特許 6584953 長時間作用型単鎖インスリン類似体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6584953

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】長時間作用型単鎖インスリン類似体

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/62 20060101AFI20190919BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20190919BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 38/28 20060101ALI20190919BHJP

   C12N 15/17 20060101ALI20190919BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/62ZNA

   A61P3/04

   A61P3/10

   A61K38/28

   C12N15/17

【請求項の数】8

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2015-541857(P2015-541857)

(86)(22)【出願日】2013年11月5日

(65)【公表番号】特表2016-506366(P2016-506366A)

(43)【公表日】2016年3月3日

(86)【国際出願番号】US2013068585

(87)【国際公開番号】WO2014071405

(87)【国際公開日】20140508

【審査請求日】2016年10月24日

(31)【優先権主張番号】61/722,350

(32)【優先日】2012年11月5日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500429332

【氏名又は名称】ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＥ ＷＥＳＴＥＲＮ ＲＥＳＥＲＶＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】ワイス、マイケル

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００９９６０１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／００３８２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０９６８５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２１６２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／００３８２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−３２０４９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０２３１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５３３２４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５０７９１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５３２２８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HUA, Q.X. et al.，"Design of an active ultrastable single-chain insulin analog: synthesis,structure, and therapeutic implications."，J. BIOL. CHEM.，２００８年 ５月２３日，Vol.283, No.21，pp.14703-14716，ISSN 0021-9258

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列ＩＤ番号７の配列を含む単鎖インスリン類似体であって、２９位のＸａａはＡｒｇであり、５９位のＸａａはＧｌｙであり、４６位のＸａａはＡｒｇまたはＨｉｓである、単鎖インスリン類似体。

【請求項2】

４６位のＸａａはＡｒｇである、請求項１記載の単鎖インスリン類似体。

【請求項3】

４６位のＸａａはＨｉｓである、請求項１記載の単鎖インスリン類似体。

【請求項4】

配列ＩＤ番号７の単鎖インスリン類似体をコードする核酸であって、２９位のＸａａはＡｒｇであり、５９位のＸａａはＧｌｙであり、４６位のＸａａはＡｒｇまたはＨｉｓである、核酸。

【請求項5】

前記核酸は配列ＩＤ番号１１を含む、請求項４記載の核酸。

【請求項6】

患者の血糖値を低下させる薬剤を製造するための、配列ＩＤ番号７の配列を含む単鎖インスリン類似体の使用であって、２９位のＸａａはＡｒｇであり、５９位のＸａａはＧｌｙであり、４６位のＸａａはＡｒｇまたはＨｉｓである、使用。

【請求項7】

配列ＩＤ番号７の４６位のＸａａはＡｒｇである、請求項６記載の使用。

【請求項8】

配列ＩＤ番号７の４６位のＸａａはＨｉｓである、請求項６記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月５日付で出願した係属中の米国仮出願第６１／７２２，３５０号の利益を主張する。

【0002】

連邦政府により支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、助成金番号ＤＫ０４０９４９およびＤＫ０７４１７６で国立衛生研究所により授与された協力協定の下で政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

本発明は、薬学的特性の向上を示すポリペプチドホルモン類似体に関する。薬学的特性の向上としては、例えば、熱力学的安定性の増大、室温より高い温度での熱によるフィブリル化に対する耐性の向上、分裂促進性の低下、並びに／または薬物動態学的および薬力学的特性の変化、即ち、対応する野生型ヒトホルモンの可溶性製剤と比較してより長い作用時間またはより短い作用時間をもたらすことが挙げられる。より詳細には、本発明は、新規のクラスの短縮連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ：Ｃ）ドメインをＡドメインとＢドメインとの間に含むポリペプチド単鎖からなるインスリン類似体に関する。６~１１残基のうち、このクラスのＣドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＩの連結ドメインに由来するＮ末端酸性エレメントとＣ末端セグメントからなる。本発明の単鎖インスリン類似体は、ＡドメインまたはＢドメインの他の部位に標準的または非標準的なアミノ酸置換を選択的に含むことができる。

【0004】

治療薬およびワクチンを含む、非標準的タンパク質の工学的作製（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、広範な医学的および社会的利点を有する可能性がある。一般に、ヒト、その他の哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、または真核細胞のゲノムにコードされているような、天然に存在するタンパク質は、多様な生物学的活性を与えることが多い。タンパク質誘導体の利点は、癌細胞の成長促進等の意図せぬ好ましくない副作用に関連した相同な細胞受容体への結合の低下といった選択的活性を達成することである。社会的利点のさらに別の例は、室温以上の温度での分解に対する耐性の向上であり、輸送、流通、および使用を促進する。治療用タンパク質の例としては、インスリンが挙げられる。他の哺乳類のゲノムにコードされた野生型ヒトインスリンおよびインスリン類似体は、ＲＮＡスプライシングの代替モードまたは翻訳後グリコシル化の代替パターンにより生成される受容体のアイソフォームに関係なく、複数の臓器および様々なタイプの細胞においてインスリン受容体に結合する。また、野生型インスリンは、相同な１型インスリン様増殖因子受容体（Ｔｙｐｅ １ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＧＦ−１Ｒ）に、より低い親和性で結合する。

【0005】

さらなる医学的利点の例は、アンフォールディングまたは分解に対するタンパク質の安定性の最適化である。そのような社会的利点は、電気や冷凍を常に利用できるわけではない発展途上地域での使用における室温以上の温度での分解に関して、標準的タンパク質に比べてより難分解性のタンパク質を工学的に作製することにより向上する。ポリペプチド単鎖からなり、非標準的アミノ酸置換を選択的に含むインスリン類似体は、熱分解への耐性または分裂促進性の低下に関して優れた特性を示す。その物理的分解がもたらす課題は、アフリカおよびアジアで切迫した真性糖尿病の流行により深刻になっている。フィブリル化は、室温より高い温度での分解の主要経路をもたらすため、フィブリル化に耐性を有する製剤の設計は、そのような課題地域におけるインスリン補充療法の安全性および有効性を向上させる可能性がある。

