特許 6587058 マクロファージ活性促進剤および脱顆粒抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6587058

(24)【登録日】2019年9月20日

(45)【発行日】2019年10月9日

(54)【発明の名称】マクロファージ活性促進剤および脱顆粒抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/899 20060101AFI20191001BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191001BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20191001BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20191001BHJP

   A61K 36/062 20060101ALN20191001BHJP

   A23L 33/105 20160101ALN20191001BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20191001BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/899

   A61P43/00 111

   A61P43/00 105

   A61P37/04

   A61P37/08

   !A61K36/062

   !A23L33/105

   A61K131:00

【請求項の数】4

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2015-176263(P2015-176263)

(22)【出願日】2015年9月8日

(65)【公開番号】特開2017-52711(P2017-52711A)

(43)【公開日】2017年3月16日

【審査請求日】2018年6月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(73)【特許権者】

【識別番号】592022372

【氏名又は名称】坂元醸造株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】菅原 卓也

(72)【発明者】

【氏名】長野 正信

(72)【発明者】

【氏名】橋口 和典

(72)【発明者】

【氏名】藤井 暁

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−１５２７７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０２９０２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 上野 知子，黒酢および黒酢もろみ末の機能性 ―免疫賦活作用・糖代謝改善作用を中心に―，日本醸造協会誌，２０１１年 ４月，第１０６巻，第４号，ｐ．１８３−１８９

【文献】 上野 知子 ほか，腫瘍移植マウスにおける黒酢の抗腫瘍および免疫賦活作用，日本食品科学工学会誌，２０１０年，第５７巻，第１０号，ｐ．４０８−４１３

【文献】 松永 一彦，黒酢，食品と容器，２０１４年，第５５巻，第９号，ｐ．５３６−５４１

【文献】 小松 陽一，下出 佳世，地域ブランドのダイナミクス 〜黒酢の事例〜，関西大学総合情報学部紀要「情報研究」，２００７年 ７月，第２７号，ｐ．２７−５６

【文献】 堀籠 悟 ほか，RBL-2H3細胞を用いた食品成分の脱顆粒抑制作用簡易スクリーニング法，日本食品科学工学会誌，２００８年１１月，第５５巻，第１１号，ｐ．５３５−５４０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

若酢を有効成分とするマクロファージの活性促進剤および脱顆粒抑制剤であって、
若酢がＪＡＳ法により規定される黒酢（米黒酢）の製造にあたり、酢酸発酵が完了した段階から経過期間が１０ヶ月未満である、マクロファージの活性促進剤および脱顆粒抑制剤。

【請求項2】

若酢を有効成分とするＩＬ−６またはＴＮＦ−α産生促進剤であって、
若酢がＪＡＳ法により規定される黒酢（米黒酢）の製造にあたり、酢酸発酵が完了した段階から経過期間が１０ヶ月未満である、前記産生促進剤。

【請求項3】

若酢を有効成分とする免疫力の向上剤であって、
若酢がＪＡＳ法により規定される黒酢（米黒酢）の製造にあたり、酢酸発酵が完了した段階から経過期間が１０ヶ月未満である、免疫力の向上剤。

【請求項4】

若酢を有効成分とする脱顆粒によって生じるＩｇＥが関連して起こるアレルギー症状の改善または予防剤であって、若酢がＪＡＳ法により規定される黒酢（米黒酢）の製造にあたり、酢酸発酵が完了した段階から経過期間が１０ヶ月未満である、前記アレルギー症状の改善または予防剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は未熟成の黒酢を有効成分とするマクロファージ活性促進剤および脱顆粒抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

黒酢は約２００年もの間、健康食材として伝承され、現在は調味料としてだけでなく、飲料やサプリメント、特定保健用食品としても広く普及し、人気を集めている。玄米黒酢や米黒酢は鹿児島県福山町に伝わる伝統的醸造法である壺仕込み静置発酵法で醸造された食酢である。原料は、蒸し米・米麹・地下水のみであり、一般的醸造酢に比べて６〜９倍の玄米、あるいは米を原料に使用し、１年以上の発酵・熟成期間をかけて製造することから、含有するアミノ酸の種類と量が多いことが特徴である。

