特許 6586136 ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6586136

(24)【登録日】2019年9月13日

(45)【発行日】2019年10月2日

(54)【発明の名称】ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20190919BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20190919BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALN20190919BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 ZZNA

   C40B40/06

   !C12Q1/34

【請求項の数】14

【外国語出願】

【全頁数】126

(21)【出願番号】特願2017-153168(P2017-153168)

(22)【出願日】2017年8月8日

(62)【分割の表示】特願2014-522918(P2014-522918)の分割

【原出願日】2012年7月22日

(65)【公開番号】特開2018-19694(P2018-19694A)

(43)【公開日】2018年2月8日

【審査請求日】2017年9月7日

(31)【優先権主張番号】61/510,841

(32)【優先日】2011年7月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(73)【特許権者】

【識別番号】314008714

【氏名又は名称】リウ，デービッド，アール．

(73)【特許権者】

【識別番号】314008725

【氏名又は名称】ギリンジャー，ジョン，ポール

(73)【特許権者】

【識別番号】314008736

【氏名又は名称】パッタナヤク，ヴィクラム

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】リウ，デービッド，アール．

(72)【発明者】

【氏名】ギリンジャー，ジョン，ポール

(72)【発明者】

【氏名】パッタナヤク，ヴィクラム

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３９９２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０１６２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／００２５０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／００７６８４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 BMC Bioinformatics，２０１１年 ５月，vol.12, no.15，pp.1-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ４０Ｂ ４０／０６

Ｃ１２Ｑ １／３４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む複数の核酸分子を含む、部位特異的ヌクレアーゼの標的部位を同定するための核酸分子のライブラリーであって、
各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含み；
候補ヌクレアーゼ標的部位が、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含む、
前記ライブラリー。

【請求項2】

左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトが６〜３０ヌクレオチド長の間である、請求項１に記載のライブラリー。

【請求項3】

左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトが１０〜１８ヌクレオチド長の間である、請求項２に記載のライブラリー。

【請求項4】

ＦｏｋＩ切断ドメインを含む部位特異的ヌクレアーゼによって切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項5】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、またはブレオマイシンによって切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項6】

少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、または少なくとも１０^１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項7】

少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項8】

候補ヌクレアーゼ標的部位が、無作為化されたスペーサー配列をＬＳＲ構造において含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項9】

候補ヌクレアーゼ標的部位が、部分的に無作為化された左ハーフサイトを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項10】

候補ヌクレアーゼ標的部位が、部分的に無作為化された右ハーフサイトを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項11】

目的のヌクレアーゼの公知の標的部位のテンプレートである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項12】

目的のヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、またはブレオマイシンである、請求項１１に記載のライブラリー。

【請求項13】

部分的に無作為化された部位が、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス部位と異なる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項14】

部分的に無作為化された部位が、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のライブラリー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）項に基づいて、２０１１年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５１０，８４１号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0002】

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／国立総合医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの助成金第Ｒ０１ ＧＭ０６５４００号および第Ｒ０１ ＧＭ０８８０４０号、国防総省国防高等研究事業局（Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ）からの助成金第ＨＲ００１１−１１−２−０００３号、および国立衛生研究所からの助成金第ＤＰ１ ＯＤ００６８６２号の下で、米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

部位特異的エンドヌクレアーゼは、理論的には、ゲノム内の単一部位の標的化操作を可能にし、遺伝子ターゲティングおよび治療用途の文脈において有用である。哺乳動物を含む種々の生物において、部位特異的エンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、非相同末端連結または相同組換えのいずれかを促進することによりゲノム工学に使用されている。強力な研究ツールを提供することに加えて、ＺＦＮは、遺伝子治療剤としての能力も有し、２つのＺＦＮが最近臨床試験に入った：その１つであるＣＣＲ５−２２４６は、抗ＨＩＶ治療の手法の一部としてヒトＣＣＲ−５対立遺伝子を標的とし（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）、もう１つのＶＦ２４６８４は、抗癌治療手法の一部としてヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的とする（ＮＣＴ０１０８２９２６）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

操作された部位特異的結合ドメインの一部にある不完全な特異性が細胞毒性につながっていたので、目的の標的部位に正確にターゲティングすることが、特に治療用途では、部位特異的ヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット作用を最小化するために重要である。しかしながら、二量体形成後にその標的部位を切断する、現行のＺＦＮを含む、操作された部位特異的ヌクレアーゼの部位選択性は、単量体タンパク質の結合および切断特異性の算出に限定される方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏでこれまで評価されてきたにすぎない。

【0005】

したがって、ヌクレアーゼおよび他の核酸切断剤のオフターゲット部位を評価するための改善されたシステムが必要であり、それは、特に治療用途のための、より優れた特異性を有するヌクレアーゼの設計に有用となろう。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの一部について報告された毒性が、単にオフターゲット結合によるのではなく、オフターゲットＤＮＡ切断に基づいているという認識に少なくとも一部は基づいている。部位特異的ヌクレアーゼの特異性に関するこれまでの情報は、以下の仮定に基づいていた、すなわち、（ｉ）二量体ヌクレアーゼは、単離の単量体ドメインがＤＮＡに結合する場合と同じ配列特異性でＤＮＡを切断すること；および（ｉｉ）所与の二量体ヌクレアーゼにおいて、一方のドメインの結合は、他方のドメインの結合に影響を及ぼさないこと。これまでの研究では、活性な二量体部位特異的ヌクレアーゼの幅広いＤＮＡ切断特異性を決定するための方法が報告されていない。そのような方法は、ヌクレアーゼのＤＮＡ切断特異性を決定するのに有用であるだけでなく、ＤＮＡを切断する小分子などの他のＤＮＡ切断剤の切断特異性を評価するのにも有用であることがわかるであろう。

【0007】

本発明は、部位特異的ヌクレアーゼ、特に、標的配列を切断するために二量体または多量体を形成するヌクレアーゼの配列特異性を評価し特徴づける以前の試みの欠点に取り組む。本発明の一部の態様は、活性ヌクレアーゼの切断特異性を幅広く調べるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法を提供する。一部の態様では、本発明は、オフターゲット切断をまったくかまたは少なくとも最小限にしか伴うことなく所与のヌクレアーゼによる特異的切断を達成するために、ゲノム内の他のいかなる部位とも十分異なる適切なヌクレアーゼ標的部位を同定する方法を提供する。本発明は、現行のヌクレアーゼと比較して特異性が向上した部位特異的ヌクレアーゼを評価、選択、および／または設計する方法を提供する。例えば、結合親和性が低下した結合ドメインを有する変異ヌクレアーゼの設計によるヌクレアーゼ特異性の向上、ヌクレアーゼの最終濃度の低減、およびゲノム中の最も近縁の配列類縁体と少なくとも３塩基対は異なる標的部位の選択によって、所与のヌクレアーゼによるオフターゲット切断を最小化するための方法を提供する。本発明の方法の実施に有用な組成物およびキットも提供する。提供する方法、組成物、およびキットは、当業者が認識するように、他の核酸（例えば、ＤＮＡ）切断剤の評価、設計、および選択にも有用である。

【0008】

別の態様では、本発明は、提供するシステムを使用して設計または選択されるヌクレアーゼおよび他の核酸切断剤を提供する。本明細書に提供する方法によって設計、評価、または選択される単離のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮならびにそのようなヌクレアーゼを含む医薬組成物も提供する。

【0009】

本発明の一部の態様は、ヌクレアーゼの標的部位を同定するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）二本鎖核酸の標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、標的部位が［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、ヌクレアーゼがスペーサー配列内の標的部位を切断するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｂ）ヌクレアーゼがヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーにヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｃ）ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の配列決定は、ステップ（ｃ）の核酸分子の平滑末端にシークエンシングアダプターを連結し、核酸分子の増幅および／またはシークエンシングを行うステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、シークエンシングアダプターの連結後、ＰＣＲにより核酸分子を増幅するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、単一の一定挿入配列を含む分子について、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）の核酸分子を濃縮するステップをさらに含む。一部の実施形態では、濃縮ステップはサイズ分画を含む。一部の実施形態では、サイズ分画はゲル精製により行われる。一部の実施形態では、この方法は、５’オーバーハングが充填された相補対を核酸分子が含まなかった場合、ステップ（ｄ）で決定されたいかなる配列も廃棄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｄ）で同定された複数のヌクレアーゼ標的部位を編集し、それによってヌクレアーゼ標的部位のプロファイルを作製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、疾患に関連した遺伝子中の特定のヌクレアーゼ標的部位を切断する治療用ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、この方法は、治療用ヌクレアーゼが特定のヌクレアーゼ標的部位を切断し、かつ１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、さらなるヌクレアーゼ標的部位を切断しないか、またはまったく切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、最大濃度以下の最終濃度を生じさせるのに有効な量で、治療用ヌクレアーゼを被験体に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは非特異的核酸切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、切断ドメインが二量体形成すると標的配列を切断する核酸切断ドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインはジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。一部の実施形態では、結合ドメインは転写活性化因子様エレメントを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは有機化合物を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはエンジインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは抗生物質である。一部の実施形態では、化合物は、ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。

【0010】

本発明の一部の態様は、核酸分子のライブラリーを提供する。一部の実施形態では、複数の核酸分子を含む、核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含む。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、ライブラリーは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含むヌクレアーゼにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および／またはブレオマイシンにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、または少なくとも１０^１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子を含む。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、部分的に無作為化された左ハーフサイト、部分的に無作為化された右ハーフサイト、および／または部分的に無作為化されたスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、目的のヌクレアーゼの公知の標的部位のテンプレートである。一部の実施形態では、目的のヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は無作為化されたスペーサー配列を含む。

【0011】

本発明の一部の態様は、切断特異性の評価に基づいて、ヌクレアーゼを選択する方法を提供する。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位を特異的に切断するヌクレアーゼを複数のヌクレアーゼから選択する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）同じコンセンサス配列を切断する複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、コンセンサス標的部位とは異なる、候補ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位に基づいて、ヌクレアーゼを選択するステップとを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択されるヌクレアーゼは、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼである。一部の実施形態では、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼは、コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である候補ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、最高の特異性でコンセンサス標的部位を切断する候補ヌクレアーゼは、標的ゲノムの文脈においてコンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である候補ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼは、コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で選択される候補ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの治療有効濃度で、被験体のゲノム内のコンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｃ）で選択されたヌクレアーゼとゲノムを接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ゲノムは、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである。一部の実施形態では、ゲノムは生細胞内にある。一部の実施形態では、ゲノムは被験体内にある。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位は、疾患または障害に関連する対立遺伝子内にある。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位の切断は、疾患または障害の治療または予防をもたらす。一部の実施形態では、コンセンサス標的部位の切断は、疾患または障害の症候の緩和をもたらす。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、対立遺伝子はＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡの対立遺伝子である。

【0012】

本発明の一部の態様は、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、（ｂ）汎用コンピューターを使用して、候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するステップであって、候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ部位を選択するステップとを含む。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位は、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含む。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、スペーサーは、１０〜２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）で選択された候補ヌクレアーゼ部位を標的とするヌクレアーゼを設計および／または作製するステップをさらに含む。一部の実施形態では、設計および／または作製は、組換え技術により行われる。一部の実施形態では、設計および／または作製は、選択された候補標的部位またはそのハーフサイトに特異的に結合する結合ドメインを設計するステップを含む。一部の実施形態では、設計および／または作製は、結合ドメインと核酸切断ドメインとをコンジュゲートするステップを含む。一部の実施形態では、核酸切断ドメインは非特異的切断ドメインであり、かつ／またはその核酸切断ドメインは核酸を切断するために二量体または多量体を形成しなければならない。一部の実施形態では、核酸切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。一部の実施形態では、この方法はヌクレアーゼを単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、候補標的部位は、その切断が疾患または障害の症候の緩和に関連することが知られているゲノム配列内にある。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、このゲノム配列はＣＣＲ５またはＶＥＧＦＡの配列である。

【0013】

本発明の一部の態様は、特異性が向上した単離ヌクレアーゼおよびそのようなヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、ゲノム内の標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼであって、本明細書に記載の任意の選択方法によって選択されたヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法によって選択された標的部位を切断する単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の概念またはパラメーターによって設計または操作された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。

【0014】

本発明の一部の態様は、ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の単離ヌクレアーゼを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、単離ヌクレアーゼの標的部位を含む核酸をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、賦形剤ならびにヌクレアーゼと賦形剤を接触させてヌクレアーゼと核酸を接触させるのに適した組成物を生成させるためのインストラクションを含む。一部の実施形態では、核酸はゲノムまたはゲノムの一部である。一部の実施形態では、ゲノムは細胞内にある。一部の実施形態では、ゲノムは被験体内にあり、賦形剤は薬学的に許容される賦形剤である。

【0015】

本発明の一部の態様は、本明細書に記載のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、被験体に投与するための医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離ヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸および薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0016】

本発明の他の利点、特徴、および用途は、特定の非限定的実施形態の詳細な説明；図面（これらは、概略図であり、計測のための描写を意図するものではない）；および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＺＦＮ媒介の切断に対するインビトロ選択を示す図である。プレ選択ライブラリーメンバーは、５’リン酸を欠く同一のＺＦＮ標的部位のコンカテマー（矢印により表わす）である。Ｌ＝左ハーフサイト；Ｒ＝右ハーフサイト、Ｓ＝スペーサー；Ｌ’、Ｓ’、Ｒ’＝Ｌ、Ｓ、Ｒに対して相補的な配列。ＺＦＮ切断により５’リン酸が現れるが、これはシークエンシングアダプターの連結に必要である。アダプターに相補的なプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅することができる唯一の配列は、２回切断されて両末端にアダプターを有する配列である。隣接した部位で切断されたＤＮＡをゲル電気泳動法により精製し、配列決定する。シークエンシング後のコンピュータスクリーニングステップにより、充填されたスペーサー配列（ＳおよびＳ’）が相補的であり、したがって同じ分子由来であることが確認される。

【図2】ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮについてのＤＮＡ切断配列特異性プロファイルを示す図である。ヒートマップは、（ａ）２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）１ｎＭのＶＦ２４６８による１４ｎＭのＤＮＡライブラリーの切断に対する選択で同定されたすべての配列から編集された特異性スコアである。標的ＤＮＡ配列を各ハーフサイトの下に示す。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対のプレ選択ライブラリーからポスト選択ライブラリーにかけての可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置でのある塩基対の濃縮を示し、白色ボックスは濃縮がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置でのある塩基対の反濃縮を示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。

【図3】ＺＦＮ標的部位認識の補償モデルについての証拠を示す図である。ヒートマップは、（ａ）２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）１ｎＭのＶＦ２４６８による選択において、黒枠位置での突然変異で特異性スコアが変化することを示す。各行は、異なる突然変異位置に対応する（図１２にグラフ的に説明する）。サイトはそれらのゲノム配向で記載する；したがって、ＣＣＲ５−２２４の（＋）ハーフサイトおよびＶＦ２４６８の（＋）ハーフサイトは、図２で見出された配列の逆相補鎖として記載する。青色の陰影は、黒枠の位置が突然変異したときの特異性スコアの増大（より多くのストリンジェンシー）を示し、赤色の陰影は、特異性スコアの低下（より少ないストリンジェンシー）を示す。

【図4】ＺＦＮが、３つ以下の突然変異を含む標的部位の大きな割合をｉｎ ｖｉｔｒｏで切断することができることを示す図である。（ａ）ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮおよび（ｂ）ＶＦ２４６８ ＺＦＮによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断に対して濃縮される（濃縮係数＞１）１つ、２つ、または３つの突然変異を含む配列の百分率を示す。濃縮係数は、選択で同定された各配列について、ポスト選択の配列決定ライブラリーにおけるその配列の観察頻度を、プレ選択ライブラリーにおけるその配列の頻度によって割ることにより算出する。

【図5】標的部位ライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成について示す図である。ライブラリーメンバーは、部分的に無作為化された左ハーフサイト（Ｌ）、完全に無作為化された４〜７ヌクレオチドのスペーサー配列（Ｓ）、および部分的に無作為化された右ハーフサイト（Ｒ）からなる。ＤＮＡプライマー上で存在するライブラリーメンバーを、約５４５塩基対の線状二本鎖ＤＮＡの中にＰＣＲにより組み込んだ。ＰＣＲの間、ライブラリーメンバー（Ｌ Ｓ Ｒ）を有するプライマーは、異なるライブラリーメンバー（Ｌ＊Ｓ＊Ｒ＊）を有するＤＮＡ鎖にアニーリングする可能性があり、一方の末端に２つの異なるライブラリーを有する二本鎖ＤＮＡが生じる。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼおよび５’−３’ポリメラーゼ活性により、ミスマッチしたライブラリーメンバーが除去され、マッチした相補的なライブラリーメンバー（Ｌ’Ｓ’Ｒ’）がそれらに置き換わった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’リン酸化の後、ライブラリーＤＮＡを、平滑末端連結反応に供し、線状および環状の単量体および多量体種の混合物を得た。環状モノマーは、ゲル電気泳動法により精製し、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼによるローリングサークル増幅を介して連結した。

【図6】ＺＦＮの発現および定量を示す図である。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８についてのウエスタンブロットを、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択に使用するＺＦＮ試料に関して、（ｂ）定量に関して示す。（ｃ）既知量のＮ末端ＦＬＡＧタグ付き細菌アルカリホスファターゼ（ＦＬＡＧ−ＢＡＰ）を使用して、ＺＦＮ定量のための標準曲線を作成した。菱形は、（ｂ）に示すウエスタンブロットからのＦＬＡＧ−ＢＡＰ標準の強度を示し、プラス記号は、ＺＦＮのバンド強度を示し、直線は、ＺＦＮを定量するために使用した、ＦＬＡＧ−ＢＡＰ標準の最良適合曲線を示す。（ｄ）１つの標的切断部位を含有する８ｎＭの線状基質に対するＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の活性アッセイのゲルを示す。それぞれのＺＦＮを、それぞれの基質と共に３７℃で４時間インキュベートした。「＋溶解物」レーン中のＤＮＡは、２．５ｎＭのＺＦＮ反応で使用した量と等量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物と共にインキュベートした。ＺＦＮ媒介の切断は、長さが約７００ｂｐおよび３００ｂｐの２つの線状断片をもたらす。２ｎＭのＣＣＲ５−２２４および１ｎＭのＶＦ２４６８が、線状基質の５０％を切断するのに必要な量であった。

【図7】ＺＦＮによる、ライブラリーの切断を示す図である。種々の量のＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８による、それぞれＣＣＲ５−２２４（ａ）またはＶＦ２４６８（ｂ）の標的部位のコンカテマーライブラリー１μｇの切断を示す。「＋溶解物」と標示したレーンは、４ｎＭのＣＣＲ５−２２４または４ｎＭのＶＦ２４６８を含有する試料に含有された量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物と共にインキュベートしたプレ選択コンカテマーライブラリーを指す。「＋溶解物」レーンで観察されるであろう非切断ＤＮＡは、長さが１２ｋｂ超であり、その大きさのために精製すると失われ、したがって、ゲル上には存在しない。「＋ＰｖｕＩ」と標示したレーンは、ライブラリーメンバーに隣接して導入されたＰｖｕＩ部位でのプレ選択ライブラリーの消化物である。ゲル上のラダーは、２つ以上の部位でのプレ選択ＤＮＡコンカテマーの切断に起因する。最下部バンドの量が用量依存的に増加しており、同じプレ選択ＤＮＡ分子中の２つの隣接したライブラリー部位での切断に対応する。ＤＮＡのこの最下部バンドをＰＣＲおよびゲル精製により濃縮した後、シークエンシングを行った。

