特許 6586103 修飾ＲＮＡを含有する分子集合体及びそれを用いたＲＮＡ送達システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6586103

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】修飾ＲＮＡを含有する分子集合体及びそれを用いたＲＮＡ送達システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20190919BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20190919BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20190919BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20190919BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20190919BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20190919BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190919BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20190919BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20190919BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

   A61K47/59

   A61K47/34

   A61K47/42

   A61K47/22

   A61K48/00

   A61K31/713

   A61K31/7105

   A61P35/00

   !C12N5/09

   !C12N5/10

【請求項の数】18

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2016-557827(P2016-557827)

(86)(22)【出願日】2015年11月6日

(86)【国際出願番号】JP2015081352

(87)【国際公開番号】WO2016072500

(87)【国際公開日】20160512

【審査請求日】2017年5月17日

(31)【優先権主張番号】特願2014-227611(P2014-227611)

(32)【優先日】2014年11月8日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度、岡山県 特別電源所在県科学技術振興事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504147243

【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100104802

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 尚人

(72)【発明者】

【氏名】大槻 高史

(72)【発明者】

【氏名】松浦 栄次

(72)【発明者】

【氏名】小渕 浩嗣

(72)【発明者】

【氏名】赤星 彰也

(72)【発明者】

【氏名】小関 英一

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０３８５５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１２７７３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０３１５６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Advanced Drug Delivery Reviews，２００８年，vol.60，pp.559-571

【文献】 Acta.Med.Okayama，２０１３年，vol.67,no.3，pp.153-164

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の１〜４に記載の成分を必須として含むことを特徴とする、分子集合体。
１）サルコシン鎖を含む親水性ブロックと乳酸鎖を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ
２）長鎖疎水性基を有する化合物により修飾されているＲＮＡ
３）細胞膜結合性化合物
４）上記１〜３の一以上の成分に結合していてもよい光増感剤。

【請求項2】

上記成分３及び４が、光増感剤を結合した細胞膜結合性化合物であって、
当該細胞膜結合性化合物により所定の細胞の細胞壁に吸着してエンドソーム内に取り込まれ、当該光増感剤に光が照射されることで崩壊して当該ＲＮＡが当該細胞内に拡散される一方で、当該光が照射されるまでの間、体内酵素による影響が抑えられるものである、請求項１に記載の分子集合体。

【請求項3】

両親媒性ブロックポリマーＡが、２０〜３００個のサルコシン単位を含む親水性ブロックと、１０〜１００個の乳酸単位を含む疎水性ブロックとを有するものである、請求項１又は２に記載の分子集合体。

【請求項4】

長鎖疎水性基を有する化合物が、ポリ乳酸、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー、又はジメトキシトリチルオキシ−ヘキシルジチオヘキサンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子集合体。

【請求項5】

ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーのポリ乳酸が、１０〜６０個の乳酸単位からなり、ポリサルコシンが、０〜１００個のサルコシン単位からなるものである、請求項４に記載の分子集合体。

【請求項6】

ＲＮＡが、遺伝子発現抑制効果を有するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子集合体。

【請求項7】

遺伝子発現抑制効果を有するＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、又はリボザイムである、請求項６に記載の分子集合体。

【請求項8】

ｓｉＲＮＡが、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇ２（ＡＢＣＧ２）遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡ、若しくはフェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡであるか、又はその両者併用物である、請求項７に記載の分子集合体。

【請求項9】

ＡＢＣＧ２遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、請求項８に記載の分子集合体。
センス鎖（配列番号１０）：
５’−ＣＧＡＵＡＵＧＧＡＵＵＵＡＣＧＧＣＵＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１１）：
５’−ＡＡＧＣＣＧＵＡＡＡＵＣＣＡＵＡＵＣＧｄＴｄＧ−３’

【請求項10】

フェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、請求項８に記載の分子集合体。
センス鎖（配列番号１２）：
５’−ＧＣＡＵＵＵＡＣＣＡＧＵＧＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１３）：
５’−ＵＡＵＧＧＵＣＡＣＵＧＧＵＡＡＡＵＧＣｄＴｄＡ−３’

【請求項11】

細胞膜結合性化合物が、細胞膜透過性ペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子集合体。

【請求項12】

細胞膜透過性ペプチドが、
配列番号１：ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号２：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ
配列番号３：ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ
配列番号４：ＹＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号５：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥ
配列番号１４：ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳＣ
配列番号１５：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＣ
配列番号１６：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶＣ、又は
配列番号１７：ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫＣ
である、請求項１１に記載の分子集合体。

【請求項13】

光増感剤が、４５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長を有する光で機能するものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分子集合体。

【請求項14】

４５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長を有する光で機能する光増感剤が、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素等のシアニン系色素、ローダミン系色素、ポルフィリン系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＤＹ７５０、ＤＹ７５１、ＤＹ７８０、エオシン、ローズベンガル、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、又はカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、請求項１３に記載の分子集合体。

【請求項15】

粒子径が１０〜１００ｎｍである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子集合体。

【請求項16】

請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分子集合体を用いることを特徴とする、腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達システム。

【請求項17】

請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分子集合体を含むことを特徴とする、癌の予防剤又は治療剤。

【請求項18】

請求項１７に記載の予防剤又は治療剤、及びそれに含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための励起光を照射する手段を備えた装置を含む、癌の予防又は治療システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ライフサイエンス、バイオテクノロジー、及び臨床医療の技術分野に属する。本発明は、高分子修飾ＲＮＡを含有する分子集合体、それを含む治療剤、及びそれを用いたＲＮＡ送達システム等に関するものである。

【背景技術】

【0002】

水溶性薬剤の一種であり、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を骨格に持つ核酸医薬品は、いずれも遺伝子上の特定の塩基配列に結合し作用するため、特異性が高く、これまで治療が困難とされていた癌、遺伝性疾患などへの治療応用が期待されている。
従来の低分子化合物では、特定のターゲットに結合する候補化合物を選定する必要があるため、化合物探索に過大な労力を有し、その上市確率はわずか３００００分の１程度である。一方、核酸医薬品は、疾患関連遺伝子そのものを直接ターゲットとし疾患原因タンパク質の発現を抑制可能であるため、低分子化合物と比較し汎用性が高いと考えられている。
核酸医薬品の代表例であるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、２１〜２３塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉と呼ばれる、ｍＲＮＡの発現を抑制する現象であり、２００６年にノーベル生理学医学賞受賞のテーマにもなった。
しかしながら、全世界でこれまでに承認に至った核酸医薬品は極めて少ない。その大きな要因は、核酸分子の生体内での不安定性や自然免疫応答の惹起による副作用の誘発と考えられている。すなわち、核酸分子を生体内で効率よく目的組織・細胞に運び、その効果を安全かつ有効に発揮するためには、適切な薬物送達技術、いわゆるＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）が必要となる（非特許文献１、２参照）。

【0003】

ｓｉＲＮＡ等の機能性ＲＮＡを細胞内に送達するためのＤＤＳ技術として、カチオン性リポソームにＲＮＡを内包する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。カチオン性リポソームは、その構成脂質が正に荷電しているため、負に荷電しているＲＮＡと静電的相互作用により容易に複合体を形成することができ、その複合体が細胞膜と融合すると共に、ＲＮＡも細胞内に侵入すると考えられる。
また、カチオン性リポソームと同様に、静電的相互作用によりカチオン性ポリマーとＲＮＡとを結合させ、ＲＮＡを細胞内に導入するＤＤＳ技術も知られている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、ＲＮＡとカチオン性ポリマー等の静電的結合を用いる方法の問題点は、生体内のアニオン性分子（硫酸化多糖など）やカチオン性分子により阻害されること、カチオン性ポリマーそのものが細胞内に付着・侵入する能力を持ち一般的に細胞毒性が高いことが挙げられる。

【0004】

近年、疎水性のポリ乳酸鎖と親水性のポリサルコシン鎖とからなる両親媒性ブロックポリマーで構成されるナノレベルの高分子ミセルが、優れたＤＤＳ効果を発揮しうるものとして提案されている。例えば特許文献３及び非特許文献３には、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、粒子径が３０ｎｍ以上のポリ乳酸−サルコシン系高分子ミセルを形成することが開示されている。

【0005】

非特許文献４には、上記の疎水性ブロックがポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーからなるポリ乳酸−サルコシン系高分子ミセルに、立体化学の異なる３種のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）標識ポリ乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ、ＩＣＧ−ＰＤＬＡ、及びＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）をそれぞれ包含させて、３種のポリ乳酸−サルコシン系高分子ミセルを調製したことが開示され、生体内におけるＩＣＧ標識ポリ乳酸の立体化学が及ぼす挙動が開示されている。非特許文献４で使用されている高分子ミセルの粒子径は３５ｎｍ以上である。

【0006】

特許文献３並びに非特許文献３及び４に開示された直鎖型両親媒性ブロックポリマーを用いるポリ乳酸−サルコシン系高分子ミセルは、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少することが報告されている。また、これらのポリ乳酸−サルコシン系高分子ミセルは、血中に滞留している、粒子径が数十〜数百ｎｍのナノ粒子が著しく血管透過性の亢進している腫瘍（癌）組織や炎症部位に蓄積しやすいという性質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果））を利用することによって、腫瘍又は炎症部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能なものである。

【0007】

特許文献４には、両親媒性ブロックポリマーを、親水性ブロックが複数本のサルコシン鎖から構成される分岐構造を有するよう分子設計することによって、該ポリマーの自己組織化で形成される分子集合体が開示されている。また特許文献４にはポリ乳酸鎖を有する機能性物質を配合することによる分子集合体の機能化、及び該分子集合体に直鎖型両親媒性ポリマーを配合することによる粒子径制御技術が開示されている。
特許文献５には、サルコシン鎖を含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆを含む分子集合体が開示されている。特許文献３の分子集合体では、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成されているか、又は、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成されている。
上記特許文献３〜５等は、ＲＮＡの細胞内送達について特に述べていない。即ち、特許文献３〜５等に記載の分子集合体が、ＲＮＡの細胞内送達に有効か否かについては不明である。

【0008】

一方、機能性ＲＮＡを細胞内へ導入する技術として、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のＮ末端側またはＣ末端側に連結した、近赤外線領域の波長を有する光で機能する光増感剤（ＰＳＴ）とからなる構造を有するキャリア分子が提案されている（特許文献６参照）。このキャリア分子のＲＢＰにＲＮＡを結合した複合体を細胞に接触させ、近赤外光を照射すると、該ＲＮＡ複合体は細胞質内に拡散され、ＲＮＡの機能が発現される。この技術は、ＲＮＡを細胞質内に侵入させ、機能を発現させるが、該ＲＮＡ複合体を生体内に投与しても、体内にある分解酵素（ＲＮａｓｅ）により直ちに分解されてしまうおそれがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第９４／１９３１４号パンフレット

【特許文献2】国際公開第００／０２９５０号パンフレット

【特許文献3】国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット

【特許文献4】国際公開第２０１２／１７６８８５号パンフレット

【特許文献5】国際公開第２０１４／０３８５５８号パンフレット

【特許文献6】国際公開第２０１２／１２７７３９号パンフレット

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ＨＳレポートＮｏ．８２「平成２５年度 規制動向調査報告書 核酸医薬品の開発と規制の動向」（平成２６年３月）、公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団、２０１４年３月２５日発行