【0003】

黒酢は健康食品として古くから親しまれており、脂質代謝改善作用、高血圧抑制作用、糖代謝改善作用、肝機能改善作用、抗酸化作用など、多くの機能性が報告されてきた。例えば、特許文献１では、黒酢の有機溶媒抽出物の乾燥物、細胞質ホスホリパーゼＡ２阻害活性やＯ_２⁻産生阻害活性により抗炎症作用を有することが開示されている。また、特許文献２には黒酢が抗アレルギー作用を有するとされている。しかし、これらの文献において、黒酢によるアレルギー症状緩和や免疫促進作用に関する知見はまだ十分に得られておらず、ましてや、熟成が十分に進んでいない段階の黒酢、すなわち若酢（以下、本発明において単に若酢ということがある）に至っては示唆も検討もされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第４３４４０３０号

【特許文献2】特開２００７−２９０２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、若酢のマクロファージの活性促進作用や脱顆粒反応の抑制作用を確認し、若酢を有効成分とする免疫力の向上剤やアレルギー症状の予防または改善剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、若酢がマクロファージの活性促進作用および脱顆粒反応の抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。若酢のこの作用を活用することにより、若酢を有効成分とする免疫力の向上剤やアレルギー症状の予防または改善剤等の提供が可能となる。

【0007】

すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）に示されるマクロファージ活性促進剤および脱顆粒抑制剤等に関する。
（１）若酢を有効成分とするマクロファージ活性促進剤および脱顆粒抑制剤。
（２）若酢を有効成分とするサイトカイン産生促進剤。
（３）サイトカインがＩＬ−６またはＴＮＦ−αである上記（２）に記載のサイトカイン産生促進剤。
（４）若酢を有効成分とする免疫力の向上剤。
（５）若酢を有効成分とするアレルギー症状の改善または予防剤。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、若酢を有効成分とするマクロファージ活性促進剤を提供することにより、マクロファージの活性化を行い、ＩＬ−６やＴＮＦ−α等のサイトカインの産生を促進することが可能となり、免疫力の向上が可能となる。また、本発明の脱顆粒反応抑制剤はヒスタミン放出の抑制が可能であることから、ＩｇＥが関連する花粉症等のＩ型アレルギーの症状の予防または改善を行うことも可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】若酢の培養細胞株に対する免疫促進効果を示した図である（実施例２）。

【図2】若酢の初代培養細胞に対する免疫促進効果を示した図である（実施例２）。

【図3】各画分におけるサイトカイン産生に対する効果を示した図である（実施例３）。

【図4】熱安定性の評価結果を示した図である（実施例３）。

【図5】プロテアーゼ抵抗性の評価結果を示した図である（実施例３）。

【図6】若酢によるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−４（ＬＰＳ受容体）への作用を示した図である（実施例４）。

