特許 6589119 異所性骨化を治療する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6589119

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】異所性骨化を治療する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/198 20060101AFI20191007BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20191007BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/198ZNA

   A61K31/436

   A61K31/704

   A61P19/04

   A61P19/08

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

【請求項の数】5

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2018-533651(P2018-533651)

(86)(22)【出願日】2016年12月9日

(65)【公表番号】特表2019-501177(P2019-501177A)

(43)【公表日】2019年1月17日

(86)【国際出願番号】US2016065810

(87)【国際公開番号】WO2017112431

(87)【国際公開日】20170629

【審査請求日】2019年4月17日

(31)【優先権主張番号】62/387,439

(32)【優先日】2015年12月24日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】511000957

【氏名又は名称】ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＣＨＩＧＡＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】ベンジャミン レビ

(72)【発明者】

【氏名】シャイレッシュ アガーウォール

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 Molecular Therapy，２０１１年，Vol.19(8)，pp.1426-1432

【文献】 J. Oral. Biosci.，２００８年，Vol.50, Suppl.，p.181, P-183

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｋ ３１／４３６

Ａ６１Ｋ ３１／７０４

Ａ６１Ｐ １９／０４

Ａ６１Ｐ １９／０８

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝性異所性骨化（ＨＯ）を有する対象、又は、遺伝性ＨＯを患うおそれを有する対象を治療するための医薬品であって、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムス、ゾタロリムス、３２デオキシ−ラパマイシン、ジゴキシン、イマチニブ、又はＰＸ−４７８を含む医薬品。

【請求項2】

ＰＸ−４７８を含む、請求項１に記載の医薬品。

【請求項3】

ラパマイシンを含む、請求項１に記載の医薬品。

【請求項4】

対象が、遺伝的に異所性骨病変形成の素因を有し、又は、遺伝疾患を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の医薬品。

【請求項5】

対象が、進行性骨化性線維異形成症を患う、請求項４に記載の医薬品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、異所性骨化を治療するための方法に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／３８７，４３９号の優先権を主張するものであり、その開示内容は参照により組み込まれる。

【0003】

政府所有権に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＧＭ１０９１０５の下で政府支援により行われた。政府は本発明に対し一定の権利を有する。

【0004】

電子的に提出された資料の参照による援用
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表を含み、これは参照によりその全体が組み込まれ、以下の通りに識別される：ファイル名：５０３１３Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１，４８８バイト、２０１６年１２月６日作成。

【背景技術】

【0005】

異所性骨化（ＨＯ）は、軟組織における病的な骨外性骨化である。Ｖａｎｄｅｎ Ｂｏｓｓｃｈｅ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ，Ｊ Ｒｅｈａｂｉｌ Ｍｅｄ ２７，１２９（２００５）。このプロセスは、広範囲表面積の熱傷、筋骨格損傷、整形外科手術、及び脊髄損傷を含む重度の外傷を有する患者集団において、ならびに進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）として知られる遺伝疾患を有する患者集団において生じる。ＦＯＰは、Ｉ型骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体ＡＣＶＲ１における過剰活性化変異によって引き起こされ、ＦＯＰを有する患者は、実質的外傷が何ら存在しない状態で異所性骨病変を発症する。これらの病的な異所性骨化の臨床的後遺症には、外傷の設定であれ遺伝的変異の設定であれ、治癒しない創傷、慢性疼痛、及び関節の硬直が含まれる。ＦＯＰの症例において、進行性の骨化は、胸郭コンプライアンスの喪失に起因して死につながり得る。

【0006】

ＨＯに対する治療選択肢は、外科的切除の後に骨が再発し、一部の患者ではＨＯがその繊細な位置に起因して切除不能であり得ることから、限定されている。手術の危険性は、とりわけ再発に直面して、切除の有益性を上回り得る。危険性のある患者においてＨＯが最初に出現する前にそれを予防することができる治療選択肢が必要とされる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、例えば、異所性骨化の治療を必要とする対象において異所性骨化を治療する方法であって、酸素誘導因子−１α（Ｈｉｆ−１α）を対象に投与することを含む、方法を含む。種々の実施形態において、Ｈｉｆ−１α阻害剤は、ＰＸ−４７８、ラパマイシン、またはジゴキシンである。

【0008】

本発明はまた、異所性骨化の治療を必要とする対象において異所性骨化を治療する方法であって、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴｏｒ）阻害剤を対象に投与することを含む、方法も含む。

【0009】

種々の実施形態において、異所性骨化は遺伝性であり、任意選択で、対象は進行性骨化性線維異形成症を患う。代替的な実施形態において、異所性骨化は、熱傷、筋骨格損傷、整形外科手術（例えば、股関節全置換術後、関節形成術後）、脊髄損傷、脳卒中、灰白髄炎、骨髄異形成、一酸化炭素中毒、脊髄腫瘍、脊髄空洞症、破傷風、または多発性硬化症などの外傷から生じる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】熱傷したまたは熱傷していない「対照」患者由来の脂肪組織から単離されたｍＲＮＡ転写物のインジェニュイティ経路解析（ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）を例示する。

【図1B】ＨＩＦ１α、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５、及びＶＥＧＦを含むプロ血管性経路の上方制御を例示する図である。

【図1C】熱傷していない「対照」患者と比較したときの、熱傷患者の遺伝子発現における数倍の増加を示すチャートである。

【図2A-C】図２Ａは、マウスに後肢アキレス腱横切開と共に３０％総体表面積の背部中間層熱傷損傷を与えて、踵骨に沿ってまた軟組織内に近位にＨＯ形成をもたらす、ＨＯの外傷誘導モデルを例示する。図２Ｂは、Ａｄ．ｃｒｅ及び心臓毒をｃａＡＣＶＲ１ｆｌ：ｆｌマウスの腓腹筋に注射して、筋肉内ＨＯ形成をもたらす、ハイブリッドモデルを例示する。図２Ｃは、遺伝性ＨＯのモデルにおいてマウスに生後４〜５日で概して関節に限局したＨＯを発症させた、Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ：野生型マウスモデルを例示する。