【図8】ＺＦＮオフターゲット切断が酵素濃度に依存することを示す図である。（ａ）ＣＣＲ５−２２４および（ｂ）ＶＦ２４６８の両方について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により示された切断可能部位の分布は、ＺＦＮ濃度の増加につれて標的部位に対する類似性が低い部位を含むようにシフトする。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の選択は両方とも、プレ選択ライブラリーよりも、少数の突然変異を有する部位を濃縮する。選択ストリンジェンシーのすべての組合せについて、プレ選択ライブラリーおよびポスト選択ライブラリー手段の間で比較すると、Ｐ値が１．７×１０^−１４である０．５ｎＭと１ｎＭのＶＦ２４６８選択間の比較を例外として、Ｐ値は０である。

【図9】個々の配列の切断効率は選択ストリンジェンシーに関連する。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＤＮＡ消化を、種々のストリンジェンシーの選択で同定された配列（「×」の印をつけた）について実施した。２ｎＭのＣＣＲ５−２２４（ａ）または１ｎＭのＶＦ２４６８（ｂ）を、図示した配列を含有する８ｎＭの線状基質と共にインキュベートした。１ｋｂの線状基質は、ＣＣＲ５−２２４（「ＣＴＧＡＴ」）またはＶＦ２４６８（「ＴＣＧＡＡ」）のゲノム標的中に見出されたスペーサー配列と、表示する（＋）および（−）のハーフサイトとを含む単一切断部位を含有した。突然変異塩基対を小文字で示す。最高のストリンジェンシー選択（０．５ｎＭのＺＦＮ）で同定されたＣＣＲ５−２２４部位およびＶＦ２４６８部位は、最も効率的に切断されるが、最低のストリンジェンシー選択（４ｎＭのＺＦＮ）でのみ同定された部位は、切断効率が最も低い。

【図10】ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮについての濃度依存的配列プロファイルを示す図である。ヒートマップは、種々の量の（ａ）ＣＣＲ５−２２４または（ｂ）ＶＦ２４６８による１４ｎＭの全ＤＮＡライブラリーの切断についての特異性スコアを示す。標的ＤＮＡ配列を各ハーフサイトの下に示す。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。

【図11】ＣＣＲ５−２２４が（−）ハーフサイト中の高度に特異的な塩基対に突然変異を有する部位を切断する場合、（＋）ハーフサイトのストリンジェンシーは増大することを示す図である。ヒートマップは、２ｎＭのＣＣＲ５−２２４によるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された配列の特異性スコアを示す。黒色ボックスで示す（−）Ａ３および（−）Ｇ６の場合、特異性スコアを算出する前に、プレ選択ライブラリー配列およびポスト選択配列の両方をフィルターにかけて、それぞれ、（−）ハーフサイトの位置３にＡを含有する、または（−）ハーフサイトの位置６にＧを含有するいかなる配列も除外した。いずれかの（−）ハーフサイト突然変異を有する部位について、（＋）ハーフサイトの特異性は増大する。黒枠は標的塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。

【図12】突然変異補償差マップを作成するために使用するデータ処理ステップを示す図である。図３の差マップの各列を作成するステップを、位置（−）Ａ３の突然変異の例について示す。（ａ）図１１に記載のタイプのヒートマップを、目的の標的部位ヌクレオチドの特異性スコアのみを示すために、１列に圧縮する。（図１１の黒く縁取りされたボックス）（ｂ）次いで、この圧縮ヒートマップを、図２からのフィルターにかけられていないベースラインプロファイルに対応する圧縮ヒートマップと比較して、特異性スコアプロファイル上の黒枠の白色ボックスにより指定される位置での突然変異の相対的効果を示す圧縮差ヒートマップを作成する。青色ボックスは、白色ボックスにより指示される位置に突然変異を含有する切断部位の位置での配列ストリンジェンシーの増大を示し、赤色ボックスは、配列ストリンジェンシーの低下を示し、白色ボックスは、配列ストリンジェンシーの変化がないことを示す。（＋）ハーフサイト差マップは、ＺＦＮのジンクフィンガードメインが認識するようにではなく、ゲノム中に見出されるように、（＋）ハーフサイトの配向を一致させるために逆にする。

【図13】両方のハーフサイトの１番目の塩基対が突然変異した部位をＶＦ２４６８が切断する場合、両方のハーフサイトのストリンジェンシーが増大することを示す図である。ヒートマップは、４ｎＭのＶＦ２４６８によるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された配列の特異性スコアを示す。黒色ボックスで示した（＋）Ｇ１、（−）Ｇ１、および（＋）Ｇ１／（−）Ｇ１の場合、特異性スコアを算出する前に、プレ選択ライブラリー配列およびポスト選択配列の両方をフィルターにかけて、（＋）ハーフサイトの位置１にＧを含有し、かつ／または（−）ハーフサイトの位置１にＧを含有するいかなる配列も除外した。いずれかの突然変異を含む部位の場合、反対側のハーフサイトにおける突然変異許容性が低下し、同じハーフサイトにおける突然変異許容性が極めてわずか低下した。両方の突然変異を含む部位は、両方のハーフサイトでストリンジェンシーの顕著な増大を示す。黒枠はオンターゲット塩基対を示す。特異性スコアは、プレ選択プールに比較した、ポスト選択ＤＮＡプールでの各位置における各塩基対の頻度変化を、各位置における各塩基対の可能な最大頻度変化によって割ることにより算出した。青色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して特異性があることを示し、白色ボックスは特異性がないことを示し、赤色ボックスは、所与の位置においてある塩基対に対して反特異性があることを示す。凡例で示す最も濃い青色は、所与の塩基対に対する絶対的な選択性（特異性スコア＝１．０）に対応し、最も濃い赤色は、所与の塩基対に対する絶対的な反選択性（特異性スコア＝−１．０）に対応する。

【図14】ＺＦＮ切断がＤＮＡ標的部位中の特定の位置で起こることを示す図である。このプロットは、（ａ）４ｎＭのＣＣＲ５−２２４または（ｂ）４ｎＭのＶＦ２４６８による、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で同定された切断部位の位置を示す。切断部位の位置は、４塩基のオーバーハングを有する５塩基対スペーサーの場合を除いて、両方のＺＦＮについて同様のパターンを示す。表題は、プロットするスペーサーの長さ／オーバーハングの長さの組合せを表す（例えば、６塩基対スペーサーおよび４塩基オーバーハングを含む部位は、「６／４」と称する）。黒色バーは、スペーサーの長さとオーバーハングの長さとの各組合せについて、切断された配列の相対数を示す。「Ｐ」は、（＋）標的ハーフサイト中のヌクレオチドを表し、「Ｍ」は、（−）標的ハーフサイト中のヌクレオチドを表し、「Ｎ」は、スペーサー中のヌクレオチドを表す。４ｎＭのＶＦ２４６８選択からは、「７／７」配列はなかった。少なくとも４塩基のオーバーハングを含む配列のみを示した。

【図15】ＣＣＲ５−２２４は、５塩基対および６塩基対のスペーサーを優先的に切断し、５塩基対のスペーサーを切断して５ヌクレオチドのオーバーハングを残すことを示す図である。ヒートマップは、図示するスペーサーおよびオーバーハングの長さを有する、ＣＣＲ５−２２４の４つのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（ａ〜ｄ）のそれぞれにおいて残存するすべての配列の百分率を示す。

【図16】ＶＦ２４６８は、５塩基対および６塩基対のスペーサーを優先的に切断し、５塩基対のスペーサーを切断して５ヌクレオチドのオーバーハングを残し、６塩基対のスペーサーを切断して４ヌクレオチドのオーバーハングを残すことを示す図である。ヒートマップは、図示するスペ−サーおよびオーバーハングの長さを有する、ＶＦ２４６８の４つのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（ａ〜ｄ）のそれぞれにおいて残存するすべての配列の百分率を示す。

【図17】ＺＦＮが、スペーサーの長さに依存した配列選択性を示すことを示す図である。ＣＣＲ５−２２４（ａ〜ｃ）およびＶＦ２４６８（ｄ〜ｆ）は両方とも、５塩基対および６塩基対のスペーサーを挟むハーフサイトに対してよりも、４塩基対および７塩基対のスペーサーを挟むハーフサイトに対して特異性が高いことを示す。両方のＺＦＮについて、一方のハーフサイトは、他方よりも突然変異許容性が大きく変化し、突然変異許容性の変化は濃度依存的である。

【図18】オフターゲット配列のＺＦＮ許容性についてのモデルを示す図である。本発明者らの結果は、一部のＺＦＮが、所与の一連の条件（点線）下の切断に対して必要とされる結合エネルギーよりも多くの結合エネルギーで目的の標的部位（上段、×のない黒色ＤＮＡ）を認識することを示唆する。１つまたは２つの突然変異（１つまたは２つの×）を含む配列は、切断に必要な閾値よりも下にＺＦＮ：ＤＮＡ結合エネルギーを低下させないため、概ね許容される。さらなる突然変異を含む配列の一部は、さらなる突然変異がすでに破壊されたジンクフィンガー結合接触面の領域に生じる場合（点線の上にある３つの×）、ＺＦＮ：ＤＮＡ結合接触面の他の場所に存在する最適相互作用が閾値を超える結合エネルギーを維持する限り、依然として切断され得る。しかしながら、ＺＦＮ：ＤＮＡ接触面の他の場所にある重要な相互作用を破壊するさらなる突然変異では、結合エネルギーが切断閾値に達しない結果になる。

【図19】ＴＡＬヌクレアーゼの特異性のプロファイリングを示す図である。選択１：ＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋ１の切断ドメインとの間の＋２８アミノ酸リンカー対＋６３アミノ酸リンカー。

【図20】ＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインおよびＲＶＤの構造を示す図である。

【図21】ＴＡＬＮ選択からの標的部位の突然変異を示す図である。＋２８リンカーは突然変異がより少ない切断配列を濃縮し、＋２８リンカーがより特異的であることが示唆される。プレ選択ライブラリー配列に比較して、ポスト選択配列は突然変異が顕著に少なく、選択が成功したことが示される。

【図22】以前のＴＡＬＮ選択の左ハーフサイトと右ハーフサイトとの間の全標的部位での突然変異の濃縮を示す図である。ハーフサイトの突然変異の数と濃縮との間の比較的規則的な（対数的な関係）傾向は、塩基対を結合する１つの反復結合が他の反復結合に左右されないことと一致している。

【図23】ＤＮＡスペーサーの長さに対するＴＡＬＮ切断の依存性を示す図である。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択における切断部位スペーサーの長さについての選択性は、以前の研究と比較して同様である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＡＬＮ切断。リンカーの長さおよびスペーサーの長さに対する依存性。Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ（２０１１）による。

【図24】個々の塩基での特異性スコアを示す図である。

【図25】個々の塩基での特異性スコアを示す図である。個々それぞれの位置で特異性は様々であり、再度、＋２８リンカーが顕著により優れた特異性を示す。

【図26】ＴＡＬＮ分析の特異性における差が補償されることを示す図である。

【図27】Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮの特異性の差が補償されることを示す図である。切断部位における１つの突然変異は、他の突然変異の分布を変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。

【図28】ＴＡＬＮの特異性のプロファイリングを示す図である。選択ＩＩ：種々のＴＡＬＮの長さ。

【図29】共通標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。

【図30】プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の分布を示す図である。

【図31】プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の分布を示す図である。

【図32】ＴＡＬＮ対の右ハーフサイトと左ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。

【図33】ＴＡＬＮ対の右ハーフサイトと左ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。

【図34】Ｌ１０ Ｒ１０ ＴＡＬＮ対について、プレ選択ライブラリーに対する、ＴＡＬＮ消化の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。

【図35】ＤＮＡスペーサーのプロファイルを示す図である。大多数の配列にはスペーサー選択性があるが、スペーサーの長さを変化させる代替のフレームから予想されるように、高度に突然変異した配列には顕著なスペーサー選択性がない。

【図36】切断点プロファイルを示す図である。大多数の配列が、予想されるようにスペーサー内で切断される一方、Ｒ１６ Ｌ１６の高度に突然変異した配列は、スペーサー内で優位に切断されることはないが、Ｌ１０ Ｒ１０の高度に突然変異した配列は、スペーサー内で切断され、これはフレームシフトした結合部位が生産的なスペーサー切断をもたらすことをおそらく示している。

【図37】Ｌ１０ Ｒ１０ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。目的のフレームの外側にあるフレームにおける多くの潜在的な結合部位には、目的の標的に類似性が高い部位がある。

【図38】フレームシフトした結合部位について編集された、ＴＡＬＮ対の左ハーフサイトと右ハーフサイトとの間の全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。

【図39】Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。

【図40】Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮ対における高度に突然変異したハーフサイトを示す図である。Ｌ１６ Ｒ１６からの高度に突然変異した配列は、フレームシフト（左図）によって説明することができず、ＤＮＡスペーサー選択性がなく（スライド１１を参照のこと）、またＤＮＡスペーサーの外側で切断されることが多いように見える（右図）。これは、おそらく、ＴＡＬドメイン結合標的部位ＤＮＡとは無関係なホモ二量体切断（ヘテロ二量体と一緒のことも）またはヘテロ二量体切断（すなわち、Ｆｏｋ１切断ドメインを介する二量体形成）を示す。

【図41】ＴＡＬＮ対の特異性スコアのヒートマップを示す図である。

【図42】Ｌ１６ Ｒ１６ ＴＡＬＮの特異性における差の補償を示す図である。切断部位の１つの突然変異が他の突然変異の分布を変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。

【図43】ＴＡＬＮ対の完全な全標的部位における突然変異の濃縮を示す図である。濃縮は、突然変異が少ない範囲では同様の対数的勾配を示すように見え、ＴＡＬＮが認識する１６ｂｐを含有する選択は例外的であるように見えるが、これは、Ｒ１６結合が一部の極めて少数の突然変異部位を飽和している可能性を示す（ａｋａ Ｒ１６＆Ｌ１６は、野生型部位に対するＫｄに近いかそれより上であった）。

【図44】ヒトゲノムにおけるＴＡＬＮオフターゲット部位を示す図である。

【図45】ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。

【図46】検出限界を下回る、実際に突然変異した標的部位に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。

【図47】検出限界を下回る、実際に突然変異した標的部位に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断を示す図である。

【図48】配列に関して、ＴＡＬＮオフターゲット部位予測切断（突然変異の数だけでなく）を示す図である。全ターゲット部位突然変異の増加に伴う、切断効率（濃縮）の規則的な対数的低下と、各位置における濃縮とを組み合わせれば、任意の配列のオフサイト切断部位を予測することができるであろう。

【図49】ＴＡＬＮとＺＦＮとの比較を示す図である。大体において、ＴＡＬＮ選択では、濃縮は両方のハーフサイトにおける突然変異の合計に依存し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の場合のようにハーフサイト間の突然変異の分布に依存することはない。この観察を、ＺＦＮの文脈に依存した結合と組み合わせると、ＺＦＮの特異性は、そのＴＡＬ等価物よりもはるかに低下したものになる。

【発明を実施するための形態】

【0018】

定義
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に明示されない限り、単数および複数への言及を含む。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つの薬剤および複数のそのような薬剤を含む。

【0019】

用語「コンカテマー」は、核酸分子の文脈において本明細書で使用する場合、連続して連結した、同じＤＮＡ配列の複数コピーを含有する核酸分子を指す。例えば、特定のヌクレオチド配列を１０コピー含むコンカテマー（例えば、［ＸＹＺ］_１０）は、連続して互いに連結した同じ特定配列を１０コピー、例えば、５’−ＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺ−３’として含むことになる。コンカテマーは、反復単位または反復配列の任意の数のコピー、例えば、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１００コピー、少なくとも１０００コピー等を含むことができる。ヌクレアーゼ標的部位と一定の挿入配列とを含む核酸配列のコンカテマーの一例は、［（標的部位）−（一定の挿入配列）］_３００である。コンカテマーは、線状の核酸分子であっても環状であってもよい。

【0020】

用語「コンジュゲートしている」、「コンジュゲートされた」、および「コンジュゲーション」は、２つの実体、例えば、２つのタンパク質、２つのドメイン（例えば、結合ドメインと切断ドメイン）、またはタンパク質と薬剤（例えばタンパク質ドメインと小分子）などの２つの分子の結合を指す。この結合は、例えば、直接的または間接的な（例えば、リンカーを介する）共有結合であることも、非共有結合的相互作用であることもある。一部の実施形態では、この結合は共有結合である。一部の実施形態では、２つの分子が両方の分子を連結するリンカーを介してコンジュゲートする。例えば、２つのタンパク質、例えば、操作されたヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインとを、互いにコンジュゲートして、タンパク質融合体を形成させる一部の実施形態では、２つのタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、一方のタンパク質のＣ末端を他方のタンパク質のＮ末端に結合するアミノ酸配列、を介してコンジュゲートさせることができる。

【0021】

核酸配列の文脈において本明細書で使用する場合、用語「コンセンサス配列」は、複数の類似配列の各位置で最も頻度高く見出されるヌクレオチド残基を表す計算上の配列を指す。典型的には、コンセンサス配列は、類似配列を互いに比較し、類似配列モチーフを評価する配列アラインメントにより決定される。ヌクレアーゼ標的部位配列の文脈では、ヌクレアーゼ標的部位のコンセンサス配列は、一部の実施形態では、所与のヌクレアーゼにより、最も頻度高く結合される配列であっても、最も高い親和性で結合される配列であってもよい。

【0022】

用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、所望の生物反応を誘発するのに十分な生理活性物質の量を指す。例えば、一部の実施形態では、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼが特異的に結合して切断する標的部位の切断を誘導するのに十分なヌクレアーゼの量を指すことができる。当業者が認識するように、薬剤、例えばヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば、所望の生物反応、特定の対立遺伝子、ゲノム、標的部位、細胞、または標的組織、および使用する薬剤のような種々の因子に依存して異なり得る。

【0023】

用語「エンジイン」は、本明細書で使用する場合、二重結合により分離された２つの三重結合を含有する９員環および１０員環のいずれかを特徴とする細菌性天然物のクラスを指す（例えば、Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ；Ａ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ；Ｅ．Ｗ．Ｙｕｅ（１９９３）．“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ”．ＰＮＡＳ ９０（１３）：５８８１−５８８８を参照のこと；この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。一部のエンジインは、Ｂｅｒｇｍａｎ環化を受けることができ、その結果生じるジラジカルである１，４−デヒドロベンゼン誘導体は、ＤＮＡの糖骨格から水素原子を引き抜き、ＤＮＡ鎖切断をもたらすことができる（例えば、Ｓ．Ｗａｌｋｅｒ；Ｒ．Ｌａｎｄｏｖｉｔｚ；Ｗ．Ｄ．Ｄｉｎｇ；Ｇ．Ａ．Ｅｌｌｅｓｔａｄ；Ｄ．Ｋａｈｎｅ（１９９２）．“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａ １ ａｎｄ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ Ｔ”．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１０）：４６０８−１２を参照のこと；この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡとのエンジインの反応性は、多くのエンジインに抗生物質的特性を付与し、一部のエンジインは、抗癌抗生物質として臨床試験されている。エンジインの非限定例として、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシンがある（例えば、Ａｄｒｉａｎ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｂｉｃｏｌａｏｕ，“Ｔｈｅ Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，３９（１１），ｐｐ２１０３−２１１７；およびＤｏｎａｌｄ Ｂｏｒｄｅｒｓ，“Ｅｎｅｄｉｙｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ，”Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１^ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２３，１９９４，ＩＳＢＮ−１０：０８２４７８９３８５を参照のこと；これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0024】

