特許 6590413 大腸菌特異的抗体配列

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6590413

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】大腸菌特異的抗体配列

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20191007BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20191007BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20191007BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20191007BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/12

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P31/04

   A61P13/02

   G01N33/569 F

【請求項の数】12

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2016-550556(P2016-550556)

(86)(22)【出願日】2014年12月19日

(65)【公表番号】特表2017-511691(P2017-511691A)

(43)【公表日】2017年4月27日

(86)【国際出願番号】EP2014078709

(87)【国際公開番号】WO2015117711

(87)【国際公開日】20150813

【審査請求日】2017年10月20日

(31)【優先権主張番号】14154158.1

(32)【優先日】2014年2月6日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14166200.7

(32)【優先日】2014年4月28日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 26762

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 26763

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 28171

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 28172

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514264606

【氏名又は名称】エックスフォー・ファーマシューティカルズ（オーストリア）ゲーエムべーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ナギー、エステル

(72)【発明者】

【氏名】ナギー、ガーボル

(72)【発明者】

【氏名】シーヤールトー、ヴァレリア

(72)【発明者】

【氏名】グアチャラ、ルイス

(72)【発明者】

【氏名】ヴァスケス、マクシミリアーノ

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表昭６２−５００１７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 VALERIA SZIJARTO，FEMS MICROBIOLOGY LETTERS，２０１２年 ７月 １日，V332 N2，P131-136

【文献】 INTERNATIONAL JOURNAL OF ANTIMICROBIAL AGENTS，NL，２０１１年 １月 １日，Vol. 37，p. 16-21

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）

ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ（ＳＴＮ）

ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）が重鎖ＣＤＲ１〜３を含み、前記抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）が軽鎖ＣＤＲ１〜３を含み、重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列の組み合わせが、Ｋａｂａｔの番号表記システムに従って、ｉ）〜ｘｉｖ）のいずれか１つである、抗体：
ｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列；
ｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号８のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号９のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１０のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列；
ｉｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１４のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１５のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列；
ｉｖ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１７のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号１８のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号１９のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２０のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列；
ｖ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２３のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２５のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２６のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２８のアミノ酸配列；
ｖｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２９のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号３０のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号３１のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２０のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３２のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３３のアミノ酸配列；
ｖｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３４のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号３５のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号３６のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３７のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３８のアミノ酸配列；
ｖｉｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２９のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号４０のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号４１のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４２のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３２のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４３のアミノ酸配列；
ｉｘ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号４４のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号４５のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号４６のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４７のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４８のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４９のアミノ酸配列；
ｘ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号５０のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号５１のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号５２のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号５３のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３２のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４のアミノ酸配列；
ｘｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号５０のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号５５のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号５６のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号５７のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３２のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号５４のアミノ酸配列；
ｘｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号５７のアミノ酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号５８のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号５９のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２６のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号６０のアミノ酸配列；
ｘｉｉｉ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号６１のアミノ酸酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号６２のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号６３のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号６４のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号６５のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３８のアミノ酸配列；
ｘｉｖ）
ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号６６のアミノ酸酸配列、
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号６７のアミノ酸配列、
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号６８のアミノ酸配列、
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号６９のアミノ酸配列、
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号７０のアミノ酸配列、及び
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号７１のアミノ酸配列。

【請求項2】

請求項１に記載の抗体であって、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の組み合わせが、
ａ）重鎖が配列番号２００のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６４のアミノ酸配列；
ｂ）重鎖が配列番号２０１のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６５のアミノ酸配列；
ｃ）重鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６６のアミノ酸配列；
ｄ）重鎖が配列番号２０３のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６７のアミノ酸配列；
ｅ）重鎖が配列番号２０４のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６８のアミノ酸配列；
ｆ）重鎖が配列番号２０５のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２６９のアミノ酸配列；
ｇ）重鎖が配列番号２０６のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７０のアミノ酸配列；
ｈ）重鎖が配列番号２０７のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７１のアミノ酸配列；
ｉ）重鎖が配列番号２０８のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７２のアミノ酸配列；
ｊ）重鎖が配列番号２０９のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７３のアミノ酸配列；
ｋ）重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７４のアミノ酸配列；
ｌ）重鎖が配列番号２１１のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７５のアミノ酸配列；
ｍ）重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７６のアミノ酸配列；
ｎ）重鎖が配列番号２１３のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７７のアミノ酸配列；
ｏ）重鎖が配列番号２１４のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７８のアミノ酸配列；
ｐ）重鎖が配列番号２１５のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号２７９のアミノ酸配列；
ｑ）重鎖が配列番号３１４のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号３１８のアミノ酸配列；及び、
ｒ）重鎖が配列番号３１５のアミノ酸配列で、軽鎖が配列番号３１９のアミノ酸配列；
からなる群より選択される、抗体。

【請求項3】

前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

前記抗体が、全長のモノクローナル抗体、その抗原結合部位を含む抗体フラグメント、または、その抗原結合部位を含む融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

大腸菌感染症の危険性がある対象、または、大腸菌感染症に罹患している対象を処置することにおける使用で、前記対象における前記感染症を制限するために、前記感染症から生じる疾患状態を改善するために、または、腎盂腎炎、二次的菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎および人工呼吸器関連肺炎の処置または予防のために、効果的な量の前記抗体を前記対象に投与することを含む使用のための、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を含み、非経口用配合物または粘膜用配合物を含み、場合により医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する医薬調製物。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれかに記載の抗体の診断用調製物であって、前記抗体およびさらなる診断試薬を組成物または部分品のキットにおいて含み、下記の成分：
ａ）前記抗体；および
ｂ）前記さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに、必要な場合には、前記抗体および前記診断試薬の少なくとも１つを固定化するための固相
を含む、診断用調製物。

【請求項8】

大腸菌菌株によって引き起こされる対象における大腸菌感染症または大腸菌菌血症の診断用の情報を得る方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を提供すること、および
ｂ）前記抗体が、試験される前記対象の生物学的サンプルにおけるＯ２５ｂ抗原と特異的に免疫反応するかを、凝集試験によって検出し、それにより、ＭＤＲ大腸菌の感染症または菌血症を診断用の情報を得ること
を含む方法。

【請求項9】

請求項１〜４のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。

【請求項10】

ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の抗体のＶＨおよびＶＬ；あるいは
ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の抗体の重鎖および軽鎖
を発現させるためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミド。

【請求項11】

請求項１０に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞。

【請求項12】

請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を製造する方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞が、前記抗体を産生させるための条件のもとで培養または維持される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合し、かつ、特異的なＣＤＲ配列によって特徴づけられる単離された抗体に関連する。

【背景技術】

【0002】

リポ多糖（ＬＰＳ）は腸内細菌病原体の表面における最も多く存在する抗原である。典型的には、ＬＰＳは、３つの構造部分、すなわち、ｉ）リピドＡ（これはまた、エンドトキシンとして知られている）、ｉｉ）コアオリゴ糖、および、ｉｉｉ）Ｏ抗原を有する。後者は、（血清型に依存して）３個〜６個の糖の反復するサブユニットから構成される。リピドＡおよびコアＯＳは、ただ１つだけの腸内細菌菌種においては比較的よく保存されており、しかしながら、抗体に対するそれらの接触性は限定される。一方、Ｏ抗原は非常に接触可能であり、しかし、その構造に関しては非常に多様である（大腸菌には、約１８０の異なるＯタイプが存在する）。

【0003】

Ｏ抗原に対する抗体は大腸菌の表面に結合することができ、したがって、様々なＯ抗原に対する抗体が診断学（例えば、疫学研究のためのＯタイプ決定）のために使用され、同様にまた、治療手段として提案される。それにもかかわらず、非常に大きい構造的変動性を考慮すると、Ｏ抗原特異的抗体による広範囲の保護は面倒である。

【0004】

大腸菌によって引き起こされる腸管外感染症が、かなりの罹患率および死亡率の一般的な原因となっている。出現している大腸菌の多剤耐性（ＭＤＲ）菌株が近年では、大腸菌感染症の有意な割合を引き起こしている。

【0005】

これらのＭＤＲ菌株はほとんどのクラスの臨床的に関連する抗生物質に対する抵抗性を進化させているので、これらのＭＤＲ菌株に対する様々な処置選択肢が非常に限定的になりつつある。したがって、代替となる処置選択肢、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による受動免疫化が将来の大きな有望性を有する。

【0006】

過去数年間、ＭＤＲ大腸菌の十分に定義されたクローン系統であるＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４が出現しており、すべての腸管外大腸菌感染症のおよそ１０％、そして、ＭＤＲ大腸菌感染症の約半数を引き起こしている（Ｐｅｉｒａｎｏ他、Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ、２０１０（Ａｐｒ）、３５（４）：３１６〜２１；Ｒｏｇｅｒｓ他、Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２０１１（Ｊａｎ）、６６（１）：１〜１４；Ｗｏｏｄｆｏｒｄ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２０１１（Ｓｅｐ）、３５（５）：７３６〜５５）。この系統に属する菌株は、限定された不均一性を示し、したがって、抗原性レパートリーに関して非常に類似していると見なされ得るかもしれない。このクラスターに属する菌株の大多数がＯ２５ｂ抗原を発現しており、したがって、この抗原を合成する酵素をコードする（ＬＰＳ合成遺伝子座内の）具体的な遺伝子が、このクローンの特定のために使用されている（Ｃｌｅｒｍｏｎｔ他、Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２００８（Ｍａｙ）、６１（５）：１０２４〜８）。代替において、この系統のＯ抗原は、遺伝子の違いによって示唆されるように古典的なＯ２５抗原とは異なる（したがって、Ｏ２５ｂと呼ばれていた）にもかかわらず、Ｏ２５タイプ決定用血清による凝集が使用され得る。しかしながら、Ｏ２５タイプ決定用血清は、大抵の場合の非ＭＤＲ性Ｏ２５クローンと、ＭＤＲ性Ｏ２５ｂクローンとを区別することができない。

【0007】

Ｒｏｇｅｒｓ他（Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２０１１（Ｊａｎ）、６６（１）：１〜１４）は、大腸菌Ｏ２５ｂ−ＳＴ１３１菌株を３つの主要な特徴によって、すなわち、その血清群（Ｏ２５ｂ）、その系統学的群（Ｂ２）およびそのＳＴ（ＳＴ１３１）によって検出することを記載する。これらの特徴のそれぞれが、検出を助けるために開示される。様々な分子技術が記載される：すなわち、ＭＬＳＴ、ＰＣＲに基づく迅速検出法、反復配列ＰＣＲおよびＰＦＧＥ。様々な免疫グロブリンを含めて、（Ｏ２５ａ菌株に対して惹起される）様々なポリクローナル抗血清が、Ｏ２５抗原を決定するために使用されており、しかし、これらはサブタイプを識別していない。

【0008】

Ｊａｄｈａｖ他（ＰＬＯＳ ＯＮＥ、２０１１、６（３）：ｅ１８０６３）は、Ｂ２−Ｏ２５ｂ−ＳＴ１３１−ＣＴＸ−Ｍ−１５病原性／多耐性タイプに関連づけられるＯ２５ｂ亜群について陽性であった菌株の病原性特徴および遺伝的親和性を記載する。様々なヒト臨床単離体が分析され、様々な血清型に分類され、様々な病原性マーカープロフィルが得られた。Ｏ２５陽性菌株が、様々なＯ抗原（Ｏ１〜Ｏ１７３）に対するポリクローナル抗血清を使用する血清型決定によって特定された。Ｏ２５陽性菌株はさらに、ｒｆｂＯ２５ｂ亜群遺伝子の遺伝子座を標的とする対立遺伝子特異的ＰＣＲによる遺伝子型決定に供された。

【0009】

Ｍｏｒａ他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ、２０１１、３７（１）：１６〜２１）は、ＣＴＸ−Ｍ−１４を産生する大腸菌の臨床単離体の中のいくつかのクローン群（とりわけ、Ｏ２５ｂ：Ｈ４−Ｂ２−ＳＴ１３１）の出現を記載する。Ｏタイプ決定が、特異的なＯ抗血清（ポリクローナル）を用いて行われた。

【0010】

Ｃｌｅｒｍｏｎｔ他（Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２００８（Ｍａｙ）、６１（５）：１０２４〜８）は、Ｏ２５ｂ ＳＴ１３１大腸菌について特異的である対立遺伝子特異的なｐａｂＢ ＰＣＲアッセイを開示する。

【0011】

Ｓｚｉｊａｒｔｏ他（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２、３３２：１３１〜６）は、ＬＰＳ分子のコア構造に基づく大腸菌菌株単離体の分子的タイプ決定を記載する。単離体のコアタイプが、コアオペロンにおける遺伝子を標的として、かつ、Ｒ１〜Ｒ４のコアタイプおよびＫ−１２コアタイプに対してそれぞれ特異的であるプライマーを使用するＰＣＲによって決定された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

ＬＰＳ Ｏ２５ｂを有する菌株によって引き起こされる大腸菌感染症の防止または治療のために使用されるための改善された特異性を有する、大腸菌（特にＭＤＲ菌株）に対する抗体を提供することが、本発明の目的である。さらには、大腸菌細菌（例えば、ＭＤＲ菌株など）を迅速かつ確実な様式で診断することができる手段および方法を提供することが、本発明の目的である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記目的が本発明の主題によって解決される。

【0014】

本発明によれば、図１において列挙されるようなＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ３配列またはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を少なくとも含む、大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された抗体が提供される。

【0015】

本発明によれば、表１において列挙されるようなＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ３配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ３配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を少なくとも含む、大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された抗体が提供される。

【0016】

具体的には、上記大腸菌菌株はＭＤＲ菌株である。

【0017】

下記では、別途示される場合を除き、参照は、Ｋａｂａｔに従って番号表記されるようなＣＤＲ配列に対して、すなわち、Ｋａｂａｔ命名法に従って決定されるようなＣＤＲ配列に対してなされ（Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省公衆衛生局（１９９１年）を参照のこと）、具体的には、表１において列挙されるようなそれらのＣＤＲ配列（配列番号１〜９７）に対してなされる。本発明、および、請求項の範囲はまた、同じ抗体およびＣＤＲではあるが、異なる番号表記の示されたＣＤＲ領域を有するもの、例えば、表２において列挙されるようなもの（配列番号９８〜１８３および配列番号３９）（ただし、この場合、ＣＤＲ領域はＩＭＧＴシステムに従って定義される；Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ、Ｌｅｆｒａｎｃ他、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：２０９〜２１２）も包含することになることが十分に理解される。

【0018】

具体的には、上記抗体は、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｘｉｖ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号３４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉｉ）
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｘ）
ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘ）
ａ）配列番号５０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉ）
ａ）配列番号５０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｉ）
ａ）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｉｉ）
ａ）配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｖ）
ａ）配列番号６６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変化体を含む抗体
である。

【0019】

具体的には、機能的に活性な変化体は、少なくとも１つの点変異を元のＣＤＲ配列において含み、かつ、元のＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または、そのようなアミノ酸配列からなる機能的に活性なＣＤＲ変化体である。

【0020】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、
ａ）図２に示されるようなＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列のＶＨアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列；あるいは
ｃ）配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸の欠失および／またはＱ１Ｅ点変異（ただし、ＶＨ配列の最初のアミノ酸がＱである場合）をさらに含む抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列
を含む。

【0021】

例えば、親抗体のそのような機能的に活性な変化体は、Ｏ２５ｂ抗原のみと特異的に結合するＯ２５ｂ特異的抗体である。例示的な親抗体が図１において列挙されており（群１の抗体）、例えば、８Ａ１、３Ｅ９または２Ａ７である親抗体のヒト化変化体（例えば、図２において列挙される抗体など）である。具体的には、そのような変化体のＶＨ配列またはＨＣ配列は別の変化体のＶＨ配列およびＨＣ配列によってそれぞれ置換されてもよく、特にこの場合、他の変化体は、同じ親抗体のどのような他の抗体であってもよい。

【0022】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は場合により、表１において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。

【0023】

具体的には、上記抗体は、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｘｉｖ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉｉｉ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｘ）
ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘ）
ａ）配列番号５３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号５４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉ）
ａ）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号５４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｉ）
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｉｉ）
ａ）配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｖ）
ａ）配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体
である。

【0024】

具体的には、上記抗体は、図２に示されるようなＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２４８〜配列番号２９５のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは、配列番号２４８〜配列番号２９５のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。

【0025】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、例えば、同等な親和性、同等を超える親和性、類似する親和性または異なる親和性を伴って、Ｏ２５ａ抗原およびＯ２５ｂ抗原によって共有されるエピトープに対して交差特異的である。

【0026】

具体的には、本発明の抗体は、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原と結合するために交差特異的であり、かつ／または、大腸菌のＯ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合する。ただし、これには、Ｏ２５ａ菌株に対して惹起されるポリクローナルなタイプ決定用血清と比較して、好ましくは、免疫アッセイによって明らかにされるような、Ｏ２５（このＯ２５は現在、Ｏ２５ａとして知られており、本明細書中ではＯ２５ａとして示される）大腸菌菌株に対して惹起されるポリクローナル血清によってＯ２５ｂ抗原と結合することと比較してより大きい親和性が伴っており、この場合、好ましくは、抗体は、免疫アッセイ（好ましくは、免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法）によって明らかにされるように、両者に対する、すなわち、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原に対する少なくとも同等の親和性を有する。

【0027】

「交差特異的」として示される場合を除き、本発明の抗体は、Ｏ２５ｂ特異的であるとして、すなわち、Ｏ２５ｂ抗原のみを特異的に認識する抗体、例えば、表１の群１の抗体のいずれかであるとして、または、交差特異的抗体として、すなわち、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原の間において共有されるエピトープを特異的に認識する抗体、例えば、表１の群２の抗体のいずれかであるとしてそのどちらでも本明細書中では理解される。したがって、用語「本発明の抗体」は、Ｏ２５ｂ特異的抗体およびＯ２５ｂ／Ｏ２５ａ交差特異的抗体の両方を包含する。本発明の抗体は具体的にはさらに、どのような他の大腸菌抗原とも交差反応しないことにおいて特徴づけられ、かつ／または、本発明の抗体は、どのような他の大腸菌抗原に対してもより低い親和性で結合すること、この場合、例えば、（Ｏ２５ｂ抗原またはＯ２５ａ抗原とは異なる）他の大腸菌抗原よりもＯ２５ｂ抗原と優先的に結合するためのＫｄ差が対数で少なくとも２の差であり、好ましくは対数で少なくとも３の差である。

【0028】

具体的には、上記の交差特異的抗体は、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｖｉｉ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号８１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号８４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号９２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号９５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体
である。

【0029】

具体的には、上記抗体は、
ａ）図２に示されるようなＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列のＶＨアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列；あるいは
ｃ）配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸の欠失および／またはＱ１Ｅ点変異（ただし、ＶＨ配列の最初のアミノ酸がＱである場合）をさらに含む抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列
を含む。

【0030】

例えば、親抗体のそのような機能的に活性な変化体は交差特異的抗体である。例示的な親抗体が図１において列挙されており（群２の抗体）、例えば、４Ｄ５である親抗体のヒト化変化体（例えば、図２において列挙される抗体など）である。具体的には、そのような変化体のＶＨ配列またはＨＣ配列は別の変化体のＶＨ配列およびＨＣ配列によってそれぞれ置換されてもよく、特にこの場合、他の変化体は、同じ親抗体のどのような他の抗体であってもよい。

【0031】

具体的な局面によれば、本発明の交差特異的抗体は場合によりさらに、表１において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体（具体的には、どのような交差特異的抗体であれ、そのＣＤＲ配列が含まれる）のいずれかを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0032】

具体的には、上記の交差特異的抗体は、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｖｉ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号８７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体
である。

【0033】

具体的には、機能的に活性な変化体は、少なくとも１つの点変異を元のＣＤＲ配列において含み、かつ、元のＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または、そのようなアミノ酸配列からなる機能的に活性なＣＤＲ変化体である。

【0034】

具体的な局面によれば、本発明の交差特異的抗体は、図２に示されるようなＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２９６〜配列番号３１１のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは、配列番号２９６〜配列番号３１１のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。

【0035】

具体的な実施形態によれば、本発明の抗体は具体的には、
ａ）表１において列挙されるような抗体のいずれかのＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ６配列、または、
ｂ）図２に示されるような抗体のいずれかのＶＨ配列およびＶＬ配列、または、
ｃ）図２において列挙されるような抗体のいずれかのＨＣ配列およびＬＣ配列
を含み、あるいは
ｄ）ａ）〜ｃ）の配列によって特徴づけられる親抗体の機能的に活性な変化体であり、
好ましくは、
ｉ．前記機能的に活性な変化体は、前記親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変化体を含み、かつ／または
ｉｉ．前記機能的に活性な変化体は少なくとも１つの点変異を前記親抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列ならびに／あるいはＨＣ配列およびＬＣ配列のいずれかのフレームワーク領域において含み、場合により、Ｑ１Ｅ点変異（ＶＨフレームワーク領域（ＶＨ ＦＲ１）の最初のアミノ酸がＱである場合）を含み、
さらには
ｉｉｉ．前記機能的に活性な変化体は、前記親抗体と同じエピトープと結合するための特異性を有し、かつ／または
ｉｖ．前記機能的に活性な変化体は、前記親抗体のヒト変化体、ヒト化変化体、キメラ変化体またはマウス変化体および／または親和性成熟化変化体である。

