特許 6585237 哺乳動物細胞へのパッケージングされたＲＮＡの新規の送達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6585237

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】哺乳動物細胞へのパッケージングされたＲＮＡの新規の送達

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20190919BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20190919BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20190919BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20190919BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20190919BHJP

   C07K 14/15 20060101ALI20190919BHJP

   C07K 14/18 20060101ALI20190919BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20190919BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/01ZNA

   C12N15/40

   C12N15/48

   C12N15/113 Z

   C12N15/62

   C07K14/15

   C07K14/18

   C07K19/00

【請求項の数】13

【外国語出願】

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2018-111489(P2018-111489)

(22)【出願日】2018年6月12日

(62)【分割の表示】特願2015-503322(P2015-503322)の分割

【原出願日】2013年3月15日

(65)【公開番号】特開2018-186815(P2018-186815A)

(43)【公開日】2018年11月29日

【審査請求日】2018年7月11日

(31)【優先権主張番号】61/615,687

(32)【優先日】2012年3月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510002280

【氏名又は名称】アメリカ合衆国

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】カズマールチェック、スタニスワフ、ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】チャタジー、デブ、ケイ．

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５１２８２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１５１９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０５６８９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J.Virol.,2006,80(19),p.9889-9895

【文献】 DEO V.K. et al，Journal of Virological Methods，177(2011)，p.147-152

【文献】 Tsuji Y. et al，Journal of Biotechnology，155(2011)，p.185-192

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／１９

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複製欠損ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
ａ．シンドビスウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス非構造タンパク質（ＮＳＰ）であるＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４をコードする配列と、ラウス肉腫ウイルスから単離されたレトロウイルスパッケージングシグナルとを有する組み換え型ポリヌクレオチドを有する、シンドビスウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスから単離されたアルファウイルスレプリコンと、
ｂ．ラウス肉腫ウイルスのゲノム配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるレトロウイルスのｇａｇタンパク質と、
ｃ．融合エンベロープタンパク質と
を有し、前記ＶＬＰはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

【請求項2】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記融合エンベロープタンパク質は、ヘマグルチニン、ラウス肉腫ウイルス融合タンパク質、ダニ媒介性脳炎ウイルス及びデング熱ウイルスのＥタンパク質、セムリキ森林ウイルスのＥ１タンパク質、バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４、水疱性口内炎（インディアナ）ウイルス−ＥｎｖＡ（ＶＳＶ−ＥｎｖＡ）、及び水疱性口内炎（インディアナ）ウイルス−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質から成る群から選択されるエンベロープタンパク質をコードするゲノム配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、ＶＬＰ。

【請求項3】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記ＶＬＰは真核細胞に細胞変性をもたらさない、ＶＬＰ。

【請求項4】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記アルファウイルスレプリコンはウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有し、前記プロモーターは前記組み換え型ポリヌクレオチドに連結される、ＶＬＰ。

【請求項5】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記組み換え型ポリヌクレオチドは、前記真核細胞において遺伝子の発現をノックダウンするアンチセンスＲＮＡをコードする、ＶＬＰ。

【請求項6】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記組み換え型ポリヌクレオチドは、短ヘアピンＲＮＡもしくは小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードし、前記ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡは、前記真核細胞において遺伝子の発現をノックダウンする、ＶＬＰ。

【請求項7】

請求項１記載のＶＬＰを産生する方法であって、
ａ．真核細胞を同時形質転換する工程であって、
ｉ．前記アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１のベクターと、
ｉｉ．前記ｇａｇタンパク質をコードするラウス肉腫ウイルスのゲノム配列を有するポリヌクレオチドを有する第２のベクターと、
ｉｉｉ．前記融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する第３のベクターと
によって真核細胞を同時形質転換し、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のベクターはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない、前記同時形質転換する工程と、
ｂ．各々のベクターがそのコードする産物を産生させるのに適した条件下で前記同時形質転換した細胞を培養し、それにより前記ＶＬＰを産生する工程と、
ｃ．前記細胞から前記ＶＬＰを単離する工程と
を有し、前記細胞はアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない、方法。

【請求項8】

請求項１記載のＶＬＰを有する薬学的組成物であって、薬剤として使用される、薬学的組成物。

【請求項9】

請求項８記載の薬学的組成物において、前記アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列は、以下のベクターｐＤｅｓｔ４７２−ＶＥＥまたはｐＤｅｓｔ４７２−ＶＥＥ−ＭＣＳに含まれる、薬学的組成物。

【請求項10】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記ＶＬＰはレトロウイルスのｐｏｌ遺伝子を有さず、または発現しない、ＶＬＰ。

【請求項11】

請求項１記載のＶＬＰにおいて、前記組み換え型ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１（ＭＨＣ ＩＩ）及びＣＤ８０をコードする配列を有する、ＶＬＰ。

【請求項12】

請求項１１記載のＶＬＰにおいて、前記レプリコンはベネズエラウマ脳炎ウイルス由来であり、ＨＬＡ−ＤＲ１は１つのサブゲノムプロモーターの制御下にあり、ＣＤ８０は別のサブゲノムプロモーターの制御下にある、ＶＬＰ。

【請求項13】

対象の疾患または障害を治療するための薬学的組成物の調製における、請求項１記載のＶＬＰの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１２年３月２６日付で出願された米国仮特許出願第６１／６１５，６８７号の利益を請求し、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本明細書において説明される発明は、複製欠損ウイルス様粒子を用い哺乳動物細胞への組み換え型ポリヌクレオチドの送達および転写に関するものである。

【背景技術】

【0003】

アルファウイルスは、ウイルスの第４群トガウイルス科に属する。アルファウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡのゲノムを有する小型球形エンベロープウイルスである。全ゲノム長は１１，０００〜１２，０００ヌクレオチドに及び、５'末端キャップおよび３'末端ポリＡ鎖を有する。３つの構造タンパク質はゲノムの３分の１の３末端と同一線状のサブゲノムｍＲＮＡから翻訳されるが、４つの非構造タンパク質遺伝子（ＮＳＰ遺伝子）がゲノムの３分の２の５末端にコードされる。

【0004】

アルファウイルスゲノムの中に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）が存在し、非構造性および構造性である。最初のものはＮＳＰ遺伝子を含み、ウイルスＲＮＡの書換えと複製のために必要なタンパク質（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）をコードする。２つ目のものは３つの構造タンパク質をコードする。コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、およびエンベロープタンパク質Ｐ６２およびＥ１は、ヘテロ二量体として結合する。ウイルス膜アンカー型表面糖タンパク質は、膜融合を通し受容体認識および標的細胞への侵入に関与する。

【0005】

シンドビス（およびＶＥＥＶ）ウイルスは、そのゲノムが１１７０３ヌクレオチドのプラスｍＲＮＡ鎖を有するアルファウイルスである。このウイルスは、様々な脊椎動物宿主に感染する。シンドビスウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質で直接翻訳される非構造（ＮＳ、レプリコン）および構造タンパク質（カプシドおよびｐＨ依存性融合エンベロープ）をコードする。アルファウイルスはまた、アウラウイルス、ババンキウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、ミッデルブルフウイルス、Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅウイルス、セムリキ森林ウイルス、南部ゾウアザラシウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｏｃａｒａウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロアウイルスを含む。

【0006】

アルファウイルスの宿主細胞への感染が、アポトーシスに終わる細胞毒性の結果となる。これは大部分が、宿主細胞において抗ウイルス状態を引き起こす大量のアルファウイルスのゲノムＲＮＡの発現および宿主細胞に対する細胞変性効果（ＣＰＥ）の原因となっている細胞ｍＲＮＡ合成または翻訳停止を持つアルファウイルス非構造タンパク質（ＳＩＮのＮＳＰ２またはＶＥＥＶのＮＣ）の直接的相互作用の両方に起因する。感染した細胞から回復したウイルス力価は大幅に減少したが、非構造タンパク質の１つ、ＮＳＰ２（位置７２６）において点突然変異を含む天然のシンドビスウイルス変種は感染した細胞において持続した非細胞変性増殖を示した（Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３８４５−６５（Ｍａｙ，１９９９））。

