特許 6588560 オーバーラップするアンプリコンの選択的増幅

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6588560

(24)【登録日】2019年9月20日

(45)【発行日】2019年10月9日

(54)【発明の名称】オーバーラップするアンプリコンの選択的増幅

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6848 20180101AFI20191001BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20191001BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20191001BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6848 ZZNA

   C12Q1/686 Z

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】12

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-543754(P2017-543754)

(86)(22)【出願日】2016年3月1日

(65)【公表番号】特表2018-505684(P2018-505684A)

(43)【公表日】2018年3月1日

(86)【国際出願番号】US2016020284

(87)【国際公開番号】WO2016144619

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2017年8月17日

(31)【優先権主張番号】62/129,360

(32)【優先日】2015年3月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516338442

【氏名又は名称】ピラー バイオサイエンシズ インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】ワーン ジャオホゥイ

(72)【発明者】

【氏名】ソーン ガーン

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０３３４４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１７／１２９４５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０８３１８４３４（ＵＳ，Ｂ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８４８

Ｃ１２Ｑ １／６８６

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オーバーラップ領域を有する標的核酸断片を選択的に増幅する方法であって、以下のステップ：
(a) 第1のタグ（t2）および第1の標的核酸断片に相補的な第1のフォワードプライマー（F1）を含む第1のポリヌクレオチドを得、ここで、t2は、F1の5’末端にあり;
(b) 第2のタグ（t1）および第1の標的核酸断片に相補的な第1のリバースプライマー（R1）を含む第2のポリヌクレオチドを得、ここで、t1は、R1の5’末端にあり;
(c) 第2のタグ(t1)および第2の標的核酸断片に相補的な第2のフォワードプライマー(F2)を含む第3のポリヌクレオチドを得、ここで、t1は、F2の5’末端にあり;
(d) 第3のタグ(t3)および第2の核酸断片に相補的な第2のリバースプライマー(R2)を含む第4のポリヌクレオチドを得、ここで、t3は、R2の5’末端にあり; ここで前記第1および第2の標的核酸断片はオーバーラップ領域を有し、
(e) 前記第1および第2の標的核酸断片と、前記第1、第2、第3および第4のポリヌクレオチドと、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施するのに必要な試薬の有効量とを混合し、
(f) （e）の混合物に対して、変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るPCRサイクルを少なくとも2回行い、そして
(g) （f）の混合物に対して、ステップ（f）におけるアニーリング温度より5〜25℃高いアニーリング温度で、変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るPCRサイクルを行って、増幅産物を得ること、
を含む、方法。

【請求項2】

前記第2のポリヌクレオチドが、前記第2のタグ（t1）と前記第1のリバースプライマー（R1）との間に、前記第2のフォワードプライマー（F2）の完全配列のポリヌクレオチドを更に含む、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記第2のポリヌクレオチドが、前記第2のタグ（t1）と前記第1のリバースプライマー（R1）との間に前記第2のフォワードプライマー（F2）の5'末端の部分配列であるF2^を更に含む、請求項1に記載の方法。

【請求項4】

前記第2のフォワードプライマーの5'末端の部分配列がF2配列の10〜90％を含む、請求項3に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（g）におけるアニーリング温度が、ステップ（f）におけるアニーリング温度より6〜20℃高い、請求項1に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（f）におけるPCRサイクルが2〜10回繰り返される、請求項1に記載の方法。

【請求項7】

前記第3のタグは、前記第2のタグと同一である、請求項1に記載の方法。

【請求項8】

(h) 処理後または未処理のいずれかであるステップ（g）からの増幅産物を、それぞれt1およびt2に結合するが、前記第1および第2の標的核酸断片には結合しない第1および第2のユニバーサルPCRプライマーと、PCRを実施するために必要な試薬の有効量とを混合し、そして
(i) ステップ（h）の混合物に対して、変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るPCRサイクルを行って、第2の増幅産物を得ること、
を更に含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

ステップ（g）からの産物が、希釈、一本鎖エキソヌクレアーゼ消化、精製またはアダプターライゲーションによって前処理される、請求項8に記載の方法。

【請求項10】

F2^が、2〜40ヌクレオチドを含む、請求項3に記載の方法。

【請求項11】

F2^が、4〜40ヌクレオチドを含む、請求項3に記載の方法。

【請求項12】

F2^が、F2より1〜5ヌクレオチド短い、請求項3に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オーバーラップ領域を有する標的核酸断片を選択的に増幅するための方法に関する。本発明の方法は、アンプリコンのオーバーラップ領域のコピーよりも標的アンプリコンのコピーを富化する。