【非特許文献2】「核酸医薬品等共同製造施設設置に向けた事前調査」報告書（２０１１年２月）、株式会社シード・プランニング

【非特許文献3】バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０

【非特許文献4】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １６１， Ｉｓｓｕｅ ３， １０ Ａｕｇｕｓｔ ２０１２， Ｐａｇｅｓ ８２１−８２５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）等を分子集合体のようなナノ粒子に内包させても、細胞のエンドソーム内に取り込まれるか否か不明であり、加えて当該ナノ粒子にＲＮＡが内包された状態でも、例えば光増感剤に光を照射することで、当該ＲＮＡが細胞内に有効に拡散するかどうか不明である。また、ＲＮＡが癌組織にまで送達される間、体内酵素による分解を抑制できる程度にまで当該ナノ粒子がブロック作用を有するか否かなどについても知られていない。
本発明は、生体内投与によって、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡといった機能性ＲＮＡを細胞内へ導入すること及び疾患部位へ送達することを可能とする、該機能性ＲＮＡを含有する新規な分子集合体を提供することを主な課題とする。また、その分子集合体を含む癌予防剤又は治療剤、その分子集合体を用いたＲＮＡ送達システムなどを提供することも課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、サルコシン鎖を含む親水性ブロックと乳酸鎖を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡから主として構成されるＤＤＳキャリアに、疎水性基を有する長鎖化合物で修飾されたＲＮＡ、細胞膜結合性化合物、及び光増感剤を包含することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

本発明として、例えば、以下のものを挙げることができる。

【0014】

［１］次の１〜４に記載の成分を必須として含むことを特徴とする、分子集合体。
１）サルコシン鎖を含む親水性ブロックと乳酸鎖を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ
２）長鎖疎水性基を有する化合物により修飾されているＲＮＡ
３）細胞膜結合性化合物
４）上記１〜３の一以上の成分に結合していてもよい光増感剤。

【0015】

［２］両親媒性ブロックポリマーＡが、２０〜３００個のサルコシン単位を含む親水性ブロックと、１０〜１００個の乳酸単位を含む疎水性ブロックとを有するものである、上記［１］に記載の分子集合体。

【0016】

［３］長鎖疎水性基を有する化合物が、ポリ乳酸、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー、又はジメトキシトリチルオキシ−ヘキシルジチオヘキサンである、上記［１］又は［２］に記載の分子集合体。
［４］ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーのポリ乳酸が、１０〜６０個の乳酸単位からなり、ポリサルコシンが、０〜１００個のサルコシン単位からなるものである、上記［３］に記載の分子集合体。

【0017】

［５］ＲＮＡが、遺伝子発現抑制効果を有するものである、上記［１］〜［４］のいずれか一に記載の分子集合体。
［６］遺伝子発現抑制効果を有するＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、リボザイムである、上記［５］に記載の分子集合体。

【0018】

［７］ｓｉＲＮＡが、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇ２（ＡＢＣＧ２）遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡ、若しくはフェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡであるか、又はその両者併用物である、上記［６］に記載の分子集合体。
［８］ＡＢＣＧ２遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、上記［７］に記載の分子集合体。
センス鎖（配列番号１０）：
５’−ＣＧＡＵＡＵＧＧＡＵＵＵＡＣＧＧＣＵＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１１）：
５’−ＡＡＧＣＣＧＵＡＡＡＵＣＣＡＵＡＵＣＧｄＴｄＧ−３’
［９］フェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、上記［７］に記載の分子集合体。
センス鎖（配列番号１２）：
５’−ＧＣＡＵＵＵＡＣＣＡＧＵＧＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１３）：
５’−ＵＡＵＧＧＵＣＡＣＵＧＧＵＡＡＡＵＧＣｄＴｄＡ−３’

【0019】

［１０］細胞膜結合性化合物が、細胞膜透過性ペプチドである、上記［１］〜［９］のいずれか一に記載の分子集合体。
［１１］細胞膜透過性ペプチドが、
配列番号１：ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号２：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ
配列番号３：ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ
配列番号４：ＹＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号５：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥ
配列番号１４：ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳＣ
配列番号１５：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＣ
配列番号１６：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶＣ、又は
配列番号１７：ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫＣ
である、上記［１０］に記載の分子集合体。

【0020】

［１２］光増感剤が、４５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長を有する光で機能するものである、上記［１］〜［１１］のいずれか一に記載の分子集合体。
［１３］４５０ｎｍ〜１３００ｎｍの波長を有する光で機能する光増感剤が、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素等のシアニン系色素、ローダミン系色素、ポルフィリン系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＤＹ７５０、ＤＹ７５１、ＤＹ７８０、エオシン、ローズベンガル、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）である、上記［１２］に記載の分子集合体。

【0021】

［１４］粒子径が１０〜１００ｎｍである、上記［１］〜［１３］のいずれか一に記載の分子集合体。

【0022】

［１５］上記［１］〜［１４］のいずれか一に記載の分子集合体を用いることを特徴とする、腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達システム。

【0023】

［１６］上記［１］〜［１４］のいずれか一に記載の分子集合体を含むことを特徴とする、癌の予防剤又は治療剤。

【0024】

［１７］上記［１６］に記載の予防剤又は治療剤、及びそれに含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための励起光を照射する手段を備えた装置を含む、癌の予防又は治療システム。

【0025】

［１８］上記［１６］に記載の予防剤又は治療剤を生体内に投与すること、及び投与した予防剤又は治療剤に含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための励起光を照射することを含む、癌の予防方法又は治療方法。

【0026】

［１９］ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーを有する高分子により修飾されているＲＮＡ。
［２０］ＲＮＡが、遺伝子発現抑制効果を有するものである、上記［１９］に記載のＲＮＡ。
［２１］遺伝子発現抑制効果を有するＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、リボザイムである、上記［２０］に記載のＲＮＡ。

【0027】

［２２］ｓｉＲＮＡが、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇ２（ＡＢＣＧ２）遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡ、若しくはフェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡであるか、又はその両者併用物である、上記［２１］に記載のＲＮＡ。
［２３］ＡＢＣＧ２遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、上記［２２］に記載のＲＮＡ。
センス鎖（配列番号１０）：
５’−ＣＧＡＵＡＵＧＧＡＵＵＵＡＣＧＧＣＵＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１１）：
５’−ＡＡＧＣＣＧＵＡＡＡＵＣＣＡＵＡＵＣＧｄＴｄＧ−３’
［２４］フェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡが、次のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である、上記［２２］に記載のＲＮＡ。
センス鎖（配列番号１２）：
５’−ＧＣＡＵＵＵＡＣＣＡＧＵＧＡＣＣＡＵＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１３）：
５’−ＵＡＵＧＧＵＣＡＣＵＧＧＵＡＡＡＵＧＣｄＴｄＡ−３’

【発明の効果】

【0028】

本発明によれば、長鎖疎水性基を有する化合物により修飾されているＲＮＡ（以下、単に「修飾ＲＮＡ」ともいう。）を、サルコシン鎖を含む親水性ブロックと乳酸鎖を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡから主として構成される分子集合体に内包させ、更に、細胞膜結合性化合物、及び光増感剤を当該分子集合体に包含することで、細胞膜結合性化合物により細胞壁に分子集合体を吸着させ、それに伴って当該分子集合体をエンドソーム内に有効に取り込ませることができ、そして当該分子集合体に包含された光増感剤に光が照射されたときに、熱作用等より当該分子集合体の崩壊と当該ＲＮＡの細胞内拡散とをほぼ同時に起こすことができる。また、当該キャリアが血中に投与されてから光が照射されるまでの間、体内酵素による影響を抑えることができる。

【0029】

両親媒性ブロックポリマーＡから主として構成される分子集合体は、ラクトソーム（登録商標）とも称され、例えば、特許文献３〜４で知られており、本発明はその有用性を享受することができる。即ち、両親媒性ブロックポリマーＡから主として構成される分子集合体は、数十ナノレベルの大きさであることから、がん組織等患部組織への集積性が高く、逆にそれ以外の組織への集積性が低く、また生分解性の成分で構成されていることから、生体に対する安全性が高い。加えて、粒径制御が容易であり、調製も容易である。

【0030】

一方、本発明に係る修飾ＲＮＡは、基本的に、カチオン性ポリマーとの結合のような静電的相互作用によらず、疎水性修飾部分にもとづく疎水性相互作用によりミセル集合体に内包される。そのため、本発明の分子集合体は、生体内のアニオン性分子（硫酸化多糖など）やカチオン性分子により阻害され難い。また、カチオン性ポリマーそのものが細胞に付着・侵入する能力を持ち、一般的に細胞毒性が高いが、それを回避することができる。
また、本発明の分子集合体は、細胞質内までＲＮＡを拡散送達することでき、そこでＲＮＡの機能（遺伝子発現抑制機能）を発揮させることができる。

【0031】

従って、本発明によれば、生体内投与によって、ＲＮＡを有効かつ安全に腫瘍などの患部組織に送達集積させることができ（それ以外の組織への集積は抑えられ、副作用を低減できる）、また、患部組織の細胞質内でＲＮＡの機能を発揮させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】本発明の分子集合体が細胞質内へ移行する際の様子を表す模式図である。

【図2】ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー修飾ＲＮＡの合成模式図である。上図左はマレイミド基が結合したポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーを表し、上図右はｓｉＲＮＡを表す。上図右のｓｉＲＮＡの中、チオール基（ＨＳ−基）が結合した方がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である。

【図3】電気泳動図を表す。１のラインはＲＮＡのみの場合を、２のラインはＲＮＡとポリマーとの配合比が１：２の場合を、３のラインは当該配合比が１：５の場合を、２のラインは当該配合比が１：１０の場合を、それぞれ示す。

【図4】ｓｉＲＮＡ・ポリマー反応物の精製前後における電気泳動図である。

【図5】ＥＧＦＰのノックダウン効果（ＲＮＡｉ効果)を表す。左カラムはコントロールを、中央カラムはポリマーで修飾した、標的配列のｓｉＲＮＡを細胞内に導入した結果を、右カラムはポリマーで修飾した、非標的配列のｓｉＲＮＡを細胞内に導入した結果を、それぞれ示す。

【図6】ＥＧＦＰのノックダウン効果（ＲＮＡｉ効果)を表す。左カラムはＥＧＦＰ−ＣＨＯ細胞に対して未処理のネガティブコントロール、左から２番目のカラムは導入試薬（リポフェクトアミン）のみを投与したネガティブコントロール、右のカラムはａｎｔｉ−ＥＧＦＰ配列の未修飾ｓｉＲＮＡを投与したポジティブコントロール、右から２番目のカラムはａｎｔｉ−ＥＧＦＰ配列のDMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡを投与した結果を、それぞれ示す。

【図7】ｓｉＲＮＡ導入細胞における各タンパク質のウェスタンブロット解析写真を表す。左３図は２１１Ｈ細胞における結果を、右３図はＣＦＰＡＣ１細胞における結果を、それぞれ表す。各上段はＡＢＣＧ２の発現量を、各中段はフェロケラターゼの発現量を、各下段はアクチンの発現量を、それぞれ示す。

【図8】細胞内プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）蓄積量を表すヒストグラムである。上図は２１１Ｈ細胞における結果を、下図はＣＦＰＡＣ１細胞における結果を、それぞれ表す。縦軸は細胞数を、横軸は細胞内ＰｐＩＸ量を、それぞれ示す。両図において、「コントロール（−）ＡＬＡ」は導入試薬（リポフェクトアミン）のみを投与したネガティブコントロールを、「コントロール（＋）ＡＬＡ」は導入試薬とＡＬＡで処理した結果を、「ＡＢＣＧ２」はＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果を、「ＦＥＣＨ」はフェロケラターゼｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果を、「ＡＢＣＧ２＋ＦＥＣＨ」はＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡ及びＦＥＣＨ ｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果を、それぞれ示す。