用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、イントロンまたはインテインにより通常コードされる一種の制限酵素を指す、Ｅｄｇｅｌｌ ＤＲ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９）．“Ｓｅｌｆｉｓｈ ＤＮＡ：ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｉｎｄ ａ ｈｏｍｅ”．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９（３）：Ｒ１１５−Ｒ１１７；Ｊａｓｉｎ Ｍ（Ｊｕｎ １９９６）．“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｏｎｔｈ ｗｉｔｈ ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２（６）：２２４−８；Ｂｕｒｔ Ａ，Ｋｏｕｆｏｐａｎｏｕ Ｖ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００４）．“Ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ：ｔｈｅ ｒｉｓｅ ａｎｄ ｆａｌｌ ａｎｄ ｒｉｓｅ ａｇａｉｎ ｏｆ ａ ｓｅｌｆｉｓｈ ｅｌｅｍｅｎｔ”．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １４（６）：６０９−１５；これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。ホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列は、極めて低い確率でのみ無作為に生じるほど十分に長く（７×１０^１０ｂｐごとに約１つ）、通常、１ゲノム当たりわずか１つの実例が見つかるだけである。

【0025】

用語「ライブラリー」は、核酸またはタンパク質の文脈において本明細書で使用する場合、それぞれ、２つ以上の異なる核酸またはタンパク質の集団を指す。例えば、ヌクレアーゼ標的部位のライブラリーは、異なるヌクレアーゼ標的部位を含む少なくとも２つの核酸分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０^１、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、または少なくとも１０^１５の異なる核酸またはタンパク質を含む。一部の実施形態では、ライブラリーのメンバーは、無作為化された配列、例えば、完全にまたは部分的に無作為化された配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、互いに無関係な核酸分子、例えば、完全に無作為化された配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、ライブラリーの少なくとも一部のメンバーは、関連していることがあり、例えば、それらは、コンセンサス標的部位配列などの特定の配列の変異体または派生体であることがある。

【0026】

用語「リンカー」は、本明細書で使用する場合、２つの隣接した分子または部分、例えば、ヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメイン、を連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置するかまたはそれらに挟まれており、共有結合を介して互いに連結して、その２つを連結する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。

【0027】

用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、核酸分子中のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することができる薬剤、例えばタンパク質または小分子を指す。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質、例えば、核酸分子に結合し、核酸分子内のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することができる酵素である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼであっても、ポリヌクレオチド鎖の末端にあるリン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列内の特定のリン酸ジエステル結合に結合し、かつ／またはそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼであり、この特定のヌクレオチド配列は、本明細書では「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」、または「標的部位」とも呼ばれる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、一本鎖の標的部位を認識するが、他の実施形態では、ヌクレアーゼは、二本鎖の標的部位、例えば、二本鎖のＤＮＡ標的部位を認識する。多くの天然のヌクレアーゼ、例えば、多くの天然のＤＮＡ制限ヌクレアーゼの標的部位は、当業者には周知である。多くの場合、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩなどのＤＮＡヌクレアーゼは、長さが４〜１０塩基対のパリンドロームの二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識し、標的部位内の特定の位置で２つのＤＮＡ鎖のそれぞれを切断する。一部のエンドヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を対称的に切断する、すなわち、同じ位置で両方の鎖を切断し、その結果、その末端は塩基対を形成したヌクレオチドを含む。これは、本明細書で平滑末端とも呼ばれる。他のエンドヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を非対称的に切断する、すなわち、異なる位置でそれぞれの鎖を切断し、その結果その末端は対を形成していないヌクレオチドを含む。二本鎖ＤＮＡ分子の末端にある、対を形成していないヌクレオチドは、「オーバーハング」とも呼ばれ、例えば、１つまたは複数の対を形成していないヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’末端か５’末端のいずれを形成するかに応じて、「５’−オーバーハング」または「３’−オーバーハング」と呼ばれる。１つまたは複数の対を形成していないヌクレオチドで終わる二本鎖ＤＮＡ分子の末端は、対を形成していない、１つまたは複数の相補的なヌクレオチドを含む他の二本鎖ＤＮＡ分子の末端「に粘着する」ことができるため、粘着末端とも呼ばれる。ヌクレアーゼタンパク質は、典型的には、このタンパク質と核酸基質との相互作用を媒介し、一部の場合には、さらに標的部位に特異的に結合する「結合ドメイン」と、核酸骨格内のリン酸ジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」とを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体の形態で核酸分子に結合し切断することができるが、他の実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために、二量体または多量体を形成しなければならない。天然ヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、ならびに融合して特定の標的部位に結合するヌクレアーゼを形成することができるモジュール性の結合ドメインおよび切断ドメインが当業者に周知である。例えば、ジンクフィンガーまたは転写活性化因子様エレメントを、所望の標的部位に特異的に結合する結合ドメインとして使用し、切断ドメイン、例えばＦｏｋＩの切断ドメインに融合またはコンジュゲートして、標的部位を切断する操作されたヌクレアーゼを形成させることができる。

【0028】

用語「核酸」および「核酸分子」は、本明細書で使用する場合、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドポリマーを指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は線状分子であり、隣接したヌクレオチドはホスホジエステル結合を介して互いに連結している。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために互換的に使用することができる。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然核酸分子の文脈において、天然であってもよい。一方、核酸分子は、非天然分子、例えば、組換えのＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または非天然のヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含むものであってもよい。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語には、核酸アナログ、すなわちリン酸ジエステル骨格以外を有するアナログが含まれる。核酸は、天然供給源から精製すること、組換え発現系を使用して産生し、場合によっては精製すること、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成された分子の場合には、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖を有するアナログなどのヌクレオシドアナログおよび骨格修飾を含んでもよい。他に指示がない限り、核酸配列は５’から３’方向で提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキノグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）；インターカレートされた塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であるかまたはそれらを含む。

【0029】

用語「医薬組成物」は、本明細書で使用する場合、疾患または障害の治療の文脈において、被験体に投与することができる組成物を指す。一部の実施形態では、医薬組成物は、活性成分、例えばヌクレアーゼ、ヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。

【0030】

用語「増殖性疾患」は、本明細書で使用する場合、細胞または細胞集団が異常に高い増殖速度を示すという点で、細胞または組織ホメオスタシスを撹乱する任意の疾患を指す。増殖性疾患には、新生物発生前の過形成症状および新生物疾患など、過剰増殖性疾患が含まれる。新生物疾患は、異常な細胞増殖を特徴とし、良性および悪性の新生物を含む。悪性新生物は、癌とも呼ばれる。

【0031】

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合により相互に連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質を指しても、タンパク質の集合を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸は、例えば、コンジュゲーション、官能化、または他の修飾等のために、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどの化学成分を付加することによって修飾してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であっても、複数分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然のタンパク質またはペプチドの単に断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組換え体、もしくは合成、またはそれらの任意の組合せであってもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメインと核酸切断ドメインとを含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば、核酸切断剤として作用することができる化合物とを含む。

【0032】

用語「無作為化された」は、核酸配列の文脈において本明細書で使用する場合、遊離ヌクレオチドの混合物、例えば、４つのヌクレオチドであるＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣのすべての混合物を組み込むように合成された配列またはその配列内の残基を指す。無作為化された残基は、通常、ヌクレオチド配列内で文字Ｎによって表す。一部の実施形態では、無作為化された配列または残基は、完全に無作為化されており、その場合には、無作為化された残基は、それぞれの配列残基の合成ステップの間に組み込まれるヌクレオチドを等量（例えば、２５％のＴ、２５％のＡ、２５％のＧ、および２５％のＣ）加えることにより合成される。一部の実施形態では、無作為化された配列または残基は、部分的に無作為化されており、その場合には、無作為化された残基は、それぞれの配列残基の合成ステップの間に組み込まれるヌクレオチドを非等量（例えば、７９％のＴ、７％のＡ、７％のＧ、および７％のＣ）加えることにより合成される。部分的な無作為化は、所与の配列のテンプレートになるが、所望の頻度で突然変異を組み込んだ配列の生成を可能にする。例えば、公知のヌクレアーゼ標的部位を合成テンプレートとして使用する場合、各ステップに、それぞれの残基で表されるヌクレオチドをその合成に７９％で加え、他の３つのヌクレオチドをそれぞれ７％で加える部分的無作為化により、部分的に無作為化された標的部位の混合物が合成されることになり、それは依然として、元の標的部位のコンセンサス配列を表すが、そのように合成された各残基について、２１％の統計的頻度（二項分布）で各残基が元の標的部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された配列は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス配列と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された配列は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。

【0033】

用語「小分子」および「有機化合物」は、本明細書において互換的に使用し、天然であるかまたは人為的に形成させたもの（例えば、化学合成を介して）であるかにかかわらず、比較的低分子量の分子を指す。典型的には、有機化合物は炭素を含有する。有機化合物は、複数の炭素−炭素結合、立体中心、および他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、または複素環）を含有することができる。一部の実施形態では、有機化合物は、単量体であり、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。特定の実施形態では、小分子の分子量は、約１０００ｇ／モル未満または約５００ｇ／モル未満である。特定の実施形態では、小分子は、薬物、例えば、適切な政府機関または規制団体によりヒトまたは動物での使用が安全かつ効果的であるとすでに認められた薬物である。特定の実施形態では、有機分子は、核酸に結合および／切断することが公知である。一部の実施形態では、有機化合物はエンジインである。一部の実施形態では、有機化合物は、抗生物質、例えば、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体などの抗癌抗生物質である。

【0034】

用語「被験体」は、本明細書で使用する場合、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。一部の実施形態では、被験体はヒトである。一部の実施形態では、被験体は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、被験体はげっ歯類である。一部の実施形態では、被験体は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。一部の実施形態では、被験体は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。

【0035】

用語「標的核酸」および「標的ゲノム」は、ヌクレアーゼの文脈において本明細書で使用する場合、所与のヌクレアーゼの少なくとも１つの標的部位を含む、それぞれ核酸分子またはゲノムを指す。

【0036】

用語「ヌクレアーゼ標的部位」と本明細書で互換的に使用する用語「標的部位」は、ヌクレアーゼが結合および切断する核酸分子内の配列を指す。標的部位は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二量体を形成するヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼの文脈では、標的部位は、典型的には、左ハーフサイト（ヌクレアーゼの一方の単量体が結合する）、右ハーフサイト（ヌクレアーゼの他方の単量体が結合する）、および切断がなされる、ハーフサイト間のスペーサー配列を含む。この構造（［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］）は、本明細書ではＬＳＲ構造と呼ばれる。一部の実施形態では、左ハーフサイトおよび／または右ハーフサイトは、１０〜１８ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、ハーフサイトのいずれかまたは両方がより短いかまたはより長い。一部の実施形態では、左ハーフサイトと右ハーフサイトは異なる核酸配列を含む。

【0037】

用語「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ結合ドメインを含む細菌タンパク質を指し、これは、高度に可変な２つのアミノ酸モチーフ（反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）、ＲＶＤ）を含む、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含有する。ＲＶＤモチーフは、核酸配列への結合特異性を決定し、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように、当業者に周知の方法によって操作することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｅｆｆｒｅｙ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４３−８；Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４９−５３；Ｇｅｉβｌｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｈ．；Ｈａｈｎ，Ｓ．；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ，Ｊ．；Ｂｏｎａｓ，Ｕ．；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．（２０１１），Ｓｈｉｕ，Ｓｈｉｎ−Ｈａｎ．ｅｄ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９５０９；Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“ＴＡＬＥｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１３５−６；Ｂｏｃｈ，Ｊｅｎｓ；ｅｔ．ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９）．“Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｄｅ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡＬ−Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９−１２；およびＭｏｓｃｏｕ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｊ．； Ａｄａｍ Ｊ．Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９）．“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｉｐｈｅｒ Ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１を参照のこと；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間に簡単な関係があるため、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組合せを選択することにより、特定のＤＮＡ結合ドメインの操作が可能になっている。

【0038】

用語「転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ切断ドメイン、例えばＦｏｋＩドメインに加えて転写活性化因子様エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人為的なヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥ構築物を作製するためのいくつかのモジュール構築スキームが報告されている（Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４９−５３；Ｇｅｉβｌｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｈ．；Ｈａｈｎ，Ｓ．；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ，Ｊ．；Ｂｏｎａｓ，Ｕ．；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．（２０１１），Ｓｈｉｕ，Ｓｈｉｎ−Ｈａｎ．ｅｄ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９５０９；Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．；Ｄｏｙｌｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．；Ｂａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，Ｒ．；Ｅｌｓａｅｓｓｅｒ，Ｊ．；Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｊ．；Ｌａｈａｙｅ，Ｔ．（２０１１）．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥ−ｔｙｐｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｌｉ，Ｔ．；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ａ．；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．；Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ｈ．；Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１１）．“Ｍｏｄｕｌａｒｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｅ．；Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．；Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．（２０１１）．Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ．ｅｄ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｂｙ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９７２２；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0039】

用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、本明細書に記載するように、疾患もしく障害、またはその１つもしくは複数の症候の反転、緩和、発症の遅延、もしくは進行の抑制を目的とした臨床的介入を指す。本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」、および「治療すること」は、本明細書に記載するように、疾患もしく障害、またはその１つもしくは複数の症候の反転、緩和、発症の遅延、もしくは進行の抑制を目的とした臨床的介入を指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症候が発症した後に、かつ／または疾患が診断された後に実施してもよい。他の実施形態では、治療は、例えば、症候の発症を防止もしくは遅延させるために、または疾患の発症もしくは進行を抑制するために、症候のない状態で実施してもよい。例えば、治療は、症候の発症前に、罹患しやすい個体に（例えば、症候履歴に照らして、かつ／または遺伝的因子もしくは他の感受性因子に照らして）実施してもよい。治療はまた、症候が消散した後に、例えば、再発を防止または遅延させるために継続することができる。

【0040】

用語「ジンクフィンガー」は、本明細書で使用する場合、折り畳みおよびその折り畳みを安定化する１つまたは複数の亜鉛イオンの配位を特徴とする、小さな核酸結合タンパク質構造モチーフを指す。ジンクフィンガーは、多種多様の異なるタンパク質構造を包含する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｇ Ａ，Ｒｈｏｄｅｓ Ｄ（１９８７）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２：４７３−８２を参照のこと）。特定のヌクレオチド配列に結合するように、ジンクフィンガーを設計することができ、また所望の任意の標的配列に実際に結合するように、一連のジンクフィンガーの融合物を含むジンクフィンガーアレイを設計することができる。そのようなジンクフィンガーアレイを、例えば核酸切断ドメインにコンジュゲートすれば、タンパク質、例えばヌクレアーゼの結合ドメインを形成することができる。異なるタイプのジンクフィンガーモチーフが当業者に公知であり、それには、これらに限定されないが、Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２、Ｇａｇ ｋｎｕｃｋｌｅ、Ｔｒｅｂｌｅ ｃｌｅｆ、亜鉛リボン、Ｚｎ_２／Ｃｙｓ_６、およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフが含まれる（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａ ＳＳ，Ｍａｊｕｍｄａｒ Ｉ，Ｇｒｉｓｈｉｎ ＮＶ（Ｊａｎｕａｒｙ ２００３）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ｓｕｒｖｅｙ ａｎｄ ｓｕｍｍａｒｙ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（２）：５３２−５０を参照のこと）。典型的には、単一ジンクフィンガーモチーフは、核酸分子の３または４ヌクレオチドに結合する。したがって、２つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、６〜８ヌクレオチドに結合することができ、３つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、９〜１２ヌクレオチドに結合することができ、４つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、１２〜１６ヌクレオチドに結合することができる等がある。ジンクフィンガーのＤＮＡ結合特異性を変更するために、かつ／または長さが３〜３０ヌクレオチドの所望の任意の標的配列に実際に結合するような新規のジンクフィンガー融合物を設計するために、任意の適切なタンパク質工学手法を使用することができる（例えば、Ｐａｂｏ ＣＯ，Ｐｅｉｓａｃｈ Ｅ，Ｇｒａｎｔ ＲＡ（２００１）．“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０：３１３−３４０；Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＡＣ，Ｍｉｌｌｅｒ ＪＣ，Ｐａｂｏ ＣＯ（２００３）．“Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（５）：３６１−３６８；およびＬｉｕ Ｑ，Ｓｅｇａｌ ＤＪ，Ｇｈｉａｒａ ＪＢ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（Ｍａｙ １９９７）．“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｕｎｉｑｕｅ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１１）を参照のこと；これらそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断するタンパク質ドメインとの間を融合して、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を生成することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、核酸分子内の特定の標的部位に結合するジンクフィンガードメインと、結合ドメインが結合した標的部位内またはその近傍の核酸分子を切断する核酸切断ドメインとを含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３〜６個の間の個々のジンクフィンガーモチーフを有し、長さが９塩基対〜１８塩基対の範囲にある標的部位に結合する結合ドメインを含む。より長い標的部位は、所与のゲノムにユニークな標的部位に結合し切断することが望ましい状況では特に魅力的である。

【0041】

用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを指す。一部の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ型制限酵素ＦｏｋＩの切断ドメインである。切断する所与の核酸分子中の任意の所望の配列を実際に標的にするように、ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することができ、設計のジンクフィンガー結合ドメインが複雑なゲノムの文脈においてユニークな部位に結合する可能性があれば、例えば、治療価値のある標的ゲノム改変を達成するような、生細胞中の単一ゲノム部位の標的切断が可能になる。所望のゲノム遺伝子座に対する二本鎖切断のターゲティングは、非相同ＤＮＡ修復経路の誤りがちな性質のため、遺伝子のコード配列にフレームシフト突然変異を導入するように使用することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に周知の方法により目的の部位を標的にするように作製することができる。例えば、所望の特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、特異性の知られた個々のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることにより設計することができる。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の構造が、この分野の研究の多くに伝えられ、６４通りの可能な塩基対トリプレットのそれぞれに対するジンクフィンガーを得て、次いでこれらのジンクフィンガーモジュールを混合し、マッチさせて、所望の任意の配列特異性を有するタンパク質を設計するという概念が記載された（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ ＮＰ，Ｐａｂｏ ＣＯ（Ｍａｙ １９９１）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ−ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．１ Ａ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５００７）：８０９−１７、この内容全体は、本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、３塩基対ＤＮＡ配列をそれぞれ認識する別々のジンクフィンガーを組み合わせて、長さが９塩基対〜１８塩基対の範囲にある標的部位を認識する３−、４−、５−、または６−フィンガーアレイを作製する。一部の実施形態では、より長いアレイを企図する。他の実施形態では、６〜８ヌクレオチドを認識する２−フィンガーモジュールを組み合わせて、４−、６−、または８−ジンクフィンガーアレイを作製する。一部の実施形態では、細菌またはファージのディスプレイを使用して、所望の核酸配列、例えば、長さが３〜３０ｂｐの所望のヌクレアーゼ標的部位を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、一部の実施形態では、リンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して互いに融合した、またはそうでなければコンジュゲートしたジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインが結合する核酸配列から切断箇所までの距離を決定する。短いリンカーを使用すると、切断ドメインは、結合核酸配列に近い核酸を切断することになり、一方、長いリンカーでは、切断と結合との核酸配列間の距離が大きくなる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合した核酸を切断するために二量体を形成しなければならない。一部のそのような実施形態では、二量体は、それぞれが異なるジンクフィンガー結合ドメインを含む２つの単量体のヘテロ二量体である。例えば、一部の実施形態では、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＡを含む１つの単量体と、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＢを含む１つの単量体とを含むことができる。この非限定例では、ジンクフィンガードメインＡは、標的部位の一方の側にある核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインＢは、標的部位の反対側にある核酸配列に結合し、二量体形成したＦｏｋＩドメインは、ジンクフィンガードメイン結合部位の間にある核酸を切断する。