【0036】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、当該抗体が依然として機能的に活性であるならば、表１において列挙されるようなＣＤＲ組合せを含む。

【0037】

具体的には、本発明の抗体は、表１において列挙されるような抗体のいずれかのＣＤＲ１〜ＣＤＲ６を含む。しかしながら、代替となる実施形態によれば、抗体は、異なるＣＤＲ組合せを含む場合があり、例えば、この場合、表１において列挙されるような抗体は、表１において列挙されるような抗体のいずれかの１つの抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列（例えば、１つのＣＤＲ配列、２つのＣＤＲ配列、３つのＣＤＲ配列、４つのＣＤＲ配列、５つのＣＤＲ配列または６つのＣＤＲ配列など）と、異なる抗体の少なくとも１つのさらなるＣＤＲ配列とを含む。具体的な一例によれば、抗体は、１つのＣＤＲ配列、２つのＣＤＲ配列、３つのＣＤＲ配列、４つのＣＤＲ配列、５つのＣＤＲ配列または６つのＣＤＲ配列を含み、ただし、これらのＣＤＲ配列は、２つ以上の抗体（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの異なる抗体）のＣＤＲ組合せである。例えば、これらのＣＤＲ配列は、表１において列挙されるような抗体のいずれかのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のうちの１つ、２つ、または３つすべてと、表１において列挙される同じ抗体またはいずれか他の抗体のＣＤＲ４〜ＣＤＲ６のうちの１つ、２つ、または３つすべてとを好ましくは含むために組み合わされる場合がある。

【0038】

ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と番号がつけられるＣＤＲはＶＨドメインの結合領域を表し、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６はＶＬドメインの結合領域を表すことが、本明細書中では特に理解される。

【0039】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、図２に示されるようなＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列の組合せのいずれかを含み、または、ＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列のそのような組合せによって形成される結合部位を含む。代替において、抗体が依然として機能的に活性であるならば、２つの異なる抗体の免疫グロブリン鎖の組合せが使用される場合がある。例えば、１つの抗体のＨＣ配列が別の抗体のＬＣ配列と組み合わされる場合がある。さらなる具体的な実施形態によれば、図２において提供されるようなフレームワーク領域のいずれもが、本明細書中に記載されるようなＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ組合せのいずれかに対するフレームワークとして用いられる場合がある。

【0040】

本発明の抗体は必要に応じて、図２のそのようなアミノ酸配列をそれぞれのシグナル配列を伴って、または伴うことなく、あるいは、代替となるシグナル配列またはリーダー配列を伴って含むことが理解される。

【0041】

具体的な局面によれば、図２の配列のそれぞれが定常領域において末端で伸張または欠失される場合がある（例えば、Ｃ末端アミノ酸の１つまたは複数の欠失）。

【0042】

具体的には、Ｃ末端のリシン残基を含む図２のＨＣ配列のそれぞれが好ましくは、そのようなＣ末端リシン残基の欠失とともに用いられる。

【0043】

図２は種々のＨＣ配列および種々のＬＣ配列を示し、どのようなＨＣ／ＬＣ組合せをも裏づけており、したがって、親抗体のそれぞれについての一連の異なるＨＣ／ＬＣ組合せを裏づけている。したがって、それぞれの親抗体の具体的な変化体は、どのようなＨＣ／ＬＣ組合せであっても、同じ親抗体から派生する図２に示される変化体抗体のそれぞれのＨＣ／ＬＣ組合せを含む場合がある。

【0044】

具体的には、図２は、Ｏ２５ｂ抗原のみを特異的に認識する群１の抗体の親抗体（８Ａ１、３Ｅ９（１Ｇ８）または２Ａ７）のそれぞれの変化体、ならびに、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原と交差特異的に結合する群２の抗体の親抗体４Ｄ５の変化体である４つの異なるＨＣ配列および４つの異なるＬＣ配列を示す。１６の異なるＨＣ／ＬＣ組合せがこれらの親抗体のそれぞれについて示される。

【0045】

加えて、図２は、Ｏ２５ｂ抗原のみを特異的に認識する群１の抗体の親抗体３Ｅ９（１Ｇ８）の変化体である２つのさらなる異なるＨＣ配列および２つのさらなる異なるＬＣ配列を示す。

【0046】

加えて、図２は、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原と交差特異的に結合する群２の抗体の親抗体４Ｄ５の変化体である２つのさらなる異なるＨＣ配列および２つのさらなる異なるＬＣ配列を示す。

【0047】

ＣＤＲ配列は、図１において列挙されるようなそれぞれのＣＤＲ配列と同一である：親の８Ａ１抗体、１Ｇ８抗体、２Ａ７抗体または４Ｄ５抗体のＣＤＲ配列は、図１の８Ａ１−１Ｇ８抗体、３Ｅ９−Ｇ１１抗体、２Ａ７−Ｆ１抗体および４Ｄ５−Ｄ４抗体のＣＤＲ配列とそれぞれ同一である。

【0048】

具体的には、配列番号１８４〜配列番号２４７および配列番号３１２〜配列番号３１５は、図２に示されるＶＨアミノ酸配列を含むＨＣ配列を示し、ただし、この場合、それぞれのＨＣ配列がおそらくはシグナル配列によってＮ端側で伸張している。特異的抗体は、そのようなＶＨアミノ酸配列またはＨＣアミノ酸配列をそれぞれのシグナル配列を伴って、または伴うことなく、あるいは、代替となるシグナル配列またはリーダー配列を伴って含むことが理解される。

【0049】

具体的には、配列番号２４８〜配列番号３１１および配列番号３１６〜配列番号３１９は、図２に示されるＶＬアミノ酸配列を含むＬＣ配列を示し、ただし、この場合、それぞれのＬＣ配列がおそらくはシグナル配列によってＮ端側で伸張している。特異的抗体は、そのようなＶＬアミノ酸配列またはＬＣアミノ酸配列をそれぞれのシグナル配列を伴って、または伴うことなく、あるいは、代替となるシグナル配列またはリーダー配列を伴って含むことが理解される。

【0050】

本発明はさらに、本発明の抗体のいずれかである親抗体（例えば、表１において列挙されるような抗体）の機能的に活性な抗体変化体、または、図２に示されるようなＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列の組合せのいずれかを含む機能的に活性な抗体変化体、または、ＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列のそのような組合せによって形成される結合部位を含む機能的に活性な抗体変化体を製造する方法であって、少なくとも１つの点変異をフレームワーク領域（ＦＲ）または定常ドメインあるいは相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）のいずれかにおいて設計して、変化体抗体を得ること、および、前記変化体抗体の機能的活性を明らかにすること、具体的にはＯ２５ｂ抗原と１０^−６Ｍ未満のＫｄにより結合するための親和性によって、好ましくは１０^−７Ｍ未満のＫｄまたは１０^−８Ｍ未満のＫｄまたは１０^−９Ｍ未満のＫｄ、それどころか、１０^−１０Ｍ未満のＫｄまたは１０^−１１Ｍ未満のＫｄにより結合するための親和性によって、例えば、ピコモル濃度範囲での親和性により結合するための親和性によって明らかにすることを含む方法を提供する。機能的活性が明らかにされると、機能的に活性な変化体は、さらなる使用のために、また、場合により、組換え製造方法による製造のために選択される。

【0051】

好ましいＣＤＲ変化体は、グリコシル化または脱アミド化を受けやすいモチーフの変異を含む。例えば、ＣＤＲ配列のいずれかにおけるＮ結合型グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔ（ただし、Ｘは任意のアミノ酸である）において、このモチーフにおける「Ｎ」は、グリコシル化のための潜在的可能性を除くために、どのようなアミノ酸であれ、他の異なるアミノ酸に変異させられる場合があり、好ましくは、「Ｑ」、「Ｓ」または「Ｄ」に変異させられる場合がある。さらなる例では、ＣＤＲ配列のいずれにおいても、アスパラギンまたはアスパラギン酸の脱アミド化を受けやすいかもしれないアミノ酸モチーフのＮＧまたはＮＮが示される。他のモチーフに含まれるアスパラギンは脱アミド化をそれほど受けやすくない。

【0052】

例えば、４Ｄ５のＶＬ ＣＤＲ１（ＣＤＲ４）に見出されるアミノ酸モチーフＳＮＧは、アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミド化を受けやすい可能性がある。したがって、ｍＡｂ ４Ｄ５のＶＬ ＣＤＲ１でのＳＮＧモチーフにおける「Ｎ」の「磨きをかける」変異が、潜在的な脱アミド化部位を除くために、どのようなアミノ酸であれ、他の異なるアミノ酸に変異させられる場合があり、好ましくは、「Ｑ」、「Ｓ」または「Ｄ」に変異させられる場合がある。

【0053】

具体的な局面によれば、変化体抗体は、親抗体と同じエピトープと結合する。

【0054】

さらなる具体的な局面によれば、変化体抗体は、親抗体と同じ結合部位を含む。

【0055】

機能的に活性な変化体抗体はＶＨ配列またはＶＬ配列のいずれかにおいて異なる場合があり、あるいは、共通のＶＨ配列およびＶＬ配列を共有する場合があり、また、修飾をそれぞれのＦＲにおいて含む場合がある。変異誘発によって親抗体に由来する変化体抗体が、この技術分野では広く知られている方法によって製造される場合がある。

【0056】

例示的な親抗体が、下記の実施例の節において、また、図１（表１）および図２に記載される。具体的には、抗体は、表１において列挙されるような親抗体の機能的に活性な誘導体である。１つまたは複数の改変されたＣＤＲ配列を有する、かつ／または、１つまたは複数の改変されたＦＲ配列（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４の配列など）、あるいは改変された定常ドメイン配列を有する変化体が設計される場合がある。

【0057】

例えば、表１において列挙される親抗体に由来し、かつ、変異誘発によって、具体的には親和性成熟および／またはヒト化によって得られている機能的に活性な変化体抗体が本発明に従って提供され、図２において列挙される。図２の変化体抗体は依然として、それぞれの親抗体の共通したＶＨ配列およびＶＬ配列を共有するにもかかわらず、機能的に活性である変化したＶＨ鎖およびＶＬ鎖がまた、例えば、それぞれのＦＲ配列またはＣＤＲ配列における改変を有する変化したＶＨ鎖およびＶＬ鎖が製造され得ることは実現可能である。

【0058】

親抗体の例示的な変化体抗体はＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかにおける少なくとも１つの点変異および／またはＦＲ領域における少なくとも１つの点変異を含み、好ましくは、この場合、抗体は、親抗体と同じエピトープと結合するための特異性を有する。

【0059】

ある特定の局面において、本発明は、重鎖および軽鎖を含み、軽鎖可変領域またはＶＬ可変領域またはそれぞれのＣＤＲのいずれもが、少なくとも１つのＦＲ配列またはＣＤＲ配列の改変によって、８Ｄ５−１Ｇ１０または４Ｄ５−Ｄ４と称される抗体あるいは表１または図２において列挙されるようないずれかの他の抗体である親抗体に由来するようなアミノ酸配列を含むそのような機能的に活性な変化体抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体を提供する。

【0060】

４Ｄ５−Ｄ４と称され、かつ、表１において列挙される抗体は、抗体８Ｄ１０−Ｃ８（これは、下記で示されるような寄託物によって特徴づけられる）と同じＣＤＲ配列を含むことが判明した。しかしながら、同じＶＨ／ＶＬ配列でさえ、定常ドメインまたは定常領域において異なり、すなわち、少なくとも１つの改変を定常ドメインのいずれかにおいて含む。

【0061】

具体的な実施形態によれば、本発明の抗体は、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体を除くどのような他の抗体でもある。そのような抗体は具体的には、可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）の１つまたは２つのみから構成されることが理解され、また、さらには本明細書中に記載されるような寄託されたＶＨ／ＶＬ物によって定義される。しかしながら、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体の具体的な変化体が本願請求項の主題に特に含まれ、それらには、様々なタイプの全長抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどを含めて、ＣＤＲ変化体、ＦＲ変化体、マウス変化体、キメラ変化体、ヒト化変化体またはヒト変化体、あるいは、どのような抗体ドメイン組合せであれ、ＶＨ／ＶＬ組合せの１つまたは２つから構成される組合せではない抗体ドメイン組合せが含まれるが、それらに限定されない。

【0062】

具体的な実施形態では、図１に示され、さらには図２において指定されるそれぞれの抗体のＣＤＲ配列および可変ドメインによって特徴づけられる４Ｄ５−Ｄ４（４Ｄ５）抗体または８Ａ１−１Ｇ８（８Ａ１）抗体が示され、この場合、そのような抗体は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、例えば、全長抗体であり、また、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。

【0063】

しかしながら、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体は、その機能的に活性な変化体を設計するための親抗体として使用される場合がある。具体的には、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体、あるいは、どのようなその機能的に活性な変化体もが、本明細書中に提供されるような配列を用いて組換え手段によって、必要な場合には、さらなる免疫グロブリン配列を、例えば、ＩｇＧ抗体を製造するために用いて製造される場合がある。具体的には、８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称されるそのような抗体の機能的に活性な変化体が、少なくとも１つのＦＲ配列またはＣＤＲ配列の改変によって製造される場合がある。

【0064】

具体的な局面によれば、本発明は、多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体のなかで、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の抗原結合部位を含む、あるいは、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０に由来する、または、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０の機能的に活性な変化体である単離されたモノクローナル抗体を提供し、ただし、好ましくは、この場合、抗体８Ｄ５−１Ｇ１０は、
ａ）ＤＳＭ２６７６３で寄託される宿主細胞によって産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ２６７６２で寄託される宿主細胞によって産生される抗体重鎖の可変領域；
ｃ）あるいは、（ａ）および／または（ｂ）の機能的に活性な変化体が用いられること
によって特徴づけられる。

【0065】

具体的には、８Ｄ５−１Ｇ１０と称される抗体は、ＤＳＭ２６７６３で寄託される大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされる可変領域を含む抗体軽鎖と、ＤＳＭ２６７６２で寄託される大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされる可変領域を含む抗体重鎖とから構成される。

【0066】

別の具体的な局面によれば、本発明は、Ｏ２５ａ抗原およびＯ２５ｂ抗原によって共有されるエピトープと結合するために交差特異的であり、かつ、抗体８Ｄ１０−Ｃ８の抗原結合部位を含む、あるいは、抗体８Ｄ１０−Ｃ８に由来する、または、抗体８Ｄ１０−Ｃ８の機能的に活性な変化体である単離されたモノクローナル抗体を提供し、ただし、好ましくは、この場合、抗体８Ｄ１０−Ｃ８は、
ａ）ＤＳＭ２８１７１で寄託される宿主細胞によって産生される抗体軽鎖の可変領域；および／または
ｂ）ＤＳＭ２８１７２で寄託される宿主細胞によって産生される抗体重鎖の可変領域；
ｃ）あるいは、（ａ）および／または（ｂ）の機能的に活性な変化体が用いられること
によって特徴づけられる。

【0067】

具体的には、８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体は、ＤＳＭ２８１７１で寄託される大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされる可変領域を含む抗体軽鎖と、ＤＳＭ２８１７２で寄託される大腸菌宿主細胞に含まれるプラスミドのコード配列によってコードされる可変領域を含む抗体重鎖とから構成される。

【0068】

具体的には、抗体は、表１において列挙されるようなＣＤＲ配列のいずれかの機能的に活性なＣＤＲ変化体を含み、ただし、この場合、機能的に活性なＣＤＲ変化体は、
ａ）元のＣＤＲ配列における１つ、２つまたは３つの点変異；ならびに／あるいは
ｂ）元のＣＤＲ配列の４つのＣ末端アミノ酸位置もしくは４つのＮ末端アミノ酸位置または４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１つまたは２つの点変異；ならびに／あるいは
ｃ）元のＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性
のうちの少なくとも１つを含む。

【0069】

具体的には、機能的に活性な変化体抗体は本発明の機能的に活性なＣＤＲ変化体の少なくとも１つを含む。具体的には、機能的に活性なＣＤＲ変化体の１つまたは複数を含む機能的に活性な変化体抗体は、親抗体と同じエピトープと結合するための特異性を有する。

【0070】

具体的には、機能的に活性な変化体はＣＤＲ変化体であり、例えば、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ（より具体的にはＣＤＲループ配列）を含むＣＤＲ変化体である。

【0071】

具体的な局面によれば、上記少なくとも１つの点変異は、１つまたは複数のアミノ酸のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入のいずれかである。

【0072】

具体的には、機能的に活性な変化体は、アミノ酸配列における、好ましくはＣＤＲにおける少なくとも１つの点変異において親抗体とは異なり、ただし、この場合、ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれにおける点変異の数は、０、１、２または３のいずれかである。

【0073】

具体的には、抗体は、それぞれのＣＤＲ配列またはＣＤＲ変異体（機能的に活性なＣＤＲ変化体、例えば、１つ、２つまたは３つの点変異を１つのＣＤＲループの中に、例えば、５アミノ酸〜１８アミノ酸のＣＤＲ長さの中に、例えば、５アミノ酸〜１５アミノ酸または５アミノ酸〜１０アミノ酸のＣＤＲ領域の中に有する機能的に活性なＣＤＲ変化体を含む）を用いて、そのような抗体に由来する。代替において、機能的に活性なＣＤＲ変化体を含む抗体を提供するために、１つ〜２つの点変異が１つのＣＤＲループの中に、例えば、５アミノ酸未満のＣＤＲ長さの中に存在する場合がある。具体的なＣＤＲ配列は短いかもしれず、例えば、ＣＤＲ２配列またはＣＤＲ５配列であるかもしれない。具体的な実施形態によれば、機能的に活性なＣＤＲ変化体は、１つまたは２つの点変異を、４個未満または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列において含む。

【0074】

具体的な局面によれば、本発明の抗体はＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を含み、ただし、この場合、ＣＤＲ配列およびフレームワーク配列の少なくとも１つが、ヒト配列、ヒト化配列、キメラ配列、マウス配列または親和性成熟化配列を含み、好ましくは、フレームワーク配列はＩｇＧ抗体のものであり、例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのものであり、あるいは、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体またはＩｇＭ抗体のものである。

【0075】

具体的な抗体が、例えば、親抗体の製造性または耐容性を改善するために、例えば、親抗体と比較して、低い免疫原能を有する改善された（変異させられた）抗体（例えば、変異をＣＤＲ配列および／またはフレームワーク配列のいずれかに有するヒト化抗体など）を提供するために、フレームワーク変異抗体として提供される。

【0076】

さらなる具体的な抗体が、例えば、抗体の親和性を改善するために、および／または、親抗体によって標的化されるエピトープに近い同じエピトープ（１つまたは複数）を標的化するために（エピトープシフトするために）、ＣＤＲ変異抗体として提供される。

【0077】

したがって、表１または図２において列挙されるような抗体のどれもが、改良型を設計するための親抗体として使用される場合がある。

【0078】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、Ｏ２５ｂ抗原と１０^−６Ｍ未満のＫｄにより、好ましくは１０^−７Ｍ未満または１０^−８Ｍ未満のＫｄにより結合するための親和性を有する。親和性成熟を受けた変化体は典型的には、Ｏ２５ｂ抗原と１０^−８Ｍ未満のＫｄにより結合するための親和性を有する。

【0079】

具体的には、本発明の抗体は大腸菌のＯ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合し、または、少なくとも両方の抗原に対する同等の親和性により結合する。

【0080】

具体的な実施形態によれば、抗体は、Ｏ２５ｂ抗原と結合することについてはＯ２５ａ抗原と比較して少なくとも２倍大きい親和性を有しており、具体的には、Ｏ２５ｂ抗原またはＯ２５ａ抗原のいずれかと結合することにおける、例えば、親和性および／またはアビディティーでの差における少なくとも２倍の差、あるいは、少なくとも３倍の差、少なくとも４倍の差、少なくとも５倍の差、または、それどころか少なくとも１０倍の差を有する。

【0081】

具体的な局面によれば、Ｏ２５ｂに対する特異的な結合が、Ｏ２５ｂ抗原と結合することについては免疫アッセイ（好ましくは、免疫ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的方法）によって明らかにされるように、Ｏ２５またはＯ２５ａの大腸菌菌株に対して惹起されるポリクローナル血清によってＯ２５ｂ抗原と結合することと比較してより大きい親和性によって特徴づけられる。このより大きい結合親和性は具体的には、少なくとも２倍の差、あるいは、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または、それどころか少なくとも１０倍の差を伴うものである。