【図9】５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）による細胞生存率の変化を表す。左図は２１１Ｈ細胞における結果を、右図はＣＦＰＡＣ１細胞における結果を、それぞれ表す。両図において、一番左のカラムは導入試薬（リポフェクトアミン）のみを投与したネガティブコントロール（コントロール（−）ＡＬＡ）を、左から２番目のカラムは導入試薬とＡＬＡで処理した結果（コントロール（＋）ＡＬＡ）を、左から３番目のカラムはＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果（ＡＢＣＧ２）を、左から４番目のカラムはフェロケラターゼｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果（ＦＥＣＨ）を、左から５番目のカラムはＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡ及びフェロケラターゼｓｉＲＮＡの導入とＡＬＡで処理した結果（ＡＢＣＧ２＋ＦＥＣＨ）を、それぞれ示す。

【図10】本発明の分子集合体（ミセル型）の模式図である。

【図11】蛍光顕微鏡写真を表す。上左端の写真は位相差像を、上中央はＦＡＭ修飾ｓｉＲＮＡの光照射前の写真を、上右端はＦＡＭ修飾ｓｉＲＮＡの光照射後の写真を、下左はＡｌｅｘａ５４６修飾ＣＰＰペプチドの光照射前の写真を、下右はＡｌｅｘａ５４６修飾ＣＰＰペプチドの光照射後の写真を、それぞれ示す。

【図12】蛍光顕微鏡写真を表す。左端は位相差像の写真を、中央はＦＡＭ修飾ｓｉＲＮＡの光照射前の写真を、右端はＦＡＭ修飾ｓｉＲＮＡの光照射後の写真を、それぞれ示す。

【図13】蛍光顕微鏡写真を表す。左端は位相差像の写真を、中央はＦＡＭで標識したDMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡの光照射前の写真を、右端はＦＡＭ標識DMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡの光照射後の写真を、それぞれ示す。

【図14】ＣＰＰペプチドの細胞内取り込み率を表す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明の分子集合体は、サルコシン単位を含む親水性ブロックと乳酸単位を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ、修飾ＲＮＡ、細胞膜結合性化合物、及び前記一以上の成分に結合していてもよい光増感剤を含むものである。

【0034】

本発明の分子集合体は、通常、両親媒性ブロックポリマーＡの凝集若しくは自己組織化により、又は自己集合的な配向会合により主として形成される構造体である。該分子集合体の形態は、特に限定されず、ミセル状、ベシクル状などの粒子状、ラメラ構造、ロッド状、その他分子の凝集形態のあらゆるものを含む。通常は、粒子状である。また、本発明の分子集合体の好ましい形態は、ミセルである。

【0035】

１．両親媒性ブロックポリマーＡ
両親媒性ブロックポリマーＡは、サルコシン単位を含む親水性ブロックと乳酸単位を含む疎水性ブロックとが直鎖状に結合した直鎖型でも、乳酸単位を含む一つの疎水性ブロックにサルコシン単位を含む親水性ブロックが３つに分岐結合した分岐型でもよい。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、通常、リンカー部位により連結されている。

【0036】

両親媒性ブロックポリマーＡは公知であり、例えば、特許文献３〜５に製造方法も含めて記載されている。かかる特許文献等に記載された両親媒性ブロックポリマーＡを用いることができる。特許文献３〜５に記載された全内容は参照され、本明細書に組み入れられる。

【0037】

１．１ 親水性ブロック
本発明において、両親媒性ブロックポリマーＡの親水性ブロックが有する「親水性」という物性の程度は特に限定されないが、少なくとも、親水性ブロックの全体が、後述の疎水性ブロックに対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロックが疎水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーＡが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。

【0038】

両親媒性ブロックポリマーＡ中の親水性ブロックは、ポリサルコシン鎖を有する。
サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃ^α炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このような構造を構成ブロックとして用いることは、該ブロックに高い親水性の基本特性、又は、高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つ基本特性が備わる点で非常に有用である。

【0039】

親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように当業者が適宜決定することができる。例えば、親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は、通常、２０〜３００個とすることができる。好ましくは３０〜２００個程度、より好ましくは５０〜１００個程度である。

【0040】

また、サルコシン単位を含む親水性ブロックが３つに分岐し、乳酸単位を含む疎水性ブロックと結合した両親媒性ブロックポリマーＡの場合、１つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、１０〜１００とすることができ、好ましくは２０〜５０程度である。親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数がこのような範囲であると、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡが粒子状の分子集合体を形成することができる。また、親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数がこのような範囲であると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体が安定なものとなる。

【0041】

親水性ブロックは、上述したような親水性を損なわない限り、サルコシン単位以外の構成単位を１種又は２種以上有してもよい。サルコシン以外の構成単位として、例えば、アミノ酸が挙げられる。アミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれでもよい。またアミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸のいずれでもよいが、好ましくはα−アミノ酸であり、例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。

【0042】

サルコシン単位以外の構成単位の割合は、親水性ブロックを構成する全構成単位に対して、通常１０モル％以下であり、好ましくは５モル％以下、より好ましくは２モル％以下、更に好ましくは１モル％以下、最も好ましくは０モル％である。本発明においては、親水性ブロックは、サルコシン単位のみからなることが好ましい。

【0043】

親水性ブロックにおいては、全てのサルコシン単位が連続していてもよく、非連続であってもよいが、両親媒性ブロックポリマーＡ全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。

【0044】

１．２ 疎水性ブロック
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度は特に限定されないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。或いは、両親媒性ブロックポリマーＡが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していればよい。

【0045】

両親媒性ブロックポリマーＡ中の疎水性ブロックは、ポリ乳酸鎖を有する。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から形成される分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内において腫瘍組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとする両親媒性物質から得られる分子集合体は、腫瘍組織への特異的な集積性という点で有用である。

【0046】

また、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、本発明の分子集合体は、生体への安全性という点で有用である。

【0047】

疎水性ブロックに含まれるポリ乳酸鎖は、通常分岐していないもの（直鎖状）である。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数は、通常、１０〜１００個であり、好ましくは２０〜８０個程度、より好ましくは２５〜５０個程度、更に好ましくは２５〜３５個程度である。疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数が上記範囲であると、両親媒性ブロックポリマーＡによって形成される分子集合体が安定なものとなる。

【0048】

疎水性ブロックは、上述したような疎水性を損なわない限り、乳酸単位以外の構成単位を１種又は２種以上を有してもよい。乳酸単位以外の構成単位として、例えば、乳酸以外のヒドロキシル酸、アミノ酸（疎水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）を挙げることができる。ヒドロキシル酸として、例えば、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸が挙げられる。アミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれでもよい。またアミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸のいずれでもよいが、好ましくはα−アミノ酸である。また、アミノ酸は、例えば疎水性アミノ酸が好ましく、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン等が挙げられる。

【0049】

乳酸単位以外の構成単位の割合は、疎水性ブロックを構成する全構成単位に対して、通常１０モル％以下であり、好ましくは５モル％以下、より好ましくは２モル％以下、更に好ましくは１モル％以下、最も好ましくは０モル％である。本発明においては、疎水性ブロックは、乳酸単位のみからなることが好ましい。

【0050】

疎水性ブロックにおいては、全ての乳酸単位が連続していてもよく、非連続であってもよいが、両親媒性ブロックポリマーＡ全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。

【0051】

疎水性ブロックに含まれるポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖であっても、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖であっても、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位の両者から構成されるポリＤＬ−乳酸鎖であってもよい。当業者が目的等に応じて適宜選択することができる。ポリＤＬ−乳酸鎖の場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合の順番は特に限定されない。Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよく、ランダムに重合されていてもよく、ブロック重合されていてもよい。

【0052】

ＲＮＡを修飾するポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーのポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）との立体的相互作用による分子集合体の安定化をより期待する場合には、Ａ−ＰＬＡの立体配置をＲ−ＰＬＡと逆の立体配置にすることができる。即ち、Ｒ−ＰＬＡがＬ−乳酸単位から構成される場合には、Ａ−ＰＬＡはＤ−乳酸単位とし、また、Ｒ−ＰＬＡがＤ−乳酸単位から構成されている場合には、Ａ−ＰＬＡはＬ−乳酸単位とすることができる。

【0053】

ここで、Ｌ−乳酸単位から構成されるポリＬ−乳酸鎖とは、Ａ−ＰＬＡを構成する全乳酸単位を基準として、通常９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％がＬ−乳酸単位であることを意味する。

【0054】

Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖とは、Ａ−ＰＬＡを構成する全乳酸単位を基準として、通常９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％がＤ−乳酸単位であることを意味する。

【0055】

１．３ その他
両親媒性ブロックポリマーＡは、分子中に薬剤等を有さないことが好ましいが、本発明の効果を損なわない限り、薬剤等を有することもできる。かかる薬剤等は特に限定されないが、例えば、後述する光増感剤が挙げられる。

【0056】

２．修飾ＲＮＡ
本発明の分子集合体は、長鎖疎水性基を有する化合物により修飾されているＲＮＡを含む。
上記化合物は、長鎖疎水性基を有していれば、それ以外に長鎖親水性基などを有していてもよい。長鎖疎水性基としては、例えば、ポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）、ジヘキシルジスルフィドのように、ジスルフィド結合を間に介する炭素数１０〜１６（好ましくは炭素数１２）の直鎖状炭化水素（好ましくは直鎖状飽和炭化水素）を有する基（例、ジメトキシトリチルオキシ−ヘキシルジチオヘキシル（ＤＭＴ−Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６基）を挙げることができ、長鎖親水性基をも有するものとしては、例えばポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）を挙げることができる。
ポリ乳酸鎖、ＤＭＴ−Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６基などの長鎖疎水性基は疎水性を示し、通常、分子集合体の疎水コア部に位置し、ポリサルコシン鎖などの長鎖親水性基やＲＮＡは親水性を示し、親水シェル部に位置する。これによって、当該修飾ＲＮＡは、本発明の分子集合体に安定に包含される。当該修飾ＲＮＡも本発明に含まれる。

【0057】

２．１ ＲＮＡ
ＲＮＡとしては、遺伝子発現抑制効果等の機能を有していれば特に限定されないが、細胞質内のｍＲＮＡに作用しその機能を阻害することができる機能性ＲＮＡが好ましい。このようなＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、リボザイムを挙げることができる。これらを１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0058】

ｓｉＲＮＡの例として、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇ２（ＡＢＣＧ２）遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡ、具体的には、例えば、配列番号１０で表されるセンス鎖と配列番号１１で表されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（ＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡ）、フェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡ、具体的には、例えば、配列番号１２で表されるセンス鎖と配列番号１３で表されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（Ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ ｓｉＲＮＡ）を挙げることができる。これらｓｉＲＮＡは、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の減少を阻止することができるものである。ＰｐＩＸは、例えば、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の投与により、ヘム合成経路の代謝物として癌細胞に選択的に蓄積し、これに光を照射すると活性酸素種が生成され、それによって癌細胞が死滅する。それ故、ＡＬＡを用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）では、癌細胞内におけるＰｐＩＸの蓄積が重要となる。一方、ＡＢＣＧ２はＰｐＩＸを能動的に細胞外へ排出するトランスポーターであり、フェロケラターゼはＰｐＩＸに二価鉄を挿入してヘムに変換するため、細胞内のＰｐＩＸを抑制的に作用する酵素である。従って、これらＡＢＣＧ２やフェロケラターゼの発現ないし活性を抑制阻害するｓｉＲＮＡは、癌細胞に蓄積したＰｐＩＸの減少を効果的に阻止することができることから、ＡＬＡを用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）による癌治療薬となり得る。
また、本発明においては、ＡＢＣＧ２遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びフェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡの２つのｓｉＲＮＡを任意の割合（例えば、１：１）で併用することが好ましい。

