特許 6588765 ＤＮＡ吸着担体及びその利用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6588765

(24)【登録日】2019年9月20日

(45)【発行日】2019年10月9日

(54)【発明の名称】ＤＮＡ吸着担体及びその利用方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/04 20060101AFI20191001BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20191001BHJP

   B01D 15/08 20060101ALI20191001BHJP

   B01J 20/34 20060101ALI20191001BHJP

   B01J 20/282 20060101ALI20191001BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20191001BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20191001BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/04 B

   C12N15/00

   B01D15/08

   B01J20/34 G

   B01J20/282 C

   G01N30/88 D

   G01N30/26 A

【請求項の数】4

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-157026(P2015-157026)

(22)【出願日】2015年8月7日

(65)【公開番号】特開2017-35651(P2017-35651A)

(43)【公開日】2017年2月16日

【審査請求日】2018年6月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】309010841

【氏名又は名称】学校法人 神野学園

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中山 章文

(72)【発明者】

【氏名】古川 彰

(72)【発明者】

【氏名】湊 健

【審査官】 松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５１２０７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１８６０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０９８３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６６４５３７７（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特開平０１−１３５７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２８３５５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−０２３６６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−００３０６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０２１０３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５２９６２５４（ＵＳ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５３１０５４８（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／００− ２０／３４

Ｂ０１Ｌ １／００− ９９／００

Ｂ０４Ｂ １／００− １５／１２

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／００− １５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｂ０１Ｄ １５／００− １５／４２

Ｇ０１Ｎ ３０／００− ３０／９６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含み、ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されているＤＮＡ吸着担体。

【請求項2】

液体採取用ピペットの吸液部内に設置される請求項１に記載のＤＮＡ吸着担体。

【請求項3】

ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着し、得られたＤＮＡを含む水溶液を試料としてＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。

【請求項4】

請求項１に記載のＤＮＡ吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法に関する。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着（溶出）することが可能なＤＮＡ吸着担体に関する。更に、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞からＤＮＡを分離する方法として従来から広く用いられる方法として、最初に細胞壁を界面活性剤やタンパク質分解酵素、あるいはアルカリなどの薬品を用いて分解し、次いでフェノール・クロロホルム処理によりタンパク質を除去後、アルコールを添加してＤＮＡを沈殿回収する方法が用いられる。こうした方法では、試料中に含まれるＤＮＡの量が十分多く、試料中に例えば１００μｇから数ｍｇ程度のオーダーで含まれている場合には回収が可能であるが、これ以下の濃度で含まれている場合には回収が困難であり、更にはこうした方法では、定量性をもってＤＮＡを回収する必要がある場合に問題があった。加えて、操作方法において健康上及び環境上極めて有害なフェノール及びクロロホルムを使用すること自体が問題であり、取り扱い上、作業環境中における有機溶剤の吸入や皮膚への接触を防止する方策が必須であり、また発生する有機廃液の処理や保管についても問題があった。

【0003】

上記の問題を解決するための手段として、例えば非特許文献１に示されるように、ヒドロキシアパタイト粒子を吸着剤として用い、細胞壁を溶解してＤＮＡを遊離した試料溶液にヒドロキシアパタイト粒子を加えることでＤＮＡをこれに吸着させ、ＤＮＡを吸着したヒドロキシアパタイト粒子を試料溶液から分離することで、ＤＮＡを選択的に試料溶液から分離する方法が知られている。しかしながら、こうした方法ではヒドロキシアパタイト表面にＤＮＡが強固に吸着するため、試料溶液からＤＮＡを吸着によって分離した後に、ＤＮＡをヒドロキシアパタイト粒子表面から脱着させることが困難であり、そのため０．５モル／Ｌ前後の高濃度のリン酸ナトリウム水溶液を用いてＤＮＡを脱着させる必要があった。こうした方法で単離されたＤＮＡを含む水溶液は高濃度でリン酸ナトリウムなどの無機物を含有するため、そのままではＰＣＲ法に利用することができず、無機物濃度を低下させる目的で、例えば透析などでリン酸ナトリウムなどの低分子の無機物を取り除く必要があり、その過程でＤＮＡの切断や変性が生じる問題があった。

【0004】

これに対して、例えば特開平７−１４３８７９号公報（特許文献１）には、ヒドロキシアパタイトに吸着したＤＮＡを脱着する方法として、尿素を添加したリン酸ナトリウムで洗浄し、その後極めて高濃度のリン酸アンモニウム水溶液を用いてＤＮＡを脱着させた後に、アルコールを用いてＤＮＡを沈殿回収する方法も示されている。この場合、ＤＮＡ分子を溶解したリン酸アンモニウム水溶液中のリン酸アンモニウムは、アルコールに沈殿しないことからＤＮＡのみを沈殿回収することが可能であるが、やはり微量のＤＮＡを分離精製し、定量的に回収することは困難であった。また特開平１０−１５５４８１号公報（特許文献２）、特開平１１−９２４９４号公報（特許文献３）、特開２０００−２３６６８号公報（特許文献４）、特開２００７−２３８４７９号公報（特許文献５）等にも、ヒドロキシアパタイトに吸着したＤＮＡを脱着する方法が記載されているが、これらにおいても、表面にＤＮＡが強固に吸着するヒドロキシアパタイトを用いる方法であるため、微量のＤＮＡを分離精製し、定量的に回収することは困難であった。

【0005】

更には、通常ヒドロキシアパタイトはＤＮＡだけでなく、様々なタンパク質に対しても相互作用を及ぼし、これらを強く吸着することが知られている。通常ＤＮＡを分離しようとする検体中には、ＤＮＡのみならず様々なタンパク質や糖類が存在し、これらがヒドロキシアパタイト粒子に競争的に吸着するため、ＤＮＡを選択的に吸着させ、これを分離精製することは困難である場合があった。