【0082】

具体的には、本発明の抗体によって標的化されるようなＯ２５ｂ抗原は、ＳＴ１３１菌株の１つまたは複数において、より具体的にはＳＴ１３１菌株の大多数において広く認められている。

【0083】

具体的には、抗体によって認識されるエピトープが、被包性および非被包性のＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株（例えば、変異菌株）の表面に存在する。

【0084】

さらなる具体的な局面によれば、抗体は、インビトロ殺菌能を、野生型ＭＤＲ大腸菌の生菌株を含む血清サンプルにおいて示す。

【0085】

さらなる具体的な局面によれば、抗体は、食作用細胞による野生型ＭＤＲ大腸菌の生菌株の取り込みをインビトロにおいて刺激する。

【0086】

さらなる具体的な局面によれば、抗体は、特異的なＬＰＳ分子の内毒素影響をインビトロにおいて中和する。

【0087】

具体的には、抗体は、全長モノクローナル抗体、抗原結合部位を取り込む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、または、抗原結合部位を取り込む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質である。好ましくは、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆｄ抗体、ｓｃＦｖ抗体、および、ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬのような単一ドメイン抗体からなる群から選択され、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。

【0088】

さらなる具体的な局面によれば、抗体は、全長モノクローナル抗体の結合部位、または、結合部位を取り込む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメントの結合部位を有しており、この場合、そのような抗体は好ましくは、マウス抗体、ラマ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウシ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆｄ抗体、ｓｃＦｖ抗体、および、ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬのような単一ドメイン抗体からなる群から選択される抗体であり、好ましくはヒトＩｇＧ抗体またはマウスＩｇＧ抗体である。

【0089】

本発明によれば、本発明の抗体は具体的には、医療、診断または分析での使用のために提供される。

【0090】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、大腸菌感染症（具体的にはＭＤＲ大腸菌菌株による感染症）の危険性がある対象、または、大腸菌感染症（具体的にはＭＤＲ大腸菌菌株による感染症）に罹患している対象を処置することにおける使用のために提供され、ただし、この場合、そのような使用は、対象における感染症を制限するために、または、前記感染症から生じる疾患状態を改善するために、好ましくは、腎盂腎炎、二次的菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎および人工呼吸器関連肺炎の処置または予防のために、効果的な量の抗体を対象に投与することを含む。

【0091】

したがって、本発明は具体的には、大腸菌感染症の危険性がある対象、または、大腸菌感染症に罹患している対象が、効果的な量の抗体を対象に投与することによって処置される処置方法を提供する。

【0092】

具体的には、抗体が、ＭＤＲ大腸菌（好ましくはＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株）の殺菌的死滅を、当該菌株によって発現される莢膜多糖に関係なく行うために提供される。

【0093】

具体的な局面によれば、本発明の抗体を使用する免疫療法は、例えば、様々な動物モデルにおいて明らかにされるように、生細菌攻撃からの効果的な保護をもたらす場合がある。

【0094】

抗体により、具体的には、致死的な内毒素血症が中和される場合がある。そのような機能的活性が、適切なインビボモデル（精製ＬＰＳによる免疫原投与）において明らかにされる場合がある。

【0095】

抗体は具体的には、例えば、インビトロでの血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって明らかにされるように、例えば、（抗体が加えられないか、または、無関係なコントロールｍＡｂが加えられる）コントロールサンプルよりも少なくとも２０％大きい細菌殺傷を伴って、補体媒介殺傷によってＭＤＲ大腸菌に対して効果的である。

【0096】

抗体は具体的には、例えば、インビトロでのオプソニン作用殺傷アッセイ（ＯＰＫ）によって明らかにされるように、例えば、（抗体が加えられないか、または、無関係なコントロールｍＡｂが加えられる）コントロールサンプルよりも少なくとも２０％大きい投入細菌の取り込みまたは２０％小さい最終のＣＦＵカウント数を伴って、抗体媒食作用によってＭＤＲ大腸菌に対して効果的である。

【0097】

抗体は具体的には、例えば、インビトロでのＬＡＬアッセイまたはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）レポーターアッセイによって明らかにされるように、例えば、（抗体が加えられないか、または、無関係なコントロールｍＡｂが加えられる）コントロールサンプルとの比較でのエンドトキシン活性における少なくとも２０％の低下を伴って、エンドトキシン機能を中和することによってＭＤＲ大腸菌に対して効果的である。

【0098】

本発明はさらに、本発明の抗体を含み、好ましくは非経口用配合物または粘膜用配合物を含み、場合により医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する医薬調製物を提供する。

【0099】

そのような医薬組成物は抗体を唯一の活性物質として、あるいは、他の活性物質との組合せで、または、活性物質のカクテル、例えば、少なくとも２つもしくは３つの異なる抗体の組合せもしくはカクテルなどとの組み合わせで含有する場合がある。

【0100】

具体的な局面によれば、本発明の抗体は、大腸菌菌株によって引き起こされる対象における大腸菌感染症または大腸菌菌血症を、具体的には、ＬＰＳ Ｏ２５ｂを発現するＭＤＲ菌株によって引き起こされる感染症を、例えば、上部尿路感染症および下部尿路感染症（膀胱炎または尿道炎、上行性または血行性の腎盂腎炎を含む）などをとりわけ糖尿病患者において、同様にまた、菌血症、敗血症、腹膜炎または腸管コロニー形成とともに明らかにするための診断使用のために提供される。

【0101】

具体的には、抗体が、対象におけるＭＤＲ大腸菌による全身的感染症が、前記対象の体液のサンプルを抗体と接触させることによってエクスビボで明らかにされる本発明による使用のために提供され、ただし、この場合、抗体の特異的な免疫反応により、感染症が明らかにされる。

【0102】

具体的には、体液のサンプルが、特異的な免疫反応について試験され、ただし、そのようなサンプルは、尿、血液、血液単離物または血液培養物、吸引物、痰、挿管された対象の洗浄液、および便からなる群から選択される。

【0103】

具体的には、本発明による診断使用は、大腸菌の血清型を臨床検体から回収される純粋な大腸菌培養物からインビトロにおいて決定することを示す。

【0104】

さらなる局面によれば、本発明は、本発明の抗体の診断用調製物であって、標識を伴う抗体および／または標識を伴うさらなる診断試薬（例えば、抗体、または、それぞれの標的抗原との抗体の免疫複合体を特異的に認識する試薬など）、ならびに／あるいは、抗体および診断試薬の少なくとも１つを固定化するための固相を必要に応じて含有する診断用調製物を提供する。

【0105】

本発明はさらに、本発明の抗体を含む診断用調製物であって、前記抗体およびさらなる診断試薬を組成物または部分品のキットにおいて含み、下記の成分：
ａ）前記抗体；および
ｂ）前記さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに、必要な場合には、前記抗体および前記診断試薬の少なくとも１つを固定化するための固相
を含む診断用調製物を提供する。

【0106】

本発明はさらに、大腸菌菌株によって引き起こされる対象における大腸菌感染症または大腸菌菌血症を診断する方法であって、
ａ）本発明の抗体を提供すること、および
ｂ）抗体がＯ２５ｂ抗原と特異的に免疫反応するかを、例えば、Ｏ２５ｂ抗原のみとの免疫反応によって、または、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂと反応するための交差反応性免疫反応によって、試験される対象の生物学的サンプル（例えば、血液または血清）において、好ましくは凝集試験によって検出し、それにより、ＭＤＲ大腸菌の感染症または菌血症を診断すること
を含む方法を提供する。

【0107】

対象の好適な生物学的サンプルが具体的には、血液、血清、血液単離物または血液培養物、尿、吸引物、痰、挿管された対象の洗浄液、および便からなる群から選択される場合がある。

【0108】

本発明の好ましい診断アッセイは、例えば、Ｏ２５ｂ抗原を発現する細菌の抗体による凝集、または、試験されるサンプルから得られる遊離状態の（または単離された）Ｏ２５ｂ抗原による凝集を試験するために固相（例えば、ラテックスビーズ、金粒子など）に固定化された本発明の抗体を含む。

【0109】

いくつかの診断アッセイでは、Ｏ２５ｂおよび／またはＯ２５ａと結合するための異なる特異性および／または親和性を有し、したがって、Ｏ２５ｂ抗原とＯ２５ａ抗原とを識別するかもしれない２つの異なる抗体が伴う場合がある。

【0110】

具体的な局面によれば、本発明は、大腸菌（具体的にはＭＤＲ大腸菌）による対象の感染症を本発明の診断剤または本発明の診断方法によって明らかにして、そのような感染症に対する治療剤による処置、例えば、免疫療法（例えば、本発明の抗体により処置することなど）を用いる処置の基礎を提供するためのコンパニオン診断剤を提供する。

【0111】

具体的な局面によれば、本発明は、遊離状態のＬＰＳを、例えば、生細菌の量が限定される臨床検体から明らかにすることによって、ＭＤＲ大腸菌（具体的にはＭＤＲ大腸菌）による対象の感染症を診断するための高感度なベッドサイド診断剤を提供する。そのようなアッセイの感度は具体的には、１００ｎｇ未満のＬＰＳであり、好ましくは１０ｎｇ未満のＬＰＳである。

【0112】

本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0113】

本発明はさらに、
ａ）本発明の抗体のＶＨおよび／またはＶＬ；あるいは
ｂ）あるいは本発明の抗体のＨＣおよび／またはＬＣ
を発現させるためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミドを提供する。

【0114】

本発明はさらに、本発明の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。

【0115】

具体的には、ＤＳＭ２６７６３またはＤＳＭ２６７６２で寄託されるプラスミドおよび宿主細胞は除外される。そのような寄託物は、プラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞であり、この場合、ＤＳＭ２６７６３で寄託された宿主細胞は、８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣと称される抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドにより形質転換され、一方、ＤＳＭ２６７６２で寄託された宿主細胞は、８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣと称される抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドにより形質転換される。

【0116】

具体的には、さらに除外されるものが、ＤＳＭ２８１７１またはＤＳＭ２８１７２で寄託されるプラスミドおよび宿主細胞である。そのような寄託物は、プラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞であり、この場合、ＤＳＭ２８１７１で寄託された宿主細胞は、８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣと称される抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドにより形質転換され、一方、ＤＳＭ２８１７２で寄託された宿主細胞は、８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣと称される抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドにより形質転換される。

【0117】

本発明はさらに、発明の抗体を製造する方法であって、本発明の宿主細胞が、前記抗体を産生させるための条件のもとで培養または維持される方法を提供する。

【0118】

さらなる局面によれば、本発明は、本発明の抗体を製造する方法であって、
ａ）ヒト以外の動物を大腸菌のＯ２５ｂ抗原により免疫化し、抗体を産生するＢ細胞を単離すること；
ｂ）不死化された細胞株を単離されたＢ細胞から形成すること；
ｃ）細胞株をスクリーニングして、Ｏ２５ｂ抗原および場合によりＯ２５ａ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を特定すること（例えば、Ｏ２５ａと比較して、Ｏ２５ｂに対する優先的な結合が明らかにされる）；および
ｄ）前記モノクローナル抗体または該抗体のヒト化形態もしくはヒト形態、あるいは、前記モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を有するそれらの誘導体を製造すること
を含む方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】Ｋａｂａｔシステムに従って特定されるＯ２５ｂ特異的抗体（群１の抗体、これらはＯ２５ｂのみに結合する）のＣＤＲ領域およびＯ２５ｂ／Ｏ２５ａ交差特異的抗体（群２の抗体）のＣＤＲ領域のＣＤＲ配列を含む表１、ならびに、ＣＤＲ領域をＩＭＧＴシステムに従って示す同じ抗体を列挙する表２。表１および表２において使用されるような命名法は下記の意味を有するものとする：ＶＨ ＣＤＲ１＝ＣＤＲ１ＶＨ ＣＤＲ２＝ＣＤＲ２ＶＨ ＣＤＲ３＝ＣＤＲ３ＶＬ ＣＤＲ１＝ＣＤＲ４ＶＬ ＣＤＲ２＝ＣＤＲ５ＶＬ ＣＤＲ３＝ＣＤＲ６

【図2】群１（図１）のＯ２５ｂ特異的抗体のヒト化変化体、すなわち、親抗体である８Ａ１、３Ｅ９および２Ａ７のヒト化変化体のＨＣ配列情報およびＬＣ配列情報、この場合、親抗体８Ａ１の変化体には１〜１６の番号がつけられ、親抗体３Ｅ９の変化体には１〜１８の番号がつけられ、親抗体２Ａ７の変化体には１〜１６の番号がつけられる；群２（図１）のＯ２５ｂ／Ｏ２５ａ交差特異的抗体（これは親抗体４Ｄ５である）のヒト化変化体のＨＣ配列情報およびＬＣ配列情報、この場合、変化体には１〜１８の番号がつけられる。

【図3】図３ｉ）：免疫ブロットアッセイにおける精製Ｏ２５ａ、精製Ｏ２５ｂおよび精製Ｏ５５のＬＰＳ分子に対する種々のＯ２５ｂ特異的ｍＡｂ（Ｏ２５ａ抗原に対する交差反応性の有無にかかわりなく）の反応性、同様にまた、コントロールとしてのＬＰＳコア特異的な（すなわち、すべての大腸菌ＬＰＳ分子に対して交差反応性の）ｍＡｂのＷＮ１の反応性。 図３ｉｉ）：様々なＯ２５特異的ｍＡｂによる免疫ブロット。Ｏ２５ａタイプ、Ｏ２５ｂタイプおよびＯ５５タイプの分離された精製ＬＰＳをキメラ型またはヒト化型のＯ２５ｂ特異的ｍＡｂと、また、コントロールとしてのＬＰＳコア特異的（すなわち、交差反応性）ＷＮ−１マウスｍＡｂと反応させた。

【図4】図４ｉ）：ストレプトアビジンチップに結合させたビオチン化Ｏ２５ｂ ＰＳ抗原を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏによってアッセイされるような種々のＯ２５ｂ ｍＡｂの親和性測定。 図４ｉｉ）：バイオレイヤー・インフェロメトリー（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｆｅｒｏｍｅｔｒｙ；ＢＬＩ）測定。親和性、会合定数および解離定数として表される、Ｏ２５ｂ多糖に対するＯ２５ｂ ｍＡｂの結合をＦｏｒｔｅＢｉｏにおいて測定した。

【図5】図５ｉ）：様々なＯ２５ｂ特異的ｍＡｂ（Ｏ２５ａ抗原に対する交差反応性の有無にかかわりなく）による、Ｏ２５ｂ抗原、Ｏ２５ａ抗原またはＯ２抗原を発現する種々の大腸菌菌株の表面染色。 図５ｉｉ）：ＬＢ（Ａ）またはヒト血清（Ｂ）のどちらかで成長させたＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ菌株３Ｏを、０．０２５μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの濃度範囲での様々なＯ２５ｂ特異的ｍＡｂにより染色した。加えて、種々のパルソタイプ（ｐｕｌｓｏｔｙｐｅ）に属する一連のＳＴ１３１菌株を４０μｇ／ｍｌの濃度での３つのＯ２５ｂ特異的ｍＡｂによる表面染色について試験した（Ｃ）。

【図6】細菌攻撃からの保護。Ｏ２５ｂ反応性の（ｉ）キメラｍＡｂまたは（ｉｉ）ヒト化ｍＡｂ、同様にまた、アイソタイプ一致のコントロールｍＡｂの予防的な保護効力を、菌血症のマウスモデルにおいて試験した。１００μｇのｍＡｂを、静脈内投与されるＳＴ１３１菌株８１００９による致死的攻撃の２４時間前にｉ．ｐ．注入した。致死率を毎日モニターした。

【図7】図７ｉ）：血清殺菌アッセイ。様々なＯ２５ｂ特異的ｍＡｂによって媒介される補体依存的な細菌殺傷を、初期細菌数に対する、３時間のインキュベーション期間の後におけるＣＦＵの減少として評価した。 図７ｉｉ）：血清殺菌アッセイ。２つの異なるＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ菌株を中期対数期にまでＬＢにおいて成長させた（パネルＡ、ＢおよびＤ）。洗浄後、細菌を２．５μｇ／ｍｌのヒト化ｍＡｂ（ＡおよびＢ）またはキメラｍＡｂ（Ｄ）と３時間インキュベーションした。代替では、菌株８１００９をヒト血清において生育させ、１０ｕｇ／ｍｌの様々なｍＡｂと５時間インキュベーションした（パネルＣ）。生存細菌の数を平板培養によって求めた。殺菌活性が、コントロール（抗体非存在）のインキュベーションに対するパーセント殺傷として表される。

【図8】内毒素血症モデルにおける保護。５匹のマウスからなる群を１００μｇ（パネルＡおよびＢ）または２５μｇ（パネルＣ）の様々なｍＡｂによるｉ．ｐ．受動免疫化に供した。翌日、マウスを２０ｍｇ／マウスのＤ−ＧａｌＮ（ｉ．ｐ．）により感作し、致死用量の精製されたＯ２５ｂ ＬＰＳによる同時攻撃（ｉ．ｖ．）に供した。生存を毎日モニターした。

【図9】インビトロでのエンドトキシン中和アッセイ。精製されたＯ２５ｂ ＬＰＳのＴＬＲ−４シグナル伝達をＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイで評価した（パネルＡ）。代表的なＯ２５ｂ特異的ｍＡｂの用量依存的中和能がポリミキシンＢとの比較で示される（パネルＢ）。この設定で求められるいくつかのヒト化Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂおよびキメラＯ２５ｂ特異的ｍＡｂのＩＣ_５０濃度として表される中和能がパネルＣにまとめられる。

【図10】（ａ）：大腸菌Ｏ２５ｂ抗原の繰り返しユニットの構造。（ｂ）：大腸菌Ｏ２５ａの繰り返しユニットの構造（Ｋｅｎｎｅ Ｌ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ Ｂ、Ｍａｄｄｅｎ ＪＫ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ＡＡ、Ｇｅｍｓｋｉ Ｐ Ｊｒ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ ２５、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ．、２８、１２２（２）：２４９〜５６、１９８３）。

【発明を実施するための形態】

【0120】

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、リンカー配列の有無にかかわらず、抗体ドメインからなる、または抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を示すものとする（ただし、抗体ドメインは免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常ドメインおよび／または可変ドメインとして理解される）。ポリペプチドは、ループ配列によってつながれる抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは生来型構造である場合があり、あるいは、例えば、抗原結合特性またはいずれかの他の特性（例えば、安定性または機能的特性（例えば、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγ受容体に対する結合など）など）を改変するために変異誘発または誘導体化によって改変される場合がある。

【0121】

本明細書中で使用されるような抗体は、１つまたは複数の抗原あるいはそのような抗原の１つまたは複数のエピトープと結合するための特異的な結合部位を有しており、具体的には、単一の可変抗体ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨなど）のＣＤＲ結合部位または複数対の可変抗体ドメイン（例えば、ＶＬ／ＶＨ対など）の結合部位を含み、ただし、抗体はＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖまたは全長抗体など）。

【0122】

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、単一の可変抗体ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨなど）、あるいは、連結配列またはヒンジ領域の有無にかかわらず、可変抗体ドメインおよび／または定常抗体ドメインの組合せ（可変抗体ドメインの対（例えば、ＶＬ／ＶＨ対など）を含む）を含む、あるいはそのようなものからなる抗体形式を特に示すものとし、ただし、抗体はＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含み、または、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインからなる（例えば、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、あるいは、全長抗体（例えば、ＩｇＧタイプ、例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプ）の全長抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体またはＩｇＭ抗体など）。用語「全長抗体」は、天然に存在する抗体モノマーにおいて一般に見出されるＦｃドメインおよび他のドメインの少なくともほとんどを含むどのような抗体分子をも示すために使用することができる。この表現は、特定の抗体分子が抗体フラグメントでないことを強調するために本明細書中では使用される。

【0123】

用語「抗体」は具体的には、単離された形態での抗体を包含するものとし、この場合、そのような抗体は、異なる標的抗原に対する他の抗体、または、抗体ドメインの異なる構造的配置を含む他の抗体を実質的に含まない。それでも、単離された抗体が、例えば、異なる特異性を有する少なくとも１つの他の抗体（例えば、モノクローナル抗体または抗体フラグメントなど）との当該単離された抗体の組合せを含有する組合せ調製物に含まれる場合がある。

【0124】

用語「抗体」は、ヒト種を含めて、動物起源の抗体に対して、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシおよびウマを含む）または鳥類（例えば、ニワトリなど）などの起源の抗体に対して適用されるものとし、この場合、そのような用語は特に、動物起源の配列（例えば、ヒト配列）に基づく組換え抗体を包含するものとする。

