特許 6592486 アポリポタンパク質（ａ）発現を調節するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6592486

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】アポリポタンパク質（ａ）発現を調節するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20191007BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20191007BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

   A61K48/00

   A61K31/7125

   A61K31/712

   A61P9/00

   A61P3/00

   A61P29/00

   A61P43/00 105

【請求項の数】15

【外国語出願】

【全頁数】400

(21)【出願番号】特願2017-182019(P2017-182019)

(22)【出願日】2017年9月22日

(62)【分割の表示】特願2016-512052(P2016-512052)の分割

【原出願日】2014年5月1日

(65)【公開番号】特開2018-27091(P2018-27091A)

(43)【公開日】2018年2月22日

【審査請求日】2017年10月20日

(31)【優先権主張番号】61/823,826

(32)【優先日】2013年5月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/843,887

(32)【優先日】2013年7月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/818,442

(32)【優先日】2013年5月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/880,790

(32)【優先日】2013年9月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/976,991

(32)【優先日】2014年4月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/986,867

(32)【優先日】2014年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/871,673

(32)【優先日】2013年8月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595104323

【氏名又は名称】アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100128750

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】プラカシュ，タジャ・ピー

(72)【発明者】

【氏名】セス，プニット・ピー

(72)【発明者】

【氏名】スウェイジ，エリック・イー

(72)【発明者】

【氏名】グラハム，マーク・ジェイ

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２０４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Bioorganic & Medicinal Chemistry，２００８年，16，p.5216-5231

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、ここで前記修飾オリゴヌクレオチドは配列番号１に１００％相補的であり、ここで当該共役基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端で前記修飾オリゴヌクレオチドに連結されており、そしてここで当該共役基は以下：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

を含む、前記化合物。

【請求項2】

（ｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾糖を含む、
（ｉｉ）少なくとも１個のヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、および／または
（ｉｉｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される、
請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

（ｉ）少なくとも１個の修飾糖が（ａ）二環糖であるか、または（ｂ）少なくとも１個の修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’橋を含み、式中、ｎが、１または２である、
（ｉｉ）前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、および／または
（ｉｉｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドが以下：（ａ）少なくとも５個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含むか、または（ｂ）少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、
請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、
連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、そして、各シトシン残基が５−メチルシトシンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結したヌクレオシドからなり、そして前記修飾オリゴヌクレオチドは、
１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして、各シトシン残基が５−メチルシトシンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項8】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１１〜５７、５９〜１１３および１３５の一つの少なくとも８個の核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項9】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１１〜５７、５９〜１１３および１３５の一つの核酸塩基配列を含むかそれからなる核酸塩基配列を有する、請求項８に記載の化合物。

【請求項10】

前記化合物が、塩の形態である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

前記化合物が、ナトリウム塩および／またはカリウム塩の形態である、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、および薬剤的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。

【請求項13】

上昇したａｐｏ（ａ）および／または上昇したＬｐ（ａ）に関連する疾患を治療し、予防し、その進行を遅らせるための、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記疾患が、炎症、心臓血管または代謝性疾患、障害または状態である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記疾患が、大動脈弁狭窄症またはアンギナである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、配列表とともに電子形式で出願されている。この配列表は、２０１４年５月１日に作成された４３２ＫｂのサイズのＢＩＯＬ０２５０ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

アンチセンス技術の背後にある原理は、アンチセンス化合物が標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の量、活性、および／または機能を調節することである。例えば、ある特定の事例において、アンチセンス化合物は、標的の転写または翻訳の変化をもたらす。発現のそのような調節は、例えば、標的ｍＲＮＡ分解または占有に基づく阻害によって達成され得る。分解によるＲＮＡ標的機能の調節の一例には、ＤＮＡ様アンチセンス化合物とのハイブリダイゼーション時の標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈに基づく分解がある。標的分解による遺伝子発現の調節のもう１つの例には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）がある。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を利用する機構を介したアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを指す。ＲＮＡ標的機能の調節のさらなる例は、マイクロＲＮＡによって自然に用いられる機構等の占有に基づく機構によるものである。マイクロＲＮＡは、タンパク質コードＲＮＡの発現を調整する小非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡへのアンチセンス化合物の結合は、そのマイクロＲＮＡのそのメッセンジャーＲＮＡ標的への結合を防ぎ、それ故にマイクロＲＮＡの機能を妨げる。マイクロＲＮＡ模倣物は、生来のマイクロＲＮＡ機能を高めることができる。ある特定のアンチセンス化合物は、プレｍＲＮＡのスプライシングを変化させる。特異的機構にかかわらず、配列特異性は、標的の検証および遺伝子の機能化の手段、ならびに疾患の発病に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬としてアンチセンス化合物を魅力的なものにする。

【0003】

アンチセンス技術は、１つ以上の特異的な遺伝子産物の発現を調節するのに効果的な手段であり、それ故に、多くの治療的用途、診断的用途、および研究用途に一意的に有用であることが判明し得る。化学修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物に組み込まれ、標的核酸のヌクレアーゼ耐性、薬物動態、または親和性等の１つ以上の特性を強化することができる。１９９８年、アンチセンス化合物であるＶｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ホミビルセン、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって開発されたもの）が、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の販売許可を得た最初のアンチセンス薬物であり、現在、ＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）誘導性網膜炎の治療薬である。

【0004】

新たな化学修飾は、アンチセンス化合物の強度および有効性を改善しており、経口送達の可能性を見出し、皮下投与を強化し、副作用の可能性を減少させ、患者の利便性の向上につながっている。アンチセンス化合物の強度を増加させる化学修飾は、低用量の投与を可能にし、毒性の可能性を減少させ、全体の治療費を削減する。分解に対する耐性を増加させる修飾は、体内からのより緩徐な排除をもたらし、投薬頻度の低下を可能にする。異なる種類の化学修飾を１個の化合物内で組み合わせて、化合物の有効性をさらに最適化することができる。

【0005】

リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質、およびコレステロールの両親媒性コーティングで包囲されたアシルグリセロールおよびコレステリルエステルの非極性コアからなる球状でミセル様の粒子である。リポタンパク質は、それらの機能的および物理的特性に基
づいて、５つの広範なカテゴリー：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に分類されている。カイロミクロンは、食物脂質を腸から組織に輸送する。ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬはすべて、トリアシルグリセロールおよびコレステロールを肝臓から組織に輸送する。ＨＤＬは、内因性コレステロールを組織から肝臓に輸送する。

【0006】

リポタンパク質粒子は、連続した代謝過程を経て、可変特性および組成を有する。リポタンパク質密度は、それらの外側コーティングの密度が内核の密度未満であるため、粒径を増加させることなく増加する。リポタンパク質のタンパク質成分は、アポリポタンパク質として知られている。少なくとも９個のアポリポタンパク質が様々なヒトリポタンパク質間で有意な量で分布している。

【0007】

リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］粒子は、約５０年前に特定されており、極めて独特のＬＤＬ粒子からなり、その中で、１個のアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）タンパク質がジスルフィド結合を介して単一アポリポタンパク質（ａ）［ａｐｏ（ａ）］タンパク質に連結される。このａｐｏ（ａ）タンパク質は、特にクリングルＩＶ２型反復ドメイン内のプラスミノーゲンと高度の相同性を共有する。循環Ｌｐ（ａ）のレベルは、分子中に存在するクリングルＩＶ２型可変反復配列の数に反比例し、両対立遺伝子が個体内で共発現するため、ヘテロ接合性血漿アイソフォームプロファイルを提示することができる（Ｋｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１９９６；４（２）：７４−８７）。ａｐｏ（ａ）におけるこのクリングル反復ドメインが、その血栓形成促進特性および抗線維素溶解特性に関与し得、かつアテローム性動脈硬化進行を高める可能性があると考えられる。

【0008】

ａｐｏ（ａ）は、ＩＬ−６によって転写制御され、ＩＬ−６阻害剤（トシリズマブ）で治療されたリウマチ性関節炎患者における研究において、血漿レベルは、３ヶ月治療した後に３０％減少した（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０；５：ｅ１４３２８）。

【0009】

ａｐｏ（ａ）は、酸化リン脂質に優先的に結合し、かつ血管炎症を増強することが示されている（Ｂｅｒｇｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００８；４９：２２３０−２２３９、Ｔｓｉｍｉｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００９；１１９（１３）：１７１１−１７１９）。

【0010】

さらに、研究は、Ｌｐ（ａ）粒子が、内皮透過性を刺激し、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型発現を誘導し、かつマクロファージインターロイキン−８分泌を活性化し得ることを示唆する（Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ２００４；１５：１６７−１７４）。重要なことに、近年の遺伝子関連研究は、Ｌｐ（ａ）が、心筋梗塞、発作、末梢血管疾患、および腹部大動脈瘤の独立危険因子であることを明らかにした（Ｒｉｆａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：１３６４−７１、Ｅｒｑｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２００９；３０２：４１２−２３、Ｋａｍｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００８；１１７：１７６−８４）。さらに、近年の早発性冠動脈疾患（ＰＲＯＣＡＲＤＩＳ）研究において、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２００９）３６１；２５１８−２５２８）は、冠状動脈性心臓病および血漿Ｌｐ（ａ）濃度との間の強く独立した関連性を説明している。さらに、Ｓｏｌｆｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．は、血清Ｌｐ（ａ）の増加がアルツハイマー病（ＡＤ）の危険性の増加に関係し得ることを示唆した（Ｓｏｌｆｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００２，７２：７３２−７３６）。現在、診療
所状況において、心臓血管疾患を治療するための間接的なａｐｏ（ａ）阻害剤の例には、血漿Ｌｐ（ａ）レベルを、それぞれ、１８％、３９％、３２％、３６％、４３％、および１７％低下させる、アスピリン、ナイアシン、ミポメルセン、アナセトラピブ、エプロチローム、およびロミタピドが挙げられる。さらに、Ｌｐ（ａ）アフェレーシスは、Ｌｐ（ａ）粒子を含有するａｐｏ（ａ）を減少させるために診療所において用いられている。

【0011】

これまで、ａｐｏ（ａ）レベルを直接標的とすることによって心臓血管疾患を治療する治療的戦略は、制限されている。リボザイムオリゴヌクレオチド（米国特許第５，８７７，０２２）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（国際公開第ＷＯ２００５／０００２０１号、国際公開第ＷＯ２００３／０１４３９７号、国際公開第ＷＯ２０１３／１７７４６８号、米国特許第２００４０２４２５１６号、米国特許第８，１３８，３２８号、同第８，６７３，６３２号、および同第７，２５９，１５０号、Ｍｅｒｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１１；５７：１６１１−１６２１（各出版物が参照によりその全体が組み込まれる））が開発されているが、いずれも商業的使用が認められていない。

【0012】

したがって、慢性的に上昇した血漿Ｌｐ（ａ）レベルに起因した心臓血管イベントの危険性の高い患者におけるａｐｏ（ａ）レベルを強力かつ選択的に減少させることのできる新規の薬剤の明らかな満たされていない医学的必要性が未だ存在する。

【発明の概要】

【0013】

ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するための組成物および方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させる。Ｌｐ（ａ）レベルの発現を調節するための組成物および方法が本明細書に提供される。

【0014】

ある特定の実施形態において、組成物は、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、核酸、タンパク質、または小分子である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、共役体を有するａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、修飾オリゴヌクレオチドおよび共役体であり、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的な少なくとも８個の連続した核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、修飾オリゴヌクレオチドおよび共役体であり、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列の少なくとも８、最小９、最小１０、最小１１、少なくとも１２、最小１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、最小１７、最小１８、最小１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、修飾オリゴヌクレオチドおよび共役体であり、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８のうちのいずれかの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メ
チルシトシンである。

【0015】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の共役アンチセンス化合物またはその塩、および薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。

【0016】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）発現の調節は、細胞または組織内で生じる。ある特定の実施形態において、調節は、動物における細胞または組織内で生じる。ある特定の実施形態において、動物は、ヒトである。ある特定の実施形態において、調節は、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルの低下である。ある特定の実施形態において、調節は、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルとａｐｏ（ａ）タンパク質レベルのいずれも低下する。ある特定の実施形態において、調節は、Ｌｐ（ａ）レベルの低下である。そのような低下は、時間依存的または用量依存的様式で生じ得る。

【0017】

ある特定の実施形態は、治療において用いるための共役アンチセンス組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防し、治療し、遅延させ、その進行を遅らせ、かつ／または改善するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防し、治療し、遅延させ、その進行を遅らせ、かつ／または改善するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、そのような疾患、障害、および状態は、炎症性、心臓血管、および／または代謝性疾患、障害、および状態である。ある特定の実施形態において、治療用の組成物および方法は、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤をそれを必要とする個体に投与することを含む。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、核酸である。ある特定の実施形態において、核酸は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役体を有する修飾オリゴヌクレオチドである。