【0006】

上記のようにタンパク質などの様々な夾雑物を含有する検体試料中から微量のＤＮＡを担体に吸着させて定量的に分離回収し、精製した後にこれを担体から脱着して得られたＤＮＡは、通常ＰＣＲ法等により増幅され、同定又は解析される。例えばＤＮＡの増幅による同定を行うＰＣＲ法の具体的な用途として、各種臨床診断への応用が挙げられる。例えば各種細菌やウィルスの保有するＤＮＡを同定することで、対象者がこれら細菌やウィルスに感染しているか否かの診断に利用することができる。特に近年リアルタイムＰＣＲ法の普及により、より迅速かつ正確に臨床診断が下されるようになり、例として、鳥インフルエンザ感染や各種ヘルペスウィルス感染の診断、麻疹の臨床診断、更に結核感染の診断法として既に広く普及している。これらのうちでも特に結核感染検査法としてリアルタイムＰＣＲ法を用いた検査方法（例えば非特許文献２）が保険適用されており、このようなリアルタイムＰＣＲ法やこれ以外にもＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの方法も含めた核酸増幅法は国内で年間１００万件程度の検査が行われている。リアルタイムＰＣＲ法を用いる結核感染検査法として、具体的には、喀痰２ｍＬを被験者から採取し、喀痰溶解剤を用いて、喀痰中に含まれる結核菌の細胞壁を溶解し均質化した後、前述したフェノール・クロロホルム処理でタンパク質を除き、次いでアルコール中にＤＮＡを析出させて分離する方法が用いられる。こうした方法では、結核菌を４〜８週間かけて培養し同定していたかつての標準方法と比較すると飛躍的に検査時間が短縮されてはいるものの、それでも検査に要する所要日数は３〜５日間と依然長期間を要するのが現状である。リアルタイムＰＣＲ法自体は数時間程度で完了するため、こうした長期間の検査は、もっぱら検体からのＤＮＡの分離精製に手間がかかることに起因している。

【0007】

近年国内のみならず国際的にも、結核感染の有無に関し、迅速かつ見落としのない正確性をもって診断検査を行う必要性が改めて認識されており、国内外を問わず結核感染撲滅対策が精力的に施策されているにもかかわらず、現実的には一向に感染数が減少しないのが現状である。このため、感染拡大を防止するには一刻も早い診断検査法の確立と、検査精度の向上が必須であることは言うまでもない。

【0008】

結核の最も重篤な病態の一つに結核性髄膜炎が挙げられる。この場合、初期には髄液所見が結核に典型的でない事例が多く、検出感度や検査に要する時間の長さに問題のある代表的な事例の一つに挙げられる。これに対する改良法として、近年、２組のプライマーペアを利用した２段階のＰＣＲ法を利用する高感度のＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法が開発されている。例えば非特許文献３には、高感度Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法と迅速リアルタイムＰＣＲ法を組み合わせた新たな臨床検査方法が示されている。しかしながら、この場合においても検体からのＤＮＡの分離精製方法は従来からの常法が用いられており、この部分における改良が必要であるのが現状である。

【0009】

また最近、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法という、ＰＣＲ法のような装置を用いることなく簡便にＤＮＡを増幅する方式が開発され、比較的安価に結核やマイコプラズマなどの感染に対する診断検査に用いられている。この方法は、溶菌後に溶出したＤＮＡをそれ以外の夾雑物と分離するため、夾雑物に対する吸着剤を含んだチューブに検体を加えてＤＮＡを精製して用いる方法で、ＤＮＡを比較的高純度に含む場合においてその増幅を有効に行うことのできる方法である。こうしたＬＡＭＰ法は、検体に標的とするＤＮＡが含まれているか否かを定性的に判定することを主たる目的とし、定量性がないため、検出感度限界付近にあるＤＮＡ濃度で検体中に含まれる場合、時として誤って陰性の判定が下される可能性が指摘される。このＬＡＭＰ法を利用する場合においても、検体中に含まれる微量のＤＮＡを効率よく高純度に分離精製する方法が望まれているのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開平７−１４３８７９号公報

【特許文献2】特開平１０−１５５４８１号公報

【特許文献3】特開平１１−９２４９４号公報

【特許文献4】特開２０００−２３６６８号公報

【特許文献5】特開２００７−２３８４７９号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｂｒｉｔｔｅｎ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔ． Ｗａｓｈ． Ｙｅａｒｂｏｏｋ ６８， ４００（１９７０）

【非特許文献2】楠ら、「感染症学雑誌」、６６巻、１２号、１６８２−１６９１、（１９９２）

【非特許文献3】高橋ら、「臨床神経」、５３巻、１１８７−１１９０、（２０１３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法を与えることを課題とする。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着することが可能なＤＮＡ吸着担体及び、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法を与えることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記した本発明の課題は、下記１〜５に示す手段により本質的には解決される。
１．ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むＤＮＡ吸着担体。
２．ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されている上記１に記載のＤＮＡ吸着担体。
３．液体採取用ピペットの吸液部内に設置される上記１または２に記載のＤＮＡ吸着担体。
４．上記１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着し、得られたＤＮＡを含む水溶液を試料としてＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。
５．上記１に記載のＤＮＡ吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。

【発明の効果】

【0014】

試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法が与えられる。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着することが可能なＤＮＡ吸着担体を与え、更に、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法が与えられる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】比較例１において、ストロンチウムを含まないアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図2】実施例１において、カルシウムを含まずストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図3】実施例２において、カルシウムとストロンチウムを１：４のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図4】実施例３において、カルシウムとストロンチウムを１：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図5】実施例４において、カルシウムとストロンチウムを４：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図6】比較例２において、市販のヒドロキシアパタイトを用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャート。