【0125】

用語「抗体」はさらに、異なる種の起源の配列（例えば、マウス起源およびヒト起源の配列など）を有するキメラ抗体に対して適用される。

【0126】

用語「キメラ」は、抗体に関して使用される場合、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの１つの部分が、特定の種に由来する抗体または特定のクラスに属する抗体における対応する配列に対して相同的であり、その一方で、その鎖の残るセグメントが別の種またはクラスにおける対応する配列に対して相同的であるそのような抗体を示す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の鎖の可変領域が、哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域に似ており、その一方で、定常部分が、別の種に由来する抗体の配列に対して相同的である。例えば、可変領域は、例えば、ヒト細胞調節物に由来する定常領域との組合せで、ヒト以外の宿主生物からの容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを使用して、現在知られている供給源に由来することができる。

【0127】

用語「抗体」はさらに、ヒト化抗体に対して適用される場合がある。

【0128】

用語「ヒト化」は、抗体に関して使用される場合、ヒト以外の種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子であって、当該分子の残る免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を示す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合される完全な可変ドメイン、または、可変ドメインにおいて適切なフレームワーク領域にグラフト化される相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのどちらかを含む場合がある。抗原結合部位は野生型である場合があり、あるいは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換によって改変される場合があり、好ましくは、ヒト免疫グロブリンに一層よく似ているように改変される場合がある。いくつかの形態のヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列を保っている（例えば、マウス抗体からの６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化されたマウス抗体）。他の形態は、元の抗体に関して変化させられる１つまたは複数のＣＤＲを有する。

【0129】

用語「抗体」はさらに、ヒト抗体に対して適用される。

【0130】

用語「ヒト」は、抗体に関して本明細書中で使用される場合、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが理解される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、あるいは、インビボでの体細胞変異によって導入される変異）を、例えば、ＣＤＲにおいて含む場合がある。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから単離される抗体、あるいは、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えである動物から単離される抗体が含まれる。

【0131】

用語「抗体」は具体的には、どのようなクラスまたはサブクラスの抗体に対しても適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は抗体の主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に割り当てることができ、また、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられる場合がある（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。

【0132】

この用語はさらに、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（具体的には組換え抗体）に対して適用され、この場合、そのような用語には、組換え手段によって調製される、発現させられる、作製される、または単離されるすべての抗体および抗体構造が含まれ、例えば、異なる起源からの遺伝子または配列を含む、動物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）に起源を有する抗体（例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはハイブリドーマ由来抗体など）などが含まれる。さらなる例には、抗体を発現するように形質転換される宿主細胞から単離される抗体、あるいは、抗体または抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離される抗体、あるいは、他のＤＮＡ配列への抗体遺伝子配列のスプライシングを伴ういずれかの他の手段によって調製される、発現させられる、作製される、または単離される抗体が示される。

【0133】

用語「抗体」はまた、抗体の誘導体、具体的には機能的に活性な誘導体を示すことが理解される。抗体誘導体は、１つまたは複数の抗体ドメインまたは抗体のどのような組合せとしてでも、ならびに／あるいは、抗体のいずれかのドメインが１つまたは複数の他のタンパク質（例えば、他の抗体（例えば、ＣＤＲループを含む結合性構造体）、受容体ポリペプチド、しかし、同様に、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素およびその他など）のどのような位置においてでも融合され得る融合タンパク質として理解される。抗体の誘導体が、様々な化学的技術（例えば、共有結合カップリング、静電的相互作用、ジスルフィド結合など）による他の物質に対する会合または結合によって得られる場合がある。抗体に結合させられる他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機分子および無機分子、または、どのような組合せであれ、それらの組合せである場合がある（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）。具体的な実施形態において、抗体は、生物学的に許容され得る化合物との特異的な相互作用を可能にするさらなるタグを含む誘導体である。本発明において使用可能であるタグに関しては、抗体がその標的に結合したときに負の影響を有しない、または許容可能な負の影響を有する限り、特に限定されない。好適なタグの例には、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグおよびＳタグが含まれる。別の具体的な実施形態において、抗体は、標識を含む誘導体である。用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的または間接的にコンジュゲート化される検出可能な化合物または組成物を示す。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光性標識）、または、酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒する場合がある。

【0134】

本明細書中に記載されるような好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは、例えば、ＳＢＡアッセイ、ＯＰＫアッセイまたはＬＡＬアッセイにおいて明らかにされるように、ＭＤＲ大腸菌およびそのエンドトキシンと戦う効力、あるいは、細菌攻撃から保護する効力、あるいは、致死的な内毒素血症を中和する効力を有する。

【0135】

具体的には、本発明の抗体に由来する抗体は、Ｏ２５ｂ抗原に示差的に結合することにおいて、例えば、Ｏ２５ｂ抗原と特異的かつ選択的に結合することにおいて機能的に活性であるＣＤＲ領域またはそのＣＤＲ変化体の少なくとも１つまたは複数を含む場合がある。

【0136】

親抗体または親抗体配列（例えば、親となるＣＤＲ配列またはＦＲ配列など）に由来する抗体は本明細書中では特に、例えば、インシリコ工学または組換え工学によって、あるいは、そうでなければ、化学的な誘導体化または合成によって得られる変異体または変化体として理解される。

【0137】

用語「抗体」はまた、親ＣＤＲ配列の機能的に活性なＣＤＲ変化体を含む抗体、および、親抗体の機能的に活性な変化体抗体を含めて、抗体の変化体を示すことが理解される。

【0138】

具体的には、本発明の抗体に由来する抗体は、ＣＤＲ領域またはそのＣＤＲ変化体の少なくとも１つまたは複数を、例えば、重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを、ＣＤＲ領域またはＦＲ領域の少なくとも１つにおける、あるいは、ＨＣまたはＬＣの定常領域における少なくとも１つの点変異を伴って含む場合があり、この場合、抗体は機能的に活性であり、例えば、Ｏ２５ｂ抗原と特異的に結合し、かつ、場合により、Ｏ２５ａ抗原と交差特異的に結合する。

【0139】

用語「変化体」は、例えば、変異誘発法によって得られる抗体（例えば、変異抗体または抗体のフラグメントなど）、具体的には、特異的な抗体アミノ酸配列または抗体領域の欠失、交換、導入、特異的な抗体アミノ酸配列または抗体領域への挿入を行うための、あるいは、アミノ酸配列を、例えば、抗体安定性、エフェクター機能または半減期を操作するために定常ドメインにおいて、または、抗原結合特性を、例えば、この技術分野で利用可能な親和性成熟技術によって改善するために可変ドメインにおいて化学的に誘導体化するための様々な変異誘発法によって得られる抗体（例えば、変異抗体または抗体のフラグメントなど）を特に示すものとする。知られている変異誘発方法のどれもが用いられる場合があり、これには、例えば、ランダム化技術によって得られる所望の位置における点変異が含まれる。場合により、様々な位置が、ランダムに、例えば、抗体配列をランダム化するための可能なアミノ酸のいずれかまたは好ましいアミノ酸の選択のどちらかにより選定される。用語「変異誘発」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を変更するためのこの技術分野で認識されているどのような技術をも示す。好ましいタイプの変異誘発には、誤りを生じさせやすいＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発または他の部位特異的変異誘発が含まれる。

【0140】

用語「変化体」は具体的には、機能的に活性な変化体を包含するものとする。

【0141】

ＣＤＲ配列の用語「機能的に活性な変化体」は、本明細書中で使用される場合、「機能的に活性なＣＤＲ変化体」として理解され、また、抗体の「機能的に活性な変化体」は、本明細書中で使用される場合、「機能的に活性な抗体変化体」として理解される。機能的に活性な変化体は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換、あるいは、アミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の化学的誘導体化、あるいは、ヌクレオチド配列内の１つまたは複数のヌクレオチドの化学的誘導体化、あるいは、配列の遠位末端のどちらかまたは両方での化学的誘導体化、例えば、ＣＤＲ配列では、Ｎ端側および／またはＣ端側の１個、２個、３個または４個のアミノ酸、ならびに／あるいは、中心の１個、２個、３個または４個のアミノ酸（すなわち、ＣＤＲ配列の中央における）化学的誘導体化によるこの配列（親抗体または親配列）の改変から生じる配列を意味し、かつ、そのような変異はこの配列の活性に影響を及ぼさず、具体的にはこの配列の活性を損なわない。選択された標的抗原に対する特異性を有する結合部位の場合には、抗体の機能的に活性な変化体は依然として、所定の結合特異性を有するであろう。だが、これは、例えば、特異的なエピトープに対する微細な特異性、親和性、アビディティー、Ｋｏｎ速度またはＫｏｆｆ速度などを変化させるために変化させることができるであろう。例えば、親和性成熟を受けた抗体が具体的には、機能的に活性な変化体抗体として理解される。したがって、親和性成熟を受けた抗体における改変されたＣＤＲ配列が、機能的に活性なＣＤＲ変化体として理解される。

【0142】

具体的には、本発明の抗体の機能的に活性な変化体は、Ｏ２５ｂ抗原と結合する潜在的能力、および、大腸菌の他の抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合するための特異性または選択性（例えば、大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合しないこと、または、Ｏ２５ａ抗原と有意に結合しないこと、または、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原の両方と交差特異的に結合するが、大腸菌の他の抗原には結合しないこと）を有する。

【0143】

機能的に活性な変化体が、例えば、親抗体の配列を変化させることによって得られる場合がある（例えば、表１および図２において列挙されるような抗体のいずれかと同じ結合部位を含み、しかし、結合部位のほかに抗体領域内の改変を伴う抗体、あるいは、結合部位内の改変によってそのような親抗体に由来するが、抗原結合を損なわず、好ましくは、Ｏ２５ｂ抗原と特異的または選択的に結合することができること、例えば、大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合しないこと、または、Ｏ２５ａ抗原と有意に結合しないこと、または、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原の両方と交差特異的に結合するが、大腸菌の他の抗原には結合しないことを含めて、親抗体と実質的に同じ生物学的活性、または、改善された活性さえも有するであろう抗体）。必要な場合には、機能的に活性な変化体はさらに、ＳＢＡアッセイにおける補体媒介殺傷の潜在的能力を含む場合があり、かつ／または、場合によりさらに、ＯＰＫアッセイにおける抗体媒介食作用の潜在的能力を含む場合があり、かつ／または、場合によりさらに、ＬＡＬアッセイにおけるエンドトキシン中和機能を、例えば、標的（ＭＤＲ）大腸菌に対しての特異的な結合アッセイまたは機能的試験によって明らかにされるように、実質的に同じ生物学的活性を伴って含む場合がある。

【0144】

用語「実質的に同じ生物学的活性」は、本明細書中で使用される場合、比較可能な抗体または親抗体について求められるような活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％である、あるいは、例えば、２００％にまで達する実質的に同じ活性によって示されるような活性を示す。

【0145】

本明細書中に記載されるような好ましい変化体または誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは、Ｏ２５ｂ抗原と特異的に結合する潜在的能力、および、大腸菌の他の抗原には結合しないこと、例えば、大腸菌のＯ２５ｂ抗原に結合し、Ｏ２５ａ抗原には結合しないこと、または、Ｏ２５ａ抗原と有意に結合しないこと、または、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原の両方と交差特異的に結合すること、例えば、Ｏ２５ａと比較してＯ２５ｂ抗原と優先的に結合すること、または、Ｏ２５（Ｏ２５ａ）菌株に対して惹起される現在のポリクローナルなタイプ決定血清と比較して、より大きい親和性によりＯ２５ｂと結合することを有する。好ましい変化体は、大腸菌の他の抗原には結合せず、少なくとも対数で２のＫｄ値差、好ましくは少なくとも対数で３のＫｄ値差を伴い、また、場合によりさらに、ＳＢＡアッセイにおける補体媒介殺傷の潜在的能力、例えば、抗体を含有しないコントロールサンプルに対する細菌カウント数における有意な低下を達成するための潜在的能力を含み、かつ／または、場合によりさらに、ＯＰＫアッセイにおける抗体媒介食作用の潜在的能力、例えば、抗体を含有しないコントロールサンプルに対する細菌カウント数における有意な低下を達成するなどのための潜在的能力を含み、かつ／または、場合によりさらに、ＬＡＬアッセイまたはＴＬＲ４シグナル伝達アッセイにおけるエンドトキシン中和機能、例えば、抗体を含有しないコントロールサンプルに対する遊離ＬＰＳにおける有意な低下を達成するなどのためのエンドトキシン中和機能を、例えば、標的ＭＤＲ大腸菌に対しての特異的な結合アッセイまたは機能的試験によって明らかにされるように、実質的に同じ生物学的活性を伴って含む。様々なアッセイにおける分析物の有意な低下は典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％から、約１００％（＋／−１％）の完全な低下に至るまでの低下を意味する。

【0146】

好ましい実施形態において、親抗体の機能的に活性な変化体は、
ａ）前記抗体の生物学的に活性なフラグメントである（ただし、この場合、このフラグメントは、当該分子の配列の少なくとも５０％を構成し、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を構成し、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を構成する）；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、アミノ酸付加および／またはアミノ酸欠失によって前記抗体に由来する（ただし、この場合、機能的に活性な変化体は、当該分子またはその一部分に対する所与の配列同一性を有する；例えば、配列同一性が少なくとも５０％である抗体、好ましくは少なくとも６０％である抗体、より好ましくは少なくとも７０％である抗体、より好ましくは少なくとも８０％である抗体、さらにより好ましくは少なくとも９０％である抗体、一層より好ましくは少なくとも９５％である抗体、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％である抗体など）；および／または
ｃ）抗体またはその機能的に活性な変化体と、さらには、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列に対して異種である少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドとからなる。

【0147】

本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明による抗体の機能的に活性な変化体は、上記で記載される変化体と本質的に同一であり、しかし、異なる種の相同的配列に由来するという点でそのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列からそれぞれ異なる。これらは、天然に存在する変化体またはアナログと呼ばれる。

【0148】

用語「機能的に活性な変化体」にはまた、天然に存在する対立遺伝子変化体、同様にまた、変異体、または、どのような変化体であれ、天然に存在しない他の変化体が含まれる。この技術分野では知られているように、対立遺伝子変化体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には変化させない、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特徴づけられる（ポリ）ペプチドの代替形態である。

【0149】

機能的に活性な変化体が、例えば、１つまたは複数の点変異によるポリペプチド配列またはヌクレオチド配列における配列変化によって得られる場合があり、しかし、この場合、配列変化は、本発明の組合せで使用されるとき、変化を受けていないポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の機能を保持し、または改善する。そのような配列変化には、（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0150】

具体的な機能的に活性な変化体がＣＤＲ変化体である。ＣＤＲ変化体は、ＣＤＲ領域における少なくとも１つのアミノ酸によって改変されるアミノ酸配列を含み、ただし、この場合、前記改変はアミノ酸配列の化学的または部分的な変化であり得るが、そのような改変は、変化体が非改変配列の生物学的特徴を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変化は、１個〜数個のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸配列）の欠失または置換によるもの、あるいは、１個〜数個のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸配列）の付加または挿入によるもの、あるいは、１個〜数個のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸配列）の化学的誘導体化によるもの、あるいは、それらの組合せによるものである場合がある。アミノ酸残基における置換は、例えば、１つの疎水性アミノ酸を代わりの疎水性アミノ酸に置換する保存的置換である場合がある。

【0151】

保存的置換は、それらの側鎖および化学的性質において関連づけられるアミノ酸の集団の中で行われる置換である。そのような集団の例が、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性の芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸、小さい側鎖を有するアミノ酸、大きい側鎖を有するアミノ酸などである。

【0152】

点変異は特に、種々のアミノ酸についての１つまたは複数の単一（非連続）または二重のアミノ酸の置換もしくは交換、欠失または挿入において非操作のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドを設計することとして理解される。

【0153】

好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を示す。この点に関して、アミノ酸は、６４個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸を示す。これら２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷を有するアミノ酸に分けることができる。

【0154】

「中性」アミノ酸が、それらのそれぞれの三文字コードおよび一文字コードならびに極性と一緒に下記に示される：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）無極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正荷電（１０％）、中性（９０％）。

【0155】

「正」荷電アミノ酸が下記の通りである：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正荷電；および
リシン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正荷電。

【0156】

「負」荷電アミノ酸が下記の通りである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負荷電；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負荷電。

【0157】

本明細書中に記載される抗体配列およびホモログに関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、必要ならば、ギャップを導入した後で、かつ、どのような保存的置換も配列同一性の一部として考慮することなく、具体的なポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされるどのようなアルゴリズムも含めて、アラインメントを見積もるための適切なパラメーターを決定することができる。

【0158】

抗体変化体は具体的には、機能的であり、かつ、機能的等価体として役立ち得る、例えば、特異的標的に結合し、また、機能的特性を有する、例えば、糖鎖工学によって製造される、特定のグリコシル化パターンを伴うホモログ、アナログ、フラグメント、改変体または変化体を含むことが理解される。

【0159】

本発明の抗体はＦｃエフェクター機能を示す場合があり、または示さない場合がある。作用様式が、Ｆｃエフェクター機能を有しない中和抗体によって主に媒介されるにもかかわらず、Ｆｃは補体を補充し、標的抗原（例えば、毒素など）が免疫複合体の形成を介して循環から除かれることを助けることができる。

【0160】

具体的な抗体は、活性なＦｃ部分を欠いている場合がある。したがって、抗体のＦｃ部分を含有しない抗体ドメイン、または、Ｆｃγ受容体結合部位を含有しない抗体ドメインから構成されるか、あるいは、例えば、Ｆｃエフェクター機能を低下させるための改変によって、具体的にはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を消す、または低下させるための改変によって、Ｆｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含むかのどちらかである。代わりの抗体が、Ｆｃエフェクターを増大させるために、具体的にはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を高めるために改変を取り込むように設計される場合がある。

【0161】

そのような改変が、変異誘発（例えば、Ｆｃγ受容体結合部位における変異）によって、あるいは、抗体形式のＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を妨害し、その結果、Ｆｃエフェクター機能の低下または増大を達成するようにするための誘導体または薬剤によって達成される場合がある。

【0162】

Ｆｃエフェクター機能の有意な低下は典型的には、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性によって測定されるような非改変（野生型）形式の１０％未満（好ましくは５％未満）のＦｃエフェクター機能を示すことが理解される。Ｆｃエフェクター機能の有意な増大は典型的には、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性によって測定されるような非改変（野生型）形式の少なくとも１０％（好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％）のＦｃエフェクター機能における増大を示すことが理解される。

【0163】

抗体配列に関しての用語「糖鎖工学（された）」変化体は、改変された免疫原性特性または免疫調節（例えば、抗炎症性）特性（ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）を糖鎖工学の結果として有するグリコシル化変化体を示すものとする。すべての抗体が炭水化物構造を重鎖定常領域における保存された位置に含有しており、それぞれのアイソタイプが、様々なＮ結合型炭水化物構造の異なった配列を有し、これらのＮ結合型炭水化物構造により、タンパク質の組み立て、分泌および機能的活性が可変的影響を受ける。ＩｇＧ１タイプの抗体は、保存されたＮ結合型糖鎖付加部位をそれぞれのＣＨ２ドメインにおいてＡｓｎ２９７に有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合する２つの複雑な二分岐したオリゴ糖がＣＨ２ドメインの間に埋もれ、これにより、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、また、それらの存在が、抗体がエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）を媒介するために不可欠である。Ｎ２９７におけるＮ−グリカンを、例えば、Ｎ２９７を、例えば、Ａに変異することにより除くこと、または、Ｔ２９９は典型的には、低下したＡＤＣＣを有する脱糖鎖された（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体形式をもたらす。具体的には、本発明の抗体はグリコシル化抗体または糖鎖工学抗体あるいは脱糖鎖抗体である場合がある。

【0164】

抗体のグリコシル化における大きな違いが細胞株の間には存在し、また、小さい違いさえもが、異なる培養条件のもとで成長させられた所与の細胞株について認められる。細菌細胞における発現は典型的には、脱糖鎖抗体をもたらす。β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、すなわち、二分性ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼのテトラサイクリン調節発現を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａ他、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。宿主細胞の選定に加えて、抗体の組換え産生の期間中におけるグリコシル化に影響を及ぼす要因には、生育様式、培地処方、培養密度、酸素化、ｐＨおよび精製スキームなどが含まれる。

【0165】

用語「抗原結合部位」または用語「結合部位」は、抗原結合に関与する抗体の一部分を示す。抗原結合部位が、重（「Ｈ」）鎖および／または軽（「Ｌ」）鎖のＮ端側可変「Ｖ」領域あるいはそれらの可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域の内部における３つの非常に異なった区域（これは「超可変領域」と呼ばれる）が、フレームワーク領域として知られているより保存された隣接区域の間に置かれる。抗原結合部位は、結合したエピトープまたは抗原の三次元表面に対して相補的である表面を与え、超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲに組み込まれる結合部位は本明細書中ではまた、「ＣＤＲ結合部位」とも呼ばれる。