【0042】

本発明の特定の実施形態の詳細な説明
緒言
部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノムの標的改変のための強力なツールである。一部の部位特異的ヌクレアーゼは、理論的には、他のいかなるゲノム部位にも影響を及ぼすことなく、切断のための、ゲノム中の単一のユニーク部位を標的にすることを可能にする、標的切断部位に対する特異性レベルを達成することができる。生細胞におけるヌクレアーゼ切断は、切断され修復されたゲノム配列の改変をもたらすことが多い、例えば相同組換えを介するＤＮＡ修復機序を誘発することが報告されている。したがって、ゲノム内の特定のユニーク配列の標的切断により、多くのヒト体細胞または胚性幹細胞など、従来の遺伝子ターゲティング法により操作することが困難である細胞を含む生細胞における遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変のための新しい手段が開かれる。疾患関連配列、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者のＣＣＲ−５対立遺伝子、または腫瘍血管新生に必要な遺伝子のヌクレアーゼ媒介の改変は、臨床的文脈において使用することが可能であり、現在、２つの部位特異的ヌクレアーゼが臨床試験中である。

【0043】

部位特異的ヌクレアーゼを媒介とする改変の分野で重要な一側面は、オフターゲットヌクレアーゼ効果、例えば、目的の標的配列と１つまたは複数のヌクレオチドが異なるゲノム配列の切断である。オフターゲット切断の望ましくない副作用の範囲としては、遺伝子ターゲティング事象の間の望まれない遺伝子座への挿入から臨床的シナリオにおける重度の合併症まである。被験体に投与されたヌクレアーゼによる、必須遺伝子機能または癌抑制遺伝子をコードする配列のオフターゲット切断は、被験体に疾患または死さえもたらす可能性がある。したがって、ヌクレアーゼの有効性および安全性を決定するために、実験室または病院でそれを使用する前に、その切断選択性を特徴づけることが望ましい。さらに、ヌクレアーゼ切断特性の特徴づけにより、一群の候補ヌクレアーゼから特定の課題に最も適したヌクレアーゼを選択すること、または既存のヌクレアーゼから得られる放出産物を選択することが可能になる。また、ヌクレアーゼ切断特性のそのような特徴づけにより、向上した特異性または有効性などの向上した特性を有するヌクレアーゼの新規設計がもたらされ得る。

【0044】

ヌクレアーゼが核酸の標的操作のために使用される多くのシナリオでは、切断特異性が重要な特徴になる。操作されたヌクレアーゼ結合ドメインの一部の不完全な特異性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、オフターゲット切断および望ましくない作用をもたらす可能性がある。ＥＬＩＳＡアッセイ、マイクロアレイ、ワンハイブリッドシステム、ＳＥＬＥＸおよびその変形、ならびにＲｏｓｅｔｔａベースの計算予測を含む、部位特異的ヌクレアーゼの特異性を評価する現行の方法はすべて、ヌクレアーゼ分子の結合特異性がその切断特異性に等価または比例しているという仮定を前提としている。

【0045】

しかしながら、ここに提示した研究は、オフターゲット結合作用の予測が、望ましくない生物学的作用をもたらし得るヌクレアーゼ切断作用の不完全な近似を与えるという発見に基づいている。この発見は、一部の部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼに関して報告された毒性が、単にオフターゲット結合によるのではなく、オフターゲットＤＮＡ切断に起因するという考えと一致する。

【0046】

本明細書に提供する方法および試薬は、所与のヌクレアーゼの標的部位特異性の正確な評価を可能にし、適切なユニークな標的部位の選択および複雑なゲノムの文脈において、単一部位の標的切断に対して高度に特異的なヌクレアーゼの設計のための戦略を提供する。さらに、本明細書に提供する方法、試薬、および戦略により、当業者が所与の任意の部位特異的ヌクレアーゼの特異性を向上させ、かつオフターゲット作用を最小化させることが可能になる。一方、ＤＮＡおよびＤＮＡ切断ヌクレアーゼに具体的に関連して、本明細書に提供する発明概念、方法、戦略、および試薬は、この点において限定されないが、任意の核酸：ヌクレアーゼ対に適用することができる。

【0047】

部位特異的ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位の同定
本発明の一部の態様は、任意の部位特異的ヌクレアーゼにより切断された核酸標的部位を決定するための方法および試薬を提供する。一般に、そのような方法は、ヌクレアーゼが標的部位に結合し切断するのに適した条件下で所与のヌクレアーゼと標的部位のライブラリーとを接触させるステップと、ヌクレアーゼが実際に切断する標的部位を決定するステップとを含む。実際の切断に基づいた、ヌクレアーゼの標的部位プロファイルの決定は、部位特異的ヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット作用の媒介に関連するパラメーターを測定するという、結合に基づく方法にまさる利点を有する。

【0048】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼの標的部位を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）二本鎖核酸の標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、標的部位が［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］（ＬＳＲ）構造を含み、ヌクレアーゼがスペーサー配列内の標的部位を切断するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｂ）ヌクレアーゼがヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーにヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｃ）ヌクレアーゼにより２回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の５’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、ヌクレアーゼを準備するステップと、そのヌクレアーゼを、候補標的部位を含む候補核酸分子のライブラリーと接触させるステップとを含む。一部の実施形態では、候補核酸分子は二本鎖核酸分子である。一部の実施形態では、候補核酸分子はＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは標的部位で二量体を形成し、標的部位はＬＳＲ構造（［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］）を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、スペーサー配列内の標的部位を切断する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、二本鎖の核酸標的部位を切断し、５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ライブラリー中の各核酸分子は、候補ヌクレアーゼ標的部位と一定の挿入配列とを含む配列のコンカテマーを含む。

【0049】

例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、構造Ｒ_１−［（ＬＳＲ）−（定常領域）］_Ｘ−Ｒ_２を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、［（ＬＳＲ）−（定常領域）］反復単位の断片を含み得る核酸配列であり、Ｘは２とｙとの間の整数である。一部の実施形態では、ｙは、少なくとも１０^１、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、または少なくとも１０^１５である。一部の実施形態では、ｙは、１０^２未満、１０^３未満、１０^４未満、１０^５未満、１０^６未満、１０^７未満、１０^８未満、１０^９未満、１０^１０未満、１０^１１未満、１０^１２未満、１０^１３未満、１０^１４未満、または１０^１５未満である。定常領域は、一部の実施形態では、単一反復単位の効率的な自己連結反応を可能にする長さである。適切な長さは当業者には明らかである。例えば、一部の実施形態では、定常領域の長さは、１００〜１０００塩基対の間であり、例えば、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約４５０塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対であり、一部の実施形態では、定常領域は、約１００塩基対よりも短いか、または約１０００塩基対よりも長い。

【0050】

ヌクレアーゼとライブラリー核酸とのインキュベーションにより、ヌクレアーゼが結合し切断することができる標的部位を含む、ライブラリー中のコンカテマーが切断されることになる。所与のヌクレアーゼが特異的な標的部位を高効率に切断する場合、標的部位を含むコンカテマーは、複数回切断されて、単一の反復単位を含む断片が生成することになる。ヌクレアーゼ切断によりコンカテマーから放出された反復単位は、構造Ｓ_２Ｒ−（定常領域）−ＬＳ_１になる。式中、Ｓ_１およびＳ_２は、ヌクレアーゼにより切断された後の相補的なスペーサー領域断片を表す。次いで、ライブラリー候補分子から放出された任意の反復単位を単離することができ、かつ／または放出された反復単位のＳ_２ＲおよびＬＳ_１領域をシークエンシングすることにより、ヌクレアーゼにより切断されたＬＳＲの配列を同定することができる。

【0051】

反復単位の単離およびシークエンシングに適した任意の方法を使用して、ヌクレアーゼにより切断されたＬＳＲ配列を解明することができる。例えば、定常領域の長さが既知であるので、放出された個々の反復単位を、より大きな未切断ライブラリー核酸分子および複数の反復単位を含むライブラリー核酸分子の断片（ヌクレアーゼによる非効率的な標的切断を示す）から、そのサイズに基づいて分離することができる。サイズに基づいて核酸分子を分離および／または単離するのに適した方法は、当業者には周知であり、例えば、ゲル電気泳動法、密度勾配遠心分離法、および適切な分子カットオフ値を有する半透膜上の透析などのサイズ分画法が挙げられる。次いで、分離／単離した核酸分子は、例えば、切断末端にＰＣＲおよび／またはシークエンシングのアダプターを連結し、かつそれぞれの核酸を増幅および／またはシークエンシングすることにより、さらに特徴づけることができる。さらに、定常領域の長さが、放出された個々の反復単位の自己連結反応が容易になるように選択されている場合、そのような放出された個々の反復単位は、ヌクレアーゼで処理されたライブラリー分子をリガーゼと接触させ、次いで、自己連結した個々の反復単位の環状特性に基づいて増幅および／またはシークエンシングすることにより濃縮することができる。

【0052】

標的核酸の切断の結果として５’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを使用する一部の実施形態では、切断された核酸分子の５’オーバーハングを充填する。５’オーバーハングを充填するための方法は当業者に周知であり、例えば、エキソヌクレアーゼ活性（Ｋｌｅｎｏｗ（３’→５’エキソ−））を欠くＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片を使用する方法が挙げられる。５’オーバーハングの充填により、陥凹鎖のオーバーハングをテンプレートとした伸張が起こり、次いで平滑末端が得られる。ライブラリーコンカテマーから放出された単一反復単位の場合には、得られる構造は、平滑末端のＳ_２’Ｒ−（定常領域）−ＬＳ_１’であり、Ｓ_１’およびＳ_２’が平滑末端を含む。次いで、ＰＣＲおよび／またはシークエンシングのアダプターを、平滑末端連結反応により末端に付加することができ、それぞれの反復単位（Ｓ_２’ＲおよびＬＳ_１’領域を含む）を配列決定することができる。配列データから、元のＬＳＲ領域を推定することができる。ヌクレアーゼ切断過程の間に生成したオーバーハングの平滑末端化はまた、それぞれのヌクレアーゼにより適切に切断された標的部位と、例えば、物理的な剪断などの非ヌクレアーゼ作用に基づいて非特異的に切断された標的部位との間の識別を可能にする。正確に切断されたヌクレアーゼ標的部位は、オーバーハングの充填の結果としてオーバーハングヌクレオチドの重複を含む、相補的なＳ_２’ＲおよびＬＳ_１’領域の存在により認識することができるが、それぞれのヌクレアーゼにより切断されなかった標的部位は、オーバーハングヌクレオチドの重複を含まないと考えられる。一部の実施形態では、この方法は、放出された個々の反復単位の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および／またはスペーサー配列の配列を決定することにより、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップを含む。それぞれのヌクレアーゼにより切断された標的部位のＬＳＲ配列を同定するために、増幅および／またはシークエンシングのための任意の適切な方法を使用することができる。核酸分子の増幅および／またはシークエンシングのための方法は当業者に周知であり、本発明はこの点において限定されない。

【0053】

本明細書に提供する方法および戦略の一部は、所与の任意のヌクレアーゼに対する可能な切断標的として複数の候補標的部位を同時に評価することを可能にする。したがって、そのような方法から得られたデータを使用して、所与のヌクレアーゼにより切断された標的部位のリストを編集することができ、これは、本明細書において標的部位プロファイルとも呼ばれる。定量的なシークエンシングデータの生成を可能にするシークエンシング法を使用する場合、それぞれのヌクレアーゼにより切断される、任意のヌクレアーゼ標的部位の検出された相対存在量を記録することも可能である。ヌクレアーゼがより効率的に切断する標的部位は、シークエンシングステップにおいてより頻度高く検出されることになるが、効率的に切断されない標的部位では、候補コンカテマーから個々の反復単位が放出されることはほとんどなく、したがって、何らかのシークエンシングリードがあっても、この標的部位が生成することはほとんどないであろう。このような定量的シークエンシングデータを標的部位プロファイルに統合して、高度に好まれるヌクレアーゼ標的部位およびあまり好まれないヌクレアーゼ標的部位のランク付けされたリストを作成することができる。

【0054】

本明細書に提供する、ヌクレアーゼ標的部位プロファイリングの方法および戦略は、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む、任意の部位特異的ヌクレアーゼに適用することができる。本明細書に詳細に記載するように、ヌクレアーゼ特異性は、通常は、ヌクレアーゼ濃度の増加と共に低下し、本明細書に記載の方法は、所与のヌクレアーゼがその目的の標的部位を効率的に切断するが、いかなるオフターゲット配列も効率的に切断することがない濃度を決定するために使用することができる。一部の実施形態では、目的のヌクレアーゼ標的部位を切断するが、１０を超える、５を超える、４を超える、３を超える、２を超える、１を超える、またはいかなる新たなヌクレアーゼ標的部位も切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定する。一部の実施形態では、治療用ヌクレアーゼは、上記に記載のように決定された最大濃度以下の最終濃度が生じるのに有効な量で、被験体に投与される。

【0055】

ヌクレアーゼ標的部位ライブラリー
本発明の一部の実施形態は、ヌクレアーゼ標的部位プロファイリングのための核酸分子ライブラリーを提供する。一部の実施形態では、そのようなライブラリーは複数の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含む。例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、構造Ｒ_１−［（ＬＳＲ）−（定常領域）］_Ｘ−Ｒ_２を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、［（ＬＳＲ）−（定常領域）］反復単位の断片を含み得る核酸配列であり、Ｘは２とｙとの間の整数である。一部の実施形態では、ｙは、少なくとも１０^１、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、少なくとも１０^１２、少なくとも１０^１３、少なくとも１０^１４、または少なくとも１０^１５である。一部の実施形態では、ｙは、１０^２未満、１０^３未満、１０^４未満、１０^５未満、１０^６未満、１０^７未満、１０^８未満、１０^９未満、１０^１０未満、１０^１１未満、１０^１２未満、１０^１３未満、１０^１４未満、または１０^１５未満である。定常領域は、一部の実施形態では、単一反復単位の効率的な自己連結反応を可能にする長さである。一部の実施形態では、定常領域は、２つ以上の反復単位を含む断片から単一反復単位を効率的に分離することを可能にする長さである。一部の実施形態では、その集合物は、１つのシークエンシングリードでの完全な反復単位の効率的なシークエンシングを可能にする長さを超えている。適切な長さは当業者には明らかである。例えば、一部の実施形態では、定常領域の長さは、１００〜１０００塩基対の間であり、例えば、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約４５０塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対であり、一部の実施形態では、定常領域は、約１００塩基対よりも短いか、または約１０００塩基対よりも長い。

【0056】

ＬＳＲ部位は、典型的には、［左ハーフサイト］−［スペーサー配列］−［右ハーフサイト］構造を含む。ハーフサイトおよびスペーサー配列の長さは、評価する特定のヌクレアーゼに依存することになる。一般に、ハーフサイトは６〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１０〜１８ヌクレオチド長である。例えば、各ハーフサイトは個々に、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、ＬＳＲ部位は、３０ヌクレオチドよりも長くてもよい。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、同じ長さである。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、異なる長さである。一部の実施形態では、ＬＳＲの左ハーフサイトと右ハーフサイトは、異なる配列である。一部の実施形態では、ＦｏｋＩ切断ドメイン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および／またはブレオマイシンにより切断され得るＬＳＲを含む候補核酸を含むライブラリーを提供する。

【0057】

一部の実施形態では、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１、または少なくとも１０^１２の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む候補核酸分子のライブラリーを提供する。一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、ローリングサイクル増幅によって、環状化されたテンプレートから産生されるコンカテマーである。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも６ｋＤａ、少なくとも７ｋＤａ、少なくとも８ｋＤａ、少なくとも９ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも１２ｋＤａ、または少なくとも１５ｋＤａの分子量の核酸分子、例えば、コンカテマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリー内の核酸分子の分子量は、１５ｋＤａより大きくてもよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、特定のサイズ範囲、例えば、５〜７ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、８〜１２ｋＤａ、１０〜１５ｋＤａ、もしくは１２〜１５ｋＤａ、もしくは５〜１０ｋＤａ、または任意の可能な部分範囲の範囲内にある核酸分子を含む。本発明の一部の態様による、核酸コンカテマーの生成に適した一部の方法が、大幅に異なる分子量の核酸分子の生成をもたらすが、核酸分子のそのような混合物は、所望のサイズ分布を得るためにサイズ分画することができる。所望のサイズの核酸分子の濃縮または所望のサイズの核酸分子の排除に適した方法は、当業者に周知であり、本発明は、この点において限定されない。

【0058】

一部の実施形態では、部分的に無作為化された左ハーフサイト、部分的に無作為化された右ハーフサイト、および／または部分的に無作為化されたスペーサー配列を有する標的部位を含む候補核酸分子を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、部分的に無作為化された左ハーフサイト、完全に無作為化されたスペーサー配列、および部分的に無作為化された右ハーフサイトを有する標的部位を含む候補核酸分子を含むライブラリーを提供する。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、コンセンサス部位と異なる。一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、二項分布的に、平均して１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下、コンセンサス部位と異なる。例えば、一部の実施形態では、部分的に無作為化された部位は、５％超であるが１０％以下；１０％超であるが２０％以下；２０％超であるが２５％以下；５％超であるが２０％以下等、コンセンサス部位と異なる。ライブラリー中の部分的に無作為化されたヌクレアーゼ標的部位の使用は、コンセンサス部位に密接に関連のある、例えば、１残基のみ、２残基のみ、３残基のみ、４残基のみ、または５残基のみコンセンサス部位と異なる標的部位を含むライブラリーメンバーの濃度を増加させるのに有用である。この背後にある理論的根拠は、所与のヌクレアーゼ、例えば所与のＺＦＮがその目的の標的部位および密接に関連する任意の標的部位を切断する可能性はあるが、目的の標的部位と大幅に異なるか完全に関連のない標的部位を切断する可能性は低いということである。したがって、部分的に無作為化された標的部位を含むライブラリーの使用は、所与の任意のヌクレアーゼに関する、いかなるオフターゲット切断事象の検出においても、感度を損なうことなく、完全に無作為化された標的部位を含むライブラリーの使用よりも効率がよくなり得る。したがって、部分的に無作為化されたライブラリーの使用は、所与のヌクレアーゼの実際上すべてのオフターゲット部位を包含する可能性が高いライブラリーを作製するのに必要なコストおよび負担を顕著に軽減する。しかしながら、一部の実施形態では、例えば、所与のヌクレアーゼの特異性を、所与のゲノム中の任意の可能な部位の文脈において評価しなければならない実施形態では、標的部位の完全に無作為化されたライブラリーを使用することが望ましい場合がある。

【0059】

部位特異的ヌクレアーゼの選択および設計
本発明の一部の態様は、複雑なゲノムの文脈において、単一のユニークな部位の標的切断が可能である部位特異的ヌクレアーゼの選択および設計のための方法および戦略を提供する。一部の実施形態では、同じコンセンサス配列を切断するように設計されたかまたは切断することが公知である複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、各候補ヌクレアーゼにより実際に切断された標的部位をプロファイリングし、それによりあらゆる切断されたオフターゲット部位（コンセンサス標的配列とは異なる標的部位）を検出するステップと、そのように同定された１つまたは複数のオフターゲット部位に基づいて候補ヌクレアーゼを選択するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、一群の候補ヌクレアーゼ、例えば、コンセンサス標的部位を最高の特異性で切断するヌクレアーゼ、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、標的ゲノムの文脈において、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、またはコンセンサス標的部位以外の標的部位をまったく切断しないヌクレアーゼ、から最も特異的なヌクレアーゼを選択するために使用される。一部の実施形態では、この方法は、被験体のゲノムの文脈において、ヌクレアーゼの治療有効濃度以上の濃度で、いかなるオフターゲット部位も切断しないヌクレアーゼを選択するために使用される。

