特許 6590344 光学測定装置及び光学測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6590344

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】光学測定装置及び光学測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/41 20060101AFI20191007BHJP

   G01N 25/00 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/41 Z

   G01N25/00 A

【請求項の数】10

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-568762(P2016-568762)

(86)(22)【出願日】2016年1月8日

(86)【国際出願番号】JP2016050549

(87)【国際公開番号】WO2016111363

(87)【国際公開日】20160714

【審査請求日】2018年11月22日

(31)【優先権主張番号】特願2015-3066(P2015-3066)

(32)【優先日】2015年1月9日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業チーム型研究（ＣＲＥＳＴ） 研究領域「先端光源を駆使した光科学・光技術の融合展開」における研究課題「高性能レーザーによる細胞光イメージング・光制御と光損傷機構の解明」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504133110

【氏名又は名称】国立大学法人電気通信大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】宮崎 淳

(72)【発明者】

【氏名】小林 孝嘉

【審査官】 森口 正治

(56)【参考文献】

【文献】 特表平8−507367（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平8−233653（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開2005−37253（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／００−２１／９５８

Ｇ０１Ｎ ２５／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料を励起するポンプ光を出力する第１光源と、
プローブ光を出力する第２光源と、
前記ポンプ光と前記プローブ光を試料に導く光学系と、
前記ポンプ光により励起された試料を透過したプローブ信号光を、当該プローブ信号光の径方向に沿って第１セグメントの光成分と第２セグメントの光成分に空間的に分離する光学素子と、
前記第１セグメントの光成分と、前記第２セグメントの光成分の差分を検出するバランス検出器と、
を有することを特徴とする光学測定装置。

【請求項2】

前記光学素子は、前記第１セグメントの光成分を反射する反射部と、前記第２セグメントの光成分を透過させる光透過部とを有することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。

【請求項3】

前記光学素子は、前記プローブ信号光の断面の強度変化の極性が反転する前記径方向の位置で前記プローブ信号光を空間的に分離するように構成されることを特徴とする請求項２に記載の光学測定装置。

【請求項4】

前記光学素子は分岐ファイバ束であり、中心側の第１ファイバ束と外周側の第２ファイバ束を有することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。

【請求項5】

前記第１ファイバ束と前記第２ファイバ束の境界は、前記プローブ信号光の断面の強度変化の極性が反転する前記径方向の位置にあることを特徴とする請求項４に記載の光学測定装置。

【請求項6】

前記試料の出射側に配置されるコンデンサレンズ、
をさらに有し、
前記分岐ファイバ束の入射面は前記コンデンサレンズの瞳共役位置に配置されることを特徴とする請求項４に記載の光学測定装置。

【請求項7】

前記バランス検出器は、前記第１セグメントの光成分を入力とする第１ポートと、前記第２セグメントの光成分を入力とする第２ポートを有し、前記差分を表わす電気信号を出出力することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の光学測定装置。

【請求項8】

前記バランス検出器の出力をロックイン検出するロックイン増幅器、
をさらに有し、
前記ポンプ光の強度は第１変調周波数で変調されており、
前記プローブ光の強度は第２変調周波数で変調されており、
前記ロックイン増幅器は、前記バランス検出器の出力を、前記第１変調周波数と前記第２変調周波数の差分で検出することを特徴とする請求項１、２、３、７のいずれか１項に記載の光学測定装置。

【請求項9】

前記光学系に挿入されるガルバノスキャナ、
をさらに有し、前記ガルバノスキャナにより前記ポンプ光と前記プローブ光を前記試料の上に走査することを特徴とする請求項１、４、５〜７のいずれか１項に記載の光学測定装置。

【請求項10】

ポンプ光とプローブ光を重畳して試料を照射し、
前記試料を透過したプローブ信号光を、当該プローブ信号光の径方向に沿って第１セグメントの光成分と第２セグメントの光成分に空間的に分離し、
前記第１セグメントの光成分と前記第２セグメントの光成分の差分を検出する、
ことを特徴とする光学測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポンプ光とプローブ光を用いて高解像の測定を行う光学測定技術に関する。

【背景技術】

【0002】

光学顕微鏡は電子顕微鏡や原子間力顕微鏡と比べて生体の活動を非接触で生きたままで観察でき、さらに試料の断面像や３次元像を測定できるなどの利点がある。通常の光学顕微鏡で観察できる構造の大きさは光の回折限界によって決まり、波長の半分程度（たとえば４００ｎｍ帯半導体レーザーで２００ｎｍ程度）であるが、近年、この限界を超えた様々な超解像光学顕微鏡が提案されている。ＳＴＥＤ（Stimulated Emission Depletion：誘導放出抑制）顕微鏡は、分子の誘導放出を利用することで通常の回折限界値の４〜５倍程度（５０ｎｍ程度）で生体試料の観察が可能である。また試料中の分子を個別に発光させてその試料内で位置を逐次記録するＰＡＬＭ（Photoactivated localization microscopy）／ＳＴＯＲＭ（Stochastic optical reconstruction microscopy）では、約１０倍の超解像が実現できる。またモアレの原理を応用したＳＩＭ（Structured illumination microscopy）では２倍程、解像度が向上する。