【0002】

配列表、テーブルまたはコンピュータプログラムの参照
配列表は、本明細書とともに、EFS-Webを介してASCII形式のテキストファイルとして同時に提出され、ファイル名はSequence Listing.txtで、作成日は2016年2月23日、サイズは5.11キロバイトである。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

マルチプレックスPCRは、異なるDNA配列に特異的なアンプリコンを産生するための単一のPCR混合物内の複数のプライマーセットからなる。一度に複数の遺伝子を標的化することにより、追加の情報を得ることができ、そうでなければ数回の試薬と実行に多くの時間が必要になるであろう。各プライマーセットのアニーリング温度は、単一の反応内で正確に機能するように最適化されなければならない。PCR一般試薬を多重化するための市販キットが入手可能である。マルチプレックスPCRの技術は、ハイスループットパラレルDNAシークエンシング技術を参照する次世代シークエンシング（NGS）の標的富化のために使用されている。数百万または数十億のDNA鎖を同時に配列決定することができ、実質的に高いスループットをもたらす。

【0004】

アンプリコンドロップアウトの1つの主な理由は、増幅中の2つの重複するアンプリコン間の短い重複領域の優先的な増幅である。現在、2つの重複するDNAアンプリコンを増幅するために、各アンプリコンを特異的に標的とするプライマー対は物理的に異なる反応ウェル、チューブまたはマイクロドロップレットに分離される。例えば、BRCA1およびBRCA2遺伝子は、100％の塩基カバレージを保証するために、オーバーラップDNAアンプリコンのPCR増幅を必要とする大きなエキソンを含む。主に効率的にオーバーラップアンプリコンを増幅することができないため、Ion AmpliSeq BRCAl and BRCA2 Panel、Qiagen GeneRead Human BRCAl and BRCA2 PanelおよびMultiplicom BRCA MASTR Dxは、3、4、5個のプライマープールにプライマー対を分ける。しかし、複数のプライマープールは、ワークフローを著しく複雑にし、テストのコストを増加させる。RainDance Technologiesは、PCRプライマーを何千ものマイクロドロップレットに分離することによってこの問題を克服するが、特別な高価な機器を使用する。

【0005】

1つのマルチプレックス反応において2つのオーバーラップDNA領域のための全てのPCRプライマーを組み合わせると、2つの異なるリバースプライマーを有する2つのフォワードプライマーの4つの異なる組み合わせから結果として生じる4つの産物が生じる。図1に従来のPCR法を示す。4つのPCR産物（図1）は、2つの標的アンプリコン（アンプリコン1およびアンプリコン2）、2つの標的アンプリコンの全領域にわたる1つの長いアンプリコン（アンプリコン4_ロング）および2つの標的とされたアンプリコン間の重複領域のみを含む1つの短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）である。従来のプライマー設計およびPCR条件を用いて、サイクル中、最も長いアンプリコン（アンプリコン4_ロング）は、4つのアンプリコンの増幅のすべてのDNAテンプレートとして機能し、2つの標的アンプリコン（アンプリコン 1＆2）のそれぞれは、最も短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）と同様に、自身のアンプリコンの増幅のためにDNAテンプレートとして機能する。全ての増幅が100％効率で起こると仮定すると、PCRサイクルnにおいて、4つの産物（アンプリコン1、アンプリコン2、アンプリコン4_ロングおよびアンプリコン3_オーバーラップ）の量は、それぞれ、n x 2ⁿ、n x 2ⁿ、2ⁿおよびn² x 2ⁿとなる。最も短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）の量は、最も長いアンプリコン（アンプリコン4_ロング）の量よりもn倍多い2つの標的アンプリコン（アンプリコン1＆2）のそれぞれのn倍である。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図1は、重複標的セグメントの増幅のための従前のマルチプレックスPCR（先行技術）を示す。

【図2】図2は、標的特異的プライマーによる増幅である、本発明のPCRの第1ラウンドの一実施形態を示す。F1およびR1は標的セグメント1のフォワードおよびリバースプライマーであり、F2およびR2は標的セグメント2のフォワードおよびリバースプライマーである。F2^は、F2プライマーの5'末端部分の部分配列である。t1、t2およびt3のタグオリゴマーは標的に結合しない。タグt2とt3は同じ配列を共有することができ、tlは異なる。1、2、3および4は、4つのプライマーの組み合わせからの増幅産物を示す。F2とRLからの短い産物であるアンプリコン3の増幅は、ステムループ構造を形成することによって阻害される。