【0059】

ＲＮＡは、通常、ポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）に結合している。ＲＮＡは、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒの末端構成単位に結合していてもよく、末端以外の構成単位に結合していてもよいが、末端構成単位に結合していることが好ましい。また、ＲＮＡがＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒに結合している場合は、サルコシン構成単位の末端に結合していることが好ましい。
ＲＮＡとＲ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒとは、マレイミド基などの反応性基を介して直接結合していてもよいが、反応性基に加え通常は適当なリンカーを介して結合される。このようなリンカーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリペプチド、脂肪族ポリエステル、多糖類を挙げることができる。ポリペプチドの具体例としては、ポリグリシン、ポリβアラニンを挙げることができ、脂肪族ポリエステルの具体例としては、ポリカプロラクトン、ポリグルコール酸を挙げることができる。

【0060】

ＲＮＡの結合部位は、特に限定されないが、３’末端又は５’末端が適当である。この中、３’末端が好ましい。ｓｉＲＮＡのような二本鎖ＲＮＡの場合には、センス鎖とＲ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ・Ｓａｒとが結合することが好ましく、センス鎖の３’末端とＲ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ・Ｓａｒの末端とが結合することがより好ましい。Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒの場合には、センス鎖の３’末端とＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのサルコシン構成単位の末端とが結合することがより好ましい。

【0061】

２．２ 長鎖疎水性基を有する化合物
本発明に係るＲＮＡは、長鎖疎水性基を有する化合物により修飾されている。かかる化合物として、具体的には、例えば、ポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）などを有する高分子や、ジメトキシトリチルオキシ−ヘキシルジチオヘキサンを挙げることができる。
上記の中、ポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）のポリ乳酸鎖は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖であっても、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖であっても、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位の両者から構成されるポリＤＬ−乳酸鎖であってもよい。当業者が目的等に応じて適宜選択することができる。ポリＤＬ−乳酸鎖の場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合の順番は特に限定されない。Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよく、ランダムに重合されていてもよく、ブロック重合されていてもよい。

【0062】

前述した両親媒性ブロックポリマーＡとの立体的相互作用による分子集合体の安定化をより期待する場合には、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのポリ乳酸鎖の立体配置を両親媒性ブロックポリマーＡのポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と逆の立体配置にすることができる。即ち、Ａ−ＰＬＡがＬ−乳酸単位から構成される場合には、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのポリ乳酸鎖はＤ−乳酸単位とし、また、Ａ−ＰＬＡがＤ−乳酸単位から構成されている場合には、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのポリ乳酸鎖はＬ−乳酸単位とすることができる。

【0063】

ここで、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖とは、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのポリ乳酸鎖を構成する全乳酸単位を基準として、通常９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％がＤ−乳酸単位であることを意味する。

【0064】

また、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖とは、Ｒ−ＰＬＡ又はＲ−ＰＬＡ−Ｓａｒのポリ乳酸鎖を構成する全乳酸単位を基準として、通常９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％がＬ−乳酸単位であることを意味する。

【0065】

ＲＮＡを修飾するポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）及びポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）のポリ乳酸鎖の乳酸単位数は、いずれも通常１０〜６０個、好ましくは２５〜４５個程度、より好ましくは２５〜３５個程度である。また、修飾ＲＮＡ中のポリ乳酸鎖を構成する乳酸単位数は、両親媒性ブロックポリマーＡ中の疎水性ブロックを構成する乳酸単位数に対して、０．８〜１．２倍程度とすることが好ましく、０．９〜１．１倍程度とすることがより好ましく、０．９５〜１．０４倍程度とすることが更に好ましい。

【0066】

ＲＮＡを修飾するポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）のポリサルコシン鎖のサルコシン単位数は、通常０〜１００個（０の場合は、乳酸単位のみからなる）、好ましくは２０〜８０個程度、より好ましくは４０〜６０個程度である。また、修飾ＲＮＡ中のポリサルコシン鎖を構成するサルコシン単位数は、両親媒性ブロックポリマーＡ中の親水性ブロックを構成するサルコシン単位数（但し、３分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの場合は、その１／３単位数）に対して、０〜１．０倍程度とすることが好ましく、０．２〜０．８倍程度とすることがより好ましく、０．４〜０．６倍程度とすることが更に好ましい。

【0067】

この範囲内で、ＲＮＡを修飾するポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックの長さを超えないように分子設計することが好ましい。また、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーＡの長さを超えないように分子設計することが好ましい。

【0068】

ＲＮＡを修飾するポリ乳酸鎖（Ｒ−ＰＬＡ）及びポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖（Ｒ−ＰＬＡ−Ｓａｒ）は、乳酸単位及びサルコシン単位以外の構成単位を１種又は２種以上を有してもよい。そのような構成単位として、例えば、乳酸以外のヒドロキシル酸、アミノ酸を挙げることができる。ヒドロキシル酸として、例えば、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸が挙げられる。アミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれでもよい。またアミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸のいずれでもよいが、好ましくはα−アミノ酸である。

【0069】

乳酸・サルコシン単位以外の構成単位の割合は、ポリマーを構成する全構成単位に対して、通常１０モル％以下であり、好ましくは５モル％以下、より好ましくは２モル％以下、更に好ましくは１モル％以下、最も好ましくは０モル％である。本発明においては、乳酸単位又は乳酸単位とサルコシン単位のみからなることが好ましい。

【0070】

ポリ乳酸鎖、ポリサルコシン鎖においては、全ての乳酸単位又はサルコシン単位が連続していてもよく、非連続であってもよいが、いずれも連続していることが好ましい。

【0071】

２．３ 長鎖疎水性基を有する化合物鎖の合成法
ＲＮＡを修飾する、長鎖疎水性基を有する化合物の合成方法は特に限定されない。市販試薬から常法により合成することができる。
また、当該化合物の中、ポリ乳酸やポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーについては、両親媒性ブロックポリマーＡに関する合成方法に準じて合成することができる。具体的には、例えば、下記の製法を挙げることができる。

【0072】

ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖のポリサルコシン鎖の合成は、公知のペプチド合成法により行うことができる。例えば、アミンなどの塩基を開始剤として、サルコシン単位を形成できる単量体（以下、サルコシン単量体ともいう）を重合することによって行うことができる。サルコシン単量体として、例えば、サルコシン、Ｎ−カルボキシサルコシン無水物（サルコシン−ＮＣＡ）が挙げられ、好ましくはＮ−カルボキシサルコシン無水物である。アミンなどの塩基を開始剤として、Ｎ−カルボキシサルコシン無水物を開環重合すること等によって行うことが好ましい。

【0073】

ポリ乳酸鎖、及びポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖のポリ乳酸鎖の合成は、例えば、公知のポリエステル合成法により行うことができる。例えば、アミンなどの塩基を開始剤として、乳酸単位を形成できる単量体（以下、乳酸単量体ともいう）を重合することによって行うことができる。乳酸単量体として、例えば、乳酸、ラクチドが挙げられ、好ましくはラクチドである。アミンなどの塩基を開始剤として、ラクチドを開環重合すること等によって行うことが好ましい。ラクチドは、ポリ乳酸鎖の所望の立体化学（光学純度）を考慮して当業者が適宜決定することができる。例えば、Ｌ−ラクチド、又はＤ−ラクチドから適宜選択し、ポリ乳酸鎖の所望の立体化学（光学純度）に応じて当業者が適宜使用量を決定することができる。

【0074】

ポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の鎖長の調整は、重合反応における開始剤及び各単量体の仕込み比を調整することによって行うことができる。また、鎖長は、例えば^１Ｈ ＮＭＲによって確認することができる。

【0075】

ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖の合成は、例えば、ポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とを連結させるリンカー試薬を合成し、それを開始剤として、サルコシン単位体の付加又はサルコシン単量体の重合反応によるポリサルコシン鎖の伸長、及び乳酸単量体の重合反応によるポリ乳酸鎖の伸長を行うことによって行うことができる。

【0076】

また例えば、サルコシン単量体をリンカー試薬に付加させた後に、又は、ポリサルコシン鎖を予め重合反応により調製し、リンカー試薬に付加させた後に、該サルコシン又はポリサルコシン鎖が付加したリンカー試薬に乳酸単量体を重合反応させてポリ乳酸鎖を伸長させることにより、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖を合成することができる。

【0077】

さらに別の態様においては、例えば、ポリサルコシン鎖、又はポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の両方を予め用意しておき、別途合成されたリンカー試薬を用いてそれらブロックを連結させることにより、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー鎖を合成することができる。

【0078】

リンカー試薬は、乳酸単量体又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）を１個有し、且つ、サルコシン単量体又はポリサルコシンと結合可能な官能基（例えば、アミノ基）を１個有する化合物であればよく、特に限定されるものではない。

【0079】

乳酸単量体又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基と、サルコシン単量体又はポリサルコシンと結合可能な官能基とは、必要に応じて、それぞれ保護基によって保護されていてもよい。この場合、それぞれの保護基としては、必要に応じて選択的に脱離させることが可能なものが当業者によって適宜選択される。

【0080】

２．４ その他
当該修飾ＲＮＡは、本発明の効果を損なわない限り、例えば、その分子内に後述する光増感剤を有することができる。かかる光増感剤は、ＲＮＡ上に結合していてもよく、ＲＮＡを修飾する化合物上に結合していてもよい。

【0081】

本発明の分子集合体における修飾ＲＮＡの含有量は、用いるＲＮＡの種類や、両親媒性ブロックポリマーＡ、ＲＮＡを修飾する化合物、細胞膜結合性化合物、光増感剤の種類や量等によって異なり適宜選択すればよいが、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡを基準（１００モル％）として、通常、１〜２０モル％の範囲内であり、好ましくは３〜１５モル％、より好ましくは５〜１０モル％である。

【0082】

２．５ 修飾ＲＮＡの調製法
当該修飾ＲＮＡの調製（製造）方法、即ち、ＲＮＡに長鎖疎水性基を有する化合物を修飾する方法は特に限定されない。ＲＮＡの種類等に応じて、適宜常法により調製することができる。

【0083】

例えば、ＲＮＡの末端とポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーの末端とを結合して、当該修飾ＲＮＡを調製する場合、ＲＮＡの末端にチオール基を導入し、一方、ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーの末端にマレイミド基を導入して、当該チオール基とマレイミド基との付加反応により、当該修飾ＲＮＡを調製することができる。具体的には、例えば、ｓｉＲＮＡについて、次のように調製することができる。

【0084】

ｓｉＲＮＡのセンス鎖３’末端とチオール化合物とを反応させ、３’末端の核酸塩基がチオール化されたセンスＲＮＡを合成する。かかるセンスＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡとを常法によりアニーリングし、センス鎖３’末端にチオール基を有するｓｉＲＮＡを調製する。一方、ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーとマレイミド試薬とを反応させ、末端にマレイミド基を有するポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーを調製する。このようにして得られた、センス鎖３’末端にチオール基を有するｓｉＲＮＡと末端にマレイミド基を有するポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーとを常法により付加反応させることにより、当該修飾ＲＮＡを調製することができる。

【0085】

上記チオール化合物としては、ＲＮＡの末端にチオール基を導入することができるものであれば特に限定されないが、例えば、核酸塩基にチオール基を持つヌクレオチド、核酸塩基にアミノ基を持つヌクレオチド、核酸塩基にカルボキシル基を持つヌクレオチドを挙げることができ、具体的には、例えば、６−チオグアノシン、６−アミノグアノシン、６−カルボキシルグアノシンなどを含むヌクレオチドを挙げることができる。

【0086】

上記マレイミド試薬としては、ポリ乳酸又はポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーの末端にマレイミド基を導入できるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド（ＧＭＢＳ）ナトリウム塩 (ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ)、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド（ＧＭＢＳ）ナトリウム塩 (ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ)を挙げることができる。