【図3A】ＰＸ−４７８処置及び対照処置熱傷／腱切除マウスのマイクロＣＴスキャンによる３次元再建及び連続断面図を図示する。

【図3B】対照処置（左側の棒）マウス及びＰＸ−４７８処置（右側の棒）マウスにおいての、熱傷／腱切除モデルにおける軟組織ＨＯ体積（ｙ軸（ｍｍ^３））（９週目の体積：０．９０ｍｍ^３ｖ．０．００ｍｍ^３、ｐ＝０．０５；９週目の正規化体積：１．０ｖ．０．０、ｐ＝０．０５；肯定／否定：χ２＝９．５、ｐ＜０．０１）、及び熱傷／腱切除マウスにおける総ＨＯ体積（ｙ軸（ｍｍ^３））（５週目の体積：４．３ｍｍ^３ｖ．１．５ｍｍ^３、ｐ＜０．０５；９週目の体積：５．８ｍｍ^３ｖ．２．３ｍｍ^３、ｐ＜０．０５；９週目の正規化体積：１．０ｖ．０．４、ｐ＜０．０５）を例示する棒グラフである。ＰＸ−４７８は、総ＨＯ体積を有意に減少させ、軟組織ＨＯを排除した。

【図3C】ラパマイシン処置及び対照処置熱傷／腱切除マウスのマイクロＣＴスキャンによる３次元再建及び連続断面図を図示する。

【図3D】対照処置（左側の棒）及びラパマイシン処置（右側の棒）マウスの熱傷／腱切除モデルにおける軟組織ＨＯ体積及び総ＨＯ体積（ｙ軸（ｍｍ^３））を例示する棒グラフである。ラパマイシン処置は、デノボＨＯ形成を有意に低減した（９週目の体積：１．６０ｍｍ^３ｖ．０．８１ｍｍ^３、ｐ＜０．０５；９週目の正規化体積：１．０ｖ．０．５１、ｐ＜０．０５）。＊体積測定値に関してｐ＜０．０５；†二値解析（肯定／否定）に関してｐ＜０．０５。矢印＝「軟組織」異所骨；薄い破線の円＝踵骨異所骨；ＰＸ−４７８処置マウスに関してｎ＝３；ＰＸ−４７８対照マウスに関してｎ＝１１；ラパマイシン処置マウスに関してｎ＝５；ラパマイシン対照マウスに関してｎ＝４。

【図4A】ＰＸ−４７８処置及び対照処置ハイブリッドモデルマウスのマイクロＣＴスキャンによる３次元再建及び連続断面図を図示する。

【図4B】対照処置及びＰＸ−４７８処置マウスにおける総ＨＯ体積（ｙ軸）を例示する棒グラフである。ＰＸ−４７８処置ハイブリッドモデルマウスは、対照処置マウスと比較したとき、マイクロＣＴにおいてＨＯの形跡をほとんど生じなかった（対照：ｎ＝１２脚、ＰＸ−４７８：ｎ＝１２脚）（体積：１８．１ｍｍ^３ｖ．０．０１ｍｍ^３、ｐ＝０．０１；正規化体積：１．０ｖ．０．０、ｐ＝０．０１；肯定／否定：χ２＝１３．６、ｐ＜０．００１）。

【図4C】ラパマイシン処置及び対照処置ハイブリッドモデルマウスのマイクロＣＴスキャンによる３次元再建及び連続断面図を図示する。

【図4D】対照処置及びラパマイシン処置マウスにおける総ＨＯ体積（ｙ軸）を例示する棒グラフである。ラパマイシン処置ハイブリッドモデルマウスは、対照処置マウスと比較したとき、マイクロＣＴにおいてＨＯの形跡を何ら生じなかった（対照：ｎ＝８脚、ラパマイシン：ｎ＝１０脚）（体積：１７．５ｍｍ^３ｖ．０．００ｍｍ^３、ｐ＜０．００１；正規化体積：１．０ｖ．０．０、ｐ＜０．０５；肯定／否定：χ２＝１４．３、ｐ＜０．００１）。

【図4E】対照処置及びＰＸ−４７８処置遺伝性ＨＯマウスの足首再建を例示する。

【図4F】対照またはＰＸ−４７８で処置された遺伝性ＨＯマウスの足首の骨外性骨体積の定量比（体積）を例示する棒グラフである。（８００ハウンスフィールド単位）（体積：６．８ｍｍ^３ｖ．２．２ｍｍ^３、ｐ＜０．０１；正規化体積：１．０ｖ．０．３２、ｐ＜０．０１；ｎ＝４対照処置脚；ｎ＝４ＰＸ−４７８処置脚）。＊体積測定値に関してｐ＜０．０５；†二値解析（肯定／否定）に関してｐ＜０．０５；矢印＝異所骨。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、少なくとも部分的に、ラパマイシンまたはＰＸ−４７８などのＨｉｆ１α阻害剤がＨＯの異なるモデルにおいて骨外性骨化を強力に減少させるという発見に基づく。異所性骨化の治療を必要とする対象において異所性骨化を治療する方法が、本開示によって提供される。本方法は、低酸素誘導因子−１α（Ｈｉｆ−１α）阻害剤を対象に投与することを含む。ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ転写因子ヘテロ二量体の構成要素であり、特徴がよく解明されている。例えば、Ｐｒｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５（１），２０（２００３）を参照されたい。Ｈｉｆ−１α阻害剤の例としては、ＰＸ−４７８（例えば、Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７（１），９０（２００８）に記載される、Ｓ−２−アミノ−３−［４′−Ｎ，Ｎ，−ビス（クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロリド）、ラパマイシン、及びジゴキシンが挙げられるが、これらに限定されない。他のＨｉｆ−１α阻害剤には、例えば、ＣＪ−３ｋ及びその誘導体（例えば、Ｍａｓｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５（７）、３８４９−５９（２０１５）に記載される）、エキノマイシン、トポテカン、ＬＡＱ８２４（例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６，８８１４（２００６）に記載される）、メトホルミン、イマチニブ、ウアバイン、及びプロスシラリジンが含まれ、追加の阻害剤が当該技術分野で知られている。種々の実施形態において、Ｈｉｆ−１α阻害剤は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。Ｈｉｆ−１α阻害剤は、治療効果を達成するためにＨｉｆ−１αを完全に阻害する必要はなく、本阻害剤は好ましくは、Ｈｉｆ−１α活性を少なくとも５０％（例えば、５０％〜９９％）、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害する。本阻害剤は、Ｈｉｆ−１αタンパク質レベル、活性化、脱ユビキチン化などを阻害または低減してＨｉｆ−１α活性を阻害し得る。