【図3】図3は実施例1および2のヒト13番染色体上のアンプリコン1〜4の大きさおよび位置を示す。

【図4】図4は、第1ラウンドのPCR（実施例1および2）後の増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。

【図5】図5は、実施例3〜6で使用した遺伝子特異的アンプリコンの概略図である。CDS：遺伝子のタンパク質コード領域。 ROI：対象領域。この例では、ROIは、BRCA2遺伝子エキソン27のCDS + 20bp上流およびエキソン27の20bp下流（CDS±20bp）を含む。

【図6】図6は、第1ラウンド（実施例3）および第2ラウンドのPCR（実施例4）後の増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。

【図7】図7はアンプリコンのNGS結果からのカバレージデータを示すチャートである（実施例6）。

【発明を実施するための形態】

【0007】

定義
「アンプリコン」は、天然または人工の増幅または複製イベントの供給源および/または産物であるDNAまたはRNAの断片である。これに関連して、「増幅」は、遺伝子断片または標的配列、特にアンプリコンの1つまたはそれ以上のコピーの産生を指す。増幅反応の産物としてのアンプリコンは、PCR産物のような共通の実験用語と互換的に使用される。

【0008】

「ロックド核酸 (Locked nucleic acids)」（LNA（商標））は、リボース環が2'-0原子と4'-C原子とを接続するメチレン架橋によって「ロック」され、Watson-Crick結合にとって理想的な立体配座を生じる高親和性RNA類似体のクラスである。この修飾は、オリゴヌクレオチドの融解温度を有意に上昇させ、また非常高いヌクレアーゼ耐性を持つ(www.exiqon.com/lna4echiiologv)。

【0009】

「ペプチド核酸」（PNA）は、リン酸-糖ポリヌクレオチド骨格が、核酸塩基が連結されたフレキシブル擬似ペプチドポリマーによって置換されている核酸の合成ホモログである。PNA鎖は荷電していないので、PNA-DNA二本鎖は対応するDNA-DNA二重鎖よりも高い融解温度を有する。

【0010】

「ユニバーサル（PCR）プライマー」は、任意のDNA挿入配列の両端に隣接するユニバーサルタグ（例えば、図2のt1、t2および/またはt3のような非標的特異的タグ）にハイブリダイズする非標的特異的プライマーである。ユニバーサルプライマーを使用するPCRは、それらの相補的なタグ配列が隣接する任意のDNA挿入物を増幅することができる。

【0011】

本発明者らは、スケーラブルな (scalabe)マルチプレックスPCR技術であるSLIMAMP（商標）（Stem-Loop Inhibition-Mediated Amplification）を発見した。この技術は、1本のチューブ内で数十万個のアンプリコンを並列増幅することを可能にする。この新規マルチプレックスPCR法は、短い重複核酸配列を主に増幅する従来のマルチプレックスPCRの欠点なしに、オーバーラップアンプリコンを同時に増幅することができる。本方法は、アンプリコンのオーバーラップ領域のコピーに対して標的アンプリコンのコピーを富化する標的富化法である。

【0012】

本発明は、短いオーバーラップ核酸配列の優位な増幅なしに、オーバーラップ領域を有する標的核酸断片を選択的に増幅するための方法に関する。本発明は、追加の高価な装置を導入することなく、単一プライマープール中の全てのプライマーを許容する。

【0013】

本発明の方法は以下のステップ; (a)第1のタグ（t2）および第1の標的核酸断片に相補的な第1のフォワードプライマー（F1）を含む第1の核酸配列を得、(b)第2のタグ（t1）および第1の標的核酸断片に相補的な第1のリバースプライマー（R1）を含む第2の核酸配列を得、(c)第2のタグ(t1)および第2の標的核酸断片に相補的な第2のフォワードプライマー(F2)を含む第3の核酸配列を得、(d)第3のタグ(t3)および第2の核酸断片に相補的な第2のリバースプライマー(R2)を含む第4の核酸配列を得、ここで前記第1および第2の標的核酸断片はオーバーラップ領域を有し、(e) 前記第1および第2の標的核酸断片と、前記第1、第2、第3および第4の核酸配列と、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施するのに必要な有効量の試薬とを混合し、(f)（e）の混合物に対して、変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るPCRサイクルを少なくとも2回行い、そして(g) （f）の混合物に対して、ステップ（f）におけるアニーリング温度より高いアニーリング温度で、変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るPCRサイクルを行って、増幅産物を得ること、を含む方法である。上記の方法のステップは、第1ラウンドのPCRサイクルを説明する。