【0018】

ある特定の実施形態において、本開示は、共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、核酸転写物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞を核酸転写物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させることと、細胞内の核酸転写物の量または活性を低減させることと、を含む方法を提供する。

【0019】

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）が以前に説明されている。例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．４７，ｐｐ１７１２５−１７１２９（２００５）を参照されたい。そのような受容体は、肝臓細胞、具体的には、肝細胞上で発現する。さらに、３個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドのクラスターを含む化合物はＡＳＧＰ−Ｒに結合することができ、細胞内への化合物の取り込みをもたらすことが示されている。例えば、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃおよびＭｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，９，ｐｐ５２１６−５２３１（Ｍａｙ ２００８）を参照されたい。したがって、そのようなＧａｌＮＡｃクラスターを含む共役体を用いて、肝臓細胞、具体的には、肝細胞へのある特定の化合物の取り込みを促進している。例えば、ある特定のＧａｌＮＡｃ含有共役体が生体内で肝臓細胞における二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の活性を増加させることが示されている。そのような事例において、ＧａｌＮＡｃ含有共役体は、典型的には、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖に結合される。アンチセンス鎖が最終的に標的核酸とハイブリダイズする前にセンス鎖が処分されるため、共役体が活性を妨げるといった懸念はほとんどない。典型的には、共役体
は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。例えば、米国特許第８，１０６，０２２号を参照されたい。本明細書に記載のある特定の共役基は、以前に説明された共役基よりも活性であり、かつ／または合成し易い。

【0020】

本発明のある特定の実施形態において、共役体は、プレｍＲＮＡ標的核酸のスプライシングを変化させるＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物およびアンチセンス化合物を含むが、これらに限定されない一本鎖アンチセンス化合物に結合される。そのような実施形態において、共役体は、利益（細胞内への取り込みの改善）を提供するのに十分な期間、アンチセンス化合物に結合したままであるべきであるが、切断されるか、またはさもなければスプライシングまたはスプライシング調節に関連した標的核酸へのハイブリダイゼーションおよびＲＮａｓｅ Ｈまたは酵素との相互作用等の活性に必要なその後のステップを妨げないか、のいずれかであるべきである。このような特性のバランスは、ｓｉＲＮＡ化合物よりも一本鎖アンチセンス化合物状況下においてより重要であり、共役体は、単にセンス鎖に結合され得る。共役体を欠く同一のアンチセンス化合物と比較して、生体内で肝臓細胞における強度の改善を有する共役体一本鎖アンチセンス化合物が本明細書に開示される。これらの化合物の要求される特性バランスを考慮すると、そのような強度の改善は、驚くべきことである。

【0021】

ある特定の実施形態において、本明細書における共役基は、切断可能な部分を含む。上述のように、機構によって束縛されることを望むことなく、共役体が、取り込みの強化を提供するのに十分長い期間、化合物に残存したままであるべきだが、その後、共役体の一部、または理想的には、共役体のすべてが切断されて、親化合物（例えば、アンチセンス化合物）をその最も活性な形態で放出することが望ましいことは論理的である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能なヌクレオシドである。そのような実施形態は、ホスホジエステル結合等の１個以上の切断可能な結合によってヌクレオシドを介して共役体の残り（クラスター）をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることによって、細胞内の内因性ヌクレアーゼをうまく利用する。ある特定の実施形態において、クラスターは、ホスホジエステル結合によって切断可能なヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態において、切断可能なヌクレオシドは、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス化合物）に結合される。ある特定の実施形態において、共役基は、２個または３個の切断可能なヌクレオシドを含み得る。そのような実施形態において、そのような切断可能なヌクレオシドは、切断可能な結合（ホスホジエステル結合等）によって、互いに、アンチセンス化合物に、かつ／またはクラスターに連結される。本明細書におけるある特定の共役体は、切断可能なヌクレオシドを含まず、代わりに切断可能な結合を含む。オリゴヌクレオチドからの共役体の十分な切断が、細胞における切断に対して脆弱な少なくとも１個の結合（切断可能な結合）によって提供されることが示される。

【0022】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、プロドラッグである。そのようなプロドラッグは、動物に投与され、最終的により活性な形態に代謝される。例えば、共役アンチセンス化合物は、切断されて、共役体のすべてまたは一部を除去し、共役体のすべてまたは一部を欠くアンチセンス化合物の活性（またはより活性な）形態をもたらす。

【0023】

ある特定の実施形態において、共役体は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。ある特定のそのような５’共役体は、３’末端に結合される同様の共役基を有する対応物よりも効率的に切断される。ある特定の実施形態において、活性の改善は、切断の改善と相関し得る。ある特定の実施形態において、５’末端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性は、３’末端に共役体を含むオリゴヌクレオチドよりも高い（例えば、実施例５６、８１、８３、および８４を参照のこと）。さらに、５’結合は、より単純なオリゴ
ヌクレオチド合成を可能にする。典型的には、オリゴヌクレオチドは、３’から５’の方向に固体支持体上で合成される。３’共役オリゴヌクレオチドを作製するために、典型的には、プレ共役３’ヌクレオシドを固体支持体に結合させ、その後、オリゴヌクレオチドを通常通りに構築する。しかしながら、その共役ヌクレオシドを固体支持体に結合させることは、合成を複雑にする。さらに、この手段を用いることにより、共役体は、次いでオリゴヌクレオチドの合成を通じて存在し、その後のステップ中で分解された状態になり得るか、または使用され得る反応物および試薬の種類を限定し得る。本明細書に記載の５’共役オリゴヌクレオチドの構造および技術を用いることにより、標準の自動化技術を用いてオリゴヌクレオチドを合成して、最終（最も５’側の）ヌクレオシドとの共役体を導入することができるか、またはオリゴヌクレオチドが固体支持体から切断された後にオリゴヌクレオチドを合成することができる。

【0024】

当技術分野および本開示を考慮して、当業者であれば、本明細書の共役体および共役オリゴヌクレオチドのうちのいずれかを容易に作製することができる。さらに、本明細書に開示されるある特定のそのような共役体および共役オリゴヌクレオチドの合成は、以前に開示された共役体の合成よりも容易であり、かつ／またはわずかなステップしか必要とせず、それ故に安価であり、製造において利点を提供する。例えば、ある特定の共役基の合成は、以前に説明された共役基と比較して、より少ない合成ステップからなり、収率の増加をもたらす。実施例４６のＧａｌＮＡｃ３−１０および実施例４８のＧａｌＮＡｃ３−７等の共役基は、より多くの化学中間体の構築を必要とする米国特許第８，１０６，０２２号または米国特許第７，２６２，１７７号に記載される共役体等の以前に説明された共役体よりもはるかに単純である。したがって、本明細書に記載のこれらおよび他の共役体は、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）のいずれかの鎖を含む任意のオリゴヌクレオチドと併せて用いる際に、以前に説明された化合物よりも有利である。

【0025】

同様に、ＧａｌＮＡｃリガンドを１つまたは２つしか有しない共役基が本明細書に開示される。示されるように、そのような共役基は、アンチセンス化合物の活性を改善する。そのような化合物は、３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含む共役体よりも調製が簡単である。１つまたは２個のＧａｌＮＡｃリガンドを含む共役基は、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）のいずれかの鎖を含む任意のアンチセンス化合物に結合され得る。

【0026】

ある特定の実施形態において、本明細書における共役体は、ある程度の耐容性を実質的に変化させない。例えば、共役アンチセンス化合物の免疫原性が非共役親化合物の免疫原性よりも低いことが本明細書に示される。強度が改善されるため、耐容性が同一のままである（または強度の増加と比較して耐容性がほんのわずか低下した場合でさえも同一のままである）実施形態は、改善された治療特性を有する。

【0027】

ある特定の実施形態において、共役は、共役の不在下においてあまり魅力的ではない結果を有する方法でアンチセンス化合物を変化させることを可能にする。例えば、ある特定の実施形態において、完全なホスホロチオエートアンチセンス化合物の１個以上のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置換することで、ある程度の耐容性の改善をもたらす。例えば、ある特定の事例において、１個以上のホスホジエステルを有するそのようなアンチセンス化合物の免疫原性は、各結合がホスホロチオエート結合である同一の化合物の免疫原性よりも低い。しかしながら、ある特定の事例において、実施例２６に示されるように、１個以上のホスホロチオエート結合のホスホジエステル結合への同様な置換は、細胞取り込みの低下および／または強度の損失ももたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役アンチセンス化合物は、完全なホスホロチオエート共役対応物と比較して、取り込みおよび強度をほとんどまたはまったく失うことなくそのような
結合の変化に耐える。実際、ある特定の実施形態において、例えば、実施例４４、５７、５９、および８６において、共役体および少なくとも１個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、同様に同一の共役体を含む完全なホスホロチオエート対応物と比較した場合でも、生体内における強度の増加を実際に示す。さらに、共役が取り込み／強度の実質的な増加をもたらすため、その実質的な増加のわずかな損失は、耐容性の改善を達成するには許容範囲内であり得る。したがって、ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、少なくとも１個のホスホジエステル結合を含む。

【0028】

ある特定の実施形態において、本明細書におけるアンチセンス化合物の共役は、肝細胞における送達、取り込み、および活性の増大をもたらす。したがって、より多くの化合物が肝臓組織に送達される。しかしながら、ある特定の実施形態において、そのような送達の増大だけでは、全体の活性増大を明白にしない。ある特定のそのような実施形態において、より多くの化合物が肝細胞に入る。ある特定の実施形態において、そのような肝細胞取り込みの増大でさえも、全体の活性増大を明白にしない。そのような実施形態において、共役化合物の生産的な取り込みが増大する。例えば、実施例１０２に示されるように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体のある特定の実施形態は、非実質細胞と比較して、肝細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃縮を増大させる。この濃縮は、肝細胞において発現される遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドに有益である。

【0029】

ある特定の実施形態において、本明細書における共役アンチセンス化合物は、腎臓曝露の低下をもたらす。例えば、実施例２０に示されるように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体のある特定の実施形態を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、腎臓において、ＧａｌＮＡｃ含有共役体を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低い。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が要求されない治療的指標において、腎臓への曝露は、腎毒性の危険性を有し、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、より迅速なクリアランスをもたらす。したがって、非腎臓標的の場合、腎臓内での蓄積は望ましくない。

【0030】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の式によって表される共役アンチセンス化合物を提供し、

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0031】

本明細書における上述の図および同様の図において、分岐基「Ｄ」は、「ｑ」で示される（Ｅ〜Ｆ）基の数を収容するのに必要なだけ分岐を繰り返す。したがって、ｑ＝１の場合、式は、以下のものであり、

【化2】

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ｑ＝２の場合、式は、以下のものであり、

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

ｑ＝３の場合、式は、以下のものであり、

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

ｑ＝４の場合、式は、以下のものであり、

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

ｑ＝５の場合、式は、以下のものである。

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

【0032】

ある特定の実施形態において、以下の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

【0033】

ある特定の実施形態において、以下の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

【0034】

ある特定の実施形態において、以下の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

【0035】

ある特定の実施形態において、以下の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

【0036】

本開示は、以下の非限定的な番号付けされた実施形態を提供する。

【0037】

特定の変数のうちの２つ以上（例えば、２つ以上の「ｍ」または「ｎ」）を有する実施形態において、別途示されない限り、各々のそのような特定の変数は、独立して選択される。したがって、２つ以上のｎを有する構造の場合、各ｎは、独立して選択さるため、互いに同一であり得るか、同一であり得ない。

【0038】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ４９４３７２を含み、式中、Ｘは、ＧａｌＮＡｃを含む共役基である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ４９４３７２からなり、式中、Ｘは、ＧａｌＮＡｃを含む共役基である。

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

【0039】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５１を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５１からなる。

【化12】

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【0040】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役体修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５７を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５７からなる。

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

【0041】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾が変化する５’−ＧａｌＮＡｃを有する配列番号５８を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾が変化する５’−ＧａｌＮＡｃを有する配列番号５８を有する修飾オリゴヌクレオチドからなり、

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

【0042】

式中、Ｒ^１が、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（ＭＯＥ）であり、Ｒ^２が、Ｈであるか、またはＲ^１およびＲ^２が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^１が、−Ｏ−であり、Ｒ^２が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^１およびＲ^２が直接連結され、
同一の環上、独立して、各環のＲ^３とＲ^４の各対について、Ｒ^３が、Ｈおよび−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択され、Ｒ^４が、Ｈであるか、またはＲ^３およびＲ^４が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^３が、−Ｏ−であり、Ｒ^４が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^３およびＲ^４が直接連結され、
Ｒ^５が、Ｈおよび−ＣＨ_３から選択され、
Ｚが、Ｓ⁻およびＯ⁻から選択される。
本開示は、以下の非限定的な番号付けされた実施形態を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0043】