【0003】

上述の超解像顕微鏡はすべて蛍光分子で標識した試料を対象としており、光を出さない無蛍光性分子は観察することができない。蛍光分子は試料に光照射を続けると、三重項状態への遷移やそれに伴って起こる光化学反応により分子が光らなくなってしまう問題がある（光褪色）。蛍光分子を観察する限り光褪色は避けることができず、蛍光顕微鏡全般の大きな問題となっている。特に生体のナノスケールの動態を追跡する１分子蛍光計測では、光照射した分子は通常数十ミリ秒で光らなくなってしまうため、長時間のタイムラプス測定が難しい。ＳＴＥＤやＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭにおいてもこの光褪色の影響が避けられないため、試料を高濃度で標識する必要があるが、光褪色は生きた細胞にとっては光毒作用を引き起こすため好ましくない。

【0004】

蛍光を出さない無蛍光性分子は、光励起状態の寿命が短く化学的に安定で褪色の影響がない（あるいは少ない）ため、光学顕微鏡での観察に有用である。蛍光分子と無蛍光性分子の双方が観察可能な新しい超解像光学顕微法がフォトサーマル顕微鏡である。フォトサーマル顕微鏡は、試料の光励起にともなう微小な屈折率変化を検出するレーザー顕微イメージング法で、近年、金属ナノ粒子やカーボンナノチューブをプローブ分子に用いた生体組織の測定が行われている。また、生体内に存在するミオグロビン、ヘモグロビンなど代謝を司る分子やメラニン色素などの無蛍光性生体分子を、標識することなく超解像イメージングできる利点がある。

【0005】

図１Ａに示すフォトサーマル顕微鏡１００は、波長の異なる２つのレーザー光（ポンプ光Ｌ１及びプローブ光Ｌ２）を試料１０に入射し、ポンプ光（励起光）Ｌ１を吸収した分子近傍の温度上昇に伴う微弱な屈折率変化を、プローブ光Ｌ２の透過率変化として検出する。レーザーの焦点位置を試料中で走査することで、光吸収体のコントラスト像を測定する。

【0006】

ポンプ−プローブ測定の解像度は、焦点面におけるポンプ光とプローブ光の空間分布で決まる。屈折率変化を起こす領域がレーザーのスポットサイズより十分小さい場合、顕微鏡の解像度（点広がり関数）はポンプ光とプローブ光の空間分布の積となるため、通常の光学顕微鏡と比べて解像度が向上する。円形のビームを入射したときは１．４倍、円環状のビームを入射した場合は約２倍、解像度が向上する（たとえば、非特許文献１参照）。また、フォトサーマル信号の角度依存性についての考察がなされている（たとえば、非特許文献２参照）。

【0007】

レーザー計測の分野では、光ノイズ除去のためにバランス検出器（ＢＤ：Balanced Detector）１２０が一般的に用いられる。バランス検出法とは、試料１０に入射する前の光（参照光）と試料１０に入射した後の光（信号光）を測定し、二つの差分からレーザーの光ノイズ（コモンモード成分）を除去し、試料１０に起因した信号のみを検出する方法である。試料１０を透過した信号光は最適な信号対雑音比を得るために虹彩絞り（ＩＤ：iris diaphragm）で制限され、中心部分だけがバランス検出器１２０の信号ポート「ｓｉｇ」に導かれる。参照光はマルチモードファイバＭＭＦによりバランス検出器１２０の参照ポート「ｒｅｆ」に導かれて差分が取られる。

【0008】

バランス検出器１２０の出力はロックイン増幅器３０に供給される。ポンプ光Ｌ１は周波数ω１で変調されており、プローブ光Ｌ２は周波数ω２で変調されている。ロックイン増幅器３０は、バランス検出器１２０の出力を変調周波数の差分｜ω１−ω２｜でロックイン検出する（たとえば、非特許文献３参照）。

【0009】

レーザー顕微鏡の場合、試料の吸収強度や屈折率が空間的に一様でないため、信号光の（フォトサーマル効果とは関係のない静的な）透過率はレーザー走査に伴って変化する。そのため信号光と参照光の強度比が変動してしまい、光ノイズを効率的に除去できない。この問題を解決するために、信号光と参照光の強度比を一定にする自動バランス検出器（ＡＢＤ：Automatic Balanced Detector）が提案されている（たとえば、特許文献１及び２参照）。提案されている自動バランス検出は、強度比の変動を自動補償する特殊な機能を用いて応答速度が遅いため、高速測定が難しい。
図１Ｂは、ポンプ−プローブ測定と差周波を用いたロックイン検出に自動バランス検出器２２０を適用したフォトサーマル顕微鏡２００の概略図である。差周波（ビート周波数）の大きさ｜ω１−ω２｜を固定した状態で変調周波数ω１とω２を変えることで、高速検出器を用いなくても試料分子の応答が広い周波数領域で測定される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第５，１３４，２７６号

【特許文献2】特開平６−３４１８９７号公報（特許文献１の対応日本公報）

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】J. Miyazaki, K. Kawasumi, and T. Kobayashi, Optics Letters 39, 4219-4222 (2014)

【非特許文献2】J. Miyazaki, H. Tsurui, K. Kawasumi, and T. Kobayashi, Optics Express 22, 18833-18842 (2014)

【非特許文献3】J. Miyazaki, H. Tsurui, A. Hayashi-Takagi, H. Kasai, and T. Kobayashi, Optics Express 22, 9024-9032 (2014)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

フォトサーマル顕微鏡は、検出光の微弱な相対強度変化を測定するため、光ノイズを除去して信号対雑音比を向上する構成及び手法が望まれる。通常、分子近傍の温度変化は０．１Ｋ〜１．０Ｋで屈折率変化は１０^−５ 〜１０^−４であるため、検出光の相対強度変化も１０^−５ 〜１０^−４と微弱である。他方、公知の自動バランス検出器は、上述のように応答速度が遅いため高速測定が難しい。

