及び腫瘍細胞が骨髄に選択的にコロニーを形成するＲａｊｉ腫瘍モデル（Brentjens et al., Nat Med. 2003 Mar;9(3):279-86）である。すべてのマウスを、Ｐｚ１を形質導入したＴ細胞（これはＣＢＲ−ｌｕｃも発現した（図３））で処置した。次いて、ルシフェラーゼ陰性のＰｚ１^＋Ｔ細胞（これはＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを発現するか、又は、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを有しないかのいずれかである）を動物に注入した。腫瘍細胞におけるガウシア−ルシフェラーゼ（Ｇａｕ−Ｌｕｃ）の発現、及び、Ｐｚ１^＋のＴ細胞におけるＣＢＲ−ｌｕｃの発現により、腫瘍の進行、並びにＴ細胞の空間的及び時間的な蓄積を同時にモニターするための二重生物発光画像化の使用が可能であった。すべての処置群において養子移入後６時間（０日目）で、ＣＢＲ−ｌｕｃ^＋リンパ球の類似の組織分布及び生物発光シグナルが観測された（図６ａ）。２日目に、ＣＢＲ−ｌｕｃ^＋Ｐｚ１^＋Ｔ細胞に対するＰｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞の効果は未だ大きくなかった（中央値で１．２倍、バイスタンダーとしてのＰｚ１^＋Ｔ細胞と比較して、ｐ＝０．０９４７）。ＣＢＲ−ｌｕｃシグナルはその後、対照のＰｚ１^＋Ｔ細胞を与えたマウスでは減衰した（図６ａ）。対照的に、Ｐｚ１^＋ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球を与えたマウスでは、胸部領域にわたって記録したこの光子計数が、平均して６．５倍に増大した（ｐ＝０．０１２２、図６ａ、図６ｂ）。重要なことに、この効果は、ＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞に対して選択的であった。これは、共注入したＣＢＲ−ｌｕｃ^＋の１９ｚｌ形質導入Ｔ細胞が、これは両大腿骨において確立されたＲａｊｉ腫瘍を浸潤しているが、何れの時点でも胸部の生物発光シグナルを著しく増大させなかったからである（４日目に中央値で１．５倍に増大、ｐ＝０．０９４７、図６ａ、図６ｂ）。まとめると、インビトロ及びインビボでのこれらのデータは、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞が、副刺激をトランス作用で提供することによってＴ細胞の応答を局所的に増強することを示唆している。

【0135】

Ｔリンパ球においてＣＤ８０を構成的に提示したことは、ＣＤ２８に対する副刺激リガンドとしては機能するが、Ｔ細胞増殖の負の調節因子（例えば、高い親和性でのＣＴＬＡ−４など）にも関与し得る（Hodi et al., Clin Cancer Res. 2007 Sep 15:13:5238-42）。Ｔ細胞に発現するＣＤ８０が媒介する治療的に望ましくないＴ細胞自己阻害を回避するために、Ｔリンパ球を、キメラ抗原受容体Ｐ２８ｚ（Maher et al., Nature Biotechnology,Vol20, Jan 2002, P70-75）と共に形質導入して、４−１ＢＢＬをＴ細胞表面に発現させた（図７）。この二重融合受容体（dual fusion receptor）Ｐ２８ｚは、ＴＣＲ及びＣＤ２８の両方のシグナル伝達部位を含有する。Ｐ２８ｚを介するシグナル伝達は、持続したＴ細胞増殖をもたらすことはできなかったが、４−１ＢＢＬの共発現は、増殖応答を１４日目までに１０倍を超えて顕著に高めた。しかしながら、両方の全長リガンドがＰｚ１を形質導入したＴリンパ球の表面に発現されるとき、相乗作用的なＣＤ８０−４−１ＢＢＬ副刺激シグナルが依然として最強であった（Ｐ２８Ｚ＋４−１ＢＢＬよりもおよそ２倍高い、図７）。従って、キメラ抗原受容体の構築物に融合されたＣＤ２８シグナル伝達エレメントによって中継されるＣＤ２８シグナルは、Ｐｚ１^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔリンパ球に、増強した増殖特性をもたらすことはできるが、それは、Ｐｚ１^＋４−１ＢＢＬ^＋ＣＤ８０^＋Ｔ細胞において観測されるほど顕著なＴ細胞増殖ではない。