【0166】

用語「抗原」は、用語「標的」または用語「標的抗原」と交換可能に本明細書中で使用されるように、抗体結合部位によって認識される標的分子全体またはそのような分子のフラグメントを示すものとする。具体的には、抗原の部分構造で、免疫学的に関連している部分構造、例えば、ポリペプチドまたは炭水化物構造（これらは一般には「エピトープ」と呼ばれ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと呼ばれる）が、そのような結合部位によって認識される場合がある。Ｏ２５ｂ抗原またはＯ２５ａ抗原のような特異的な抗原が、単離された抗原として提供され、あるいは、それどころか、大腸菌細胞または大腸菌細胞分画物の形態で提供される。

【0167】

用語「エピトープ」は、本明細書中で使用される場合、特異的な結合パートナーを完全に構成することがある、または、抗体の結合部位に対しての特異的な結合パートナーの一部であることがある分子構造を特に示すものとする。エピトープが、炭水化物、ペプチド性構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質もしくは無機物質またはその誘導体、および、どのような組合せであれ、それらの組合せから構成される場合がある。エピトープがペプチド性構造（例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質など）に含まれるならば、エピトープは通常、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５個〜４０個のアミノ酸、より好ましくは約１０個〜２０個の間のアミノ酸を含むことになる。エピトープは線状エピトープまたは立体配座エピトープのどちらもが可能である。線状エピトープが、ポリペプチド鎖または炭水化物鎖の一次配列のただ１つだけのセグメントから構成される。線状エピトープは連続または重複していることが可能である。

【0168】

立体配座エピトープが、三次構造を形成するためにポリペプチドを折りたたむことによってまとまるアミノ酸または炭水化物から構成され、これらのアミノ酸は必ずしも線状配列において相互に隣接していない。具体的には、また、ポリペプチド抗原に関して、立体配座エピトープまたは不連続エピトープが、一次配列においては隔てられるが、ポリペプチドが生来型タンパク質／抗原に折り重なるときには分子の表面における一貫した構造に集まる２つ以上の異なったアミノ酸残基の存在によって特徴づけられる。

【0169】

本明細書中では、用語「エピトープ」は、抗体によって認識される１つだけのエピトープ、または、様々なエピトープ変化体を含むエピトープの混合物（ただし、それぞれが交差反応性抗体によって認識される）を特に示すものとする。

【0170】

用語「発現」は下記のように理解される。発現産物（例えば、本明細書中に記載されるような抗体など）の所望されるコード配列と、制御配列（例えば、動作可能な連結でのプロモーターなど）とを含有する核酸分子が、発現目的のために使用される場合がある。これらの配列による形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主は、コードされたタンパク質を産生させることができる。形質転換を達成するために、発現システムがベクターに含まれる場合がある；しかしながら、関連したＤＮＡはまた、宿主染色体に組み込まれる場合がある。具体的には、この用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための好適な条件のもとにある宿主細胞および適合し得るベクターを示す。

【0171】

コードＤＮＡは、特定のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体など）のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始させる、調節する、あるいは、そうでない場合には媒介する、または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子から、または異なる遺伝子から得られる場合があり、また、同じ生物または異なる生物から得られる場合がある。組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー（例えば、抗生物質抵抗性）、および、１つまたは複数の発現カセットを含むであろう。

【0172】

本明細書中で使用される「ベクター」は、好適な宿主生物におけるクローン化された組換えヌクレオチド配列の転写、すなわち、組換え遺伝子の転写およびそのｍＲＮＡの翻訳のために要求されるＤＮＡ配列として定義される。

【0173】

「発現カセット」は、発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントで、規定された制限部位においてベクターに挿入され得るＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを示す。カセットの制限部位が、適正な読み枠でのカセットの挿入を保証するように設計される。一般には、外来ＤＮＡがベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位において挿入され、その後、伝達性ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞にベクターによって運ばれる。挿入されたＤＮＡまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列（例えば、発現ベクターなど）はまた、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶことができる。

【0174】

発現ベクターは発現カセットを含み、さらには通常の場合、宿主細胞における自律的複製のための起点、あるいは、ゲノム組み込み部位、１つまたは複数の選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、または、抗生物質（例えば、ゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８またはヒグロマイシンなど）に対する抵抗性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列および転写ターミネーター（そのような成分は一緒に動作可能に連結される）を含む。用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、自律的に複製するヌクレオチド配列、同様にまた、ヌクレオチド配列を組み込むゲノムを包含する。一般的なタイプのベクターが「プラスミド」であり、これは一般に、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、かつ、好適な宿主細胞に容易に導入することができる二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子である。プラスミドベクターは多くの場合、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、また、外来ＤＮＡを挿入するために好適である１つまたは複数の制限部位を有する。具体的には、用語「ベクター」または用語「プラスミド」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に挿入することができ、その結果、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進させるビヒクルを示す。

【0175】

用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合、特定の組換えタンパク質（例えば、本明細書中に記載されるような抗体など）を産生するように形質転換される一次の対象細胞、および、どのような子孫であれ、その子孫を示すものとする。必ずしもすべての子孫が、（意図的な変異または故意でない変異あるいは環境における違いに起因して）親細胞とまさに同一であるわけではないことを理解しなければならない。しかしながら、子孫が、最初に形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を保持する限り、そのような変化した子孫はこれらの用語に含まれる。用語「宿主細胞株」は、組換えポリペプチド（例えば、組換え抗体など）を産生させるための組換え遺伝子を発現させるために使用されるような宿主細胞の細胞株を示す。用語「細胞株」は、本明細書中で使用される場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞タイプの樹立されたクローンを示す。そのような宿主細胞または宿主細胞株は細胞培養で維持される場合があり、かつ／または、組換えポリペプチドを産生させるために培養される場合がある。

【0176】

用語「単離された」または用語「単離」は、核酸、抗体または他の化合物に関して本明細書中で使用される場合、自然界では伴うと思われる環境から十分に単離されており、その結果、「実質的に純粋な」形態で存在するようにされるそのような化合物を示すものとする。「単離された」は、他の化合物または材料との人為的混合物または合成混合物、あるいは、基本的活性を妨害しない不純物の存在、および、例えば、不完全な精製に起因して存在することがある不純物の存在を除外することを必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、天然には存在しない核酸分子（例えば、コドン最適化核酸またはｃＤＮＡ）または化学合成される核酸分子を包含することが意味される。

【0177】

同様に、本発明の単離された抗体は具体的には、天然には存在しておらず、例えば、別の抗体または活性な作用因との組合せ調製物において提供されるようなものであり（ただし、この場合、そのような組合せは自然界に存在しない）、あるいは、天然に存在する抗体の最適化された変化体または親和性成熟化された変化体、あるいは、抗体の製造性を改善するために設計されるフレームワーク領域を有する抗体である。

【0178】

本発明の核酸に関しては、用語「単離された核酸」が使用されることがある。この用語は、ＤＮＡに対して適用されるときには、ＤＮＡの起源となる生物の天然に存在するゲノムにおいて当該ＤＮＡが直に隣接している配列から分離されるＤＮＡ分子を示す。例えば、「単離された核酸」は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなど）に挿入されるＤＮＡ分子、あるいは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子を含む場合がある。ＲＮＡに対して適用されるときには、用語「単離された核酸」は主に、上記で定義されるような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を示す。代替において、この用語は、その天然の状態において（すなわち、細胞または組織において）伴うと思われる他の核酸から十分に単離されているＲＮＡ分子を示す場合がある。「単離された核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらも）はさらに、生物学的手段または合成的手段によって直接に製造され、その製造の期間中に存在する他の成分から分離される分子を表す場合がある。

【0179】

ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、本発明の単離された抗体またはエピトープなど）に関しては、用語「単離された」は具体的には、ポリペプチドまたはタンパク質に天然では伴う物質、例えば、それらの自然の環境において、あるいは、調製が、インビトロまたはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術によるものであるときには、ポリペプチドまたはタンパク質が調製される環境（例えば、細胞培養）においてポリペプチドまたはタンパク質と一緒に見出される他の化合物などを含まない、または実質的に含まない化合物を示すものとする。単離された化合物は希釈剤または補助剤とともに配合することができ、また、依然として実用的目的のために単離することができる。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または治療において使用されるとき、医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤と混合することができる。特に、本発明の単離された抗体は、単離および精製された形態で提供されるので、好ましくは、単離された抗体を唯一の活性な物質として含む調製物で提供されるので、Ｏ２５（ａ）菌株に対して惹起されるポリクローナル血清調製物とは異なる。しかしながら、このことは、単離された抗体が、限られた数のさらなる十分に定義された（単離された）抗体を含む組合せ製造物で提供されることを排除するものではない。単離された抗体は、固体キャリア、半液体キャリアまたは液体キャリア（例えば、ビーズなど）において提供されてもよい。

【0180】

用語「中和する」または用語「中和」は、最も広い意味で本明細書中では使用され、どのような分子であれ、中和が達成される機構にかかわらず、病原体（例えば、ＭＤＲ大腸菌など）が対象に感染することを妨げる分子、または、病原体が、強力なタンパク質毒素を産生することにより感染を促進させることを妨げるための分子、または、毒素が対象における標的細胞を損傷することを妨げるための分子を示す。中和を、例えば、ＭＤＲ大腸菌エンドトキシンが結合すること、および／または、標的細胞表面のその同族受容体と相互作用すること（例えば、ＴＬＲ４受容体に結合すること）を阻害する抗体によって達成することができる。中和はさらに、エンドトキシン分子をＦｃ媒介機能によって循環から除くことによって生じさせることができる。

【0181】

中和効力が典型的には、標準的なアッセイにおいて、例えば、エンドトキシンの生物学的活性の阻害が、例えば、比色分析によって測定されるＬＡＬ試験で求められる。

【0182】

用語「ＭＤＲ大腸菌」は下記のように理解される：ほんのこの１０年で出現し、世界的に拡大した優勢な耐性クローンになったＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４クローン系譜にかなりの部分が起因する多剤耐性大腸菌による感染症。多耐性大腸菌は、３つ以上のクラスの抗生物質に対する抵抗性、例えば、下記の薬剤／群に対する抵抗性を明らかにするそのような菌株として特に理解される：ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、フルオロキノロン系、ニトロフラントイン系、トリメトプリム（およびその組合せ）、ホスホマイシン、ポリミキシン系、クロラムフェニコール、アズトレオナム、チゲサイクリン。

【0183】

酸性の莢膜多糖（ＣＰＳ）は、ほとんどの病原体大腸菌を取り囲む多糖の厚い粘膜様の層である。したがって、本発明の抗体によって認識される特異的エピトープが特異的に、被包性ＭＤＲ大腸菌菌株および非被包性ＭＤＲ大腸菌菌株の両方に対して接近可能であると思われることは驚くべきことである。

【0184】

ＭＤＲ大腸菌と戦う抗体またはＭＤＲ大腸菌を中和する抗体は病原体および病原性反応を妨げており、したがって、感染を制限または防止することができ、かつ／または、そのような感染から生じる疾患状態を改善することができ、あるいは、ＭＤＲ大腸菌の病理発生を阻害することができ、具体的には、宿主の無菌の身体区画／部位への、または、宿主の無菌の身体区画／部位における播種および複製を阻害することができる。この点に関して、「保護抗体」は、能動免疫または受動免疫において認められる、感染性作用因に対する免疫性を担う抗体として本明細書中では理解される。特に、本明細書中に記載されるような保護抗体はおそらくは、治療目的のために、例えば、予防または治療のために、すなわち、病原体によって誘発される疾患の疾患症状、副作用または進行を防止するために、改善するために、処置するために、または少なくとも部分的には停止させるために使用される。具体的には、保護抗体は、生きた大腸菌細胞を殺すこと、またはその複製を妨げることを、例えば、血清の殺菌活性またはオプソニン作用活性を誘導することによって行うことができ、あるいは、全細菌細胞またはそのＬＰＳ分子を治療的投与（すなわち、確立された感染に対して与えられる治療的投与）の後で無菌の身体部位から除くことができる。代替において、予防的に施された保護抗体は感染の確立（すなわち、非無菌部位からの無菌の身体区域への大腸菌の拡大）を上記機構または他の機構の１つによって阻害する。

【0185】

用語「Ｏ２５ｂ抗原」は、図８（ａ）において説明される構造を有するＬＰＳ Ｏ抗原として本明細書中では理解される。この構造は類似するが、Ｏ２５ａ抗原の構造とは異なっている。Ｏ２５ｂは、類似するが、Ｏ２５ａとは異なっている血清型として本明細書中では理解される。

【0186】

用語「Ｏ２５ａ抗原」は、Ｋｅｎｎｅ他によって記載される五糖の繰り返しユニットから構成される抗原として本明細書中では理解される。Ｏ２５ｂ抗原を特定する前は、Ｏ２５の用語が、本明細書中に記載されるようなＯ２５ａを表している（図８（ｂ）を参照のこと）。

【0187】

用語「組換え」は、本明細書中で使用される場合、「遺伝子工学によって調製される、または遺伝子工学の結果である」ことを意味するものとする。組換え宿主は具体的には発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、あるいは、組換え宿主は、組換え核酸配列を含有するために、具体的には、宿主にとって外来であるヌクレオチド配列を用いて遺伝子操作されている。組換えタンパク質が、それぞれの組換え核酸を宿主において発現させることによって産生させられる。用語「組換え抗体」は、本明細書中で使用される場合、組換え手段によって調製される、発現させられる、作製される、または単離される抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組換えまたは染色体組換え（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）、または、そのような動物から調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）抗体を発現させるために形質転換される宿主細胞から単離される抗体、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル・ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴ういずれかの他の手段によって調製される、発現させられる、作製される、または単離される抗体などを包含する。そのような組換え抗体は、例えば、抗体成熟時に生じる様々な再配列および変異を含むように設計される抗体を含む。

【0188】

本明細書中で使用される場合、用語「特異性」または用語「特異的結合」は、分子の不均一な集団における目的とする同族リガンドの決定をもたらす結合反応を示す。したがって、指定された条件（例えば、免疫アッセイ条件）のもとで、抗体は、サンプルに存在するその特定の標的に特異的に結合し、サンプルに存在する他の分子に対しては有意な量で結合しない。特異的結合は、結合が、選択されるように、標的同一性、大きい、中程度の、もしくは低い結合親和性またはアビディティーの面で選択的であることを意味する。選択的結合が通常、結合定数または結合動力学が（対数で少なくとも１の差として理解される）少なくとも１０倍異なるならば達成され、好ましくは、差は、別の抗原と比較される場合、（対数で少なくとも２の差として理解される）少なくとも１００倍であり、より好ましくは（対数で少なくとも３の差として理解される）少なくとも１０００倍である。

【0189】

本明細書中で使用される場合、用語「特異性」または用語「特異的結合」は、分子の不均一な集団における目的とする同族リガンドの決定をもたらす結合反応を示す。したがって、指定された条件（例えば、免疫アッセイ条件）のもとで、抗体は、サンプルに存在するその特定の標的に特異的に結合し、サンプルに存在する他の分子に対しては有意な量で結合しない。特異的結合は、結合が、選択されるように、標的同一性、大きい、中程度の、もしくは低い結合親和性またはアビディティーの面で選択的であることを意味する。選択的結合が通常、結合定数または結合動力学が（対数で少なくとも１の差として理解される）少なくとも１０倍異なるならば達成され、好ましくは、差は、（対数で少なくとも２の差として理解される）少なくとも１００倍であり、より好ましくは（対数で少なくとも３の差として理解される）少なくとも１０００倍である。用語「特異性」または用語「特異的結合」はまた、１つまたは複数の分子に結合する結合体（例えば、交差特異的な結合体）に対して適用されることが理解される。

【0190】

本発明の抗体は具体的には、Ｏ２５ｂ抗原と結合するだけであること、または、Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原と優先的に結合すること、または、Ｏ２５ａ菌株に対して惹起されるポリクローナルな血清と比較して（この場合、そのような血清は低い親和性によりＯ２５ｂ抗原に結合する）、より大きい親和性によりＯ２５ｂと結合することにおいて選択的である。したがって、本発明の抗体は、示差的にそのような抗原と結合すること、例えば、少なくとも同等の親和性により、または同等以上の親和性により、例えば、少なくとも対数で１のＫｄ差、好ましくは少なくとも対数で２のＫｄ差、より好ましくは少なくとも対数で３のＫｄ差による異なる親和性により結合することが理解される場合がある。Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に選択的に結合するそのような抗体は好ましくは、診断目的または治療目的のために使用される。いくつかの診断目的のために、Ｏ２５ｂ抗原と検出可能な様式で結合するだけである抗体が具体的には使用される。

【0191】

他の大腸菌抗原（例えば、Ｏ２５抗原以外のいずれかの炭水化物抗原、または、いずれかのコア抗原）と比較してＯ２５ｂ抗原と好ましくは結合するための示差的な結合親和性は、好ましくは少なくとも１０倍大きく、すなわち、少なくとも１０倍大きいＫｄ差、好ましくは少なくとも１００倍大きいＫｄ差、より好ましくは少なくとも１０００倍大きいＫｄ差を伴うものである。

【0192】

Ｏ２５ｂ抗原と優先的に結合するための示差的な結合親和性は、市販のタイプ決定用血清（例えば、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔから得られる高力価の大腸菌Ｏ２５抗血清（＃８１３６９）など）との比較において具体的には少なくとも５倍または少なくとも６倍または少なくとも７倍または少なくとも８倍または少なくとも９倍または少なくとも１０倍大きい。

【0193】

Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原と優先的に結合するための示差的な結合親和性は具体的には少なくとも同等または同等を超え、例えば、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍または少なくとも４倍または少なくとも５倍または少なくとも６倍または少なくとも７倍または少なくとも８倍または少なくとも９倍または少なくとも１０倍大きい。

【0194】

本発明の好ましい抗体は、前記個々の抗原のいずれとも、特にＯ２５ｂ抗原と大きい親和性により、具体的には、大きいオン（ｏｎ）速度および／または低いオフ（ｏｆｆ）速度あるいは大きい結合アビディティーにより結合する。抗体の結合親和性は通常、抗原結合部位の半数が占有される抗体の濃度に換算して特徴づけられ、これは解離定数（ＫｄまたはＫ_Ｄ）として知られている。通常、結合体は、１０^−７Ｍ未満のＫｄを有する高親和性の結合体であると見なされ、いくつかの場合において、例えば、治療目的のためには、より大きい親和性の結合体であると見なされ、例えば、１０^−８Ｍ未満のＫｄ、好ましくは１０^−９Ｍ未満のＫｄを有する結合体であると見なされ、一層好ましいものは、Ｋｄが１０^−１０Ｍ未満である。

【0195】

それにもかかわらず、特に好ましい実施形態において、個々の抗原結合親和性は、例えば、少なくとも２つの抗原に結合するときには中程度の親和性であり、例えば、Ｋｄが１０^−６未満で、かつ、１０^−８Ｍまでである。

【0196】

中程度の親和性の結合体が、必要に応じて、本発明に従って、好ましくは親和性成熟プロセスとの関連で提供される場合がある。

【0197】

親和性成熟は、標的抗原についての増大した親和性を有する抗体が産生されるプロセスである。この技術分野において利用可能である親和性成熟ライブラリーを調製および／または使用するいずれか１つまたは複数の方法が、親和性成熟化抗体を本明細書中に開示される本発明の様々な実施形態に従って生じさせるために用いられる場合がある。例示的なそのような親和性成熟方法および使用、例えば、ランダム変異誘発、細菌ミューテーター菌株の継代培養、部位特異的変異誘発、変異ホットスポット標的化、倹約的（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）変異誘発、抗体シャフリング、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１変異誘発、ならびに、様々な方法および使用を本明細書中に開示される本発明の様々な実施形態に従って実行することを受け入れやすい親和性成熟ライブラリーを製造および使用する方法などには、例えば、下記において開示されるものが含まれる：Ｐｒａｓｓｌｅｒ他（２００９）、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、第１巻（４）、５７１頁〜５８３頁；Ｓｈｅｅｄｙ他（２００７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、第２５巻（４）、３３３頁〜３５２頁；国際公開ＷＯ２０１２／００９５６８；国際公開ＷＯ２００９／０３６３７９；国際公開ＷＯ２０１０／１０５２５６；米国特許出願公開第２００２／０１７７１７０号；国際公開ＷＯ２００３／０７４６７９。

【0198】

抗体の構造変化（アミノ酸変異誘発を含む）により、または、免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞変異の結果として、抗原に対する結合部位の変化体が製造され、より大きい親和性について選択される。親和性成熟を受けた抗体は、親抗体よりも対数で数倍大きい親和性を示す場合がある。ただ１つの親抗体が親和性成熟を受ける場合がある。代替において、標的抗原に対しての類似する結合親和性を有する抗体のプールが、親和性成熟を受けたただ１つの抗体またはそのような抗体の親和性成熟化プールを得るために変化させられる元の構造であると見なされる場合がある。