【0013】

そこで、自動バランス検出器を用いずに、光ノイズを低減して信号対雑音比を向上することのできる新しい測定技術を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記課題を解決するために、本発明はフォトサーマル効果による信号の角度依存性を利用して信号強度を向上し、同時に光ノイズを低減する。

【0015】

一つの態様では、光学測定装置は、
試料を励起するポンプ光を出力する第１光源と、
プローブ光を出力する第２光源と、
前記ポンプ光と前記プローブ光を試料に導く光学系と、
前記ポンプ光により励起された試料を透過したプローブ信号光を、当該プローブ信号光の径方向に沿って第１セグメントの光成分と第２セグメントの光成分に空間的に分離する光学素子と、
前記第１セグメントの光成分と、前記第２セグメントの光成分の差分を検出するバランス検出器と、
を有する。

【0016】

プローブ信号光の径方向に沿った第１セグメントの光成分と、第２セグメントの光成分の差分をとることで、信号強度を倍に高めると同時に光ノイズを相殺する。

【発明の効果】

【0017】

特殊な自動バランス検出器を使わずに光ノイズを低減して信号対雑音比の高い光学測定が実現する。また、装置構成が簡素になり、高速測定が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】従来のフォトサーマル顕微鏡の概略図である。

【図1B】従来のフォトサーマル顕微鏡の概略図である。

【図2】第１実施形態の光学測定装置の概略図である。

【図3】フォトサーマル効果による散乱を説明する図である。

【図4】第１実施形態のフォトサーマル測定法の原理を説明する図である。

【図5】第１実施形態の構成により得られる画像を、一般的なバランス検出法及び従来の自動バランス検出法により得られる画像と比較して示す図である。

【図6】第１実施形態の構成により得られる信号の強度を、従来の自動バランス検出法により得られる信号の強度と比較して示す図である。

【図7】第１実施形態の構成により得られる信号のノイズを、一般的なバランス検出法及び従来の自動バランス検出法により得られる画像と比較して示す図である。

【図8】第１実施形態のＲＳＢ測定は、自動バランス検出器を必要としないことを示す図である。

【図9】第１実施形態のＲＳＢ測定は、自動バランス検出器を必要としないことを示す図である。

【図10】第２実施形態の光学測定装置の概略図である。

【図11】分岐ファイバ束の概略図である。

【図12】第２実施形態の光学測定装置の変形例を示す図である。

【図13】第２実施形態の光学測定装置の別の変形例を示す図である。

【図14】第２実施形態の光学測定装置により得られる測定画像を従来のフォトサーマル顕微鏡で得られる画像と比較して示す図である。

【図15】第２実施形態の光学測定装置により得られる信号強度を従来法と比較して示す図である。

【図16】第２実施形態の光学測定装置による３次元走査画像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

＜第１実施形態＞
図２は、第１実施形態の光学測定装置１の概略図である。光学測定装置１は、ポンプ−プローブ法により試料１０に生じる変化を測定し、試料１０を透過した信号光を、ビームの径方向に２つのセグメントに分離して差分を検出することで、高速、高感度の測定を実現する。

【0020】

光学測定装置１は、ポンプ光源としての光源１１と、プローブ光源としての光源１２を有する。図２の例では、光源１１は波長４５０ｎｍの半導体レーザーであり、試料１０を光励起するためのポンプ（励起）光Ｌ１を出力する。光源１２は波長６６０ｎｍの半導体レーザーであり、光励起された試料１０に生じる変化を検出するプローブ（検出）光Ｌ２を出力する。光学測定装置１は、フォトサーマル効果を利用して顕微測定する点で、フォトサーマル顕微鏡と称してもよい。フォトサーマル効果とは、光エネルギーを熱に変換する効果である。試料１０内でポンプ光を吸収した分子からの発熱により、その分子の近傍で温度が上昇して屈折率が微小に変化する。プローブ光Ｌ２は、その屈折率の変化を検知する。

【0021】

ポンプ光Ｌ１の強度は周波数ω１で変調され、プローブ光Ｌ２の強度は周波数ω２で変調される。変調手段は特に図示しないが、光源１１と光源１２の内部にそれぞれの変調周波数に対応する低周波信号生成器を組み込んでもよいし、光源１１と光源１２の外部から変調信号を印加してもよい。

【0022】

強度変調を受けたポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２は、それぞれ図示しないシングルモードファイバーによって空間モードが整えられる。ポンプ光Ｌ１は、ミラー１３によってダイクロイックミラー１４に導かれる。ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１４を通して同軸に重ね合わされて対物レンズ１５に入射する。試料１０を透過した光はコンデンサレンズ１７で集光され、コリメートされる。コリメート後のビームの直径は、たとえば１７ｍｍである。フィルタ１８によりポンプ光Ｌ１がカットされ、プローブ光のみが透過する。フィルタ１８を出た光は、励起光の吸収による屈折率変化の情報の乗せた信号光Ｌ３である。

【0023】

光学測定装置１は、光軸に沿ってフィルタ１８の後ろに配置される光学素子４０を有する。光学素子４０は、信号光Ｌ３をスポットの径方向に中央部と辺縁部とに分離する。光学素子４０は、たとえば、ガラス板４１に直径１２．７ｍｍ（０．５インチ）のミラー４２を取り付けた光学素子である。光学素子４０に入射した信号光Ｌ３の中心部分（第１セグメント）はミラー４２によって反射され、中心光成分Ｌ３ａとしてバランス検出器２０の信号ポート２１に導かれる。光学素子４０のガラス板４１を透過した信号光Ｌ３の辺縁部分（第２セグメント）は、辺縁光成分Ｌ３ｂとしてバランス検出器２０の参照ポート２２に導かれる。ガラス板４１に替えて、任意の光透過部材を用いてもよい。