【0060】

本明細書に提供する方法および試薬は、例えば、同じ目的標的部位を標的とする複数の異なるヌクレアーゼ、例えば、所与の部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、所与のジンクフィンガーヌクレアーゼ）の複数の変異体を評価するために使用することができる。したがって、このような方法は、特異性が改善した新規の部位特異的ヌクレアーゼの展開または設計における選択ステップとして使用することができる。

【0061】

ゲノム内のユニークなヌクレアーゼ標的部位の同定
本発明の一部の実施形態は、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法を提供する。本明細書の他の箇所で詳細に記載するように、驚くべきことに、所与のヌクレアーゼにより切断されたオフターゲット部位が、通例、コンセンサス標的部位に高度に類似している、例えば、コンセンサス標的部位と、１ヌクレオチド残基のみ、２ヌクレオチド残基のみ、３ヌクレオチド残基のみ、４ヌクレオチド残基のみ、または５ヌクレオチド残基のみ異なることが発見された。この発見に基づいて、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択して、この部位を標的とし、ゲノム内のいかなるオフターゲット標的部位も切断しないヌクレアーゼの可能性を増大させることができる。例えば、一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するステップとを含む方法を提供する。候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するための方法は、当業者に周知であり、例えば、汎用コンピューター上でＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントソフトウェアまたはアルゴリズムを使用する、配列アラインメント法などが挙げられる。次いで、配列比較の結果に基づいて、適切なユニークなヌクレアーゼ標的部位を選択することができる。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ標的部位は、ゲノム内のユニークな部位として選択され、一方、その部位がこの基準を満たさない場合、その部位は廃棄することができる。一部の実施形態では、上記に概説するように、配列比較に基づいていったん部位が選択されると、その選択部位を標的とする部位特異的ヌクレアーゼが設計される。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的部位に結合するジンクフィンガーアレイを構築し、そのジンクフィンガーアレイにＤＮＡ切断ドメインをコンジュゲートすることにより、任意の選択された標的部位を標的とするように設計することができる。ＤＮＡ切断ドメインがＤＮＡを切断するために二量体形成する必要がある実施形態では、それぞれがヌクレアーゼのハーフサイトに結合し、それぞれが切断ドメインにコンジュゲートするジンクフィンガーアレイが設計される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの設計および／または作製は、組換え技術により行われる。適切な組換え技術は当業者に周知であり、本発明はこの点において限定されない。

【0062】

一部の実施形態では、本発明の態様に従って設計または作製した部位特異的ヌクレアーゼを、単離および／または精製する。本発明の態様による部位特異的ヌクレアーゼを設計するための方法および戦略は、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジインヌクレアーゼ、抗生物質ヌクレアーゼ、およびジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体、変異体または誘導体を含む、任意の部位特異的ヌクレアーゼの設計または作製に適用することができる。

【0063】

部位特異的ヌクレアーゼ
本発明の一部の態様は、本明細書に記載の方法および戦略を使用して設計される、特異性が向上した単離の部位特異的ヌクレアーゼを提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなコード核酸を含む発現構築物を提供する。例えば、一部の実施形態では、ゲノム内の所望の標的部位を切断するように操作され、本明細書に提供する方法に従って、ヌクレアーゼがその目的の標的部位を切断するのに有効な濃度で、１未満、２未満、３未満、４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、または１０未満のオフターゲット部位を切断すると評価された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、ゲノム内の他のいかなる部位とも、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド残基、異なるように選択された所望のユニークな標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、疾患または障害に関連する対立遺伝子内のコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、その切断が疾患または障害の治療または予防をもたらすコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、この疾患はＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、対立遺伝子は、ＣＣＲ５（ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療用）またはＶＥＧＦＡ対立遺伝子（増殖性疾患の治療用）である。

【0064】

一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、医薬組成物の一部として提供される。例えば、一部の実施形態は、本明細書に提供するヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、場合によっては、１つまたは複数のさらなる治療上活性な物質を含むことができる。

【0065】

一部の実施形態では、被験体、例えばヒト被験体に、その被験体内に標的ゲノム改変をもたらすために、本明細書に提供する組成物を投与する。一部の実施形態では、細胞を被験体から採取し、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、所望のゲノム改変が細胞にもたらされたか検出された後に、被験体に戻す。本明細書に提供する医薬組成物の説明は、ヒトへの投与に適した医薬組成物に主に向けられるが、そのような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることを、当業者ならば理解している。種々の動物への投与に適する組成物にするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を改変することは、十分理解されることであり、普通に熟練した獣医学の薬理学者は、もしあるとしても通常の実験作業のみでそのような改変を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される被験体としては、これらに限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に価値のある哺乳動物；および／または鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的に価値のある鳥類が挙げられる。

【0066】

本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製することできる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の副成分と一緒に合わせ、次いで、必要かつ／または所望ならば、所望の単回または複数回用量単位にその製品を成形および／または包装するステップを含む。

【0067】

医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができ、賦形剤としては、本明細書で使用する場合、所望の特定の投与剤形に適する、すべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁の補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等が挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；参照により本明細書に組み込まれる）に、医薬組成物の製剤化において使用する種々の賦形剤および医薬組成物の調製のための公知の手法が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的作用をもたらすことによって、またはそうでなければ医薬組成物の他のいずれかの構成要素と有害性をもたらすように相互作用することによって、物質またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。

【0068】

本発明のこれらおよび他の実施形態の機能および利点は、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利点を示し、特定の実施形態を説明することを意図するものであるが、本発明の全範囲を例示することを意図するものではない。したがって、実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。
実施例

【0069】

実施例１−ジンクフィンガーヌクレアーゼ
緒言
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、所望の標的ＤＮＡ配列を認識し切断するように操作された酵素である。ＺＦＮ単量体は、非特異的なＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ切断ドメイン^１と融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するためには、二量体を形成して、２つのＤＮＡハーフサイトを架橋しなければならないため^２、ＺＦＮは、二量体としてＤＮＡに結合する場合にのみ、可変長のスペーサー配列を挟む２つのユニークな配列を認識し、切断するように設計される。ＺＦＮは、非相同末端結合または相同組換えのいずれかを促進することにより、哺乳動物を含む種々の生物におけるゲノム工学のために使用されてきた^３−９。強力な研究ツールの提供に加えて、ＺＦＮには、遺伝子治療剤としての能力もある。実際、２つのＺＦＮが最近臨床試験に入った：一つは、抗ＨＩＶ治療のアプローチ（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）の一部としてであり、もう一つは、抗癌治療（ＮＣＴ０１０８２９２６）として使用される細胞を改変するためのものである。

【0070】

ＤＮＡ切断特異性はＺＦＮの重要な特徴である。操作されたジンクフィンガードメインの一部にある不完全な特異性は、細胞毒性に結びついており^１０、したがって、ＺＦＮの特異性を決定することは、重大な関心事である。ＥＬＩＳＡアッセイ^１１、マイクロアレイ^１２、細菌ワンハイブリッドシステム^１３、ＳＥＬＥＸおよびその変形^{１４−１６}、Ｒｏｓｅｔｔａベースの計算予測^１７はすべて、単離状態の単量体ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性を特徴づけるために使用されている。しかしながら、ＺＦＮの毒性は、単に結合によるのではなく、ＤＮＡ切断に起因すると考えられる^{１８、１９}。その結果、ジンクフィンガーヌクレアーゼの特異性に関する情報は、これまで、以下の証明されていない仮定に基づいていた、すなわち、（ｉ）二量体ジンクフィンガーヌクレアーゼは、単離の単量体ジンクフィンガードメインがＤＮＡに結合する場合と同じ配列特異性でＤＮＡを切断すること；および（ｉｉ）所与のＺＦＮにおいて、一方のジンクフィンガードメインの結合は、他方のジンクフィンガードメインの結合には影響を及ぼさないこと。単量体ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は、ゲノムにおける、二量体ＺＦＮの潜在的なオフターゲット切断部位を予測するために使用されているが^６、２０、本発明者らが知る限りでは、これまでの研究では、活性な二量体ジンクフィンガーヌクレアーゼの幅広いＤＮＡ切断特異性を決定するための方法は報告されていない。

【0071】

この研究において、本発明者らは、活性なＺＦＮのＤＮＡ切断特異性を幅広く検討するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法を提示する。本発明者らの選択は、１０^１１の潜在的な標的部位のそれぞれを切断する能力について、２つの真正ヘテロ二量体のＺＦＮ、すなわち、現在臨床試験（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）中のＣＣＲ５−２２４^６およびヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターを標的とするＶＦ２４６８^４を評価するためのハイスループットＤＮＡシークエンシング手法と結びついている。本発明者らは、ＣＣＲ５−２２４によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る、ヒトゲノム中に存在する３７個の部位、ＶＦ２４６８によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る、ヒトゲノム中の２，６５２個の部位、およびヒトゲノム中に存在しない、両ＺＦＮがｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能な数十万の部位を同定した。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により同定された部位が、細胞においてもＺＦＮにより切断され得ることを実証するために、本発明者らは、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８のＺＦＮを発現する培養ヒトＫ５６２細胞における、ＺＦＮ誘導の突然変異誘発を証明するために、それぞれ３４個または９０個の部位を検討した。試験したＣＣＲ５−２２４部位のうちの１０個、ＶＦ２４６８部位のうちの３２個が、ヒト細胞において、ＺＦＮ媒介の切断と一致するＤＮＡ配列の変化を示した。ただし、本発明者らは、切断は、細胞型およびＺＦＮ濃度に依存するであろうと予想する。１つのＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位が悪性腫瘍に関連するＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーターに存在する。

【0072】

単量体ジンクフィンガードメイン単独の結合特異性の決定によっては得ることができなかったであろう本発明者らの結果は、過剰なＤＮＡ結合エネルギーが、オフターゲットＺＦＮ切断活性の増加をもたらすことを示し、結合特異性が低下したＺＦＮを設計することにより、ＺＦＮ発現レベルを低下させることにより、またゲノムにおいて、最も近縁な配列と少なくとも３塩基対異なる標的部位を選ぶことによりＺＦＮ特異性が向上する可能性があることを示唆する。

【0073】

結果
ＺＦＮ媒介のＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択
潜在的な切断部位のライブラリーを、合成プライマーおよびＰＣＲを使用して二本鎖ＤＮＡとして調製した（図５）。プライマー中の部分的に無作為化された位置はそれぞれ、７９％の野生型ホスホラミダイトと、他の３つのホスホラミダイトすべての等量混合物との混合物を組み込むことにより合成した。したがって、ライブラリーの配列は、二項分布的に、平均して２１％が、正規のＺＦＮ切断部位と異なった。平滑連結反応の戦略を使用して、１０^１２メンバーの小環状ライブラリーを作製した。ローリングサークル増幅を使用して、このライブラリーの１０^１１超のメンバーを増幅すると共に、連結して高分子量（１２ｋｂ超）ＤＮＡ分子にした。理論上、このライブラリーは、野生型標的配列から７つ以下の突然変異があるＤＮＡ配列をすべて、少なくとも１０倍過剰量で包含する。

【0074】

ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８のＤＮＡ切断部位ライブラリーを１４ｎＭの全切断部位濃度で、０．５ｎＭ〜４ｎＭの範囲の２倍希釈系列のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の粗ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８とインキュベートした（図６）。消化後、得られたＤＮＡ分子（図７）を、ＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択およびその後の対末端ハイスループットＤＮＡシークエンシングに供した。手短に言えば、３つの選択ステップ（図１）によって、切断されなかった配列から切断された配列を分離できるようになった。第１に、切断された部位のみが、シークエンシングに必要となるアダプターの連結に必要な５’リン酸を含有した。第２に、ＰＣＲの後、ゲル精製ステップにより、切断されたライブラリーメンバーが濃縮された。最後に、標的部位コンカテマー切断のホールマークである両末端上の充填された相補的５’オーバーハングを有する、考慮すべき配列のみをシークエンシングした後、計算フィルターを適用した（図２およびプロトコール１〜９）。ライブラリー配列に隣接したＰｖｕＩ制限ヌクレアーゼ認識部位でライブラリーを切断し、ＺＦＮ消化のライブラリー配列と同じプロトコールに消化産物を供することによって、シークエンシングのためのプレ選択ライブラリー配列を準備した。ハイスループットシークエンシングにより、ローリングサークルで増幅したプレ選択ライブラリーが予想される突然変異分布を含有することが確認された（図８）。

【0075】

ＺＦＮ媒介のＤＮＡ切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の設計
活性ＺＦＮのＤＮＡ切断特異性を包括的に特徴づけるために、ノイズを増幅しバイアスを導入する可能性のある反復濃縮ステップを必要とすることなく、１ステップでＤＮＡ切断に対して選択することができる、潜在的なＤＮＡ基質の大規模なライブラリーを最初に作製した。ライブラリー中の各分子が１０^１１超の潜在的な基質配列のうちの１つのコンカテマーであるように、基質ライブラリーを設計した（図５）。ＺＦＮとのインキュベーションにより、切断されない分子、１回切断された分子、および少なくとも２回切断された分子が得られる。少なくとも２回切断された分子には、切断されたＤＮＡ配列の各半分からなる末端がある（図１）。切断されたライブラリーメンバーは、３つの方法で、切断されないライブラリーメンバーに対して濃縮される（図１）。第１に、２回切断された配列には、２つの相補的５’オーバーハングがあり、これらは、本物の切断産物のホールマークとして、ＤＮＡシークエンシング後に計算的に同定することができる。第２に、ＺＦＮ媒介の切断により、プレ選択ライブラリー中に存在しない５’リン酸が現れるので、切断を受けたＤＮＡのみにシークエンシングアダプター連結反応が可能である。第３に、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用するＰＣＲの後に、ゲル精製ステップにより、配列決定される材料すべてが、２つの隣接した部位で切断されたライブラリーメンバーと一致する長さであることが保証される。このゲル精製材料は、イルミナ法を使用するハイスループットＤＮＡシークエンシングに供される（Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｗｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４５６，５３−９（２００８））。理想的には、ＺＦＮ切断選択に使用されるライブラリーは、ＺＦＮにより認識される長さのあらゆる可能なＤＮＡ配列からなるであろう。しかしながら、そのようなライブラリーの１０５メンバーごとに１つのメンバーのみが、２４塩基対の認識配列のうち突然変異が７つ以内である配列を含有するであろう。オフターゲット認識配列は標的認識部位に類似している可能性が極めて高いため、その代わりとして、野生型認識配列と最大７つの突然変異だけ異なるハーフサイト配列をすべて１０倍超で含有するバイアスのかかったライブラリーを使用した。ライブラリーメンバーは、認識部位の５’末端に隣接した完全に無作為化された塩基対、４−、５−、６−、または７−ｂｐの完全に無作為化されたスペーサーを挟む２つの部分的に無作為化されたハーフサイト、および認識部位の３’末端に隣接した、別の完全に無作為化された塩基対からなる。完全に無作為化された５塩基対タグが、各ライブラリーメンバーに続く。このタグは、無作為化された隣接塩基対および無作為化されたスペーサー配列と共に、各ライブラリーメンバーに対するユニークな識別子「キー」として使用した。このユニークなキーが同一のライブラリーメンバーを含有する２つ以上の配列リードと関連する場合、これらの重複したシークエンシングリードは、ＰＣＲ増幅の間に生じたと考えられ、したがって、１つのデータポイントとして処理される。

【0076】

ＤＮＡ切断選択を使用する、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のＺＦＮに関する分析
配列対の各メンバーは、スペーサーの断片、全ハーフサイト、隣接したヌクレオチド、および一定配列から構成された。スペーサーの一方の末端は、通例、一方の配列に見出され、他方の末端は、その対応する対配列に見出されるが、アダプターの連結前に伸長によってオーバーハングが平滑化されるので、オーバーハング配列は両方の対配列のリードの中に存在する。スペーサー配列は、共有のオーバーハング配列を最初に同定し、次いで、オーバーハング配列とハーフサイト配列との間に存在するすべてのヌクレオチドを同定することにより再構築した。曖昧さのないヌクレオチドおよび少なくとも４ヌクレオチドのオーバーハングを含有する配列のみを分析した。全体として、同一のライブラリーメンバー上の２つの切断事象に由来するユニーク配列に対する計算スクリーニングから、切断されたライブラリーメンバーのリードを合計２００万取得した（表２）。０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭのＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の選択について分析された配列は、上記のユニークな識別子キーの使用により同定されたが、数多くの配列反復のために、４ｎＭの選択と比較してはるかに少ない。反復配列が除去される前における、０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭの選択における、大量の反復配列の存在は、それらの選択で得られたシークエンシングリードの数が、すべての実験的選択ステップで残存した個々のＤＮＡ配列の数よりも大きいことを示す。すべての対のリードにおける一定ヌクレオチドの分析によって、シークエンシングのエラー率をヌクレオチド当たり０．０８６％と推定した。このエラー率を使用して、ポスト選択のＺＦＮ標的部位配列の９８％はエラーを含有しないと推定した。

【0077】

オフターゲット切断は、ＺＦＮ濃度に依存する
予想されるように、ライブラリーメンバーのサブセットのみが各酵素により切断された。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８に対するプレ選択ライブラリーはそれぞれ、完全な標的部位（２つのハーフサイト）当たり平均４．５６および３．４５の突然変異を含有したが、使用した最高濃度のＺＦＮ（４ｎＭのＣＣＲ５−２２４および４ｎＭのＶＦ２４６８）に曝露されたポスト選択ライブラリーはそれぞれ、標的部位当たり平均２．７９および１．５３の突然変異を有した（図８）。ＺＦＮ濃度が低下するにつれて、両方のＺＦＮのオフターゲット配列に対する許容性が低下した。最低濃度（０．５ｎＭのＣＣＲ５−２２４および０．５ｎＭのＶＦ２４６８）において、切断された部位はそれぞれ、平均１．８４および１．１０の突然変異を含有した。新しいＤＮＡの文脈において、同定された部位の小規模なサブセットを設けて、２ｎＭのＣＣＲ５−２２４または１ｎＭのＶＦ２４６８と、３７℃で４時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした（図９）。試験した部位すべてについて切断が観察され、よりストリンジェントな（低いＺＦＮ濃度）選択から得られた部位は、低ストリンジェントな選択に由来する部位よりも効率的に切断された。試験した配列はすべて、幾つかの突然変異を含有するが、配列の中には、設計された標的よりも効率的にｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されるものがあったことに留意されたい。

【0078】

二量体ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮのＤＮＡ切断特異性プロファイル（図２ａおよび図１０ａ、ｂ）は、ＳＥＬＥＸにより以前に決定されたＣＣＲ５−２２４単量体のＤＮＡ結合特異性プロファイル^６と顕著に異なっていた。例えば、ＳＥＬＥＸ研究によって予測されなかった、（＋）Ａ５および（＋）Ｔ９などの一部の位置が、本発明者らの切断選択においては、オフターゲット塩基対に対する許容性を示した。ＶＦ２４６８は、ＤＮＡ結合特異性に関してもＤＮＡ切断特異性に関しても以前に特徴づけがなされていないが、限定的な配列選択性を示す２つの位置、（−）Ｃ５および（＋）Ａ９を示し、これらの位置がＺＦＮにより認識されにくいことが示唆された（図２ｂおよび図１０ｃ、ｄ）。