【0007】

アルファウイルスは、遺伝子治療研究者にとり興味深いものである。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のすべては、遺伝子の送達のためのベクターを開発するために用いられた。偽型ウイルスは、アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質およびレトロウイルスのカプシドを結合させることにより形成される可能性がある。アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質偽型レトロウイルスまたはレンチウイルスはそれらが潜在的な宿主細胞に運搬する遺伝子をインテグレートすることが可能である。偽型アルファウイルスは、アルファウイルスエンベロープタンパク質Ｅ２およびＥ１により認識され感染する。ウイルス遺伝子の安定したインテグレーションは、これらのベクターのレトロウイルス内部を介して行われる。

【0008】

ターゲティングの特異性が欠如しているため、遺伝子治療の分野においてアルファウイルスの使用には限界がある。しかしながら、Ｅ２の構造の非保存ループの可変抗体領域の導入を通し、特定の細胞集団が標的とされる。さらにまた、いくつかの内在性アルファウイルスタンパク質が感染においてアポトーシスの誘導に関与しているので、また、アルファウイルスカプシドが宿主細胞へのｍＲＮＡの一過性導入のみを介して行われるので、遺伝子治療の場合、全てのアルファウイルスの使用は限られた有効性しか持たない。これらの限界のどちらも、レトロウイルスまたはレンチウイルスのアルファウイルスエンベロープの偽型には及ばない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書の１態様は、アルファウイルスレプリコンを有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、そこでアルファウイルスレプリコンは、組み換え型ポリヌクレオチド、レトロウイルスのｇａｇタンパク質、融合エンベロープタンパク質を有し、ＶＬＰはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない。アルファウイルスレプリコンはシンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４、およびレトロウイルスのパッケージングシグナルに由来する可能性がある。レトロウイルスのｇａｇタンパク質は、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。融合エンベロープタンパク質は、ヘマグルチニン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）融合タンパク質、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよびデング熱ウイルスのＥタンパク質、ＳＦＶのＥ１タンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４、および水疱性口内炎（インディアナ）ウイルス−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質、望ましくは糖タンパク質、または断片またはその派生物、より望ましくはＲＮＡウイルスまたはレトロウイルス、または断片またはその派生物、最も望ましくはＶＳＶ−ＧまたはＥｎｖＡ、または変換ＶＳＶ−Ｇから成る群から選択される。本明細書において説明されるＶＬＰは、真核細胞、望ましくはヒト細胞と結合することが可能である可能性がある。ＶＬＰの結合は、標的細胞に特異的である可能性がある。望ましくは本明細書において説明されるＶＬＰは、標的細胞において複製する。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰは、細胞に対し細胞変性効果を持たない。ＶＬＰの組み換え型ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ、望ましくは細胞の遺伝子の発現をノックダウンするｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを有する可能性がある。ＶＬＰの組み換え型ポリヌクレオチドは、細胞により発現することが可能なタンパク質をコードするＲＮＡを有する可能性がある。

【0010】

本明細書の別の実施形態は本明細書において説明されるＶＬＰの産生方法であり、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１のベクター、そこでアルファウイルスレプリコンは目的のポリヌクレオチドを含み、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する第２のベクター、および融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する第３のベクターで真核細胞を同時形質転換する工程、各々のベクターが、それがコードする産物の産生を生じさせる適当な条件下で同時形質転換した細胞を培養する工程、それによりＶＬＰを産生する工程、およびＶＬＰを細胞から単離する工程を有し、ベクターも細胞も任意のアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない。

【0011】

本明細書の別の実施形態は、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１のベクターを有するキットであり、アルファウイルスレプリコンは目的のポリヌクレオチドを含み、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する第２のベクター、およびＶＳＶ−Ｇのような融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する第３のベクターを有するキットである。いくつかの実施例において、キットにより提供されるベクターは、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない。あるいは、いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコン、レトロウイルスのｇａｇタンパク質、および融合エンベロープタンパク質の１若しくはそれ以上は、同じベクターによりコードされる可能性がある。

【0012】

本明細書の別の実施形態は、細胞を本明細書において説明されるＶＬＰで処理することを有する、真核細胞において組み換え型ポリヌクレオチドを発現する方法である。

【0013】

本明細書の別の実施形態は対象に本明細書において説明される組み換え型ポリヌクレオチドを送達する方法であり、本明細書において説明されるＶＬＰを前述の対象に投与する工程を有する。

【0014】

本明細書の別の実施形態は対象における病気または障害を治療または予防する方法であり、本明細書において説明されるＶＬＰを対象に投与する工程を有する。好ましくは、目的の遺伝子の発現は、前述の対象により内在性遺伝子の不足した発現を補う。

【0015】

本明細書の別の実施形態は、本明細書において説明されるＶＬＰを有する医薬品組成物である。

【0016】

本明細書の別の実施形態は、細胞を本明細書において説明されるＶＬＰで処理することにより産生される真核細胞である。

【0017】

このようなＶＬＰＳを産生するために、いくつかのコンポーネントは、インビトロでの産生のために細胞株にこれらのコンポーネントをコードする１若しくはそれ以上のベクターをトランスフェクションまたはヌクレオフェクションすることにより産生される可能性がある。いくつかの実施形態において、これらのコンポーネントは、結果として生じるＶＬＰが複製能を有する可能性を下げるために、別々のベクターによりコードされる。例えば、１つのベクターがＶＬＰによりパッケージングされるようにアルファウイルスベースのＲＮＡポリヌクレオチドのような遺伝物質をコードし、別のベクターがｇａｇタンパク質のようなＶＬＰの構造タンパク質をコードし、さらに別のベクターが標的細胞の膜にＶＬＰの融合を促進するためにＶＳＶ−Ｇのような融合タンパク質をコードするマルチベクターシステムが用いられる可能性がある。アルファウイルスベースのＲＮＡポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来であることが可能である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドはシンドビスウイルスに由来し、シンドビスウイルス非構造タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来し、ＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードする。しかしながら、他のアルファウイルス非構造タンパク質は、本明細書において説明されるＲＮＡコンストラクトにとって十分である可能性がある。適当なアルファウイルスは、アウラウイルス、ババンキウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎウイルス、ゲタウイルス、ハイランドＪウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、ミッデルブルフウイルス、Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅウイルス、セムリキ森林ウイルス、南部ゾウアザラシウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｏｃａｒａウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロアウイルスを含む。

【0018】

また、ＶＬＰｓを産生するために説明されるベクターを有する細胞は、本明細書において説明される。これらの細胞は、ベクターのポリヌクレオチドを転写または発現することにより本明細書において説明されるＶＬＰｓを産生するのに用いられる可能性がある。例えば、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドおよびパッケージングシグナルを有するアルファウイルスＲＮＡコンストラクトをコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするベクター、およびウイルス融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトした哺乳動物細胞は、ＶＬＰの中に包まれた１または２コピーのコードされたアルファウイルスＲＮＡコンストラクトで、その表面上に発現したウイルス融合タンパク質を有するＶＬＰを産生することが可能であった。さらにまた、これらのベクターのいずれもアルファウイルス構造タンパク質をコードしないので、伝染性ウイルスを作り出す可能性はアルファウイルス構造タンパク質を含むシステムと比較して大幅に減少する。

【0019】

ベクターおよび細胞を用い産生させたＶＬＰｓはまた、本明細書において説明される。本明細書において説明されるＶＬＰｓは、４つの一般的な特徴を有し、それらはアルファウイルスレプリコンをコードする１つまたは２つのＲＮＡ分子、および任意に目的のタンパク質を有し、それらはレトロウイルスのｇａｇタンパク質、または、いくつかの実施形態において、ｇａｇ融合タンパク質を有するウイルスコアを有し、それらは細胞で融合を促進するために表面タンパク質を有し、それらはアルファウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない。