【0024】

後述するように、信号光Ｌ３の中心部と辺縁部を分割する最適角は、理論計算と実験結果とから見積もることができる。開口数０．９５の対物レンズ１５を用いた場合、信号光Ｌ３の中心部と辺縁部を分割する最適角は、約０．２７π［ｒａｄ］と見積もられる。

【0025】

半導体レーザーのノイズを除去するため、中心光成分Ｌ３ａと辺縁光成分Ｌ３ｂの光強度が等しくなるように、光強度の強い方（実施形態では中心光成分Ｌ３ａ）を絞り１９を用いて微調整する。バランス検出器２０は、中心光成分Ｌ３ａと辺縁光成分Ｌ３ｂをそれぞれ電流に変換して引き算を行い、差分を表わす電気信号をロックイン増幅器３０に出力する。

【0026】

ロックイン増幅器３０は、フォトサーマル効果による情報を載せた信号光Ｌ３から差周波成分｜ω１−ω２｜をヘテロダイン的に検出する。図２の例では、ポンプ光Ｌ１の変調周波数ω１は１．０ＭＨｚ、プローブ光Ｌ２の変調周波数ω２は１．１ＭＨｚである。これらの変調周波数は、ポンプ光Ｌ１及びプローブ光Ｌ２の振動周波数よりもはるかに小さい。試料１０をピエゾステージ１６に固定し、試料１０を走査しながら各点で信号を検出して図示しない演算装置に出力することで、顕微イメージを測定することができる。

【0027】

従来は、図１（Ｂ）に示すように、試料１０の走査により透過光強度が変動するため、信号光と参照光の差分を出力する前に、信号ポート「ｓｉｇ」と参照ポート「ｒｅｆ」の出力を一定に保つ自動利得調整が必要であった。これに対し、第１実施形態では、信号光Ｌ３を径方向の２つのセグメントに分離して差分をとることで、自動バランス検出（自動利得調整）を用いずに、信号光強度を向上し、かつ光ノイズを低減する。

【0028】

図３はフォトサーマル効果による散乱を説明する図、図４は本発明の原理を説明する図である。図３に示すように、フォトサーマル効果により屈折率変化が起きている媒質中を伝搬する平面波（プローブ光Ｌ２）は、進行方向とは別の方向へ偏向（散乱）される。その振舞いは量子力学的な散乱と同等の式で理論的に記述することができ、伝搬する光は有限の相互作用力である湯川ポテンシャル（Ｕ（ｒ）＝Ｕ_０×（ｅ^−ｍｒ／ｒ））型の散乱を受ける。

【0029】

実際のフォトサーマル顕微鏡では、レーザー光を対物レンズ１５を介して試料１０に集光させるため、さまざまな進行方向をもった平面波が試料１０に入射していると考えることができる。このことを考慮して発散する透過光断面のフォトサーマル効果による強度変化パターンを計算した結果が、図４（ａ）である。理論の詳細は、非特許文献２に記載されている。

【0030】

図４（ａ）では、入射光（透過光）の集光（発散）角度を０．４π［ｒａｄ］としているが、集光（発散）角度は、対物レンズ１５の焦点距離、開口数（ＮＡ）等によって異なり得る。透過光断面（スポット）の中心の集光（発散）角度は０π［ｒａｄ］であり、中心から離れるにつれて角度が大きくなる。光の中心部ではフォトサーマル効果により光強度は増加するが、辺縁部は逆に減少する。図４（ａ）の下側のグラフに示すように、光の中心側（光強度増加領域ａ）の強度変化のパターン（極性）と、光の辺縁部（光強度減少領域ｂ）の強度変化のパターン（極性）は、ある角度を境に反転する。図４（ａ）の例では、中心から０．２７π［ｒａｄ］の点を境に、信号強度が強くなる領域と、信号強度が弱くなる領域に分けられる。すべての角度にわたって光強度を積分すると増加と減少が打ち消しあってゼロとなる。

【0031】

透過光全体でみると強度は変化していないが（エネルギー保存）、フォトサーマル効果によりビームの中心部に光が集まってくると考えることができる。そのため、今までのフォトサーマル顕微鏡では、辺縁部を絞りでカットしたり、低開口数の対物レンズで透過光を集光したりするなどして、中心部の光（光強度増加）のみを検出していた。

【0032】

しかし、辺縁部の光もフォトサーマル効果により強度変化（光強度減少）を受けているので、辺縁部の光を活用することで信号強度を向上させることができる。これが、本発明の根本原理である。

【0033】

図４（ｂ）に示すように、本発明では、透過光の中心部と辺縁部を空間的に分けて別々に検出し、その後、二つの差分を計算することで、信号強度を２倍向上させる。透過光の中心光成分Ｌ３ａは、図４（ａ）の光強度増加領域ａの光成分に対応し、辺縁光成分Ｌ３ｂは図４（ａ）の光強度減少領域ｂの光成分に対応する。信号光Ｌ３の中心部と辺縁部を分割する最適角は、信号変化の強度の符号が反転する点（図４では０．２７π［ｒａｄ］）である。