【0014】

F1、R1、F2、R2はゲノムDNAの特定領域に相補的な遺伝子特異的プライマーである。これらのプライマーの長さは、当業者が選択することができる。一般に、遺伝子特異的プライマーは、6〜40、10〜50、10〜40、10〜100、20〜40または20〜50ヌクレオチドの長さである。

【0015】

タグt1およびt2は、2つの異なるユニバーサルタグ配列である。タグt3は、t2と同じまたは異なる配列を有することができる。t1、t2およびt3のタグオリゴマーは、標的配列に結合しない。各タグは各遺伝子特異的プライマーの5 '末端にある。

【0016】

本発明を図2に示す。図2は説明のためのものであり、本発明を図面にのみ限定するものではない。図2の上部に、ステップ（a）〜（d）で説明したタグ、フォワードプライマー、リバースプライマー、標的核酸、アンプリコンの配置を示す。図2は、F2^がF2プライマーの5'末端部分の部分配列である、本発明の一実施形態を示す。本発明の他の実施形態において、F2^は0個のヌクレオチド（存在しない）で置換されるか、または図２のF2（F2プライマーの完全な配列）で置換される。

【0017】

ステップ(f)において、核酸および試薬の混合物は、標準的なPCR温度または当業者に公知の条件で、変性、アニーリングおよびプライマー伸長工程のPCRサイクルを少なくとも2回、例えば2〜5回または2〜10回経る。非常に初期のPCRサイクルでは、一端でのみ標識されたアンプリコンが生成される。次いで、第2のPCRサイクルにおいて、片末端タグ化アンプリコンは、他のタグ化プライマーのテンプレートとして働き、2末端タグ化アンプリコンを生成する。ステップ(f)は図2の中段に示されており、ここでアンプリコン1（Fl + R1）、アンプリコン2（F2 + R2）、アンプリコン4_ロング（F1 + R2）、アンプリコン3_オーバーラップ（F2 + R1）が最初のサイクルの後に生成される。少なくとも2回のPCRサイクルの後、両端にタグ配列を有する完全アンプリコンが生成され、ステップ（g）のアニーリング温度の上昇と共にPCRサイクルの次のラウンドの準備が整う。

【0018】

ステップ(g)において、（f）の混合物は、変性、アニーリングおよびプライマー伸長のより多くのPCRサイクルを経る。今回はステップ（f）よりも高いアニーリング温度で行う。このことは本発明の重要な特徴である。最も短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）が主に増幅されるのを防ぐため、アニーリング温度を上げる。

【0019】

アニーリング温度が（従来のPCR法のように）上昇しない場合、全ての増幅は、短い増幅産物（アンプリコン3_オーバーラップ）の増幅のためのテンプレートとしてアンプリコン1、2および4_ロングが全て機能することができる従来の方法に従う。これは、アンプリコン1、2、および4_ロングがすべて、アンプリコン3のオーバーラップのフォワードおよびリバースプライマーの遺伝子特異的部分を含むからである。増幅の結果（アニーリング温度を上げることなく）、最も短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）の量は、2つの標的アンプリコン（アンプリコン1および2、n x 2ⁿ）のそれぞれのn倍であるn²x2ⁿであり、全てのアンプリコンが同じ増幅効率を有すると仮定している。実際に増幅効率は、より短いアンプリコンがより高い増幅効率と相関するアンプリコンの長さ（Mallona I et al., BMC Bioinformatics 2011, 12：404）によって影響され、従って、より短いアンプリコンはさらにより良好に増幅する。

【0020】

本発明のステップ（g）では、アニーリング温度が上昇するので、プライマー - テンプレートハイブリダイゼーションの成功は、プライマーの遺伝子特異的部分だけでなくタグ部分も必要とする。アニーリング温度が上昇すると、アンプリコン1、2および4_ロングは、もはや短いアンプリコン（アンプリコン3_オーバーラップ）の増幅のためのテンプレートとしては機能せず、短いアンプリコン自体（アンプリコン3_オーバーラップ）のみが、それ自身のテンプレートとして機能することが出来る。本発明は、（i）最初の少なくとも2回のPCRサイクルの後のアニール温度の上昇、（ii）各アンプリコン、特にF2およびR1プライマーに関連するタグ（t1、t2、t3）の適切な配置は、同じタグt1でタグ付けされる; そのような特徴は、各アンプリコンが増幅のためのテンプレートとしてのみそれ自身のアンプリコンを使用することができるので、理論的にはすべてのアンプリコンの2ⁿ個のコピーの生産をもたらす。これは、すでにアンプリコン3（短いオーバーラップ）が標的のアンプリコンよりもn倍高くなる従来の方法よりも改善されている。実際には、より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンよりも効率的に増幅する。