【図7】若酢によるサイトカイン遺伝子発現に及ぼす効果を示した図である（実施例５）。

【図8】マクロファージのＮＯ産生に及ぼす若酢の影響を示した図である（実施例５）。

【図9】マクロファージの貪食活性に及ぼす若酢の影響を示した図である（実施例６）。

【図10】若酢による脱顆粒抑制作用を示した図である（実施例７）。

【図11】若酢の分子量５００Ｄａ以上の物質からなる透析画分における脱顆粒抑制作用を示した図である（実施例８）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明で用いられる「若酢」とは、ＪＡＳ法により規定される黒酢（米黒酢）の製造にあたり、原料の発酵が終了してアルコールがほぼなくなった状態から熟成が十分に進行する前までの状態のもののことをいう。例えば、黒酢の製造では、陶器の壺に蒸し米、米麹、地下水を入れ、糖化、アルコール発酵、酢酸発酵までが１つの壺で進行したものをさらに熟成させるが、この酢酸発酵が完了した段階から熟成が進行する前までのものが本発明の「若酢」となる。熟成が進行する前までのものとは、具体的には、酢酸発酵が完了した段階から経過期間が１年未満のものが好ましく、さらに好ましくは１０か月未満、特に好ましくは９か月未満、さらにいっそう好ましくは６ヶ月未満、もっとも好ましくは３ヶ月未満のものが挙げられる。このような「若酢」は熟成後の黒酢と異なり、酢酸エチルを含んでいるためフルーティな香りとなり、薄黄色を呈する。本発明の若酢由来成分としては、若酢そのもののほかに、若酢から酢酸成分を除いた成分等が挙げられる。
なお、後述の実施例において、若酢から酢酸を除した成分について各試験を行ったのは、若酢の主成分である酢酸成分による作用との違いを明確にするべく行ったものであり、その結果、若酢から酢酸を除いた成分にマクロファージの活性促進作用および脱顆粒反応の抑制作用があることが判明したことから、当該作用は、若酢を由来とする成分のうちでも酢酸以外の成分にあるといえる。

【0011】

本発明における「黒酢」とは、ＪＡＳ法により規定される米黒酢を指し、このように定義される黒酢であれば、どのようなものでも用いることができる。特に、本発明で用いられる黒酢は陶器の壺に蒸し米、米麹、地下水を入れ、糖化、アルコール発酵、酢酸発酵までを１つの壺で進行したものを、さらに熟成させることで得られる褐色または黒褐色に着色され独特の深い味わいを有する酢であることが好ましい。

【0012】

本発明の「マクロファージ活性化促進剤」とは、自然免疫系に属し、侵入微生物を貪食した後、細胞内で分解するマクロファージの活性を促進する剤のことをいう。また、本発明の「マクロファージ活性促進剤」には、マクロファージが有する作用である侵入微生物の分解断片を抗原として細胞表面上に提示し、抗原提示細胞として自然免疫系と獲得免疫系の橋渡しを行う作用を増強する剤も含まれる。このような本発明の剤は「免疫力の向上剤」として使用することもできる。

【0013】

本発明の「サイトカイン産生促進剤」とは、マクロファージが活性化されることにより、マクロファージによるサイトカインの産生を促進し得る剤のことをいう。本発明の「サイトカイン促進剤」によって産生が促進されるサイトカインは従来知られるいずれのサイトカインであっても良いが、特に、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αであることが好ましい。

【0014】

本発明の「脱顆粒抑制剤」とは、好塩基球や肥満細胞等のヒスタミン産生細胞において、細胞表面の抗体に抗原が結合する等の刺激により、細胞内に貯蔵されている顆粒が外に放出される（脱顆粒される）ことを抑制する剤のことをいう。
また、本発明の「アレルギー症状の予防または改善剤」とは、脱顆粒によって生じるＩｇＥが関連して起こるアレルギー症状の発生を予防したり、発生した症状を緩和し、改善したりする剤のことをいう。

【0015】

本発明の「マクロファージ活性促進剤」、「サイトカイン産生促進剤」、「免疫力の向上剤」、「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」は、若酢を有効成分として含む剤であればよく、この有効成分の効果を阻害しない、または、さらに効果を付与できるその他の成分を含むものであってもよい。
有効成分である若酢は独自に調製した若酢を用いることができ、この若酢を濃縮したものを用いることもできる。さらに、若酢を分画し、脱顆粒抑制作用の高い画分のみを用いることもできる。このような画分とした場合は、分子量５００以上、より好ましくは、８，０００以上の画分を用いることが好ましい。

【0016】

本発明の「マクロファージ活性促進剤」、「サイトカイン産生促進剤」、「免疫力の向上剤」、「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」は、ヒトやヒト以外の動物を対象とするものであることが好ましく、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、リス等のペット（愛玩動物、コンパニオンアニマルということもある。）、牛、豚等の家畜、マウス、ラット等の動物を対象とするものであってもよい。

【0017】

本発明の「マクロファージ活性促進剤」、「サイトカイン産生促進剤」、「免疫力の向上剤」、「脱顆粒抑制剤」や「アレルギー症状の予防または改善剤」をヒトまたはヒト以外の動物に投与する方法は、経口投与が望ましく、製剤化したものでもよいし、飲食物・飼料として摂取することも可能である。
経口投与する場合の摂取量としては、脱顆粒抑制効果やアレルギー症状の予防または改善の効果がみられる量であればよく、たとえば、若酢エキスとしては（若酢１０倍濃縮液として）６〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日が好ましい。