【0136】

癌免疫療法の主要な目標は、腫瘍反応性Ｔリンパ球に対する安全かつ効果的な副刺激を提供することである。遺伝子手法を使用した場合、Ｔ細胞自身が強力な副刺激を提供することが明らかにされた。ヒト初代ＣＭＶ特異的細胞及びＰＳＭＡ標的化Ｔ細胞における副刺激リガンドの構成的発現は、ＡＰＣにおけるこれらのリガンドの非存在を補っただけでなく、従来のＡＰＣによって誘発される増殖応答を超える増殖応答もまた誘導した（図１）。副刺激リガンドの分析により、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬが、本発明者らの実験条件下で、毎週繰り返した抗原刺激による顕著なＴ細胞増殖を可能にする、最強のＴ細胞活性化を提供したことが示された。ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞は、優れた増殖、サイトカイン分泌、インビトロでの生存、並びに、インビボでの増殖及び持続性を示し、腫瘍保有マウスにおける注入後１週間で、ＣＤ８０及び４−１ＢＢＬを形質導入していないＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞と比較して、４０倍〜５０倍より大きいＴ細胞バイオマスをもたらした（図３）。ＣＤ８０／４−１ＢＢＬを形質導入していないＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞で処置した動物が一様に疾患により死亡した一方で、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋を与えた同じＴ細胞の注入により、処置したマウスの大部分において、確立されている全身性ＰＣ−３腫瘍を効果的に根絶させた（図２）。非常に興味深い腫瘍モデルにおいて得られた、これらの知見は、Ｔ細胞における副刺激リガンドの構成的な高レベルの発現についての生物学的活性及び顕著な効力を強調するものである。

【0137】

この強化された応答の根底にある機構を調べるために、腫瘍結合前及び後におけるＴ細胞上のＣＤ８０及び４−１ＢＢＬ、並びににそれらの受容体の空間的分布を最初に分析した。ＣＤ２８及び４−１ＢＢが、免疫学的シナプスの中心の超分子活性化クラスターの内部においてＴＣＲの極近くに蓄積することが知られている。ＣＤ８０、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ７０を含む、ＡＰＣによって発現される副刺激リガンドがシナプスに分極する。このことは、免疫学的シナプスが、副刺激リガンド−受容体の相互作用を促進及び伝播するための整列した接触領域を提供するという考えを裏付けている。このモデルと一致して、Ｔ細胞にコードされるＣＤ８０及び４−１ＢＢＬが、ＣＤ２８及び４−１ＢＢＬと一緒に、Ｔ細胞と、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞との間の接触領域に向かって分極した（図４）。この共局在化の機能的結果が、４−１ＢＢを有していないＴ細胞においてではなく、４−１ＢＢ^＋４−１ＢＢＬ^＋病巣を含有しているシナプスにおいて、抗原接触後、微小管に沿ってＴ細胞−ＡＰＣ境界に向かって輸送されるＧＲＢの蓄積によって示される（図４）。従って、免疫学的シナプスは、明らかに、自己副刺激を組織化するために十分に好適である。

【0138】

直近に形質導入したＴ細胞における４−１ＢＢ及び４−１ＢＢＬのデノボ発現により、隣接Ｔ細胞からの何れの可能な寄与も伴うことなくＮＦ−κＢを活性化させた、単一細胞アッセイにおいて自己副刺激を明らかにした。ＮＦ−κＢの発現を、形質導入直後の単一クローンの物理的分離の後、副刺激リガンドの発現を検出することができた数時間前にリアルタイムで可視化した（図４）。従って、自己副刺激が、Ｔリンパ球を、腫瘍細胞を含む最適ではないＡＰＣの不良な副刺激能力を超えるものにしている可能性がある。さらには、Ｔ細胞における４−１ＢＢＬの構成的な細胞表面での発現は、リガンドが一時的に上向き調節させた受容体（例えば、４−１ＢＢなど）と引き続き結合する準備状態にあることを保証することによって「要求に応じた」副刺激を保証している。４−１ＢＢＬのその受容体との物理的相互作用が、初期のラフト再組織化の間に、又はシナプスの中心での対向する細胞膜の折り重なりの間に生じ得ると推測できる。この影響は、ＣＤ８０^＋４−１ＢＢＬ^＋Ｔ細胞増殖が繰り返しのインビトロ抗原暴露に応答して徐々に弱まっていることから、自己制御されると考えられる（図１）。インビボでのＴ細胞増殖もまた自己制限された（図３）。これは、抗原刺激のＴ細胞を枯渇させる腫瘍の排除、及び弱まった副刺激シグナル伝達に起因する可能性がある。