【0006】

インスリンの投与は、真性糖尿病の治療として長く確立されている。真性糖尿病患者における従来のインスリン補充療法の主要目的は、健常なヒト被験者に特有な正常範囲の上下に血糖濃度が逸脱することを予防するための、血糖濃度の厳格な管理である。正常範囲の下への逸脱は、即座に現れるアドレナリン様または神経低糖症の症状と関連しており、重度のエピソードでは痙攣、昏睡、および死亡につながる。正常範囲の上への逸脱は、網膜症、失明、および腎不全を含む微小血管疾患の長期的リスクの上昇と関連している。

【0007】

インスリンは、脊椎動物の代謝において中心的な役割を果たす小球状タンパク質である。インスリンには、２１残基を含むＡ鎖と３０残基を含むＢ鎖の２つの鎖が含まれる。ホルモンは、Ｚｎ^２+安定化六量体として膵臓β細胞中に貯蔵されるが、血流中ではＺｎ^２+なしの単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの産物であり、プロインスリンでは、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）とＡ鎖のＮ末端残基とを結合している（図１Ａ）。様々な証拠により、プロインスリンはインスリン様のコアと不規則な連結ペプチドからなることが示されている（図１Ｂ）。３つの特異的ジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、およびＡ２０−Ｂ１９、図１Ａおよび図１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的折り畳みと共役していると考えられる。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ体への輸送直後、会合して、可溶性のＺｎ^２＋配位六量体を形成する。細胞内タンパク質分解による消化およびインスリンへの変換が未成熟分泌顆粒で起こり、その後、形態的凝縮が起こる。成熟貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン六量体の結晶配列は、電子顕微鏡（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＥＭ）により可視化されている。インスリンの配列を図１Ｃに概略図形式で示す。個々の残基は、アミノ酸（典型的には、標準的な３文字コードを用いて）、鎖、および配列位置（典型的には、上付き文字として）の識別により示す。本発明は、ヒトプロインスリンの３６残基野生型Ｃドメインの特性に代わる６〜１１残基長の新規の短縮Ｃドメインの発明に関する。

【0008】

真性糖尿病治療用のインスリンおよびインスリン類似体の製造、貯蔵、および使用における重大な懸念点であるフィブリル化は、高温、低ｐＨ、撹拌、または、尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、若しくは疎水性表面の存在下で促進される。現行の米国薬物規制は、フィブリル化が１％以上のレベルで生じた場合、インスリンを廃棄することを求めている。フィブリル化は、高温で促進されるため、真性糖尿病患者は、最適には、使用前にインスリンを冷蔵しておかなければならない。インスリンまたはインスリン類似体のフィブリル化は、少量のインスリン又はインスリン類似体を一定間隔で患者の体内に注入する外部インスリンポンプを使用する真性糖尿病患者にとって、特に懸念点となる可能性がある。そのような使用法において、インスリン又はインスリン類似体は、ポンプ装置内で冷蔵保存されておらず、インスリンのフィブリル化は、インスリンまたはインスリン類似体を体内に注入するために用いられるカテーテルの閉塞をもたらす可能性があり、その結果、予測不能な血糖値の変動またはさらには危険な高血糖をも引き起こす可能性がある。インスリンは、２５℃を超える温度において、１０℃上昇する毎に分解速度が１０倍以上増加するため、指針は、<３０℃の温度での貯蔵、好ましくは冷蔵保存を求めている。５より低いｐＨで可溶性溶液として製剤化された基礎インスリン類似体（インスリングラルギンおよび亜鉛イオンのｐＨ４．０の非緩衝溶液を含むランタス（登録商標）、サノフィ・アベンティス社（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）等）のフィブリル化もまた、室温以上の温度における物理的分解のために基礎インスリン類似体の寿命を制限する可能性があり、そのような製剤で使用された酸性条件は、インスリンの自己会合を阻害し、亜鉛イオンの結合を弱め、インスリン類似体が亜鉛−タンパク質複合体内への封鎖により保護され得る度合いを減少させる。

【0009】

インスリンは、分子内で原子が再構成しない化学結合の切断、または異なるインスリン分子間での化学結合の形成を含む、化学的分解を受けやすい。そのような化学結合の変化は、通常、タンパク質のアンフォールド状態においてもたらされるため、インスリンの熱力学的安定性を向上させるインスリン修飾もまた、化学的分解を遅延させるまたは防ぐ可能性がある。インスリンはまた、物理学的分解も受けやすい。タンパク質のフィブリル化に関する現在の理論では、フィブリル化のメカニズムは、部分的に折り畳まれた中間状態を経て進行し、これが次いで凝集してアミロイド形成の核を形成すると仮定している。本理論においては、天然状態を安定化させるアミノ酸置換が、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化する可能性もあれば、安定化しない可能性もあり、また、天然状態と中間状態の間の自由エネルギー障壁を増加（または減少）させる可能性もあれば、しない可能性もある。したがって、本理論は、２本鎖インスリン分子内の特定のアミノ酸置換がフィブリル化のリスクを増加または減少させる傾向は、極めて予測不能であることを示している。平行に配置されたβシートを有する３つのαヘリックス（天然状態で見られるような）のほぼ完全なアンフォールディングによりＢ鎖の連続的な積み重なりおよびＡ鎖の連続的な積み重なりが形成され、鎖間およびＡ鎖内の天然のジスルフィド対形成は保持されることが、インスリン分子構造のモデルにより想定される。そのような平行なクロスβシートでは、Ａ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端とが実質的に分離していること（>３０Å）が必要であるが、末端は、通常、インスリン単量体の天然状態では近接近している（<１０Å）。短縮Ｃドメインを有する単鎖インスリン類似体のフィブリル化に対する顕著な耐性は、当該技術分野で知られており、インスリンのプロトフィラメントにおける平行なクロスβシートの広がり構造と、天然のジスルフィド対を有する単鎖インスリン類似体であって、短縮ＣドメインがＡ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端との距離をプロトフィラメントにおいて好ましくない距離に制限している単鎖インスリン類似体の構造との間のトポロジーの不一致（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を反映すると考えられる。