【0034】

フォトサーマル信号をｓ、レーザー強度ノイズをδｐとすると、中心光成分Ｌ３ａの強度は（ｓ＋δｐ）、辺縁光成分Ｌ３ｂの強度は（−ｓ＋δｐ）となる。２つの光成分の差分を取ると、
（ｓ＋δｐ）−（−ｓ＋δｐ）＝２ｓ （１）
となり、信号強度を２倍にできるだけではなく、光源１１及び１２の光ノイズ（中心部と辺縁部の同相モードノイズ）を除去することができる。

【0035】

ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２の走査中に、屈折率や吸収強度の非均一性に起因する（フォトサーマル効果とは無関係の）静的な透過率変化の影響を受けても、一つのビームの中心部と辺縁部は試料１０の同じ位置を透過するので、中心光成分Ｌ３ａと辺縁光成分Ｌ３ｂの強度比は常に一定に保たれる。そのため両者の強度比を調整するための自動バランス検出法などの特殊な装置を必要としないことも特徴である。

【0036】

図５は、第１実施形態の光学測定装置１による測定結果を、従来法による測定結果と比較する図である。図５（ａ）は、図１（ａ）の従来のバランス検出（ＢＤ）による測定結果を示し、図５（ｂ）は、図１（ｂ）の従来の自動バランス検出（ＡＢＤ）による測定結果を示す。図５（ｃ）は、図２の光学測定装置１を用いた実施例の測定結果を示す。図５（ｃ）の測定法は、信号光を径方向に中心部と辺縁部に分割して差分を取るので、便宜上「ＲＳＢ（Radial Segment Balance）」法と称する。

【0037】

図５（ａ）〜図５（ｃ）において、マウスメラノーマのスライス（凍結切片、厚さ２０μｍ）を試料１０として用い、試料１０上の同一領域を走査範囲とする。試料１０に入射するポンプ光Ｌ１の強度は８０μＷ、プローブ光Ｌ２の強度を２００μＷである。ロックイン増幅器３０の時定数は０．５ｍｓ、１ピクセル当たりの滞在時間は１ｍｓで、イメージサイズは（２００×２００）ピクセルである。

【0038】

図５（ａ）〜図５（ｃ）の画像中の黒い斑点はメラニン顆粒である。図５（ｃ）のＲＳＢ法による測定は、図５（ａ）の従来のバランス検出（ＢＤ）及び図５（ｂ）の従来の自動バランス検出（ＡＢＤ）と比べて、明らかに信号強度が強くなっている。図５（ａ）の矢印Ｂで示すぼんやりとした影は、ノイズである。従来のバランス検出（ＢＤ）では、試料１０中の静的吸収強度や屈折率の非均一性により、信号光と参照光の強度比がずれてしまい、両者の差分をとるだけでは光ノイズを十分に除去することができない。

【0039】

図５（ｂ）の自動バランス検出（ＡＢＤ）は、オードゲイン制御により信号光と参照光の強度比の変動を補償して光ノイズを抑制しているが、図５（ｃ）のＲＳＢ法と比較して鮮明度（強度）が劣る。空間解像度は、図５（ｃ）のＲＳＢ法と図５（ｂ）のＡＢＤで同じであり、通常の明視野顕微鏡による観察像と比較して３０％向上している。

【0040】

図６は、第１実施形態の測定法による信号強度の向上効果を示す図である。図６（ａ）は、図５（ｂ）と図５（ｃ）のＸ−Ｘ’ラインに沿った強度プロファイルを比較する図、図６（ｂ）は従来の自動バランス検出（ＡＢＤ）に対する第１実施形態のＲＢＳ法の強度比を示す図である。図６（ａ）では、全体にわたってＲＳＢ法による検出強度が従来のＡＢＤによる検出強度よりも高い。図６（ｂ）は、ピーク強度比をプロットしたものであり、その平均強度比は、１．７〜１．８である。

【0041】

図４を参照して説明した理論計算では、信号強度は最高で２倍となるが、実際の測定では、後方散乱成分の存在や、最適な分割角度からのズレのため、２倍よりもやや小さくなる。これらの要因は寄与が小さいため、理論では考慮されていない。

【0042】

図７は、ノイズ成分を比較する図であり、図５（ａ）〜図５（ｃ）のＹ−Ｙ’ラインに沿った強度プロファイルである。従来の自動バランス検出（ＡＢＤ）は、従来のバランス検出（ＢＤ）と比較してノイズが低減されている。第１実施形態のＲＳＢ法も同様に、従来のバランス検出（ＢＤ）と比較して、不規則な上下振動が抑制されている。これは、第１実施形態のＲＳＢ法では、中心光成分Ｌ３ａと辺縁光成分Ｌ３ｂの両方が試料１０を通過しているため、試料走査中の強度比の変動がなく、単純に差分をとる通常のバランス検出だけでも全領域で光ノイズを抑制できるからである。

【0043】

図８及び図９は、第１実施形態のＲＳＢ法は、従来、光源ノイズの除去に用いられていた自動バランス検出を必要としないことを示す図である。図８（ａ）は、第１実施形態のＲＳＢ法により観察される画像、図８（ｂ）は図２の第１実施形態の光学系に自動バランス検出器２２０を適用して観察される画像である。両画像で、自動バランス検出器の使用の有無にかかわらず、ノイズの影響はほとんどみられない。信号光を径方向に分離して中心光成分と辺縁光成分の差を検出することで、応答速度の遅い自動バランス検出を用いなくても測定領域全体にわたって光ノイズを抑制できることがわかる。

【0044】

図９は、図８（ａ）と図８（ｂ）のＣ−Ｃ’ラインに沿ったノイズの強度プロファイルである。この図からも、第１実施形態のＲＳＢ法は、従来の自動バランス検出を行わなくても十分に光源ノイズを低減できることがわかる。