【0012】

加えて、本発明は、異所性骨化の治療を必要とする対象において異所性骨化を治療する方法であって、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴｏｒ）阻害剤を対象に投与することを含む、方法を含む。ｍＴｏｒは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼタンパク質ファミリーのセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであり、特徴がよく解明されている。例えば、Ｌａｐｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９（２），２７４（２０１２）、Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ４１，８８９（２０１３）を参照されたい。ｍＴｏｒ阻害剤の例としては、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムス、ビンクリスチン、ゾタロリムス、３２デオキシ−ラパマイシン、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ−５８７、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＧＮＥ４７７（チエノピリミジン）、ＰＩ−１０３（三環系ピリドフロピリミジン）、ＸＬ７６５、ＷＪＤ００８（５−シアノ−６−モルホリノ−４−置換ピリミジン類似体）、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１、ＷＹＥ−３５４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、Ｋｕ−００６３７９４、クルクミン、レスベラトロール、没食子酸エピガロカテキン、ゲニステイン、３，３−ジインドリルメタン、及びカフェインが挙げられるが、これらに限定されない。

【0013】

種々の実施形態において、異所性骨化は遺伝性であり、任意選択で、対象は進行性骨化性線維異形成症を患う。代替的な実施形態において、異所性骨化は、熱傷、筋骨格損傷、整形外科手術、または脊髄損傷などの外傷から生じる。それ故、種々の態様において、対象は、異所性骨化を患うか、または異所性骨化を患う危険性がある（例えば、遺伝性的に異所性骨病変の形成の素因がある、外傷を受けたなど）。種々の実施形態において、本方法は、対象にＨｉｆ−１α阻害剤（及び／またはｍＴｏｒ阻害剤）を、異所性骨化を全体的にまたは部分的に治療するのに有効な量及び条件下で投与することを含む。異所性骨化「を治療すること」には、対象における異所性骨化の形成もしくは進行を予防するもしくはそれを緩徐にする、ならびに／または異所性骨化に関連する症状の発現を低減するもしくは遅延させることが含まれる（しかしこれらに限定されない）。本方法は、有益な（例えば、治療）効果を達成するために異所性骨化の進行を完全に予防するまたは停止する必要はないことが理解されよう。異所性骨化の発現もしくは進行または異所性骨化に関連する症状の重症度のいずれの阻害も企図される。例えば、骨が通常は存在しない軟組織構造内側の層板骨の形成のいずれの低減も企図される。

【0014】

異所性骨化を治療する上での本方法の有効性を判定する方法が当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。例えば、異所性骨化の進行は、ｘ線、骨スキャン、対象の可動域、２４時間の尿中のプロスタグランジンＥ２排泄、超音波、及び／または関節腫脹もしくは疼痛の評価を用いて監視される。

【0015】

本発明は、異所性骨化の治療におけるＨｉｆ−１α阻害剤及び／またはｍＴｏｒ阻害剤の使用をさらに含む。例えば、Ｈｉｆ−１α阻害剤及び／またはｍＴｏｒ阻害剤は、本明細書に詳述されるように、異所性骨化の治療用の医薬品の製造において使用することができる。

【0016】

Ｈｉｆ−１α阻害剤は、消炎剤、鎮痛剤、放射線療法、及び理学療法を含むがこれらに限定されない、他の活性剤または治療法と併用投与することができる。同様に、ｍＴｏｒ阻害剤は、消炎剤、鎮痛剤、放射線療法、及び理学療法を含むがこれらに限定されない、他の活性剤または治療法と併用投与することができる。

【実施例】

【0017】

この実施例は、臨床的に関連性のある動物モデルにおいて外傷誘導性及び遺伝系異所性骨化の両方を治療するＨＩＦ−１α阻害剤の能力を実証するものであり、本発明の方法のさらなる説明を提供する。

【0018】

材料及び方法
遺伝子発現プロファイリング患者登録及び試料採取：患者登録及び患者の試料採集については以前に記載されている。Ｃｏｂｂ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２，４８０１−４８０６（２００５）。２０００年〜２００９年に４つの熱傷センターのうちの１つにおいて２４４人の熱傷患者を登録した。入院が損傷後９６時間以内に生じた場合、ＴＢＳＡの少なくとも２０％が侵され、少なくとも１回の切除及び移植術が必要とされた。加えて、２００４〜２００７年に３５人の健常な対照被験者（１６〜５５歳）を募集した。熱傷患者及び対照患者の両方において、脂肪組織を採集し、ＲＮＡ転写物レベルについて分析した。細かい剪刀または外科用メスを使用して、８０ｍｇの脂肪組織を得、氷冷ペトリ皿の上に即座に置き、２〜５ｍｍの立方体へと切り刻んだ。標準作業手順書（ＳＯＰ）Ｂ００１．０３に従って、試料を、２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒを含有するクライオジェニックチューブに入れて組織を安定化させ、ＳＯＰ Ｇ０２６．０１に従って、商業的ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して組織を総細胞ＲＮＡにプロセスした。ビオチン化ｃＲＮＡを４μｇの総細胞ＲＮＡから生成し、製造業者の推奨に従ってＨＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上にハイブリダイズし、染色し、洗浄した。総計２５，０００の遺伝子をクエリし、このうち３，５００が有意に変化し、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．００１及び定義された倍率変化≧１．５であった。

【0019】

時系列遺伝子発現データの解析：ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して検体を即座に安定化させた。総細胞ＲＮＡを、商業的ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して質の良い残りの検体から抽出した。ビオチン化ｃＲＮＡを、３′ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルを使用して１μｇの総細胞ＲＮＡから生成し、ＨＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上にハイブリダイズした。ＥＤＧＥ（差次的遺伝子発現の抽出（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））を用いて、１，０００のランダム置換につき各遺伝子の発現変化の有意性を推定した。有意な遺伝子は、ＦＤＲ＜０．００１及び倍率変化≧１．５を基準に選択した。これらの遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ３６を用いてさらに解析した。

【0020】

動物：骨外性骨評価に含めたマウスは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｄｈ５−Ｃｒｅ／ｔｄＴｏｍａｔｏｆｌ／野生型、Ｐｒｘ−Ｃｒｅ／Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ、Ｐｒｘ−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｍＴｍＧ、ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ／ｆｌ、Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ／野生型、または同腹仔対照であった。テールゲノムＤＮＡを遺伝子型決定に用いた。生物発光イメージングに使用したマウスは、ＯＤＤ−ｌｕｃ導入遺伝子にホモ接合性であった。これらのマウスにおいて、低酸素誘導因子１α酸素依存的分解ドメイン（ＯＤＤ）のＣ末端部分は、蛍ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子に融合されている。低酸素は、融合タンパク質の安定化を引き起こし、それによってルシフェリン投与時の蛍光を増加させる。