【0010】

したがって、単鎖インスリン類似体は、フィブリル化耐性インスリン類似体の設計への好ましいアプローチを提供するように思われる。しかしながら、これまで、そのような類似体は、野生型ヒトインスリンと比較して１％以下となり得る低い活性を示してきた。（Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．ら（２０００）は、野生型ＡドメインおよびＢドメインを有する５７残基長または５８残基長の単鎖インスリン類似体が、ヒトインスリンと比較して３０〜４０％の範囲の受容体結合親和性を示すと主張したが、この文献は、科学的不正行為により２００９年に撤回されており、我々の管理下では、Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．らにより開示された類似体は、１％未満の相対親和性を示す。）親和性は、インスリン受容体に対するインスリンの親和性を増加させることが当該技術分野において知られている置換である、Ａｓｐ^Ｂ１０の導入により、部分的に回復する可能性がある。我々は、過去に、ＣドメインリンカーであるＧＧＧＰＲＲを有し、Ａｓｐ^Ｂ１０を含む５７残基の単鎖インスリンについて説明した。しかしながら、名称「アイソフォーム特異的インスリン類似体（Ｉｓｏｆｏｒｍ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｓｌｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」の米国特許出願第１２／９８９，３９９号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、Ａドメインおよび／またはＢドメインにおけるそのような置換とともに短縮Ｃドメインを使用することにより、ＩＲ−Ｂと比較してＩＲ−Ａへの結合率が増加するように結合率を偏らせることができる。高い受容体結合親和性を有する単鎖インスリン類似体が記載されており、当該単鎖インスリン類似体において、短縮Ｃドメインは、インスリン様増殖因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ：ＩＧＦ−Ｉ）の１２残基のＣドメイン（配列ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列ＩＤ番号１２）であり、キメラタンパク質を生成する。しかしながら、そのようなキメラ分子は、ＩＧＦ−１Ｒに対する相対および絶対親和性の増加を示す。そのような変性は、Ａｓｐ^Ｂ１０およびＢ１０位におけるその他の置換に関連した変性と同様に、そのような類似体を摂取している動物またはヒトの患者における発癌リスクの上昇に関与する可能性があることにより引き起こされる、広い懸念を有する。この懸念は、基礎インスリン類似体、即ち、皮下デポー剤（ｄｅｐｏｔ）からの１２〜２４時間のインスリン吸収プロフィールおよび１２〜２４時間のインスリン作用プロフィールを有し、１日１回投与用に設計されたインスリン類似体に関して特に顕著である。

【0011】

本発明は、医学的および社会的ニーズに動機づけられて、（ｉ）分解耐性、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏにおける実質的な血糖降下効力、（ｉｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒに対するクロス結合の低下、および（ｉｖ）野生型ヒトインスリンに類似した、インスリン受容体のＡアイソフォームおよびＢアイソフォームに対する親和性の比、を組み合わせた、１日１回用基礎単鎖インスリン類似体を工学的に作製する。後者の目的は、ヒトの体におけるインスリンの多面的な機能および標的組織を反映した。インスリン作用の古典的パラダイムは、このホルモンの標的組織としての、脂肪細胞（脂肪細胞において、インスリンは、トリグリセリド液滴の形で燃料貯蔵を調節する）、肝臓（肝臓において、インスリンは、グルコネオゲネシスによるグルコース産生を調節し、グリコーゲンの形で燃料貯蔵を調節する）、および筋肉（筋肉において、インスリンは、ＧＬＵＴ４の細胞膜への移動を介した血流からのグルコースの流入を調節する）の臓器特異的機能に焦点を当ててきた。しかしながら、最近の研究により、インスリンが、脳の視床下部等の他の臓器および組織において生理学的役割を果たすことが明らかになった。脳の視床下部において、インスリン反応性神経回路は、肝代謝、食欲、満腹感、および恐らく理想的な体重のための設定値に影響する。ヒトゲノムは、インスリン受容体、細胞質チロシンキナーゼドメインを含む膜貫通タンパク質をコードする単一遺伝子を含むが、そのプレメッセンジャーＲＮＡは、選択的スプライシングを受けて、部分分布が臓器によって異なる可能性があり、シグナリング機能が同じ細胞内で異なる可能性がある異なるＡアイソフォームおよびＢアイソフォームを産生する。

【0012】

ＡアイソフォームとＢアイソフォーム（ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂと表す）とでは、インスリンに対する親和性が異なり（ＩＲ−Ａの親和性は、ＩＲ−Ｂの親和性よりも２倍高い）、ＩＲ−Ａ（エクソン１１にコードされたαサブユニットにおいて、１つのペプチドドメインが欠損している）のみが高い親和性でＩＧＦ−ＩＩに結合する。インスリン類似体は、ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂそれぞれに対する親和性の比が野生型インスリンとは異なることが当該技術分野において知られているが、インスリン補充療法の安全性および有効性には、最適には、ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対する親和性の比が野生型インスリンと類似しているインスリン類似体の投与を必要とする可能性がある。ＩＲ−Ａ当たりのインスリン類似体のＩＲ−Ａへの結合が低下すると、例えば、ＩＲ−Ａ受容体が優位である脳および白血球において、インスリンシグナリングの程度が相対的または絶対的に低下する可能性がある。同様に、ＩＲ−Ｂ当たりのインスリン類似体のＩＲ−Ｂへの結合が低下すると、例えば、ＩＲ−Ｂ受容体が優位である古典的な標的臓器において、インスリンシグナリングの程度が相対的または絶対的に低下する可能性がある。そのような結合親和性の偏りはまた、標的細胞（膵臓β細胞等）の細胞機能を障害する可能性があり、当該標的細胞においては、ＩＲ−Ａ媒介インスリンシグナリングおよびＩＲ−Ｂ媒介インスリンシグナリングが、それぞれ適切なβ細胞生存能力および分泌機能に関与する異なる細胞機能を媒介すると考えられている。癌細胞は、ＩＲ−Ａの過剰発現を示すことがあるため、（野生型ヒトインスリンと比較して）ＩＲ−Ａのシグナリング能力の向上を示す類似体による患者の治療は、腫瘍を増殖させる危険性がある。癌細胞におけるインスリン類似体による分裂促進シグナリングは、（野生型ヒトインスリンと比較して）分裂促進性ＩＧＦ−１Ｒ受容体に対するクロス結合の向上を示す類似体により、（野生型ヒトインスリンと比較して）ＩＲ−Ａへの結合の向上を示す類似体により、または、（野生型ヒトインスリンと比較して）ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、若しくはＩＲ−Ｂにおける滞留時間が長い類似体により媒介される。Ｂ鎖またはＢドメインのＣ末端に近い塩基性残基（Ｂ２８〜Ｂ３０）、Ｃ末端伸長内の塩基性残基（Ｂ３１またはＢ３２）、または単鎖インスリン類似体の等価位置にある塩基性残基（Ｃ１およびＣ２）は、インスリン類似体のＩＧＦ−１Ｒへのクロス結合を強化し、それにより分裂促進性を高めることができる。

