特許 6587057 脱顆粒抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6587057

(24)【登録日】2019年9月20日

(45)【発行日】2019年10月9日

(54)【発明の名称】脱顆粒抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/899 20060101AFI20191001BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191001BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20191001BHJP

   A61K 36/062 20060101ALN20191001BHJP

   A23L 33/105 20160101ALN20191001BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20191001BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/899

   A61P43/00 111

   A61P43/00 105

   A61P37/08

   !A61K36/062

   !A23L33/105

   A61K131:00

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-176262(P2015-176262)

(22)【出願日】2015年9月8日

(65)【公開番号】特開2017-52710(P2017-52710A)

(43)【公開日】2017年3月16日

【審査請求日】2018年6月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(73)【特許権者】

【識別番号】592022372

【氏名又は名称】坂元醸造株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】菅原 卓也

(72)【発明者】

【氏名】長野 正信

(72)【発明者】

【氏名】橋口 和典

(72)【発明者】

【氏名】藤井 暁

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０２９０２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０６０３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１６８５４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１５２７７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 堀籠 悟 ほか，RBL-2H3細胞を用いた食品成分の脱顆粒抑制作用簡易スクリーニング法，日本食品科学工学会誌，２００８年１１月，第５５巻，第１１号，ｐ．５３５−５４０

【文献】 小松 陽一，下出 佳世，地域ブランドのダイナミクス 〜黒酢の事例〜，関西大学総合情報学部紀要「情報研究」，２００７年 ７月，第２７号，ｐ．２７−５６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３３／９０６８

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酢酸成分を除去した黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤。

【請求項2】

酢酸成分を除去した黒酢を有効成分とする脱顆粒が関連して起こるアレルギー症状の予防または改善剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤に関する。また、黒酢を有効成分とするアレルギー症状の予防または改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

黒酢は約２００年もの間、健康食材として伝承され、現在は調味料としてだけでなく、飲料やサプリメント、特定保健用食品としても広く普及し、人気を集めている。玄米黒酢や米黒酢は鹿児島県福山町に伝わる伝統的醸造法である壺仕込み静置発酵法で醸造された食酢である。原料は、蒸し米・米麹・地下水のみであり、一般的醸造酢に比べて６〜９倍の玄米、あるいは米を原料に使用し、１年以上の発酵・熟成期間をかけて製造することから、含有するアミノ酸の種類と量が多いことが特徴である。

【0003】

黒酢は健康食品として古くから親しまれており、脂質代謝改善作用、高血圧抑制作用、糖代謝改善作用、肝機能改善作用、抗酸化作用など、多くの機能性が報告されてきた。例えば、特許文献１では、黒酢の有機溶媒抽出物の乾燥物、細胞質ホスホリパーゼＡ２阻害活性やＯ_２⁻産生阻害活性により抗炎症作用を有することが開示されている。しかし、黒酢について、アレルギー症状緩和や免疫促進作用に関する知見はまだ十分に得られていない。
特許文献２には黒酢が抗アレルギー作用を有するとされているものの、コレステロールや中性脂肪を減少させる効果を確認しているだけであり、抗アレルギー作用について具体的な検討はされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第４３４４０３０号

【特許文献2】特開２００７−２９０２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、黒酢の抗アレルギー作用を確認し、黒酢を有効成分とするアレルギー症状の予防または改善剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、黒酢が抗アレルギー作用である脱顆粒抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。黒酢のこの作用を活用することにより、黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤、およびアレルギー症状の予防または改善剤の提供が可能となる。

【0007】

すなわち、本発明は、次の（１）または（２）に示される脱顆粒抑制剤等に関する。
（１）黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤。
（２）黒酢を有効成分とするアレルギー症状の予防または改善剤。

【発明の効果】

【0008】

本発明により抗アレルギー剤として、黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤の提供が可能となる。この剤の提供により、ヒスタミンの放出を抑制でき、ＩｇＥが関連する花粉症等のＩ型アレルギーの症状の予防または改善を行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】黒酢による脱顆粒抑制作用を示した図である（実施例２）。