前記一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的であるのみであ
って、本開示を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において、単数形の使用は、別途明確に記述されない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるとき、「または（ｏｒ）」の使用は、別途記述されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」等の用語は、別途明確に記述されない限り、１つのユニットを含む複数の要素および複数の成分と２つ以上のサブユニットを含む複数の要素および複数の成分の両方を包含する。

【0044】

本明細書で使用される節の見出しは、構成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むが、これらに限定されない本出願において引用されるすべての文書または文書の一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明確に組み込まれる。

Ａ．定義

【0045】

特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および製薬化学に関連して用いられる学名、ならびにそれらの手順および技法は、周知であり、当技術分野で一般に使用されるものである。標準の技法は、化学合成および化学分析において使用され得る。ある特定のそのような技法および手順は、例えば、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２１^ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５、および“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９において見出すことができ、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。許容される場合、本開示を通して参照されるすべての特許、出願、公開された出願、および他の出版物、ならびに他のデータは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0046】

別途示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基部分および糖部分を含む化合物を意味する。ヌクレオシドには、天然に存在するヌクレオシド（ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるもの）ならびに修飾ヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオシドは、ホスフェート部分に連結され得る。

【0047】

本明細書で使用されるとき、「化学修飾」とは、天然に存在する対応物と比較した場合の化合物の化学的相違を意味する。オリゴヌクレオチド化学修飾は、ヌクレオシド修飾（糖部分修飾および核酸塩基修飾を含む）ならびにヌクレオシド間結合修飾を含む。オリゴヌクレオチドに関して、化学修飾は、核酸塩基配列においてのみ相違を含まない。

【0048】

本明細書で使用されるとき、「フラノシル」とは、４個の炭素原子と１個の酸素原子とを含む５員環を含む構造を意味する。

【0049】

本明細書で使用されるとき、「天然に存在する糖部分」とは、天然に存在するＲＮＡに見られるリボフラノシルまたは天然に存在するＤＮＡに見られるデオキシリボフラノシルを意味する。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「糖部分」とは、ヌクレオシドの天然に存在する糖部分または修飾糖部分を意味する。

【0051】

本明細書で使用されるとき、「修飾糖部分」とは、置換糖部分または糖代理物を意味する。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「置換糖部分」とは、天然に存在する糖部分ではないフラノシルを意味する。置換糖部分には、２’位、３’位、５’位、および／または４’位に置換基を含むフラノシルが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の置換糖部分は、二環式糖部分である。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「２’−置換糖部分」とは、ＨまたはＯＨ以外の２’位に置換基を含むフラノシルを意味する。別途示されない限り、２’−置換糖部分は、二環式糖部分ではない（すなわち、２’−置換糖部分の２’−置換基は、フラノシル環の別の原子への橋を形成しない）。

【0054】

本明細書で使用されるとき、「ＭＯＥ」とは、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３を意味する。

【0055】

本明細書で使用されるとき、「２’−Ｆヌクレオシド」は、２’位にフッ素を含む糖を含むヌクレオシドを指す。別途示されない限り、２’−Ｆヌクレオシドにおけるフッ素は、（天然リボースのＯＨを置換する）リボ位に存在する。

【0056】

本明細書で使用されるとき、「糖代理物」という用語は、結果として生じるヌクレオシドサブユニットが一緒に結合し、かつ／または他のヌクレオシドに結合して、相補的なオリゴマー化合物にハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を形成することができるように、フラノシルを含まず、かつヌクレオシドの天然に存在する糖部分を置換することができる構造を意味する。そのような構造は、フラノシル（例えば、４、６、もしくは７員環）とは異なる数の原子、フラノシルの酸素の非酸素原子（例えば、炭素、硫黄、もしくは窒素）への置換、または原子の数の変化および酸素の置換の両方を含む環を含む。そのような構造はまた、置換糖部分（例えば、さらなる置換基を任意に含む６員炭素環式二環式糖代理物）について記載された置換に対応する置換も含み得る。糖代理物はまた、より複雑な糖置換物（例えば、ペプチド核酸の非環系）も含む。糖代理物には、モルフォリノ、シクロヘキセニル、およびシクロヘキシトールが含まれるが、これらに限定されない。

【0057】

本明細書で使用されるとき、「二環式糖部分」とは、４〜７員環の２個の原子をつないで第２の環を形成して、二環式構造をもたらす橋を含む４〜７員環（フラノシルを含むが、これに限定されない）を含む修飾糖部分を意味する。ある特定の実施形態において、４〜７員環は、糖環である。ある特定の実施形態において、４〜７員環は、フラノシルである。ある特定のそのような実施形態において、橋は、フラノシルの２’−炭素と４’−炭素とをつなぐ。

【0058】

本明細書で使用されるとき、「核酸」は、モノマーヌクレオチドからなる分子を指す。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ）、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。核酸は、単一分子中にこれらの要素の任意の組み合わせ
も含み得る。

【0059】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」とは、ホスフェート結合基をさらに含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用されるとき、「連結したヌクレオシド」は、ホスフェート結合によって連結されてもされなくてもよく、それ故に、「連結したヌクレオチド」を含むが、これに限定されない。本明細書で使用されるとき、「連結したヌクレオシド」は、連続した配列において連結されるヌクレオシドである（すなわち、さらなるヌクレオシドは、連結される配列間に存在しない）。

【0060】

本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」とは、糖部分に連結されてオリゴヌクレオチドに組み込むことができるヌクレオシドを作成することができる原子団を意味し、この原子団は、別のオリゴヌクレオチドまたは核酸の相補的な天然に存在する核酸塩基と結合することができる。核酸塩基は、天然に存在し得るか、または修飾され得る。本明細書で使用されるとき、「核酸塩基配列」とは、任意の糖、結合、または核酸塩基修飾とは無関係に連続した核酸塩基の順序を意味する。

【0061】

本明細書で使用されるとき、「非修飾核酸塩基」または「天然に存在する核酸塩基」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡの天然に存在する複素環式核酸塩基を意味し、プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）をベースとし、ピリミジンは、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）（５−メチルＣを含む）、およびウラシル（Ｕ）をベースとする。

【0062】

本明細書で使用されるとき、「修飾核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基ではない任意の核酸塩基を意味する。

【0063】

本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオシド」とは、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオシドと比較して、少なくとも１つの化学修飾を含むヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を含む。

【0064】

本明細書で使用されるとき、「二環式ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」とは、二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0065】

本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオシド」または「ｃＥｔ」とは、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0066】

本明細書で使用されるとき、「ロックド酸ヌクレオシド」または「ＬＮＡ」とは、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0067】

本明細書で使用されるとき、「２’−置換ヌクレオシド」とは、ＨまたはＯＨ以外の２’位に置換基を含むヌクレオシドを意味する。別途示されない限り、２’−置換ヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドではない。

【0068】

本明細書で使用されるとき、「デオキシヌクレオシド」とは、天然に存在するデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）に見られる２’−Ｈフラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’−デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含み得るか、またはＲＮＡ核酸塩基（例えば、ウラシル）を含み得る。

【0069】

本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」とは、複数個の連結したヌクレオシドを含む化合物を意味する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１個以上の非修飾リボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／または非修飾デオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）および／または１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。

【0070】

本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオシド」とは、ヌクレオシド間結合のうちのいずれもリン原子を含有しないオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドを含む。

【0071】

本明細書で使用されるとき、「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシドおよび／または少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0072】

本明細書で使用されるとき、「結合」または「結合基」とは、２個以上の他の原子団を一緒に結合する原子団を意味する。

【0073】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間結合」とは、オリゴヌクレオチド中の隣接したヌクレオシド間の共有結合を意味する。

【0074】

本明細書で使用されるとき、「天然に存在するヌクレオシド間結合」とは、３’から５’へのホスホジエステル結合を意味する。

【0075】

本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合以外の任意のヌクレオシド間結合を意味する。

【0076】

本明細書で使用されるとき、「末端ヌクレオシド間結合」とは、オリゴヌクレオチドまたはその定義された領域の最後の２個のヌクレオシド間の結合を意味する。

【0077】

本明細書で使用されるとき、「リン結合基」とは、リン原子を含む結合基を意味する。リン結合基には、以下の式を有する基が含まれるが、これに限定されず、

【化15】

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式中、
Ｒ_ａおよびＲ_ｄは各々、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、ＮＨ、またはＮＪ_１であり、Ｊ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_ｂは、ＯまたはＳであり、
Ｒ_ｃは、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アミノ、または置換アミノであり、
Ｊ_１は、Ｒ_ｂが、ＯまたはＳである。

【0078】

リン結合基には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオアミデート、チオノアルキルホスホネート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートが含まれるが、これらに限定されない。

【0079】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間リン結合基」とは、２個のヌクレオシドを直接結合するリン結合基を意味する。

【0080】

本明細書で使用されるとき、「非ヌクレオシド間リン結合基」とは、２個のヌクレオシドを直接結合しないリン結合基を意味する。ある特定の実施形態において、
非ヌクレオシド間リン結合基は、ヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に結合させる。

【0081】

ある特定の実施形態において、
非ヌクレオシド間リン結合基は、２個の基を結合するが、これらはいずれもヌクレオシドではない。

【0082】

本明細書で使用されるとき、「中性結合基」とは、荷電されていない結合基を意味する。中性結合基には、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−）、アミド−３（−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−）、アミド−４（−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−）、ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−）、およびチオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、中性結合基には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、硫化物、スルホン酸エステル、およびアミドを含む非イオン性結合が含まれる（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ
Ｅｄｓ．ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３
ａｎｄ ４（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい）。さらに、中性結合基は、混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分部分を含む非イオン性結合を含む。

【0083】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間中性結合基」とは、２個のヌクレオシドを直接結合する中性結合基を意味する。

【0084】

本明細書で使用されるとき、「非ヌクレオシド間中性結合基」とは、２個のヌクレオシドを直接結合しない中性結合基を意味する。ある特定の実施形態において、非ヌクレオシド間中性結合基は、ヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に結合させる。

【0085】

ある特定の実施形態において、非ヌクレオシド間中性結合基は、２個の基を結合するが、これらはいずれもヌクレオシドではない。

【0086】

本明細書で使用されるとき、「オリゴマー化合物」とは、２つ以上の下部構造を含む重合体構造を意味する。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、１個以上の共役基および／または末端基を含む。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドからなる。オリゴマー化合物はまた、天然に存在する核酸も含む。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、１個以上の連結した単量体サブユニットの骨格を含み、各連結した単量体サブユニットは、複素環式塩基部分に直接的または間接的に結合される。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物はまた、複素環式塩基部分に連結されない単量体サブユニットも含み得、それにより脱塩基部位を提供し得る。ある特定の実施形態において、単量体サブユニット、糖部分または代理物、および複素環式塩基部分を結び付ける結合は、独立して修飾され得る。ある特定の実施形態において、複素環式塩基を含み得るか、または含み得ない結合糖単位は、ペプチド核酸における単量体等の模倣物と置換され得る。

【0087】

本明細書で使用されるとき、「末端基」とは、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端のいずれか、またはこれら両方に結合される１個以上の原子を意味する。ある特定の実施形態において、末端基は、共役基である。ある特定の実施形態において、末端基は、１個以上の末端基ヌクレオシドを含む。

【0088】

本明細書で使用されるとき、「共役体」または「共役基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合される原子または原子団を意味する。概して、共役基は、薬
力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、および／またはクリアランス特性を含むが、これらに限定されない、それらが結合する化合物の１つ以上の特性を修飾する。

【0089】

本明細書で使用されるとき、共役基との関連での「共役リンカー」または「リンカー」とは、任意の原子または原子団を含む共役基の一部を意味し、（１）オリゴヌクレオチドを共役基の別の部分と共有結合させるか、または（２）共役基の２個以上の部分を共有結合させる。

【0090】

共役基は、本明細書においてラジカルとして示され、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴマー化合物への共有結合を形成するための結合を提供する。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物における結合点は、オリゴマー化合物の３’末端ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基の３’−酸素原子である。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物における結合点は、オリゴマー化合物の５’末端ヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の５’−酸素原子である。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物への結合を形成するための結合は、切断可能な結合である。ある特定のそのような実施形態において、そのような切断可能な結合は、切断可能な部分のすべてまたは一部を構成する。