【0013】

したがって、僅かな分裂促進性およびＩＧＦ−１Ｒへのクロス結合性を有するにもかかわらず、野生型インスリンのグルコース低下作用の少なくとも一部を保持する単鎖インスリン類似体を発明することが望ましい。より一般的には、インスリン受容体のＡアイソフォームおよびＢアイソフォームに対する親和性の比、即ち、含蓄的に、野生型インスリンの複数の臓器特異的な生物学的活性の少なくとも一部を示しつつ、熱力学的安定性の向上、および室温より高い温度でのフィブリル化に対する耐性の向上を示すインスリン類似体が必要である。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許第８，１９２，９５７号明細書
（特許文献２） 米国特許出願公開第２０１２／０２５２７２４号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

したがって、本発明の一態様は、皮下注射後に齧歯動物における野生型インスリンのグルコース低下作用の少なくとも一部を保持しつつ、ＩＧＦ−１Ｒへのクロス結合の低下および長い作用時間を示す単鎖インスリン類似体を提供することである。本発明の類似体は、Ｂ１０位にヒスチジンを含むため、この位置での酸性置換（アスパラギン酸またはグルタミン酸）に関連した発癌性に関する懸念を回避する。本発明のさらなる態様において、単鎖インスリン類似体のＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの絶対的親和性は、野生型ヒトインスリンに対して５〜１００％の範囲であり、そのため、ホルモン−受容体複合体において長い滞留時間を示す可能性は低い。本発明は、野生型ヒトインスリンと類似したＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対する結合親和性の比を示す単鎖インスリン類似体の有用性を検討する。

【0015】

上記の特徴の組み合わせは、新規のＣドメイン設計によりもたらされ、当該Ｃドメイン設計では、短縮連結ポリペプチド（６〜１１残基長）が、Ｎ末端酸性エレメント（残基Ｃ１およびＣ２）、柔軟な結合またはヒンジ（Ｃ３）、およびＩＧＦ−ＩＩのＣドメインに由来するＣ末端セグメント（Ｃ４−Ｃ_ｎ、式中、ｎ＝６、７、８、９、１０、または１１）を含む。Ｎ末端酸性エレメントは、インスリングラルギンのＡｒｇ^Ｂ３１−Ａｒｇ^Ｂ３２塩基性エレメントの電荷が逆転した３２残基のＢ鎖を含む二本鎖インスリン類似体の研究（参照により本明細書に組み込まれる、名称「非標準的インスリン類似体（Ｎｏｎ−Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」の米国特許第８，３９９，４０７号）に基づいて設計した。理論に縛られることは望まないが、２残基の酸性残基は、類似体とＩＧＦ−１Ｒとの結合に好ましくない静電反発力をもたらすが、インスリン受容体アイソフォームにより十分に許容されることが想定される。同様に、理論に縛られることは望まないが、本発明のＣドメインにおけるＩＧＦ−ＩＩ由来のＣ末端セグメントは、インスリン受容体アイソフォームとの好ましい相互作用を引き起こし、そのため、単なるテザー（ｔｅｔｈｅｒ）エレメントまたは空間エレメントとしてよりもむしろ補助的な受容体結合エレメントとして機能することがさらに想定される。

【0016】

概して、本発明は、本発明のＣドメイン、およびＡ８位に置換を有する修飾Ａ鎖を含む単鎖インスリン類似体を提供する。したがって、本発明は、連結ドメイン（Ｃドメイン）が６〜１１残基長で２つのエレメントからなる、新規のクラスの単鎖インスリン類似体に関する。Ｎ末端エレメントは、最初の２つの残基（伸長インスリンＢ鎖の残基Ｂ３１〜Ｂ３３に相当し、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３と表す）からなり、（ｉ）Ｃ１およびＣ２は、少なくとも１つの酸性側鎖を含み、ｐＨ７．４で−１または−２の正味の形式電荷を有し、（ｉｉ）Ｃ３は、グリシン、アラニン、プロリン、またはセリンにより提供されるような、柔軟な結合またはねじれを提供する。例として、これらに限定されるものではないが、以下のジペプチドセグメントが挙げられる：ＥＥＧ、ＡＥＧ、ＥＡＧ、ＥＤＧ、ＤＥＧ、ＤＤＧ、ＡＤＧ、ＡＤＧ、ＥＥＡ、ＡＥＡ、ＥＡＡ、ＥＤＡ、ＤＥＡ、ＤＤＡ、ＡＤＡ、ＡＤＡ、ＥＥＰ、ＡＥＰ、ＥＡＰ、ＥＤＰ、ＤＥＰ、ＤＤＰ、ＡＤＰ、ＡＤＰ、ＥＥＳ、ＡＥＳ、ＥＡＳ、ＥＤＳ、ＤＥＳ、ＤＤＳ、ＡＤＳ、またはＡＤＳ。Ｃ末端エレメントは、Ｃドメインが配列ＳＲＶＳＲＲＳＲ（配列ＩＤ番号１３）を有する、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）由来のペプチドセグメントを含む。残基Ｃ４−Ｃ_ｎ（式中、ｎ＝６〜１１）は、配列ＲＶＳＲＲＳＲ、ＶＳＲＲＳＲ、ＳＲＲＳＲ、ＲＲＳＲ、またはＲＳＲを有する、ＩＧＦ−ＩＩのＣドメインまたはＣ末端フラグメントに由来する。したがって、これらのハイブリッドＣドメインは、最小で６残基（Ｎ末端エレメントの３残基とＣ末端エレメントの３残基）から最大で１１残基（Ｎ末端エレメントの３残基とＣ末端エレメントの８残基）の長さに及ぶ。Ａ鎖は、酸触媒によるアミド分解またはＡｓｎに関連したその他の化学分解機序を回避するために、Ａ８位に塩基性置換（リジン、アルギニン、またはヒスチジン）およびＡ２１位に置換（Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒ）を有する。１つの実施例において、Ｂ鎖もまた、酵母における生合成過程でのＬｙｓ特異的なタンパク質分解切断を回避するために、Ｌｙｓ^Ｂ２９→Ａｒｇ置換を含む。