【図2】各画分における脱顆粒抑制作用を示した図である（実施例３）。

【図3】熱安定性の評価結果を示した図である（実施例３）。

【図4】プロテアーゼ抵抗性の評価結果を示した図である（実施例３）。

【図5】細胞内カルシウムイオン濃度に対する黒酢の影響を示した図である（実施例４）。

【図6】脱顆粒シグナル伝達経路に及ぼす黒酢の影響を示した図である（実施例４）。

【図7】受動皮膚アナフィラキシーモデルマウスへの黒酢の経口投与の効果を示した図である（実施例５）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明で用いられる黒酢とは、ＪＡＳ法により規定される米黒酢であり、本発明ではこのように定義される黒酢であればどのようなものでも用いることができる。特に、本発明で用いられる黒酢は陶器の壺に蒸し米、米麹、地下水を入れ、糖化、アルコール発酵、酢酸発酵までを１つの壺で進行したものを、さらに熟成させることで得られる褐色または黒褐色に着色され独特の深い味わいを有する酢であることが好ましい。
本発明の黒酢由来成分としては、黒酢そのもののほかに、黒酢から酢酸成分を除いた成分等が挙げられる。
なお、後述の実施例において、黒酢から酢酸を除した成分について各試験を行ったのは、黒酢の主成分である酢酸成分による作用との違いを明確にするべく行ったものであり、その結果、黒酢から酢酸を除いた成分に脱顆粒抑制作用があることが判明したことから、当該作用は、黒酢を由来とする成分のうちでも酢酸以外の成分にあるといえる。

【0011】

本発明の「脱顆粒抑制剤」とは、好塩基球や肥満細胞等のヒスタミン産生細胞において、細胞表面の抗体に抗原が結合する等の刺激により、細胞内に貯蔵されている顆粒が外に放出される（脱顆粒される）ことを抑制する剤のことをいう。
また、本発明の「アレルギー症状の予防または改善剤」とは、ＩｇＥによって生じる脱顆粒が関連して起こるアレルギー症状の発生を予防したり、発生した症状を緩和し、改善したりする剤のことをいう。

【0012】

本発明の「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」は、黒酢そのものでもよいし、黒酢から酢酸成分を除去した残りの成分そのものでもよい。
黒酢から酢酸成分を除去した残りの成分を分画し、脱顆粒抑制作用の高い画分のみを用いることもできる。このような画分とした場合は、分子量５００以上、より好ましくは３，５００以上の画分を用いることが好ましい。
また、これらを本発明の作用に影響を与えない他の成分と混合したものであってもよい。

【0013】

本発明の「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」の形態としては液体でもよいし、乾燥させた固体であってもよい。固体は、固形物であってもよいし、粉末状であってもよい。固体の場合は、適当な液体に溶解するかもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用することができる。製剤として使用する場合における、抽出物の使用量は製剤の形態によっても異なり、安全性に問題がないので特に上限は規定しない。

【0014】

飲食物としては、チューインガム，キャンディ，錠菓，グミゼリー，チョコレート，ビスケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム，シャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャム、乳製品、調味料等が挙げられ、本発明の「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」を添加したこれらの飲食物を日常的に摂取することで脱顆粒抑制効果やアレルギー症状の予防または改善の効果が得られる。飲食物における本発明の剤の含有量は当該飲食物の嗜好品としての味・風味等を損なわない範囲内で含まれていればよく、飲食品の種類および形態によってそれぞれ異なる。また、飼料としては通常与える飼料に混合して投与することができる。なお、本発明の黒酢は、薬物相互作用を調べた結果、薬物代謝に関連する遺伝子・タンパク質の発現に影響を及ぼさないことが判明したため、他の薬を併用した場合であっても副作用がなく、安全に摂取することが可能である。

【0015】

本発明の「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」は、ヒトやヒト以外の動物を対象とするものであることが好ましく、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、リス等のペット（愛玩動物、コンパニオンアニマルということもある。）、牛、豚等の家畜、マウス、ラット等の動物を対象とするものであってもよい。

【0016】

本発明の「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」をヒトまたはヒト以外の動物に投与する方法は、経口投与が望ましく、製剤化したものでもよいし、飲食物・飼料として摂取することも可能である。
経口投与する場合の摂取量としては、脱顆粒抑制効果やアレルギー症状の予防または改善の効果がみられる量であればよく、たとえば、黒酢エキスとしては（黒酢１０倍濃縮液として）６〜２００mg／kg体重／日が好ましい。

【0017】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

【実施例】

【0018】

〔実施例１〕
黒酢の調製
黒酢（坂元醸造株式会社製、坂元のくろず（製品名））１０００ｍｌを凍結乾燥し粉末化した。これに蒸留水を加え、再び凍結乾燥を行った。この作業を４回繰り返し、黒酢中の酢酸を完全に除去した。得られた粉末を蒸留水１００ｍｌに溶解したものを黒酢１０倍濃縮液とし、後述の実施例における試験に用いた。なお、これらの試験では、黒酢１０倍濃縮液を単に黒酢と示す場合がある。