【0087】

溶媒、反応温度、反応時間などは、ＲＮＡの種類や各種試薬の種類等に応じて、適宜設定することができる。
ｓｉＲＮＡ以外の当該修飾ＲＮＡについても、上記修飾ｓｉＲＮＡの合成方法に準じて、合成することができる。

【0088】

３．細胞膜結合性化合物
本発明の分子集合体は、細胞膜結合性化合物を含む。本発明の分子集合体がミセル等の粒子状の場合、かかる細胞膜結合性化合物は、その粒子の外側に一部でも突出する鎖長を有するものが好ましい。

【0089】

３．１ 細胞膜結合性化合物
本発明に係る「細胞膜結合性化合物」は、細胞膜に結合し、場合によっては自身を細胞内に取り込ませる働きを有するものである。細胞膜結合性化合物は、通常、ペプチド、糖鎖、抗体である。その代表例として、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を挙げることができる。ＣＰＰは、アルギニンなどの塩基性アミノ酸（カチオン性アミノ酸）に富んだペプチドであったり、塩基性でかつ疎水性アミノ酸を含む両親媒性ペプチドであったり、またほとんどが疎水性アミノ酸で若干の塩基性アミノ酸を含むペプチドである場合もある。

【0090】

ＣＰＰは、一般的には、主に細胞のエンドサイトーシス経路を経て細胞内に取り込まれると考えられている。膜透過性ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ：ＰＴＤ）と称されることもある。

【0091】

本発明においては、細胞膜に結合しうる機能を有する化合物であれば特に限定されないが、ＣＰＰが好ましい。かかるＣＰＰも特に限定されない。野生型のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、細胞内に侵入する能力を有する範囲で、野生型のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加を施した変異型のアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、両親媒性のＣＰＰ又は疎水性のＣＰＰが好ましい。これらは両親媒性ブロックポリマーＡと共に分子集合体を形成しやすいからである。

【0092】

ＣＰＰの具体例としては、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）に由来する融合タンパク質ｇｐ４１に含まれる、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＭＰＧペプチド、ＨＩＶ−１に由来するＴｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔａｔタンパク質）に含まれる、配列番号２で示されるポリペプチド、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）に由来する配列番号３で示されるポリペプチド、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＴＰ５１２（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＰｅｐペプチド、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＤＰＶ３ペプチド、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＰＴＤ４ペプチド、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＰｅｐ１ペプチド、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＥＢ１ペプチド、Ｒｅｖペプチド、ネコヘルペスウイルスＣｏａｔタンパク質由来ペプチド、ポリアルギニン、ＣＡＤＹペプチドを挙げることができる。この中、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＭＰＧペプチドが好ましい。これらを１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0093】

配列番号１：ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号２：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ
配列番号３：ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ
配列番号４：ＹＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＲ
配列番号５：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥ
配列番号１４：ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳＣ
配列番号１５：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＣ
配列番号１６：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶＣ
配列番号１７：ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫＣ

【0094】

ＭＰＧペプチドは両親媒性ペプチドであるが、両親媒性ペプチドでないＰｅｐペプチド等であっても、例えば、ＷＳＱアミノ酸配列（リンカー）を介して疎水性配列を有することにより、両親媒性ペプチドとすることができる。

【0095】

３．２ 細胞膜結合性化合物の含有量、その他
本発明の分子集合体における細胞膜結合性化合物の含有量は、用いる細胞膜結合性化合物の種類や、両親媒性ブロックポリマーＡ、修飾ＲＮＡ、光増感剤の種類や量等によって異なり適宜選択すればよいが、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡを基準（１００モル％）として、通常、１〜５０モル％の範囲内であり、好ましくは５〜２５モル％、より好ましくは１０〜２０モル％である。

【0096】

本発明に係る細胞膜結合性化合物は、本発明の効果を損なわない限り、その分子内に後述する光増感剤を有することができ、また光増感剤を有することが好ましい。

【0097】

４．光増感剤
本発明の分子集合体は、光増感剤を含む。
４．１ 光増感剤
本発明に係る「光増感剤」は、例えば、光（近赤外光やそれに近い波長の光）を照射することにより、細胞内に取り込まれエンドソームに局在化していた分子集合体を細胞質中に拡散させることができる機能を有するものである。かかる拡散メカニズムは、光の照射により励起された光増感剤が一重項酸素を発生させ、これがエンドソーム膜を不安定化させる（破壊する）ためであると推測される。

【0098】

励起光の波長としては、例えば、４５０〜１３００ｎｍの波長領域を挙げることができる。好ましくは５００〜１２００ｎｍ、より好ましくは７００〜１０００ｎｍの近赤外光の波長領域である。極大励起波長がこれらの領域にある光増感剤を用いることができる。この中、近赤外光は、生体中のヘモグロビンや水による吸収を回避して、生体組織を透過しやすい特性を有する。

【0099】

本発明に係る光増感剤は、上記機能を有し、上記波長領域において極大励起波長を有するものであれば特に限定されない。このような光増感剤は、様々なものが知られており、また市販されており、適当な市販品を用いることができる。例えば、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素等のシアニン系色素、ローダミン系色素、ポルフィリン系色素、量子ドットが挙げられる。具体的には、例えば、ＤＹ７５０（ＤＹＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨ社製）、ＤＹ７５１（ＤＹＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨ社製）、ＤＹ７８０（ＤＹＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）、ローズベンガル（Ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ）、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）等のインドシアニン系色素、Ｃｙ（登録商標）７、ＤＹ７７６、Ａｌｅｘａ ＦＬｕｏｒ（登録商標）７９０、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を挙げることができる。この中、ＤＹ７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＤＹ７５１、ＤＹ７８０、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）、ローズベンガル（Ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌ）、ポルフィリン系色素が好ましい。

【0100】

４．２ 光増感剤と細胞膜結合性化合物との結合
本発明に係る光増感剤は、単独でも本発明の分子集合体中に存在しうるが、一般に水溶性の光増感剤が多いことから、分子集合体に有効に包含させるためにも、前述の通り、本発明の分子集合体を構成する他の一以上の成分の分子内に存在することが好ましい。中でも、細胞膜結合性化合物の分子内に存在させることが好ましい。細胞膜結合性化合物（ＣＰＰ等）の分子内に存在させることにより、細胞膜結合性化合物による細胞膜への結合と、光増感剤による細胞質中への拡散とが相乗的に発揮されることが期待される。

【0101】

細胞膜結合性化合物と光増感剤との結合は、常法により行うことができる。例えば、細胞膜結合性化合物がＣＰＰペプチドの場合、ＣＰＰ中唯一のシステインをＮ末端付近又はＣ末端付近に配置しておき、一方、光増感剤には当該システインのチオール基と選択的に反応する（ＣＰＰの他のアミノ酸残基とは反応しない）マレイミド基を導入しておき、これらチオール・マレイミド間の結合反応を介して行うことができる。マレイミド基導入のためのマレイミド試薬としては、修飾ＲＮＡの調製に用いられる前記マレイミド試薬と同様のものを挙げることができる。

【0102】

また、市販の「マレイミド基の付いた光増感剤」を用いて、同様にＣＰＰと結合することもできる。例えば、マレイミド基の付いた光増感剤と末端１箇所にシステインを含むＣＰＰとを混ぜ合わせたのちに、ゲル濾過スピンカラムなどで未反応の光増感剤を除去することにより、光増感剤とＣＰＰとを結合させることができる。

【0103】

４．３ 光増感剤の含有量
本発明の分子集合体における光増感剤の含有量は、用いる光増感剤の種類や、両親媒性ブロックポリマーＡ、修飾ＲＮＡ、細胞膜結合性化合物の種類や量、他の成分との結合有無等によって異なり適宜選択すればよいが、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡを基準（１００モル％）として、通常、１〜２０モル％の範囲内であり、好ましくは１〜１０モル％、より好ましくは１〜５モル％である。

【0104】

５．分子集合体
５．１ 分子集合体
本発明の分子集合体は、両親媒性ブロックポリマーＡの凝集により、或いは自己集合的な配向により構成される構造体である。本発明では、内側（コア部）が疎水性ブロック、外側（シェル部）が親水性ブロックとなるように構成されたミセル形状の分子集合体（ポリ乳酸系両親媒性ポリマーミセル）を用いることが好ましい。また、細胞膜結合性化合物の一部が外側に突出しているミセル形状の分子集合体が好ましい。

【0105】

５．２ 粒子径
本発明の分子集合体の粒子径は、使用する両親媒性ブロックポリマーＡ、修飾ＲＮＡ、細胞膜結合性化合物、及び光増感剤の種類、割合等により適宜調整することができるが、例えば、１０〜１００ｎｍとすることができる。好ましくは１０〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍである。
ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。

【0106】

例えば、好ましいＥＰＲ効果を得るためには、分子集合体の粒子径を３０ｎｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは３０ｎｍ未満とする。

【0107】

本発明の分子集合体の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）による観察法や、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）法等により測定することができる。

【0108】

５．３ 分子集合体の作製
本発明の分子集合体の作製方法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる機能性構造の種類、性質、含有量等に応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、通常、電子顕微鏡観察によって行うことができる。

【0109】

５．３．１ フィルム法
本発明における両親媒性ブロックポリマーＡは低沸点溶媒への溶解性を有するため、例えば、いわゆるフィルム法を用いて本発明の分子集合体を調製することができる。

【0110】

フィルム法は、例えば、次の工程を含む。
ガラスビーズが入っていてもよい容器中に、両親媒性ブロックポリマーＡや修飾ＲＮＡ等の分子集合体構成成分を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程（以下、「工程（ａ１）」ともいう）、
上記溶液から上記有機溶媒を除去し、上記容器の内壁に上記両親媒性ブロックポリマーＡ等を含むフィルムを得る工程（以下、「工程（ａ２）」ともいう）、及び
上記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、上記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程（以下、「工程（ａ３）」ともいう）
工程（ａ１）〜工程（ａ３）は、通常この順に行われる。上記工程（ａ１）〜工程（ａ３）を含む調製方法は、本発明の分子集合体の調製方法として好適に用いられる。

【0111】

さらに、フィルム法は、分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。

【0112】

工程（ａ１）で用いられる容器は特に限定されず、例えば、ガラス容器等を用いることができる。容器の形状等も特に限定されない。
両親媒性ブロックポリマーＡ等を有機溶媒中に含む溶液の調製方法は特に限定されず、有機溶媒に両親媒性ブロックポリマーＡ等を混合することによって調製してもよく、両親媒性ブロックポリマーＡをあらかじめフィルムの状態でストックしておき、分子集合体を調製する際に、その他の構成成分を含む溶液を加えて該フィルムを溶解することによって調製してもよい。

【0113】

有機溶媒中の両親媒性ブロックポリマーＡの濃度は、その種類や他の成分の種類等によって異なるが、例えば、１０％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、１％（ｗ／ｖ）以下とすることがより好ましい。当該濃度の下限は、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）とすることが好ましい。

【0114】

本発明に係る修飾ＲＮＡの有機溶媒中の濃度は、例えば、５％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、２．５％（ｗ／ｖ）以下とすることがより好ましい。当該濃度の下限は、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）とすることが好ましい。また、当該濃度が、両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、好ましくは１０モル％以下、より好ましくは５モル％以下、さらに好ましくは２モル％以下、特に好ましくは１モル％以下となるようにすることが好ましい。

【0115】

細胞膜結合性化合物ないし光増感剤が結合した細胞膜結合性化合物の有機溶媒中の濃度は、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）以下とすることがより好ましい。当該濃度の下限は、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）とすることが好ましい。また、当該濃度が、両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、好ましくは１モル％以下、より好ましくは０．５モル％以下、さらに好ましくは０．２モル％以下、特に好ましくは０．１モル％以下となるようにすることが好ましい。