【0021】

骨外性骨モデル：全てのマウスに、０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンからなる術前麻酔、続いてイソフルラン吸入による麻酔を与え、麻酔投与により術後の綿密な監視を行った。熱傷／腱切除マウスにおいては、剃毛した背部に３０％総体表面積（ＴＢＳＡ）中間層熱傷を与え、続いて左後肢アキレス腱横切開を行った。背部は、水浴中で６０℃に加熱した金属ブロックを用いて、背部に１８秒間継続的に適用して熱傷させた。腱切除部位は、一本の５−０バイクリル縫合を皮膚のみに通して適用することにより閉じた。ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ：ｆｌマウスには、後肢心臓毒及びＡｄ．ｃｒｅ注射をＰ２４で与えた。次いで、マウスを２２日後（ＰＸ−４７８）または１５日後（ラパマイシン）に安楽死させた。安楽死日における差異を説明するために、各薬物処置につき別個の対照を使用した。Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ＋マウスをｃａＡｃｖｒ１ｆｌ：野生型マウスと交配させることによって、Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ：野生型マウスを生成した。結果として生じた変異体は、Ｐ４〜５までに骨外性骨を発症した。

【0022】

薬物処置：熱傷／腱切除またはハイブリッドＨＯマウスに、腹腔内注射を介してＰＢＳ溶液中のＰＸ−４７８（１００ｍｇ／ｋｇ）またはラパマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。マウスには、本研究の継続期間にわたって１日おきに注射を与えた。Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ：野生型マウスには、ＰＸ−４７８（１００ｍｇ／ｋｇ）を総計２週間にわたって１日おきに投与した。

【0023】

間葉系幹細胞の単離及び培養：マウス間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を、野生型マウス踵骨から始まり腓骨及び脛骨の合流部までの腱横切開部位から採取した。全ての組織を機械的に細かく切り刻み、コラゲナーゼＡ及びディスパーゼで消化させ、その後プレートした。Ｈｉｆ１α発現に対する薬物処理を試験するために、細胞を０．５％酸素を含む低酸素チャンバで培養した。低酸素処理の２４時間前にＰＸ−４７８（１０μＭ）またはラパマイシン（５μＭ）での細胞処理を開始し、再び低酸素に２４時間供した。タンパク質を採取し、ウェスタンブロットを使用してＨｉｆ１α及びα−チューブリンについて分析した。軟骨形成に対するＰＸ−４７８処理の効果を試験するために、腱から単離された細胞を軟骨形成分化培地（ＰＴ−３９２５＆ＰＴ−４１２１，Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養した。全ての体外実験は、生物学的及び技術的３連で行った。

【0024】

組織学及び免疫蛍光：組織学的評価を、熱傷／腱切除、Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒、またはＮｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａ−Ａｃｖｒ１ｆｌ：野生型変異体において指定された時点で行った。後肢をホルマリン中に４℃で一晩固定し、その後、ｘ線により脱灰が検証されるまで１９％ＥＤＴＡ溶液中で４℃で３〜５週間脱灰した。後肢をパラフィンパラフィン包埋または凍結包埋し、５−７μｍ切片を切り出し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）に載置し、室温で保管した。足首領域のヘマトキシリン／エオシン及びモバットペンタクローム染色を行った。骨外性異所性骨の染色の免疫染色を、以下の一次抗体を用いて、再水和したワックス切片に対して行なった。マウス抗マウス抗Ｈｉｆ１α（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号５３５４６）、ヤギ抗マウス抗Ｃｄｈ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号６４５８）、ヤギ抗マウス抗ｐＳｍａｄ １／５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号１２３５３）、ヤギ抗マウス抗ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号１５０６）、ウサギ抗マウス抗Ｓｏｘ９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号２００９５）、または抗マウスＰＤＧＦＲα。採集画像を達成する前に適切な希釈を決定した。適切な蛍光二次抗体を適用し、蛍光顕微鏡法を用いて可視化した。二次抗体は、抗ウサギまたは抗ヤギＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８（緑）または−５９４（赤）からなっていた。全てのマウス切片は熱傷／腱切除から３週間後に採取された。全ての計数は、盲検化された観察者が各試料につき１５の高倍率視野で行った。

【0025】

蛍光及び生物発光撮像：全ての蛍光及び生物発光画像は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステムを使用して取得した。血管灌流を評価するために野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを蛍光撮像に用いた。マウスに尾静脈注射を介してＡｎｇｉｏｓｅｎｓｅ ７５０ ＥＸを投与した。蛍光画像を注射から２４時間後に７７０ｎｍ波長で取得した。全ての生物発光撮像にＯＤＤ−ｌｕｃを用いた。撮像の１０分前にマウスにルシフェリン腹腔内注射を与えた。

【0026】

定量的ＰＣＲ：組織を熱傷／腱切除マウスの腱切除部位から、または対応する対側の対照後肢から、指定された時点で採取した。製造業者の仕様に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用してＲＮＡを組織から採集した。Ｔａｑｍａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して１μｇ ＲＮＡで逆転写を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ及びＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲを実行した。これらの遺伝子に対する特異的プライマーをそれらのＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ配列に基づいて選択した（表１）。

【表1】

【0027】

μＣＴ及びナノ−ＣＴ分析：μＣＴスキャン（８０ｋＶｐ、８０ｍＡ、及び１，１００ｍｓ露光を使用したＳｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ）を用いて、熱傷／腱切除、Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒、または変異体Ｎｆａｔｃ１−ｃｒｅ／ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ：野生型マウスにおける骨外性骨成長を定量化した。熱傷／腱切除マウスには、スキャンを腱切除から５週間及び９週間後に行った。Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒マウスには、μＣＴスキャンをＡｄ．ｃｒｅ及び心臓毒注射による誘導後２２日目に行った。Ｎｆａｔｃ１−ｃｒｅ／ｃａＡｃｖｒ１ｆｌ：野生型マウス及び同腹仔対照には、μＣＴスキャンを生後１３日目に行った。画像を再構築し、ＨＯ体積を、ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ μＣＴビューア（Ｐａｒａｌｌａｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｉｌｄｅｒｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）で以前に記載された較正撮像プロトコルを用いて定量化した。