【0091】

ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能な部分（例えば、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシド）およびＧａｌＮＡｃクラスター部分等の炭水化物クラスター部分を含む。そのような炭水化物クラスター部分は、標的部分と、任意に、共役リンカーを含む。ある特定の実施形態において、炭水化物クラスター部分は、リガンドの数および同一性によって特定される。例えば、ある特定の実施形態において、炭水化物クラスター部分は、３個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ_３」と表記される。ある特定の実施形態において、炭水化物クラスター部分は、４個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ_４」と表記される。特定の炭水化物クラスター部分（特異的テザー、分岐、および共役リンカー基を有する）は、本明細書に記載され、ローマ数字、続いて下付き文字「ａ」で表記される。したがって、「ＧａｌＮａｃ３−１_ａ」は、３個のＧａｌＮａｃ基、ならびに特異的に特定されたテザー、分岐、および結合基を有する共役基の特定の炭水化物クラスター部分を指す。そのような炭水化物クラスター断片は、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシド等の切断可能な部分を介してオリゴマー化合物に結合される。

【0092】

本明細書で使用されるとき、「切断可能な部分」とは、生理学的条件下で分割され得る結合または基を意味する。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、リソソーム等の細胞または細胞内コンパートメント内で切断される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ヌクレアーゼ等の内因性酵素によって切断される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、１個、２個、３個、４個、または４個以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。
本明細書で使用されるとき、「切断可能な結合」とは、分割され得る任意の化学結合を意味する。ある特定の実施形態において、切断可能な結合は、アミド、ポリアミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、ジスルフィド、またはペプチドの中から選択される。

【0093】

本明細書で使用されるとき、「炭水化物クラスター」とは、足場またはリンカー基に結合される１個以上の炭水化物残基を有する化合物を意味する（例えば、炭水化物共役クラスターの例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，”Ｂｉ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，（１４）：１８−２９、またはＲｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，（４７）：５７９８−５８０８を参照のこと）。

【0094】

本明細書で使用されるとき、「修飾炭水化物」とは、天然に存在する炭水化物と比較して、１つ以上の化学修飾を有する任意の炭水化物を意味する。

【0095】

本明細書で使用されるとき、「炭水化物誘導体」とは、出発物質または中間体として炭水化物を用いて合成され得る任意の化合物を意味する。

【0096】

本明細書で使用されるとき、「炭水化物」とは、天然に存在する炭水化物、修飾炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。

【0097】

本明細書で使用されるとき、「保護基」とは、当業者に既知の任意の化合物または保護基を意味する。保護基の非限定的な例は、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見出され得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0098】

本明細書で使用されるとき、「一本鎖」とは、その相補体にハイブリダイズされず、かつ安定した自己二本鎖を形成するのに十分な自己相補性を欠くオリゴマー化合物を意味する。

【0099】

本明細書で使用されるとき、「二本鎖」とは、互いにハイブリダイズされるオリゴマー化合物の対またはヘアピン構造を形成する単一の自己相補的なオリゴマー化合物を意味する。ある特定の実施形態において、二本鎖オリゴマー化合物は、第１および第２のオリゴマー化合物を含む。

【0100】

本明細書で使用されるとき、「アンチセンス化合物」とは、オリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる化合物を意味し、その少なくとも一部は、それがハイブリダイズすることができる標的核酸に相補的であり、少なくとも１つのアンチセンス活性をもたらす。

【0101】

本明細書で使用されるとき、「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能および／または測定可能な変化を意味する。ある特定の実施形態において、アンチセンス活性は、標的核酸転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の量または活性の調節を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス活性は、プレｍＲＮＡのスプライシングの調節を含む。

【0102】

本明細書で使用されるとき、「ＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物」とは、アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部が、アンチセンス化合物の標的核酸へのハイブリダイゼーションおよびその後のＲＮａｓｅ Ｈによる標的核酸の切断に起因するアンチセンス化合物を意味する。

【0103】

本明細書で使用されるとき、「ＲＩＳＣベースのアンチセンス化合物」とは、アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（
ＲＩＳＣ）に起因するアンチセンス化合物を意味する。

【0104】

本明細書で使用されるとき、「検出」または「測定」とは、検出または測定のための試験またはアッセイが実行されることを意味する。そのような検出および／または測定は、ゼロの値をもたらし得る。したがって、検出または測定のための試験が活性なし（ゼロの活性）の知見をもたらす場合、活性を検出または測定するステップは、それでもやはり実行されている。

【0105】

本明細書で使用されるとき、「検出可能および／または測定可能な活性」とは、ゼロではない統計的に有意な活性を意味する。

【0106】

本明細書で使用されるとき、「本質的に不変」とは、はるかに変化する別のパラメータと特に比較して、特定のパラメータに変化がほとんどまたは全くないことを意味する。ある特定の実施形態において、あるパラメータが５％未満変化するとき、そのパラメータは、本質的に不変である。ある特定の実施形態において、あるパラメータが２倍未満変化する場合、そのパラメータは、本質的に不変である一方で、別のパラメータは、少なくとも１０倍変化する。例えば、ある特定の実施形態において、アンチセンス活性は、標的核酸の量の変化である。ある特定のそのような実施形態において、非標的核酸の量の変化が標的核酸の量の変化よりもはるかに小さい場合、それは本質的に不変であるが、変化がゼロである必要はない。

【0107】

本明細書で使用されるとき、「発現」とは、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらす工程を意味する。発現には、転写、転写後修飾（例えば、スプライシング、ポリアデニル化、５’−キャップの付加）、および翻訳が含まれるが、これらに限定されない。

【0108】

本明細書で使用されるとき、「標的核酸」とは、アンチセンス化合物がハイブリダイズして所望のアンチセンス活性をもたらすよう意図される核酸分子を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下でハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なそれらの標的核酸に対する相補性を有する。

【0109】

本明細書で使用されるとき、核酸塩基に関して「核酸塩基相補性」または「相補性」とは、別の核酸塩基と塩基対合することができる核酸塩基を意味する。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）に相補的である。例えば、ＲＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的である。ある特定の実施形態において、相補的核酸塩基とは、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるアンチセンス化合物の核酸塩基を意味する。例えば、アンチセンス化合物のある特定の位置の核酸塩基が、標的核酸のある特定の位置の核酸塩基と水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、その核酸塩基対において相補的であると見なされる。ある特定の修飾を含む核酸塩基は、対応する核酸塩基と対合する能力を維持し得、それ故に、依然として核酸塩基相補性を有することができる。

【0110】

本明細書で使用されるとき、核酸塩基に関して「非相補的な」とは、互いに水素結合を形成しない核酸塩基の対を意味する。

【0111】

本明細書で使用されるとき、オリゴマー化合物（例えば、連結したヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、または核酸）に関して「相補的な」とは、そのようなオリゴマー化合物またはそれらの領域が核酸塩基相補性を介して別のオリゴマー化合物またはそれらの領域にハイブリダイズする能力を意味する。相補的なオリゴマー化合物は、各ヌクレオシドで核酸塩基相補性を有する必要はない。むしろ、いくつかのミスマッチが許容される。ある特定の実施形態において、相補的なオリゴマー化合物または領域は、核酸塩基の７０％で
相補的である（７０％相補的である）。ある特定の実施形態において、相補的なオリゴマー化合物または領域は、８０％相補的である。ある特定の実施形態において、相補的なオリゴマー化合物または領域は、９０％相補的である。ある特定の実施形態において、相補的なオリゴマー化合物または領域は、９５％相補的である。ある特定の実施形態において、相補的なオリゴマー化合物または領域は、１００％相補的である。

【0112】

本明細書で使用されるとき、「ミスマッチ」とは、第１および第２のオリゴマー化合物が整列するときに、第２のオリゴマー化合物の対応する位置で核酸塩基と対合することができない第１のオリゴマー化合物の核酸塩基を意味する。第１および第２のオリゴマー化合物のいずれかまたは両方ともにオリゴヌクレオチドであり得る。

【0113】

本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なオリゴマー化合物（例えば、アンチセンス化合物およびその標的核酸）の対合を意味する。特定の機構に限定されないが、最も一般的な対合機構には水素結合が含まれ、これは、相補的核酸塩基間のワトソン・クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。

【0114】

本明細書で使用されるとき、「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴマー化合物が、ある核酸部位にハイブリダイズするよりも高い親和性で別の核酸部位にハイブリダイズする能力を意味する。

【0115】

本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドまたはその部分に関して「完全に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドまたはその部分の各核酸塩基が、相補的な核酸またはその連続した部分の核酸塩基と対合することができることを意味する。したがって、完全に相補的な領域は、いずれの鎖でもミスマッチまたは非ハイブリダイズ核酸塩基を含まない。

【0116】

本明細書で使用されるとき、「パーセント相補性」とは、標的核酸の等長部分に相補的なオリゴマー化合物の核酸塩基の割合を意味する。パーセント相補性は、標的核酸の対応する位置の核酸塩基に相補的なオリゴマー化合物の核酸塩基の数をオリゴマー化合物の全長で割ることによって計算される。

【0117】

本明細書で使用されるとき、「パーセント同一性」とは、第１の核酸の核酸塩基の総数で割った、第２の核酸の対応する位置の核酸塩基と同一の（化学修飾から独立した）種類の第１の核酸の核酸塩基の数を意味する。

【0118】

本明細書で使用されるとき、「調節」とは、調節前の分子、機能、もしくは活性の量または質と比較した、分子、機能、もしくは活性の量または質の変化を意味する。例えば、調節は、遺伝子発現における増加（刺激もしくは誘導）または減少（阻害もしくは低減）のいずれかの変化を含む。さらなる例として、発現の調節は、調節の不在下における量と比較した、特定のスプライス変異体の絶対量または相対量の変化をもたらすプレｍＲＮＡ処理のスプライス部位選択の変化を含み得る。

【0119】

本明細書で使用されるとき、「化学モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域における化学修飾のパターンを意味する。モチーフは、オリゴヌクレオチドのある特定のヌクレオシドおよび／またはある特定の結合基での修飾によって定義され得る。

【0120】

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシドモチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域におけるヌクレオシド修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドの結合は、修飾または非修飾であり得る。別途示されない限り、本明細書においてヌ
クレオシドのみを記載するモチーフは、ヌクレオシドモチーフであるよう意図される。したがって、そのような事例において、結合は限定されない。

【0121】

本明細書で使用されるとき、「糖モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域における糖修飾のパターンを意味する。

【0122】

本明細書で使用されるとき、「結合モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域における結合修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、修飾または非修飾であり得る。別途示されない限り、本明細書において結合のみを記載するモチーフは、結合モチーフであるよう意図される。したがって、そのような事例において、ヌクレオシドは限定されない。

【0123】

本明細書で使用されるとき、「核酸塩基修飾モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドに沿った核酸塩基への修飾のパターンを意味する。別途示されない限り、核酸塩基修飾モチーフは、核酸塩基配列から独立している。

【0124】

本明細書で使用されるとき、「配列モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその部分に沿って整列した核酸塩基のパターンを意味する。別途示されない限り、配列モチーフは、化学修飾から独立しており、それ故に、化学修飾なしを含む化学修飾の任意の組み合わせを有し得る。

【0125】

本明細書で使用されるとき、ヌクレオシドまたはある「種類」のヌクレオシドに関する「修飾の種類」とは、ヌクレオシドの化学修飾を意味し、修飾および非修飾ヌクレオシドを含む。したがって、別途示されない限り、「第１の種類の修飾を有するヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオシドであり得る。

【0126】

本明細書で使用されるとき、「別々に修飾された」とは、修飾の不在を含む、互いに異なる化学修飾または化学置換基を意味する。したがって、例えば、ＭＯＥヌクレオシドおよび非修飾ＤＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドが修飾されていなくても「別々に修飾される」。同様に、ＤＮＡおよびＲＮＡは、これら両方ともに天然に存在する非修飾ヌクレオシドであっても「別々に修飾される」。同一であるが、異なる核酸塩基を含むヌクレオシドは、別々に修飾されない。例えば、２’−ＯＭｅ修飾糖および非修飾アデニン核酸塩基を含むヌクレオシドと２’−ＯＭｅ修飾糖および非修飾チミン核酸塩基を含むヌクレオシドは、別々に修飾されない。

【0127】

本明細書で使用されるとき、「同一の種類の修飾」とは、修飾の不在を含む、互いに同一の修飾を指す。したがって、例えば、２個の非修飾ＤＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドが修飾されていなくても「同一の種類の修飾」を有する。同一の種類の修飾を有するそのようなヌクレオシドは、異なる核酸塩基を含み得る。

【0128】

本明細書で使用されるとき、「別個の領域」とは、オリゴヌクレオチドの部分を意味し、任意の隣接する部分の化学修飾または化学修飾のモチーフは、別個の領域が互いに区別されることを可能にする少なくとも１つの相違点を含む。

【0129】

本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される担体または希釈剤」とは、動物への投与における使用に好適な任意の物質を意味する。ある特定の実施形態において、薬剤的に許容される担体または希釈剤は、滅菌生理食塩水である。ある特定の実施形態において、そのような滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。