【0017】

別の実施例において、本発明は、ＥＥＧＸ_ｎという形のリンカーを有する一連の単鎖インスリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ：ＳＣＩ）分子を提供する。ＥＥＧＸ_ｎにおいて、Ｃ１およびＣ２位のＥＥエレメント（ランタス（登録商標）の有効成分であるインスリングラルギンのＲＲエレメントとは逆の電荷を有する）は、ＩＧＦ−１Ｒクロス結合を弱め、（ｉｉ）Ｇは、柔軟なヒンジをもたらし、（ｉｉｉ）Ｘ_ｎは、ＩＧＦ−ＩＩのＣドメイン（配列ＳＲＶＳＲＲＳＲ：配列ＩＤ番号１３）に由来する。ＩＧＦ−ＩＩ由来のテザーの使用により、複数のＡｒｇ残基が存在し（負のＥＥエレメントを補って、等電点の正味シフトをもたらす）、ＩＲ受容体結合の向上において仮説的役割を果たす。サーマリンベーサル（Ｔｈｅｒｍａｌｉｎ−ｂａｓａｌ）と称されるＳＣＩは、８残基の連結ペプチド（配列ＥＥＧＳＲＲＳＲ：配列ＩＤ番号１４）を含む。この長さのＣドメインは、受容体結合における誘導適合のメカニズムに対応していると考えられている。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】図１Ａは、Ａ鎖およびＢ鎖、並びに、隣接する２塩基切断部位（黒丸）とＣ−ペプチド（白丸）とで示される連結領域を含む、ヒトプロインスリンの配列の概略図である。

【図1B】図１Ｂは、インスリン様部分と不規則な連結ペプチド（破線）とからなる、プロインスリンの構造モデルである。

【図1C】図１Ｃは、Ｂ鎖中の残基Ｂ２７および残基Ｂ３０の位置を示すヒトインスリンの配列の概略図である。

【図2】図２は、野生型ヒトインスリンおよび本発明の単鎖インスリン類似体（ＳＣＩ−５９Ｂ）の受容体結合実験の結果を示すグラフである。上段図は、インスリン受容体のアイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）を用いた競合置換アッセイである。中段図は、インスリン受容体のアイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）を用いた競合置換アッセイである。下段図は、１型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を用いた競合置換アッセイである。記号：ヒトインスリン（■）およびＳＣＩ−５９（▲）。これらのデータを分析することにより、表１に示すようにホルモン−受容体解離定数を推算することが可能である。

【図3】図３は、本発明の単鎖インスリン類似体（ＳＣＩ−５９Ｂ）の２Ｄ―ＮＭＲスペクトルを示す。ｐＨ３．５（基礎製剤と同様に）および３７℃で得られるスペクトル、混合時間は２００ｍｓ、磁場強度７００ＭＨｚであった。

【図4】図４は、ステプトゾトシン（ｓｔｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）により糖尿病に罹患させたラットにおける中用量インスリン類似体（２０μｇ／ラット）の動物試験結果を示すグラフである。経時的（分）な血糖の低下：ヒューマログ（登録商標）（リスプロインスリン）（■）、（ＳＣＩ−５９Ｂ：▲）、ランタス（登録商標）（インスリングラルギン）（◆）、および希釈剤（●）。各製剤（Ｕ−１００として）の１ユニットを５匹のＳＴＺラット（Ｎ＝５）に皮下注射した。エラーバーは、標準誤差を示す。

【図5A】図５Ａは、ステプトゾトシンにより糖尿病に罹患させ、新鮮サーマリンベーサル（Ｔ−ｂ：▲）、加熱サーマリンベーサル（●）、新鮮ランタス（登録商標）（インスリングラルギン）（◆）、加熱ランタス（登録商標）（インスリングラルギン）（■）、または希釈剤コントロール（×）を投与したスプラーグドーリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ）における経時的な血糖値を示すグラフである。加熱したサンプルは、３７℃で穏やかに撹拌した。サーマリンベーサルは５６日間加熱し、ランタス（登録商標）は１２日間加熱した。

【図5B】図５Ｂは、ステプトゾトシンにより糖尿病に罹患させ、新鮮サーマリンベーサル（Ｔ−ｂ：▲）、加熱サーマリンベーサル（●）、新鮮ランタス（登録商標）（インスリングラルギン）（◆）、加熱ランタス（登録商標）（インスリングラルギン）（■）、希釈剤コントロール（×）を投与したスプラーグドーリーラットにおける経時的な血糖値を示すグラフである。加熱したサンプルは、４５℃で穏やかに撹拌した。サーマリンベーサルは３９日間加熱し、ランタス（登録商標）は６日間加熱した。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、長い作用時間、５〜１００％の範囲（下限はプロインスリンに対応するように選択された）の絶対的親和性を有する野生型インスリンに類似したＩＲ−Ａ／ＩＲ−Ｂ受容体結合親和性比、ＩＧＦ−１Ｒに対する識別の増加、Ａ２１位における化学的分解に対する耐性の推定される増加（Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒによるＡｓｎの置換による）、室温より高い温度でのフィブリル化に対する耐性の推定される増加（単鎖トポロジーによる）、および熱力学的活性の推定される増大（部分的に、塩基性側鎖であるＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＯｒｎによるＴｈｒ^Ａ８の置換による）を示す単鎖インスリン類似体に関する。

【0020】

本発明の少なくともいくつかの実施例の態様において、単鎖類似体の等電点は、６．８〜７．８であるため、酸性条件下（ｐＨ３．０〜４．５）の可溶性製剤は、皮下デポー剤において、ｐＨが中性付近にシフトすることにより等電沈殿することが予想される。また、本発明の少なくともいくつかの実施例の態様において、単鎖インスリン類似体は、Ｔ_６インスリン六量体、Ｔ_３Ｒ^ｆ_３インスリン六量体、またはＲ_６インスリン六量体として当該技術分野で知られている古典的亜鉛インスリン六量体と類似した、タンパク質六量体の亜鉛イオン依存性形態を形成する能力を保持する。