【0045】

以上述べたように、第１実施形態の光学測定法はフォトサーマル信号の角度依存性を利用して、信号対雑音比を向上させる。試料透過後の信号光の中心部と辺縁部を空間的に分離して、両者の差分をバランス検出で測定することで、信号強度が従来の自動バランス検出の約２倍になり、同時にレーザー光源の光ノイズ（同相モードノイズ）を除去することができる。信号光の中心部と辺縁部は試料１０中で同じ位置を透過するため、透過率が非一様な試料を走査しても中心光成分と辺縁光成分の強度比は一定となるからである。

【0046】

第１実施形態の光学測定装置１は、蛍光顕微鏡では見ることができない「光らない」組織の３次元構造を超解像で観察することができる。メラノーマ細胞やマウスの神経細胞、内臓など様々な生体組織の３次元イメージングにも適用することができる。また、触媒、太陽電池や発光素子などの光電子材料の評価などの用途にも役立つ。

【0047】

光学測定装置１は光源を選ばないので、低コスト、省スペースで維持管理の容易な連続発振半導体レーザーを光源として利用できる。特殊な自動バランス検出を用いずに、信号雑音比を向上できるので、低い強度のレーザー入射で試料１０のダメージを抑えつつ、高速に測定することができる。特に、生きた細胞の測定に必須のリアルタイム測定に適している。

【0048】

なお、図２の例では、光学素子４０を用いて信号光（情報を載せたプローブ光）Ｌ３を径方向に沿って空間的に分離したが、信号光Ｌ３を空間的に分離できる任意の構成を採用してもよい。
＜第２実施形態＞
図１０は、第２実施形態の光学測定装置２の概略構成図である。第２実施形態では、プローブ信号光を径方向にセグメント分離する光学手段として、分岐ファイバ束（ＢＦＢ：bifurcated Fiber Bundle）を用いる。また、実施形態のＲＳＢ法をガルバノスキャナと組み合わせて、より高速、高解像の顕微システムを実現する。第１実施形態の光学測定装置１と同じ構成要素には同じ符号を付けて、重複する説明を省略する。

【0049】

光学測定装置２は、ポンプ光源としての光源３１と、プローブ光源としての光源３２を有する。図１０の例では、光源３１は波長５２０ｎｍの半導体レーザーであり、試料１０を光励起するためのポンプ（励起）光（図中、「Ｌ_ｐｕｍｐ」と表記）を出力する。光源３２は波長６４０ｎｍの半導体レーザーであり、光励起された試料１０に生じる変化を検出するプローブ（検出）光（図中、「Ｌ_ｐｕｍｐ」と表記）を出力する。ポンプ光の強度は周波数ω１で変調されている。

【0050】

ポンプ光は、レンズ５１により偏光保持単一モードファイバ（ＰＭＳＭＦ：Polarization Maintained Single Mode Fiber）５２に入射し、アクロマティックコリメータ（ＡＣ）とミラー１３によってダイクロイックミラー１４に導かれる。プローブ光は、レンズ５３により、ＰＭＳＭＦ５４に入射し、メニスカスレンズ５５でビーム発散角が調整されてダイクロイックミラー１４に入射する。ポンプ光とプローブ光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１４を通して同軸に重ね合わされ、ミラー５６及び１／４波長板５７を介して、ガルバノスキャナ６０に導かれる。ガルバノスキャナ６０は、ダイクロイックミラー１４により同軸に重ねられたポンプ光とプローブ光をＸ−Ｙ面内で高速走査する。ポンプ光とプローブ光はレンズ６１，６２により、対物レンズ１５の瞳面に拡大投影されて試料１０上を走査する。

【0051】

試料１０はピエゾステージ１６に固定されている。ピエゾステージをＺ軸方向（光軸方向）に駆動することで、試料１０を３次元走査して、試料１０の厚さ方向の情報を得ることができる。試料１０を透過したポンプ光とプローブ光は、コンデンサレンズ１７で集光され、コリメートされる。フィルタ１８によりポンプ光がカットされ、プローブ光のみが透過する。

【0052】

第１実施形態では、試料１０をピエゾステージでＸ−Ｙ方向に動かすことで、Ｘ−Ｙ面内の走査を行っていたが、機械的な動作速度には限界がある。第２実施形態では、ガルバノミラーを用いた高速走査により、レーザー顕微イメージングで高速測定が実現する。たとえば、ピエゾステージ１６のみを使った走査では、２００×２００ピクセルの１フレーム測定に４０秒程度の時間がかかる。これに対し、ガルバノスキャナ６０を用いる場合、同じ試料に対して２００×２００ピクセルのイメージングを約２秒で行うことができる。

【0053】

フィルタ１８を出たプローブ光は、レンズ６３、６４を介して、分岐ファイバ束（ＢＦＢ）７０に入射する。分岐ファイバ束７０の入射面は、コンデンサレンズ１７の瞳共役位置に配置されており、試料１０上を走査されたプローブ光は、レンズ６３，６４により分岐ファイバ束７０の入射面に縮小投影される。

【0054】

分岐ファイバ束７０は、中央または内側部分の光ファイバを束ねた第１ファイバ束７１と、外周または外側部分の光ファイバを束ねた第２ファイバ束７２に分岐されており、プローブ光は径方向に沿って２つのセグメントに分離される。分離されたプローブ光は、それぞれバランス検出器２０の２つの入力ポート２０１、２０２に入力され、差分が検出される。バランス検出器２０は、第１実施形態と同様に、プローブ光の内側領域に含まれるノイズと、プローブ光の外側領域に含まれるノイズを相殺し、かつ信号光の強度を２倍に強めた光を出力する。バランス検出器２０の出力は、ロックイン増幅器３０により、変調周波数ω１でロックイン検出される。この構成により、高い信号対雑音比で高速測定が可能になる。