【図7】実施例７において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子。

【図8】比較例３において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明のＤＮＡ吸着担体は、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含む。
本発明は、ＤＮＡ吸着担体としてストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いることで、各種ＤＮＡを選択的に効率よく吸着するとともに、吸着したＤＮＡを比較的低濃度のリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着担体から脱着することができることを見出したことにより成された。すなわち、本発明者らは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子がタンパク質よりもＤＮＡを優先的に吸着し、かつ吸着したＤＮＡが、後述するように比較的低濃度のリン酸塩水溶液を用いることで容易に該アパタイト粒子から脱着することを見出した。このことは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対するＤＮＡの吸着が穏和な状態で維持されており、これに対して、該アパタイト粒子のタンパク質に対する吸着力が、ＤＮＡと比べて更にいっそう弱いことを意味している。具体的な吸着や脱着に関する条件については後述する実施例の中で詳しく説明する。

【0017】

本発明においてストロンチウムを含むアパタイト粒子とは、一般式Ｃａ_１０−ｘＳｒ_ｘ（ＰＯ_４）_６−ｙ（ＣＯ_３）_ｙＸ_２において、ｘが１〜１０の範囲の任意の実数を表し、ｙが０〜２の範囲の任意の実数を表し、Ｘが水酸基またはハロゲン基である化合物からなる固体粒子を意味する。ｘが１未満である場合には、ストロンチウムを含む効果が顕著でなくなり、本発明の効果が認められない場合がある。また、本発明において用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子には炭酸イオンがリン酸イオンと置換する形で含まれるストロンチウムを含む炭酸アパタイトの粒子も好ましく用いることができ、この場合、式中においてｙの値は０＜ｙ≦２の範囲の任意の数値をとることが好ましい。ｙが２を超える場合には、炭酸ストロンチウムの形で不純物が含まれる場合があり、こうした場合にはＤＮＡを選択的に吸着する性質が認められない場合がある。ｘは、好ましくは７〜１０である。

【0018】

本発明において用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子の合成方法については従来から知られている種々の合成方法を利用することが可能であり、例えば特開２０１４−１８０４９１号公報、特開２０１５−０８６０８１号公報、特開２０１５−０８６０８２号公報、特開２０１５−０８６０８４号公報、特開２０１５−０８６０９７号公報、特開２０１５−０９３８２５号公報などに開示される合成方法を利用して得られる各種ストロンチウムを含むアパタイト粒子を本発明に利用することが最も好ましい。

【0019】

本発明で用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子として、特開２０１５−０８６０８１号公報、特開２０１５−０８６０８２号公報、特開２０１５−０８６０８４号公報、特開２０１５−０８６０９７号公報などに記載される炭酸イオンを含む炭酸ストロンチウムアパタイトの粒子も好ましく用いることができる。あるいは、特開２０１５−０９３８２５号公報等に記載されるようなストロンチウムを含むフッ素アパタイト粒子を用いることも好ましく行われる。

【0020】

本発明においてストロンチウムを含むアパタイト粒子の大きさに関しては特に制限はないが、体積平均粒子径で１０μｍを超える場合には、顆粒状粒子としてこれをＤＮＡ吸着担体としてそのまま利用することも好ましく行うことができる。更にこれを液体クロマトグラフィーの固定層として用いることも好ましい。例えば、カラムに充填してカラムクロマトグラフィーの充填剤として利用することで、試料溶液からＤＮＡを吸着分離するために利用することも好ましく行うことができる。
ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径の上限は特に限定されないが、例えば、１０００μｍ以下であることが好ましい。なお本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径は、光回折法又は光散乱法により測定される。

【0021】

ストロンチウムを含むアパタイト粒子の大きさとして体積平均粒子径が１０μｍ以下である場合にはこれを微粉体として繊維マトリックスに担持させて用いることも好ましく行うことができる。ここで繊維マトリックスとは、ポリエステル繊維、ナイロン繊維などの各種プラスチック繊維や、木綿、綿花などの天然繊維、あるいは、ガラス繊維や金属繊維などの繊維の集合体で構成されるシート状、綿状、布状、帯状、紐状、袋状などの形状を有する３次元マトリックスが挙げられる。繊維マトリックスは、通液性を有することが好ましい。繊維マトリックスに微粉体である該アパタイト粒子が担持されていると、これにＤＮＡを含む試料溶液を通液する際に、担持されている微粉体である該アパタイト粒子にＤＮＡが吸着保持されることで、試料溶液からＤＮＡを分離することが可能となる。この場合、該アパタイト粒子は繊維マトリックスから脱離しないように固定されていることが好ましい。
本発明においては、ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されていることが好ましい。

【0022】

繊維マトリックスとして各種繊維から構成されるシート状、綿状、布状、帯状、紐状、袋状などの形状を有する３次元マトリックスの具体的な例として、各種不織布や濾布、綿等の通液性の良好な繊維基材を利用することが好ましい。また、繊維マトリックスを構成する繊維の繊維径としては１〜５０μｍの範囲にあることが好ましい。繊維マトリックスは、目付が平米当たり１〜２００ｇの範囲にあるものが好ましい。

【0023】

本発明において繊維マトリックスに固定されるストロンチウムを含むアパタイト粒子の量には好ましい範囲が存在する。繊維マトリックスの単位面積あたりに固定される該アパタイト粒子の固形分量を以て表した場合、単位平方メートル当たり０．１〜５０ｇの範囲にある場合が好ましく、０．５〜４０ｇの範囲にある場合がより好ましい。単位平方メートル当たり０．１ｇを下回る量で該アパタイト粒子を繊維マトリックスに固定した場合、検体試料溶液からＤＮＡを吸着し分離する際に、単位面積あたり吸着されるＤＮＡの量が少なく、分離担体としての効率や利便性が低下する場合がある。あるいは、逆に単位平方メートル当たり５０ｇを上回る量で該アパタイト粒子を繊維マトリックスに固定した場合、繊維マトリックスを構成する各繊維の間隙を該アパタイト粒子が埋めることで通液性が低下し、試料溶液が通液せず、ＤＮＡの回収に支障を来す場合がある。