【0018】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

【実施例】

【0019】

〔実施例１〕
若酢の調製
坂元醸造株式会社で若酢（酸度４．３％）１０００ｍｌを凍結乾燥し粉末化した。これに蒸留水を加え、再び凍結乾燥を行った。この作業を４回繰り返し、若酢中の酢酸を完全に除去した。得られた粉末を蒸留水１００ｍｌに溶解したものを若酢１０倍濃縮液とし、後述の実施例における試験に用いた。なお、これらの試験では、若酢１０倍濃縮液を単に若酢と示す場合がある。
なお、比較試料として、黒酢または純米酢を若酢と同様に１０倍濃縮したものも調製した。これらも以下、本明細書の実施例において単に黒酢または米酢と示す場合がある。

【0020】

〔実施例２〕
マクロファージに対する免疫促進効果の検討
１．培養細胞株に対する効果
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入）のインターロイキン（ＩＬ）−６、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α産生に及ぼす若酢の効果を検討した。培養上清中のマウスＩＬ−６量の測定には、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社の酵素抗体法測定キット（Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ，＃４３１３０３）を用いた。また、マウスＴＮＦ−α量の測定には、Ｒ＆Ｄ社の酵素抗体法測定キット（ＴＮＦ−αマウスＤｕｏ ｓｅｔ，ＤＹ４１０）を用いた。測定手順は、キットの測定手順通りに行った。また、比較として黒酢および米酢の効果も検討した。

【0021】

その結果、図１に示されるように、若酢はマクロファージのＩＬ−６、およびＴＮＦ−α産生を濃度依存的に促進した。一方で、黒酢にはこの効果が認められず、データは示していないが米酢にもこの効果は認められなかった。

【0022】

２．初代マウス腹腔マクロファージに対する効果
上記１の結果を受けて、細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞以外にも効果を示すかどうかを検討するため、マウス腹腔から回収した初代マウス腹腔マクロファージ（以下、本明細書においてＰ−Ｍａｃと示す場合がある）に対する若酢の効果を検討した。
初代マウス腹腔マクロファージ（Ｐ−Ｍａｃ）は次の（１）〜（８）の工程により回収した。
（１）４．０５％チオグリコレート培地を、６週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ２ｍＬ注射した。
（２）注射から３日後、マウスを屠殺し、７０％エタノールにより消毒した。
（３）上記（２）の後、マウスの腹腔内へ０．０５％ＥＤＴＡ−ＰＢＳを４ｍＬ注射した。
（４）上記（３）のマウスを４分間ゆらして腹腔内にＥＤＴＡ−ＰＢＳを行き渡らせ、２２ゲージニードルと１ｍＬシリンジを用いて細胞を回収した。
（５）上記（４）にて回収した細胞を１２００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心した。
（６）遠心後ＥＤＴＡ−ＰＢＳをアスピレートした後、ＰＢＳで洗浄して再度遠心した。
（７）ＰＢＳをアスピレーターで廃棄し、細胞を１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で懸濁して、１０ｃｍディッシュに加えてインキューベーターに入れた。
（８）翌日、浮遊している好中球を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、培養器に接着したＰ−Ｍａｃのみを回収した。

【0023】

上記１と同様の方法により、培養液中に産生されたＴＮＦ−α量、およびＩＬ−６量の測定を行った。即ち、培養上清中のマウスＩＬ−６量の測定には、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社の酵素抗体法測定キット（Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ，＃４３１３０３）を用い、マウスＴＮＦ−α量の測定には、Ｒ＆Ｄ社の酵素抗体法測定キット（ＴＮＦ−αマウスＤｕｏ ｓｅｔ，ＤＹ４１０）を用いた。