【0021】

また、単鎖類似体を、非限定的な例としてであるが、ブタ、ウシ、ウマ、およびイヌのインスリン等の動物性インスリンに由来するＡドメインおよびＢドメインの配列から作製することもまた想定される。さらにまたは代わりに、本発明のインスリン類似体は、残基Ｂ１〜Ｂ３が欠損していてもよく、または、リジン（例えば、野生型ヒトインスリンのＬｙｓＢ２９）を欠損している変異型Ｂ鎖と組み合わせて、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅ）、またはその他の酵母発現種若しくは株における酵母の生合成においてＬｙｓが介在する前駆体ポリペプチドのタンパク質分解を回避してもよい。本発明の単鎖インスリンのＢドメインは、熱力学的安定性および受容体結合活性を向上させることを目的とした他の置換を選択的に含んでいてもよい。Ｔｈｒ^Ｂ２７、Ｔｈｒ^Ｂ３０、またはＣドメインにおける１つ以上のセリン残基を、単独でまたは組み合せて単糖付加体により修飾することもまた想定され、例としては、Ｏ−結合型Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｏ^β−ＳｅｒまたはＧａｌＮＡｃ−Ｏ^β−Ｔｈｒと表す）、Ｏ−結合型α−Ｄ−マンノピラノシド（マンノース−Ｏ^β−Ｓｅｒまたはマンノース−Ｏ^β−Ｔｈｒ）、および／またはα−Ｄ−グルコピラノシド（グルコース−Ｏ^β−Ｓｅｒまたはグルコース−Ｏ^β−Ｔｈｒ）が挙げられる。

【0022】

さらに、ヒトインスリンと動物性インスリンとの間の類似性、および過去にヒトの真性糖尿病患者で動物性インスリンを使用したことを考慮して、インスリン配列に他の若干の修飾、特に、「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」とみなされる置換を導入することもまた想定される。例えば、アミノ酸のさらなる置換は、本発明から逸脱することなく、類似の側鎖を有するアミノ酸のグループ内で行ってもよい。これらは、中性疎水性アミノ酸：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、およびメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）のグループ内で互いに置換してもよい。塩基性アミノ酸は、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別途記述されない限り、または文脈から明らかである場合はいつでも、本明細書で言及されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であるとみなされるべきである。標準的アミノ酸もまた、同じ化学的分類に属する非標準的アミノ酸により置換されてもよい。非限定的な例としてであるが、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖を有する塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）により置き換えられてもよい。Ｌｙｓはまた、中性の脂肪族同配体であるノルロイシン（Ｎｌｅ）により置き換えられてもよく、また同様により短い脂肪族側鎖を含む類似体（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）により置換されてもよい。

【0023】

ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を、比較の目的のため、配列ＩＤ番号１として提供する。

【0024】

配列ＩＤ番号１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ

【0025】

ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号２として提供する。

【0026】

配列ＩＤ番号２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ

【0027】

ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号３として提供する。

【0028】

配列ＩＤ番号３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ

【0029】

本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列を、長さ５７、５７、５８、５９、６０、６１、および６２のポリペプチドに相当する配列ＩＤ番号４〜１０として提供する。

【0030】

配列ＩＤ番号４
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｘａａ₃−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₄
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり、Ｘａａ_４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0031】

配列ＩＤ番号５
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｘａａ₃−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₄
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり、Ｘａａ_４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0032】

配列ＩＤ番号６
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₃
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0033】

配列ＩＤ番号７
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₃
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0034】

配列ＩＤ番号８
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₃
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0035】

配列ＩＤ番号９
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₃
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0036】

配列ＩＤ番号１０
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｘａａ₂−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₁−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘａａ₃
Ｘａａ_１は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎを示し、Ｘａａ_２は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＯｒｎであり、Ｘａａ_３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。

【0037】

以下のＤＮＡ配列は、ピキア・パストリスでの使用形態用に最適化したコドンを有する単鎖インスリン類似体ＳＣＩ−５９Ｂ（下記を参照）をコードする。

【0038】

配列ＩＤ番号１１
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧ
ＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧ
ＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＧＧＡＴＡＡ

【0039】

ＳＣＩ−５９Ａ（下記を参照）、並びにさらなる置換Ｇｌｕ^Ｂ１３→Ｇｌｎを含むＳＣＩ−５９ＡおよびＳＣＩ−５９Ｂの誘導体をコードする類似合成遺伝子を調製し、ピキア・パストリスでクローニングした。

【0040】

本発明の２つの単鎖インスリン類似体（ＳＣＩ−５９ＡおよびＳＣＩ−５９Ｂと表す）を、ピキア・パストリスにおける前駆体ポリペプチドの生合成により調製した。このシステムは、切断Ｎ末端伸長ペプチドを有する天然のジスルフィド架橋を含む折り畳まれたタンパク質を分泌する。切断された単鎖インスリン産物は、３０残基のＢドメイン、８残基のＣドメイン、および２１残基のＡドメインの合計５９残基の長さであった。Ｃドメイン配列は、どの場合もＥＥＧＳＲＲＳＲ（配列ＩＤ番号１４）であり、酸性エレメント（Ｃ１およびＣ２位、太字）が導入されてＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害し、柔軟な結合としてＧｌｙ（Ｃ３位、斜字）が導入され、ＩＧＦ−ＩＩ Ｃドメイン由来のエレメント（本類似体のＣ４〜Ｃ８位、下線）が導入された。ＳＣＩ−５９Ａは、Ｔｈｒ^Ａ８→Ｈｉｓ、Ａｓｎ^Ａ２１→Ｇｌｙ、およびＬｙｓ^Ｂ２９→Ａｒｇのさらなる置換を含み、一方、ＳＣＩ−５９Ｂは、Ｔｈｒ^Ａ８→Ａｒｇ、Ａｓｎ^Ａ２１→Ｇｌｙ、およびＬｙｓ^Ｂ２９→Ａｒｇのさらなる置換を含んだ（配列ＩＤ番号７）。ＳＣＩ−５９Ａの形式的な等電点（ｐＩ）は、Ｃドメイン配列（２つの追加のグルタミン酸残基により部分的に相殺された３つの追加のアルギニン残基）とＡ８位における滴定可能な追加のヒスチジンとの複合効果により中性の方へシフトすると予想され、Ｂ２９位におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換は、等電点にほとんど影響を及ぼさないと予想された。ＳＣＩ−５９Ｂの形式的ｐＩは、Ｃドメイン配列（ＳＣＩ−５９Ａと同様に、２つの追加のグルタミン酸残基により部分的に相殺された３つの追加のアルギニン残基）とＡ８位における追加のＡｒｇとの複合効果によりさらに中性の方へシフトすると予測された。