【0020】

本明細書において説明されるＶＬＰｓは様々な方法で産生される可能性があり、そのことは提供される開示に基づき当業者にとって明らかである。これらの様々な方法の共通性は、必要なタンパク質（ｇａｇおよび融合タンパク質）を発現し、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを産生することが可能な細胞における説明されるベクターの発現である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、本明細書において例示される３つのベクターの配列を図示する。図１Ａは、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｉｎ Ｒｅｐ−目的のタンパク質−２（ＰＯＩ−２）を示し、それはシンドビスウイルスベースのレプリコンである。図１Ｂは、プラスミドｐＧＡＧ−目的のタンパク質−１（ＰＯＩ−１）を示し、それはレトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードする。図１Ｃは、プラスミドｐＥｎｖｅｌｏｐｅを示し、それはＶＳＶ−Ｇのようなウイルス融合タンパク質をコードする。

【図2】図２は、図１Ａにおいて示されるプラスミドに相当する、本明細書に準じるベクターの例を図式的に示す。ベクターのＤＮＡシークエンスは配列表において提供され、本明細書に付加される。

【図3】図３は、本明細書において説明される形質導入するＶＬＰｓを産生する方法を図式的に示す。

【図4】図４は、３つの別々のＶＬＰ形質導入実験の結果を示す。図４Ａは、３つ全てのプラスミドでトランスフェクションしたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）−２１細胞から回収した上清より得られるＶＬＰｓにパッケージングされるＧＦＰを発現しているシンドビスウイルスレプリコンで形質導入した細胞を示し、図４Ｂは、エンベロープタンパク質を欠きｐＣＭＶ−Ｓｉｎ Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２およびｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１プラスミドのみでヌクレオフェクトしたＢＨＫ−２１細胞から回収した細胞上清でインキュベートした細胞におけるＧＦＰ発現の欠損を示す。図４Ｃは、構築したＶＬＰｓがヒト細胞を形質導入することが可能であることを証明するヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞の形質導入を示す。

【図5】図５は、本明細書において説明されるＶＬＰｓを１時間（Ａ）、２日（Ｂ）、４日（Ｃ）、および８日（Ｄ）の間４℃で保存後、細胞をうまく形質導入することが可能であることを示す。

【図6】図６は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を発現することが可能なＶＥＥＶレプリコンを有するＶＬＰｓで形質導入される細胞でのガウシアルシフェラーゼの発現レベルを示す（図６Ａ、条件４）。図６Ａの条件１、２、および３は、外来性遺伝子を持たないＶＥＥＶレプリコン（条件１）、またはＧＦＰをコードする遺伝子（条件２および３）で形質導入した細胞でのガウシアルシフェラーゼの発現を示す。図６Ｂは、形質導入後、最初の４時間の間にルシフェラーゼタンパク質の発現動態の実例を提供する。

【図7】図７は、ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子でＶＥＥＶレプリコンを有するＶＬＰでの形質導入を通してｃｒｅリコンビナーゼを細胞に送達することにより細胞で遺伝子発現を変えるのに用いられることが可能であるｃｒｅ／ｌｏｘシステムによる遺伝的プロセスを図示する（図７Ａ）。ｃｒｅリコンビナーゼの存在下においてＧＦＰを発現し、ｃｒｅリコンビナーゼ存在下においてＲＦＰを発現するよう設計された細胞株の、ｃｒｅリコンビナーゼを発現することが可能なレプリコンを運搬するＶＬＰでの形質導入の前および（５、６、および７日）後の遺伝子発現プロファイルを示す。図７Ｂは、機能的なｃｒｅリコンビナーゼ（赤色細胞）のｃｒｅリコンビナーゼ非存在下においてＧＦＰを発現するよう設計した細胞への送達の結果を示す。

【図8】図８は、ＧＦＰを発現することが可能なシンドビスウイルスまたはＶＥＥＶベースのレプリコンを有するＶＬＰｓでＢＨＫ−２１細胞、２９３Ｔの細胞、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質導入した後のＧＦＰの発現を示す。すべてのサンプルの２４および４８時間の時点を示す。

【図9】図９は、ＶＬＰｓへのノンコーディングＲＮＡの機能的なパッケージングを図示する。細胞は、ＶＥＥ−ｒｅｐ−ＧＦＰ（ＧＦＰをコードする）（図９Ａ）、ＶＥＥ−Ｒｅｐ ｍｉＧＦＰ（ＧＦＰのマイクロＲＮＡをコードする）（図９Ｂ）、ＶＥＥＲｅｐ−ＧＦＰおよびＶＥＥＲｅｐ ｍｉＧＦＰ（同時形質導入）（図９Ｃ）、ＶＥＥＲｅｐ−ＧＦＰおよびＶＥＥＲｅｐ ｍｉＧＦＰ（ＧＦＰ形質導入の４時間前に生じたｍｉＲＮＡ形質導入）（図９Ｄ）、ＶＥＥ−ｒｅｐ−Ｃｒｅ（ｍｉＲＮＡの特異性を示すためのスクランブルｍｉＲＮＡの代わりに使用した）（図９Ｅ）、ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＧＦＰおよびＶＥＥ−Ｒｅｐ−Ｃｒｅ（同時形質導入）（図９Ｆ）、またはＶＥＥＲｅｐ−Ｃｒｅ（ＶＥＥ−ｒｅｐ−ＧＦＰを含むＶＬＰｓでの形質導入の４時間前の細胞のインキュベーション）（図９Ｇ）を含むＶＬＰｓで形質導入した。

【図10】図１０は、発現が同じ細胞において生じることが可能である（ＨＬＡ−ＤＲ１またはＣＤ８０をコードする）２つの異なる遺伝子を有するアルファウイルスレプリコンの略図を示す（図１０Ａ）。図１０Ａに示すレプリコンを有するＶＬＰで形質導入後、両方のタンパク質を発現する細胞のイメージは、図１０Ｂにおいて提供され、ＨＬＡ−ＤＲ１発現はＦＩＴＣ（緑色）で免疫特異的な標識を用い可視化され、ＣＤ８０はフィコエリトリン（赤色）で免疫特異的な標識を用い視覚化され、結合したイメージはまた、同じ細胞における共発現を図示するため示される。

【図11】図１１は、ｐＤｅｓｔ４７２−ＶＥＥ−ＭＣＳの略図を提供する。

【図12】図１２は、ｐＤｅｓｔ４７２−ＶＥＥの略図を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0022】

標的細胞における導入遺伝子発現のための様々なアルファウイルスベースの発現ベクターが報告された（Ｘｉｏｎｇ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ１１８８−９１およびＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４３９−４６）。安全性考察のため、これらの発現システムは、通常２つのプラスミドを有する。第２のプラスミドはウイルス構造遺伝子をコードするが、１つのプラスミドはウイルスレプリコン（すなわち、非構造タンパク質）のコーディング配列および内在性プロモーターおよび導入遺伝子のコーディング領域を含む。これらのプラスミドはインビトロでｍＲＮＡを生成するのに用いられ、その後球状感染性ウイルス粒子を生成するため宿主細胞にレクトロポレートした。その後、これらのウイルス粒子を導入遺伝子発現のため標的細胞に感染させるために用いる。非構造および構造ウイルスエレメントをコードするこれらのシークエンスエレメントとの間の組み換えは、生体内で有意な細胞変性効果をもたらす能力を有する複製可能なアルファウイルス粒子を産生することが可能であるので、しかしながら、これらの粒子は安全性の懸念を生じさせる。