【0116】

光増感剤の有機溶媒中の濃度は、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）以下とすることがより好ましい。当該濃度の下限は、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）とすることが好ましい。また、当該濃度が、両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、好ましくは１モル％以下、より好ましくは０．５モル％以下、さらに好ましくは０．２モル％以下、特に好ましくは０．１モル％以下となるようにすることが好ましい。

【0117】

フィルム法に用いる有機溶媒としては、上述した低沸点溶媒を用いることが好ましい。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等が挙げられる。また、このような溶媒を２種以上混合した混合溶媒を用いてもよい。このような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。

【0118】

工程（ａ２）における溶媒の除去の方法としては特に限定されず、使用する有機溶媒の沸点等に応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去、自然乾燥による溶媒除去等により除去することができる。

【0119】

有機溶媒が除去された後は、容器内壁に両親媒性ブロックポリマーＡ等を含むフィルムが形成される。工程（ａ３）において、このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されず、例えば、分子集合体の用途に応じて適宜選択することができる。生化学的ないし薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。このような水又は水溶液として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。水又は水溶液の添加量は、例えば、工程（ａ１）で使用した両親媒性ブロックポリマーＡに対して、質量比で通常１０〜１０００、好ましくは１０〜１００である。

【0120】

水又は水溶液が加えられた後、超音波処理又は加温処理を行う。通常、超音波又は加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体が形成される。加温処理は、例えば７０℃〜１００℃、５分間〜６０分間の条件下で行うことができる。超音波処理は、例えば、室温〜１００℃で２〜６０分程度行うことが好ましい。超音波処理又は加温処理終了時には、分子集合体が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。また、工程（ａ３）におけるフィルムの剥離の際、超音波処理及び加温処理を併せて行ってもよい。

【0121】

５．３．２ インジェクション法
本発明の分子集合体は、いわゆるインジェクション法により調製することもできる。インジェクション法は、以下の工程を含むことが好ましい。
容器中に、両親媒性ブロックポリマーＡや修飾ＲＮＡ等の分子集合体構成成分を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程（以下、「工程（ｂ１）」ともいう）、
上記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程（以下、「工程（ｂ２）」ともいう）、及び
上記有機溶媒を除去する工程（以下、「工程（ｂ３）」ともいう）。
上記工程（ｂ１）〜（ｂ３）は、通常この順に行われる。

【0122】

上記工程（ｂ１）〜工程（ｂ３）を含む調製方法は、本発明の分子集合体の調製方法として好適に用いられる。

【0123】

上記工程を含む調製方法により調製される分子集合体は、本発明の好ましい実施態様の１つである。インジェクション法においては、さらに、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。

【0124】

インジェクション法に用いられる容器は特に限定されず、例えば、試験管等を用いることができる。工程（ｂ１）において用いられる有機溶媒としては、例えばトリフルオシド、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。両親媒性ブロックポリマーＡ等を有機溶媒中に含む溶液の調製方法は特に限定されず、上述したフィルム法における溶液の調製方法と同様の方法を採用することができる。

【0125】

工程（ｂ２）における水又は水溶液としては特に限定されず、例えば、精製水、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。水又は水溶液は、両親媒性ブロックポリマーＡ等を有機溶媒中に含む溶液に対して、通常、５〜１００倍（体積比）使用する。両親媒性ブロックポリマーＡ等を有機溶媒中に含む溶液を、水又は水溶液中に分散させる方法は特に限定されず、例えば、ミキサー等により行うことができる。

【0126】

工程（ｂ３）においては、両親媒性ブロックポリマーＡ等を含む有機溶媒が分散している水又は水溶液から、該有機溶媒を除去する。工程（ｂ３）において有機溶媒を除去する方法は特に限定されず、上述した方法等により行うことができる。
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心等の処理が挙げられる。これらを組み合わせて行うこともできる。

【0127】

フィルム法、インジェクション法等の方法により得られた分子集合体の分散液は、直接生体に投与することができるものである。また、分散液の状態で用時まで保存することもできる。
また、得られた分散液を凍結乾燥処理してもよい。凍結乾燥処理の方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、上記のようにして得られた分子集合体の分散液を液体窒素等によって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、分子集合体を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、分子集合体の分散液を得ることによって、分子集合体を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されず、例えば、分子集合体の用途に応じて適宜選択することができる。生化学的ないし薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。このような水又は水溶液として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。

【0128】

６．腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達システム
本発明は、本発明の分子集合体を用いた、腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達システムも包含する。

【0129】

６．１ 分子集合体の投与対象
本発明のＲＮＡ送達システムは、通常、上記分子集合体を動物（生体）内に投与することを含む。分子集合体を投与することができる動物は特に限定されないが、例えば、ヒト又は非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、具体的には例えば、霊長類、齧歯類（マウス、ラット等）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマ等が挙げられる。

【0130】

上記分子集合体は、悪性腫瘍部位等への特異的集積性に優れるものである。本発明の分子集合体は、ＥＰＲ （Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ） 効果により悪性腫瘍部位の組織へ集積するため、その集積性は悪性腫瘍部位の組織の種類によらない。本発明の分子集合体の投与対象として、悪性腫瘍部位を有する動物又は悪性腫瘍部位を有する可能性がある動物が好適である。
本発明の分子集合体を投与する標的となりうる腫瘍は特に限定されず、例えば、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がん等の固形癌が挙げられる。

【0131】

６．２ 投与
動物（生体内）への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。投与の方法としては、全身投与又は局所投与のいずれでもよい。分子集合体の投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与経路は、予防又は治療に効果的な経路を選択することが好ましい。例えば、全身的に投与する場合は、経口投与の他、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等の非経口投与により投与される。局所的に投与する場合は、例えば、皮膚、粘膜、肺、気管支、鼻腔、鼻粘膜、眼等に投与される。好ましくは、非経口投与、より好ましくは静脈内注射により投与される。

【0132】

本発明の分子集合体の投与量は特に限定されず、分子集合体が有するＲＮＡの種類、標的部位等に応じて適宜選択することができる。

【0133】

６．３ 腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達
本発明の分子集合体を生体内に投与後、当該分子集合体が標的部位（腫瘍患部）に到達した適当な時期に、例えば、当該分子集合体に内包されている光増感剤が励起する波長の光を患部組織に適当な時間、適当なエネルギーを照射することにより、修飾ＲＮＡを腫瘍細胞質内へ拡散送達することができる。修飾ＲＮＡが腫瘍細胞質内に送達されることにより、当該ＲＮＡがｍＲＮＡ等に作用し、その機能（遺伝子発現抑制機能）が発揮され、患部組織の腫瘍細胞を死滅させることができる。
修飾ＲＮＡのＲＮＡが、ＡＢＣＧ２遺伝子をノックダウンし、その発現を抑制するｓｉＲＮＡや、フェロケラターゼ遺伝子をノックダウンし、その活性を阻害するｓｉＲＮＡ、あるいはその両者併用物である場合、ＡＬＡを用いた光線力学的療法（ＡＬＡ−ＰＤＴ）において、当該ｓｉＲＮＡの作用により癌細胞に蓄積したＰｐＩＸの減少が阻止され、ＰｐＩＸへの光照射で発生した活性酸素種により、効果的に腫瘍細胞を死滅させることができる。

【0134】

修飾ＲＮＡの細胞質内への移行は、次のようなメカニズムによると考えられる。生体内に投与された分子集合体は、エンドサイトーシスによりエンドソーム内に取り込まれ、光刺激により分子集合体中の光増感剤が機能を発揮し、エンドソーム膜と分子集合体（ミセル構造）が破壊され、修飾ＲＮＡ等が細胞質内へ移行すると考えられる（図１参照）。

【0135】

光の照射時間は、光増感剤の種類や含有量、波長、腫瘍の種類や状態、位置などにより異なるが、通常、１秒〜６００秒である。好ましくは１秒〜１００秒、より好ましくは１秒〜６０秒である。これらの時間内に、通常１〜３００Ｊ／ｃｍ２のエネルギーを患部に与えられればよい。

【0136】

７．癌の予防剤・治療剤、癌の予防・治療システム、癌の予防方法・治療方法
本発明の分子集合体は、機能性ＲＮＡを有し、腫瘍組織の細胞質内へ有効に移行することから、癌の予防又は治療に用いられる医薬（ミセル製剤）として有用である。

【0137】

本発明の予防剤又は治療剤は、本発明の効果を損なわない限り、医薬分野で通常使用される担体等を含む医薬組成物であってもよい。このような医薬組成物は、例えば、分子集合体及び担体を混合等して、公知の製剤の製造方法により製造することができる。医薬組成物の剤形は特に限定されず、非経口投与のための製剤として、例えば、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、リニメント剤、座薬、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤が挙げられる。経口投与のための製剤としては、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤が挙げられる。好ましくは、非経口投与のための製剤であり、中でも、注射剤が好ましい。例えば上述した分子集合体の分散液は、そのまま注射剤として使用することができるものである。

【0138】

本発明として、上記予防剤又は治療剤、及びそれに含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための光を照射する手段を備えた装置を含む、癌の予防又は治療システムも挙げることができる。
本発明の予防剤又は治療剤に含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための励起光を照射する手段としては、例えば、光線力学治療（ＰＤＴ）用の光源装置（例えば、パナソニック ヘルスケア株式会社製ＰＤＴ半導体レーザー）などの医療用半導体レーザー装置（例えば、オリンパス社製ＵＤＬ−１５）を挙げることができる。具体的には、例えば、ダイレーザー、エキシマレーザーなどを励起光とした色素レーザー、パルス波エキシマダイレーザー、波長可変レーザー、半導体レーザーを挙げることができる。また、ハロゲンランプ、キセノンランプ、蛍光ランプ、ＬＥＤなどを内蔵した光源装置も挙げることができる。
本発明に係る癌の予防又は治療システムにおいては、例えば、腫瘍の位置を解析する手段や光源の照射位置を腫瘍に合わせる手段を含んでいてもよい。具体的には、赤外線観察カメラシステム（浜松ホトニクス社製 ＰＤＥ−ＮＥＯ Ｃ１０９３５−２０）などを挙げることができる。

【0139】

上記予防剤又は治療剤は生体内に投与することができ、また投与後、例えば、投与した光増感剤の励起光を適当な時間照射することにより、癌を予防又は治療することができる。投与することができる動物、標的となる癌（腫瘍）、光の照射時間などは前記と同じである。癌の予防又は治療には、癌の細胞の増殖阻止、転移阻止なども含まれる。本発明は、上記予防剤又は治療剤を生体内に投与すること、及び投与した予防剤又は治療剤に含まれる分子集合体中の光増感剤を励起させるための光を照射することを含む、癌の予防方法又は治療方法も包含する。

【実施例】

【0140】

以下に本発明をより詳細に説明するために実施例、試験例等を示すが、本発明はこれら実施例等に何ら限定されるものではない。

【0141】

［合成例１：ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー修飾ＲＮＡの合成］
本発明に係るポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー修飾ＲＮＡとして、ＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−ｓｉＲＮＡ（平均鎖長３０ｍｅｒのポリ乳酸と平均鎖長５６ｍｅｒのポリサルコシンの連なったブロックコポリマーに、ｓｉＲＮＡのつながったもの）の合成を行った（図２参照）。