【0130】

本明細書で使用されるとき、「代謝性障害」という用語は、主に代謝（食物を分解して
エネルギーを生成することに関連した一連の複雑な化学反応）の異常調節を特徴とする疾患または状態を意味する。

【0131】

本明細書で使用されるとき、「心血管障害」という用語は、主に心臓または血管の機能障害を特徴とする疾患または状態を意味する。

【0132】

本明細書で使用されるとき、「単環式または多環式環系」という用語は、単環式または多環式ラジカル環系から選択されるすべての環系を含むよう意図されており、前記環は、縮合または連結され、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、およびヘテロアリールアルキルから個別に選択される単一環系および混合環系を含むよう意図される。そのような単環式および多環式構造は、各々が同一のレベルの飽和を有するか、または各々が独立して、完全に飽和、部分的に飽和、もしくは完全に不飽和を含む様々な程度の飽和を有する環を含有し得る。各環は、複素環式環、および例えばベンズイミダゾール等の混合モチーフに存在し得るＣ環原子のみを含む環を生じさせるために、Ｃ、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される環原子を含み得、１個の環は、炭素環原子のみを有し、縮合環は、２個の窒素原子を有する。単環式または多環式環系は、例えば、前記環のうちの１個に結合される２個の＝Ｏ基を有するフタルイミド等の置換基とさらに置換され得る。単環式または多環式環系は、環原子を介した直接結合、複数の環原子を介した縮合、置換基を介した結合、または二機能性結合部分を介した結合等の様々な戦略を用いて親分子に結合され得る。

【0133】

本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」とは、対象に投与されると、代謝して活性化合物またはより活性の化合物（例えば、薬物）を形成する化合物の不活性形態または活性の低い形態を意味する。

【0134】

本明細書で使用されるとき、「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」および「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」とは、指名された親化合物の原子または基を置換する原子または基を意味する。例えば、修飾ヌクレオシドの置換基は、天然に存在するヌクレオシドに見られる原子または基とは異なる任意の原子または基である（例えば、修飾された２’−置換基は、ＨまたはＯＨ以外のヌクレオシドの２’位の任意の原子または基である）。置換基は、保護されても保護されなくてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、親化合物の１つの位置または２つ以上の位置に置換基を有する。置換基は、他の置換基ともさらに置換され得、親化合物に直接結合され得るか、またはアルキル基もしくはヒドロカルビル基等の結合基を介して結合され得る。

【0135】

同様に、本明細書で使用されるとき、化学官能基に関する「置換基」とは、指名された官能基に通常存在する原子または原子団とは異なる原子または原子団を意味する。ある特定の実施形態において、置換基は、官能基の水素原子を置換する（例えば、ある特定の実施形態において、置換メチル基の置換基は、非置換メチル基の水素原子のうちの１個を置換する水素以外の原子または基である）。別途示されない限り、置換基としての使用に従順な基には、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ_ａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ（−Ｏ−Ｒ_ａａ）、アリール、アラルキル、複素環式ラジカル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、イミノ（＝ＮＲ_ｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａａ）、アジド（−Ｎ_３）、ニトロ（−ＮＯ_２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_ａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、チオウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、グアニジニル（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）また
は−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）（Ｒ_ａａ））、チオール（−ＳＲ_ｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒ_ｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｂｂ）、およびスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｂｂ）が含まれるが、これらに限定されない。式中、各Ｒ_ａａ、Ｒ_ｂｂ、およびＲ_ｃｃは、独立して、Ｈ、任意に連結された化学官能基、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、およびヘテロアリールアルキルを含むが、これらに限定されない好ましいリストを有するさらなる置換基である。本明細書に記載の化合物内の選択された置換基は、再帰的程度まで存在する。

【0136】

本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される「アルキル」とは、最大２４個の炭素原子を含有する飽和直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は、典型的には、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）を含み、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。

【0137】

本明細書で使用されるとき、「アルケニル」とは、最大２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素鎖ラジカルを意味する。アルケニル基の例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエン等のジエン等が挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルケニル基は、１個以上のさらなる置換基を任意に含み得る。

【0138】

本明細書で使用されるとき、「アルキニル」とは、最大２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキニル基の例として、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルキニル基は、１個以上のさらなる置換基を任意に含み得る。

【0139】

本明細書で使用されるとき、「アシル」とは、有機酸からのヒドロキシル基の除去によって形成されたラジカルを意味し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、式中、Ｘは、典型的には、脂肪族、脂環式、または芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族ホスフェート、脂肪族ホスフェート等が挙げられる。本明細書で使用されるアシル基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0140】

本明細書で使用されるとき、「脂環式」とは、環式環系を意味し、前記環は、脂肪族である。前記環系は、１個以上の環を含み得、少なくとも１個の環は、脂肪族である。好ましい脂環式基は、環内に約５〜約９個の炭素原子を有する環を含む。本明細書で使用される脂環式基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0141】

本明細書で使用されるとき、「脂肪族」とは、最大２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味し、任意の２個の炭素原子の間の飽和は、一重、二重、または三重結合である。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子を含有し、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖または分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含む１個以上のヘテロ原子
で中断され得る。ヘテロ原子によって中断されるそのような脂肪族基には、ポリアルコキシ、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、およびポリイミンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される脂肪族基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0142】

本明細書で使用されるとき、「アルコキシ」とは、アルキル基と酸素原子との間に形成されたラジカルを意味し、前記酸素原子を用いて、アルコキシ基を親分子に結合させる。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるアルコキシ基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0143】

本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」とは、アミノ置換されたＣ_１〜Ｃ_１２アルキルラジカルを意味する。前記ラジカルのアルキル部分は、親分子と共有結合を形成する。アミノ基は、任意の位置に位置し得、アミノアルキル基は、アルキルおよび／またはアミノ部分のさらなる置換基で置換され得る。

【0144】

本明細書で使用されるとき、「アラルキル」および「アリールアルキル」とは、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルラジカルに共有結合される芳香族基を意味する。結果として生じるアラルキル（またはアリールアルキル）基のアルキルラジカル部分は、親分子と共有結合を形成する。例として、ベンジル、フェネチル等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるアラルキル基は、ラジカル基を形成するアルキル、アリール、またはこれら両方の基に結合されるさらなる置換基を任意に含み得る。

【0145】

本明細書で使用されるとき、「アリール」および「芳香族」とは、１個以上の芳香族環を有する単環式または多環式炭素環式環系ラジカルを意味する。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアリール環系は、１個以上の環内に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用されるアリール基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0146】

本明細書で使用されるとき、「ハロ」および「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される原子を意味する。

【0147】

本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」とは、単環式もしくは多環式芳香族環、環系、または縮合環系を含むラジカルを意味し、前記環のうちの少なくとも１つは、芳香族であり、１個以上のヘテロ原子を含む。ヘテロアリールは、縮合環のうちの１個以上がヘテロ原子を含有しない系を含む縮合環系もまた含むよう意図される。ヘテロアリール基は、典型的には、硫黄、窒素、または酸素から選択される１個の環原子を含む。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル等が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールラジカルは、親分子に直接結合され得るか、または脂肪族基もしくはヘテロ原子等の結合部分を介して結合され得る。本明細書で使用されるヘテロアリール基は、さらなる置換基を任意に含み得る。

【0148】

本明細書で使用されるとき、「共役化合物」とは、共役基としての使用に好適な任意の原子、原子団、または結合原子団を意味する。ある特定の実施形態において、共役化合物は、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込
み特性、電荷特性、および／またはクリアランス特性を含むが、これらに限定されない１つ以上の特性を有し得るか、または付与し得る。

【0149】

本明細書で使用されるとき、別途示されないか、または修正されない限り、「二本鎖」という用語は、互いにハイブリダイズされる２個の別個のオリゴマー化合物を指す。そのような二本鎖化合物は、一方もしくは両方の鎖（オーバーハング）の一方もしくは両方の末端に１個以上のヌクレオシドまたはハイブリダイズしていないヌクレオシドを有し得、かつ／または１個以上のハイブリダイズしていない内部ヌクレオシド（ミスマッチ）を有し得るが、但し、生理学的関連条件下でハイブリダイゼーションを維持するのに十分な相補性が存在することを条件とする。

【0150】

本明細書で使用されるとき、「５’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

【0151】

本明細書で使用されるとき、「約」とは、値の±１０％以内を意味する。例えば、「マーカーが約５０％増加し得る」と述べられている場合、マーカーが４５％〜５５％増加し得るという意味が含まれる。

【0152】

本明細書で使用されるとき、「同時に投与される」とは、２つの薬剤の薬理学的効果が患者に同時に現れる任意の様式でそれら２つの薬剤を共投与することを指す。同時投与は、両方の薬剤が、単一の医薬組成物で、同一の剤形で、または同一の投与経路によって投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果が同時に現われなくてもよい。効果は、ある期間の重複しか必要とせず、共に広範囲に及ぶ必要はない。

【0153】

本明細書で使用されるとき、「投与する」または「投与」とは、個体に医薬品を提供することを意味し、医療専門家による投与および自己投与を含むが、これらに限定されない。個体への医薬品の投与は、連続投与、長期投与、短期投与、または間欠投与であり得る。投与は、非経口投与または非非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与であり得る。

【0154】

本明細書で使用されるとき、「薬剤」とは、動物に投与したときに治療的利益を提供することができる活性物質を意味する。「第１の薬剤」とは、本発明の治療用化合物を意味する。例えば、第１の薬剤は、ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第２の薬剤」とは、本発明の第２の治療用化合物（例えば、ａｐｏ（ａ）を標的とする第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド）および／または非ａｐｏ（ａ）治療用化合物を意味する。

【0155】

本明細書で使用されるとき、「改善」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」とは、関連疾患、障害、または状態の少なくとも１つの指標、兆候、または症状の軽減を指す。指標の重症度は、当業者に既知の主観的または客観的尺度によって決定され得る。

【0156】

本明細書で使用されるとき、「動物」とは、ヒト、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、および非ヒト霊長類（サルおよびチンパンジーを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない非ヒト動物を指す。

【0157】

本明細書で使用されるとき、「ａｐｏ（ａ）」とは、ａｐｏ（ａ）をコードする任意の核酸またはタンパク質配列を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）は、ａｐｏ（ａ）をコードするＤＮＡ配列、ａｐｏ（ａ）をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）、ａｐｏ（
ａ）をコードするｍＲＮＡ配列、またはａｐｏ（ａ）をコードするペプチド配列を含む。

【0158】

本明細書で使用されるとき、「ａｐｏ（ａ）核酸」とは、ａｐｏ（ａ）をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸は、ａｐｏ（ａ）をコードするＤＮＡ配列、ａｐｏ（ａ）をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）、およびａｐｏ（ａ）をコードするｍＲＮＡ配列を含む。

【0159】

本明細書で使用されるとき、「ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ」とは、ａｐｏ（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。

【0160】

本明細書で使用されるとき、「ａｐｏ（ａ）タンパク質」とは、Ａｐｏ（ａ）をコードする任意のタンパク質配列を意味する。

【0161】

本明細書で使用されるとき、「ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤」とは、ａｐｏ（ａ）核酸および／またはａｐｏ（ａ）タンパク質の発現を特異的に阻害することができる任意の薬剤を指す。例えば、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、ならびにａｐｏ（ａ）核酸および／またはａｐｏ（ａ）タンパク質の発現を阻害することができる他の薬剤を含む。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸発現および／またはａｐｏ（ａ）タンパク質発現を特異的に調節することにより、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、下流成分を含む脂質輸送系の他の成分に影響を与え得る。同様に、ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、動物における他の分子過程に影響を与え得る。

【0162】

本明細書で使用されるとき、「アテローム性動脈硬化症」とは、大動脈および中動脈に影響を及ぼす動脈の硬化を意味し、脂肪沈着物の存在を特徴とする。脂肪沈着物は、「アテローム」または「プラーク」と呼ばれ、主にコレステロールおよび他の脂肪、カルシウム、ならびに瘢痕組織からなり、動脈の内膜を損傷する。

【0163】

本明細書で使用されるとき、「冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）」とは、血液および酸素を心臓に供給する微小血管の狭窄を意味し、これは、多くの場合、アテローム性動脈硬化症の結果である。

【0164】

本明細書で使用されるとき、「真性糖尿病」または「糖尿病」は、不十分なレベルのインスリンまたはインスリン感受性の低下に起因する代謝障害および異常に高い血糖（高血糖症）を特徴とする症候群である。特徴的な症状は、高血糖値に起因した過剰な尿産生（多尿症）、排尿増加を補うための過剰な口渇および水分摂取の増加（多渇症）、目の視覚への高血糖の影響に起因した視界のぼやけ、原因不明の体重減少、および嗜眠である。