【0139】

理論にとらわれることは望まないが、本発明者らの検討はまた、トランス副刺激を、Ｔリンパ球におけるＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの高レベル発現を介して免疫性を増強するためのメカニズムとして裏付けている。従って、ＣＤ８０又は４−１ＢＢＬの非存在下でＡＰＣに提示された抗原と結合するＴ細胞の増殖機能及びエフェクター機能が、両方のリガンドを提示するＴ細胞のインビトロ共培養又はインビボ共投与により増幅された。インビトロでの細胞混合及びトランスウエルでの検討では、他の細胞型（例えば、線維芽細胞又はバイスタンダー腫瘍細胞など）について報告されているトランス作用と一致して、トランス副刺激が細胞−細胞接触を必要としたことが示された（図５）。トランス副刺激はまた、異なる部位に分離する２つの異なる腫瘍を保有するマウスにおいて例示されるように、器官特異的な様式でインビボで誘導された（図６）。

【0140】

副刺激は、腫瘍微小環境内の隣接Ｔ細胞に送達され得るので、Ｔ細胞が媒介するトランス副刺激は、興味深い新しい治療的取り組みを開拓するものである。樹状細胞はしばしば腫瘍微小環境内で副刺激リガンドを十分に上向き調節することができないため、この特徴は特に有益である。可溶性因子（例えば、インターロイキン−２など）はＴ細胞の目的に寄与できるが、細胞−細胞接触におけるその依存性は他の腫瘍浸潤性Ｔ細胞に対するトランス副刺激により効果的に制限される。理論にとらわれることは望まないが、トランス作用でのトランス副刺激のインビボでのＴ細胞の競合の影響は、究極的には、内因性の腫瘍浸潤性リンパ球の多様な集団の集合を経由する抗腫瘍免疫応答を幅広いものにすることができ、従って、腫瘍抗原を回避することの予防に役立つ。

【0141】

まとめると、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ８０及び４−１ＢＢＬの発現は、腫瘍微小環境における従来のＡＰＣの媒介による副刺激の欠如を回避するための生物学的に有効な手段であることが示された。この方法は、形質導入した抗原受容体、更にはそれらの内因性ＴＣＲを介して活性化されるＴ細胞に対して適用可能である。従って、Ｔ細胞が媒介する副刺激は、自己若しくはトランス、又はその両方であろうとも、養子Ｔ細胞療法によって治療されている広範囲の悪性腫瘍及び感染性疾患において有用であるだろう。

【0142】

本発明の態様
前記の説明から、本発明を様々な用法及び条件に合わせて適用するために、様々な変法及び改変が、本明細書中に記載の本発明に対して行われてもよいことを理解されたい。そのような態様もまた、本発明の範囲内である。

【0143】

本明細書中の変数の何らかの定義における構成要素の列挙の詳述では、その変数の様々な定義が、列挙された構成要素のいずれか１つの構成要素として、又は、列挙された構成要素の組合せ（又は部分的組合せ）として含まれる。本明細書中に記載の種々の態様は、それらの態様がいずれか１つの態様として、あるいは、いずれかの他の態様又はその一部分との組合せなどを包含している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1(1)】

【図8-1(2)】

【図8-1(3)】

【図8-2(1)】

【図8-2(2)】

【図8-2(3)】

【図8-3】

【図8-4(1)】

【図8-4(2)】

【図8-4(3)】

【図8-5(1)】

【図8-5(2)】

【図8-5(3)】

【図8-5(4)】

【図8-6(1)】

【図8-6(2)】

【図8-7(1)】

【図8-7(2)】

【図8-7(3)】

【図8-7(4)】

【図8-7(5)】

【図8-7(6)】

【図8-7(7)】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]