【0041】

【表1】

【0042】

表１は、野生型ヒトインスリンと比較したＳＣＩ−５９ＡおよびＳＣＩ−５９Ｂの受容体結合親和性を示す。代表的なデータを図２に示す。２つの単鎖類似体は、野生型インスリンと比較して、ＩＧＦ−１Ｒに対してそれぞれ非常に低いクロス結合を示す。（相対活性を、^１２５Ｉ−ヒトインスリンを用いた競合置換アッセイにより測定した、野生型ヒトインスリンに対する類似体のホルモン−受容体解離定数の比と定義する。）ＳＣＩ−５９Ｂは、５〜１００％の目標範囲内で野生型インスリンと類似した比でＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対する相対親和性を示す。一方、ＳＣＩ−５９Ａ（Ａ８位が異なる）のＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対する親和性は、それぞれＳＣＩ−５９Ｂの親和性よりも低い。ＩＲ−Ａに対するＳＣＩ−５９Ａの親和性は、目標範囲内である（約１０％）が、ＩＲ−Ｂに対するＳＣＩ−５９Ａの親和性は、目標範囲の最低値（実験誤差内で５％）であるため、野生型インスリンに比べて高いＩＲ−Ａ／ＩＲ−Ｂ結合比となる可能性がある。これらの発見により、リンカーＥＥＧＳＲＲＳＲ（配列ＩＤ番号１４）との関連において、Ａ８位はＨｉｓよりもＡｒｇの方が好ましいことが示唆される。ＳＣＩ−５９Ｂの予測ｐＩもまた、ＳＣＩ−５９Ａよりもインスリングラルギン（同様に過剰な２つのアルギニン残基を含む）に近い値となる。

【0043】

受容体結合活性のアッセイプロトコルは、以下の通りである。マイクロタイターストリッププレート（ヌンクマキシソルブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ））を、４℃で一晩、ＡＵ５ ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水中の４０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）とともにインキュベートした。結合データは、二点逐次モデルにより解析した。データは、非特異的結合（１μＭのヒトインスリン存在下で結合した膜に残存する放射能量）について補正した。すべてのアッセイにおいて、競合リガンドの非存在下で結合したトレーサーのパーセンテージは、リガンド枯渇によるアーティファクトを回避するため、１５％未満であった。解離定数（Ｋ_ｄ）を、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２―２０９３６）により記載された数学モデル、即ち、異種競合を前提として非線形回帰を用いたモデル（Ｗａｎｇ，１９９５，ＦＦＢＳ Ｌｅｔｔ．３６０：１１１−１１４）に当てはめて決定した。

【0044】

構造的および生物学的実験では、ＳＣＩ−５９Ｂのより高い受容体結合親和性およびより好ましい予想等電点を考慮して、ＳＣＩ−５９Ｂに重点を置いた。２Ｄ−ＮＭＲ ＮＯＥＳＹスペクトルにより、折り畳まれた構造を示す証拠が得られた（図３）。ＮＯＥｓのパターンおよび化学シフトは、５７残基単鎖インスリン類似体における過去の分析（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２００８））と合致している。

【0045】

動物モデルにおける類似体の生物学的活性および有効性を評価するために、オスのスプラーグドーリーラット（平均体重〜３００グラム）をストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ：ＳＴＺ）処置により真性糖尿病に罹患させた。タンパク質溶液は、ＫＰ−インスリン（インスリンリスプロ、ヒューマログ（登録商標）の有効成分、イーライリリー・アンド・カンパニー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．））、インスリングラルギン（ランタス（登録商標）、サノフィ・アベンティス社）、および／または本発明の単鎖インスリンを含む。コントロールは、グリセリン１６ｍｇ、メタ−クレゾール１．６ｍｇ、フェノール０．６５ｍｇ、およびｐＨ７．４リン酸ナトリウム３．８ｍｇからなる無タンパク質性リリー希釈剤（イーライリリー・アンド・カンパニー社より入手）を注射することにより得た。ＳＣＩ−５９Ｂの活性は、図４に示すように、ヒューマログ（登録商標）（有効期限内の市販バイアルから採取したＵ−１００強度）およびランタス（登録商標）（有効期限内の市販バイアルから採取したＵ−１００強度）の活性と比較して評価した。ＳＣＩ−５９Ｂは、ｐＨを３．５に調整した（ｐＨ４．０ではなく）こと以外は、ランタス（登録商標）のインスリングラルギンの処方にしたがって処方した。これらの製剤のそれぞれ１ユニットを皮下注射し、その結果生じた血糖濃度の変化を臨床血糖値測定器（Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ Ａｄｖａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗメータ）を用いた連続測定によりモニターした。ラットは、５匹（Ｎ＝５）まとめて時間ｔ＝０に皮下注射した。血液は、時間０から３６０分まで１０分毎に、切断した尾の先端から採取した。本発明のＳＣＩ−５９Ｂは、ランタス（登録商標）と同様の処方条件下で、インスリングラルギンの生物学的活性の相当な割合を保ち、ランタス（登録商標）と同等またはそれを超える作用時間を有することが分かった。

【0046】

Ａｒｇ^Ａ８、Ｇｌｙ^Ａ２１、Ａｒｇ^Ｂ２９の置換を有し、リンカーＥＥＧＳＲＲＳＲ（配列ＩＤ番号７）を有する５９残基のＳＣＩを合成した。このＳＣＩは、サーマリンベーサルと称するか、または図５においてＴ−ｂという略称で示す（前述の「ＳＣＩ−５９Ｂ」）。熱力学的安定性を、グアニジン変性のＣＤモニターにより２５℃、ｐＨ４．０で評価した。アンフォールディングの自由エネルギー値（ΔＧｕ）である３．５（±０．１）ｋｃａｌ／モルは、２状態モデルを用いて得られた。これは、これらの条件下でのインスリングラルギンの安定性（２．７（±０．１）ｋｃａｌ／モル）よりも高い。この自由エネルギーの上昇（ΔΔＧｕ ０．７（±０．２）ｋｃａｌ／モル）により、化学安定性の顕著な向上が予想される。