【0024】

ストロンチウムを含むアパタイト粒子を繊維マトリックスに固定する方法として、例えば種々のバインダーを利用して繊維表面に該アパタイト粒子を接着する方法が好ましく利用される。特に、用いる該アパタイト粒子の大きさが体積平均粒子径で１μｍ以下である場合には、種々のバインダーを利用して繊維マトリックスを構成する繊維表面に接着することが極めて好ましい。こうした目的で利用可能であるバインダーとして、種々のアクリル樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、アセタール樹脂、ポリアミド樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂などの疎水性ポリマーや、あるいはポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等の水溶性合成樹脂や、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系樹脂を好ましく用いることができる。特に各種水溶性樹脂をバインダーに利用する場合には、これを耐水化することで、該アパタイト粒子を繊維マトリックスに耐水固定化することが好ましい。耐水化を付与するために用いることのできる耐水化剤として、各種エポキシ系架橋剤やイソシアネート系架橋剤を各種水溶性樹脂とともに用いることを好ましく行うことができる。

【0025】

上記において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対してバインダーを用いてこれを繊維マトリックスに固定する場合、該アパタイト粒子に対するバインダーの比率に好ましい範囲が存在する。好ましくは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対してバインダーを１０〜１００質量％用いる。該アパタイト粒子に対してバインダーを１０質量％未満で用いた場合には、バインダーを用いた効果が現れにくく、繊維マトリックスから該アパタイト粒子が脱落する場合がある。あるいは、該アパタイト粒子に対してバインダーを１００質量％を超える範囲で用いた場合には、該アパタイト粒子の表面がバインダーで被覆されることからＤＮＡの吸着が阻害され、本発明の効果が認められない場合がある。

【0026】

本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子は、体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子として用いることがより好ましい。該アパタイト粒子の粒子径が減少するに伴い、該アパタイト粒子の表面積が飛躍的に増大することから、該アパタイト粒子単位重量あたりに吸着保持できるＤＮＡの量が格段に増大することからきわめて好ましく利用することができる。ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径の下限は、例えば、５０ｎｍ以上であることが好ましい。これよりストロンチウムを含むアパタイト粒子の粒子径が小さい場合は、ＤＮＡ吸着後に、溶液から粒子を遠心分離などの方法で分離することが困難となる場合がある。

【0027】

前述した各種合成方法を用いて得られるストロンチウムを含むアパタイト粒子は、これにボールミルなどを利用する乾式粉砕処理を施すことで、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子に加工することが可能である。あるいは、水中もしくは各種有機溶剤中において各種メディアミル装置を利用した湿式分散処理を施すことで、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子に加工することも好ましく利用することができる。

【0028】

本発明においてメディアミル装置を利用した上記の湿式分散処理とは、具体的には、水もしくは各種有機溶剤中にストロンチウムを含むアパタイト粒子を添加し、これに、分散処理用のメディアとしてガラスビーズやアルミナビーズ、その他のセラミックビーズ等を加えて振盪や撹拌を行い、該アパタイト粒子と該ビーズが機械的に衝突し、微粉砕されることであって、このように該アパタイト粒子の湿式分散処理を行う方法が好ましい。メディアを含まないで例えば超音波照射下で湿式分散処理を行った場合には、分散が十分に進行せず、粒子径が１０μｍを超える粗大粒子が混在するため、該アパタイト粒子を性状が整った微粉体もしくは微粒子として利用したい場合に支障を来す場合がある。あるいは、ホモジナイザーなどの高速撹拌装置を使用した場合でも、同様に粗大粒子が混在する場合があることから該アパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子としての利用に支障を来す場合がある。

【0029】

メデイアミル装置の具体的な例を挙げると、少量をバッチ方式で湿式分散処理を行う場合には、メディアミル装置としてペイントコンディショナーを使用して数時間に亘る振盪を行うことで湿式分散処理を行うことができる。またメディアミル装置として、ダイノーミル（ＷＡＢ社製）に代表される横型ビーズミルのような連続方式での湿式分散処理が可能である装置を用いて、これを複数台用いて直列に配置して１パスで湿式分散処理を行っても良く、あるいは１台のメディアミルを用いて複数回処理を繰り返すことも好ましく行うことができる。このような湿式分散処理を行うことで、水または各種有機溶剤中においてストロンチウムを含むアパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子を製造することができる。メディアミル装置としては、これら以外にも様々な形状、タイプの装置が市販されるが、いずれの場合も、装置がメディアを用いて水中または各種有機溶剤中において湿式分散処理を行うことのできる装置であれば基本的には使用することができる。

【0030】

上記したメディアを利用してストロンチウムを含むアパタイト粒子の湿式分散処理を行う場合に、使用するメディアはセラミックビーズを用いることが好ましい。特に、ビーズが研磨されるなどしてビーズ由来の不純物が該アパタイト粒子中に混入することを防止することが好ましく、仮に、微細に粉砕されたビーズ由来の成分が混入した場合であっても、これが該アパタイト粒子に対するＤＮＡの吸着挙動に影響を及ぼさないことが好ましい。こうした目的で利用できるセラミックビーズとして、具体的にはＺｒＯ、立方晶ジルコニア、イットリウム安定化ジルコニア、ジルコニア強化アルミナなどのジルコニアを含有するセラミックビーズを最も好ましく用いることができる。また、メディアの平均直径は０．０１〜１０ｍｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。こうしたメディアを使用したメディアミルを用いる湿式分散処理の条件は、通常行われる室温での処理であり、特に処理時間や温度等に関する制限は無い。また、パス回数については１回で十分である場合もあるが、２〜７回程度のパス回数で処理を行うことで、より粒子径分布が狭く、かつ分散安定性に優れたストロンチウムを含むアパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子を製造することができる。

【0031】

上記のような方法を利用して、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは１μｍ以下の微粒子に加工したストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いて、これを繊維マトリックスに固定する具体的な方法としては、以下に述べる方法を好ましく用いることができる。例えば一つの方法として、該アパタイト粒子を水もしくは各種有機溶剤中に分散した液に必要に応じてバインダーを加えてこれを塗工液として用い、この塗工液中に繊維マトリックスを浸漬して引き上げ、余分な塗工液を除いた後、繊維マトリックスに保持された塗工液を乾燥して該アパタイト粒子を固定する方法を好ましく用いることができる。あるいは、スプレー噴霧やカーテン塗工などの方法で該塗工液を繊維マトリックスに満遍なく付着させ、その後に乾燥を行って該アパタイト粒子を固定する方法などを利用することが可能である。