【0165】

本明細書で使用されるとき、「糖尿病性脂質異常症」または「脂質異常症を伴う２型糖尿病」とは、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃの減少、トリグリセリド（ＴＧ）の増加、および小さく高密度のＬＤＬ粒子の増加を特徴とする状態を意味する。

【0166】

本明細書で使用されるとき、「希釈剤」とは、薬理学的活性を欠くが、薬剤的に必要であるか、または望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注入された組成物中の希釈剤は、液体、例えば、生理食塩水であり得る。

【0167】

本明細書で使用されるとき、「脂質異常症」とは、脂質および／またはリポタンパク質の過剰産生または欠損を含む、脂質および／またはリポタンパク質代謝の障害を指す。脂質異常症は、カイロミクロン、コレステロール、およびトリグリセリド等の脂質、ならび
に低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール等のリポタンパク質の増加により明らかになり得る。

【0168】

本明細書で使用されるとき、「投薬単位」とは、医薬品が提供される形態、例えば、丸剤、錠剤、または当技術分野で既知の他の投薬単位を意味する。ある特定の実施形態において、投薬単位は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。ある特定の実施形態において、投薬単位は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。

【0169】

本明細書で使用されるとき、「用量」とは、単回投与で提供されるか、または特定の期間に提供される医薬品の特定の量を意味する。ある特定の実施形態において、用量は、１、２、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注入で投与され得る。例えば、ある特定の実施形態において、皮下投与が所望される場合、所望の用量は、単回注入では容易に提供されない体積を必要とし、それ故に、２回以上注入して所望の用量を達成することができる。ある特定の実施形態において、医薬品は、輸液によって長期間にわたって、または連続して投与される。用量は、１時間、１日、１週間、または１ヶ月当たりの医薬品の量で提示され得る。用量は、ｍｇ／ｋｇまたはｇ／ｋｇでも提示され得る。

【0170】

本明細書で使用されるとき、「有効な量」または「治療的に有効な量」とは、活性医薬品を必要とする個体において所望の生理学的結果をもたらすのに十分な活性医薬品の量を意味する。有効な量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤、個体の病状の評価、ならびに他の関連因子によって個体間で異なり得る。

【0171】

本明細書で使用されるとき、「完全に相補的な」または「１００％相補的な」とは、第１の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が、第２の核酸の第２の核酸塩基配列中に相補的な核酸塩基を有すことを意味する。ある特定の実施形態において、第１の核酸は、アンチセンス化合物であり、第２の核酸は、標的核酸である。

【0172】

本明細書で使用されるとき、「グルコース」とは、エネルギー源および炎症性中間体として細胞によって使用される単糖である。「血漿グルコース」とは、血漿中に存在するグルコースを指す。

【0173】

本明細書で使用されるとき、「高密度リポタンパク質−Ｃ」または「ＨＤＬ−Ｃ」とは、高密度リポタンパク質粒子に関連したコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−の濃度は、典型的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌ単位で定量される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」および「血漿ＨＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ、血清および血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。

【0174】

本明細書で使用されるとき、「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤」とは、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチン等の酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害によって作用する薬剤を意味する。

【0175】

本明細書で使用されるとき、「高コレステロール血症」とは、成人における高コレステロールを検出し、その治療の評価する全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）の専門委員会報告書のガイドラインに見られる、コレステロールの上昇、または循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、およびＶＬＤＬ−コレステロールを特徴とする状態を意味する（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．（１９８８）１４８，３６−３９を参照のこと）。

【0176】

本明細書で使用されるとき、「脂質異常症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）」または「脂質異常症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ）」は、血清脂質または循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする状態である。この状態は、異常に高い脂肪濃度を示す。循環血液中の脂質画分は、コレステロール、低密度リポタンパク質、超低密度リポタンパク質、カイロミクロン、およびトリグリセリドである。脂質異常症のフレドリクソン分類は、電気泳動または超遠心分離によって測定されるＴＧおよびコレステロール豊富なリポタンパク質粒子のパターンに基づき、一般に高トリグリセリド血症等の脂質異常症の主な原因を特徴付けるために用いられる（ＦｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎおよびＬｅｅ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９６５，３１：３２１−３２７、Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ，１９６７，２７６（１）：３４−４２）。

【0177】

本明細書で使用されるとき、「高トリグリセリド血症」とは、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする状態を意味する。その病因には、一時的要因（すなわち、遺伝子的原因）および二次的要因（糖尿病、代謝症候群／インスリン抵抗性、肥満、運動不足、喫煙、過剰なアルコール摂取、および炭水化物が非常に多い食事等の他の根本にある原因）、または、多くの場合、これらの組み合わせが含まれる（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．ＣＭＡＪ，２００７，１７６：１１１３−１１２０）。

【0178】

本明細書で使用されるとき、「特定する」または「代謝性疾患もしくは心臓血管疾患を有する動物を選択する」とは、高コレステロール血症、高血糖症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高血圧症、インスリン抵抗性の増加、インスリン感受性の低下、標準以上の体重、および／もしくは標準以上の体脂肪含量、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、代謝性疾患、心臓血管疾患、もしくは代謝症候群を発症しやすいか、または代謝性疾患、心臓血管疾患、もしくは代謝症候群と診断された対象を特定または選択すること、あるいは、代謝性疾患、心臓血管疾患、または代謝症候群の任意の症状を有する対象を特定または選択することを意味する。そのような特定は、血清または循環（血漿）コレステロールの測定、血清または循環（血漿）血糖の測定、血清または循環（血漿）トリグリセリドの測定、血圧の測定、体脂肪含量の測定、体重の測定等の標準の臨床試験または評価を含むが、これらに限定されない任意の方法によって達成され得る。

【0179】

本明細書で使用されるとき、「心臓血管転帰の改善」とは、有害な心臓血管系イベントの発症またはその危険性の低減を意味する。有害な心臓血管系イベントの例には、死、再梗塞、発作、心臓性ショック、肺浮腫、心停止、および心房律動不整が挙げられるが、これらに限定されない。

【0180】

本明細書で使用されるとき、「直接隣接した」とは、直接隣接した要素間に、例えば、領域、区分、ヌクレオチド、および／またはヌクレオシド間に介在要素が存在しないことを意味する。

【0181】

本明細書で使用されるとき、「ＨＤＬの増加」または「ＨＤＬの上昇」とは、いかなる化合物も投与されていない動物のＨＤＬレベルと比較して、本発明の少なくとも１つの化合物の投与後の動物におけるＨＤＬのレベルの増加を意味する。

【0182】

本明細書で使用されるとき、「個体」または「対象」または「動物」とは、治療または療法に選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。

【0183】

本明細書で使用されるとき、「それを必要とする個体」とは、治療または療法を必要とするそのような治療または療法に選択されたヒトまたは非ヒト動物を指す。

【0184】

本明細書で使用されるとき、「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」、「低減させる」等は、２つの状態間の量的差を示す。例えば、「ａｐｏ（ａ）の活性または発現を阻害するのに有効な量」とは、処理された試料のａｐｏ（ａ）の活性または発現のレベルが処理されていない試料のａｐｏ（ａ）の活性または発現のレベルとは異なることを意味する。そのような用語は、例えば、発現のレベルおよび活性のレベルに適用される。

【0185】

本明細書で使用されるとき、「炎症状態」とは、炎症をもたらす疾患、病状、症候群、または他の状態を指す。例えば、リウマチ性関節炎および肝線維症は、炎症状態である。炎症状態の他の例には、敗血症、心筋虚血／再灌流傷害、成人呼吸窮迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、および血管炎が挙げられる。

【0186】

本明細書で使用されるとき、「発現または活性を阻害する」とは、ＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性の減少または阻止を指し、必ずしも発現または活性の完全な排除を示すわけではない。

【0187】

本明細書で使用されるとき、「インスリン抵抗性」とは、正常な量のインスリンが、脂肪、筋肉、および肝細胞から正常なインスリン応答をもたらすには不十分である状態と定義される。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、血漿中の遊離脂肪酸を上昇させる貯蔵されたトリグリセリドの加水分解をもたらす。筋肉におけるインスリン抵抗性がグルコース取り込みを減少させる一方で、肺におけるインスリン抵抗性は、グルコース貯蔵を減少させ、これら両方の影響は、血糖を上昇させる働きをする。インスリン抵抗性に起因したインスリンおよびグルコースの高血漿レベルは、多くの場合、代謝症候群および２型糖尿病に至る。

【0188】

本明細書で使用されるとき、「インスリン感受性」は、個体がどの程度効果的にグルコースを処理するかの尺度である。高インスリン感受性を有する個体がグルコースを効果的に処理する一方で、低インスリン感受性を有する個体は、グルコースを効果的に処理しない。

【0189】

本明細書で使用されるとき、「脂質低下」とは、対象における１つ以上の脂質（例えば、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）の減少を意味する。「脂質上昇」とは、対象における脂質（例えば、ＨＤＬ）の増加を意味する。脂質低下または脂質上昇は、１回以上の用量で経時的に生じ得る。

【0190】

本明細書で使用されるとき、「脂質低下療法」または「脂質低下剤」とは、対象における１つ以上の脂質を減少させるために対象に提供される治療レジメンを意味する。ある特定の実施形態において、脂質低下療法は、対象におけるａｐｏ（ａ）、ＣＥＴＰ、ａｐｏＢ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小さく高密度のＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）のうちの１つ以上を減少させるために提供される。脂質低下療法の例には、ａｐｏＢ阻害剤、スタチン、フィブラート、およびＭＴＰ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

本明細書で使用されるとき、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ等の「リポタンパク質」とは、血清、血漿、およびリンパ液中に見られるタンパク質群を指し、脂質輸送に重要である。各リポタンパク質の化学組成物は、例えば、ＨＤＬが、脂質よりも高い割合のタンパク質を有する一方で、ＶＬＤＬが、脂質よりも低い割合のタンパク質を有するという点で異なる。

【0192】

本明細書で使用されるとき、「Ｌｐ（ａ）」は、ａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢを含有するＬＤＬ様粒子を含む。ａｐｏ（ａ）は、ジスルフィド結合によってａｐｏＢに連結される。

【0193】

本明細書で使用されるとき、「低密度リポタンパク質−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」とは、低密度リポタンパク質粒子中で運搬されるコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＬＤＬ−Ｃの濃度は、典型的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌ単位で定量される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＬＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ、血清および血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。

【0194】

本明細書で使用されるとき、「主要危険因子」とは、特定の疾患または状態に対する高い危険性に寄与する因子を指す。ある特定の実施形態において、冠状動脈性心臓病の主要危険因子には、喫煙、高血圧、高ＬＤＬ、低ＨＤＬ−Ｃ、冠状動脈性心臓病の家族歴、年齢、および本明細書に開示される他の因子が含まれるが、これらに限定されない。

【0195】

本明細書で使用されるとき、「代謝性障害」または「代謝性疾患」とは、代謝機能の変化または障害を特徴とする状態を指す。「代謝性」および「代謝」は、当技術分野で周知の用語であり、一般に、生きている生物内で生じるあらゆる種類の生化学的プロセスを含む。代謝性障害には、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン抵抗性、代謝症候群、ならびに２型糖尿病に起因する脂質異常症が含まれるが、これらに限定されない。

【0196】

本明細書で使用されるとき、「代謝症候群」とは、代謝由来の脂質および非脂質心血管危険因子のクラスタ化を特徴とする状態を意味する。ある特定の実施形態において、代謝症候群は、以下の因子：男性において１０２ｃｍを超え、女性において８８ｃｍを超えるウエスト周り；少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血清トリグリセリド；男性において４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性において５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ；少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧；および少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコースのうちのいずれか３つの存在によって特定される。これらの決定因子は、臨床診療時に容易に測定され得る（ＪＡＭＡ，２００１，２８５：２４８６−２４９７）。

【0197】

「非経口投与」とは、注入または輸液を介する投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば、髄腔内もしくは脳室内投与が含まれる。投与は、連続投与、長期投与、短期投与、または間欠投与であり得る。

【0198】

本明細書で使用されるとき、「ペプチド」とは、アミド結合によって少なくとも２つのアミノ酸を連結することによって形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を指す。

【0199】

本明細書で使用されるとき、「医薬品」とは、個体に投与されたときに治療的利益を提供する物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬品である。

【0200】

本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」または「組成物」とは、個体への投与に好適な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性剤と医薬担体、例えば、滅菌水溶液を含み得る。

【0201】

本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される誘導体」は、溶媒和物、水和物、エ
ステル、プロドラッグ、多形体、異性体、同位体標識バリアント、薬剤的に許容される塩、および当技術分野で既知の他の誘導体等の本明細書に記載の化合物の誘導体を包含する。