【0023】

可能性のあるこの問題の解決策は、それが自己複製し、何ら核が関与しなくても目的の遺伝子を発現することが可能である哺乳動物細胞の細胞質にアルファウイルスレプリコンを送達するために関連のないＶＬＰｓを用いることである。これらのＶＬＰｓは、３つのベクターを用い産生されることが可能である。第１のベクターは、哺乳類プロモーター（例えばＣＭＶ）の制御下のアルファウイルスレプリコンのコーディング配列、レトロウイルス特異的ＲＮＡパッケージシグナル、および目的の遺伝子またはポリヌクレオチドを有する。遺伝子は、治療または研究用途を持つタンパク質、またはｓｈＲＮＡまたは他の制御核酸を発現する可能性がある。第２のベクターは、レトロウイルスｇａｇを有する。第３のベクターは、標的細胞の感染のための適当なエンベロープ糖タンパク質を提供する。

【0024】

適切なパッケージング細胞株への同時トランスフェクションでは、第１のベクターに存在する細胞プロモーターから転写されるＲＮＡ分子は、第２のベクターから産生されるＶＬＰｓにパッケージングされる。これらのＶＬＰｓは、アルファウイルスベースのレプリコンをＶＬＰｓに存在するエンベロープ糖タンパク質に基づき標的細胞に送達することが可能である。細胞内に入ると、宿主翻訳機構は導入されたアルファウイルスＲＮＡを翻訳し、アルファウイルス複製タンパク質を産生し、それは順にＲＮＡを増幅し、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する。上述したような変異体レプリコンは、宿主細胞への影響を最小限に抑えて、発現の持続時間を大幅に延長することが可能である。さらに、アルファウイルス構造要素の遺伝子をコードするＤＮＡは標的細胞において存在しないため提案されたシステムの安全性は大幅に強化される。

【0025】

ＶＬＰｓに関する組成物および説明されるＶＬＰｓを製作し使用する方法は、本明細書において説明される。説明される組成物はＶＬＰｓを含み、ベクターおよび細胞を説明されるＶＬＰｓを産生するため使用した。本明細書において説明される関連した方法は、ＶＬＰｓを産生する方法、ＶＬＰｓを用い細胞を形質導入する方法、および本明細書において説明されるＶＬＰｓを用い標的細胞における目的のタンパク質またはポリヌクレオチドを産生する方法に関するものである。ウイルス感染の危険性のない標的細胞において目的のタンパク質またはポリヌクレオチドの発現を可能にさせるアルファウイルスベースのレプリコンはまた説明される。

【0026】

定義
用語「１つ」、「ａ」、または「ａｎ」がこの開示において用いられる場合、特に明記しない限り、それらは「少なくとも１」または「１若しくはそれ以上」を意味する。

【0027】

本明細において用いられる「融合タンパク質」という用語は、受容細胞の膜にＶＬＰのエンベロープ由来の細胞膜の融合を誘導することが可能なタンパク質を指すように意図されている。

【0028】

「発現する」および「産生する」という用語は、同義的に本明細書において用いられ、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は、ＲＮＡへの遺伝子の発現を包含する。これらの用語はまた、１若しくはそれ以上のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳を包含し、さらにすべての天然に産生する転写後および翻訳後の修飾を含む。抗体またはその抗原結合性フラグメントの発現または産生は、細胞の細胞質内または細胞培養の増殖培地のような細胞外環境中で起こる可能性がある。

【0029】

同意語として「核酸分子」、「ヌクレオチド」、または「核酸」を指す「ポリヌクレオチド」は任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである可能性がある。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より一般的には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物である可能性があるＤＮＡおよびＲＮＡを有する混成分子を含むが、これに限定されるものではない。これに加え、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を有する三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１若しくはそれ以上の修飾塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性または他の理由のため修飾した骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾」塩基は、例えば、イノシンのようなトリチル化塩基および異常塩基を含む。様々な修飾は、ＤＮＡおよびＲＮＡになされる可能性があり、このように「ポリヌクレオチド」は、ウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態だけでなく、典型的に天然に認められるような、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態を含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短い核酸鎖を含む。

【0030】

本明細において用いられる「レプリコン」は、そのシークエンスの複製を促進するのに必要な遺伝因子を有するリヌクレオチドを指し、また、翻訳を成し遂げることが可能である。

【0031】

本明細において用いられる「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に類似している構造を指す。好ましい実施形態において、ＶＬＰは、粒子の表面に提示される少なくとも１つの融合タンパク質を有する。本発明に基づくウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製コンポーネントの全てまたは一部が欠損している。一般的に、本発明に基づくウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を運搬しない。

【0032】

ベクター
アルファウイルス構造タンパク質をコードしないアルファウイルスベースのレプリコンを運搬するＶＬＰｓを産生するのに用いられるベクターは、本明細書において説明される。このようなＶＬＰＳを産生するために、いくつかのコンポーネントは、インビトロでの産生のために細胞株にこれらのコンポーネントをコードする１若しくはそれ以上のベクターをトランスフェクションまたはヌクレオフェクションすることにより産生される可能性がある。いくつかの実施形態において、これらのコンポーネントは、結果として生じるＶＬＰが複製能を有する可能性を下げるために、別々のベクターによりコードされる。例えば、１つのベクターがＶＬＰによりパッケージングされるようにシンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドのような遺伝物質をコードし、別のベクターがｇａｇタンパク質のようなＶＬＰの構造タンパク質をコードし、さらに別のベクターが標的細胞の膜にＶＬＰの融合を促進するためにＶＳＶ−Ｇのような融合タンパク質をコードするマルチベクターシステムが用いられる可能性がある。

【0033】

選択可能または誘導可能なプラスミドのような宿主細胞によりパッケージされる遺伝物質をコードするベクターは様々な形をとることが可能であるが、いくつかの共通の特徴を有する。例えば、本明細書において説明されるＲＮＡアルファウイルスベースのレプリコンをコードするベクターは、プロモーター配列、レトロウイルスのパッケージングシグナル配列、翻訳開始配列、非構造アルファウイルスタンパク質、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドを挿入するためのクローニングサイト、挿入された目的の遺伝子またはポリヌクレオチド、３'末端の非翻訳領域、およびポリアデノシン鎖セグメントを含む可能性がある。

【0034】

いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、ベクターのセグメントが宿主細胞により転写されるのを可能にさせるプロモーター要素を含む。いくつかの実施形態において、ベクター配列は、ＶＬＰにパッケージングされるＲＮＡに転写される可能性がある。説明されるベクターの大部分の実施形態において、プロモーター配列は、ベクター中に含まれる翻訳可能な要素の全ての上流に位置する（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター「ｐＣＭＶ」の位置を図示している図１（ａ）を参照）。本明細書において説明されるいくつかの実施形態において、プロモーター配列はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスに由来する。多数の他のプロモーター配列は当業者には周知であり、本明細書において説明されるベクターでのそれらの使用は提供される説明に基づき明らかである。

【0035】

いくつかの実施形態において、宿主細胞によりパッケージングされる遺伝物質をコードする説明されるベクターは、ベクターから転写された１または２コピーのＲＮＡ配列が、宿主細胞で形成されるＶＬＰ粒子にパッケージされるのを可能にさせるためにレトロウイルスのパッケージングシグナル配列（別名プサイ（Ψ）因子）をコードするポリヌクレオチド配列を含むことが可能である。全てではないが、ほとんどのレトロウイルスはこの天然のパッケージングシークエンスを有し、従って、これらのシークエンスが説明されるベクターへ組み込まれることは当業者にとってすぐに明らかである。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、ラウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、などに由来するレトロウイルスのパッケージング配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、レトロウイルスのパッケージング配列は、ラウス肉腫ウイルスに由来する。あるいは、レトロウイルスのパッケージング配列は、マウス白血病ウイルスに由来する。