【0019】

〔実施例２〕
脱顆粒抑制作用の評価
脱顆粒抑制作用の評価にあたり、ヒスタミンとともに顆粒中に存在するβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標として、好塩基球の脱顆粒活性を調べた。
試料として、実施例１にて調製した黒酢を用い、コントロールとして１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４（ＮａＰＢ）を用いた。

【0020】

１．ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭ培地にて前培養したラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（独立行政法人 医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）の細胞数を約２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせ、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートの各ウェルに２００μＬずつ分注し、３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養した。

【0021】

２．脱顆粒誘導
１）抗ジニトロフェロール−ＩｇＥ（シグマ社製（以下、単に抗ＤＮＰ−ＩｇＥと示す場合がある））を５０ｎｇ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで希釈して抗ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を得た。
上記１．にて一晩培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＰＢＳで洗浄し、各ウェルに抗ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を１２０μＬ入れ、２時間培養することで細胞を感作させた（抗ＤＮＰ−ＩｇＥの終濃度：２５ｎｇ／ｍＬ）。また、ブランクには抗ＤＮＰ−ＩｇＥの入っていない培地を入れた。
２）上記１）の後、各ウェルの細胞を洗浄した後、段階希釈した黒酢を添加したタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で細胞を１０分間処理し、その後、抗原としてＤＮＰ−ＨＳＡ（シグマ社製）を添加して３０分インキュベートした。黒酢の添加量はタンパク質濃度を指標として示した（各タンパク質濃度：３２５μｇ／ｍＬ、６５０μｇ／ｍＬ、１３００μｇ／ｍＬまたは２６００μｇ／ｍＬ）。
３）上記２）の後、細胞内外に存在するβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標として、脱顆粒を評価した。

【0022】

２）結果
図１、Ａにβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標とした黒酢による脱顆粒抑制作用を示した。その結果、黒酢は濃度依存的にＲＢＬ−２Ｈ３細胞の脱顆粒を抑制することが示された。
また、図１、ＢにＲＢＬ−２Ｈ３細胞の細胞生存率を示したが、黒酢による脱顆粒の抑制作用は細胞傷害性によるものではないことも明らかとなった。
従って、黒酢が脱顆粒抑制による抗アレルギー効果を有することが確認できた。

【0023】

〔実施例３〕
黒酢に含まれる脱顆粒抑制物質の検討
１．活性成分の分画および各抽出画分の活性評価
１）活性成分の分画
黒酢中に含まれる脱顆粒抑制物質がどの様な物質であるかを推察するために、透析処理によって分子サイズの推定を試みた。
次の（１）〜（３）の工程により、黒酢を分子量カット３，５００の透析膜を用いて透析をおこなった。その後、実施例２と同様の方法によりβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を測定した。
（１）分子量カット３，５００のセルロース製透析膜（スペクトラム社製）を３０分間１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）の入ったビーカー内で撹拌し、洗浄した。
（２）上記（１）で洗浄した透析膜に試料を注入し、４リットルの１０ｍＭ ＮａＰＢ を外液として、１２時間以上４℃で攪拌しながら透析した。透析中、外液を２回交換した。
（３）上記（２）の透析が終了した後、透析膜内液を回収した。

【0024】

２）結果
図２にβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標とした各画分における脱顆粒抑制作用を示した。その結果、分子量３，５００以上の物質からなる透析画分は、透析していない黒酢と比べてβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性が上昇することが確認できた。
従って、この結果より、黒酢に含まれる活性物質は遊離アミノ酸などの低分子物質ではなく、分子量３，５００よりも大きな物質である可能性が示唆された。
また、分子量カット５００の透析膜（スペクトラム社製）を用いて透析をおこなった分子量５００以上の物質からなる画分においても同様にβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性が上昇していたことから、黒酢に含まれる活性物質は、分子量５００よりも大きな物質である可能性も示唆された。

【0025】

２．熱安定性、およびプロテアーゼ抵抗性の評価
１）熱安定性の評価
熱安定性の評価として、実施例１において調製した黒酢を１００℃で３０分加熱処理した後、これを試料として実施例２と同様の方法により、βヘキソサミニダーゼの放出抑制活性の評価を行った。
その結果、図３に示されるように、黒酢を加熱処理しても、βヘキソサミニダーゼの放出抑制活性に変化が認められないことが確認できた。