【0021】

ステップ（g）において、アニール温度は、ステップ（f）のアニール温度より少なくとも2℃高い。例えば、アニーリング温度は、ステップ（f）の遺伝子特異的アニーリング温度よりも約2〜35℃、4〜35℃、5〜25℃、6〜20℃、6〜15℃高い。ステップ（g）では、PCRサイクルを少なくとも2回、例えば2〜50回、好ましくは2〜5、5〜10、10〜30、10〜40または10〜50回繰り返す。

【0022】

任意の添加塩基は、プライマー配列が100％テンプレートと一致する場合にプライマーの融解温度を上昇させることができる。本発明において、タグ配列は、少なくとも2または3ヌクレオチドの長さであり、5〜100、3〜40、10〜30、10〜40、10〜50ヌクレオチドの長さであり得る。好ましくは、タグは、遺伝子特異的タグ付けされていないプライマーの融解温度に少なくとも5℃（例えば、5〜10℃または5〜15℃）を加えるように設計される。タグ配列は、PCRにおける最初の最小2サイクル後の高いアニーリング温度のサイクル条件を提供する。タグ配列は、修飾または非修飾核酸でもあり得る。いくつかの修飾された塩基（例えば、LNAまたはPNA）は、それらの対応する天然の塩基よりも高いアニーリング温度を有する。より短いタグ配列が様々な理由で所望される場合、それらの修飾された塩基を天然塩基の代わりに使用することができる。

【0023】

本発明の一実施形態では、アンプリコン3の両端のタグt1配列のTm（融解温度）は、タイトなt-ステムを形成する程度に十分高い。当該ｔ-ステムは、プライマーtlF2のアンプリコン3テンプレートへのハイブリダイゼーションを妨げ、アンプリコン3のさらなる指数関数的増幅を防ぐ。アンプリコン3テンプレートへのプライマーtlF2の結合を阻害するために、アンプリコン3の末端のtl-ステムのTmは、tlF2オリゴ単独のTmと同じかまたはそれより高くなければならない。アンプリコン3の末端のtl-ステムの融解およびハイブリダイゼーションは、分子内動力学に従い、通常の分子間オリゴ二重鎖反応よりも有利である。したがって、同一の2つの短い相補的オリゴ配列（例えば、2〜100ヌクレオチド）は、線状二本鎖を形成する2つの相補的オリゴ配列のTmよりも1分子の非相補的ループによって連結されたステムを形成する場合、より高いTmを持つ。さらに、ステムのTmは、ステム配列の影響を受けるだけでなく、ループ長（オーバーラップ領域に相当）も影響を受ける。小さなループサイズ（例えば2〜200、5〜200、または10〜100ヌクレオチド）と比較して、大きなループサイズ（例えば、500〜1000または500〜1500ヌクレオチドなどの500ヌクレオチドより大きい）は、おそらくより大きなループの末端間の接触確率が低下するために、ステムハイブリダイゼーション速度を低下させ、通常の分子間DNA二本鎖形成の動力学と類似する。

【0024】

一実施形態では、第2の核酸配列は、第2のタグ（t1）と第1のリバースプライマー（R1）との間において、第2のフォワードプライマー（F2）の5'末端から連続して、全配列(F2)または一部配列(F2^)を任意で更に含む。図2では、プライマーt1 F2＾R1のこの任意での実施形態が示されている。一実施形態では、F2の長さに依存して、F2^の部分配列は、F2よりも1〜50、1〜20、1〜10、または1〜5ヌクレオチド短い。例えば、F2^の部分配列は、2〜40、4〜40、8〜40、8〜30または8〜20ヌクレオチドであり得る。別の実施形態では、F2^の部分配列は、F2配列の10〜50、10〜90、20〜80、30〜70、40〜90または50〜90％を含む。

【0025】

図2の下部に示すように、ステップ（g）の後、アンプリコン1（Fl + R1）、アンプリコン2（F2 + R2）、およびアンプリコン4_ロング（F1 + R2）は、PCRによって指数関数的に増幅され、アンプリコン3のオーバーラップ（F2 + R1）は抑制される。これは、F2およびR1プライマーが同じタグt1でタグ付けされているためであり、したがって、適切な長さのF2^の存在下では、t1およびF2^の配列を含む強力なステムループ構造が形成され、アンプリコン3テンプレートに対するプライマーtlF2のハイブリダイゼーションが妨げられ、アンプリコン3のさらなる指数関数的増幅が阻害される。強いステムループ構造を可能にするF2^{^}の適切な長さは、タグt1のTmに依存して変化し得る。図2は、好ましい実施形態であるt1およびF2^{^}によるステムループ形成を示す。別の実施形態では、上記のように、アンプリコン3の両端のタグt1配列のTmは、タイトなt-ステムを形成するのに十分高く、F2^{^}の存在は必要とされない。