【0036】

本明細書において説明される宿主細胞によりパッケージングされる遺伝物質をコードするベクターの別の態様は、翻訳開始配列であり、宿主細胞において翻訳されるベクターによりＲＮＡ配列がコードされるのを可能にする。いくつかの実施形態において、説明される翻訳開始配列は、アルファウイルスベースの非構造タンパク質の発現を可能にさせることが可能である可能性があり、それが宿主細胞に送達されると、それは説明されるＶＬＰｓにより運搬されるＲＮＡ配列を複製することが可能である。いくつかの実施形態において、説明される翻訳開始配列は、目的の遺伝子の発現を可能にさせることが可能である可能性がある。いくつかの実施形態において、翻訳開始配列は、目的の遺伝子が宿主細胞翻訳複合体により翻訳されることを可能にさせる可能性がある。いくつかの実施形態において、本明細書において説明される翻訳開始配列は、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶのようなアルファウイルスに由来する可能性がある。他の実施形態において、翻訳開始配列は、哺乳類の翻訳複合体によりＲＮＡ配列の翻訳を開始することが可能である翻訳開始配列を有することが知られているウイルス遺伝子のような他の遺伝子に由来する可能性がある。あるいは、翻訳開始配列は、説明されるアルファウイルスレプリコンに挿入される目的の遺伝子の天然の翻訳開始配列のような他の遺伝子に由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、本明細書において説明される翻訳開始配列は、パッケージングされたＲＮＡ分子の中に複数個所存在する可能性があり、このように説明されるベクターにより１若しくはそれ以上の回数、コードされる可能性がある。例えば、パッケージＲＮＡ分子によりコードされる目的の遺伝子とは別に説明されるシンドビスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質を翻訳することが望ましい可能性がある。このような例においては、非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは両方、ベクターおよびパッケージングされたＲＮＡにおいて、それらの配置の５'末端に位置する別々の翻訳開始配列を有する。この説明に基づいて、当業者は、哺乳動物細胞でＲＮＡの翻訳を促進させることが可能な様々な翻訳開始配列が本明細書において説明される記載したＶＬＰパッケージングＲＮＡに包含される可能性があることを理解するであろう。

【0037】

宿主細胞によりパッケージングされるための遺伝物質をコードするベクターはまた、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質のような非構造アルファウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、説明されるベクターは１若しくはそれ以上のシンドビスウイルス非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、１若しくはそれ以上のＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ２をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ３をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４をコードするポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする説明されるベクターのポリヌクレオチドは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶのそれのようなアルファウイルスゲノムの対応するゲノム配列に由来する。いくつかの実施形態において、非構造タンパク質配列が存在するよりむしろ、構造タンパク質が同一または異なるアルファウイルス由来であるか否かにかかわらず、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドはアルファウイルス構造タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを欠く。

【0038】

宿主細胞によりパッケージングされるための遺伝物質を取り込むために本明細書において説明されるベクターはまた、ベクターによりコードされる遺伝物質を運搬するＶＬＰにより形質導入される宿主細胞において発現される可能性のある目的のポリヌクレオチドを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるベクターはＶＬＰにパッケージングされるＲＮＡポリヌクレオチド配列をコードする可能性があり、その後、それは細胞のＶＬＰ介在性の形質導入により宿主細胞に送達されることが可能である。ＲＮＡポリヌクレオチド配列が標的細胞に送達されると、ＲＮＡによりコードされる目的のポリヌクレオチドは目的のタンパク質の発現を提供する可能性がある。したがって、本明細書において説明されるベクターは、標的細胞内に入ると目的の遺伝子を発現することが可能なＶＬＰへのパッケージングのためのＲＮＡをコードするよう設計される。したがって、いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、目的のポリヌクレオチド配列を含む。説明されるベクターのいくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、目的のタンパク質をコードする可能性がある。例えば、目的のポリヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態においてＧＦＰをコードする可能性があり、標的細胞のウイルス形質導入の検出可能なマーカーの役目を果たす可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞の内在性タンパク質の機能的なバージョンをコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象の内在性タンパク質の機能的なバージョンをコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞にとって異質であるタンパク質をコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象にとって異質であるタンパク質をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞に治療効果を有することが可能なタンパク質をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象に治療効果を有することが可能なタンパク質をコードする可能性がある。他の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ干渉分子として働き、宿主細胞で内在性遺伝子発現を制御する働きをする可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ干渉を開始するためのＲＮＡヘアピンループの形成を提供する配列を有する可能性がある。これに加えて、目的のポリヌクレオチドは、パッケージングされたＲＮＡ分子によりコードされるアルファウイルス非構造タンパク質により形成されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体により転写されることが可能であるＲＮＡのプラスまたはマイナス鎖である可能性がある。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはプラス鎖およびマイナス鎖方向においてＲＮＡを転写ことが可能であるため、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのようなＲＮＡ干渉する配列はパッケージングされたＲＮＡレプリコンに挿入される可能性があり、干渉するポリヌクレオチドをどちらの方向にでもコードするよう設計されることが可能である。それが対象において選択したタンパク質の発現を可能にさせることが可能であるため、当業者は、説明される形質導入システムのこの態様の治療的な特徴を正当に評価するであろう。説明されるベクターのこの態様に基づいて、目的のポリヌクレオチド配列の挿入を容易にするために、１若しくはそれ以上の制限酵素サイトを有するクローニングサイトはまた、ベクターに含まれる可能性がある。

【0039】

本明細書において説明されるＶＬＰｓの産生に有用な別のベクターは、ウイルス構造タンパク質をコードするベクターである。そのような種類のタンパク質の１つは、レトロウイルスの群特異抗原（ｇａｇ）タンパク質である。ｇａｇタンパク質はレトロウイルスのコア構造タンパク質であり、いくつかの例で、真核細胞で発現する場合、エンベロープを有するウイルスコアを形成することが可能である。それらは粒子の基本的な構造面を形成することが可能であり、レトロウイルスのパッケージングシグナル配列と関連したＲＮＡをパッケージングを可能にさせることが可能であるので、この特性はｇａｇタンパク質を特にＶＬＰｓの産生に有用なものにする。したがって、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、レトロウイルスｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびｇａｇ遺伝子配列が宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡに転写を可能にさせるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。１実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列は、ＳＶ４０またはＣＭＶのようなウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、ベクターはさらに、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。従来の当業者は、任意のレトロウイルス由来のｇａｇタンパク質のポリヌクレオチド配列がベクターおよび本明細書において説明されるＶＬＰｓを産生するのに用いられる可能性があることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ラウス肉腫ウイルスに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＩＶに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトＴリンパ球向性ウイルスに由来する可能性がある。

【0040】

本明細書において説明されるＶＬＰｓの産生に有用な別のベクターは、ＶＬＰエンベロープと宿主細胞との間で融合を仲介するタンパク質をコードするベクターである。この目的の場合の適当なタンパク質の種類はウイルス融合タンパク質であり、それはエンベロープウイルスをその膜と宿主細胞のそれとを融合させることにより細胞のウイルス感染を促進する。ウイルス融合タンパク質の多くはまた、選択した細胞型のターゲティングを可能にさせる可能性のある細胞受容体タンパク質であることが知られており、またはそれが疑われており、または、インフルエンザウイルスのためのシアル酸のような、より遍在する受容体の場合には、より全般的なターゲティングが要求される可能性がある。いくつかの例において、ウイルス融合タンパク質は、ウイルス付着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、または付属タンパク質とともに連動して働き、従って、このようなタンパク質はまた、説明されるベクターによりコードされる可能性があり、加えて、また、ウイルス融合タンパク質をコードするベクターによりコードされる可能性がある。あるいは、いくつかの実施形態において、望ましい細胞型にＶＬＰのターゲティングを促進、または命令する、別のウイルスのウイルス付着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、または付属タンパク質と共に１つのウイルス由来のウイルス融合タンパク質は、説明されるベクターによりコードされる可能性がある。いくつかの実施形態において、ウイルス融合タンパク質、ウイルス付着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、または付属タンパク質は１型膜タンパク質であり、細胞表面に存在する場合、それはタンパク質の細胞外領域を細胞外に配向させる。これはまた、融合タンパク質が、パッケージング細胞からのＶＬＰの出芽後、正しい位置に配向させることを可能にさせる。細胞におけるそのようなタンパク質の発現は一般的にタンパク質で被覆されている細胞表面をもたらし、そのため、細胞膜の任意の部分からのＶＬＰの出芽はその表面でＶＬＰにある程度のタンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、ウイルス融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび融合タンパク質遺伝子配列が宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡに翻訳されるのを可能にさせるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。１実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列は、ＳＶ４０またはＣＭＶのようなウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、説明されるベクターは、ウイルス付着タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび付着タンパク質遺伝子配列が宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡに翻訳されるのを可能にさせるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。１実施形態において、プロモーターポリヌクレオチド配列は、ＳＶ４０またはＣＭＶのようなウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、ロタウイルスＶＰ７タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。その他のそのような融合タンパク質は、望ましい親和性または関連するウイルスの細胞標的に基づく当業者にとって明らかである。