【0142】

（１）マレイミド基が結合したポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーの作製
ポリサルコシン鎖側の末端にマレイミド基を持つポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー（ＰＬＬＡ−ＰＳ−マレイミド）を次の方法により作製した。
ＮＨ−ＰＳ５６−ＰＬＬＡ３０ １００ｍｇを乾燥したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した後、Ｎ−ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｏｎａｔｅ ２１．３ｍｇ（５当量）およびＤｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ５．４５μＬ（２当量）加え、室温で７時間撹拌した。ＤＭＦを留去した後、得られた白色沈殿を酢酸エチルで３回洗浄し、ＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−マレイミドを得た（収量：５９．１ｍｇ）。

【0143】

【化1】

【0144】

（２）ＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−ｓｉＲＮＡの合成
ＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６（ポリマー）とｓｉＲＮＡとが１：１のものを、表１の反応組成で、容量２０μＬにて合成した。ｓｉＲＮＡは、ａｎｔｉ−ＧＦＰ（抗緑色蛍光タンパク質）配列のｓｉＲＮＡ（下記配列番号６と７）であって、そのセンス鎖３’末端にチオール基を、アンチセンス鎖３’末端にＦＡＭ蛍光色素を持つものである。かかるセンス鎖とアンチセンス鎖は、株式会社日本バイオサービスから購入した。
ＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−ｓｉＲＮＡの合成に先立ち、上記センス鎖とアンチセンス鎖を２０μＭずつの濃度で混ぜ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を含む水溶液中でアニーリング（８５℃で２分間加熱後に徐冷）することにより二重鎖のｓｉＲＮＡを形成させておいた。

【0145】

センス鎖（配列番号６）：
５’−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号７）：
５’−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣｄＴｄＴ−３’

【0146】

【表1】

【0147】

反応効率を高めるためにｓｉＲＮＡに対する様々なＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−マレイミドの配合比（１：２，１：５，１：１０）で３時間，２５℃で反応させ、反応物を０．７μＬ程度泳動し、８％Ｕｒｅａ ＰＡＧＥで確認した。その結果を図３に示す。

【0148】

図３の上にシフトしたバンドが、ポリマーと共有結合したＲＮＡを示している。その結果、反応効率は、ＲＮＡ：ポリマー＝１：５くらいのとき最も高かった。この反応物を８％Ｕｒｅａ ＰＡＧＥをして切り出し・抽出したところ、図４の丸２のバンドの通り、目的物を精製できたことが確認された。

【0149】

［合成例２：ジメトキシトリチルオキシ−ヘキシルジチオヘキサン（ＤＭＴ−Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）修飾ＲＮＡの合成］
DMT-C6-SS-C6基を５’末端に付加したｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ配列）センス鎖、及びｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ配列）アンチセンス鎖を、株式会社日本バイオサービスから購入した。当該センス鎖およびアンチセンス鎖のＲＮＡ配列は、配列番号６と７と同じである。DMT-C6-SS-C6基の構造は下記の通りであり、これがセンス鎖の５’末端リン酸基の酸素原子に付いている。DMT-C6-SS-C6-修飾センス鎖とアンチセンス鎖をアニーリングするために、下記表２の組成の溶液を調製した。その溶液をＰＣＲ装置より８５℃で１分間加熱し、１℃／ｓで徐冷した。

【0150】

【化2】

【0151】

【表2】

【0152】

［合成例３：光増感剤が結合した細胞膜結合性化合物の合成］
（１）細胞膜結合性化合物の作製
細胞膜結合性化合物である下記２種のＣＰＰペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により作製した。いずれもＮ末端又はＣ末端にシステインを結合した。システインのチオール基と、光増感剤が有するマレイミド基とを介して、ＣＰＰペプチドに光増感剤を結合させるためである。

【0153】

配列名Ｃ−ＭＰＧｄＮＬＳ（配列番号８）：
ＣＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ
配列名ＭＰＧΔＮＬＳ−Ｃ（配列番号９）：
ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶＧＣ

【0154】

（２）光増感剤が結合した結合細胞膜結合性化合物の合成
上記２種のＣＰＰペプチドに、チオール―マレイミド結合を介して、マレイミド基を持つ光増感剤（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、又はＤＹ７５０）を付加することにより合成した。

【0155】

合成は、表３の組成の溶液を調製し、２時間、２５℃でインキュベーションすることにより行った。そして、その溶液をＨＰＬＣ装置（ＰＵ９７０，ＰＵ−９８０，ＤＧ−９８０−５０，ＬＧ−９８０−０２，８２１−ＦＰ，Ｊａｓｃｏ社製）で精製した。カラムにはＣ１８カラムを用い、溶媒にはアセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ａｑを用い、４０分間でアセトニトリル０→１００％のグラジエントにより精製した。精製した光増感剤修飾ペプチドは、その後、エバポレーターを用いて溶媒を除去し、ＭｉｌｌｉＱ水に溶かした。得られたものは、ＨＰＬＣ−ＣＨＩＰ／ＱＴＯＦ質量分析装置（Ｇ６５２０ Ｇ４２４０，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により分子量の一致を確認した。

【0156】

【表3】

【0157】

［試験例１：ＲＮＡｉ効果の確認］
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を安定発現するＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞に、合成例１で合成したポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマー修飾ｓｉＲＮＡ（ポリマー修飾ｓｉＲＮＡ）の導入を行った。

【0158】

９６ｗｅｌｌプレートのウェル上で培養とＲＮＡ導入を行い、導入後２０時間後に培地を除き、ＰＢＳ１００μＬで洗浄し、トリプシン２０μＬで処理した。５分間処理後、Ｆ１２培地１００μＬ加え、懸濁して１．５ｍＬチューブに移した。４℃，５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、ＰＢＳ２５０μＬで再懸濁した。その溶液をフローサイトメトリー法により測定した。その結果を図５に示す。

【0159】

Ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ配列のポリマー修飾ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合、コントロールを１００％とすると４０％弱まで発現が抑制されており、確かにＲＮＡｉ効果（ＥＧＦＰノックダウン）が観測された。一方、ＥＧＦＰを標的としないネガティブコントロールのポリマー修飾ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合には、有意なＲＮＡｉ効果は観測されなかった。このことから、ポリ乳酸・ポリサルコシンコポリマーで修飾したｓｉＲＮＡ（本発明に係る修飾ｓｉＲＮＡ）は確かに生理活性を持つことが明らかである。

【0160】

［試験例２：ＲＮＡｉ効果の確認］
試験例１と同様にして、合成例２で合成したDMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果を観測した。その結果を図６に示す。
図６に示す通り、ＥＧＦＰ−ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＰのノックダウンを指標として、当該DMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡを投与した際には高効率なＲＮＡｉ効果が観測された。

【0161】

［試験例３：５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）において有用なｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果の確認］
（１）６ｗｅｌｌプレートのウェル上で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ (Life technologies社製)を用いて、ヒト悪性中皮腫細胞株（２１１Ｈ）又はヒト膵臓腺がん細胞株（ＣＦＰＡＣ１）に、ATP-binding cassette transporter G2（ＡＢＣＧ２）遺伝子をノックダウンするＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡ（配列番号１０と配列番号１１からなる二本鎖核酸）、フェロケラターゼ（Ferrochelatase, ＦＥＣＨ）遺伝子をノックダウンするＦＥＣＨ ｓｉＲＮＡ（配列番号１２と配列番号１３からなる二本鎖核酸）の導入を行った。ＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡは最終濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌ、ＦＥＣＨ ｓｉＲＮＡは最終濃度が２０ｎｍｏｌ／Ｌになるように添加した。

【0162】

（２）６ｗｅｌｌプレートのウェル上でＲＮＡ導入と培養を行い、導入から０時間後、２４時間後、４８時間後に細胞を回収しＰＢＳ１ｍＬで洗浄した。細胞懸濁液を遠心（４℃、３５００ｒｐｍで５分間）したのち上清を除去し、ＲＩＰＡ（Radio-Immunoprecipitation assay）バッファー（組成、50 mmol/ Tris-HCl (pH8.0), 150 mmol/L sodium chloride, 0.5% (w/v) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) sodium dodecyl sulfate, 1% (w/v) NP-40）で細胞を溶解した。各試料は、１ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間加熱した。なお、タンパク質濃度はBCA protein assay kit (Pierce 社製)を用いてウシ血清アルブミンによる標準曲線から測定した。

【0163】

（３）各試料はウェスタンブロット法により下記の操作で解析した。
タンパク質量として２０μｇを１０％のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。そのゲルに存在するタンパク質は、トランスファー装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。そのＰＶＤＦ膜は、５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ(150 mmol/L sodium chloride, 0.05%（v/v）Tween 20, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4)溶液で１時間ブロッキングを行った。抗ＡＢＣＧ２抗体（Cell signaling Technology 社製）、抗ＦＥＣＨ抗体（Cell signaling Technology 社製）、抗ａｃｔｉｎ抗体（Millipore社製）は、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク−ＴＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸して４℃で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜はＴＢＳ−Ｔ溶液で洗浄（５分間、３回）し、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク−ＴＢＳ−Ｔ溶液で希釈したhorse radish peroxidase（ＨＲＰ）を標識した抗ウサギ抗体又は抗マウス抗体を、室温で２時間反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄（５分間、３回）した後、Clarity Western ECL substrate (BioRad社製)を用いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ化学発光用フィルム（ＧＥ社製）に感光させ、目的とする各タンパク質を可視化させ解析した。なお、ＡＢＣＧ２及びフェロケラターゼは、特異的抗体を用いてそれぞれ検出した。Ａｃｔｉｎは、内在性コントロールとして使用した。その結果を図７に示す。

【0164】

図７に示す通り、２１１Ｈ細胞とＣＦＰＡＣ１細胞の両細胞において、ＲＮＡ導入後４８時間でＡＢＣＧ２発現量の減少が観察された。一方、フェロケラターゼ（ＦＥＣＨ）の発現量は、２４時間で強く減少し、４８時間後には検出されないほど顕著な抑制効果が観察された。この結果は、用いたｓｉＲＮＡが確かにＲＮＡｉ効果を持つことを示している。

【0165】

［試験例４：ｓｉＲＮＡ導入によるＡＬＡ誘導の細胞内プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）蓄積量の増大の確認］
ＲＮＡの導入は、試験例３（１）と同様にして行った。
ＲＮＡ導入から４８時間後、培地に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。培養３時間後に培地を除き、トリプシン溶液を用いて細胞を回収しＰＢＳ１ｍＬで洗浄した。細胞懸濁液を遠心（４℃、３５００ｒｐｍで５分間）したのち上清を除去し、ＰＢＳ０．５ｍＬで再懸濁した。その細胞懸濁液をフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図８に示す。

【0166】

図８において、ヒストグラムのピークが右にシフトするほど細胞内プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）量の増大を意味する。図８が示す通り、両細胞において、ＡＬＡ処理（コントロール（＋）ＡＬＡ線）は細胞内にＰｐＩＸを蓄積させたが、ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではより多くのＰｐＩＸの蓄積が観察された。特に、ＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡとフェロケラターゼｓｉＲＮＡの両方を導入した細胞（ＡＢＣＧ２＋ＦＥＣＨ線）は顕著なＰｐＩＸ蓄積が観察され、これらのｓｉＲＮＡが細胞内ＰｐＩＸの蓄積に有効であることが明らかである。

【0167】

［試験例５：ＡＬＡ−ＰＤＴにおけるｓｉＲＮＡ導入細胞における細胞生存率の低下の確認］
ＲＮＡの導入は、試験例３（１）と同様にして行った。
ＲＮＡ導入から４８時間後、培地に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。培養３時間後にＮａ−Ｌｉランプを装備したTheraBeam VR630 (Ushio Lighting社製)を用いて、細胞に光（波長：６３０ｎｍを中心とする５３０ｎｍから７００ｎｍ、出力：２９ｍＷ／ｃｍ^２）を１０分間照射した。その後、さらに２４時間培養した。培地にＭＴＴ溶液を０．０１２５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し３０分間培養を続けた。培地を除去し細胞をＰＢＳ１ｍＬで洗浄しＰＢＳを除去した後、ジメチルスルホキシド１ｍＬを添加し細胞内に生成したホルマザンを可溶化した。その溶液を９６ｗｅｌｌプレートに１００μＬずつ移し、マイクロプレートリーダーで吸光度（５７０ｎｍ）を測定し、細胞生存率を算出した。なお、ネガティブコントロールの細胞生存率を１００％とした。その結果を図９に示す。