【0026】

本発明の他の実施形態では、上記の第1ラウンドのPCRの後の上記増幅産物は、第1ラウンドにおいてt1およびt2に結合するユニバーサルプライマーを用いる第2ラウンドのPCR増幅によってさらに増幅される。本実施形態では、第一ラウンドのPCRの間、t3はt2と同じであることが要求される。第2ラウンドのPCRは、以下のステップ;
(h) 処理後または未処理のいずれかである（g）からの増幅産物を、それぞれt1およびt2に結合する第1および第2のユニバーサルPCRプライマーと、PCRを実施するために必要な試薬の有効量とを混合し、ここで、両方のユニバーサルPCRプライマーは、前記第一及び第二の標的特異的核酸配列と相補的である配列を含まず、そして
(i) （h）の混合物に対して、標準的なＰＣＲ温度及び当業者に既知の条件で、PCRの変性、アニーリングおよびプライマー伸長ステップを経るサイクルを行って、第2の増幅産物を得ること、を含む。

【0027】

ステップ（i）では、PCRサイクルを少なくとも2回、例えば5〜50回、好ましくは2〜5、5〜10、10〜30、10〜40または10〜50回繰り返す。

【0028】

PCRの第2ラウンドの間、短い重複アンプリコン3_オーバーラップおよび長いアンプリコン4_ロングの増幅は、それらのプライマー結合部位が、アンプリコン3_ショートの両端でのt1、およびアンプリコン_ロングの両端でのt2の強いステム形成によってブロックされるため、さらに阻害される。したがって、第1および第2の標的核酸アンプリコン（アンプリコン1および2）の増幅は、PCRの第2ラウンドにおいて優勢である。最終産物は、次世代シーケンシング（NGS）などの様々な目的で使用することができる。

【0029】

PCRの第2ラウンドにおいて、第1ラウンドのPCRからの（g）の産物は、例えば、希釈、一本鎖エキソヌクレアーゼ消化、精製またはアダプターライゲーション等によって、ステップ（i）の前に任意で前処理される。

【0030】

以下の実施例は、本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0031】

表1および図3は、ヒトゲノムhgl9上のアンプリコン1〜4のサイズおよび位置を示す。アンプリコン3はアンプリコン1と2のオーバーラップであり、アンプリコン4はアンプリコン1と2の両方の配列をカバーする長いアンプリコンである。

【0032】

【表1】

【0033】

表2は、実施例1および2で使用されたオリゴヌクレオチド配列を示し、図4の配列番号1〜4は、タグ配列なしのBRCA2アンプリコン1およびアンプリコン2の遺伝子特異的プライマーである。配列番号5〜6は、イルミナTSCAタグ由来のタグ配列である。配列番号7〜16は、実施例の実験において用いられたタグ付きプライマーである。

【0034】

配列番号7は、標準マルチプレックスPCRのみで使用した（図4、レーン3）。配列番号8〜14を本発明で使用した（レーン4〜8）。配列番号15〜16は、標準マルチプレックスPCRおよび本発明の両方で使用した（レーン3〜8）。

【0035】

Tmは、1,5mMのMg⁺²濃度を有するOligo Analyzer 3.1（IDTDNA）によって評価される。

【0036】

【表2】

【0037】

小文字はタグ配列を示す。下線はR1における挿入されたF2配列の一部を示す。ラベル無し大文字配列は遺伝子特異的配列を示す。N/Aは適応不可を示し、FWDはフォワード、REVはリバースを示す。

【0038】

表3は、実施例1および2のプライマーミックス情報を示す。

【0039】

【表3】

【0040】

体積比で混合した別々の増幅産物からの各シングルプレックス産物を含有する。

【0041】

実施例１
PCR増幅の第1ラウンド（遺伝子特異的プライマー）
25μLの代表的なPCR混合物は、以下の成分を含む： 12.5μLの2x Multiplex Master Mix (KAPA Biosystems、カタログ番号K5802)、low TE buffer (USB、カタログ番号75793)で5ng/μLに希釈した2μLのhuman genomic DNA (Promega、カタログ番号G3041)、6.5μLのヌクレアーゼを含まない水、および4μLの遺伝子特異的プライマーミックス(それぞれ1.25 μΜ、表3のマルチプレックスプライマーミックスレーン3〜8参照)。