【0041】

説明されるベクターを発現している細胞
説明されるベクターを有するＶＬＰｓを産生するための細胞は、本明細書において提供される。これらの細胞は、ベクターのポリヌクレオチドを転写または発現することにより本明細書において説明されるＶＬＰｓを産生するのに用いられる可能性がある。例えば、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドおよびパッケージングシグナルを有するアルファウイルスＲＮＡコンストラクトをコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするベクター、およびウイルス融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトした哺乳動物細胞は、ＶＬＰの中に包まれた１または２コピーのコードされたアルファウイルスＲＮＡコンストラクトで、その表面上に発現したウイルス融合タンパク質を有するＶＬＰを産生することが可能であった。さらにまた、これらのベクターの何れもアルファウイルス構造タンパク質をコードしないので、伝染性ウイルスを作り出す可能性はアルファウイルス構造タンパク質を含むシステムと比較して大幅に減少する。

【0042】

説明される細胞は、翻訳することが可能である任意の真核細胞である可能性があり、（ｇａｇおよび融合タンパク質の場合のような）必要に応じ、説明されるベクターのポリヌクレオチドを転写する。多くの実施形態において、細胞はおそらく哺乳動物細胞である。例えば、マウス、ハムスター（ＣＨＯまたはＢＨＫ−２１）、またはラット細胞のような齧歯動物の細胞は、説明されるベクターを発現させるのに用いられることが可能であり、メイディンダービーイヌ腎臓細胞のようなイヌ細胞は、説明されるベクターを発現するのに用いることが可能であり、ベロ細胞のような霊長類細胞は、説明されるベクターを発現するのに用いることが可能であり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト腎臓）、Ｈｅｐ−２細胞（ヒト気道）、Ｃａｃｏ−２（腸）、ＨｅＬａ（上皮）、および当技術分野で既知であるその他のそのような細胞株のようなヒト細胞は、説明されるベクターを発現するのに用いることが可能であった。いくつかの実施形態において、説明される細胞は、当技術分野で既知である標準的なトランスフェクションおよび選択方法を用いてトランスフェクトし、選択することが可能であり、説明されるベクターの１若しくはそれ以上を安定して有する。

【0043】

いくつかの実施形態において、本明細書において説明される細胞株は、アルファウイルスレプリコンが目的のタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、および異種融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターを含み、ベクターも細胞もアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびレトロウイルスのパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列を有する可能性がある。いくつかの実施形態において、レトロウイルスのパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ラウス肉腫ウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、異種融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＶＳＶ−Ｇをコードする。

【0044】

ウイルス様粒子
ベクターおよび細胞を用い産生させたＶＬＰｓはまた、本明細書において説明される。本明細書において説明されるＶＬＰｓは、４つの一般的な特徴を有し、それらはアルファウイルスレプリコンをコードする１つまたは２つのＲＮＡ分子、および任意に目的のタンパク質を有し、それらはレトロウイルスのｇａｇタンパク質、または、いくつかの実施形態において、ｇａｇ融合タンパク質を有するウイルスコアを有し、それらは細胞で融合を促進するために表面タンパク質を有し、それらはアルファウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まない。

【0045】

本明細書において説明されるＶＬＰｓは、その中の目的のタンパク質を発現するために細胞を形質導入するのに有用である。したがって、説明されるＶＬＰｓは、目的のタンパク質をコードすることが可能な１つまたは２つのアルファウイルスベースのＲＮＡポリヌクレオチドを包含する可能性がある。ＲＮＡ配列の翻訳を促進するために、本明細書において解説されるように、説明されるパッケージングされたＲＮＡのいくつかの実施形態は翻訳開始配列を含む可能性がある。いくつかの実施形態において、ＶＬＰに取り込まれるＲＮＡ配列は、形成されるＶＬＰにＲＮＡの包含を促進するレトロウイルスのパッケージング配列を含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスのパッケージング配列は、ラウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスなどに由来する。特定の実施形態において、レトロウイルスのパッケージング配列は、ラウス肉腫ウイルスに由来する。あるいは、レトロウイルスのパッケージング配列は、マウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。これに加えて、ＶＬＰに含まれるＲＮＡ配列は、非構造アルファウイルスタンパク質をコードすることが可能である可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、１若しくはそれ以上のシンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ２をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ３をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、パッケージングされたＲＮＡは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４をコードする可能性がある。パッケージングされたＲＮＡはまた、目的のタンパク質のポリヌクレオチド配列を含む可能性がある。例えば、目的のポリヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態においてＧＦＰをコードする可能性があり、標的細胞のウイルス形質導入の検出可能なマーカーの役割を果たす可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞の内在性タンパク質の機能的なバージョンをコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象の内在性タンパク質の機能的なバージョンをコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞にとって異質であるタンパク質をコードする可能性がある。別の実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象にとって異質であるタンパク質をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞に治療効果を有することが可能なであるタンパク質をコードする可能性がある。いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチド配列は、標的対象に治療効果を有することが可能であるタンパク質をコードする可能性がある。それらが細胞または対象において選択したタンパク質の発現を可能にさせることが可能であるため、当業者は、説明されるＶＬＰｓのこの態様の治療的な特徴を正当に評価するであろう。

【0046】

説明されるＶＬＰｓはまた、ウイルスコア構造を粒子に提供するために、ウイルスｇａｇタンパク質を有する可能性がある。真核細胞で発現される場合、ｇａｇタンパク質はレトロウイルスのコア構造タンパク質であり、いくつかの実施形態において、エンベロープを有するウイルスコアを形成することが可能である。それらが粒子の基本的な構造面を形成することが可能であり、レトロウイルスのパッケージングシグナル配列と関連したＲＮＡをパッケージングすることを可能にさせることが可能であるので、この特性はｇａｇタンパク質を特にＶＬＰｓの産生に有用なものにする。従来の当業者は、任意のレトロウイルス由来のｇａｇタンパク質は、本明細書において説明されるベクターおよびＶＬＰｓを産生するのに用いられる可能性があるものと理解するであろう。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質は、ラウス肉腫ウイルスに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質は、マウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。他の実施形態において、ｇａｇタンパク質は、ＳＩＶ、ＨＩＶ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、または類似したレトロウイルスに由来する可能性がある。