【0032】

本発明のＤＮＡ吸着担体を用いると、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを効率的に分離し精製することができる。本発明のＤＮＡ吸着担体は、例えば、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ試料の調製等において好適に用いられる。
本発明のＤＮＡ吸着担体を用いてＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを分離し精製する方法は特に限定されない。例えば、ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、リン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着することにより、ＤＮＡを分離精製して回収することができる。
上記ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離する方法は特に限定されず、例えば、ＤＮＡを含む試料溶液と、該ＤＮＡ吸着担体とを接触させてＤＮＡ吸着担体にＤＮＡを吸着させ、次いで該ＤＮＡを吸着させたＤＮＡ吸着担体と、試料溶液とを分離することにより、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離することができる。
ＤＮＡ吸着担体に吸着したＤＮＡの脱着は、ＤＮＡを吸着したＤＮＡ吸着担体を、リン酸塩を含む水溶液と接触させることにより行うことができる。リン酸塩を含む水溶液とＤＮＡ吸着担体とを接触させることにより、吸着していたＤＮＡがストロンチウムを含むアタパイト粒子から脱着して、ＤＮＡを含む水溶液を得ることができる。
このような方法により、試料溶液に含まれるＤＮＡを分離し精製することができる。得られるＤＮＡを含む水溶液は、ＰＣＲ法による核酸増幅に用いる試料等として好適に用いることができる。

【0033】

本発明のＤＮＡ吸着担体は、例えば、ＤＮＡ吸着担体を液体採取用ピペット（液体を採取するピペット）の吸液部内に設置して使用することができる。このように液体採取用ピペットの吸液部内に設置されるＤＮＡ吸着担体は、本発明における好ましい実施態様の一つである。本発明のＤＮＡ吸着担体が吸液部内に設置された液体採取用ピペットを用いると、ＤＮＡを試料溶液から簡便な操作で効率よく分離し精製することができる。また、上述したようにＤＮＡ吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いることもできる。このようなＤＮＡ吸着担体の利用方法も、本発明に包含される。

【0034】

本発明において、ＤＮＡを試料溶液から分離回収するためにストロンチウムを含むアパタイト粒子を利用するための好ましい態様として、上記のように繊維マトリックスに該アパタイト粒子を固定した状態で、該繊維マトリックスを、液体採取用ピペットの吸液部内に設置して用いることを極めて好ましく行うことができる。この場合、液体採取用ピペットの吸液部として、例えば、各種分注器、ピペット、マイクロピペットの先端に取り付けて吸液を行うためのチップである場合が好ましいが、ピペット自体が吸液部を兼ねるガラスピペットやディスポーザブルタイプのプラスチック製ピペットも同様に用いることができる。このようなピペットの吸液部の内部に該アパタイト粒子を固定した繊維マトリックスを設置し、ピペット吸液部内部から該アパタイト粒子やこれを固定した繊維マトリックスが脱離することなく用いた場合、該ピペットにより試料溶液を採取することで該アパタイト粒子に試料溶液中に含まれるＤＮＡが吸着し、該ＤＮＡを分離精製することができる。後述する実施例において詳細に説明するように、具体的な手順として、下記（ｉ）〜（ｖ）を行うことで、検査しようとする試料溶液からＤＮＡを分離精製して回収することができる。
（ｉ）試料溶液を、該アパタイト粒子を設置したピペット吸液部に吸入する。
（ｉｉ）吸入した試料溶液をピペット吸液部外に排出する。
（ｉｉｉ）必要であれば手順（ｉ）及び（ｉｉ）を複数回繰り返す。
（ｉｖ）純水（イオン交換水や蒸留水など）を用いてピペット吸液部内部を洗浄する。
（ｖ）リン酸塩を溶解した水溶液を用いて、ピペット吸液部内部の該アパタイト粒子に吸着したＤＮＡを脱着させる。
特に（ｉｉｉ）の段階で、複数の試料溶液からＤＮＡの吸着を行うことで、これらに含まれるＤＮＡを濃縮した状態で分離回収することが可能である。

【0035】

従来技術では、既存のアパタイトを利用した場合に、試料中の各種タンパク質や糖類がアパタイトの表面に競争的に吸着するため、試料中のＤＮＡの吸着を阻害し、ＤＮＡの回収を困難にする場合があった。更には、既存のアパタイトにＤＮＡが強固に吸着することから、吸着したＤＮＡを脱着するために極めて高濃度のリン酸塩を溶解した水溶液を用いることが必要とされ、このことがＰＣＲ法などで回収したＤＮＡの増幅や分析を行う際に妨げになる場合があった。

【0036】

試料溶液からＤＮＡを分離する際に、試料溶液の温度には好ましい範囲が存在し、２０〜８０℃の範囲に調節した試料溶液に対して該アパタイト粒子もしくはこれを担持した繊維マトリックス、あるいは上記したピペット吸液部を接触させることで、該アパタイト粒子にＤＮＡを吸着させることが好ましく行われる。例えば、ＤＮＡ吸着担体として該アパタイト粒子を単体で用いる場合には、試料溶液中に該アパタイト粒子を懸濁させ、適当な時間を経て該アパタイト粒子を濾過により回収し、次いで粒子表面に吸着したＤＮＡをリン酸塩水溶液を用いて脱着し、回収することが行われる。ＤＮＡ吸着担体として該アパタイト粒子を担持した繊維マトリックスを用いる場合も、同様にして試料溶液からＤＮＡを分離回収することが行われる。