【0028】

顕微鏡法：全ての蛍光染色済みの画像を、標準ＤＡＰＩ、４８８ｎｍ、及びＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ−７０高解像度デジタルカメラに取り付けたＴＲＩＴＣキューブを装着したＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５１直立光学顕微鏡を使用して取得した。各部位を全てのチャネルにおいて撮像し、ＤＰＶｉｅｗｅｒで重ね合わせてから、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにおいて検査した。

【0029】

統計分析：ＰＸ−４７８処置群に何匹のマウスが必要であるかを決定するために、検定力分析を最初に行った。検定力分析について、目的とする主要評価項目は、処置によるＨＯ体積の差異である。０．８の検定力でＨＯ体積の５０％の減少を確認するために、未処置マウスにおける標準偏差１．５ｍｍ^３及び平均ＨＯ体積７．５ｍｍ^３を想定して、群当たり３匹のマウスが必要とされた。文字、図、及び図の説明文に提示されるように、平均値及び標準偏差を数的データから算出した。図において、棒グラフは平均値を表す一方で、エラーバーは１標準偏差を表す。３つ以上の群を比較した適切な分散分析を用いて統計分析を行い、続いて事後スチューデントのｔ検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正を用いて）を行って２つの群を直接比較した。標準偏差の不等は、ルビーン検定を使用することによって除外した。外れ値は、外れ値に対するグラブス検定を使用して除外した。ｐ値を図の説明文に含める。

【0030】

結果
ヒト外傷患者はＨＩＦ１αの上方制御及び関連する下流血管シグナル伝達メディエーターを呈する：熱傷していない「対照」患者と比較するための、広域表面積の熱傷に起因してＨＯの危険性が高い２４４人の患者のゲノムデータベースを検査した。総計２５，０００の遺伝子をクエリし、このうち３，５００が、熱傷患者由来の組織において対照患者と比較したときに有意に異なることが認められた。総計２５，０００の遺伝子をクエリし、このうち３，５００が、熱傷患者由来の組織において対照患者と比較したときに有意に異なることが認められた。特に、上方制御された遺伝子転写物の上位５０位内に入る、ＨＩＦ１αの有意な上方制御が観察された。加えて、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５、及びＶＥＧＦを含む関連する下流遺伝子転写物が上方制御された（図１Ａ〜Ｃ）。ＨＩＦ１αの評価において、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅを、発現レベルがＨＩＦ１αの活性化により変化することが以前に知られているＨＩＦ１α下流遺伝子についてクエリした。Ｒａｊｉｃｉｃ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ５，ｅ１４３８０ （２０１０）、Ｄｅｓａｉ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，ｅ１００１０９３（２０１１）。ＨＩＦ１αの発現レベルは、熱傷後に有意に上方制御され（倍率変化＝２．１０３、ＦＤＲ＜０．０５）、このうち経路活性化ｚスコアは４．９６５であり、上方制御された遺伝子の上位５０位内に入った。

【0031】

３つの別個の動物モデルにおいてＨＯは上昇したＨｉｆ１α発現を特徴とする：次の３つの別個のＨＯモデルを研究した。１）熱傷／腱切除、２）Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒誘導性ｃａＡＣＶＲ１発現、及び３）先天性ＨＯ（Ｎｆａｔｃ１−ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／野生型）（図２Ａ〜Ｃ）。Ｙｕ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４，１３６３−１３６９（２００８）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６，２５５ｒａ１３２（２０１４）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ ２５９，９９３−９９８（２０１４）、Ａｓａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ３２，３２６６−３２７７（２０１４）。注目すべきことに、熱傷／腱切除をＯＤＤ−ＬｕｃＨｉｆ１αレポーターマウスにおいて行ったとき、腱切除部位において、損傷していない部位と比較して高度に正のシグナルが観察されたが、これは腱切除部位が高度に低酸素となることを示している。Ｈｉｆ１αに対する免疫染色により、これらの３つのモデルの各々においてその発現が観察された。重要なことに、Ｈｉｆ１αは、熱傷／腱切除モデルにおける前軟骨及び未成熟ＨＯ期中に存在しており、成熟ＨＯの形成と共に徐々に低減された。熱傷／腱切除モデルにおいて、Ｈｉｆ１αは軟骨形成マーカーＳｏｘ９と共局在化していたことから、このモデルの軟骨形成においてそれが果たす密接な役割が示唆される。外傷から９週間後に観察された成熟ＨＯ内で、Ｈｉｆ１α発現は、異所骨の骨髄腔内でのみ存在したが、類骨内またはＨＯ病変の周囲に沿ってはもはや存在しなかった。

【0032】

同様に、Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒モデルにおいて発症したＨＯ病変は、骨発達の既知の調節因子であるＳｏｘ９及びｐＳｍａｄ １／５との共局在化を伴う、同様のＨｉｆ１α発現パターンを実証した。

【0033】

Ｈｉｆ１αが、患者過剰活性ＡＣＶＲ１を有する患者に見られるような、炎症性外傷の不在下でのＨＯの形成に役割を果たすかどうかを理解するために、ＡＣＶＲ１の構成的活性に起因してＨＯが自発的に発症するモデル（Ｎｆａｔｃ１−Ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ：野生型）を用いた。Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．「ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＣＶＲ１）ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｄｉｓｔａｌ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｏｉｎｔｓ．」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）。これらのマウスは、付随の外傷またはＡｄ．Ｃｒｅもしくは心臓毒注射なしに生後４〜５日以内に自発的にＨＯ病変を発症する。病変は、足首、膝、肘、及び指を含む関節に概して局在化される。免疫染色により、このモデルにおいても未成熟ＨＯ内で強力なＨｉｆ１α発現が観察され、これは、炎症性外傷の不在にもかかわらずＨｉｆ１αが過剰活性ＢＭＰ受容体シグナル伝達の設定でＨＯ形成において役割を果たすことを示す。再び、Ｈｉｆ１αのＳｏｘ９及びｐＳｍａｄ １／５との強力な共局在化が認められた。

【0034】

まとめて、このデータは、Ｈｉｆ１α発現がＨＯの外傷誘導性及び遺伝性モデルにおける共通項であり、軟骨形成及び軟骨骨化に先立って存在することを実証しており、それによってＨｉｆ１αを治療標的として検証する。