【0047】

本明細書において説明されるＶＬＰｓの別のコンポーネントは、ＶＬＰエンベロープと宿主細胞との間で融合を仲介するタンパク質である。この目的の場合の適当なタンパク質の種類はウイルス融合タンパク質であり、それはエンベロープウイルスをその膜と宿主細胞のそれとを融合させることにより細胞のウイルス感染を促進する。ウイルス融合タンパク質の多くはまた、選択した細胞型のターゲティングを可能にさせる可能性のある細胞受容体タンパク質であることが分かっていたか、疑わしかった、または、インフルエンザウイルスのためのシアル酸のような、より遍在する受容体の場合には、より全般的なターゲティングが達成される可能性がある。いくつかの例において、ウイルス融合タンパク質は、ウイルス付着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、または付属タンパク質とともに連動して働く可能性があり、従って、このようなタンパク質はまた、ウイルス融合タンパク質に加えてＶＬＰ表面に存在する可能性がある。あるいは、いくつかの実施形態において、説明されるＶＬＰｓは、望ましい細胞型にＶＬＰのターゲティングを促進、または命令する、１つのウイルス由来のウイルス融合タンパク質および別のウイルスのウイルス付着タンパク質、細胞受容体のリガンド、細胞リガンドの受容体、または付属タンパク質を有する可能性がある。同様に、これは選択した様々な細胞型に融合を促進する可能性があるため、説明されるＶＬＰｓはＶＬＰエンベロープにおいて１以上の融合タンパク質を有するよう産生される可能性がある。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ表面タンパク質は１型膜タンパク質であり、細胞表面に存在する場合、それはタンパク質の細胞外領域を細胞外に配向させることを可能にさせる。これはまた、融合タンパク質が、パッケージング細胞からのＶＬＰの出芽後、正しい位置に配向させることを可能にさせる。細胞におけるそのようなタンパク質の発現は一般的にタンパク質で被覆されている細胞表面をもたらし、そのため、細胞膜の任意の部分からのＶＬＰの出芽はその表面でＶＬＰにある程度の融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、細胞融合を仲介する水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、細胞融合を仲介するインフルエンザヘマグルチニンタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、細胞融合を促進するために、インフルエンザノイラミニダーゼタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、ロタウイルスＶＰ７タンパク質を含む。他のそのような融合タンパク質は、望ましい親和性または関連するウイルスの細胞標的に基づく当業者にとって明らかである。

【0048】

本明細書において説明されるＶＬＰｓは、アルファウイルスレプリコンを有する可能性があり、そこでアルファウイルスレプリコンは目的のポリヌクレオチドを含む、または目的のタンパク質、レトロウイルスのｇａｇタンパク質、および異種融合エンベロープタンパク質をコードし、そこでＶＬＰはアルファウイルス構造タンパク質遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、ＶＬＰのアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶに由来する。例えば、本明細書において説明されるＶＬＰｓは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４をコードするアルファウイルスレプリコンを有する可能性がある。いくつかの実施形態において、説明されるＶＬＰｓのパッケージングされたＲＮＡと関連したレトロウイルスのパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルスに由来する。この説明に基づき、当業者は、説明されるＶＬＰｓがＶＬＰ安定性、ＲＮＡパッケージング、または細胞侵入を促進する可能性のあるウイルスの面を取り込むために修飾される可能性があることは容易に理解するであろう。そのような修飾は、本明細書において提供されている開示の範囲内であると理解すべきである。

【0049】

説明されるＶＬＰｓを産生する方法
本明細書において説明されるＶＬＰｓは様々な方法で産生される可能性があり、そのことは提供された開示に基づく当業者にとって明らかである。これらの様々な方法の共通性は、必要なタンパク質（ｇａｇおよび融合タンパク質）を発現し、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを産生することが可能な細胞における、説明されるベクターの発現である。したがって、本明細書において説明されるＶＬＰを産生する方法は、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、そこでアルファウイルスレプリコンは目的のポリヌクレオチドを含む、または目的のタンパク質をコードし、レトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクター、および異種融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有するベクターで真核細胞を同時形質転換する工程、トランスフェクトする工程、またはヌクレオフェクトする工程、および各々のベクターがそのコードする産物の産生を生じさせる適当な条件下で同時形質転換した細胞を培養する工程、それによりウイルス様粒子を産生する工程を含む可能性がある。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンをコードするポリヌクレオチド配列は、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルスまたはＶＥＥＶ非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびレトロウイルスのパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列を有する可能性がある。いくつかの実施形態において、レトロウイルスのパッケージングシグナルは、ラウス肉腫ウイルスまたはマウス白血病ウイルスに由来する可能性がある。いくつかの実施形態において、ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ラウス肉腫ウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、異種融合エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＶＳＶ−Ｇをコードする。

【0050】

組成物および投与の方法
少なくとも１つの説明されるＶＬＰおよび薬理学的に許容可能なキャリヤーを有する組成物は、本明細書において説明される。そのような組成物は、例えば、外来性タンパク質の発現、または対象と同じ種のそれらにおいて通常認められるタンパク質の発現の増加が必要な対象への投与に有用である。組成物は、当技術分野で周知であり適当である、本明細書において説明され例示されるそれらを含む、任意の様々な調製物として製剤される可能性がある。いくつかの実施形態において、組成物は水性製剤である。水溶液は、水または適当な生理バッファにＶＬＰｓを混合すること、要望通り任意に適当な着色剤、香味料、防腐剤、安定化剤、および増粘剤などを加えることにより準備される可能性がある。水性懸濁液はまた、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の既知の懸濁化剤のような粘着性物質を加えた水または生理バッファにおいてＶＬＰｓを分散させることにより作成される可能性がある。

【0051】

組成物は、対象への注射のために製剤される可能性がある。注射の場合、説明される組成物は、水のような水溶液で、または、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的食塩水バッファのような生理的に相溶性のあるバッファで製剤される可能性がある。溶液は、懸濁化剤、安定化剤、分散剤のような１若しくはそれ以上の調合剤を含む可能性がある。例えば、使用前に、滅菌水、食塩液、またはアルコールのような適当な媒体のある状態により、注射製剤はまた、使用直前に注射に適切な液状調製物に変換させる目的で固形調製物として調合される可能性がある。

【0052】

組成物は、対象への噴霧による送達のために製剤される可能性がある。噴霧による送達の場合、説明される組成物は、水のような水溶液で、またはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的食塩水バッファのような生理的に相溶性のあるバッファで製剤される可能性がある。溶液は、懸濁化剤、安定化剤、分散剤のような１若しくはそれ以上の調合剤を含む可能性がある。

【0053】

組成物は、持続放出性または持効性製剤で製剤される可能性がある。そのような長時間作用性の製剤は、（例えば皮下または筋肉内に）移植により投与される可能性がある。つまり、例えば、組成物は適当な高分子または疎水性材料（例えば、許容可能な油中におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体として、例として、難溶性塩として製剤される可能性がある。リポソームおよびエマルジョン類は、疎水性薬物のためのキャリヤーとして使用に適している送達担体の既知の例である。

【0054】

以下の実施例は例示を目的として提供され、先行する開示を強化し、制限しないことが意図されている。

【実施例1】

【0055】

アルファウイルスベースの遺伝子発現システムの産生
アルファウイルス遺伝子発現システムは、標的細胞に細胞変性ウイルス感染を引き起こす危険性の低い外来性の目的の遺伝子（ＧＯＩ）または目的のタンパク質（ＰＯＩ）のＶＬＰ介在性送達を可能にするよう設計される。発現システムは３つのベクターを用いて設計され、それは形質導入するＶＬＰを産生するためにパッケージング細胞株において発現することが可能である。１つのベクターはアルファウイルスベースの発現コンストラクトをコードし、別のベクターはＶＬＰ形成を促進するレトロウイルスのｇａｇタンパク質をコードし、および第３のベクターは宿主細胞にＶＬＰ融合を仲介する融合タンパク質をコードする。これに加え、本システムは、存在するアルファウイルス構造タンパク質を必要とせずに働くよう構築される。

【0056】

これを達成するため、アルファウイルスベースのＤＮＡプラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、後にそれぞれのレトロウイルスのパッケージングタンパク質ＧＡＧのレトロウイルスのパッケージングシグナルが続き、後に非構造タンパク質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、およびＮＳＰ４をコードするシンドビスまたはＶＥＥウイルス遺伝子が続き、そして最後に目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現を誘導する、１若しくはそれ以上のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ；ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターで、結果的にｍＲＮＡの形成をもたらす。）を有するよう産生し、組み換え型ポリヌクレオチドから成り、複数のクローニングサイト、３'非翻訳領域（ＵＲＴ）、およびポリＡ鎖に挿入される。図２は、そのようなアルファウイルスベースのＤＮＡプラスミドの例を示す。この発現ベクターの別のバージョンにおいて、レトロウイルスのパッケージングシグナル（ＧＡＧ）は省略される。