【0037】

本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に吸着したＤＮＡを脱着する際に用いることのできるリン酸塩を含む水溶液として、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素アンモニウム等から選ばれるリン酸塩を全体で０．３モル／Ｌ以下の濃度で含む水溶液を用いることができる。好ましくは、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を使用する。こうした場合においては、ＤＮＡとともに含まれるリン酸塩の影響は、ＰＣＲ法などの分析方法において妨げとはならず、上記濃度のリン酸塩を含むＤＮＡ水溶液をＰＣＲ法の試料として好ましく利用することができる。

【0038】

上記ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着し、得られたＤＮＡを含む水溶液を試料としてＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法も、本発明に包含される。

【0039】

本発明のＤＮＡ吸着担体は、上記した製造方法により製造され、その後に好ましくは滅菌処理されることが好ましい。滅菌方法としては、従来から行われているオートクレーブを用いた加熱滅菌処理や、エチレンオキサイドガスによる化学的滅菌処理、あるいはガンマ線照射や電子線照射による放射線滅菌処理方法など、いずれの方法によっても滅菌処理が可能である。

【0040】

以下に実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率は断りのない限り質量基準である。

【実施例】

【0041】

（実施例１〜４及び比較例１）
（各種アパタイトの合成）
１Ｌの三角フラスコ内に、塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）をそれぞれ表１に示す割合で秤取り、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍＬのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ中で、５０℃に調整した水浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を１時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に１時間加熱攪拌を行った。その後水浴上から三角フラスコを移し、室温まで冷却した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、６０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物の収量は、各々の理論収量に対してほぼ１００％の収量であった。生成物を、Ｘ線回折装置（ミニフレックス、リガク社製）を用いて広角Ｘ線回折により解析した結果、アパタイトに特有の結晶回折パターンを示し、結晶性は比較的低いもののアパタイトに帰属される以外の回折ピークは認められなかった。更に、ＦＴ−ＩＲ測定において何れの試料も１４６０ｃｍ^−１、１４０５ｃｍ^−１及び８７０ｃｍ^−１付近にＢ型炭酸アパタイトに特有の吸収が認められた。

【0042】

【表1】

【0043】

各々の実施例及び比較例で得られたアパタイトである粉体をメノウ乳鉢で磨り潰すことで体積平均粒子径が１００〜３００μｍの範囲にある粒子を得た。これらを各々試験管に１ｇずつ添加した。濃度１モル／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム（和光純薬工業社製）及びウシ血清由来アルブミン（和光純薬工業社製）を各々５００ｐｐｍの濃度に溶解した溶液を、それぞれの試験管に１０ｍＬずつ添加し、４０℃に調節した水浴中において十分に攪拌し、静置後、上澄み液を濾過して吸着処理後の試料溶液とし、次のＨＰＬＣ測定を行った。また、サケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液を濾過したものを吸着処理前の試料溶液とし、ＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣ測定条件として、カラムは水系ＧＰＣ用カラム３本（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ５０００ＰＷ_ＸＬ、Ｇ３０００ＰＷ_ＸＬ、Ｇ２５００ＰＷ_ＸＬ、全て東ソー製）を連結して使用し、移動相はｐＨ６．７のリン酸緩衝液（濃度０．１モル／ＬでＮａ_２ＨＰＯ_４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ_２ＰＯ_４を含有。）を用い、流速１ｍＬ／分、カラム温度４０℃で測定を行った。サンプルの導入量は２０μＬで行い、検出器は波長２８０ｎｍにおける紫外検出器を用いた。各々のサンプルのＨＰＬＣ測定を行った結果を図１〜５に示す。図１〜５中、実線が吸着処理前の試料のチャートであり、破線が吸着処理後の試料のチャートである。なお、アパタイト粒子の体積平均粒子径は、アパタイト粒子を水に添加し光散乱回折式粒度分布計（粒度分布測定装置ＬＡ−９２０、堀場製作所社製）を使用して測定した。

【0044】

図１は、比較例１において、ストロンチウムを含まないアパタイト粒子である炭酸アパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。吸着処理前では、ＤＮＡ及びアルブミンは図中に示す位置に分離して溶出されるが、吸着処理後においては、ＤＮＡはアパタイト粒子に吸着して溶出されず、一方アルブミンも、その大部分が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。この例では、ストロンチウムを含まないアパタイト粒子はＤＮＡ及びアルブミンの両方に対して高い吸着能力を示すことが明らかとなった。

【0045】

図２は、実施例１において、カルシウムを含まずストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡの大部分はアパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれており（約８０％程度吸着して試料溶液から取り除かれている）、一方アルブミンは、その大部分がアパタイト粒子に吸着せずに試料溶液に残されていることが分かった。この実施例１では、ストロンチウムを含むアパタイト粒子はＤＮＡに対する高い吸着能力を示す一方で、アルブミンに対する吸着能力が顕著に低下しており、ＤＮＡに対する高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。

【0046】

図３は、実施例２において、カルシウムとストロンチウムを１：４のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡの大部分は該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンは、該アパタイト粒子に吸着せずにほぼ全量が試料溶液中に取り残されていることが明らかとなった。この実施例２では、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対する極めて高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。

【0047】

図４は、実施例３において、カルシウムとストロンチウムを１：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡはほぼ３５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンは、該アパタイト粒子に吸着せずにほぼ全量が試料溶液中に取り残されていることが明らかとなった。この実施例３でも、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対する高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。

【0048】

図５は、実施例４において、カルシウムとストロンチウムを４：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡはほぼ３５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンはほぼ１５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれていることが明らかとなった。この実施例４でも、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対するある程度の選択吸着性を示すことが明らかとなった。

【0049】

（比較例２）
比較例２として、市販されるヒドロキシアパタイトであるＨＡＰ−１００（医薬品グレード高純度ヒドロキシアパタイト：Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２、太平化学産業社製）を用いて、先の実施例及び比較例と同様にして試料作製及びＨＰＬＣ測定を行った。図６に結果を示す。図６は比較例２において、市販のヒドロキシアパタイトを用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。図６中、実線が吸着処理前の試料のチャートであり、破線が吸着処理後の試料のチャートである。この場合、吸着処理後においてＤＮＡは該アパタイトに少量吸着されており、一方アルブミンに対する吸着性がより高い結果であった。この例では、試料溶液中からＤＮＡを選択的に吸着分離することはできなかった。