【0079】

ハーフサイト間の補償はＤＮＡ認識に影響を及ぼす
本発明者らの結果は、一方のハーフサイト中に突然変異を含むＺＦＮ基質は、プレ選択ライブラリーに比較して、同じハーフサイト中の近傍の位置にさらなる突然変異を有する可能性が高く、他方のハーフサイト中にさらなる突然変異を有する可能性が低いことを示す。この効果は、最も強力に認識される塩基対が変異した場合に最大であることが見出されたが（図１１）、ＣＣＲ５およびＶＥＧＦターゲティングＺＦＮの両方に対する指定のハーフサイト位置すべてについてこの補償現象が観察された（図３および図１２）。ＶＦ２４６８標的部位位置（＋）Ｇ１、（−）Ｇ１、（−）Ａ２、および（−）Ｃ３などの切断部位の少数派となるヌクレオチドの場合は、変異により、他方のハーフサイト中の塩基対における突然変異許容性が低下し、また、同じハーフサイトにおける突然変異許容性も、増大ではなくわずかに低下した。これらの突然変異のうちの２つ、（＋）Ｇ１および（−）Ｇ１が同時に実行された場合は、他のすべての位置での突然変異許容性が低下した（図１３）。まとめると、これらの結果から、一方のハーフサイトの突然変異許容性が他方のハーフサイトにおけるＤＮＡ認識によって影響を受けることがわかる。

【0080】

ＺＦＮ部位認識についてのこの補償モデルは、理想的でないハーフサイトのみならず、理想的でない長さのスペーサーにも当てはまる。一般に、ＺＦＮはスペーサー内の特定の位置で切断し（図１４）、５および６塩基対のスペーサーが４および７塩基対のスペーサーよりも好まれる（図１５および１６）。しかしながら、５または６塩基対のスペーサーの切断部位は、４または７塩基対のスペーサーの部位よりも、隣接するハーフサイトの配列許容性が大きいことを示す（図１７）。したがって、スペーサーの不完全性により、ハーフサイトの突然変異と同様に、ＤＮＡ基質の他の領域のｉｎ ｖｉｔｒｏ認識がよりストリンジェントになる。

【0081】

ＺＦＮは、最大３つの突然変異を含む多くの配列を切断することができる
ポスト選択ライブラリー中の各配列の出現頻度をプレ選択ライブラリー中のその出現頻度で割ることにより、３つ以下の突然変異を含有する配列すべてについて濃縮係数を算出した。切断により濃縮された配列（濃縮係数＞１）の中で、ＣＣＲ５−２２４は、すべてのユニークな単一突然変異配列、すべてのユニークな二重突然変異配列の９３％、およびすべての可能な三重突然変異配列の半分を、使用した最高酵素濃度で切断することができた（図４ａおよび表３ａ）。ＶＦ２４６８は、すべてのユニークな単一突然変異配列の９８％、すべてのユニークな二重突然変異配列の半分、およびすべての三重突然変異配列の１７％を切断することができた（図４ｂおよび表３ｂ）。

【0082】

本発明者らの手法では、活性なＺＦＮ二量体をアッセイするので、切断され得るＺＦＮ部位の完全な配列が示される。スペーサーの配列を無視すると、選択により、ＣＣＲ５−２２４によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され得る５または６塩基対のスペーサーを有する、ヒトゲノム中の３７部位（表１および表４）、およびＶＦ２４６８により切断され得る、ヒトゲノム中の２，６５２部位（ＶＦ２４６８のデータ）が明らかになった。ＶＦ２４６８によりｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されるゲノム部位の中で、１，４２８部位は、正規の標的部位（スペーサー配列を除く）に対して３つ以下の突然変異を有していた。ＣＣＲ５−２２４に比較して、ＶＦ２４６８による、単一、二重、および三重突然変異配列に対する大きな識別力にもかかわらず（図４および表３）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能なＶＦ２４６８部位の数が多いことは、ＶＦ２４６８標的部位（３，４５０部位）と３つ以下の突然変異だけ異なる、ヒトゲノム中の部位の数と、ＣＣＲ５−２２４標的部位（８部位）と３つ以下の突然変異だけ異なる、ヒトゲノム中の部位の数との差を反映している（表５）。

【0083】

同定された部位は、ヒト細胞においてＺＦＮにより切断される
Ｋ５６２細胞においてＣＣＲ５−２２４を発現させることにより、そしてＺＦＮ誘導の突然変異を証明するために、ＰＣＲおよびハイスループットＤＮＡシークエンシングを使用して、ヒトゲノム内の３４個の潜在的な標的部位を調べることにより、ヒト細胞において、選択により同定された部位でＣＣＲ５−２２４が切断することができるか否かを試験した。空ベクターを含有する対照細胞と比較して、活性なＣＣＲ５−２２４を発現する細胞において有意（Ｐ＜０．０５）に濃縮された、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復に特徴的な挿入または欠失突然変異（インデル）を有する部位を（表６）、ＺＦＮ媒介の切断の証拠となる部位と定義した。分析する各部位について、約１００，０００配列以上を取得し、これによって、１０，０００中に約１の頻度で有意に改変された部位の検出が可能になった。分析により、１０のそのような部位が同定された、すなわち、ＣＣＲ５における目的の標的配列、ＣＣＲ２において以前に同定された配列、および８つのオフターゲット配列（表１、４、および６）、そのうちの１つはＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーター内に位置する。８つの新たに同定されたオフターゲット部位は、１／３００〜１／５，３００の頻度で改変されている。さらに、培養Ｋ５６２細胞においてＶＦ２４６８を発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により同定された、９０の最も高度に切断された部位について上記の分析を実施した。分析された９０のＶＦ２４６８部位のうち３２が、Ｋ５６２細胞において、ＺＦＮ媒介ターゲティングと一致するインデルを示した（表７）。３つのＣＣＲ５−２２４部位および７つのＶＦ２４６８部位について、部位特異的ＰＣＲ増幅を得ることができなかったため、それらの遺伝子座でのＮＨＥＪの発生を分析することができなかった。まとめると、これらの観察から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法により同定されたオフターゲット配列には、ヒト細胞において、ＺＦＮにより切断され得る多くのＤＮＡ配列が含まれることがわかる。

【0084】

考察
ここに提示した方法により、ヒト細胞のゲノム中に存在し、かつ切断され得る多くの配列を含めて、２つの活性な二量体ＺＦＮにより切断され得る数十万の配列が同定された。ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮについて新たに同定された切断部位の１つは、ＢＴＢＤ１０遺伝子のプロモーター内にある。ダウンレギュレートされると、ＢＴＢＤ１０は、悪性腫瘍^２１および膵臓β細胞のアポトーシス^２２と関連した。アップレギュレートされると、ＢＴＢＤ１０は、Ａｋｔファミリータンパク質^{２２、２３}のリン酸化を介して、神経細胞の増殖^２３および膵臓β細胞の増殖を促進することが示された。この潜在的に重要なオフターゲット切断部位および本発明者らが細胞において観察した７つの他の部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単量体結合データを使用して、潜在的なＣＣＲ５−２２４基質を予測する最近の研究^６では同定されなかった。

【0085】

本発明者らは、１つの細胞株において複数部位で切断することができるＺＦＮが、おそらくはクロマチン構造の局所的な相違により、異なる細胞株^４で必ずしも機能することができるとは限らないことを以前示した。したがって、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８が異なる細胞株で発現された場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断可能なオフターゲット部位の異なるサブセットが、それらにより改変される可能性がある。ホーミングエンドヌクレアーゼオフターゲット切断^２４に関する最近の研究など、エンドヌクレアーゼ特異性に関する純粋に細胞レベルの研究も、同様に細胞株の選択により影響を受けることがある。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、細胞内ＤＮＡのいくつかの特徴を考慮しないが、この方法は、目的の細胞型で実施されるその後の研究に伝えることができる、エンドヌクレアーゼ特異性およびオフターゲット部位に関する、細胞型に依存しない一般的な情報を提供する。加えて、本発明者らのプレ選択ライブラリーは、目的のＺＦＮ標的部位の突然変異が７つ以内のすべての配列を少なくとも１０倍のカバレッジでオーバーサンプリングしているが、選択当たり得られる配列リードの数（約１００万）は、ポスト選択ライブラリー中に存在するすべての切断配列をカバーするには不十分であるように思われる。したがって、シークエンシング性能の改善が続いているので、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８についてのさらなるオフターゲット切断部位が、ヒトゲノムにおいて同定され得る可能性がある。

【0086】

本発明者らが分析したＺＦＮは両方とも、ヒトゲノム中のユニーク配列に対して操作されたが、両方とも細胞中の相当数のオフターゲット部位を切断する。この結果は、４フィンガーＣＣＲ５−２２４対の理論上の特異性が、３フィンガーＶＦ２４６８対よりも４，０９６倍優れていることを考えると、４フィンガーＣＣＲ５−２２４対については、特に驚くべきことである（ＣＣＲ５−２２４は、１８塩基対のＶＦ２４６８部位よりも６塩基対長い２４塩基対の部位を認識するはずである）。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の切断プロファイル（図２）ならびに３つ以下の突然変異を含む配列の突然変異許容性（図４）を検討すると、オフターゲット切断活性が低下した、これらのＺＦＮの変異体を操作するための異なる戦略が必要となり得ることが示唆される。４フィンガーＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮは、３フィンガーＶＦ２４６８ ＺＮＦよりも、広範囲の位置で特異性が緩和しており、かつ３つ以下の突然変異を含む突然変異配列に高い許容性を示した。ＶＦ２４６８の場合は、フィンガーのサブセットのみの再最適化により、望ましくない切断事象の実質的な減少を可能することができる。これに対して、ＣＣＲ５−２２４の場合は、フィンガーの多くまたはすべての広範囲な再最適化が、オフターゲット切断事象を除去するために必要となる可能性がある。

【0087】

４フィンガーおよび３フィンガーのすべてのＺＦＮが、この研究で試験した２つのＺＦＮほど特異的であるとは必ずしも限らないことに留意する。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８は両方とも、ＺＦＮの結合活性を最適化するように設計する方法を使用して操作された。以前の研究から、３フィンガーおよび４フィンガーの両方のＺＦＮの場合、ＺＦＮ対を操作するために使用する具体的な方法が、ヌクレアーゼの品質および特異性に多大な影響を及ぼし得ることがわかっている^{７、１３、２５、２６}。

【0088】

本発明者らの発見は、特異性が向上したＺＦＮの設計および適用にとって重要な意味をもつ。１つまたは２つの部位に突然変異を有するすべての潜在的な基質の半分以上がＺＦＮにより切断される可能性があり、このことは、ＺＦＮとＤＮＡ基質との間の結合親和性が、突然変異した位置での分子相互作用が最適以下の場合でも切断を起こすのに十分高いことを示唆する。本発明者らはまた、一方のハーフサイト中に突然変異を有する部位を提示されたＺＦＮは、突然変異したハーフサイト内の他の部位でのより高い突然変異許容性および他方のハーフサイトの位置でのより低い許容性を示すことを観察した。これらの結果をまとめると、切断のための最小の親和性閾値を満たすためには、オフターゲット塩基対を包含するハーフサイトからの結合エネルギーの不足が、別のハーフサイトにおける過剰なジンクフィンガー：ＤＮＡ結合エネルギーによってエネルギー的に補償されなければならず、これには、変異していないハーフサイトでの配列認識ストリンジェンシーの増大が要求される（図Ｓ１８）。逆に、変異したハーフサイトの他の位置でのストリンジェンシーの緩和は、全体のＺＦＮ結合エネルギーへの変異したハーフサイトの寄与が低下したことにより説明することができる。この仮説は、ＺＦＮにおけるジンクフィンガーの数が減少すると、実際には、活性が低下するよりもむしろ増大することを示す最近の研究によって支持される^２７。

【0089】

このモデルはまた、おそらくＺＦＮによりそれほど有利に結合されない、スペーサーの長さが最適以下の部位が、スペーサーの長さが最適な部位よりも高いストリンジェンシーで認識されたという本発明者らの観察を説明する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスペーサー選択性は、必ずしも細胞でのスペーサー選択性を反映するものではない^{２８、２９}；しかしながら、本発明者らの結果は、二量体のＦｏｋＩ切断ドメインがＺＦＮ標的部位認識に影響を及ぼすことができることを示唆する。このモデルと一致して、Ｗｏｌｆｅおよび共同研究者は、ジンクフィンガードメインは同じであるが、ＦｏｋＩドメイン変異体が異なる２つのＺＦＮにおける、ゼブラフィッシュでのオフターゲット事象の頻度の差を最近観察した^２０。

【0090】

まとめると、本発明者らの発見は、以下のことを示唆する、すなわち、（ｉ）ＺＦＮの特異性は、過剰なＤＮＡ結合エネルギーを有するＺＦＮの設計を回避することにより、向上させることができること；（ｉｉ）オフターゲット切断は、突然変異が３つ以内の類縁部位をゲノム中に有さない標的部位に対して、ＺＦＮを設計することにより、最小化することができること；および（ｉｉｉ）ＺＦＮは、標的配列を所望の程度に切断するのに必要な最低濃度で使用されるべきであること。この研究はＺＦＮに焦点を合わせたが、本発明者らの方法は、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼおよび操作された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡを切断する配列特異的エンドヌクレアーゼすべてに適用可能である。この手法は、配列特異的エンドヌクレアーゼのためにゲノム中の標的部位を選ぶ場合、および特に治療用途のためにこれらの酵素を操作する場合、重要な情報を提供することができる。

【0091】

方法
オリゴヌクレオチドおよび配列。オリゴヌクレオチドはすべて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したものであり、表８に収載する。縮重した位置を有するプライマーは、指定の塩基を７９％および他の標準ＤＮＡ塩基のそれぞれを７％含有する、手動で混合したホスホラミダイトを使用して、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された。

【0092】

この研究で使用したＺＦＮの配列。この研究で使用したＺＦＮについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。Ｔ７プロモーターに下線を付し、開始コドンを太字で示す。

【数1】

【数2】

【0093】

ライブラリーの構築。標的部位のライブラリーを、プライマーの「Ｎ５−ＰｖｕＩ」および「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ４」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ５」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ６」、「ＣＣＲ５−２２４−Ｎ７」、「ＶＦ２４６８−Ｎ４」、「ＶＦ２４６８−Ｎ５」、「ＶＦ２４６８−Ｎ６」、または「ＶＦ２４６８−Ｎ７」を用い、ｐＵＣ１９開始テンプレート上でのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）によるＰＣＲによって、二本鎖ＤＮＡに組み込み、ライブラリー配列に隣接してＰｖｕＩ制限部位を含む約５４５ｂｐの産物を生じさせ、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで精製した。

【0094】

ライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドは、５’骨格−ＰｖｕＩ部位−ＮＮＮＮＮＮ−部分的に無作為化されたハーフサイト−Ｎ_４−７−部分的に無作為化されたハーフサイト−Ｎ−骨格３’の形態にした。精製したオリゴヌクレオチド混合物（約１０μｇ）を平滑化し、１×ＮＥＢＮｅｘｔ末端修復反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．４ｍＭ ｄＴＴＰ、ｐＨ７．５）中の５０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと１５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとの混合物を用いて、室温で１．５時間リン酸化した。平滑末端を有しリン酸化されたＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．５）中で１０ｎｇ／μＬに希釈し、２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）による、室温で１５．５時間の連結反応により環状化した。環状単量体を、１％のＴＡＥ−アガロースゲル上でゲル精製した。７０ｎｇの環状単量体を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ １００増幅キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１００μＬの反応液中にて、３０℃で２０時間、ローリングサークル増幅の基質として使用した。反応を６５℃で１０分間のインキュベーションにより停止させた。標的部位ライブラリーは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により定量した。部分的に無作為化されたハーフサイト間にＮ_４、Ｎ_５、Ｎ_６、およびＮ_７のスペーサー配列を含むライブラリーを、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の両方のために、等モル濃度でプールした。

【0095】

ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現および特徴づけ。ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のための３×ＦＬＡＧタグ付きジンクフィンガータンパク質を、ｐＭＬＭ２９０およびｐＭＬＭ２９２に由来する哺乳動物発現ベクター^４中の、ＦｏｋＩ真正ヘテロ二量体への融合物として発現させた。ＤＮＡおよびタンパク質の配列は、本明細書の他の箇所に示す。完全なベクター配列は、要請により入手可能である。ＺＦＮをコードするベクター２μｇを、ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄウサギ網状赤血球システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳した。塩化亜鉛（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５００μＭで加え、転写／翻訳反応を３０℃で２時間実施した。グリセロールを５０％の最終濃度まで加えた。ウエスタンブロットを用い、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してタンパク質を視覚化した。ＺＦＮ濃度は、ウエスタンブロットを行い、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付き細菌アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の標準曲線と比較することにより決定した。

【0096】

ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８に対する試験基質は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングすることにより構築した。プライマーの「ｔｅｓｔ ｆｗｄ」および「ｔｅｓｔ ｒｅｖ」ならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲにより、適切なＺＦＮによりサイズが約３００ｂｐおよび約７００ｂｐの２つの断片に切断され得る、１ｋｂの線状ＤＮＡが得られた。ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する活性プロファイルは、Ｍｉｌｌｅｒら^３０およびＣｒａｄｉｃｋら^３１が使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ切断プロトコールを改変して取得した。１ｋｂの線状ＤＮＡ１μｇを、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、種々の濃度のＺＦＮにより３７℃で４時間消化した。ＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）１００μｇを、室温で１０分間反応物に加えて、精製およびゲル分析を妨害する可能性のあるＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳混合物から除去した。反応物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、１％のＴＡＥアガロースゲルで分析した。

【0097】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択。種々の濃度のＺＦＮ、タンパク質をコードするＤＮＡテンプレートをまったく含まない、使用したＺＦＮの最大濃度に等しい量のＴＮＴ反応混合物（「溶解物」）、または５０単位のＰｖｕＩ（ＮＥＢ）を、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、３７℃で４時間、ローリングサークル増幅ライブラリー１μｇとインキュベートした。ＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）１００μｇを、室温で１０分間反応物に加えて、精製およびゲル分析を妨害する可能性のあるＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳混合物から除去した。反応物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製した。反応混合物の１／１０を、１％のＴＡＥアガロースゲル上でのゲル電気泳動およびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色によって視覚化した。

【0098】

精製したＤＮＡを、室温で３０分間、５００μＭ ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、５単位のＤＮＡポリマラーゼＩ、ラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（ＮＥＢ）により平滑化した。反応混合物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、最終容量５０μＬにて、２４０μＭ ｄＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中で、３７℃で３０分間、５単位のＫｌｅｎｏｗフラグメント（３’ｅｘｏ⁻）（ＮＥＢ）とインキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を９０μＬ容量まで加え、反応物を７５℃で２０分間インキュベートして、酵素を不活性化した後、１２℃に冷却した。酵素濃度に従ってバーコードが付けられた、３００ｆｍｏｌの「アダプター１／２」またはＰｖｕＩ消化のための６ｐｍｏｌの「アダプター１／２」を、１０×ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＡＴＰ）１０ｕｌと共に、反応混合物に加えた。アダプターを、室温で１７．５時間、４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより平滑ＤＮＡ末端上に連結し、連結したＤＮＡを、Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲセファクリルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、連結していないアダプターを除去した。アダプターが連結したＤＮＡを、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ならびにそれぞれ１０ｐｍｏｌのプライマー「ＰＥ１」および「ＰＥ２」を用いて、３％ＤＭＳＯおよび１．７ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＧＣ緩衝液中で増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３分間に続く、９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間のサイクル、および７２℃での最終的な５分間伸長とした。ＰＣＲは、ゲル上で産物を可視化するのに十分なサイクル（典型的には２０〜３０）行った。反応物を等モル量でプールし、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製した。精製したＤＮＡを、１％のＴＡＥアガロースゲル上でゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ３６塩基対末端シークエンシングのために、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出した。