【0024】

その結果、図２に示したように、ＲＡＷ２６４．７細胞に対する効果と同様に、若酢がＰ−Ｍａｃのサイトカイン産生を濃度依存的に促進することが確認できた。
従って、これらの結果から、若酢に含まれる成分は、マクロファージ細胞株だけでなく、初代マクロファージに対しても、サイトカイン産生を促進することが明らかになった。

【0025】

〔実施例３〕
若酢に含まれるマクロファージ活性化物質の検討
１．活性成分の分画および各抽出画分の活性評価
１）活性成分の分画
若酢中に含まれるマクロファージ活性化物質がどの様な物質であるかを推察するために、まず、透析処理によって分子サイズの推定を試みた。
次の（１）〜（３）の工程により、若酢を分子量カット８，０００の透析膜を用いて透析した。その後、実施例２と同様の方法によりＲＡＷ２６４．７細胞のサイトカイン産生に対する効果を評価した。
（１）分子量カット８，０００のセルロース製透析膜（スペクトラム社製）を３０分間、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）の入ったビーカー内で撹拌し、洗浄した。
（２）上記（１）で洗浄した透析膜に試料を注入し、４リットルの１０ｍＭ ＮａＰＢを外液として、１２時間以上４℃で撹拌しながら透析した。透析中、外液を２回交換した。
（３）上記（２）の透析が終了した後、透析膜内液を回収した。

【0026】

２）結果
図３に各画分のサイトカイン産生を示した。
その結果、分子量８，０００以上の物質からなる透析画分は、透析していない若酢と比べてサイトカインの産生量が大きく上昇することが確認できた。
従って、この結果より、若酢に含まれる活性物質は、分子量約８，０００を越える、比較的大きな物質である可能性が示唆された。

【0027】

２．熱安定性、およびプロテアーゼ抵抗性の評価
１）熱安定性の評価
熱安定性の評価として、実施例１において調製した若酢を１００℃で１０分、３０分または６０分加熱処理した後、これを試料として実施例２と同様の方法により、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生に対する促進効果を評価した。
その結果、図４に示されるように、若酢を加熱処理した場合、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生に対する促進効果が低下することが示された。特にＩＬ−６については顕著に産生促進効果が抑制された。

【0028】

２）プロテアーゼ抵抗性の評価
タンパク質分解酵素に対する抵抗性の評価として、実施例１において調製した若酢を種々の濃度（０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬ）のトリプシン（和光純薬社製）で次の方法によって処理した。

【0029】

トリプシン処理
（１）トリプシンを１０ｍＭ ＮａＰＢで５００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬに調製した。
（２）各濃度の若酢に上記（１）で調製したトリプシンを１／５量加え、３７℃、１５分間反応させた。
（３）上記（２）の１５分間の反応の後、１００℃で１０分間加熱し、トリプシンを失活させた。
（４）上記（３）にて１０分間加熱した後、氷上におき、トリプシン処理サンプルを得た。

【0030】

その後、これを試料として実施例２と同様の方法により、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生に対する促進効果を評価した。
その結果、図５に示されるように、若酢をタンパク質分解酵素で処理しても、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生促進効果に変化が認められないことが確認できた。

【0031】

上記１、２の結果から、若酢中の活性物質は、分子量およそ８，０００以上で、タンパク質分解酵素処理によって活性が変化しない物質であることが示唆された。また、熱処理で活性が低下したことから、若酢に含まれる活性物質が、ＬＰＳのようなリポ多糖である可能性は低いことが推察された。

【0032】

〔実施例４〕
若酢の作用メカニズムの解明
１．Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−４（ＬＰＳ受容体）への作用の検討
実施例３の推察をもとに、若酢に含まれる活性物質が、マクロファージの活性化に大きく関わるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−４（ＬＰＳ受容体）に作用しているか否かを検討した。

【0033】

ＴＬＲ−４の阻害剤で処理したＲＡＷ２６４．７細胞に対する若酢の効果を検討した。
即ち、ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞密度を１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１５時間前培養した。その後、若酢を６時間作用した。その際、培地で終濃度５μＭに調製したＴＬＲ−４阻害剤（ノバス バイオロジカルス社製）を添加し、インヒビターの有無による影響を検討した。