【0050】

（実施例５）
実施例２で用いたカルシウムとストロンチウムを１：４のモル比で含むアパタイト粒子を用いて、乾式ボールミルにより微粉砕を行い、体積平均粒子径が５μｍである微粉体を得た。次に、ガラス製パスツールピペットの先端内面部分にカット綿を詰めて層とし、これに水中でスラリーにした上記アパタイト微粉体を通液してカット綿上でろ過を行い、該アパタイト微粉体をカット綿の上面及び内部に固定化した。蒸留水を用いて数回このパスツールピペットの内部を洗浄した場合、内部に固定化された該アパタイト微粉体が流出しないことを確認した。次に、先の実施例及び比較例で使用したサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液１０ｍＬを液温２０℃にして、このパスツールピペットのアパタイト微粉体を含むカット綿の層に通液し、回収した液について先と同様にしてＨＰＬＣ測定を行った。その結果、試料溶液に含まれていたＤＮＡのうち約５０％が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。

【0051】

次に、上記と同様にして作製した該アパタイト微粉体をカット綿に固定化して吸液部内部に設置したパスツールピペットを用いて、サケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液の液温を５０℃として通液する以外は上記と同様にして試料作製及びＨＰＬＣ測定を行った。その結果、試料溶液に含まれていたＤＮＡの全量が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。

【0052】

上記で、試料溶液を液温５０℃で通液したパスツールピペットの内部を、蒸留水を用いて繰り返し洗浄を行った場合、洗浄液中にはＤＮＡが含まれず、蒸留水による該アパタイト微粉体からのＤＮＡの脱着は生じないことを確認した。次に、試料溶液を液温５０℃で通液したパスツールピペット内部に、濃度０．１モル／ＬでＮａ_２ＨＰＯ_４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ_２ＰＯ_４を含むリン酸塩水溶液５０ｍＬを通液し回収したところ、回収液中にＤＮＡが含まれていることがＨＰＬＣ測定により明らかとなった。回収液中にはアルブミンは含まれておらず、かつ回収されたＤＮＡの量は元の試料溶液中に含まれているＤＮＡの量とほぼ一致していたことから、試料溶液中のＤＮＡがほぼ定量的に上記パスツールピペット内の該アパタイト微粉体に吸着され、吸着したＤＮＡを比較的低濃度のリン酸塩を含む水溶液を用いて容易に脱着できることが明らかとなった。

【0053】

（実施例６）
実施例２で用いたカルシウムとストロンチウムをモル比で各々１：４の比率で含むアパタイト粒子を用いて、メディアミルにより湿式分散処理を行い、ストロンチウムを含むアパタイトの微粒子を作製した。すなわち、上記の実施例２で得たストロンチウムを含むアパタイト２０ｇを０．２リットルのポリプロピレン容器に移し、更にポリメタクリル酸メチル４ｇとテトラヒドロフラン７６ｇ及び粒径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して６時間湿式分散処理を行った。その後、濾布を使用して分散物からジルコニアビーズを分離した。得られた分散液に含まれる、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の大きさを測定するために、光散乱回折式粒度分布計（粒度分布測定装置ＬＡ−９２０、堀場製作所社製）を使用して測定したところ、体積平均粒子径は０．８μｍであった。

【0054】

上記で得られたストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液中に、平均繊維径２０μｍのポリエステル長繊維を使用して湿式不織布法で製造した厚み１００μｍ、目付１５ｇ／ｍ^２の不織布を浸漬し、引き上げて余分な液を落下させながら乾燥を行い、繊維表面にバインダーとしてポリメタクリル酸メチルを用いて上記アパタイト微粒子を固定化した不織布試料を得た。蛍光Ｘ線測定装置によりこの不織布試料の解析を行ったところ、不織布１平方メートル当たり約１０ｇのストロンチウムを含むアパタイト微粒子が担持されていることが分かった。得られた不織布試料を直径１ｃｍの円形に切り抜き、これを丸めてマイクロピペット用チップ（２００μＬ）の内部に装填した。このようにして作製したチップを用いて、先の実施例及び比較例で使用したサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液を液温５０℃にして、マイクロピペットを利用してチップ内に吸液し、１分間吸液した状態を保ってから排液した。排液した試料について、先と同様にしてＨＰＬＣ測定を行ったところ、試料溶液中から大部分のＤＮＡが取り除かれていることが判明した。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。次に、ＤＮＡを吸着して含むチップ内を、濃度０．１モル／ＬでＮａ_２ＨＰＯ_４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ_２ＰＯ_４を含むリン酸塩水溶液１ｍＬを用いて、繰り返し洗浄を行なったところ、ほぼ定量的にＤＮＡが溶出し、アルブミンを含まない状態でリン酸溶液中に回収されていることが分かった。