【0057】

別のプラスミドは、レトロウイルスのｇａｇタンパク質および第２の、任意の目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードするよう構築した。第３のプラスミドは、ＶＳＶ−Ｇウイルス融合タンパク質の発現を提供するために構築した。これらのプラスミドの実施形態の概略図は、それぞれ図１Ａ〜１Ｃにおいて提供する。図１ＡはｐＣＭＶ−Ｓｉｎ Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２を示し、図１ＢはｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１を示し、および図１ＣはＶＳＶ−ＧのｐＥｎｖを示す。

【0058】

構築されたプラスミドは、目的の遺伝子を有するシンドビスウイルスレプリコンを運搬するＶＬＰｓを産生する能力をテストした。これらの実験のために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、遺伝子の送達および細胞内発現の検出を容易にするために、目的の遺伝子として用いられた。ＶＬＰｓを産生するために、上述の３つのプラスミドの各々は、メーカーの使用説明書（Ｌｏｎｚａ）に従い、Ａｍａｘａシステムで標準的なヌクレオフェクション手順を用いてベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞にトランスフェクトした（図３）。

【0059】

簡潔に説明すると、３ｘ１０^６のＢＨＫ−２１細胞を、１００μｌヌクレオフェクション溶液Ｌ（Ａｍａｘａ）中に再懸濁し、（総量１０μｌにおいて）ＧＡＧをコードするプラスミド４．５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質をコードするプラスミド３μｇ、およびシンドビスアルファウイルスレプリコンをコードする１００ナノグラムのプラスミドまたはＶＥＥレプリコンの２．５マイクログラムを含むチューブに移した。細胞およびプラスミドの混合物をヌクレオフェクションキュベットに移し、ＢＨＫ−２１のセッティングを用いＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置を用いてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞を完全培養液５００μｌに再懸濁し、培養液を含んだ組織培養プレートに移し、３７℃で７２〜９６時間、または３２℃で７２時間インキュベートした。それ以降、ＶＬＰｓおよびカプシドで包まれたアルファウイルスレプリコンから成る上清を、４℃で３０００ＲＰＭ／１０分での遠心分離により澄まし、０．４５ｕｍフィルターで濾過し、室温で３０分間、１０ＵｎｉｔのＤＮＡｓｅ Ｉ（ｔｕｒｂｏＴＭ−ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ））に曝した。処理したＶＬＰｓは４℃に保存またはドライアイス上で凍結させ−８０℃に移動した。（融合に欠陥があるＶＬＰｓ）ネガティブコントロールとして、ＢＨＫ−２１細胞はまた、ｐＣＭＶ−Ｓｉｎ Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２のみ、またはＶＥＥＶ−Ｒｅｐ−ＰＯＩおよびｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１プラスミドでヌクレオフェクトしたが、ＶＳＶ−ＧをコードするｐＥｎｖｅｌｏｐｅプラスミドはしなかった。トランスフェクションの後、ＶＬＰｓのプラスミド由来の産生を可能にさせるため、細胞を組織培養液において通常の増殖条件下で４８〜７２時間インキュベートした。トランスフェクトした細胞のインキュベートを終了させ、産生した任意のＶＬＰｓを含む組織培養上清を回収した。その後、回収した細胞上清は、細胞がＧＦＰでうまく形質導入されることが可能であったかどうか同定するため、培養ＢＨＫ−２１細胞に加えた。図４で示すように、全３つのプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞から回収した細胞上清をトランスフェクトしなかったＢＨＫ−２１細胞に曝した場合、強いＧＦＰ発現を示す結果となった（図４Ａ）。反対に、ｐＣＭＶ−Ｓｉｎ Ｒｅｐ−ＰＯＩ−２およびｐＧＡＧ−ＰＯＩ−１プラスミドのみでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞から回収した細胞上清とともにインキュベートしたトランスフェクトしなかったＢＨＫ−２１細胞についてはＧＦＰ発現は観察されなかった（図４Ｂ）。類似した実験はまた、構築したＶＬＰｓがヒト細胞を形質導入することが可能であることを実証するためにヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を用いて行われた（図４Ｃ）。さらにまた、構築したＶＬＰｓはまた、細胞を形質導入する能力を失うことなく、少なくとも３０日間４℃に保存することが可能である（図５Ａ〜５Ｄ）。

【0060】

実験はまた、細胞においてタンパク質を発現するＶＥＥＶベースのアルファウイルスレプリコンの能力を評価するため行った。これらの研究のために、ＢＨＫ−２１細胞をＶＥＥＶレプリコンに挿入したガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するＶＬＰｓで形質導入した。形質導入の後、細胞上清のルシフェラーゼタンパク質の発現をモニターした。図６で示すように、外来性遺伝子のない（条件１）またはＧＦＰをコードする遺伝子を持つ（条件２および３）コントロールＶＥＥＶレプリコンと比較して、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を有するＶＥＥＶレプリコンで形質導入した細胞（図６Ａ、条件４）の上清において高いルシフェラーゼ量を検出した。その上、ルシフェラーゼタンパク質の発現は、形質導入の後、急速に増加した（図６Ｂ）。類似した結果はまた、機能的なｃｒｅリコンビナーゼ（赤色細胞）をｃｒｅリコンビナーゼ非存在下において、ＧＦＰを発現するよう設計した細胞に送達する状況において観察された（図７Ｂ）。

【0061】

細胞は、ＧＦＰをコードするシンドビスベースのＶＬＰｓまたはＧＦＰをコードするＶＥＥＶベースのＶＬＰｓと同時に形質導入した。図８で示すように、ＶＥＥＶベースのＶＬＰｓで形質導入した細胞がより高い発現レベルを有することが観察されるが、両方のアルファウイルスベースのＶＬＰｓは強いＧＦＰ発現を引き起こした（図８）。

【実施例2】

【0062】

ＶＥＥアルファウイルスレプリコンにより発現させたｍｉＲＮＡはタンパク質産生を抑制する
実験は、ｍｉＲＮＡ配列をコードするアルファウイルスレプリコンがタンパク質産生を抑制することが可能であったかどうか評価するために行った。これを評価するために、ＢＨＫ−２１細胞をＧＦＰ、ＧＦＰに特異的なｍｉＲＮＡ、またはｃｒｅリコンビナーゼをコードするＶＬＰレプリコンで形質導入した（図９）。（下の図１１および１２、および表１における配列ＩＤ番号１において示されるベクターを参照。）ＧＦＰをコードするレプリコンのみで形質導入した細胞と比較して、ＧＦＰ発現は、細胞を最初にＧＦＰのためのｍｉＲＮＡをコードするレプリコンで形質導入し、その後、続いて（最初の形質導入の４時間後）ＧＦＰをコードするレプリコンで形質導入した場合、顕著に減少した（図９Ａを図９Ｄと比較）。反対に、細胞を最初にｃｒｅリコンビナーゼをコードするレプリコンで形質導入し、その後、（最初の形質導入の４時間後）ＧＦＰをコードするレプリコンで形質導入した場合、ＧＦＰ発現の有意な減少は認められなかった（図９Ｇ）。

【実施例3】

【0063】

ＶＥＥ ＶＬＰｓで形質導入した標的細胞における複数のタンパク質の発現
アルファウイルスレプリコンが同じ細胞で２つの別々のタンパク質を発現することが可能かどうか判断するために、１つのサブゲノムプロモーターの制御下にＨＬＡ−ＤＲ１および別のサブゲノムプロモーター下にＣＤ８０を有するＶＥＥレプリコンを用い実験を行った（図１０Ａ）。説明されるＶＥＥレプリコンを有するＶＬＰｓの産生の後、細胞を形質導入し、両方のタンパク質の発現を解析した。図１０Ｂで示すように、形質導入した細胞は両方のタンパク質を発現することが可能であった（免疫標識されたＨＬＡ−ＤＲ１は緑色（ＦＩＴＣ）で示され、ＣＤ８０は赤色（フィコエリトリン）で示される）。

【0064】

【表1】

【0065】

【0066】

【0067】

【0068】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】