【0034】

その結果、図６に示されるように、ＴＬＲ−４のリガンドであり、ポジティブコントロールとして試験したＬＰＳによるサイトカイン産生促進活性は、ＴＬＲ−４阻害剤処理細胞に対しては、活性を示さなかった。
一方、ＴＬＲ−４阻害剤処理細胞に対する若酢の促進効果は、非処理細胞に対する効果よりも低下したものの、完全にはキャンセルされなかった。
従って、この結果より、若酢に含まれる活性物質は、ＴＬＲ−４経路の活性化を誘導するとともに、他の経路によってもマクロファージを活性化するのではないかと推察された。また、ＬＰＳ以外の成分がＴＬＲ−４経路を活性化していることが推察された。

【0035】

２．サイトカイン遺伝子発現の検討
若酢成分がＴＬＲ−４経路にも作用していることが明らかになったことから、サイトカイン遺伝子発現に及ぼす効果を次の１）〜３）の工程を経たリアルタイムＰＣＲ法によって検討した。
１）ＲＮＡ抽出
（１）手袋、マスクをした状態でＲＮａｓｅ ＡＷＡＹ（ＢＭ機器社製）で使う実験器具や机をすべてふいた。
（２）若酢を作用させたＲＡＷ２６４．７細胞のペレットにセパゾール（ナカライテスク社製）を１ｍＬ加え、ピペッティングした。細胞塊がなくなるまでよく懸濁した。
（３）上記（２）の懸濁物を５分間、室温で放置した。
（４）上記（３）のチューブにクロロホルムを２００μＬ加えボルテックスで撹拌した。
（５）上記（４）の後、チューブを１２ｋｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離した。
（６）遠心分離後、水相（最上層、透明）のＲＮＡを１５０μＬずつ１．５ｍＬチューブに３回とった。
（７）上記（６）の１．５ｍＬチューブに５００μＬの２−プロパノールを加え、ボルテックスで１，２秒撹拌した。
（８）上記（７）の後、チューブを１０分間、室温で放置した。
（９）上記（８）のチューブを１２ｋｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離した。
（１０）遠心分離後、チューブを逆さまにして上清を捨てた。
（１１）上清を捨てたチューブに７５％エタノールを１ｍＬ加え、ボルテックスで沈殿を溶かした。
（１２）上記（１１）の後、チューブを１２ｋｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離した。
（１３）遠心分離後、チューブを逆さまにして、上清を捨てた。
（１４）上清を捨てたチューブを１２ｋｒｐｍ、１分、４℃で遠心分離した。
（１５）遠心分離後、上澄みを取り除いた。
（１６）上記（１５）にて残ったペレットを１０分ほど風乾した。
（１７）上記（１６）の風乾後、ペレットを１０μＬのＤＥＰＣ水に溶かし、ＲＮＡ濃度を測定した。

【0036】

２）ｃＤＮＡの合成（逆転写）
（１）ＰＣＲ用チューブに表１に示した組成からなる試薬を取った。０．３μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを含むように上記１）にて調製したＲＮＡ抽出液を希釈した。
（２）上記（１）のチューブをサーマルサイクラーで７０℃、１０分間処理した。
（３）表２に示した組成からなる試薬を上記（２）の７０℃、１０分間処理後のチューブにピペットで取った。
（４）上記（３）のチューブをサーマルサイクラーで３７℃、１時間処理した。
（５）上記（４）の３７℃、１時間処理後のチューブを軽く遠心分離した。

【0037】

【表1】

【0038】

【表2】

【0039】

３）ＲＴ−ＰＣＲ
（１）表３に示した組成からなる試薬を調製し、マイクロチューブに分注した。なお、マウスＴＮＦ−α用プライマーのＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列表配列番号１に示し、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列表配列番号２に示した。また、マウスＩＬ−６用プライマーのＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列表配列番号３に示し、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は配列表配列番号４に示した。
（２）ＰＣＲプレートに上記２）にて合成したｃＤＮＡを２μＬずつ加え、上記（１）にて調製した試薬をプレートの１ウェルあたり１８μＬずつ分注した。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にセットし、リアルタイムＰＣＲを開始した。