【0099】

データ解析。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングリードを、Ｃ＋＋で書かれたプログラムを使用して解析した。アルゴリズムは、本明細書の他の箇所（例えば、プロトコール１〜９）に別記されており、要請によりソースコードは入手可能である。両方の対配列上に同じバーコードを含有し、品質スコアが「Ｂ」の位置を含有しない配列をバーコードによりビニングした（ｂｉｎｎｅｄ）。ハーフサイト配列、オーバーハングおよびスペーサー配列、ならびに隣接した無作為化された位置を、一定配列との位置的関係および設計したＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８の認識配列に類似した配列の検索により決定した。これらの配列を、２つの隣接しかつ同一の部位で切断されたローリングサークルコンカテマーに対応する、少なくとも４塩基対の相補的な充填されたオーバーハング末端に対する計算選択ステップに供した。特異性スコアを以下の式により算出した：正の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（１−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）および負の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）。

【0100】

正の特異性スコアは、所与の位置において、出発ライブラリーよりもポスト選択ライブラリーで高い頻度で出現する塩基対を反映する；負の特異性スコアは、所与の位置において、出発ライブラリーよりもポスト選択ライブラリーで頻度が低い塩基対を反映する。＋１のスコアは絶対的な選択性を示し、−１のスコアは完全な非許容性を示し、０のスコアは選択性がないことを示す。

【0101】

ヒト細胞における切断部位でのゲノム改変のアッセイ。ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮを、ＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクターの中にクローニングした。この発現ベクターでは、両方のＺＦＮ単量体が、以前に記載のベクター^３２と同様の自己切断Ｔ２Ａペプチド配列を使用して、化学量論的量で同じｍＲＮＡ転写物から翻訳される。このベクターはまた、ＺＦＮ発現カセットの下流にあるＰＧＫプロモーターから高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現する。ｅＧＦＰのみを発現する空ベクターを、陰性対照として使用した。

【0102】

細胞内にＺＦＮ発現プラスミドを送達するために、活性なＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮのＤＮＡまたは空ベクターＤＮＡのいずれか１５μｇを、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）についての製造業者の使用説明書に従って、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ ２×１０^６ Ｋ５６２細胞に二つ組の反応で使用した。ＧＦＰ陽性細胞をトランスフェクションの２４時間後にＦＡＣＳにより単離し、増殖させ、トランスフェクションの５日後にＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により回収した。

【0103】

３７の潜在的なＣＣＲ５−２２４基質および９７の潜在的なＶＦ２４６８基質に対するＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）およびプライマー「［ＺＦＮ］［＃］ｆｗｄ」および「［ＺＦＮ］［＃］ｒｅｖ」（表９）を用いて、３％ＤＭＳＯを添加した１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液中で実施した。プライマーはＰｒｉｍｅｒ３^３３を使用して設計した。増幅したＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で溶出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ機器（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、１Ｋ Ｃｈｉｐにより定量し、触媒活性ベクター試料および空ベクター対照試料について、別々の等モルプールにまとめた。３つのＣＣＲ５部位および７つのＶＦ２４６８部位に対するＰＣＲ産物は得られなかったので、これらの試料はさらなる解析から除外した。多重Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製を、アダプター連結反応およびＰＣＲ濃縮ステップの後に精製のためにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用することを除いて、製造業者の説明書に従って実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａインデックス１１（「ＧＧＣＴＡＣ」）および１２（「ＣＴＴＧＴＡ」）をＺＦＮ処理ライブラリー用に使用し、インデックス４（「ＴＧＡＣＣＡ」）および６（「ＧＣＣＡＡＴ」）を空ベクター対照用に使用した。ライブラリー濃度は、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザープラットフォーム（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のＫＡＰＡライブラリー定量キットにより定量した。活性ベクターおよび空ベクター処理細胞に由来する、等量のバーコード付きライブラリーを１０ｎＭに希釈し、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＦＡＳ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙのＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００上のシングルリードシークエンシングに供した。活性ＺＦＮ試料および空ベクター対照について、プロトコール９を使用して配列を解析した。

【0104】

統計解析。図８では、Ｐ値を、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８に関し、プレ選択、０．５ｎＭのポスト選択、１ｎＭのポスト選択、２ｎＭのポスト選択、および４ｎＭのポスト選択のライブラリー間のあらゆる可能なペアワイズ比較における、標的部位の突然変異数の平均値の差の片側検定について算出した。ｔ−統計は、ｔ＝（ｘ＿ｂａｒ_１−ｘ＿ｂａｒ_２）／ｓｑｒｔ（ｌ×ｐ＿ｈａｔ_１×（１−ｐ＿ｈａｔ_１）／ｎ_１＋ｌ×ｐ＿ｈａｔ_２×（１−ｐ＿ｈａｔ_２）／ｎ_２）として算出した。式中、ｘ＿ｂａｒ_１およびｘ＿ｂａｒ_２は比較する分布の平均であり、ｌは標的部位の長さ（ＣＣＲ５−２２４については２４；ＶＦ２４６８については１８）であり、ｐ＿ｈａｔ_１およびｐ＿ｈａｔ_２は各ライブラリーついての突然変異の計算確率（ｘ＿ｂａｒ／ｌ）であり、ｎ_１およびｎ_２は各選択について分析した配列の総数である（表２）。プレ選択ライブラリーおよびポスト選択ライブラリーはすべて、二項分布すると仮定した。

【0105】

表４および７では、Ｐ値を、活性なＺＦＮ試料および空ベクター対照試料に由来する挿入または欠失を含む配列の割合における差の片側検定について算出した。ｔ−統計は、ｔ＝（ｐ＿ｈａｔ_１−ｐ＿ｈａｔ_２）／ｓｑｒｔ（（ｐ＿ｈａｔ_１×（１−ｐ＿ｈａｔ_１）／ｎ_１）＋（ｐ＿ｈａｔ_２×（１−ｐ＿ｈａｔ_２）／ｎ_２））として算出した。式中、ｐ＿ｈａｔ_１およびｎ_１はそれぞれ、活性な試料に由来する配列の割合および総数であり、ｐ＿ｈａｔ_２およびｎ_２はそれぞれ、空ベクター対照試料に由来する配列の割合および総数である。

【0106】

プロット。ヒートマップはすべて、下記のコマンドを用いて、Ｒソフトウェアパッケージで生成した：ｉｍａｇｅ（［ｖａｒｉａｂｌｅ］，ｚｌｉｍ ＝ｃ（−１，１），ｃｏｌ＝ｃｏｌｏｒＲａｍｐＰａｌｅｔｔｅ（ｃ（”ｒｅｄ”，”ｗｈｉｔｅ”，”ｂｌｕｅ”），ｓｐａｃｅ＝”Ｌａｂ”）（２５００）。

【0107】

プロトコール１：品質スコアフィルタリングおよび配列ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）。
１）シークエンシングリードの両方の対のそれぞれの位置を品質スコアについて検索し、いずれかの位置が品質スコア＝「Ｂ」である場合、拒絶する。
２）対中の最初の配列がバーコード（「ＡＡＴ」、「ＡＴＡ」、「ＴＡＡ」、「ＣＡＣ」、「ＴＣＧ」）で開始するすべての配列リードを別々のファイルに出力し、各バーコードに対応する配列の数をカウントする。

【0108】

プロトコール２：ＺＦＮ（「ＡＡＴ」、「ＡＴＡ」、「ＴＡＡ」、「ＣＡＣ」）によるフィルタリング
各ビニングされたファイルについて、
１）対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
２）定常領域の検索によってシークエンスリードの配向を同定する。
−配向１は、定常領域「ＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧ」により同定する。
−配向２は、定常領域「ＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧ」により同定する。
３）同定された定常領域に対応する、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のハーフサイトと比較して最少の突然変異を有する部分配列について、位置４（バーコード後）から定常領域の最初の位置までの配列を検索する。
−「ＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣ」（ＣＣＲ５−２２４（＋））および「ＧＡＣＧＣＴＧＣＴ」（ＶＦ２４６８（−））について、配向１の配列を検索する。
−「ＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ」（ＣＣＲ５−２２４（−））および「ＧＡＧＴＧＡＧＧＡ」（ＶＦ２４６８（＋））について、配向２の配列を検索する。
４）両方のハーフサイトにわたって最少の突然変異について調べることによって、ＣＣＲ５−２２４またはＶＦ２４６８として配列をビニングする。
５）ハーフサイトおよび一定配列の位置を使用して、オーバーハング／スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列を決定する。
−配向１のハーフサイトと定常領域との間の部分配列はタグ配列である。
ｏタグ配列がない場合は、タグ配列は「Ｘ」と表示される。
−オーバーハング配列は、バーコードの後に開始する、配向１と配向２の部分配列間の最長の逆相補的部分配列を検索することにより決定する。
−スペーサー配列は、オーバーハングとハーフサイト（もしあれば）との間にある、配向１の部分配列の逆相補鎖を、オーバーハングとハーフサイトとの間にある、配向２の部分配列に連結することにより決定する。
ｏオーバーハングとハーフサイトとの間にオーバーラップがある場合は、オーバーハングの中に存在するオーバーラップしていない部分配列のみをスペーサーの一部としてカウントする。
６）重複配列を除去するために、各配列対をツリーの中にソートする。
−ツリーの各レベルは配列の位置に対応する。
−各レベルの各ノードは、特定の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＸ＝ｎｏｔ（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ））に対応し、次の位置の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｘ）を指す。
−配列対をノードにコードし、スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列の連結からなる部分配列をツリーにソートする。
−ツリーの終端ノードにおいて、新たに加わる各配列を、重複を回避するためにノードにおける他のすべての配列と比較する。
７）ツリーのコンテンツを、バーコードおよびＺＦＮに基づいて別々のファイルに再帰的に出力する。

【0109】

プロトコール３：ライブラリーのフィルタリング（「ＴＣＧ」）
１）対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
２）配列「ＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣ」を含有しない配列対を分析する（他方の対はライブラリー配列を含有する）。
３）ＺＦＮハーフサイトについて配列を検索し、突然変異がより少ないＺＦＮ部位によってビニングする。
−「ＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣ」および「ＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ」（ＣＣＲ５−２２４）ならびに「ＡＧＣＡＧＣＧＴＣ」および「ＧＡＧＴＧＡＧＧＡ」（ＶＦ２４６８）について検索する。
４）ハーフサイトの位置に基づいて、スペーサー、隣接するヌクレオチド、およびヌクレオチドタグ配列を同定する。
５）ＺＦＮによるフィルタリングの下で、ステップ６のツリーアルゴリズムを使用して、重複配列を除去する。

【0110】

プロトコール４：配列プロファイル
１）「Ｎ」位置を含有せず、スペーサーの長さが４〜７の間である配列のみを分析する。
２）突然変異の総数、スペーサーの長さ、オーバーハングの長さ、（＋）および（−）ハーフサイトに関するヌクレオチド頻度、長さが４−ｂｐ、５−ｂｐ、６−ｂｐ、および７−ｂｐのスペーサーに関するヌクレオチド頻度、および隣接するヌクレオチドおよびタグ配列に関するヌクレオチド頻度を表にする。
３）ライブラリー配列について、ステップ１および２を反復する。
４）各位置での特異性スコアを、正の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（１−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）、負の特異性スコア＝（その位置の塩基対の頻度［ポスト選択］−その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）／（その位置の塩基対の頻度［プレ選択］）を使用して算出する。

【0111】

プロトコール５：ゲノムのマッチ
１）ヒトゲノム配列を、５または６塩基のすべてのスペーサー配列を受け入れた正規標的部位の９つの突然変異（ＣＣＲ５−２２４）または６つの突然変異（ＶＦ２４６８）以内のすべての部位について、２４および２５の塩基ウィンドウ（ＣＣＲ５−２２４）および１８および１９の塩基ウィンドウ（ＶＦ２４６８）で検索した。
２）各ポスト選択配列を、ＣＣＲ５−２２４およびＶＦ２４６８のそれぞれ９つおよび６つの突然変異以内のゲノム配列セットと比較した。

【0112】

プロトコール６：０、１つ、２つ、または３つの突然変異を含む配列に対する濃縮係数
１）各配列について、ポスト選択ライブラリー中の出現頻度を、プレ選択ライブラリー中の出現頻度で割る。

【0113】

プロトコール７：フィルタリングされた配列のプロファイル
１）配列プロファイルにおいて、プレ選択およびポスト選択の両方のデータについて、所与の位置にオフターゲット塩基を有する配列のみをさらに分析することを除いて、上記のアルゴリズムを使用する。

【0114】

プロトコール８：補償差マップ
１）両方のハーフサイトにおけるあらゆる位置での突然変異について、フィルタリングされた配列プロファイルアルゴリズムを使用する。
２）Δ（特異性スコア）＝フィルタリングされた特異性スコア−フィルタリングされていない特異性スコア、を計算する。

【0115】

プロトコール９：ＮＨＥＪ検索
１）正確な隣接配列を検索することにより部位を同定する。
２）計算部位の長さを予測部位の長さと比較し、非改変標的部位（目的部位と比較して５つ以下の突然変異を含む配列を非改変とカウントした）との類似性を検索することにより、挿入または欠失の塩基の数をカウントする。
３）本当の挿入または欠失を同定するために、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２、およびＶＥＧＦ−Ａプロモーター以外のすべての部位を手動で点検する。

【0116】

参考文献
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１２． Ｂｕｌｙｋ， Ｍ．Ｌ．， Ｈｕａｎｇ， Ｘ．， Ｃｈｏｏ， Ｙ． ＆ Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， ７１５８−６３ （２００１）．
１３． Ｍｅｎｇ， Ｘ．， Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ−Ｂｅｇａｎｎｙ， Ｓ．， Ｊｉａｎｇ， Ｔ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．Ｋ． ＆ Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｒａｐｉｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５， ｅ８１ （２００７）．
１４． Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ．， Ｇｒｅｉｓｍａｎ， Ｈ．Ａ．， Ｒａｍｍ， Ｅ．Ｉ． ＆ Ｐａｂｏ， Ｃ．Ｏ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｖｉａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｄｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８５， １９１７−３４ （１９９９）．
１５． Ｓｅｇａｌ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２， ２１３７−４８ （２００３）．
１６． Ｚｙｋｏｖｉｃｈ， Ａ．， Ｋｏｒｆ， Ｉ． ＆ Ｓｅｇａｌ， Ｄ．Ｊ． Ｂｉｎｄ−ｎ−Ｓｅｑ： ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７， ｅ１５１ （２００９）．
１７． Ｙａｎｏｖｅｒ， Ｃ． ＆ Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｐ． Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃ２Ｈ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （２０１１）．
１８． Ｂｅｕｍｅｒ， Ｋ．， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｇ．， Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ．， Ｔｒａｕｔｍａｎ， Ｊ．Ｋ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７２， ２３９１−４０３ （２００６）．
１９． Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ．， Ｇｏｌｉｃ， Ｍ．， Ｇｏｌｉｃ， Ｋ．Ｇ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１， １１６９−７５ （２００２）．
２０． Ｇｕｐｔａ， Ａ．， Ｍｅｎｇ， Ｘ．， Ｚｈｕ， Ｌ．Ｊ．， Ｌａｗｓｏｎ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｗｏｌｆｅ， Ｓ．Ａ． Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９， ３８１−９２ （２０１１）．
２１． Ｃｈｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＢＴＢ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ， ＢＴＢＤ１０， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ． Ｇｅｎｅ ３４０， ６１−９ （２００４）．
２２． Ｗａｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＧＭＲＰ１） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５４， ８５２−６３ （２０１１）．
２３． Ｎａｗａ， Ｍ．， Ｋａｎｅｋｕｒａ， Ｋ．， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ．， Ａｉｓｏ， Ｓ． ＆ Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｍ． Ａ ｎｏｖｅｌ Ａｋｔ／ＰＫＢ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＳＯＤ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰ２Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ／ＰＫＢ． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２０， ４９３−５０５ （２００８）．
２４． Ｐｅｔｅｋ， Ｌ．Ｍ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．Ｗ． ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ．Ｇ． Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｔ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， ９８３−６ （２０１０）．
２５． Ｈｕｒｔ， Ｊ．Ａ．， Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ， Ｓ．Ａ．， Ｈｉｒｓｈ， Ａ．Ｓ．， Ｐａｂｏ， Ｃ．Ｏ． ＆ Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．Ｋ． Ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００， １２２７１−６ （２００３）．
２６． Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｃ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５， ３７４−５ （２００８）．
２７． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｄｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒｓ ｔｏ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｎ Ｒｅｄｕｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０， ５０３３−４１ （２０１１）．
２８． Ｂｉｂｉｋｏｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１， ２８９−９７ （２００１）．
２９． Ｈａｎｄｅｌ， Ｅ．Ｍ．， Ａｌｗｉｎ， Ｓ． ＆ Ｃａｔｈｏｍｅｎ， Ｔ． Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｏｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ−ｄｏｍａｉｎ ｌｉｎｋｅｒ ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７， １０４−１１ （２００９）．
３０． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５， ７７８−８５ （２００７）．
３１． Ｃｒａｄｉｃｋ， Ｔ．Ｊ．， Ｋｅｃｋ， Ｋ．， Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｓ．， Ｊａｍｉｅｓｏｎ， Ａ．Ｃ． ＆ ＭｃＣａｆｆｒｅｙ， Ａ．Ｐ． Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， ９４７−５４ （２０１０）．
３２． Ｄｏｙｏｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６， ７０２−８ （２００８）．
３３． Ｒｏｚｅｎ， Ｓ． ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ， Ｈ． Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２， ３６５−８６ （２０００）．

【0117】

本明細書に記述のすべての刊行物、特許、およびデータベースエントリーは、上記に収載のアイテムを含めて、あたかも個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように指示されたかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。矛盾がある場合は、本出願が、本明細書のいかなる定義も含めて、統制するものとする。

【0118】

実施例２−ＴＡＬＥＮ
種々のＴＡＬＥＮの部位選択性を、上記のＺＦＮプロファイリングについてなされた研究と同様にしてプロファイリングした。実験および結果を図１９〜４９に記載する。選択１は、＋２８リンカー対＋６３リンカーのＴＡＬＥＮ間の比較を含む。選択２は、ＴＡＬドメインの長さが異なるＴＡＬＥＮの比較を含む。

【0119】

ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞の両方において、標的ＤＮＡを具体的に調節する変形技術に基づいている。設計可能なＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、他のＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーと比較して、標的化可能な配列空間および構築の容易さにおいて利点を有する。これらのＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインは、標的ＤＮＡ配列中の単一塩基対の認識をコードする高度に可変なジ−アミノ酸（ＲＶＤ）を含有する、３４アミノ酸のドメインの反復で構成される（図２０）。このＲＶＤコードの頑健性およびそのＤＮＡ標的に結合したＴＡＬの結晶構造に基づくと、単一反復の塩基対への結合は、隣接する反復結合に比較的左右されないように思われる。ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメイン（反復アレイ）は、ヘテロ二量体性のヌクレアーゼドメインの単量体に連結して、ＴＡＬヌクレアーゼを形成することができる。したがって、２つの別々のＴＡＬヌクレアーゼが、隣接する標的ハーフサイトに結合して、特定配列を切断することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム改変がもたらされ得る（図１９および２０）。いくつかの研究で、ＴＡＬ ＤＮＡ結合の特異性について検討がなされているが、本発明者らが知るかぎり、ＴＡＬヌクレアーゼの特異性を大規模にプロファイリングした研究はない。本発明者らは、容易に設計可能なことから予測されるＴＡＬ反復の独立したモジュール結合を確認するだけでなく、治療に関連するＴＡＬヌクレアーゼによるゲノムオフターゲット配列を同定するためにも、実施例１のＺＦＮについて概説した、ヌクレアーゼ特異性に対するハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の概念を適用した。