【0055】

図１１は、分岐ファイバ束７０の概略図である。図１１に示す例では、径方向に分割されるプローブ光Ｌｐｒｏｂｅの内径ｄ１は２ｍｍ、外径ｄ２は４ｍｍである。これは、分岐ファイバ束７０への入射光の集光角度を０．４π［ｒａｄ］としたときに、０．２７π［ｒａｄ］の集光角で分離する場合に相当する。この分離点は、対物レンズ１５の焦点距離や開口数、レンズ６４の焦点距離等により調整可能である。

【0056】

内側部分（「ｉｎｎｅｒ」）の第１ファイバ束７１は、バランス検出器２０の入力ポート２０１に接続されている。外側部分（「ｏｕｔｅｒ」）の第２ファイバ束７２は、バランス検出器２０の入力ポート２０２に接続されている。図示は省略するが、バランス検出器２０は２つの光検出器を用いて、それぞれの入力光を検出する。第２実施形態では、比較的大面積のフォトダイオードを用いて、２つに分割された第１ファイバ束７１と第２ファイバ束７２のそれぞれの出射光を検出する。

【0057】

図１２は、第２実施形態の光学測定装置２の変形例として、光学測定装置３の概略構成を示す。図１２の変形例では、ポンプ光源として、第１波長の第１ポンプ光源３１−１と第２波長の第２ポンプ光源３１−２を用いて、多色フォトサーマル顕微鏡を実現する。図１０の光学測定装置２と同じ構成要素には同じ符号を付けて、重複する説明を省略する。

【0058】

第１ポンプ光源３１−１は、たとえば波長が４０５ｎｍの半導体レーザーである。第２ポンプ光源３１−２は、たとえば波長が５２０ｎｍの半導体レーザーである。第１ポンプ光源３１−１から出力される第１ポンプ光は、周波数ω１で強度変調がかけられ、第２ポンプ光源３１−２から出力される第２ポンプ光は、周波数ω２で強度変調がかけられている。異なる波長のポンプ光を用いることで試料１０内に異なる励起反応を生じさせ、プローブ光を用いて、各波長のポンプ光を吸収した分子から異なる発熱（屈折率変化）を観測することができる。

【0059】

第１ポンプ光源３１−１からのポンプ光は、ミラー８１によりダイクロイックミラー８２上で、第２ポンプ光源３１−２からのポンプ光と同軸に重ね合される。同軸に重ねられ２つのポンプ光は、レンズ５１によりＰＭＳＭＦ５２に入射し、アクロマティックコリメータ（ＡＣ）とミラー１３によってダイクロイックミラー１４に導かれ、プローブ光と同軸に重ねられる。

【0060】

２色のポンプ光とプローブ光は、図１０と同様に、ガルバノスキャナ６０により試料１０上を高速走査される。この高速走査により、試料１０のＸ−Ｙ面内で２種類の励起反応が生じる。また、ピエゾステージ１６をＺ軸（入射光の光軸方向）に駆動することで、試料１０の内部の励起反応を測定することができる。試料１０を透過したポンプ光とプローブ光は、コンデンサレンズ１７で集光され、コリメートされる。フィルタ１８によりポンプ光がカットされ、プローブ光のみが透過する。

【0061】

図１０と同様に、コンデンサレンズ１７の瞳共役位置に分岐ファイバ束７０の入射面が配置されており、走査されたプローブ光はレンズ６３，７４により分岐ファイバ束７０の入射面に縮小投影される。分岐ファイバ束７０の内側部分の第１ファイバ束７１を伝搬する信号光は、バランス検出器２０の入力ポート２０１に入力され、外周部分の第２ファイバ束７２を伝搬する信号光は入力ポート２０２に入力される。

【0062】

バランス検出器２０の出力（強度が２倍に増強された差信号）は、ロックイン増幅器３０−１と３０−２にそれぞれ入力される。ロックイン増幅器３０−１は、差信号を周波数ω１で同期検出し、第１ポンプ光源３１−１からのポンプ光により励起された試料情報を抽出する。ロックイン増幅器３０−２は、差信号を周波数ω２で検出し、第２ポンプ光源３１−２からのポンプ光により励起された試料情報を抽出する。

【0063】

図１２の構成では、ガルバノスキャナ６０を用いた高速走査と、プローブ光を径方向に分割する分岐ファイバ束７０により、高速かつ高い信号対雑音比の多色測定が実現する。

【0064】

図１３は、第２実施形態の光学測定装置２の別の変形例として、光学測定装置４の概略構成を示す。図１３の変形例では、多色かつ、多モードの光学測定装置４を実現する。図１２の光学測定装置３と同じ構成要素には同じ符号を付けて、重複する説明を省略する。

【0065】

異なる波長の第１ポンプ光源３１−１と第２ポンプ光源３１−２を用いて、多色でフォトサーマル測定する点は、図１２の光学測定装置３と同様である。図１３では、多色のフォトサーマル顕微測定に加えて、別の種類の光学測定、たとえば蛍光顕微測定を行う。これをマルチモード測定と称する。