【0040】

【表3】

【0041】

その結果、図７に示されるように、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αの遺伝子発現が若酢によって濃度依存的に活性化されることが明らかになった。

【0042】

〔実施例５〕
マクロファージのＮＯ産生に及ぼす若酢の影響の検討
マクロファージは、抗菌活性を持つ活性酸素種である一酸化窒素（ＮＯ）を産生している。ＮＯ産生に及ぼす若酢の影響を検討した。
即ち、若酢を添加した培地でＲＡＷ２６４．７細胞を培養し、培養上清中に分泌されたＮＯ量を、Ｇｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、キットの操作手順に従って、次の手順により測定した。
１．０．１Ｍ Ｎｉｔｒｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄを希釈し、１００μＭ Ｎｉｔｒｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎを準備した。
２．上記１．で作成したＮｉｔｒｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎを段階希釈し、１．５６〜１００μＭの検量線用の液を調製した。
３．Ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ ＳｏｌｕｔｉｏｎとＮＥＤ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを室温に戻した。
４．上記２．で調製した１．５６〜１００μＭのＮｉｔｒｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎをスタンダードとし、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清をサンプルとしてそれぞれを９６穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
５．上記４．の９６穴プレートにＳｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、５分間室温で遮光し静置した。
６．さらにＮＥＤ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、５〜１０分室温で遮光し静置した。
７．上記６．にて静置後、５４０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。

【0043】

その結果、図８に示されるように、若酢が濃度依存的にＮＯ産生を促進することが明らかになった。

【0044】

〔実施例６〕
マクロファージの貪食活性に与える若酢の影響の検討
次の１および２の方法により、若酢がマクロファージの貪食活性に与える影響を調べた。
１．蛍光標識下ザイモサンを用いたフローサイトメトリー解析法
マクロファージの貪食活性をＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＺｙｍｏｓａｎ Ａ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて、次の１）〜６）の工程によりフローサイトメトリーにて解析した。
この手法は、マクロファージがＴｅｘａｓ Ｒｅｄで蛍光標識したザイモサン（酵母の細胞壁に含まれるβ−１，３−Ｄ−グルカン）を貪食することにより５９６ｎｍの光で励起され、６１５ｎｍ付近の蛍光を発する事を利用したものである。マクロファージがザイモサンを貪食することで蛍光強度が増すため、その蛍光強度の上昇を指標として貪食率を評価した。

【0045】

１）ＲＡＷ２６７．７細胞を２４ｗｅｌｌ細胞培養用プレートにて一晩培養することでプレートへ接着させた。
２）上記１）のプレートから上清をアスピレートし、若酢を含む培地で６時間培養した。ブランク、およびコントロールは、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を含む培地で培養した。
３）ＰＢＳで細胞表面を洗浄し、コントロールと若酢を含む培地で培養したＲＡＷ２６７．７細胞は、４０μｇ／ｍＬのザイモサンを含む培地で１時間培養した。一方、ブランクのＲＡＷ２６７．７細胞には、ザイモサンの代わりに１０ｍＭ ＮａＰＢを同量添加して１時間培養した。
４）上記３）のプレートから上清をアスピレートし、冷やしたＰＢＳにて細胞をはがして４℃、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心処理により細胞を回収した。
５）上記４）のプレートに２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）−ＰＢＳにて細胞を洗浄し、再遠心することで細胞を得た。
６）上記５）で得た細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて分析した。解析はＷｉｎｄｏｗｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９で行った。

【0046】

２．ラテックスビーズの貪食
次の１）〜３）の工程により、マクロファージにラテックスビーズを作用させ、顕微鏡にて観察することによりマクロファージの貪食活性を調べた。
１）ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞密度を５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１５時間前培養した。
２）上記１）の前培養後、若酢を６時間作用させ、上清を廃棄した。
３）その後、希釈したラテックスビーズ（シグマ社製）を細胞に２４時間作用させ、顕微鏡で観察した。