【0120】

ｉｎ ｖｉｔｒｏライブラリースクリーニングを介してＴＡＬヌクレアーゼの特異性をプロファイリングするための選択スキームは、実施例でＺＦＮについて記載された選択スキームと同様であった。詳細なプロトコールを、以下に示す。

【0121】

部分的に無作為化された標的部位のライブラリーの調製
２ｕｌ １０ｐｍｏｌのＴＡＬＮＣＣＲ５ライブラリーＯｌｉｇｏ（各ｏｌｉｇｏに対して別々の反応）
２ｕｌ １０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １０×反応緩衝液
１ｕｌ ５０ｍＭのＭｎＣｌ２
１ｕｌ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ ｓｓＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ）［Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ］
Ｘｕｌの水で全容積２０ｕＬにする
６０℃で１６時間インキュベートする。８５℃で１０分間インキュベートして不活化する。
各Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩ反応液（精製していない）２．５ｕｌを加える。
ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］１００試料緩衝液２５ｕｌを加える。
９５℃で３分間インキュベートする。４℃に徐々に冷却する。
ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）反応緩衝液２５ｕｌ／酵素混合物１ｕｌを加える。
３０℃で１６時間インキュベートする。５５℃で１０分間熱不活化する。
Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を使用して、ｄｓＤＮＡ量を定量する。
等モルのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）反応液を合わせて、切断部位の数に関して最終２ｕＭにする。

【0122】

ＴＡＬＮ発現
１６ｕｌ ＴｎＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ［Ｐｒｏｍｅｇａ］
０．４ｕｌ １ｍＭメチオニン
２ｕＬ ．８ｕｇのＴＡＬＮベクター発現プラスミドまたは空溶解物のための水
１．６ｕＬ 水
３０で１．５時間インキュベートした後、４℃で一晩保存する。
ウエスタンブロットにより、溶解物中のＴＡＬＮ量を定量する。

【0123】

ＴＡＬＮ消化
２５ｕＬ １０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ ３［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
１０ｕＬ ２ｕＭのＴｅｍｐｌｉＰｈライブラリーＤＮＡ
１６５ｕＬ 水
レフトＴＡＬＮ溶解物を２０ｎＭの全レフトＴＡＬＮに加える。
ライトＴＡＬＮ溶解物を２０ｎＭの全ライトＴＡＬＮに加える。
空溶解物を合計５０ｕＬの溶解物に加える。
３７℃で２時間インキュベートする。５ｕｌ（５０ｕｇ）のＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を加える。室温で１０分間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。５０ｕＬの１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶出する。

【0124】

ＴＡＬＮ消化物のアダプター連結反応、ＰＣＲ、およびゲル精製
５０ｕｌ 消化されたＤＮＡ
３ｕｌ ｄＮＴＰ混合物
６ｕｌ ＮＥＢ ２
１ｕｌ Ｋｌｅｎｏｗ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
室温で３０分間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
５０ｕｌ 溶出ＤＮＡ
５．９ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）
２ｕｌ（２０ｐｍｏｌ）の加熱／冷却アダプター（選択ごとに異なるアダプター）
１ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００単位）
室温で２０時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ ＴＡＬＮ消化ＤＮＡ
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＰＥ＿ＴＡＬＮ＿ｒｅｖ１プライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を１５サイクル行う。ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットにより精製する。
１０％グリセロール４０ｕＬ中の溶出ＤＮＡ１ｕｇを負荷して、２％アガロースゲル上でゲル精製する。１３５Ｖで３５分間、ゲル上で泳動させる。切断ハーフサイト＋完全ハーフサイト＋アダプターに相当する長さのバンドを、濾紙を用いてゲル精製する。濾紙を除去して、上清を回収する。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ ＴＡＬＮ消化ＤＮＡ（５−２６−１２）
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＰＥ＿ＴＡＬＮ＿ｒｅｖ２プライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を６サイクル行う。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。

【0125】

プレ選択ライブラリーの調製
２５ｕＬ １０×ＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ ４
１０ｕＬ ２ｕＭのＴｅｍｐｌｉＰｈライブラリーＤＮＡ
１６５ｕＬ 水
５ｕＬ 適切な制限酵素［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］
２１０ｕＬ 水
３７℃で１時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
５０ｕｌ 溶出ＤＮＡ
５．９ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）
２ｕｌ（２０ｐｍｏｌ）の加熱／冷却アダプター（４アダプター配列のプール）
１ｕｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００単位）
室温で２０時間インキュベートする。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。
６ｕＬ 制限酵素消化ＤＮＡ（５−２６−１２）
３０ｕＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ＨＦ
１．５ｕＬ １００ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｒｅｖプライマー
１．５ｕＬ １００ｕＭのＴＡＬＮＬｉｂＰＣＲプライマー
３ｕｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５ｕＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ
１０６．５ｕＬ 水
９８℃で３分間、そして９８℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間を１２サイクル。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製する。

【0126】

ハイスループットシークエンシング
ＲＴ−ｑＰＣＲにより定量する
１２．５ｕＬ ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ
１ｕＬ １０ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｒｅｖ
１ｕＬ １０ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａ＿ｆｗｄ
９．５ｕＬ 水
１ｕＬ ＤＮＡテンプレート（プレ選択ライブラリーおよびＴＡＬＮ消化の両方）
９５℃で５分間、そして９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間を３０サイクル行う。
ＤＮＡを２ｎＭに希釈する（シークエンシング標準に比較して）
５ｕＬ ＴＡＬＮ消化 ２ｎＭのＤＮＡ
２．５ｕＬ プレ選択ライブラリー ２ｎＭのＤＮＡ
１０ｕＬ ．１ＮのＮａＯＨ
室温で５分間インキュベートする
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉ−Ｓｅｑによりシークエンシングする

【0127】

計算フィルタリング
ＴＡＬＮ消化配列について、２つの適切に間隔があいた一定オリゴ配列を見出す。
プレ選択ライブラリー配列について、適切に間隔があいた一定オリゴ配列およびライブラリーアダプター配列を見出す。
切断オーバーハング、左ハーフサイト、スペーサー、右ハーフサイトに配列を構文解析する。
ハーフサイト中に悪いＩｌｌｕｍｉｎａ塩基スコアを有する配列を除去する（＜Ｂ＝拒絶）。

【0128】

【表1】

【0129】

【表2】

【0130】

【表3】

【0131】

【表4】

【0132】

結論
ハーフサイトの突然変異の数と濃縮との間の比較的規則的な（対数的な関係）傾向は、塩基対結合する１つのＴＡＬ反復結合が他の反復結合に左右されないことと一致している。補償差分析では、切断部位の１つの突然変異が他の突然変異の分布を顕著に変化させることはなく、ＴＡＬ反復ドメインが独立して結合することが示唆される。＋２８のリンカーのＴＡＬＮ構築物は、＋６３のリンカーのＴＡＬＮ構築物よりも特異的である。より大きな標的部位を認識するＴＡＬＮほど、より多くの突然変異を許容することができるという点で、特異性が低下するが、突然変異したより大きな配列の存在量は、濃縮の増加よりも少なく、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データおよびオフターゲット部位の存在量からは、より長いＴＡＬＮ対ではオフターゲット切断が起こる可能性がかなり低いことが示される。全体の標的部位突然変異が増加するにつれて、切断効率（濃縮）が規則的に低下することと各位置での濃縮とを組み合わせると、任意の配列のオフターゲット部位切断を予測することが可能になる。大体において、ＴＡＬＮ選択では、濃縮は両方のハーフサイトにおける突然変異の合計に依存し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の場合に観察されたようにハーフサイト間の突然変異の分布に依存することはない。この観察をＺＦＮの文脈依存の結合と組み合わせるとＴＡＬＥＮは、そのＺＦＮ相当物と同等またはそれより高い特異性に容易に操作することができることがわかる。

【0133】

本明細書に記述のすべての刊行物、特許、およびデータベースエントリーは、上記に収載のアイテムを含めて、あたかも個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように指示されたかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。矛盾がある場合は、本出願が、本明細書のいかなる定義も含めて、統制するものとする。

【0134】

均等物および範囲
当業者ならば、単なるルーチン的な実験作業を使用して、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定するように意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。

【0135】

特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それに反する指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味することができる。ある群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、それに反する指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する場合に満足されると見なされる。本発明は、その群の正確に１つのメンバーが所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明はまた、その群のメンバーの２つ以上またはすべてが所与の生成物または方法に存在するか、使用されるか、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。

【0136】

さらに、本発明は、あらゆる変更、組合せ、および置換を包含し、そこでは、特許請求の範囲の１つもしくは複数からの、または説明の関連部分からの１つまたは複数の限定、要素、条項、記述用語等が、別の請求項に導入されると理解されたい。例えば、別の請求項に従属している任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する他の任意の請求項に見られる１つまたは複数の限定を含むように修飾され得る。さらに、請求項が組成物を列挙する場合、別途指示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される任意の目的のために組成物を使用する方法が含まれ、また本明細書に開示の任意の製造方法または当技術分野で公知の他の方法に従って組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。

【0137】

要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群形式で提示される場合、それらの要素の各部分群もまた開示されること、また任意の要素がその群から除去され得ることを理解されたい。さらに、用語「含む」は、オープンであることを意図し、さらなる要素または工程の包含を許容することに留意されたい。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴、工程等を含むとして言及される場合、本発明または本発明の態様の特定の実施形態は、そのような要素、特徴、工程等からなるか、またはそれらから本質的になると理解されたい。単純化の目的のために、それらの実施形態は、本明細書中に、これらの言葉で具体的に示されていない。したがって、１つまたは複数の要素、特徴、工程等を含む、本発明の各実施形態に対して、本発明は、それらの要素、特徴、工程等からなるか、またはそれらから本質的になる実施形態も提供する。

【0138】

範囲が与えられる場合、端点は含まれる。さらに、別途指示されないか、文脈および／または当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表示される値は、別途文脈から明確に指示されない限り、本発明の種々の実施形態で記述の範囲内の任意の特定の値を、その範囲の下限の単位の１／１０まで想定することができると理解されたい。さらに、別途指示されないか、文脈および／または当業者の理解から別途明らかでない限り、部分範囲の端点が、その範囲の下限の単位の１／１０と同程度の正確さで表示されている、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができると理解されたい。

【0139】

加えて、本発明の特定の任意の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つまたは複数から明示的に除外され得ると理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、特許請求の範囲の１つまたは複数から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途、態様は、特許請求の範囲の１つまたは複数から除外され得る。簡潔さのために、１つまたは複数の要素、特徴、目的、または態様が除外される実施形態のすべてが、本明細書に明示的に示されることはない。

【0140】

【表5】

【0141】

表１：ヒトＫ５６２細胞のゲノム中のＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位。小文字は、標的部位に対する突然変異を示す。「Ｘ」マークが付いた部位は、対応するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載しており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。Ｋ５６２改変頻度は、空ベクターを発現する細胞に比較した、活性ＺＦＮを発現する細胞における、非相同末端結合修復（方法を参照のこと）の重要な証拠となる観察配列の頻度である。統計的に有意な改変の証拠を示さなかった部位は、検出されない（ｎ．ｄ．）として記載し、ゲノムからの非特異的ＰＣＲ増幅のため、分析されなかった３つの部位についてのＫ５６２改変頻度は空白とした。表４に、Ｋ５６２改変頻度を決定するために使用した試験部位の配列数およびＰ値を示し、表６に、各部位について得られた改変配列を示す。

【0142】

【表6】

【0143】

表２：シークエンシングの統計。解釈可能な配列の総数（「全配列」）、および各ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択条件ごとの分析配列の数を示す。分析配列は、ポスト選択配列の場合は、ＺＦＮ媒介切断のホールマークとしてこの研究で使用したサインである、少なくとも４塩基の逆相補的オーバーハング配列を含有した、曖昧なヌクレオチドを含有しない非反復配列である。「不適合オーバーハング」は、少なくとも４塩基の逆相補的オーバーハング配列を含有しなかった配列を指す。０．５ｎＭ、１ｎＭ、および２ｎＭの選択において反復配列が多く存在することは、反復配列が除去される前の、それらの選択で得られたシークエンシングリードの数が、すべての実験的選択ステップで残存した個々のＤＮＡ配列の数よりも大きかったことを示す。

【0144】

【表7】

【0145】

表３：試験した両方のＺＦＮには、３つ以下の突然変異を含む標的部位の大部分を切断する能力がある。（ａ）ＣＣＲ５−２２４ ＺＦＮおよび（ｂ）ＶＦ２４６８ ＺＦＮにより切断され得る、１つ、２つ、または３つの突然変異（ｍｕｔ）を含む配列セットの百分率を示す。選択で同定された各配列に対する濃縮係数（ＥＦ）を、ポスト選択配列決定ライブラリー中のその配列の観察頻度を、プレ選択ライブラリー中のその配列の観察頻度で割ることによって算出した。各ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択ストリンジェンシーについて計算した、野生型配列（ｗｔ ＥＦ）に対する濃縮係数を表の第１列に示す。

【0146】

【表8-1】

【表8-2】

【0147】

表４：潜在的なＣＣＲ５−２２４ゲノムオフターゲット部位。ヒトゲノムを、ＣＣＲ５−２２４切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で残存したＤＮＡ配列について検索した。「Ｘ」マークが付いた部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。ヒトゲノムのビルド（ｂｕｉｌｄ）３６からの染色体座標を記載する。各部位の突然変異頻度は、活性なＣＣＲ５−２２４を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する、配列決定されたＤＮＡ中の挿入または欠失（インデル）を含む配列の百分率である。赤色太字の部位は、空ベクターを含有する細胞に比較して、活性なヌクレアーゼ試料中に有意に濃縮されたインデル百分率を有する。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載しており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。３つの部位は、部位特異的ＰＣＲ増幅産物を生じなかったので、試験しなかった。試験しなかったそれらの部位のインデルおよび合計は示していない。表示したＰ値は、インデル頻度が、ＺＦＮを発現しない細胞に対してよりも活性ＺＦＮ処理細胞に対して大きいという片側対立仮説に対するものである。

【0148】

【表9】

【0149】

表５：ＣＣＲ５−２２４標的部位よりも多くの潜在的なゲノムＶＦ２４６８標的部位がある。ヒトゲノムを、正規ＣＣＲ５−２２４標的部位と最大９つの突然変異だけ異なる部位、および正規ＶＦ２４６８標的部位と最大６つの突然変異だけ異なる部位について、計算的に検索した。反復配列を含む、ゲノム中の５または６塩基対スペーサーを含有する部位の出現数を表に記載する。

【0150】

【表10】

【0151】

表６：培養ヒトＫ５６２細胞において同定されたＣＣＲ５−２２４媒介ゲノムＤＮＡ改変配列。ＣＣＲ５−２２４を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する潜在的なＣＣＲ５−２２４オフターゲット部位をシークエンシングした後に同定された挿入（青）および欠失（赤）を含む配列を示す。出現数を各配列の右側に示す。他の突然変異は小文字で示すが、ＰＣＲまたはシークエンシングの間に発生した突然変異を反映している可能性がある。非改変部位は、遺伝子名または座標（ビルド３６）の下に記載し、またスペーサー配列に下線を付した。

【0152】

【表11】

【0153】

表７：潜在的なＶＦ２４６８ゲノムオフターゲット部位。９７の潜在的なＶＦ２４６８ゲノム標的部位のうちの９０に対するＤＮＡを、活性なＶＦ２４６８ ＺＦＮを発現する培養Ｋ５６２細胞から、または空発現ベクターを含有する細胞からＰＣＲによって増幅した。各部位の突然変異頻度は、活性なＶＦ２４６８を発現する培養Ｋ５６２細胞に由来する、配列決定されたＤＮＡ中の挿入または欠失（インデル）を含む配列の百分率である。赤色太字の部位は、ヌクレアーゼを発現しない細胞に比較して、活性なヌクレアーゼ試料中に有意に濃縮されたインデル百分率を有する。部位の配列は、５’（＋）ハーフサイト／スペーサー／（−）ハーフサイト３’として記載されており、したがって、（＋）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。７つの部位は、部位特異的ＰＣＲ増幅産物を生じなかったので、試験しなかった。試験しなかったそれらの部位のインデルおよび合計は示していない。表示したＰ値は、インデル頻度が、ＺＦＮを発現しない細胞に対してよりも活性ＺＦＮ処理細胞に対して大きいという片側対立仮説に対するものである。

【0154】

【表12】

【0155】

【表13】

【0156】

【表14】

【0157】

表８：この研究で使用したオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド「［ＺＦＮ］［＃］ｆｗｄ／ｒｅｖ」は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに注文した。他のすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。「Ｎ」は、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、または「Ｔ」の機械的な混合取り込みを指す。アスタリスクは、その前のヌクレオチドが、そのヌクレオチドを７９モル％含有し、かつ他の正規ヌクレオチドのそれぞれを７モル％含有する混合物として取り込まれたことを示す。「／５Ｐｈｏｓ」／は、合成の間に付加された５’リン酸基を示す。

【0158】

ＶＦ２４６８データ
潜在的なＶＦ２４６８ゲノムオフターゲット部位。ヒトゲノムを、ＶＦ２４６８切断に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択で残存したＤＮＡ配列について検索した。「Ｘ」マークが付いた部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択データセット中に見出された部位である。「Ｔ」は、部位中の突然変異の総数を指し、「（＋）」および「（−）」はそれぞれ、（＋）および（−）のハーフサイト中の突然変異の数を指す。部位の配列は、ゲノム中に出現するとおりに記載しており、したがって、（−）ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。

【0159】

【表15】

【0160】

【表16】

【0161】

【表17】

【0162】

【表18】

【0163】

【表19】

【0164】

【表20】

【0165】

【表21】

【0166】

【表22】

【0167】

【表23】

【0168】

【表24】

【0169】

【表25】

【0170】

【表26】

【0171】

【表27】

【0172】

【表28】

【0173】

【表29】

【0174】

【表30】

【0175】

【表31】

【0176】

【表32】

【0177】

【表33】

【0178】

【表34】

【0179】

【表35】

【0180】

【表36】

【0181】

【表37】

【0182】

【表38】

【0183】

【表39】

【0184】

【表40】

【0185】

【表41】

【0186】

【表42】

【0187】

【表43】

【0188】

【表44】

【0189】

【表45】

【0190】

【表46】

【0191】

【表47】

【0192】

【表48】

【0193】

【表49】

【0194】

【表50】

【0195】

【表51】

【0196】

【表52】

【0197】

【表53】

【0198】

【表54】

【0199】

【表55】

【0200】

【表56】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A-C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A-B】

【図15C-D】

【図16A-B】

【図16C-D】

【図17A-1】

【図17A-2】

【図17B-1】

【図17B-2】

【図17C-1】

【図17C-2】

【図17D-1】

【図17D-2】

【図17E-1】

【図17E-2】

【図17F-1】

【図17F-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]