【0066】

ポンプ光（第１ポンプ光源３１−１からの第１ポンプ光と第２ポンプ光源３１−２からの第２ポンプ光を含む）とプローブ光は、ダイクロイックミラー１４により同軸に重ねられる。このダイクロイックミラー１４と試料１０の間の光路に、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）８５が挿入されている。試料１０を透過したプローブ光は、図１０及び図１２と同様に、分岐ファイバ束７０で径方向に分離されて、バランス検出器２０でバランス検出される。バランス検出器２０の出力信号は、ロックイン増幅器３０−１で周波数ω１でロックイン検出され、ロックイン増幅器３０−２で周波数ω２でロックイン検出される。

【0067】

試料１０からの戻り光（蛍光）は、入射光路を反対方向に戻って、偏光ビームスプリッタ８５により、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）８９に導かれる。より詳細には、偏光ビームスプリッタ８５で反射された戻り光のうち、ポンプ光とプローブ光はフィルタ８６によりカットされ、蛍光はレンズ８７によりマルチモードファイバ（ＭＭＦ）８８に入力される。蛍光は、ＭＭＦ８８により光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）８９に入力され、電気信号に変換される。得られた電気信号により、たとえば蛍光の測定が可能になる。

【0068】

蛍光は、ポンプ光で励起された分子が異なる波長の光を放出する現象である。それにより試料１０内部の蛍光イメージングが可能になる。図１３の光学測定装置４は、一つの装置を用いて、フォトサーマル効果を利用した顕微イメージングと、蛍光測定によるイメージングを実現する。

【0069】

図１４は、図１０の光学測定装置２を用いて測定したマウス脳標本のフォトサーマル画像を、ロックインのみで検出した従来のフォトサーマル画像と比較して示す図である。図１０（ａ）が従来法、図１０（ｂ）が第２実施形態の手法によるフォトサーマル画像である。ポンプ光（波長５２０ｎｍ）の入射強度は３．８ｍＷ、変調周波数ω１は１２０ｋＨｚ、プローブ光（波長６４０ｎｍ）の入射強度は６ｍＷである。ロックイン増幅器３０の時定数は２０μｓ、１ピクセルの測定時間は２０μｓ、ピクセル数６００×６００、測定時間は９秒である。

【0070】

図１５は、図１４の破線ラインの位置での信号強度分布を示す。実線が第２実施形態の光学測定装置２による信号強度を示し、点線が従来法（バランス検出なし、ロックイン検出のみのフォトサーマル顕微法）による信号強度を示す。第２実施形態でプローブ光を径方向にセグメント分離して差分をとる方法（ＲＳＢ法）により、信号強度は約２倍に向上する。他方、レーザー強度ノイズを相殺することで信号対雑音比が向上している。図１５の測定例では、信号強度が２倍、ノイズの振幅が１／２になっていることから、信号対雑音比は従来の４倍に向上している。

【0071】

このことは、図１４の画像からも確認される。図１４（ｂ）では、脳標本の血管壁だけでなく、グリア細胞内に存在しているグリコーゲン顆粒などの網目状構造の詳細を高感度かつ高分解（平面方向の分解能が約１５０ｎｍ）でイメージングされている。

【0072】

また、測定速度は信号対雑音比の２乗に比例することから、信号雑音比が４倍に向上すると、測定速度は１６倍になり、測定時間は１／１６に短縮される。

【0073】

図１６は、マウス脳標本の３次元測定画像（Ｚ−スタック像）である。図１０の光学測定装置２を用いて、６００×６００×３０ｖｏｘｅｌの３次元画像を約５分で測定している。試料１０の観察範囲は７０μｍ×７０μｍ×２０μｍである。

【0074】

第２実施形態の構成では、ＲＳＢ法により光軸方向にも高い分解能（４００ｎｍ以下）を有しており、共焦点蛍光イメージングや多光子励起蛍光顕微鏡と同じように、厚さのある試料の断層像や３次元像を観測できる。図１６の画像は、図１０の光学測定装置２でピエゾステージ１６を用いて、試料１０の深さ位置を光軸方向に変化させて３０枚測定した画像をスタックしたものである。Ｘ−Ｙ平面内の走査をガルバノスキャナ６０で行っており、グリア細胞由来の３次元網目状構造の様子を実用的な時間（約５分）で観察できる。

【0075】

第２実施形態の光学測定装置２〜４は、マウス骨格筋の虚血過程の観察にも適用可能である。生きた生体試料は動いてしまうので、高速測定が重要である。生きた状態のマウス骨格筋の虚血過程を観察する場合、フォトサーマル画像で筋肉中のシトクロムやミオグロビンなどのヘム蛋白を高感度で観察できる。また、虚血過程でミトコンドリアの形状が変わっている様子を観察できる。

【0076】

第１実施形態と第２実施形態を通して、ＲＳＢ法により信号雑音比が向上するので、より弱いパワーのレーザー光で観察できるようになり、試料の熱ダメージを低減することができる。

【0077】

この出願は、２０１５年１月９日に日本国特許庁に出願された特許出願第２０１５−００３０６６号に基づき、その全内容を含むものである。

【符号の説明】

【0078】

１，２，３，４ 光学測定装置
１０ 試料
１１、３１、３１−１、３１−２ 光源（ポンプ光源）
１２、３２ 光源（プローブ光源）
２０ バランス検出器
２１ 信号ポート
２２ 参照ポート
３０、３０−１、３０−２ ロックイン増幅器
４０ 光学素子
４１ ガラス板（光透過部材）
４２ ミラー
６０ ガルバノスキャナ
７０ 分岐ファイバ束
７１ 第１ファイバ束
７２ 第２ファイバ束
２０１、２０１ 入力ポート

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】