【0202】

本明細書で使用されるとき、「薬剤的に許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的および薬剤的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつそれに望ましくない毒物学的影響を与えない塩を意味する。「薬剤的に許容される塩」または「塩」という用語は、薬剤的に許容される非毒性酸または塩基（無機または有機酸および塩基を含む）から調製された塩を含む。本明細書に記載の化合物の「薬剤的に許容される塩」は、当技術分野で周知の方法によって調製され得る。薬剤的に許容される塩の概説については、Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００２）を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であり、ヒトへの治療的投与に広く受け入れられている。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の化合物は、ナトリウム塩の形態である。

【0203】

本明細書で使用されるとき、「部分」とは、核酸の連続した（すなわち、連結された）核酸塩基の定義された数を意味する。ある特定の実施形態において、部分は、標的核酸の連続した核酸塩基の定義された数である。ある特定の実施形態において、部分は、アンチセンス化合物の連続した核酸塩基の定義された数である。

【0204】

本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」とは、数分から無期限の期間、疾患、障害、もしくは状態の発病もしくは発症を遅延させるか、または未然に防ぐことを指す。予防は、疾患、障害、または状態の発症の危険性を低下させることも意味する。

【0205】

本明細書で使用されるとき、「上昇」とは、量の増加を意味する。例えば、血漿ＨＤＬレベルを上昇させるとは、血漿中のＨＤＬの量を増加させることを意味する。

【0206】

本明細書で使用されるとき、「低減」とは、より低い程度、小さい大きさ、少ない量、または少ない数に減らすことを意味する。例えば、血漿トリグリセリドレベルを低下させるとは、血漿中のトリグリセリドの量を減らすことを意味する。

【0207】

本明細書で使用されるとき、「領域」または「標的領域」は、少なくとも１つの特定可能な構造、機能、または特性を有する標的核酸の一部と定義される。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合点、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義される核酸領域を包含し得る。ａｐｏ（ａ）の構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースの受入番号によって得ることができ、そのような情報は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、標的領域は、標的領域内のある標的セグメントの５’標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。

【0208】

本明細書で使用されるとき、「第２の薬剤」または「第２の治療薬」とは、「第１の薬剤」と組み合わせて用いられ得る薬剤を意味する。第２の治療薬には、ａｐｏ（ａ）またはａｐｏＢを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ得るが、これに限定されない。第２の薬剤には、抗ａｐｏ（ａ）抗体、ａｐｏ（ａ）ペプチド阻害剤、コレステロール低下剤、脂質低下剤、グルコース低下剤、および抗炎症薬も含まれ得る。

【0209】

本明細書で使用されるとき、「セグメント」は、核酸内の領域のより小さい下位部分と定義される。例えば、「標的セグメント」とは、１つ以上のアンチセンス化合物が標的と
する標的核酸のヌクレオチド配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。あるいは、「開始部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指し得、「終止部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。標的セグメントは、ある配列の「開始部位」で始まり、別の配列の「終止部位」で終わり得る。

【0210】

本明細書で使用されるとき、「スタチン」とは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害する薬剤を意味する。

【0211】

本明細書で使用されるとき、「皮下投与」とは、皮膚の直下への投与を意味する。

【0212】

本明細書で使用されるとき、「対象」とは、治療または療法に選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。

【0213】

本明細書で使用されるとき、「心臓血管疾患または障害の症状」とは、心臓血管疾患または障害に起因し、かつそれを伴う現象を意味し、その指標として働く。例えば、アンギナ、胸痛、息切れ、動悸、衰弱、目まい、嘔気、発汗、頻脈、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔のしびれ、肢のしびれ、跛行もしくは筋けいれん、腹部腫脹、または発熱は、心臓血管疾患または障害の症状である。

【0214】

本明細書で使用されるとき、「標的とする」または「標的にする」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、かつ所望の効果を引き起こすアンチセンス化合物の設計および選択のプロセスを意味する。

【0215】

本明細書で使用されるとき、「治療的に有効な量」とは、個体に治療的利益を提供する医薬品の量を意味する。

【0216】

本明細書で使用されるとき、「治療的生活スタイル変化」とは、脂肪（ｆａｔ）／脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ）組織量および／またはコレステロールを低下させるように意図された食生活および生活スタイルの変化を意味する。そのような変化は、心臓病を発症する危険性を低下させることができ、１日の総カロリー、総脂質、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一価不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維の食事摂取量の推奨、ならびに身体的活動の推奨を含み得る。

【0217】

本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」とは、本明細書に記載の化合物を投与して、疾患、障害、または状態の変化または改善をもたらすことを指す。

【0218】

本明細書で使用されるとき、「トリグリセリド」または「ＴＧ」とは、３つの脂肪酸分子と結合されるグリセロールからなる脂質または中性脂肪を意味する。

【0219】

本明細書で使用されるとき、「２型真性糖尿病」、「真性糖尿病２型」、「インスリン非依存性糖尿病」、「ＮＩＤＤＭ」、「肥満関連糖尿病」、または「成人発症糖尿病」としても既知の「２型糖尿病」は、主にインスリン抵抗性、相対的インスリン欠損、および高血糖症を特徴とする代謝性障害である。

ある特定の実施形態

【0220】

ある特定の実施形態において、化合物は、当技術分野で既知のアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））を標的にするｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと、
本明細書に記載の共役基とを含む。共役に好適なａｐｏ（ａ）を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドの例として、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３／１７７４６８号、米国特許第ＵＳ８，６７３，６３２号、同第ＵＳ７，２５９，１５０号、および米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０２４２５１６号に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、化合物は、国際公開第ＷＯ２０１３／１７７４６８号に開示される、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のうちのいずれかの核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、本明細書に記載の共役基とを含む。ある特定の実施形態において、化合物は、米国特許第ＵＳ８，６７３，６３２号に開示される、配列番号１１〜４５および８５〜９６のうちのいずれかの核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、本明細書に記載の共役基とを含む。ある特定の実施形態において、化合物は、米国特許第ＵＳ７，２５９，１５０号に開示される、配列番号１１〜４５のうちのいずれかの核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、本明細書に記載の共役基とを含む。ある特定の実施形態において、化合物は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０２４２５１６号に開示される、配列番号７〜４１のうちのいずれかの核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、本明細書に記載の共役基とを含む。前記参照される配列番号のうちのすべての核酸塩基配列が参照により本明細書に組み込まれる。

【0221】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を減少させるための化合物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）関連疾患を治療、予防、または改善するためのａｐｏ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび共役基である。

【0222】

ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させるための化合物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、化合物は、Ｌｐ（ａ）関連疾患を治療、予防、または改善するためのａｐｏ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび共役基である。

【0223】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドは、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または３０個の連結したヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結したヌクレオシドからなる。

【0224】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４のうちのいずれかのの等長部分に相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む。

【0225】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）セグメントを標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、例えば実施例１１４および１１７に示される標的セグメントのうちのいずれかの等長部分に相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む。表において、「開始部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指し、「終止部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。標的セグメントは、表に列記される各配列の開始部位から終止部位に及び得る。あるいは、標的セグメントは、ある配列の開始部位からの範囲であり得、別の配列の終止部位で終わり得る。例えば、表１２５に示されるように、標的セグメントは、３９０１から３９２０（配列番号５８の開始部位から終止部位）に及び得る。別の例において、表１２５に示されるように、標的セグメントは、３９００から３９２３（配列番号５７の開始部位から配列番号６１の終止部位）に及び得る。

【0226】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１〜４のうちのいずれかに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、例えば実施例１１４および１１７に示される標的セグメントのうちのいずれかに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。

【0227】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補的である。

【0228】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９００〜３９２３の等長部分に相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または３０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補的である。

【0229】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配
列を有する。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれか１つの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のうちのいずれか１つと共役基からなる。

【0230】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜２０、２２〜３３、３５〜４４、４７〜５０、５１、５３、５７〜６２、６５〜６６、６８、７０〜７９、８１、８５〜８６、８９〜９０、９２〜９４、９７、１０５〜１１０、１０３〜１０４、１３３〜１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１２〜２０、２２〜３３、３５〜４４、４７〜５０、５１、５３、５７〜６２、６５〜６６、６８、７０〜７９、８１、８５〜８６、８９〜９０、９２〜９４、９７、１０５〜１１０、１０３〜１０４、１３３〜１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0231】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１９、２６〜３０、３２、３５、３８〜４４、４６〜４７、５０、５７〜５８、６１、６４〜６６、６８、７２〜７４、７６〜７７、９２〜９４、１０３〜１１０の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１２〜１９、２６〜３０、３２、３５、３８〜４４、４６〜４７、５０、５７〜５８、６１、６４〜６６、６８、７２〜７４、７６〜７７、９２〜９４、１０３〜１１０の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0232】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１１１、１１４〜１２１、１２３〜１２９の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１１１、１１４〜１２１、１２３〜１２９の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0233】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、１７、１８、２６〜２８、３９、７１、１０６〜１０７の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１４、１７、１８、２６〜２８、３９、７１、１０６〜１０７の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0234】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役
基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、２６〜２９、３９〜４０、８２の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１４、２６〜２９、３９〜４０、８２の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0235】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、１６〜１８の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号１４、１６〜１８の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0236】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号２６〜２７、１０７の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号２６〜２７、１０７の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0237】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号２８〜２９、３９〜４０、４７の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号２８〜２９、３９〜４０、４７の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0238】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号２８、９３、１０４、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号２８、９３、１０４、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかと共役基からなる。

【0239】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、
共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態において、化合物は、配列番号５８および共役基からなる。

【0240】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ４９４３７２を含み、式中、Ｘは、ＧａｌＮＡｃを含む共役基である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ４９４３７２からなり、式中、Ｘは、ＧａｌＮＡｃを含む共役基である。

【化16】

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【0241】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５１を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５１からなる。

【化17】

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【0242】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役体修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５７を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６８１２５７からなる。

【化18】

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【0243】

ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾が変化する５’−ＧａｌＮＡｃを有する配列番号５８の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾が変化する５’−ＧａｌＮＡｃを有する配列番号５８の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドからなり、

【化19】

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【0244】

式中、Ｒ^１が、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（ＭＯＥ）であり、Ｒ^２が、Ｈであるか、またはＲ^１およびＲ^２が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^１が、−Ｏ−であり、Ｒ^２が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^１およびＲ^２が直接連結され、
同一の環上、独立して、各環のＲ^３とＲ^４の各対について、Ｒ^３が、Ｈおよび−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択され、Ｒ^４が、Ｈであるか、またはＲ^３およびＲ^４が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^３が、−Ｏ−であり、Ｒ^４が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^３およびＲ^４が直接連結され、
Ｒ^５が、Ｈおよび−ＣＨ_３から選択され、
Ｚが、Ｓ⁻およびＯ⁻から選択される。

【0245】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。

【0246】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態において、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。

【0247】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、少なくとも１個のヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。

【0248】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾糖を含む。ある特定の実施形態において、修飾糖は、二環糖である。ある特定の実施形態において、修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’橋を含み、式中、ｎは、１または２である。

【0249】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ（ａ）連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。

【0250】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ（ａ）１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【0251】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のうちのいずれかの少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと
３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【0252】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【0253】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号５８の核酸塩基配列を有する２０個の連結したヌクレオシドからなり、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【0254】

ある特定の実施形態において、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で修飾オリゴヌクレオチドに連結される。ある特定の実施形態において、共役基は、飾オリゴヌクレオチドの３’末端で修飾オリゴヌクレオチドに連結される。

【0255】

ある特定の実施形態において、共役基は、１個以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、２個以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、３個以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、３個のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、各リガンドは、多糖、修飾多糖、糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、ガラクトース誘導体、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコロイル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコ−ヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、
Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースの中から選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンである。

【0256】

ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンである。

【0257】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化20】

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【0258】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化21】

[この文献は図面を表示できません]

【0259】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

【0260】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

【0261】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

【0262】

ある特定の実施形態において、共役基は、少なくとも１個のリン結合基または中性結合基を含む。

【0263】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下の中から選択される構造を含み、

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜１２であり、
ｍは、１〜１２である。

【0264】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下の中から選択される構造を有するテザーを有し、

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｌは、リン結合基または中性結合基のいずれかであり、
Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキであり、
各ｍ１は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ１は、各テザーに対して０を超える。

【0265】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下の中から選択される構造を有するテザーを有し、

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｚ２は、ＨまたはＣＨ３であり、
各ｍ１は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ１は、各テザーに対して０を超える。

【0266】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下の中から選択される構造を有するテザーを有し、

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜１２であり、
ｍは、１〜１２である。

【0267】

ある特定の実施形態において、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドに共有結合される。

【0268】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0269】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
各ｎは、独立して、０または１であり、
ｑは、１〜５の整数である。
ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0270】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0271】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0272】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0273】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0274】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の式によって表される構造を有し、