【0026】

２）プロテアーゼ抵抗性の評価
タンパク質分解酵素に対する抵抗性の評価として、実施例１において調製した黒酢を種々の濃度（０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬまたは５００μｇ／ｍＬ）のトリプシン（和光純薬社製）、およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（和光純薬社製）で次の方法によって処理した。

【0027】

トリプシン処理
（１）トリプシンを１０ｍＭ ＮａＰＢで５００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬに調製した。
（２）各濃度の黒酢に上記（１）で調製したトリプシンを等量加え、３７℃、１５分間反応させた。
（３）上記（２）の１５分間の反応の後、１００℃で１０分間加熱し、トリプシンを失活させた。
（４）上記（３）にて１０分間加熱した後、氷上におき、トリプシン処理サンプルを得た。

【0028】

Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理
（１）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１０ｍＭ ＮａＰＢで５００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬに調製した。
（２）各濃度の黒酢に上記（１）で調整したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを等量加え、３７℃、１２時間反応させた。
（３）上記（２）の１２時間の反応の後、１００℃で１０分間加熱することでＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを失活させ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理サンプルを得た。

【0029】

その後、これを試料として実施例２と同様の方法により、βヘキソサミニダーゼの放出抑制活性の評価を行った。
その結果、図４、Ａおよび図４、Ｂに示されるように、黒酢をタンパク質分解酵素で処理しても、βヘキソサミニダーゼの放出抑制活性に変化が認められないことが確認できた。

【0030】

上記１、２の結果から、黒酢中の活性物質は、分子量およそ５００以上、より好ましくは３，５００以上であって、熱処理およびタンパク質分解酵素処理によって活性が変化しない物質であることが示唆された。

【0031】

〔実施例４〕
黒酢の作用メカニズムの解明
１．細胞内カルシウムイオン濃度に対する黒酢の影響
好塩基球による脱顆粒は、アレルゲンによる刺激が細胞内に伝達されると、細胞内カルシウムイオンの濃度が上昇し、誘導されることが知られている。そこで、黒酢の作用によって、この細胞内カルシウムイオンの上昇がどの様に変化するかを解明するため、カルシウムイオンの蛍光プローブであるＦｌｕｏ３（同仁化学研究所社製）を用いて、次の（１）〜（１０）の工程により検討した。

【0032】

（１）白色９６穴プレートに細胞数４．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／穴で捲き込み、１２時間インキュベートした。
（２）上記（１）のインキュベート後、培養上清を除去した後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。
（３）洗浄後のプレートに抗ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液（１，０００倍希釈）を加え、２時間３７℃でインキュベートした。
（４）上記（３）のインキュベート中に、Ｌｏａｄｉｎｇ ＢｕｆｆｅｒおよびＲｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを表１および表２に記載の組成で調製した。
（５）上記（３）のインキュベート後、上清を除去し、３７℃で加温したＰＢＳ（−）で２度洗浄した。
（６）洗浄後のプレートに（４）で調製したＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
（７）上記（６）のインキュベート後、上清を除去し、３７℃で加温したＰＢＳ（−）で２度洗浄した。
（８）洗浄後のプレートに（４）で調製したＲｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃で１０分インキュベートした。
（９）上記（８）のインキュベート後、蛍光プレートリーダーで蛍光強度（λ_ｅｘ＝４８０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３０ｎｍ）を測定し、ベースラインを調べた。
（１０）上記（９）におけるベースラインの測定後、抗原物質としてＤＮＰ−ＨＳＡ溶液を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、蛍光プレートリーダーで蛍光強度（λ_ｅｘ＝４８０ｎｍ、λ_ｅｍ＝５３０ｎｍ）を測定した。

【0033】

【表1】

【0034】

【表2】

【0035】

その結果、図５に示されるように、抗原刺激で誘導される細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が、黒酢を作用させることにより抑制されることが確認できた。この結果より、抗原誘導性の脱顆粒において、黒酢により細胞内シグナル伝達が阻害され、これによって細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑えられることにより脱顆粒が抑制されることが示唆された。

【0036】

２．脱顆粒シグナル伝達経路に及ぼす黒酢の影響
上記１．の結果をより、抗原刺激によって誘導される脱顆粒シグナル伝達経路に及ぼす黒酢の影響を次の１）〜３）の工程によって評価した。
なお、この評価において使用した一次抗体は以下のとおりである。
抗Ｌｙｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌｙｎ（Ｔｙｒ５０７）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｓｙｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｙｋ（Ｔｙｒ５２５／５２６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗ＰＬＣγ１（Ｄ９Ｈ１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗ＰＬＣγ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＣγ２（Ｔｙｒ７５９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗ＰＩ３ Ｋｉｎａｓｅ ｐ８５（１９Ｈ８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＩ３ Ｋｉｎａｓｅ ｐ８５（Ｔｙｒ４５８）／ｐ５５（Ｔｙｒ１９９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
抗Ａｃｔｉｎ（Ｉ−１９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）