【0047】

上記１および２の結果、図９に示されるように、若酢を作用させることにより、マクロファージの貪食活性が促進されることが確認できた。

【0048】

〔実施例７〕
脱顆粒抑制作用の評価
脱顆粒抑制作用の評価にあたり、ヒスタミンとともに顆粒中に存在するβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標として、好塩基球の脱顆粒活性を調べた。
試料として、実施例１にて調製した若酢を用い、コントロールとして１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．４（ＮａＰＢ）を用い、比較として、黒酢または純米酢を若酢と同様に１０倍濃縮したものを用いた。

【0049】

１．ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭ培地にて前培養したラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（独立行政法人 医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）の細胞数を約２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせ、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を９６穴プレートの各ウェルに２００μＬずつ分注し、３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養した。

【0050】

２．脱顆粒誘導
１）抗ジニトロフェロール−ＩｇＥ（シグマ社製（以下、単に抗ＤＮＰ−ＩｇＥと示す場合がある））を５０ｎｇ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで希釈して抗ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を得た。
上記１．にて一晩培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＰＢＳで洗浄し、各ウェルに抗ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液を１２０μＬ入れ、２時間培養することで細胞を感作させた（抗ＤＮＰ−ＩｇＥの終濃度：２５ｎｇ／ｍＬ）。また、ブランクには抗ＤＮＰ−ＩｇＥの入っていない培地を入れた。
２）上記１）の後、各ウェルの細胞を洗浄し、抗ジニトロフェニル−ＩｇＥを培地に添加して２時間培養した。これを洗浄した後、段階希釈した若酢を添加したタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で細胞を１０分間処理し、その後、抗原としてＤＮＰ−ＨＳＡ（シグマ社製）を添加して３０分インキュベートした。若酢の添加量はタンパク質濃度を指標として示した（各タンパク質濃度：５６μｇ／ｍＬ、１６７μｇ／ｍＬ、５０２μｇ／ｍＬ、１，００４μｇ／ｍＬまたは２，００８μｇ／ｍＬ）。
３）上記２）の後、細胞内外に存在するβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標として、脱顆粒を評価した。

【0051】

３．結果
図１０にβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標として若酢による脱顆粒抑制作用を示した。その結果、若酢は黒酢、米酢とほぼ同等の比活性で濃度依存的にＲＢＬ−２Ｈ３細胞の脱顆粒を抑制することが示された。

【0052】

〔実施例８〕
若酢に含まれる脱顆粒抑制物質の検討
１）活性成分の分画
若酢中に含まれる脱顆粒抑制物質がどの様な物質であるかを推察するために、透析処理によって分子サイズの推定を試みた。
次の（１）〜（３）の工程により、若酢を分子量カット５００Ｄａの透析膜を用いて透析をおこなった。その後、実施例２と同様の方法によりβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を測定した。
（１）分子量カット５００Ｄａのセルロース製透析膜（スペクトラム社製）を３０分間１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）の入ったビーカー内で撹拌し、洗浄した。
（２）上記（１）で洗浄した透析膜に試料を注入し、４リットルの１０ｍＭ ＮａＰＢを外液として、１２時間以上４℃で撹拌しながら透析した。透析中、外液を２回交換した。
（３）上記（２）の透析が終了した後、透析膜内液を回収した。

【0053】

２）結果
図１１にβヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を指標とした分子量５００Ｄａ以上の物質からなる透析画分における脱顆粒抑制作用を示した。その結果、分子量５００Ｄａ以上の物質からなる透析画分であっても、βヘキソサミニダーゼの放出抑制活性を保持し、脱顆粒抑制効果を示すことが確認できた。

【産業上の利用可能性】

【0054】

本発明により若酢を有効成分とするマクロファージ活性促進剤の提供が可能となる。このマクロファージの活性促進剤の提供により、マクロファージの活性化を行うことでＩＬ−６やＴＮＦ−α等のサイトカインの産生を促進や、免疫力の向上をすることができる。
また、本発明により若酢を有効成分とする脱顆粒抑制剤の提供も可能となり、この剤によりヒスタミンの放出を抑制することにより、ＩｇＥが関連する花粉症等のＩ型アレルギーの症状の予防または改善を行うことが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]