【0042】

シングルプレックス（図4、レーン2）PCR、標準マルチプレックス（図4、レーン3）PCR、およびステム形成マルチプレックス（図4、レーン4〜8）PCRはすべてサーマルサイクラー上で以下の条件で実行された：
1サイクル 95℃ 2分 酵素活性化および初期DNA変性
5サイクル 95℃ 30秒 変性
60℃ 90秒 アニーリング/伸長
30サイクル 95℃ 30秒 変性
72℃ 90秒 温度を上げてのアニーリング/伸長
1サイクル 72℃ 5分 最終伸長
1サイクル 8℃ ホールド

【0043】

実施例２
アガロースゲル電気泳動
実施例1の産物をE-ベース装置（Life Technologies）で分析した。2μLの産物をヌクレアーゼを含まない水で20μLの最終容量に希釈し、2％SizeSelect E-ゲルにロードした。希釈したPCR産物（レーン2〜8）および1KbプラスDNAラダー（Invitrogen、カタログ番号10488〜090、レーン1）のDNA電気泳動を行い、ランの最後にゲルのデジタル画像を捕捉したE-ゲルイメージャー（Life Technologies）によって測定した。結果を図4に示す。

【0044】

図4のレーン2では、等量の実施例1からのシングルプレックス反応の産物が混合され、アンプリコンIおよび2で示されたゲル上で一緒に見ることができる。標準マルチプレックスPCRは、主に、アンプリコン1および2のオーバーラップから増幅されたPCR産物である、アンプリコン3（レーン3）を産生する。アンプリコン4は、アンプリコン1と2によって覆われた全領域が、レーン3で淡く見えることがある。t1のみのステムオリゴヌクレオチドおよびT1と部分的なF2（5 '末端から4ヌクレオチド）をそれぞれ含むレーン4および5は、アンプリコン１、および３の3つの検出可能なバンドと同様のパターンを示す。レーン6〜8では、すべてのアンプリコン1、2および3が見られるが、アンプリコン3はレーン3〜5に比べて実質的に減少している。

【0045】

表4および図5は、実施例3〜6において使用されるBRCA2エキソン27（B2X27）を標的とするヒトゲノムhgl9上のアンプリコンのサイズおよび位置を示す。

【0046】

【表4】

【0047】

表5は、BRCA2（B2）エキソン27（X27）増幅のために実施例3、4、5および6で使用されたオリゴヌクレオチド配列を示す。

【0048】

【表5】

【0049】

小文字はタグ配列を示す。下線は次のアンプリコンから挿入されたフォワードプライマー配列の一部を示す。ラベル無し、大文字は遺伝子特異的配列である。

【0050】

実施例３
BRCA2エキソン27（B2X27）の遺伝子特異的PCR増幅の第1ラウンド
25μLの代表的なPCR混合物は以下の成分を含む： 12.5μLの2x Multiplex Master Mix (KAPA Biosystems、カタログ番号K5802)、low TE buffer (USB、カタログ番号75793)で5ng/μLに希釈した6μLのhuman genomic DNA (Promega、カタログ番号G3041)、2.5μLのヌクレアーゼを含まない水、および4μLの遺伝子特異的プライマーミックス(それぞれ1.25μΜ)。

【0051】

従来のプライマー混合物は、配列番号17および18（B2X27アンプリコン1）、19および20（B2X27アンプリコン2）および21および22（B2X27アンプリコン3）の表5の以下の6つのオリゴを含む。SLIMAMP（商標）プライマー混合物（本発明）は、以下の6つのオリゴ17および23（B2X27アンプリコン1）、24および25（B2X27アンプリコン2）および21および22（B2X27アンプリコン3）を含む。

【0052】

標準的なマルチプレックスおよびステム形成マルチプレックスPCRは以下のようにサーマルサイクラー上で行われた：
1サイクル 95℃ 2分 酵素活性化および初期DNA変性
5サイクル 95℃ 15秒 変性
60℃ 6分 アニーリング/伸長
25サイクル 95℃ 30秒 変性
72℃ 3分 温度を上げてのアニーリング/伸長
1サイクル 8℃ ホールド