【0047】

フィブリル化に対する耐性を、３７℃および４５℃、ｐＨ４．０でＵ−１００製剤を穏やかに撹拌することにより、インスリングラルギンと比較して評価した。ランタスは、３７℃で１０日後、４５℃で５日後に沈殿したのに対し、サーマリンベーサル溶液は、透明なままであり、チオフラビンＴ（アミロイドのプローブ）の蛍光の上昇もなかった。

【0048】

有効性を、ストレプトゾトシンにより糖尿病に罹患したスプラーグドーリーラット（約３００ｇ）において試験した（図５Ａおよび図５Ｂ）。Ｕ−１００（０．６ｍＭ）のサーマリンベーサルまたはランタス（登録商標）を皮下注射した（１ユニット／ラット、サーマリンベーサル群（▲）はＮ＝５、ランタス（登録商標）群（◆）はＮ＝１０）後、その結果生じた血糖濃度（ＡＵＣ）の低下および回復により、サーマリンベーサルの有効性は、ランタス（登録商標）と同等またはそれ以上であることが示された。サーマリンベーサルの作用時間もまた、ランタス（登録商標）を上回った。３７℃および４５℃で穏やかに撹拌した場合のサーマリンベーサルまたはランタス（登録商標）の有効性の保持または消失は、ランタス（登録商標）（■）では急速にその有効性が消失したのに対し、サーマリンベーサル（●）では、このような厳しい条件下で数週間、完全な活性を維持したことを示している。

【0049】

真性糖尿病患者の治療方法は、本明細書に記載した単鎖インスリン類似体の投与を含む。本発明の別の態様として、単鎖インスリン類似体を、酵母（ピキア・パストリス）で調製してもよく、または、天然フラグメントのライゲーションによる完全な化学合成により調製してもよい。非標準的修飾の場合には、製剤の合成の方が好ましいが、遺伝子コード技術または４塩基コドン技術の拡大により非標準的修飾を含む単鎖類似体のサブセットを製造することができる可能性がある。本発明のさらに別の態様において、非標準的アミノ酸置換の使用により、化学的分解または物理的分解に対する単鎖インスリン類似体の耐性を向上させることができる。さらに我々は、本発明の類似体により真性糖尿病またはメタボリック症候群の治療方法を提供することを想定している。インスリン類似体の輸送経路は、注射器またはペン型装置の使用を通じた皮下注射による。

【0050】

医薬組成物は、係るインスリン類似体を含んでいてもよく、選択的に亜鉛を含んでもよい。亜鉛イオンは、インスリン類似体六量体当たり２．２〜１０亜鉛原子の範囲の様々な亜鉛イオン：タンパク質の比で含まれる。製剤のｐＨは、３．０〜４．５の範囲である。そのような製剤において、インスリン類似体の濃度は、通常、約０．６〜５．０ｍＭであり、バイアルまたはペンにおいて５ｍＭまでの濃度を使用することができ、顕著なインスリン耐性を有する患者では、より高濃度の製剤（Ｕ−２００以上）が特に有用である。賦形剤としては、グリセロール、グリシン、アルギニン、トリス、その他の緩衝剤および塩、並びにフェノールおよびメタ−クレゾールなどの抗菌性保存剤を挙げることができ、後者の保存剤は、インスリン六量体の安定性を向上することが知られている。そのような医薬組成物は、生理学的有効量の当該組成物を患者に投与することにより、真性糖尿病または他の病状を有する患者を治療するために使用することができる。

【0051】

前述の開示に基づいて、提供した単鎖インスリン類似体が上述の目的を達成することはすでに明らかなはずである。即ち、これらのインスリン類似体は、所望の薬物動態学的および薬力学的特徴（持続作用を付与する）を保持し、野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しつつ、フィブリル化への耐性の向上を示す。したがって、如何なる明白な変形形態も特許請求に係る発明の範囲内に含まれ、また、それ故に特定の構成要素の選択は、本明細書に開示、記載された本発明の精神から逸脱することなく決定できることを理解すべきである。

【0052】

以下の文献は、本明細書に記載の試験およびアッセイの方法が当業者に理解されることを実証するために引用する。

【0053】

Ｇｌｅｎｄｏｒｆ，Ｔ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｌ．，Ｓｔｉｄｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｂ．Ｆ．，Ｈｅｇｅｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｒ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｅ．，& Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，Ｔ．２０１２．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｏ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ Ｂ１０−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（２），ｅ２９１９８．
Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．，& Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．２０１２．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６，８０９−１５．
Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．Ｈ．，Ｊｉａ，Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｈｕ，Ｓ．& Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２００８）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１４７１６．
Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｓ．，Ｈａｃｈ，Ｍ．，Ｗｉｂｅｒｇ，Ｆ．Ｃ．，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｌ．，& Ｋｊｅｌｄｓｅｎ，Ｔ．１９９５．Ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ/ｉｎｓｕｌｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｂｉｎｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５，９８１−６．
Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｃ．，& Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｗ． ２０００．Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４０８，４８３−８．Ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ：Ｌｅｅ ＨＣ，Ｋｉｍ ＫＳ，Ｓｈｉｎ ＨＣ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４５８，６００．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ，Ｆ．，& Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２０１２）Ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｔｏ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａ ｐｕｍｐ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６，２７７−２８８．
Ｓｃｉａｃｃａ，Ｌ．，Ｃａｓｓａｒｉｎｏ，Ｍ．Ｆ．，Ｇｅｎｕａ，Ｍ．，Ｐａｎｄｉｎｉ，Ｇ．，Ｌｅ Ｍｏｌｉ，Ｒ．，Ｓｑｕａｔｒｉｔｏ，Ｓ．，& Ｖｉｇｎｅｒｉ，Ｒ．２０１０．Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５３，１７４３−５３．
Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｘ．１９９５．Ａｎ ｅｘａｃｔ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｄｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６０：１１１−１１４．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２−２０９３６．

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]