【0035】

Ｈｉｆ１αの薬理的阻害は熱傷／腱切除後のＨＯを制限する：Ｈｉｆ１α阻害によりＨＯを阻止する能力を、Ｈｉｆ１α転写及び翻訳を阻害することが示された代表的なＨｉｆ１α阻害剤である、薬物ＰＸ−４７８を使用して特徴付けた。Ｚｈａｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６，２２５０−２２６２（２０１５）。損傷から３週間後の腱切除部位（３ＷＬＳＴ）に由来し、低酸素条件で培養した細胞の体外処理において、ＰＸ−４７８での処理後にＨｉｆ１α転写物ならびに軟骨生成遺伝子転写物Ｓｏｘ９及びＡｃａｎのレベルの減少が示された。加えて、同じくＨｉｆ１α阻害剤であるＰＸ−４７８及びラパマイシンは、腱から単離された間葉系細胞によって産生されるＨｉｆ１αを有意に減少させたことから、再び、これらの薬物が将来のＨＯ部位に属する細胞におけるＨｉｆ１αレベルに影響を及ぼすことが確認された。

【0036】

次に、ＰＸ−４７８での処理が体内でＨｉｆ１α発現及び軟骨形成を減少させ、結果的にＨＯの全体的な発症を阻害したことが決定された。マウスに熱傷／腱切除を与え、その後ＰＸ−４７８で処置した。３週間後の組織学的評価により、３週間後に典型的に存在する軟骨原基の実質的な減少が確認された。さらに、Ｈｉｆ１α発現は、損傷から３週間後に減少した。これらのデータと一致して、Ｓｏｘ９の発現は、ＰＸ−４７８処置群において相当に減少した。その上、ＰＸ−４７８で処置された熱傷／腱切除マウスは、損傷から５週目（４．３ｍｍ^３ｖ．１．５ｍｍ３、ｐ＜０．０５）、及び９週目（５．８ｍｍ^３ｖ．２．３ｍｍ^３、ｐ＜０．０５）に、総ＨＯ体積の有意な低減を示した。図３Ａ及び３Ｂ。最後に、ＰＸ−４７８処置は、二値解析（肯定／否定：χ２＝９．５、ｐ＜０．０１）及び定量比較（０．９０ｍｍ^３ｖ．０．００ｍｍ^３、ｐ＝０．０５）によって示されるように、９週間後に、「軟組織」ＨＯ、すなわち、近位の横切開された腱及び遠位腓腹筋内で、ただし踵骨からは離れて形成する骨外性骨を完全に阻害した。図３Ｂ。これは、「軟組織」ＨＯが、通常は踵骨の骨外性骨に近接して位置する隣接の軟骨、骨、または骨膜の影響なしにデノボで形成する可能性が高いため、顕著である。全てをまとめると、これらの知見は、Ｈｉｆ１αが軟骨形成に許容的な因子であり、その阻害が非骨軟骨始原細胞系細胞の、軟骨及び最終的には骨外性骨を形成する細胞への移行を防止し得ることを示唆する。注目すべきことに、熱傷の創傷治癒に対してまたは後肢腱切除部位において、ＰＸ−４７８の有害作用は何ら観察されなかった。第２のＨｉｆ１α阻害剤を試験するために、マウスをラパマイシンで処置したところ、有意に減少したデノボＨＯ形成がもたらされた（１．６０ｍｍ^３ｖ．０．８１ｍｍ^３，ｐ＜０．０５）。図３Ｃ及び３Ｄ。Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ１０５，１９５７９−１９５８６（２００８）。

【0037】

Ｈｉｆ１αの薬理的阻害はＡＣＶＲ１構成的活性によって引き起こされるＨＯを制限する：上述の知見を、ｃａＡＣＶＲ１（ＡＣＶＲ１ Ｑ２０７Ｄ）変異の発現によって引き起こされる構成的ＡＣＶＲ１活性のモデルにおいて確認した。心臓毒及びＡｄ．ｃｒｅを注射したｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／ｆｌマウスは強固なＨＯを発症するため、このモデルは、ＡＣＶＲ１シグナル伝達の阻害剤を研究するのに使用されてきた。ＰＸ−４７８で処置したｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／ｆｌマウスは、Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒誘導後のペンタクローム染色に基づいて軟骨または骨がほぼ排除されたことを実証した。同様に、免疫染色に基づいてＨｉｆ１α及びＳｏｘ９の排除が見られた。最後に、マイクロＣＴ分析により、二値解析（肯定／否定；χ２＝１３．６、ｐ＜０．００１）及び定量比較（１８．１ｍｍ^３ｖ．０．０１ｍｍ３、ｐ＝０．０１）に基づいて、ＰＸ−４７８処置群においてＨＯの完全な不在が確認された。図４Ａ及び４Ｂ。これらの知見は、文献における他のＢＭＰ阻害剤を上回って実質的に改善された有効性のため顕著であった。ペンタクローム染色により軟骨及び骨の不在が確認され（図４Ａ）、免疫染色によりＨｉｆ１α及びＳｏｘ９発現の不在がさらに確認された（図４Ｂ）。再び、これらの知見は、ラパマイシンを使用して再現され、そこにおいては処置マウスにおけるＨＯの完全な不在を示した（１７．５ｍｍ^３ｖ．０．０ｍｍ^３、ｐ＜０．００１；肯定／否定；χ２＝１４．３、ｐ＜０．００１）。図４Ｃ及び４Ｄ。

【0038】

最後に、ＰＸ−４７８を、先天性ＨＯ（Ｎｆａｔｃ１−ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／ｆｌ）を有するマウスに、生後から開始して２週間、１日おきに投与した。処置マウスは、ビヒクルで処置された変異体マウスと比較したとき、足首関節において有意により少ない異所性骨を有した（６．８ｍｍ^３ｖ．２．２ｍｍ^３、ｐ＜０．０１）。図４Ｅ及び４Ｆ。

【0039】

間葉系前駆細胞におけるの遺伝性喪失は異所性骨化の形成を阻止する：全体的Ｈｉｆ１αノックアウトが胚性致死的であることから、条件的Ｈｉｆ１αノックアウトマウスモデルもまた検査した。Ｐｒｘ−ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｍＴｍＧマウスを用いた一連の系譜追跡実験を使用して、熱傷／腱切除後の異所性骨化はＰｒｘ系譜由来の細胞からなることが最初に確証された。重要なことに、軟組織内で及び軟組織内でより近位に形成したＨＯは両方とも、Ｐｒｘ−ｃｒｅ細胞のほぼ１００％の存在を示した。実際、存在した唯一の非Ｐｒｘ−ｃｒｅ細胞は、成熟ＨＯの骨髄腔を形成する細胞であった。