【0053】

実施例４
第2ラウンドのPCR増幅（ユニバーサルプライマー）および精製
実施例3の遺伝子特異的産物を1000倍に希釈した。25μLの代表的なPCR混合物は、以下の成分を含む; 2.5μLの10x反応バッファー、0.5μLのdNTPs、0.25μLの酵素(Roche、カタログ番号12140314001）、2μLの実施例3からの希釈した産物、2μLのIllumina Indexフォワードプライマー、2μLのIllumina Indexリバースプライマー（TruSeq Custom Amplicon Index Kit、カタログ番号FC-130-1003からの25μMプライマーストック）および15.75μLのヌクレアーゼフリー水。

【0054】

PCR増幅は下記の様に行われた：
1サイクル 95℃ 4分 初期DNA変性
95℃ 30秒 変性
20サイクル 66℃ 30秒 アニーリング
72℃ 60秒 伸長
1サイクル 72℃ 5分 最終伸長
1サイクル 8℃ ホールド

【0055】

18μlのAgencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881）を添加し、上清からビーズを分離し、上清を捨てることによって、産物を精製した。2回70％エタノールの洗浄を用いてビーズを洗浄し、32μLのヌクレアーゼフリー水を用いてビーズから産物を溶出させた。次いで、Qubit High Sensitivity緩衝液（Invitrogen、カタログ番号Q32854）198μLで希釈した2μMの産物を用いて、産物の濃度を定量した。

【0056】

実施例５
アガロースゲル電気泳動
実施例3および実施例4の産物をE-ベース装置（Life Technologies）で分析した。2μLの産物をヌクレアーゼを含まない水で20μLの最終容量に希釈し、2％SizeSelect E-ゲル上にロードした。希釈PCR産物および50bp DNAラダー（Invitrogen、カタログ番号10488-043）でDNA電気泳動を行った。泳動の最後に、ゲルのデジタル画像をE-ゲル画像（Life Technologies）によって撮影した。結果を図6に示す。

【0057】

実施例3の産物（第1ラウンドのPCR産物）を図6のレーン1〜4に示す。レーン1および2は、従来のマルチプレックスPCRの産物を示す。アンプリコン1と２および２と３とのオーバーラップである小さなアンプリコンはアンプリコン1〜3と共に生成された。一方、レーン3および4にロードされたSLIMAMP（商標）反応は、アンプリコン1〜3を主に産生し、重複するアンプリコンはごくわずかである。

【0058】

実施例4からの産物（2回目のPCR産物）は、図6のレーン5〜8に示されており、これらはユニバーサルPCRの後のビーズによって洗浄された産物である。実施例4（レーン5〜8）では、アンプリコンをタグ付けし、さらに増幅し、レーン1〜4と比較した場合のヌクレオチドサイズの増加によって実証した。SLIMAMP(商標)サンプル（本発明）は標的アンプリコン1〜3（レーン7〜8）のみを含むが、従来のマルチプレックスPCRを最初に受けたサンプルは、主に望ましくない短いオーバーラッピングアンプリコンを生成した（レーン5〜6）。

【0059】

実施例６
NGSライブラリーの正規化とシーケンシング
実施例4の各産物を、10mM Tris-HCl（0.1％Tween 20）（Teknova、カタログ番号T7724）を用いて4mMに標準化した。実施例4からのすべての標準化産物を等量（各3μg）でライブラリーミックスを作製するために混合した。5μlのライブラリーミックスを5μLの0.2N NaOHに加えてライブラリーを変性させる。HT1バッファーを用いて20pMライブラリーを調製し、ロードし、250bpの対の末端の読み取り長さで配列決定する（Illumina、カタログ番号MS-102-2003）。その後、得られた各サンプルのFastqシーケンシングリードを、BWA-MEMによってhg19参照ゲノムにアライメントした。次いで、対末端読み取りを併合し、各アンプリコン領域のカバレージを分析した。カバレッジインフォメーションを図7に示す。

【0060】

図7は、各試料中の各アンプリコンに起因するNGSリードのパーセンテージを示す。従来のマルチプレックスPCRでは、オーバーラップするアンプリコンは、標的アンプリコンよりも効率的に増幅され、それらのサイズが非常に小さい（60および82bp）ため、NGSの全読み取りの78％をカウントする。SLIMAMP（商標）サンプルでは、望ましくないオーバーラッピングアンプリコンの全てがNGSでの検出が0％に近い値に抑制された。従来のサンプルとSLIMAMP（商標）サンプルの両方で、目的とするアンプリコンに関して、アンプリコン1（267bp）は同じサイズ（アンプリコン1）は典型的により効率的に増幅するため、アンプリコン2（324bp）と3（348bp）より高いパーセンテージを示した。

【0061】

上記は本発明の好ましい実施形態を説明し、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく変更を行うことができることを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]