【0168】

図９が示す通り、両細胞において、ＡＬＡ処理をした細胞はいずれも細胞生存率が低下したが、ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではさらに生存率が低下していた。その中でもＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡとフェロケラターゼｓｉＲＮＡの両方を導入した細胞（ＡＢＣＧ２＋ＦＥＣＨ）は、顕著な生存率の低下が観察された。これら生存率の結果は、図８で観察された細胞内ＰｐＩＸの蓄積量とよく一致していた。

【0169】

以上により、使用したｓｉＲＮＡは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）の効率化に有効であることが明らかである。

【0170】

［試験例６：ＲＮＡの細胞内侵入の確認］
（１）本発明の分子集合体の調製
ポリ乳酸―ポリサルコシン（両親媒性ブロックポリマーＡ）からなる高分子ミセルへの本発明に係る修飾ｓｉＲＮＡの組み込みと精製は、以下の操作により行った。

【0171】

２０ｎｍｏＬのＰＬＬＡ３０−ＰＳ７０と、１００ｐｍｏＬの修飾ｓｉＲＮＡ（合成例１）、２５０ｐｍｏＬの細胞膜結合性化合物（２種のＣＰＰペプチド（１：１）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６又はＤＹ７５０修飾体、合成例３）のクロロホルム溶液（１００μＬ）を小型試験管（ダーラム管）内で乾燥させ、フィルムを形成させたのち、１時間減圧乾燥を行った。そして、２０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を加え８５℃で１５分間加熱した。その溶液を４５０ｎｍフィルターに通した後、３００ｋＤａ限外濾過フィルターに通して精製を行った。

【0172】

４５０ｎｍのフィルターを通り抜け、３００ｋＤａの限外濾過膜にトラップされたので、得られたものはナノサイズの粒子であることが推測された。
上記のように製造された本発明の分子集合体ミセルにおいては、そのミセルの外側（シェル部）に細胞膜結合性化合物の一部が突出している。

【0173】

（２）本発明の分子集合体による、ＲＮＡの細胞内侵入の確認
修飾ＲＮＡと細胞膜結合性化合物（ＣＰＰペプチド）とを含む分子集合体（図１０）が細胞内に侵入することを以下のようにして確認した。

【0174】

前日に９６ｗｅｌｌプレートにＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖｅｒｙ（ＣＨＯ）細胞を２．０×１０^４個撒いた。翌日、Ｔ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ （ｐＨ７．４），１１５ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，１．８ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ａｎｄ １３．８ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ］を溶媒とし、ＣＰＰペプチド（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６又はＤＹ７５０修飾体、合成例３）の濃度が１μＭになるよう調製したサンプル５０μＬをｗｅｌｌに加え、２時間インキュベーションした。

【0175】

その後、Ｔ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、Ｔ ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ添加して画像を撮影した。まず各位相差像を撮り、励起光を照射する前に各ＦＡＭ像とＡｌｅｘａ５４６像を撮影した。続いて、Ａｌｅｘａ５４６に対しては、蛍光顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１を用い、５３０−５５０ｎｍの励起光を、ｘ２０対物レンズを通して１１秒間照射し、２分間放置して、ＦＡＭ像とＡｌｅｘａ５４６像を撮影した。ＤＹ７５０に対しては、ｅｐｉｔｅｘ社のＬＥＤライトＬ７５０−６６−６０により５分間照射後、ＦＡＭ像を撮影した。その結果を図１１及び図１２に示す。修飾ｓｉＲＮＡはＦＡＭで標識されており、ＦＡＭ像は修飾ｓｉＲＮＡの局在を示す。

【0176】

図１１に示す通り、分子集合体に刺さり込んだＡｌｅｘａ５４６標識ペプチド及び修飾ＲＮＡは、２時間の細胞処理後に、それぞれ細胞内に侵入し、主として（エンドソームと考えられる）小胞内に局在した（光照射前の写真参照）。このとき、Ａｌｅｘａ５４６には光増感剤としての機能も有しており、その励起光を１１秒間照射したのちには、エンドソームから脱出し細胞質へと拡散した（光照射後の写真参照）。また、ＤＹ７５０に係る図１２からも、光照射後において修飾ｓｉＲＮＡが細胞質内に拡がっていることが明らかである（光照射後のＦＡＭ写真像参照）。

【0177】

すなわち、このポリマー修飾ＲＮＡは、同様なポリマーにより形成された両親媒性ブロックポリマーＡに容易に組み込むことができ、細胞質内に送達された。
従って、本発明の分子集合体は、細胞質内へＲＮＡを送達できることが明らかである。

【0178】

［試験例７：ＲＮＡの細胞内侵入の確認］
（１）本発明の分子集合体の調製
ポリ乳酸−ポリサルコシン（両親媒性ブロックポリマーＡ）からなる高分子ミセルへのDMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡの組み込みは以下のように行った。

【0179】

２０ｎｍｏＬのＰＬＬＡ３０−ＰＳ７０と、１０ｐｍｏＬのDMT-C6-SS-C6-修飾ｓｉＲＮＡ、２５０ｐｍｏＬの細胞膜結合性化合物（２種のＣＰＰペプチド（１：１）、ＤＹ７５０修飾体）のクロロホルム溶液（１００μＬ）を小型試験管（ダーラム管）内で調合し、乾燥させ、フィルムを形成させたのち、１時間減圧乾燥を行った。その後の操作は試験例３（１）と同じである。

【0180】

（２）本発明の分子集合体による、ＲＮＡの細胞内侵入の確認
この分子集合体による、ＲＮＡの細胞内侵入の確認は試験例３（２）と同様にして行った。
その結果、ＦＡＭで標識された修飾ｓｉＲＮＡの局在は、光照射の前後で、図１３に示すようになった。修飾ＲＮＡは、２時間の細胞処理後に、それぞれ細胞内に侵入し、主として（エンドソームと考えられる）小胞内に局在した（光照射前の写真参照）。光照射後には修飾ｓｉＲＮＡが細胞質内に拡がっていることが明らかである（光照射後のＦＡＭ写真像参照）。

【0181】

［試験例８：細胞膜結合性化合物の効果の確認］
（１）用いた細胞膜結合性化合物と光増感剤
当該実験に用いた細胞膜結合性化合物は下記４種のＣＰＰペプチドであり、いずれもＦｍｏｃ固相合成法により作製した。

【0182】

配列名ＤＰＶ３（配列番号１４）：ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳＣ
配列名ＰＴＤ４（配列番号１５）：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＣ
配列名Ｐｅｐ１（配列番号１６）：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶＣ
配列名ＥＢ１（配列番号１７）：ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫＣ

【0183】

当該実験に用いた光増感剤は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）に３４のポリ乳酸からなるＰＬＬＡ３４を結合させたものである（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ３４）。これは、特許第5531332号の実施例１に準じて作製したＮＨ２−ＰＬＬＡ３４にＩＣＧ−ＮＨＳを付加する形で同特許の実施例５に準じて合成した。

【0184】

（２）ＣＰＰペプチド含有分子集合体の調製
３２のポリ乳酸からなるＰＬＬＡ３２と２５のポリサルコシンからなるＰＳ２５がＰＬＬＡ３２に３つ分岐して結合したＰＬＬＡ３２−（ＰＳ２５）３（分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ）からなる高分子ミセルへの細胞膜結合性化合物の組み込みと精製は、以下の操作により行った。

【0185】

１００ｎｍｏＬのＰＬＬＡ３２−（ＰＳ２５）３、合成例１（１）で作製した１０ｎｍｏｌのＰＬＬＡ３０−ＰＳ５６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅおよび２ｎｍｏｌのＩＣＧ−ＰＬＬＡ３４のクロロホルム溶液（１１２μＬ）を試験管内で乾燥させ、フィルムを形成させたのち、２０分間減圧乾燥を行った。これに５０μＬの生理食塩水を加え水和させた。
その後、ＤＰＶ３、ＰＴＤ４、Ｐｅｐ１またはＥＢ１（配列番号１４〜１７）のＣＰＰペプチドを３０ｎｍｏｌ加え、全液量を１００μＬとし、室温で１２時間以上振盪し反応させた。そして、５０ｋＤａの限外濾過フィルターに移し、生理食塩水で全液量を５００μＬとした後、１２０００×Ｇで１０分間遠心した。遠心後の溶液に再度生理食塩水を加えて全液量を５００μＬとし再度同条件で遠心を行い、同工程をもう一度繰り返した後、限外濾過フィルターを逆にして、室温、１０００×Ｇで３分間遠心し溶液を回収した。回収した溶液は、生理食塩水で全液量を５０μＬとし、以下の実験に供した。

【0186】

（３）細胞内取り込み率の評価
ＣＰＰペプチドを含む分子集合体が細胞内に侵入することを以下のようにして確認した。実験は上述の４種のＣＰＰペプチドを含む分子集合体サンプルで行った。対照としてＣＰＰペプチドを含まないサンプルを使用した。

【0187】

前日に９６ｗｅｌｌプレートにＣｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖｅｒｙ（ＣＨＯ）細胞を２．０×１０^４個撒いた。翌日、１４２μＬのＴ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ （ｐＨ７．４），１１５ｍＭ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ ＫＣｌ，１．８ｍＭ ＣａＣｌ２，０．８ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ａｎｄ １３．８ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ］と、上述のサンプル８μＬをｗｅｌｌに加え、３７℃、５％ＣＯ_２下で２時間インキュベーションした。その後、培地を交換し、ＩＶＩＳスペクトラム（パーキンエルマー社製）で撮像した。

【0188】

撮像は、ＩＶＩＳを用い、７４５ｎｍの励起光を照射し、８４０ｎｍの波長、露光時間１０秒でＩＣＧ像の蛍光強度を測定した。

【0189】

次に、各々のウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８(同仁化学社製)を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした後、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を求めた。そして、ＩＶＩＳでの蛍光強度をプレートリーダーでの生細胞数で除し、対照の結果で標準化することにより、当該ＣＰＰペプチドの細胞内取り込み率を評価した。その結果を図１４に示す。
図１４に示す通り、特にＰｅｐ１ペプチドとＥＢ１ペプチドの取り込み率が高かった。

【産業上の利用可能性】

【0190】

本発明の分子集合体は、生体内投与によって、ＲＮＡを細胞質内まで送達することができるから、本発明は、腫瘍細胞質内へのＲＮＡ送達システム（ＤＤＳ）として、また癌予防剤又は癌治療剤として有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0191】

配列番号４：ＣＴＰ５１２
配列番号５：Ｐｅｐペプチド
配列番号６：ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｉＲＮＡのセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号７：ａｎｔｉ−ＧＦＰ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号８：ＭＰＧｄＮＬＳのＮ末端にシステインを有する。
配列番号９：ＭＰＧΔＮＬＳのＣ末端にシステインを有する。
配列番号１０：ＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡのセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号１１：ＡＢＣＧ２ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号１２：Ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ ｓｉＲＮＡのセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号１３：Ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、３’末端の２つのヌクレオチドはＤＮＡで構成され、その他はＲＮＡ。
配列番号１４：ＤＰＶ３
配列番号１５：ＰＴＤ４
配列番号１６：Ｐｅｐ１
配列番号１７：ＥＢ１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]