【0040】

Ｐｒｘ−ｃｒｅ細胞における条件的Ｈｉｆ１αノックアウトのマウスモデル（Ｐｒｘ−ｃｒｅ／Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌ）を用いた。これらのマウスは、欠陥のある正常軟骨発達を示す。Ｐｒｏｖｏｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １７７，４５１−４６４（２００７）。しかしながら、病的な異所性骨化に及ぼす影響は実証されてこなかった。したがって、Ｐｒｘ−ｃｒｅ／Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌマウスにおいて熱傷／腱切除を行った。変異体マウスは踵骨の周りでのみ最小のＨＯを発症し、これらの病変でさえ、対照におけるよりも実質的に小さかった（５．０２ｍｍ^３ｖ．０．１８ｍｍ^３、ｐ＜０．０１）。加えて、「軟組織」ＨＯは、ＰＸ−４７８処置を用いた本発明者らの知見と一致するように、体積（０．３２ｍｍ^３ｖ．０．０１ｍｍ^３）、及び二値解析（肯定／否定；χ２＝３．７、ｐ＝０．０５）に基づいて変異体マウスにおいてほぼ完全に消滅した。

【0041】

この研究で使用された条件的Ｈｉｆ１αノックアウトマウスが成長板異常を示すことを認識して、損傷していないアキレス腱及び脛骨を最初に評価した。損傷していない変異体の腱断面積は、同腹仔対照の６０％であった一方で、損傷していない変異体の脛骨長は、同腹仔対照の３２％であった。重要なことに、腱の組織学的外観は正常に見え、脛骨皮質も同様であった。これらの表現型の差異に起因して、ＨＯ値を腱断面積または脛骨長のいずれかに対して正規化した。予想通り、この差異は、変異体モデルにおけるＨＯのほぼ完全な不在に起因して有意なままであった。

【0042】

連続的なペンタクローム染色による組織学的評価を行ったところ、発明者らは、踵骨の近くでも軟組織内でも、異所性骨化のいずれの領域も特定することができなかった。したがって、組織学的評価は、変異体マウスにおいて軟骨存在の形跡を何ら示さず、Ｈｉｆ１αのほぼ完全な不在、及び最小限のみのＳｏｘ９またはｐＳｍａｄ １／５発現を示した。これらの知見は、間葉系前駆細胞におけるＨｉｆ１αの遺伝的喪失が、骨外性骨の形成を阻止するのに十分であることを示す。

【0043】

Ｈｉｆ１αの喪失はＨＯモデルにおいて間葉凝縮の形成を阻止する：条件的Ｈｉｆ１αノックアウトマウス及び同腹仔対照のＨＯ間葉を熱傷／腱切除損傷から３週間後に評価した。Ｈ＆Ｅを用いた通例の組織学的評価により、ノックアウトマウスにおける間葉凝縮の不在が実証された。さらに、間葉凝縮内の間葉系細胞の以前に記載されたマーカーであるＰＤＧＦＲα、及びＳＯＸ９の免疫染色により、間葉凝縮の不在が確認された。Ｈｉｆ１αノックアウトと同様に、ＰＸ−４７８及びラパマイシン処置は、Ｈ＆Ｅ染色、ならびにＰＤＧＦＲα及び／またはＳＯＸ９免疫染色によって示されるように、間葉系前駆細胞の存在及び間葉凝縮の形成を実質的に減少させた。処置または未処置マウス、及びＣｒｅ−条件的Ｈｉｆ１αノックアウトマウスの損傷していない後肢の腱−踵骨挿入部位を含む、発達中のＨＯの外側の部位におけるＰＤＧＦＲα＋／ＳＯＸ９＋細胞を分析した。Ａｄ．ｃｒｅ／心臓毒モデルに対するＨｉｆ１α阻害の効果を確認するために、同様の染色をＰＤＧＦＲα／ＳＯＸ９＋細胞に対して行った。再び、誘導から２週間後の処置の設定において有意に減少したこれらの細胞の数が観察された。早期損傷後のこれらの細胞における同様の減少を実証するために、損傷から５日後のＡｄ．ｃｒｅ／心臓毒モデル由来の切片の分析により、同様の結果、すなわち、損傷後のＰＤＧＦＲα／ＳＯＸ９＋細胞の同様の減少が示された。

【0044】

考察
異所性骨化（ＨＯ）は、２つの別個の患者集団、すなわち重度の熱傷及び筋骨格外傷を有する患者集団、ならびに過剰活性を付与するＡＣＶＲ１遺伝子における遺伝性変異を有する患者集団における、病的なプロセスである。現在まで、ＡＣＶＲ１変異を有する患者の治療に重点が置かれており、ＨＯの２つの形態間で共通のシグナル伝達メディエーターは、治療有効性について特定され、評価されてこなかった。上述のデータは、Ｈｉｆ１αが異所性骨化の両形態についての共通の標的を代表することを実証する。Ｈｉｆ１αの遺伝性喪失または薬理的阻害は、ＨＯを有意にかつ一貫して低減または排除した。これらの知見は、熱傷／腱切除を有する外傷誘導性ＨＯのモデル、ならびに遺伝性ＨＯの２つの異なるモデル、すなわち、１つ目は、構成的に活性なＡＣＶＲ１遺伝子が、炎症を刺激する外来性Ａｄ．ｃｒｅ注射及び心臓毒により活性化されるもの（ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／ｆｌ）、２つ目は、構成的に活性なＡＣＶＲ１遺伝子が生後、条件的に発現される非外傷モデル（Ｎｆａｔｃ１−ｃｒｅ／ｃａＡＣＶＲ１ｆｌ／ｆｌ）において、一貫している。

【0045】

トランスクリプトーム分析により、熱傷患者から単離された脂肪組織におけるＨｉｆ１αの有意な上方制御が示された。骨形成分化の能力を有し、ＨＯ前駆細胞として機能し得る間葉系細胞は、脂肪組織内に常在することから、脂肪組織は、アッセイするのに適切な組織型となっている。加えて、熱傷患者は、外傷誘導性ＨＯ発症の危険性がある重要な患者集団である。ＴＢＳＡ＞３０％の熱傷を有する患者は、より小さな表面積熱傷を有する患者と比較したとき、ＨＯを発症する確率が２３倍高いことから、トランスクリプトーム分析のために＞２０％ＴＢＳＡ熱傷を有するこの患者のコホートの使用が有効である。Ｌｅｖｉ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｕｍａ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｃａｒｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ７９，８７０−８７６（２０１５）。インジェニュイティ経路解析により、Ｈｉｆ１αシグナル伝達経路が熱傷患者の脂肪組織において上方制御されることが示され、これは下流における結果を示唆する。