【0199】

本発明による抗体の好ましい親和性成熟化変化体は結合の親和性における少なくとも２倍の増大を示し、好ましくは少なくとも５倍の増大、好ましくは少なくとも１０倍の増大、好ましくは少なくとも５０倍の増大、または、好ましくは少なくとも１００倍の増大を示す。親和性成熟が、結合親和性Ｋｄが１０^−８Ｍ未満である特異的標的結合特性を有する本発明の抗体を得るために、中程度の結合親和性を有する抗体とともに、親分子のそれぞれのライブラリーを用いる選択活動の過程で用いられる場合がある。代替において、親和性が、１０^−９Ｍ未満のＫｄ、好ましくは１０^−１０Ｍ未満のＫｄ、または、それどころか１０^−１１Ｍ未満のＫｄ、最も好ましくはピコモル濃度範囲でのＫｄに対応する大きい値を得るために、本発明による抗体の親和性成熟によって一層さらに増大させられる場合がある。

【0200】

ある特定の実施形態において、結合親和性が親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。ある特定の実施形態において、結合親和性が、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイまたはＭＳＤアッセイによって決定される。ある特定の実施形態において、結合親和性が速度論的方法によって決定される。ある特定の実施形態において、結合親和性が平衡／溶液法によって決定される。

【0201】

用語「同じ特異性を有する」、用語「同じ結合部位を有する」、または用語「同じエピトープと結合する」の使用は、同等のモノクローナル抗体が、同じまたは本質的に同じである、すなわち、類似する免疫反応（結合）特徴を示し、事前に選択された標的結合配列に結合することについて競合することを示す。特定の標的についての抗体分子の相対的特異性を、競合アッセイによって、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８）に記載されるような競合アッセイによって相対的に求めることができる。

【0202】

用語「対象」は、本明細書中で使用される場合、温血哺乳類（具体的にはヒト）を示すものとする。特に、本発明の医学的使用、または、処置のそれぞれの方法は、ＭＤＲ大腸菌感染症に伴う疾患状態の予防または処置を必要としている対象に対して、あるいは、早期段階または後期段階の疾患を含めて、疾患に罹患している対象に対して適用される。用語「患者」には、予防的処置または治療的処置のどちらかを受けるヒト対象および他の哺乳動物対象が含まれる。したがって、用語「処置」は、予防的処置および治療的処置の両方を包含することが意味される。

【0203】

対象は、例えば、ＭＤＲ大腸菌疾患状態の予防または治療のために処置される。具体的には、感染の危険性があるか、または、そのような疾患もしくは疾患再発を発症する危険性があるかのどちらかである対象、あるいは、そのような感染および／またはそのような感染に伴う疾患に罹患している対象が処置される。

【0204】

具体的には、本明細書中に記載されるような対象における疾患状態を処置するための、防止するための、または遅らせるための方法は、当該状態の原因作用因としてのＭＤＲ大腸菌の病理発生を妨げることによるものである。

【0205】

具体的には、用語「予防」は、病理発生の開始を妨げることを包含することが意図される防止的措置、または、病理発生の危険性を低下させるための予防的措置を示す。

【0206】

例えば、本発明の抗体は、ＭＤＲ大腸菌感染症の発症を阻害するために予防的に使用される場合があり、あるいは、ＭＤＲ大腸菌感染症を処置するために、具体的には、難治性であることが知られているＭＤＲ大腸菌感染症、または、具体的な対象の場合には、他の従来的な抗生物質治療による処置に対して難治性であることが判明しているＭＤＲ大腸菌感染症を処置するために治療的に使用される場合がある。

【0207】

用語「実質的に純粋な」または用語「精製された」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも５０％（ｖ／ｖ）の、好ましくは少なくとも６０％（ｖ／ｖ）、７０％（ｖ／ｖ）、８０％（ｖ／ｖ）、９０％（ｖ／ｖ）または９５％（ｖ／ｖ）の化合物（例えば、核酸分子または抗体など）を含む調製物を示すものとする。純度が、当該化合物について適切な方法（例えば、クロマトグラフィー方法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＨＰＬＣ分析など）によって測定される。

【0208】

用語「治療効果的な量」は、化合物（例えば、本発明の抗体）の用語「効果的な量」または用語「十分な量」のいずれかと交換可能に本明細書中では使用されるが、対象に投与されたとき、臨床結果を含めて、有益な結果または所望される結果を達成するために十分である量または活性であり、そのようなものとして、効果的な量またはその同義語は、その都度適用される文脈に依存する。

【0209】

効果的な量は、そのような疾患または障害を処置するために、防止するために、または阻害するために十分である化合物のそのような量を意味することが意図される。疾患の文脈において、本明細書中に記載されるような抗体の治療効果的な量は具体的には、（ＭＤＲ）大腸菌病理発生（例えば、粘膜表面の接着およびコロニー形成、無菌の身体部位の内部における制御されない複製、ならびに、細菌産物による宿主細胞の毒性）の阻害から利益を受ける疾患もしくは状態を処置するために、調節するために、弱めるために、取り消すために、または、そのような疾患もしくは状態に影響を及ぼすために使用される。

【0210】

そのような効果的な量に対応することになる化合物の量は、様々な要因に依存して、例えば、与えられた薬物または化合物、医薬配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、処置されている対象または宿主の正体などに依存して変化することになり、しかし、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定されることが可能である。

【0211】

本明細書中に記載されるような抗体の治療効果的な量、例えば、その必要性のあるヒト患者に与えられる量などは具体的には、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である場合があり、好ましくは５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲、一層より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲、１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲、５ｍｇ／ｋｇまでの範囲である場合があり、だが、より大きい用量が、例えば、急性の疾患状態を処置するために示される場合がある。

【0212】

そのうえ、本発明の抗体の治療効果的な量による対象の処置療法または防止療法は単回投与からなる場合があり、または代替において、一連の複数回の適用を含む場合がある。例えば、抗体が、少なくとも年に１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも月に１回で投与される場合がある。しかしながら、別の実施形態において、抗体が、所与の処置のために１週間あたりおよそ１回から、およそ毎日の投与まで対象に投与される場合がある。処置期間の長さは様々な要因に依存しており、例えば、疾患の重篤度、急性疾患または慢性疾患のどちらか、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性などに依存する。処置または予防のために使用される効果的な投薬量が、特定の処置療法または予防療法の経過にわたって増減することがあることもまた理解されるであろう。投薬量における変化が、この技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって生じ、また、明らかになる場合がある。いくつかの症例では、長期間の投与が要求される場合がある。

【0213】

具体的な局面によれば、本発明は、本明細書中に提供される図において詳述されるような例示的抗体、ならびに、さらなる抗体変化体、具体的には、ＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列によって、または、そうでなければ、図２のＨＣアミノ酸配列およびＬＣアミノ酸配列によって形成される特異的結合部位、あるいは、そのようなＶＨ／ＶＬドメインによって形成される結合部位によって特徴づけられる親抗体と本質的に同じエピトープに結合する変化体を含むさらなる抗体変化体を提供する。そのような抗体は、例えば、親抗体のそれぞれのＣＤＲ配列または抗体配列を改変することによって得られる機能的に活性な変化体抗体である場合がある。本明細書中に記載されるような抗体配列はどれもが、例えば、点変異による変化を受ける「親」配列であると見なされることが十分に理解される。

【0214】

例示的な親抗体が下記の実施例の節において、また、図１および図２において記載される。図２の抗体は、表１の親抗体に由来する変化体抗体、すなわち、２Ａ７、８Ａ１、４Ｄ５および３Ｅ９と称される抗体および異なるＨＣ／ＬＣ組合せを有するそれぞれの変化体に由来する変化体抗体であり、これらはヒト化および必要な場合には親和性成熟によって得られる。これらの変化体抗体は標的抗原に結合し、したがって、機能的に活性であると見なされる。機能的に活性である（例えば、親抗体と同じエピトープに結合する、または、親抗体と同じ結合部位を含む、または、親抗体と同じ結合特徴を有する）変化したＶＨドメインまたはＶＬドメインあるいは変化したＨＣ鎖またはＬＣ鎖（例えば、改変をそれぞれのＦＲ配列またはＣＤＲ配列において有するもの）もまた使用され得ることが実行可能である。本明細書中に記載される抗体のＦＲ配列またはＣＤＲ配列のいくつかが、他の抗体（図１または図２において列挙されるような抗体）のＦＲ配列またはＣＤＲ配列によって交換され得ることもまた実行可能である。

【0215】

抗体は、これらの抗体が交差競合し、その結果、１つの抗体のみが所与の時点でエピトープに結合することができるならば、すなわち、一方の結合が他方の抗体の結合効果または調節効果を妨げるならば、「同じエピトープに結合する」、または、「同じ結合部位を含む」、または、「本質的に同じ結合」特徴を有すると言われる。

【0216】

用語「競合する」または用語「交差競合する」は、抗体に関して本明細書中で使用される場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分が結合するのと十分に類似する様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体がその同族エピトープと結合することの結果が、第１の抗体が第２の抗体の非存在下において結合することと比較して、第２の抗体の存在下において検出可能に低下させられるようになることを意味する。第２の抗体がそのエピトープに結合することもまた、第１の抗体の存在下において検出可能に低下させられる代わりの選択肢が当てはまることが可能であり、しかし、このことは必ずしも当てはまる必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体がそのエピトープに結合することを阻害することができ、第２の抗体が、第１の抗体がそのそれぞれのエピトープに結合することを阻害することは伴わない。しかしながら、それぞれの抗体が、同じ程度に、より大きい程度に、または、より小さい程度にではあるかどうかにかかわりなく、他方の抗体がその同族エピトープと結合することを検出可能に阻害する場合、これらの抗体は、それらのそれぞれのエピトープの結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合する抗体および交差競合する抗体の両方が本発明によって包含される。

【0217】

本明細書中における競合は、競合ＥＬＩＳＡ分析によって、または、ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析によって明らかにされるように、約３０％を超える大きい相対的阻害を意味する。相対的阻害のより大きい閾値を、何が特定の状況（例えば、競合分析が、抗原の結合の意図された機能とともに設計される新しい抗体について選択し、またはスクリーニングするために使用される場合）における競合の好適なレベルであるかの判定基準として設定することが望ましい場合がある。したがって、例えば、競合的結合についての様々な判定基準（少なくとも４０％の相対的阻害が検出される、あるいは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または、それどころか少なくとも１００％の相対的阻害が検出される）を、抗体が十分に競合的であると見なされる前に設定することが可能である。

【0218】

本明細書中に記載されるように、１つの局面において、本発明は、例えば、Ｏ２５ｂ抗原と結合することについて、図１または図２において列挙される抗体のいずれかと競合することができることによって特徴づけられる抗体分子を提供する。

【0219】

Ｏ２５ｂに対して非常に特異的である様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＳＴ１３１系譜に属するＭＤＲ菌株を特定するための診断試薬としての大きい潜在的能力を有する。さらに、ヒト化の後では特に、これらのｍＡｂは、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株によって引き起こされる大腸菌感染症の予防（例えば、高リスク群について）および処置のために使用されるために好適である。

【0220】

Ｏ２５ｂおよびＯ２５ａの炭水化物抗原は、Ｏ２５に対する免疫血清が、Ｏ２５ｂ抗原を発現する大腸菌菌株の診断的特定において日常的に使用されるという事実に基づいて同一である、または非常に類似していると考えられていた。ＳＴ１３１菌株におけるＯ抗原合成の遺伝的背景は完全には解明されなかった。しかしながら、（Ｏ抗原合成をコードする）ｒｆｂクラスターの内部における具体的な遺伝子が、ＰＣＲに基づくＯ２５ｂ抗原の特定の基礎となっている。さらに、構造データは今までのところ、Ｏ２５ａ抗原とＯ２５ｂ抗原との間における違いを何ら裏づけなかった。

【0221】

したがって、本発明の抗体がＯ２５ｂ抗原と特異的に結合し得るかもしれないことは驚くべきことであった。

【0222】

Ｏ２５ｂ抗原発現大腸菌菌株とＯ２５ａ抗原発現大腸菌菌株との間における遺伝的差異を確認するために、Ｏ抗原合成をコードするｒｆｂクラスターが、保存された隣接遺伝子のｇｎｄおよびｇａｌＦに対して特異的であるオリゴヌクレオチドを用いて開始するプライマーウォーク法を使用してＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株８１００９の臨床単離体から配列決定された（Ｓｚｉｊａｒｔｏ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２、３３２：１３１〜６）。ｒｆｂオペロンの得られたコンティグは１１，３００ｂｐの長さであり、Ｏ２５抗原合成酵素をコードするコンティグ（ＮＣＢＩアクセション番号ＧＵ０１４５５４）に対してほんの一部が相同的であるにすぎない。Ｏ２５ｂ ｒｆｂオペロンの３’末端における２０４３ｂｐの長さのセグメントが、Ｏ２５ ｒｆｂオペロンの対応する領域に対して非相同的であり、このセグメントが、フコースの合成および輸送をコードする６２６７ｂｐの長さの配列によって置き換わっていることが判明した。

【0223】

大腸菌ＳＴ１３１から単離されるＬＰＳに存在するＯ特異的なＰＳ生物学的繰り返しユニット（ＲＵ）の構造が、１つの繰り返しユニット（ＲＵ）により置き換わるコアＯＳによって組み立てられる精製分画物において詳しく分析された。ＬＰＳ ＳＴ１３１のＲＵは、図８（ａ）に示される構造を有するＯ−アセチル化五糖である。

【0224】

実際、ＳＴ１３１ Ｏ−ＰＳのＲＵ構造は、Ｋｅｎｎｅ他によって報告されるＬＰＳ Ｏ２５ ＲＵ（図８（ｂ））とは異なり、また、本発明者らが知っている限りでは、この構造は大腸菌リポ多糖の中の新しいＯ−血清型である（Ｓｔｅｎｕｔｚ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２００６（Ｍａｙ）、３０（３）：３８２〜４０３、総説）。加えて、ＬＰＳ ＳＴ１３１から単離されるコアオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法および組成分析（糖分析およびメチル化分析）の予備的結果はＫ−１２タイプを裏づけた。これは、遺伝子分析に基づいて、Ｓｚｉｊａｒｔｏ Ｖ．他によって以前に報告されたことであった（Ｓｚｉｊａｒｔｏ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２、３３２：１３１〜６）。ＬＰＳ ＳＴ１３１が２つの主要なコアオリゴ糖（ＯＳ）グリコフォームからなることが示された。グリコフォームのタイプはＯ特異的多糖（ＰＳ）の有無に依存している。置換されていないコアＯＳの支配的なグリコフォームがＫ−１２のコアオリゴ糖の短縮型であり、これは、→７）−α−Ｈｅｐｐ−（１→６）−α−Ｇｌｃｐ二糖を欠いている。そのような二糖の存在が、Ｏ−ＰＳ置換されたコアＯＳと、非置換のコアＯＳとの間における違いである。

【0225】

具体的な局面により、特異的な抗菌機能活性（例えば、補体媒介の細菌殺傷ならびにオプソニン作用による取り込みおよび殺傷など）によって特徴づけられる本発明の抗体が示される。

【0226】

１つの具体的な実施形態によれば、本発明の抗体は、標準的なＳＢＡアッセイまたはＯＰＫアッセイで測定されるような免疫エフェクター細胞の存在下における細胞毒性活性を有する。細菌殺傷の百分率における有意な増大がコントロールと比較した場合に認められるならば、ＳＢＡアッセイまたはＯＰＫアッセイのどちらかによって求められるような細胞毒性活性が本発明の抗体について示される場合がある。ＳＢＡまたはＯＰＫに関連づけられる殺菌活性が好ましくは、絶対値での百分率の増大として測定され、この場合、絶対値での百分率の増大は好ましくは５％超であり、より好ましくは１０％超であり、一層より好ましくは２０％超、３０％超、４０％超または５０％超である。

【0227】

食作用エフェクター細胞が、補体の活性化を用いる別の経路を介して活性化される場合がある。微生物の表面抗原に結合する抗体はそれらのＦｃ領域により補体カスケードの最初の成分を引き寄せ、「古典的」補体系の活性化を開始させる。これらは、最終的には標的を補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって殺す食作用エフェクター細胞の刺激をもたらす。

【0228】

１つの具体的な実施形態によれば、本発明の抗体は、標準的なＡＤＣＣアッセイまたはＣＤＣアッセイで測定されるような免疫エフェクター細胞の存在下における細胞毒性活性を有する。細菌溶解の百分率における有意な増大がコントロールと比較した場合に認められるならば、ＡＤＣＣアッセイまたはＣＤＣアッセイのどちらかによって求められるような細胞毒性活性が本発明の抗体について示される場合がある。ＡＤＣＣまたはＣＤＣに関連づけられる細胞毒性活性が好ましくは、絶対値での百分率の増大として測定され、この場合、絶対値での百分率の増大は好ましくは５％超であり、より好ましくは１０％超であり、一層より好ましくは２０％超である。補体結合が特異的に関連するかもしれず、この機構により、毒素が、形成された免疫複合体の除去によって感染部位または血液から排出され得る。

【0229】

１つの具体的な実施形態によれば、本発明の抗体は、様々なＩｇＧのＦｃ部分によって発揮される免疫調節機能を有する。シアリル化含有量を、例えば、末端ガラクトース残基において増大させる変化したグリコシル化はおそらくは、ＤＣ−ＳＩＧＮシグナル伝達を介する抗炎症効果を有するかもしれない。Ｉａ型、ＩＩａ型およびＩＩＩ型のＦｃγ受容体を上回るＦｃγ受容体ＩＩｂ（阻害性）に対する優先的結合により、抗炎症効果がおそらくはもたらされるかもしれない。

【0230】

本発明の抗体が、ハイブリドーマ法を用いて特定され、または得られる場合がある。そのような方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターなど）が、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するリンパ球、または産生することができるリンパ球を誘発するために免疫化される。代替において、リンパ球がインビトロで免疫化される場合がある。その後、リンパ球が、好適な融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して、ハイブリドーマ細胞を形成するために骨髄腫細胞と融合される。

【0231】

ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈殿によって、あるいは、インビトロ結合アッセイによって、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められる。

【0232】

例えば、本発明の抗体が、例えば、（莢膜合成をコードする）ｋｐｓクラスターを、カナマイシン抵抗性をコードするカセットにより置換することによる代表的なＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株８１００９の非被包性変異体（例えば、８１００９Δｋｐｓ：：ｋａｎ）によりマウスを免疫化することによって得られる起源（親）抗体から得られる場合がある。このマウスから得られる血清サンプルがその後、分析される場合があり、Ｏ２５ｂ抗原に対する最大のＩｇＧ力価を（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにおいて）示すマウスの脾臓がハイブリドーマ作製のために使用される場合がある。サブクローニングの後、Ｏ２５ｂ抗原に対して特異的である抗体を分泌し、同様にまた、Ｏ２５ｂ抗原を発現する生きた野生型大腸菌菌株の表面に結合したハイブリドーマクローンが選択される場合がある。これらのｍＡｂがその後、Ｏ２５ｂ抗原のその特異的結合について、また、おそらくは、Ｏ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原と優先的に結合するためのその示差的結合親和性についてさらに試験するために、そして、抗体を、例えば、種々の診断目的または治療目的のために設計するためにハイブリドーマ上清から精製される場合がある。

【0233】

示差的に結合する抗体（本明細書中では選択的抗体とも呼ばれる）がいくつかの場合には、ただ１つの抗原に対するスクリーニングにより現れる。示差的に結合するクローンを単離する可能性を増大させるために、多数の選択圧が、異なる抗原に対して順次スクリーニングすることによって加えられるであろう。特別なｍＡｂ選択戦略では、Ｏ２５ｂ成分およびＯ２５ａ成分または他の大腸菌抗原が交互様式で用いられる。

【0234】

所望の選択的結合特性を有する抗体を特定するための様々なスクリーニング方法が、（ファージ、細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞を使用する）ディスプレイ技術によって行われる場合がある。反応性を、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、または、フローサイトメトリーを用いた表面染色に基づいて、例えば、標準的なアッセイを使用して評価することができる。

【0235】

組換え抗原が、例えば、抗体を抗体ライブラリー（例えば、酵母ディスプレイされた抗体ライブラリー）から選択するために使用される場合がある。

【0236】

例えば、本発明は具体的には、Ｏ２５ｂ抗原と結合するための様々な特異性を有する抗体を特定するためのプロセスによって、例えば、特異的な発見選択スキームによって得られるＯ２５ｂ特異的抗体を提供する。したがって、Ｏ２５ｂ標的との反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーが、標的との反応性について選択される場合がある。

【0237】

本発明はさらに具体的には、２つの標的（例えば、Ｏ２５ｂ抗原およびＯ２５ａ抗原）と結合するための様々な特異性を有する抗体を特定するためのプロセスによって、例えば、交差反応性の発見選択スキームなどによって得られる交差特異的抗体を提供する。したがって、２つの標的（標的Ａおよび標的Ｂ）との反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーが最初、これらの標的の一方（例えば、標的Ａ）との反応性について選択され、その後、他方の標的（例えば、標的Ｂ）との反応性について選択される場合がある。それぞれの連続する選択処理により、両方の標的に対する得られたプールの反応強度が強化される。したがって、この方法は、２つの異なる標的に対する交差反応性と、病原体を交差中和する潜在的能力とを有する抗体を特定するために特に有用である。この方法は、さらなる標的（１つまたは複数）に対するさらなる回数の濃縮を含むことによって、さらなる標的に対する反応性を示す抗体を特定することに拡張することができる。