【0055】

（実施例７及び比較例３）
（ＢＣＧ菌を利用したＰＣＲ法による結核菌ＤＮＡの増幅試験）
ＢＣＧ菌を利用した結核菌ＰＣＲ検査に対するモデル試験を以下のように実施した。マクファーランドＮｏ．１．０に調製したＢＣＧ菌液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）０．１ｍＬを喀痰０．９ｍＬに加えてＢＣＧ菌株含有喀痰Ａ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。次いで、菌濃度が段階的に１／１０ずつ低下するよう、喀痰にて希釈した喀痰液を調製し、順にＢ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^６ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｃ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^５ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｄ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^４ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｅ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^３ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｆ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０^２ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｇ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０ｃｆｕ／ｍＬ）とし、比較（ブランク）としてＢＣＧ菌液を加えない喀痰液をＨ液として使用した。これらの１００μＬを、各々ビーズ入りのマイクロチューブに加え、次いで濃度２％の水酸化ナトリウム１００μＬと濃度１モル／Ｌのジチオスレイトール２０μＬをそれぞれに加えて１分間振盪撹拌した。これを３７℃で１０分間加温後、濃度１モル／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μＬをそれぞれに加えて中和し、各々の試料溶液とした。次いで、各試料溶液２００μＬに対して実施例２で得られた、カルシウムとストロンチウムをモル比で１：４の比率で含むアパタイト粒子を５０ｍｇ添加して攪拌しながら、３７℃で１０分間加温した。その後、アパタイト粒子を濾過により分離し、該粒子を１ｍＬのＴＥ緩衝液で３回洗浄を行った。次いで、濃度０．１５モル／ＬでＮａ_２ＨＰＯ_４と、濃度０．１５モル／ＬでＫＨ_２ＰＯ_４を含むリン酸塩水溶液（ｐＨ６．８）を１００μＬ用いて吸着したＤＮＡを溶出（脱着）し、得られたＤＮＡ溶出液中のＢＣＧ菌株ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で定量した。プライマー及びプローブはアプライドバイオシステムズ社製ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブキット（蛍光色素：ＦＡＭ）を使用した。結果を図７に示した。図７は、実施例７において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子を示す。この図より、ＢＣＧ菌株含有喀痰のＢＣＧ菌濃度がＥ液に相当する３×１０^３ｃｆｕ／ｍＬ以上であれば、本方法で菌体の存在を検出することが可能であることが分かった。

【0056】

一方、比較例３として、市販されるヒドロキシアパタイト吸着担体（バイオゲル（登録商標）ＨＴＰハイドロキシアパタイト、バイオラッド社製）をＤＮＡの吸着担体として用いて、上記実施例７と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法によるＢＣＧ菌の検出感度を調べる実験を行ったところ、図８に示す結果を得た。図８は比較例３において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子を示す。この図より、ＢＣＧ菌株含有喀痰のＢＣＧ菌濃度がＣ液に相当する３×１０^５ｃｆｕ／ｍＬ以上であれば、菌体の存在を検出することが可能であることが分かった。なお、図７及び図８において、太い横線より蛍光強度が上回れば、菌体の存在を検出することが可能な程度にＤＮＡが増幅されたことを示す。実施例７と比較例３を比較することで、本発明のストロンチウムを含むアパタイト粒子をＤＮＡ吸着担体として利用することで、ＰＣＲ法において検出感度が１００倍程度向上することが明らかとなった。なお、図７及び図８において測定に用いたＣ液の結果がＢ液の結果と近接する数値を与えているが、これは試料溶液を調整する際の濃度に若干のフレが存在したためと推定される。

【0057】

（実施例８〜１０及び比較例４、５）
（ＤＮＡ吸着担体からのＤＮＡの溶出性試験）
実施例８、９及び１０として、各々実施例１、実施例２及び実施例４の合成方法で得られたストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた。実施例７と同様にして、ＢＣＧ菌液を喀痰に加えて調整したＢＣＧ菌株含有喀痰を水酸化ナトリウムとジチオスレイトールで処理後、トリス塩酸緩衝液で中和処理を行った試料溶液を調製し、その試料溶液７００μＬ中に、各々のアパタイト粒子０．２ｇを添加して３７℃で１０分間加温しながら撹拌を行い、試料中に含まれるＤＮＡの吸着を行った。同様に、比較例４として比較例１の合成法で得られた炭酸アパタイトを用い、比較例５として比較例３で用いたヒドロキシアパタイトを用いて、上記と同様にして用いてＤＮＡの吸着を行った。得られたそれぞれのＤＮＡを吸着したアパタイト粒子に対し、リン酸塩濃度を０．１モル／Ｌ、０．２モル／Ｌ及び０．３モル／Ｌに調節した３水準の濃度のリン酸塩水溶液（Ｎａ_２ＨＰＯ_４とＫＨ_２ＰＯ_４をモル比１／１で含有）を用いて溶出（脱着）処理を行い、得られた溶出液を試料として用いて実施例７と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅試験を行った。その結果、比較例４では、濃度０．２モル／Ｌと濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が確認されたが、濃度０．１モル／Ｌの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したＤＮＡ濃度が希薄なため、ＰＣＲ法でサイクル数を増加させてもＤＮＡの増幅は確認されなかった。また、比較例５では濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が確認されたが、濃度０．２モル／Ｌと濃度０．１モル／Ｌの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したＤＮＡ濃度が希薄なため、ＰＣＲ法でサイクル数を増加させてもＤＮＡの増幅は確認されなかった。これに対して実施例８〜１０では、何れの濃度のリン酸緩衝液を用いて溶出した試料でもＰＣＲ法で顕著なＤＮＡの増幅が確認された。

【0058】

更に、比較例４で濃度０．２モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料と、比較例５で濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料、及び実施例８〜１０で、濃度０．１モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料について、それぞれ紫外線分光光度計により２６０ｎｍ吸光度、２８０ｎｍ吸光度を測定し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比を求めた。２６０ｎｍ吸光度は試料中に含まれるＤＮＡ濃度に比例し、２８０ｎｍ吸光度は試料中に含まれるタンパク質濃度に比例する値である。更に、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比は、タンパク質に対するＤＮＡの濃度比を表し、この値が大きいほどＤＮＡ吸着担体の選択吸着性が高いことを表す。結果を表２に示した。表２より、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合には、比較例の場合と比べ、より選択性が高くＤＮＡを吸着することが明らかとなり、更に担体に吸着したＤＮＡを溶出できるリン酸緩衝液中のリン酸塩濃度も０．３モル／Ｌ以下の濃度で可能であることが実証された。

【0059】

【表2】

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明のＤＮＡ吸着担体はＰＣＲ法への利用以外にも、アフィニティークロマトグラフィーをはじめとする様々なカラムクロマトグラフィーの充填剤等の、液体クロマトグラフィー用固定層に利用することで、核酸やタンパク質の分離に利用することが可能である。更には、遺伝子導入に際して利用される遺伝子のキャリヤーとしての遺伝子ベクターとしての利用にも用いることが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】