【0046】

外傷誘導性ＨＯの設定において、最初の工程は、発達中に生じる凝縮事象を模倣する線維増殖段階である。間葉系細胞におけるＨｉｆ１αの遺伝性喪失及びＨｉｆ１αの薬理的阻害は両方とも、間葉凝縮の形成を阻止することによってＨＯ形成を重度に損なう。Ｐｒｘ−ｃｒｅ細胞内の条件的Ｈｉｆ１αノックアウトのモデルにおいて、最小のＨＯ形成が観察され、間葉凝縮または軟骨形成はほぼなかった。Ｐｒｘ−ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６ｍＴｍＧマウスを使用して、Ｐｒｘ−ｃｒｅ陽性細胞が早期軟骨形成から後期骨化までの発達期間にわたってＨＯを形成することが決定された。この系譜を用いて、この系譜におけるＨｉｆ１αの遺伝性喪失がどのようにＨＯに影響を及ぼすかを、Ｐｒｘ−ｃｒｅ／Ｈｉｆ１αｆｌ／ｆｌマウスを使用して評価した。熱傷／腱切除後の軟骨形成の不在は、これらのマウスにおける成長板形成の障害を実証する研究と一致している。この公開データに基づいて、腱横切開部位における間葉凝縮の完全な不在は予想外で、しかし顕著であった。加えて、遺伝子ノックアウトは、ＰＤＧＦＲαの発現によって決定したとき、間葉系前駆細胞の数を低減した。処置または遺伝子ノックアウトは、これらの細胞が損傷の不在下では存在しないため、損傷していない部位（例えば腱−踵骨挿入部または付着部）における凝縮間葉系細胞の存在を変化させなかった。ＰＤＧＦＲα１７−１９及びＳＯＸ９７のＨ＆Ｅ及び免疫染色による組織学的評価により、間葉凝縮の不在が確認された。ＰＤＧＦＲα及びＳＯＸ９は両方とも、発達中の間葉のマーカーとして以前に記載されたものである一方で、Ｈ＆Ｅもまた間葉凝縮を特定するために使用することができる。Ｂａｒｎａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３６，２７７−２８１（２００５）

【0047】

本文献に記載される研究において、異なる機構を介してＨｉｆ１αを阻害する２つの異なる薬物、ＰＸ−４７８及びラパマイシンが、ＨＯに対して治療効果を実証した。ＰＸ−４７８は、Ｈｉｆ１αｍＲＮＡレベルを減少させ、Ｈｉｆ１αｍＲＮＡ翻訳を遮断することによって、体外及び体内の両方でＨｉｆ１αを減少させる。構成的ＶＥＧＦシグナル伝達は、下流血管新生シグナル伝達に対するＰＸ−４７８の効果を抑止することから、その効果がＶＥＧＦの上流であることが確認される。ＰＸ−４７８は、ＨＯ形成に影響を及ぼすことが以前に示された経路である、レチノイン酸シグナル伝達を変化させるようには思われない。Ｌａｎｄ，Ｓ．Ｃ．＆Ｔｅｅ，Ａ．Ｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２，２０５３４−２０５４３（２００７）．ラパマイシンは、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を通してＨｉｆ１αを阻害する。Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，１９５７９−１９５８６（２００８）。薬物を、腱から単離し、低酸素で培養した間葉系細胞に対して体外で試験したとき、Ｈｉｆ１αの有意な減少が観察された。ＰＸ−４７８及びラパマイシンは両方ともオフターゲット効果を有し得るが、本明細書に記載される条件的Ｈｉｆ１αノックアウトマウスからの結果と共に、Ｈｉｆ１αに対するそれらの共有される効果は、Ｈｉｆ１αの薬理的阻害がＨＯを阻止することを示す。遺伝性喪失の効果と同様に、Ｈｉｆ１αの薬理的阻害αは、デノボ異所骨を有意に減少または排除し、間葉系前駆細胞及び間葉凝縮の数を減少させた。

【0048】

際だったことに、ＡＣＶＲ１変異の設定において、ＰＸ−４７８またはラパマイシンによる薬理的Ｈｉｆ１α阻害は再び、ＨＯ形成を阻止した。これは、構成的ＡＣＶＲ１活性が単独ではＨＯを誘導するのに十分でないことを示唆し、ＡＣＶＲ１（ＡＣＶＲ１Ｒ２０６Ｈ）において過剰活性化変異を有する進行性骨化性線維異形成症の患者が軽微な外傷の後に異所性骨病変を発症するという本発明者らの臨床知識と一致する。熱傷／腱切除モデルと同様に、ＰＤＧＦＲα及びＳｏｘ９の共発現を特徴とする間葉系細胞が未処置マウスの発達中の病変に存在したが、治療的Ｈｉｆ１α阻害の設定において排除されたことが観察された。

【0049】

初めて、外傷誘導性と遺伝性ＨＯとの間の共通の標的が明らかとなる。本明細書に記載される知見は、ＰＸ−４７８またはラパマイシンなどのＨｉｆ１α阻害剤が、過剰活性ＡＣＶＲ１シグナル伝達によって引き起こされるＨＯに対してさえも治療選択肢であることを実証する。

【0050】

本明細書全体は、統合された開示として関連し、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが、その特徴の組み合わせが本明細書の同じ文章、または段落、または節内で一緒に見られない場合であっても企図されることを理解されるべきである。本発明はまた、例えば、上記に具体的に言及された変形形態よりも範囲の狭い本発明の全ての実施形態も含む。属として記載される本発明の態様に関して、全ての個々の種は、本発明の別個の態様と見なされる。「ａ」または「ａｎ」を用いて記載または特許請求される本発明の態様に関して、これらの用語は、文脈上より制限された意味が明確に求められない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。本発明の態様がある特徴「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものとして記載される場合、その特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」またはその特徴「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態もまた企図される。

【0051】

本明細書に引用される刊行物、特許及び特許出願は全て、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が参照により組み込まれることが明確かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A-C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]