【0238】

いずれの場合においても、選択的結合を、この技術分野で知られている抗体最適化方法によってさらに改善することができる。例えば、本明細書中に記載される免疫グロブリン鎖の可変領域の特定の領域が、軽鎖シャフリング、目的的変異誘発、ＣＤＲ融合、ならびに、選択されたＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域の定方向突然変異誘発を含めて、１つまたは複数の最適化戦略に供される場合がある。

【0239】

所望の特性を有する示差的に結合する抗体が特定されると、抗体によって認識される最も有力なエピトープ（１つまたは複数）が決定される場合がある。エピトープマッピングのための様々な方法がこの技術分野では広く知られており、例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＷｅｓｔｗｏｏｄおよびＨａｙ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１）において開示される。

【0240】

エピトープマッピングは、抗体が結合するエピトープを特定することに関する。多くの方法が、抗体−抗原複合体の結晶学分析、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および、合成ペプチドに基づくアッセイを含めて、タンパク質表面のエピトープまたは炭水化物によって形成されるエピトープの位置を決定するために当業者には知られている。参照抗体と「同じエピトープと結合する」抗体は本明細書中では下記のように理解される。２つの抗体が、同一のエピトープまたは立体的に重なり合うエピトープであるエピトープを認識するとき、これら抗体は、同じエピトープまたは本質的に同じエピトープまたは実質的に同じエピトープと結合するとして示される。２つの抗体が同一のエピトープまたは立体的に重なり合うエピトープに結合するかどうかを明らかにするための一般に使用されている方法が競争アッセイであり、この場合、この競合アッセイは、標識された抗原または標識された抗体のどちらかを使用して、異なる形式のすべてで構成され得る。通常、抗原が９６ウエルプレートに固定化され、非標識の抗体が標識抗体の結合を阻止することができるかが、放射性標識または酵素標識を使用して測定される。

【0241】

所望の結合特性を有する抗体が特定されると、そのような抗体（抗体フラグメントを含む）は、例えば、ハイブリドーマ技術または組換えＤＮＡ技術を含めて、この技術分野では広く知られている様々な方法によって製造することができる。

【0242】

組換えモノクローナル抗体を、例えば、要求される抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、組換え宿主細胞を、広く知られている組換え発現ベクター（例えば、抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット）を使用して発現のためのコード配列によりトランスフェクションすることによって製造することができる。組換え宿主細胞は原核生物細胞および真核生物細胞（例えば、上記で記載される細胞など）が可能である。

【0243】

具体的な局面によれば、ヌクレオチド配列が、抗体をヒト化するために、あるいは、抗体の親和性または他の特徴を改善するために遺伝子操作のために使用される場合がある。例えば、抗体がヒトでの臨床試験および処置において使用されるならば、免疫応答を回避するために、定常領域が、ヒトの定常領域と一層ほとんど似ているように設計される場合がある。標的Ｏ２５ｂに対するより大きい親和性、および、ＭＤＲ大腸菌に対するより大きい効力を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。１つまたは複数のポリヌクレオチド変化が抗体に対して行われ、標的Ｏ２５ｂに対するその結合能を依然として維持し得ることが当業者には明らかであろう。

【0244】

様々な手段によって行われるが、抗体分子の製造が一般に広く理解されている。例えば、米国特許第６３３１４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙ他）は、抗体を組換え製造するための方法であって、重鎖および軽鎖が、ただ１つのベクターから、または、２つの別個のベクターから１つの細胞において同時に発現させられる方法を記載する。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒ他（１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４３０（２）：１９１〜２０２）、ならびに、ＬｅｅおよびＫｗａｋ（２００３、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０１：１８９〜１９８）は、大腸菌の別個の培養において発現させられるプラスミドを使用する、別々に製造された重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の製造を記載する。抗体の製造に関連した様々な他の技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８））において提供される。

【0245】

所望されるならば、本発明の抗体（例えば、図１または図２の抗体のいずれも）が配列決定される場合があり、その後、ポリヌクレオチド配列が発現または伝播のためのベクターにクローン化される場合がある。抗体をコードする配列が宿主細胞においてベクターに維持される場合があり、その後、宿主細胞は拡大培養し、将来の使用のために凍結することができる。組換えモノクローナル抗体を細胞培養で製造することが、抗体遺伝子をこの技術分野で知られている手段によってＢ細胞からクローニングすることにより行うことができる。

【0246】

別の局面において、本発明は、本発明の組換え抗体の製造のためにコードする配列を含む単離された核酸を提供する。

【0247】

抗体をコードする核酸は、どのような特性であれ、好適な特性を有することができ、また、どのような特徴であれ、好適な特徴またはその組合せを含むことができる。したがって、例えば、抗体をコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドの形態であってもよく、天然に存在しない塩基、改変された骨格（例えば、核酸の安定性を増進させるホスホロチオアート骨格）または両方を含む場合がある。核酸は好都合には、標的宿主細胞における所望される発現、複製および／または選択を増進させる特徴を含む本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミドに組み込まれる場合がある。そのような特徴の例には、複製起点成分、選択遺伝子成分、プロモーター成分、エンハンサーエレメント成分、ポリアデニル化配列成分および終結成分などが含まれ、それらの数多くの好適な例が知られている。

【0248】

本開示はさらに、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換え構築物は、いずれかの開示された抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるベクター（例えば、プラスミドベクター、ファージミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターなど）に関連して使用される。

【0249】

様々なモノクローナル抗体が、どのような方法であれ、抗体分子を培養における継続的な細胞株によって産生させる方法を使用して製造される。モノクローナル抗体を調製するための好適な方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）のハイブリドーマ法、および、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１；および、Ｂｒｏｄｅｕｒ他、１９８７、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、５１頁〜６３頁）が含まれる。

【0250】

本発明はさらには、本明細書中に記載されるような抗体と、医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、本発明に従って、ボーラス注射またはボーラス注入として、あるいは、連続注入によって投与することができる。投与のそのような手段を容易にするために好適である様々な医薬用キャリアがこの技術分野では広く知られている。

【0251】

医薬的に許容されるキャリアには一般に、本発明によって提供される抗体あるいは関連した組成物または組合せと生理学的に適合し得るありとあらゆる好適な溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容されるキャリアのさらなる例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、同様にまた、それらのいずれかの組合せが含まれる。

【0252】

１つのそのような局面において、抗体は、所望の投与経路に適切である１つまたは複数のキャリアと組み合わせることができ、様々な抗体が、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合される場合があり、また、必要な場合にはさらに、従来的な投与のために錠剤化またはカプセル化される場合がある。代替において、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴムおよび／または様々な緩衝剤に溶解される場合がある。他のキャリア、補助剤および投与様式が製薬分野では広く知られている。キャリアには、制御放出材料または時間遅延材料（例えば、単独での、またはワックスと一緒でのグリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなど）、あるいは、この技術分野では広く知られている他の材料が含まれる場合がある。

【0253】

さらなる医薬的に許容されるキャリアがこの技術分野では知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載される。液体配合物は、溶液、乳濁液または懸濁物であることが可能であり、様々な賦形剤（例えば、懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤およびキレート化剤など）を含むことができる。

【0254】

本発明の抗体と、１つまたは複数の治療活性な薬剤とが配合される医薬組成物が意図される。本発明の抗体の安定な配合物が、所望される程度の純度を有する前記免疫グロブリンを必要に応じて使用される医薬的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と混合することによって貯蔵のために、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で調製される。インビボ投与のために使用されるための配合物は具体的には無菌であり、好ましくは、無菌の水溶液の形態である。このことが、無菌ろ過膜によるろ過または他の方法によって容易に達成される。本明細書中に開示される抗体および他の治療活性な薬剤はまた、免疫リポソームとして配合される場合があり、かつ／または、マイクロカプセルに封入される場合がある。

【0255】

本発明の抗体を含む医薬組成物の投与が、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所的（例えば、ゲル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、吸入可能技術または肺送達システムを用いて）、膣的、非経口、直腸または眼内を含めて、様々な方法で行われる場合がある。

【0256】

非経口投与のために使用されるような例示的配合物には、例えば、無菌の溶液、乳濁液または懸濁物として、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射のために好適である配合物が含まれる。

【0257】

１つの実施形態において、本発明の抗体は、例えば、疾患緩和または疾患防止の単独療法として対象に投与される唯一の治療活性薬剤である。

【0258】

別の実施形態において、本発明の抗体は、大腸菌を標的とするために、カクテルにおいてさらなる抗体と組み合わされ、例えば、混合物において、または部分品からなるキットにおいて組み合わされ、その結果、カクテルが、例えば、疾患緩和または疾患防止の併用療法として対象に投与される２つ以上の治療活性薬剤を含有するようにされる。

【0259】

さらに、本発明の抗体は、１つまたは複数の他の治療剤または予防剤との組合せで投与される場合があり、これには、標準的処置（例えば、抗生物質、炎症のステロイド系阻害剤および非ステロイド系阻害剤）、および／または、抗体に基づく他の治療、例えば、抗菌剤または抗炎症剤を用いる処置が含まれるが、それらに限定されない。

【0260】

併用療法は、例えば、ＭＤＲ大腸菌感染を処置するために使用されるような標準療法を特に用いることである。これには、抗生物質（例えば、チゲサイクリン（ｔｙｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リネゾリド、メチシリンおよび／またはバンコマイシン）が含まれる場合がある。

【0261】

併用療法において、抗体は混合物として、あるいは、１つまたは複数の他の治療療法に関して付随して、例えば、併用治療の前に、併用治療と同時に、または併用治療の後でのいずれかで投与される場合がある。

【0262】

本発明の抗体またはそれぞれの医薬調製物の生物学的特性が、細胞、組織および生物体での実験においてエクスビボで特徴づけられる場合がある。この技術分野では知られているように、薬物は多くの場合、薬物の効力を疾患または疾患モデルに対する処置について評価するために、あるいは、薬物の薬物動態学、薬力学、毒性および他の性質を評価するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサル（これらに限定されない）を含めて、様々な動物においてインビボで試験される。動物は疾患モデルとして示される場合がある。治療剤は多くの場合、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび遺伝子組換えマウス（ノックイン体およびノックアウト体を含む）（これらに限定されない）を含めて、マウスにおいて試験される。そのような実験は、適切な半減期、エフェクター機能、（交差）中和活性および／または免疫応答を能動免疫療法または受動免疫療法のときに伴う治療剤として、または予防剤として使用されるための抗体の潜在的能力を決定するための意味のあるデータを提供する場合がある。どのような生物も、好ましくは哺乳動物が試験のために使用される場合がある。例えば、ヒトに対するそれらの遺伝的類似性のために、霊長類、サルが、好適な治療モデルであることが可能であり、したがって、対象とする薬剤または組成物の効力、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期または他の性質を試験するために使用される場合がある。ヒトにおける試験が最終的には、薬物としての承認のために要求され、したがって、当然のことながら、これらの実験が意図される。したがって、本発明の抗体およびそれぞれの医薬組成物が、それらの治療効力もしくは予防効力、毒性、免疫原性、薬物動態学および／または他の臨床特性を明らかにするためにヒトにおいて試験される場合がある。

【0263】

本発明はまた、本発明の主題抗体を診断目的のために、例えば、生物学的流体サンプルにおける免疫試薬または標的としての細菌負荷または抗体を検出し、その濃度を定量的に決定する方法における使用のために提供する。

【0264】

本発明はまた、生物学的サンプルにおける敗血症またはＭＤＲ大腸菌感染の程度、例えば、ＭＤＲ大腸菌によるサンプル（例えば、体液など）への負荷を検出するための方法であって、サンプルを本発明の抗体と接触させることを含む方法を提供する。本発明の抗体は、どのようなアッセイ方法であれ、知られているアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、免疫沈殿アッセイならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）において用いられる場合がある。

【0265】

好ましい診断アッセイが下記のように行われる。標的抗原特異的な抗体が、体液に存在する細菌または体液から単離される細菌とインキュベーションされるラテックスビーズに固定化される。陽性の反応を、細菌の表面に発現される対応する同族抗原の存在下における（おそらくは着色された）ラテックスビーズの凝集に起因して肉眼によって検出することができる。

【0266】

本発明に従って使用されるような体液には、対象の生物学的サンプル、例えば、組織抽出物、尿、血液、血清、便および痰などが含まれる。

【0267】

１つの実施形態において、方法は、固体支持体を、抗体が固体支持体の表面に結合することを可能にする条件のもと、標的との複合体を特異的に形成する過剰なある種のタイプの抗体フラグメントと接触させることを含む。抗体が結合させられる生じた固体支持体がその後、生物学的流体サンプルと接触させられ、その結果、生物学的流体中の標的が抗体に結合し、標的−抗体複合体を形成する。複合体は検出可能なマーカーにより標識されることが可能である。代替において、標的または抗体のどちらかが複合体形成の前に標識されることが可能である。例えば、検出可能なマーカー（標識）を抗体にコンジュゲート化することができる。複合体はその後、検出され、定量的に決定され、それにより、生物学的流体サンプルにおける標的を検出し、その濃度を定量的に決定することができる。

【0268】

特定の適用のために、本発明の抗体は、有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光性標識、発色標識、発光性標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド状金およびこれらの混合物からなる群から選択される標識またはレポーター分子にコンジュゲート化される。標識またはレポーター分子にコンジュゲート化された抗体は、例えば、アッセイシステムまたは診断方法において、例えば、大腸菌感染またはそれに伴う疾患状態を診断するために使用される場合がある。

【0269】

本発明の抗体は、例えば、結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）および結合研究における前記コンジュゲートの簡便な検出を可能にする他の分子にコンジュゲート化される場合がある。

【0270】

本発明の別の局面は、抗体を含むキットで、１つまたは複数の抗体に加えて、様々な診断剤または治療剤を含むことがあるキットを提供する。キットはまた、診断方法または治療方法における使用のための説明書を含む場合がある。そのような説明書は、例えば、キットに含まれるデバイスについて提供されることが可能であり、例えば、生物学的サンプルを診断目的のために調製するためのツールまたはデバイス（例えば、疾患を診断するためのＭＤＲ大腸菌負荷量を明らかにする前に細胞および／またはタンパク質含有画分を分離することなどのために調製するためのツールまたはデバイス）について提供されることが可能である。代替において、そのようなキットは、本明細書中に記載される様々な診断方法の１つまたは複数において使用することができる抗体および診断剤または診断試薬を含む。別の好ましい実施形態において、キットは、抗体、例えば、凍結乾燥形態での抗体を、必要な場合には凍結乾燥物を再構成するための説明書および媒体を含んで、ならびに／あるいは、間近の投与のための注射可能な組成物を形成するために使用前に混合することができる医薬的に許容されるキャリアとの組合せで含む。

【0271】

８Ｄ５−１Ｇ１０および８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体、具体的にはこれらの抗体軽鎖および／または抗体重鎖のいずれもが、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ／Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ））に寄託された生物学材料によってさらに特徴づけられる。

【0272】

寄託物は、形質転換された大腸菌培養物を示し、この場合、それぞれが、目的とする遺伝子の挿入物がクローン化されたプラスミドを含有する。目的とする遺伝子は、マウスモノクローナル抗体８Ｄ５−１Ｇ１０（ＩｇＧ３）の重鎖および軽鎖の可変ドメイン、ならびに、マウスモノクローナル抗体８Ｄ１０−Ｃ８（ＩｇＧ２ｂ）の重鎖および軽鎖の可変ドメインである。

【0273】

ＤＳＭ２６７６３は、８Ｄ５−１Ｇ１０の軽鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＬＣ）の可変ドメインをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ５−１Ｇ１０−ＶＬ＝ＤＳＭ２６７６３、寄託日：２０１３年１月１５日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ（ウィーン、オーストリア）。

【0274】

ＤＳＭ２６７６２は、８Ｄ５−１Ｇ１０の重鎖（８Ｄ５−１Ｇ１０−ＨＣ）の可変ドメインをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ５−１Ｇ１０−ＶＨ＝ＤＳＭ２６７６２、寄託日：２０１３年１月１５日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ（ウィーン、オーストリア）。

【0275】

ＤＳＭ２８１７１は、８Ｄ１０−Ｃ８の軽鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＬＣ）の可変ドメインをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ１０−Ｃ８−ＶＬ＝ＤＳＭ２８１７１、寄託日：２０１３年１２月１１日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ（ウィーン、オーストリア）。

【0276】

ＤＳＭ２８１７２は、８Ｄ１０−Ｃ８の重鎖（８Ｄ１０−Ｃ８−ＨＣ）の可変ドメインをコードする配列を含むプラスミドにより形質転換された大腸菌宿主細胞である。大腸菌８Ｄ１０−Ｃ８−ＶＨ＝ＤＳＭ２８１７２、寄託日：２０１３年１２月１１日；寄託者：Ａｒｓａｎｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ（ウィーン、オーストリア）。

【0277】

下記定義の主題は、本発明の実施形態であると見なされる。

【0278】

１．表１において列挙されるようなＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ３配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ３配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を少なくとも含む、大腸菌菌株のＯ２５ｂ抗原に特異的に結合する単離された抗体。

【0279】

２．定義１の抗体であって、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｘｉｖ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号３４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉｉ）
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｘ）
ａ）配列番号４４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘ）
ａ）配列番号５０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉ）
ａ）配列番号５０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｉ）
ａ）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｉｉ）
ａ）配列番号６１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｘｉｖ）
ａ）配列番号６６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体。

【0280】

３．定義１または定義２の抗体であって、
ａ）図２に示されるようなＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列のＶＨアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列；あるいは
ｃ）配列番号１８４〜配列番号２３１のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸の欠失および／またはＱ１Ｅ点変異（ただし、ＶＨ配列の最初のアミノ酸がＱである場合）をさらに含む抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列
を含む、抗体。

【0281】

４．定義１〜３のいずれかに記載の抗体であって、表１において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む抗体。

【0282】

５．定義４記載の抗体であって、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｘｉｖ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉｉｉ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号４３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｘ）
ａ）配列番号４７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘ）
ａ）配列番号５３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号５４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉ）
ａ）配列番号５７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号５４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｉ）
ａ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｉｉ）
ａ）配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｘｉｖ）
ａ）配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体。

【0283】

６．定義４または５記載の抗体であって、
図２に示されるようなＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２４８〜配列番号２９５のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは、配列番号２４８〜配列番号２９５のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む抗体。

【0284】

７．定義１の抗体であって、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ抗原に共通するエピトープに交差特異的に結合する抗体。

【0285】

８．定義７記載の抗体であって、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｖｉｉ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号７２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号８１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号８４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号９２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
ｖｉｉ）
ａ）配列番号９５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体。

【0286】

９．定義７または８記載の抗体であって、
ａ）図２に示されるようなＶＨ配列のいずれかから選択されるＶＨアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列のＶＨアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかである抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列；あるいは
ｃ）配列番号２３２〜配列番号２４７のいずれかまたは配列番号３１２〜配列番号３１５のいずれかであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸の欠失および／またはＱ１Ｅ点変異（ただし、ＶＨ配列の最初のアミノ酸がＱである場合）をさらに含む抗体重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列
を含む抗体。

【0287】

１０．定義７〜９のいずれかに記載の抗体であって、さらに、表１において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＫａｂａｔの番号表記システムに従って示される）または表２において列挙されるようなＣＤＲ４配列〜ＣＤＲ６配列（これらはＩＭＧＴ番号表記システムに従って示される）あるいはそれらの機能的に活性なＣＤＲ変化体のいずれかを含む抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体。

【0288】

１１．定義１０記載の抗体であって、
Ａ）
下記の群要素ｉ）〜群要素ｖｉ）からなる群から選択される：
ｉ）
ａ）配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉ）
ａ）配列番号７５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｉｉ）
ａ）配列番号６９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号７１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｉｖ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号８７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖ）
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
ｖｉ）
ａ）配列番号４２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ４と、
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ５と、
ｃ）配列番号８８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ６と
を含む抗体である；
あるいは
Ｂ）Ａの前記群要素のいずれかである親抗体の機能的に活性な変化体である抗体で、前記親抗体のＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的な活性なＣＤＲ変化体を含む抗体。

【0289】

１２．定義１〜１２のいずれかに記載の抗体であって、
図２に示されるようなＶＬ配列のいずれかから選択されるＶＬアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２９６〜配列番号３１１のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは、配列番号２９６〜配列番号３１１のいずれかまたは配列番号３１６〜配列番号３１９のいずれかである抗体軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む、定義１０または定義１１に記載の抗体。