【0037】

１）細胞破砕とタンパク質の抽出
黒酢を添加した培養条件で培養し、抗原刺激によって脱顆粒を誘導したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を回収した。また、比較として黒酢の代わりにＮａＰＢを添加した培養条件で培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ネガティブコントロール）、およびこの培養条件で培養し、抗原刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞（コントロール）を回収した。
これらの回収した細胞をそれぞれＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、細胞溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＦ，３０ｍＭ Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７，１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）にインヒビター（５ｍｇ／ｍＬ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ ＡＥＢＳＦ、２μｇ／ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を加えたものを添加し、泡立てないようにピペッティングし、氷上で３０分静置した。その後、１２，０００×ｇ、１５分で遠心し、上清を回収し、各細胞破砕液（サンプル）間のタンパク質濃度をそろえた。

【0038】

２）電気泳動とブロッティング
上記１）にてタンパク質濃度をそろえた各細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動にかけた後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社製）に転写した。ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜への転写には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のブロッティング装置を用い、０．８ｍＡ／ｃｍ^２の定電流で１時間の条件で行った。

【0039】

３）抗体との反応、およびバンドの検出
上記２）にてタンパク質を転写させたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク−Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−ｔ）によって、室温で１時間、ブロッキングを行った。
ブロッキング後、ＴＢＳ−ｔで５分間、３回洗浄した。一次抗体を５％ＢＳＡ−ＴＢＳ−ｔで希釈し、４℃で１２時間、膜と反応させた。一次抗体反応が終了した膜をＴＢＳ−ｔで５分間、３回洗浄したのち、二次抗体として、ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＨＲＰ（１，０００倍希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、あるいはｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ（４，０００倍希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５％スキムミルク−ＴＢＳ−ｔで希釈し、室温で１時間、膜と反応させた。二次抗体の反応後、ＴＢＳ−ｔで５分間、３回洗浄した。その後、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ ＬＤ（和光純薬社製）のＲｅａｇｅｎｔ １と２を１：１で１ｍＬ混合した発色液で発色反応を行い、イメージアナライザー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、バンドを検出した。

【0040】

その結果、図６に示されるように、黒酢を添加した培養条件で培養し、抗原刺激によって脱顆粒を誘導したＲＢＬ−２Ｈ３細胞において、脱顆粒シグナル因子のうち、Ｓｙｋ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ１、ＡＫＴの活性化レベルが抑制されていることが確認できた。Ｓｙｋは、好塩基球細胞表面上に発現している高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）直下に存在し、シグナル伝達の上流に位置するチロシンキナーゼであり、ＰＩ３ＫやＰＬＣγ１のリン酸化による活性化に関与している。従って、この結果より、黒酢中の活性物質は、Ｓｙｋのリン酸化による活性化を下方制御することで、その下流のＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ１、ＡＫＴの活性化を抑制し、カルシウムイオンの流入を抑え、脱顆粒を抑制しているものと推察された。

【0041】

〔実施例５〕
受動皮膚アナフィラキシーモデルマウスへの黒酢の経口投与の効果
黒酢の生体内における抗アレルギー効果を明らかにするため、受動皮膚アナフィラキシーモデルマウスに対する経口投与の効果を検討した。
すなわち、マウス（７週齢、雌、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ｎ＝５）の耳介皮下に抗ＤＮＰ−ＩｇＥを投与し、その２３時間後に低用量（６ｍｇタンパク質／ｋｇ体重）、および高用量（６０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重）の黒酢を経口投与した。その１時間後に０．５％エバンスブルーを含むＤＮＰを尾静脈から投与し、３０分後に、耳介におけるエバンスブルーの浸潤を評価した。

【0042】

その結果、図７に示されるように、黒酢の経口投与によって、有意に色素の浸潤が抑制されることが確認できた。従って、黒酢を経口投与することにより、耳介皮下におけるアレルギー応答が抑制でき、経口投与によって、体内におけるアレルギー応答を抑制できることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0043】

本発明により抗アレルギー剤として、黒酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤の提供が可能となる。この剤の提供により、ヒスタミンの放出を抑制でき、ＩｇＥが関連する花粉症等のＩ型アレルギーの症状の予防または改善を行うことが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】