【0290】

１３．下記の配列：
ａ）表１において列挙されるような抗体のいずれかのＣＤＲ１配列〜ＣＤＲ６配列、または、
ｂ）図２に示されるような抗体のいずれかのＶＨ配列およびＶＬ配列、または、
ｃ）図２において列挙されるような抗体のいずれかのＨＣ配列およびＬＣ配列
を含み、あるいは
ｄ）ａ）〜ｃ）の配列によって特徴づけられる親抗体の機能的に活性な変化体であり、
好ましくは、
ｉ．前記機能的に活性な変化体は前記親抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかの少なくとも１つの機能的に活性なＣＤＲ変化体を含み、かつ／または
ｉｉ．前記機能的に活性な変化体は少なくとも１つの点変異を前記親抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列ならびに／あるいはＨＣ配列およびＬＣ配列のいずれかのフレームワーク領域において含み、場合により、Ｑ１Ｅ点変異（ＶＨフレームワーク領域（ＶＨ ＦＲ１）の最初のアミノ酸がＱである場合）を含み、
さらには
ｉｉｉ．前記機能的に活性な変化体は、前記親抗体と同じエピトープと結合するための特異性を有し、かつ／あるいは
ｉｖ．前記機能的に活性な変化体は、前記親抗体のヒト変化体、ヒト化変化体、キメラ変化体またはマウス変化体および／または親和性成熟化変化体である、抗体。

【0291】

１４．８Ｄ５−１Ｇ１０または８Ｄ１０−Ｃ８と称される抗体の機能的に活性な誘導体であり、少なくとも１つの点変異をＣＤＲ１〜ＣＤＲ６のいずれかにおいて含み、好ましくは、８Ｄ５−１Ｇ１０および８Ｄ１０−Ｃ８とそれぞれ称される抗体と同じエピトープと結合するための特異性を有する、定義１３に記載の抗体。

【0292】

１５．表１において列挙されるようなＣＤＲ配列のいずれかの機能的に活性なＣＤＲ変化体を含み、前記機能的に活性なＣＤＲ変化体が、
ａ）元のＣＤＲ配列における１つ、２つまたは３つの点変異；ならびに／あるいは
ｂ）元のＣＤＲ配列の４つのＣ末端アミノ酸位置もしくは４つのＮ末端アミノ酸位置または４つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける１つまたは２つの点変異；ならびに／あるいは
ｃ）元のＣＤＲ配列との少なくとも６０％の配列同一性
のうちの少なくとも１つを含む、定義１〜１４のいずれかに記載の抗体。

【0293】

１６．前記機能的に活性なＣＤＲ変化体が、１つまたは２つの点変異を、４個未満または５個未満のアミノ酸からなるいずれかのＣＤＲ配列において含む、定義１５に記載の抗体。

【0294】

１７．ＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を含み、前記ＣＤＲ配列およびフレームワーク配列の少なくとも１つが、ヒト配列、ヒト化配列、キメラ配列、マウス配列または親和性成熟化配列を含み、好ましくは、前記フレームワーク配列がＩｇＧ抗体のものである、定義１〜１６のいずれかに記載の抗体。

【0295】

１８．Ｏ２５ｂ抗原と１０^−６Ｍ未満のＫｄにより、好ましくは１０^−７Ｍ未満または１０^−８Ｍ未満のＫｄにより結合するための親和性を有する、定義１〜１７のいずれかに記載の抗体。

【0296】

１９．大腸菌のＯ２５ａ抗原と比較してＯ２５ｂ抗原に優先的に結合し、または、少なくとも両方の抗原に対する同等の親和性により結合する、定義１〜１８のいずれかに記載の抗体。

【0297】

２０．全長のモノクローナル抗体、抗原結合部位を取り込む少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体フラグメント、または、抗原結合部位を取り込む少なくとも１つの抗体ドメインを含む融合タンパク質である、定義１〜１９のいずれかに記載の抗体。

【0298】

２１．大腸菌感染症の危険性がある対象、または、大腸菌感染症に罹患している対象を処置することにおける使用で、前記対象における前記感染症を制限するために、または、前記感染症から生じる疾患状態を改善するために、好ましくは、腎盂腎炎、二次的菌血症、敗血症、腹膜炎、髄膜炎および人工呼吸器関連肺炎の処置または予防のために、効果的な量の前記抗体を前記対象に投与することを含む使用のための、定義１〜１９のいずれかに記載の抗体。

【0299】

２２．定義１〜２０のいずれかに記載の抗体を含み、好ましくは非経口用配合物または粘膜用配合物を含み、場合により医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する医薬調製物。

【0300】

２３．大腸菌菌株によって引き起こされる対象における大腸菌感染症または大腸菌菌血症を、例えば、上部尿路感染症および下部尿路感染症（膀胱炎、尿道炎、上行性または血行性の腎盂腎炎を含む）などをとりわけ糖尿病患者において、同様にまた、菌血症、敗血症、腹膜炎または腸管コロニー形成とともに明らかにするための診断使用のための、定義１〜２０のいずれかに記載の抗体。

【0301】

２４．定義１〜２０のいずれかに記載の抗体の診断用調製物であって、前記抗体およびさらなる診断試薬を組成物または部分品のキットにおいて含み、下記の成分：
ａ）前記抗体；および
ｂ）前記さらなる診断試薬；
ｃ）ならびに、必要な場合には、前記抗体および前記診断試薬の少なくとも１つを固定化するための固相
を含む診断用調製物。

【0302】

２５．大腸菌菌株によって引き起こされる対象における大腸菌感染症または大腸菌菌血症を診断する方法であって、
ａ）定義１〜２０のいずれかに記載の抗体を提供すること、および
ｂ）前記抗体が、試験される前記対象の生物学的サンプルにおけるＯ２５ｂ抗原と特異的に免疫反応するかを、好ましくは凝集試験によって検出し、それにより、ＭＤＲ大腸菌の感染症または菌血症を診断すること
を含む方法。

【0303】

２６．定義１〜２０のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。

【0304】

２７．ａ）定義１〜２０のいずれかに記載の抗体のＶＨおよび／またはＶＬ；あるいは
ｂ）あるいは、定義１〜２０のいずれかに記載の抗体のＨＣおよび／またはＬＣ
を発現させるためのコード配列を含む発現カセットまたはプラスミド。

【0305】

２８．定義２７に記載の発現カセットまたはプラスミドを含む宿主細胞。

【0306】

２９．定義１〜２０のいずれかに記載の抗体を製造する方法であって、定義２８に記載の宿主細胞が、前記抗体を産生させるための条件のもとで培養または維持される、方法。

【0307】

前記記載は、下記の実施例を参照してより十分に理解されるであろう。しかしながら、そのような実施例は、本発明の１つまたは複数の実施形態を実施する様々な方法を単に表しているだけであり、発明の範囲を限定するものとして理解してはならない。

【実施例】

【0308】

実施例１：Ｏ２５ｂ特異的抗体の作製
代表的なＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株８１００９の非被包性変異体（８１００９Δｋｐｓ：：ｋａｎ［Ｓｚｉｊａｒｔｏ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２］）を、（莢膜合成をコードする）ｋｐｓクラスターを、カナマイシン抵抗性をコードするカセットにより置換することによって作製した。亜致死用量のこの変異体の生細胞またはホルムアルデヒド不活化細胞、同様にまた、亜致死用量の親野生型菌株を使用して、マウスを２週間間隔で４回免疫化した。続いて、これらのマウスから得られる血清サンプルを分析し、Ｏ２５ｂ抗原に対する最大のＩｇＧ力価を（ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティングおよび表面染色において）示すマウスの脾臓をハイブリドーマ作製のために使用した。サブクローニングの後、精製されたＯ２５ｂ抗原に対して特異的である抗体を分泌し、同様にまた、Ｏ２５ｂ抗原を発現する生きた野生型大腸菌菌株の表面に結合したいくつかのハイブリドーマクローンを選択した。作製されたマウス抗体はすべての可能なマウスアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）に及んだ。Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを、縮重した重鎖プライマーおよび軽鎖プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用することによってハイブリドーマクローンから増幅し、配列決定した。配列をＩｇデータベースについてはＢＬＡＳＴにより分析し、同様にまた、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴにより分析し、ＣＤＲ領域をＫａｂａｔ命名法に従って定義した（図１、表１）。

【0309】

選択したハイブリドーマクローンをキメラｍＡｂとして発現させた（すなわち、マウス可変領域をヒトＩｇＧ１定常ドメインに融合し、同様にまた、カッパ軽鎖に融合した）。そのうえ、ヒト化ｍＡｂを、超可変（ＣＤＲ）マウス配列を、元のマウス・フレームワークに対して最も適合し得ることがインシリコ予測されたヒト・フレームワーク配列にグラフト化することによって作製した。これらのキメラｍＡｂおよびヒト化ｍＡｂを哺乳動物細胞によって発現させ、プロテインＡカラムに通して精製し、その後の実施例（下記参照）において示されるアッセイにおいて使用した。

【0310】

実施例２：結合特性
キメラｍＡｂおよびヒト化ｍＡｂの特異性を、精製されたＬＰＳを使用する免疫ブロット分析によって確認した（図３）。すべてのｍＡｂが、Ｏ２５ｂ抗原を含有するＳＴ１３１菌株から得られるＬＰＳ分子を認識し、しかしながら、Ｏ２５ａ ＬＰＳ抗原に対するそれらの交差反応能において異なっていた。いくつかのｍＡｂがもっぱらＯ２５ｂ抗原に対して反応した一方で、（系譜４Ｄ５から得られる）いくつか（図４ｉｉ、中段パネル）がＯ２５ａに対して交差反応性であった。これらのｍＡｂのどれもが、無関係のＯ抗原（例えば、Ｏ５５）を有するＬＰＳ分子には反応しなかった。抗体結合特性をさらに、バイオレイヤー・インフェロメトリー（ＢＬＩ）によって調べた。Ｏ２５ｂ ｍＡｂ（キメラ体およびヒト化体）のビオチン化Ｏ２５ｂ多糖に対する結合を、ビオチン化抗原をストレプトアビジンセンサー（ＦｏｅｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化し、事前に負荷されたセンサーに対するｍＡｂ（８〜１０μｇ／ｍｌ）の会合を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて１０分間、その後、同じ緩衝液における解離を（５分間）モニターすることによって行った。Ｋ_ｄ値、ｋ_ｏｎ値およびｋ_ｏｆｆ値を、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ７ソフトウエア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して求めた。調べたすべてのｍＡｂがこの設定では９．５ｎＭ〜２１１ｎＭの間での強い結合親和性を示した（図４）。

【0311】

細菌表面の生来型抗原に対するｍＡｂの結合をフローサイトメトリーによって調べた。すべての抗体が、ＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ：Ｈ４菌株であることが決定されたいくつかの異なる臨床分離体に結合した。Ｏ２５ａ抗原を発現する菌株に対する結合に関して、２つのタイプのｍＡｂが特定された。１つの群はＯ２５ａ菌株の表面に結合せず、一方で、他方の群のｍＡｂは、関連したＯ２５ａ菌株を発現する菌株に対して交差反応性であった。しかしながら、これらのｍＡｂのどれもが、無関係の抗原（Ｏタイプ）を発現するどの大腸菌菌株には結合することができなかった（図５ｉ）。フローサイトメトリー測定（図５ｉ）および免疫ブロッティング（図３）によって示される交差反応性の間における良好な相間が認められた。

【0312】

表面結合をより詳しく調べるために、ＳＴ１３１菌株３Ｏ（Ｎｏｖａｉｓ Ａ．他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２０１２、５６（５）：２７６３〜６）を成長の中期対数期までＬＢ（すなわち、一般的な研究室用成長培地）または（インビボ様の生育条件を模擬するための）不活化ヒト血清のどちらかで培養し、洗浄後、０．０２５μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの希釈範囲での精製されたＯ２５ｂ反応性ｍＡｂにより染色した。洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識された抗ヒトＩｇＧを４μｇ／ｍＬの濃度で加え、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）によって測定した。図５ｉｉ）Ａに示される代表的な実験により、試験されたすべてのｍＡｂが、調べられた菌株の表面に用量依存的様式で結合することができることが確認された。結合強度が、細菌を（ＬＢに対して）血清中で成長させたときには幾分か低下し、しかしながら、試験されたすべてのｍＡｂについては非常に著しいままであった（図５ｉｉ）Ｂ）。表面結合がＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ菌株内の遺伝的差異に関係ないことを証明するために、異なるパルソタイプを含むＳＴ１３１菌株の十分に特徴づけられたパネルを調べた（Ｐｅｉｒａｎｏ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２０１４、５８（７）：３７６２）。図５ｉｉ）Ｃにまとめられるデータにより、調べられた３つすべてのｍＡｂが、パルソタイプ「Ｏ」（これは、ＳＴ１３１：Ｏ１６系譜に属することが実際に報告されていた）についての菌株を除くすべての代表的な菌株の表面を強く染色することが証明された。したがって、フローサイトメトリー実験は、ＳＴ１３１：Ｏ２５ｂ系譜全般にわたる幅広い結合スペクトルを証明することができ、また、細菌がヒト血清中で（すなわち、インビボ様条件のもとで）成長させられたときには、この結合が保持された。

【0313】

実施例３：Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂの抗菌効果
選択されたＯ２５ｂ特異的なキメラｍＡｂおよびヒト化ｍＡｂ（Ｏ２５ａに対する交差反応性の有無にかかわらず）の潜在的な保護効果を致死的なマウス菌血症モデルにおいて調べた。５匹のマウスの群に、１００μｇの精製ｍＡｂをＰＢＳにおいて腹腔内に与えた。２４時間後、マウスを、Ｏ２５ｂ抗原を発現する大腸菌菌株ＳＴ１３１ ８１００９（［Ｓｚｉｊａｒｔｏ他（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２、３３２：１３１〜６））の（先行実験で事前に決定される）致死用量によって静脈内投与により抗原攻撃した。２４時間後、マウスを、Ｏ２５ｂ抗原を発現することが証明される大腸菌ＳＴ１３１の菌株８１００９（Ｓｚｉｊａｒｔｏ他、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ、２０１２、３３２：１３１〜６）の致死用量（先行実験で事前に決定されるような１０^８ＣＦＵ）によって静脈内投与により抗原攻撃した。マウスの致死率を毎日モニターした。図６ｉ）は、無関係な特異性を有するコントロールｍＡｂの１００μｇにより免疫化されたマウスの１００％が感染により死亡した一方で、試験されたすべてのＯ２５ｂ特異的ｍＡｂは、モニターされる感染後１４日の期間にわたる生存における統計学（ログランク検定）的に有意な増大を証明したことを示す。

【0314】

このインビボデータを裏づけるために、精製ｍＡｂの抗菌効果もまたインビトロで調べた。細菌を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスまたは熱不活化された正常なヒト血清において成長の中期対数期にまで成長させた。２ｍｌの細菌培養液をＰＢＳで２回洗浄した。血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）を、カルシウムおよびマグネシウムが補充されるＤＰＢＳにより希釈される５０％枯渇化ヒト血清プールにおいて行った。反応混合物は、ＬＢまたは血清で成長させた中期対数期の細菌懸濁物からの約５×１０^３ＣＦＵと、２．５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのｍＡｂとをそれぞれ含有した。抗体を何ら伴わない混合物、および、アイソタイプ一致の無関係なｍＡｂを伴う混合物をコントロールとして含めた。細菌を、４１０ＲＰＭで振とうすることを伴う３７℃での３時間のインキュベーション（ＬＢ成長細菌の場合）または５時間のインキュベーション（血清成長細菌の場合）の後での適切な希釈物を平板培養することによって計数した。特異的ｍＡｂによって媒介される殺傷を、接種物（開始ＣＦＵ）に対するパーセントとして（図７ｉ）、または、
殺傷（％）＝１００−（［ＣＦＵ（ｍＡｂ）／ＣＦＵ（抗体非存在）］＊１００） （図７ｉｉ）
として表した。

【0315】

図７ｉ）に示されるように、試験されたすべてのｍＡｂが、３時間の試験期間にわたるＣＦＵを有意に低下させることができた。対照的に、無関係なｍＡｂと混合された、または抗体と混合されなかった細菌は成長をこの培地において示した。補体が（３０分間の５６℃でのインキュベーションによって）血清サンプルにおいて不活化された場合には、細菌殺傷がどのｍＡｂによっても認められなかった（データは示されず）。これらの結果により、Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂ（Ｏ２５ａに対する交差反応性の有無にかかわらず）は補体媒介の殺菌作用を引き起こすことができることが証明される。

【0316】

さらなる実験により、この活性が確認された（図７ｉｉ）。アイソタイプ一致の無関係なｍＡｂは殺菌活性を誘発することができなかった一方で、すべての抗Ｏ２５ｂ ｍＡｂは、ＣＦＵを試験された両方のＳＴ１３１−Ｏ２５ｂ菌株に対する３時間の試験期間にわたって有意に低下させることができた（図７ｉｉのＡ、ＢおよびＤ）。細菌殺傷が、補体が（３０分間の５６℃でのインキュベーションによって）血清サンプルにおいて熱不活化された場合にはどのｍＡｂによっても認められなかった（データは示されず）。これらの結果により、Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂ（Ｏ２５ａに対する交差反応性の有無にかかわらず）は補体媒介の殺菌作用を引き起こすことができることが証明される。この作用様式が、認められたインビボ保護（上記参照）において関連性があるかもしれないことを確認するために、本発明者らは、（細菌培養培地、すなわち、ＬＢとは対照的に）ヒト血清で成長させた細菌を使用する同じアッセイを行った。細菌を「インビボ様」条件のもとで成長させることの重要性が、細菌の表面、および、したがって、抗原の接触可能性が、表面の細菌成分の発現時の再編成のために、異なる条件で成長させられたときには非常に異なることがあるということである（Ｍｉａｊｌｏｖｉｃ Ｈ他、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、８２：２９８〜３０５、２０１４）。図７ｉｉＣに示されるように、Ｏ２５ｂ特異的なヒト化ｍＡｂは、細菌をヒト血清において前処理した後（すなわち、成長させた後）でさえ有意な細菌殺傷を引き起こすことができた。しかしながら、最大の殺菌効果のためには、より大きいｍＡｂ用量（１０μｇ／ｍｌ）、同様にまた、より長いインキュベーション期間（５時間）が必要であった。

【0317】

実施例４．Ｏ２５ｂ特異的ｍＡｂのエンドトキシン中和能
ＬＰＳはエンドトキシンとしての潜在的可能性を有するので、本発明者らは、ＬＰＳ分子内のＯ２５ｂ抗原に結合するｍＡｂの潜在的な中和能力を試験することが重要であると考えた。

【0318】

マウスはヒトよりもエンドトキシンに対して固有的に耐性であり、しかしながら、マウスを、肝毒性炭水化物Ｄ−ＧａｌＮの投与によって微量の精製ＰＬＳに対して感受性にすることができる（Ｇａｌａｎｏｓ Ｃ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、７６：５９３９〜５９４３、１９７９）。マウスを、同時に施される２０ｍｇ／マウスのＤ−ＧａｌＮによるｉ．ｐ．感作および致死用量（１ｎｇ）の精製Ｏ２５ｂ ＬＰＳによるｉ．ｖ．抗原攻撃の２４時間前に予防的に１００μｇまたは２５μｇのｍＡｂにより免疫化した。図８は、致死的な内毒素血症からの有意かつ用量依存的な保護を示すヒト化ｍＡｂについての代表的な実験を示す。

【0319】

この作用様式についてさらに解明するために、ヒト化されたＯ２５ｂ特異的ｍＡｂをインビトロ中和アッセイにおいて調べた。ＬＰＳは、敗血症性ショックをインビボにおいて誘発することに関わるｔｏｌｌ様受容体−４（ＴＬＲ−４）／ＭＤ２受容体複合体を介してシグナル伝達する。ＴＬＲ−４複合体を介するＬＰＳシグナル伝達の中和を評価するために、本発明者らは市販のＨＥＫ−Ｂｌｕｅシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した。このアッセイでは、ヒトＴＬＲ−４複合体を発現させるために形質転換されるＨＥＫ細胞が利用される。この受容体を介したシグナル伝達は、発色性基質により定量化される酵素の分泌を誘導する。図９Ａは、精製されたＯ２５ｂ ＬＰＳが用量依存的活性をこのアッセイにおいて有することを示す。中和ｍＡｂは、エンドトキシンの標準的濃度によって誘発されるシグナルを用量依存的様式で阻害することができる（図９Ｂ）。ＩＣ５０値（最大効果の５０％を中和するｍＡｂの濃度）により、様々なｍＡｂの中和能を比較することが可能になる。図９Ｃには、代表的なヒト化Ｏ２５ｂ反応性ｍＡｂの中和効力がまとめられる。

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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図2-9】

【図2-10】

【図2-11】

【図2-12】

【図2-13】

【図2-14】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]