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0275】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｌは、独立して、リン結合基または中性結合基であり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0276】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

【0277】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の構造を有する。

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

【0278】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

【0279】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

【0280】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

【0281】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、ピロリジンを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、ピロリジンを含まない。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、ＰＥＧを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アミドを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、少なくとも２個のアミドを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アミドを含まない。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、ポリアミドを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、アミンを含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、１個以上のジスルフィド結合を含む。ある特定の実施形態において、共役リンカーは、タンパク質結合部分を含む。ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、脂質を含む。

【0282】

ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメト
キシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質の中から選択される。

【0283】

ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、Ｃ１６〜Ｃ２２長鎖飽和もしくは不飽和脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタン、または１−ペンタフルオロプロピルの中から選択される。

【0284】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化43】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、ｐが、１〜６である。

【0285】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0286】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

【0287】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜２０である。

【0288】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

【0289】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

【0290】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の構造を有する。

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

【0291】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造のうちの１つを有し、

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0292】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造のうちの１つを有し、

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0293】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

【0294】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化53】

[この文献は図面を表示できません]

【0295】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

【0296】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

【0297】

ある特定の実施形態において、分岐基は、エーテルを含む。

【0298】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有し、

【化56】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
ｍは、２〜６である。

【0299】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

【0300】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の構造を有する。

【化58】

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【0301】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下を有し、

【化59】

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式中、各ｊは、１〜３の整数であり、
各ｎは、１〜２０の整数である。

【0302】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下を有する。

【化60】

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【0303】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の中から選択され、

【化61】

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式中、Ｌは、リン結合基および中性結合基から選択され、
Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキであり、
各ｍ１は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ１は、各テザーに対して０を超える。

【0304】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の中から選択され、

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｚ２は、ＨまたはＣＨ３であり、
各ｍ２は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ２は、各テザーに対して０を超える。

【0305】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の中から選択される。

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜１２であり、
ｍは、１〜１２である。

【0306】

ある特定の実施形態において、少なくとも１個のテザーは、エチレングリコールを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のテザーは、アミドを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のテザーは、ポリアミドを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１個のテザーは、アミンを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも２個のテザーが互いに異なる。ある特定の実施形態において、テザーのすべてが互いに同一である。ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の中から選択され、

【化64】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
各ｐは、１〜約６である。

【0307】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の中から選択される。

【化65】

[この文献は図面を表示できません]

【0308】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の構造を有し、

【化66】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0309】

ある特定の実施形態において、各テザーは、以下の構造を有する。

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【0310】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下

【化68】

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の中から選択される構造を有し、
式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

【0311】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化69】

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【0312】

ある特定の実施形態において、リガンドは、ガラクトースである。ある特定の実施形態において、リガンドは、マンノース−６−ホスフェートである。

【0313】

ある特定の実施形態において、各リガンドは、以下の中から選択され、

【化70】

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式中、各Ｒ１は、ＯＨおよびＮＨＣＯＯＨから選択される。

【0314】

ある特定の実施形態において、各リガンドは、以下の中から選択される。

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

【0315】

ある特定の実施形態において、各リガンドは、以下の構造を有する。

【化72】

[この文献は図面を表示できません]

【0316】

ある特定の実施形態において、各リガンドは、以下の構造を有する。

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

【0317】

ある特定の実施形態において、共役基は、細胞標的部分を含む。

【0318】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下の構造を有する細胞標的部分を含み、

【化74】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0319】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下の構造を有する。

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

【0320】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0321】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下の構造を有する。

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

【0322】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

【0323】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

【0324】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化80】

[この文献は図面を表示できません]

【0325】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化81】

[この文献は図面を表示できません]

【0326】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

【0327】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

【0328】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

【0329】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

【0330】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

【0331】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

【0332】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

【0333】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化89】

[この文献は図面を表示できません]

【0334】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化90】

[この文献は図面を表示できません]

【0335】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化91】

[この文献は図面を表示できません]

【0336】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

【0337】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化93】

[この文献は図面を表示できません]

【0338】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

【0339】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

【0340】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

【0341】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化97】

[この文献は図面を表示できません]

【0342】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含む。

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

【0343】

ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、以下を含み、

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される。

【0344】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含み、

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される。

【0345】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含み、

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される。

【0346】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

【0347】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

【0348】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

【0349】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含む。

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

【0350】

ある特定の実施形態において、共役基は、ホスホジエステル、アミド、またはエステルの中から選択される切断可能な部分を含む。

【0351】

ある特定の実施形態において、共役基は、ホスホジエステル切断可能な部分を含む。

【0352】

ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能な部分を含まず、共役基は、共役基とオリゴヌクレオチドとの間にホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、アミド切断可能な部分を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、エステル切断可能な部分を含む。

【0353】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化106】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0354】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化107】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0355】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは結合固体支持体であり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0356】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは結合固体支持体であり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0357】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0358】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化111】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３が、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0359】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化112】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0360】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化113】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0361】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化114】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0362】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化115】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0363】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化116】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0364】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化117】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0365】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化118】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0366】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化119】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0367】

ある特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有し、

【化120】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0368】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含み、

【化121】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0369】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含み、

【化122】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0370】

ある特定の実施形態において、共役基は、以下を含み、

【化123】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0371】

ある特定の実施形態において、Ｂｘは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、またはシトシン、もしくは５−メチルシトシンの中から選択される。ある特定の実施形態において、Ｂｘは、アデニンである。ある特定の実施形態において、Ｂｘは、チミンである。ある特定の実施形態において、Ｑ１３は、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。ある特定の実施形態において、Ｑ１３は、Ｈである。

【0372】

ある特定の実施形態において、化合物は、塩形態である。さらなる実施形態において、化合物は、薬剤的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。ある特定の実施形態において、化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基、またはその塩、ならびに薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む。

【0373】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の共役アンチセンス化合物を含む組成物を提供し、化合物の粘度レベルは、４０センチポイズ（ｃＰ）未満である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役アンチセンス化合物は、実施例１２５に記載のパラメータで測定されたときに、４０ｃＰ未満、３５ｃＰ未満、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満、または１５ｃＰ未満の粘度を有するため、有効である。

【0374】

ある特定の実施形態は、組成物と、動物に本明細書に開示される共役アンチセンス化合物または組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物の投与は、心臓血管、代謝性、および／もしくは炎症性疾患を予防するか、治療するか、改善するか、またはその進行を遅らせる。

【0375】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）関連疾患、障害、または状態を治療するための療法において用いるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、または状態を治療するための療法において用いるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）および／またはＬｐ（ａ）レベルは、動物において上昇する。ある特定の実施形態において、組成物は、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤を含む化合物である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤は、核酸である。ある特定の実施形態において、核酸は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基である。ある特定の実施形態において、共役基を有するａｐｏ（ａ）を標的とする修飾オリゴヌクレオチドは、心臓血管および／もしくは代謝性疾患、障害、または状態を治療し、予防し、その進行を遅らせ、改善する際に用いられる。ある特定の実施形態において、治療用の組成物および方法は、ａｐｏ（ａ）特異的阻害剤をそれを必要とする個体に投与することを含む。

【0376】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、組織、臓器、または対象におけるａｐｏ（ａ）レベルの低下は、ＬＤＬ：ＨＤＬ比またはＴＧ：ＨＤＬ比を改善する。ある特定の実施形態は、動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させるための組成物および方法を提供し、動物に本明細書に開示される共役アンチセンス化合物または組成物を投与して、動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させることを含む。ある特定の実施形態は、動物におけるＬｐ（ａ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供し、動物に本明細書に開示される共役アンチセンス化合物または組成物を投与して、動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させることを含む。

【0377】

ある特定の実施形態は、組成物を必要とする対象におけるａｐｏ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防し、治療し、遅延させ、それらの進行を遅延らせ、かつ／または改善するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、組成物を必要とする対象におけるＬｐ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防し、治療し、遅延させ、それらの進行を遅らせ、かつ／または改善するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、そのような疾患、障害、および状態には、炎症性、心臓血管、および／または代謝性疾患、障害、および状態が含まれる。ある特定のそのような心臓血管疾患、障害、または状態には、乳糜血症、高トリグリセリド血症、大動脈弁狭窄症、動脈瘤（例えば、腹部大動脈瘤）、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠状動脈性心臓病、脂質異常症、高コレステロール血症、脂質異常症、高血圧症、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患、末梢動脈閉塞疾患）、網膜血管閉塞、または発作が含まれるが、これらに限定されない。ある特定のそのような代謝性疾患、障害、または状態には、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、肥満、インスリン抵抗性、代謝症候群、および糖尿病性脂質異常症が含まれるが、これらに限定されない。ある特定のそのような炎症性疾患、障害、または状態には、大動脈弁狭窄症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、および血栓塞栓性疾患、障害、または状態が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の血栓塞栓性疾患
、障害、または状態には、発作、血栓症（例えば、静脈血栓塞栓症）、心筋梗塞、および末梢血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態は、大動脈弁狭窄症を予防し、治療し、遅延させ、進行を遅らせ、かつ／または改善するための組成物および方法を提供する。

【0378】

ある特定の実施形態は、心臓血管疾患、障害、または状態の少なくとも１つの症状を軽減させる方法を提供する。ある特定の実施形態において、これらの症状には、アンギナ、胸痛、息切れ、動悸、衰弱、目まい、嘔気、発汗、頻脈、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔のしびれ、肢のしびれ、跛行または筋けいれん、腹部腫脹、および発熱が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態は、大動脈弁狭窄症の少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。

【0379】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）またはＬｐ（ａ）発現の調節は、細胞、組織、または臓器内で生じる。ある特定の実施形態において、調節は、動物における細胞、組織、または臓器内で生じる。ある特定の実施形態において、調節は、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルの低下である。ある特定の実施形態において、調節は、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下である。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルとａｐｏ（ａ）タンパク質レベルのいずれも低下する。ある特定の実施形態において、調節は、Ｌｐ（ａ）レベルの低下である。そのような低下は、時間依存的または用量依存的様式で生じ得る。

【0380】

ある特定の実施形態において、対象または動物は、ヒトである。

【0381】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は非経口投与される。さらなる実施形態において、非経口投与は、皮下投与である。

【0382】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物または組成物は、第２の薬剤または療法と共投与される。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物または組成物および第２の薬剤は、同時に投与される。

【0383】

ある特定の実施形態において、第２の薬剤は、グルコース低下剤である。ある特定の実施形態において、第２の薬剤は、ＬＤＬ、ＴＧ、またはコレステロール低下剤である。ある特定の実施形態において、第２の薬剤は、抗炎症薬である。ある特定の実施形態において、第２の薬剤は、アルツハイマー病薬である。ある特定の実施形態において、第２の薬剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、例えば、アスピリン）、ナイアシン（例えば、Ｎｉａｓｐａｎ）、ニコチン酸、ａｐｏＢ阻害剤（例えば、Ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）、ＣＥＴＰ阻害剤（例えば、Ａｎａｃｅｔｒａｐｉｂ）、ａｐｏ（ａ）阻害剤、甲状腺ホルモン類似体（例えば、Ｅｐｒｏｔｉｒｏｍｅ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート（例えば、Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）、およびミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤（例えば、Ｌｏｍｉｔａｐｉｄｅ）であり得るが、これらに限定されない。療法は、Ｌｐ（ａ）アフェレーシスであり得るが、これに限定されない。薬剤または療法は、共投与され得るか、または同時に投与され得る。薬剤または療法は、連続して投与され得るか、またはその後に投与され得る。

【0384】

ある特定の実施形態は、動物におけるａｐｏ（ａ）レベルを低下させるためのａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物の使用を提供するある特定の実施形態は、動物におけるＬｐ（ａ）レベルを低下させるためのａｐｏ（ａ）を標的にする。共役アンチセンス化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）に関連した疾患、障害、または状態を治療、予防、または改善するためのａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）に関連した疾患、
障害、または状態を治療、予防、または改善するためのａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物の使用を提供する。

【0385】

ある特定の実施形態は、動物におけるａｐｏ（ａ）レベルを低下させる薬剤の調製におけるａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、動物におけるＬｐ（ａ）レベルを低下させる薬剤の調製におけるａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）に関連した疾患、障害、または状態を治療、予防、または改善する薬剤の調製のための共役アンチセンス化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）に関連した疾患、障害、または状態を治療、予防、または改善する薬剤の調製のための共役アンチセンス化合物の使用を提供する。

【0386】

ある特定の実施形態は、ａｐｏ（ａ）および／またはＬｐ（ａ）に関連した疾患のうちの１つ以上を治療するか、改善するか、遅らせるか、または予防する薬剤の製造における本明細書に記載の共役アンチセンス化合物の使用を提供する。

【0387】

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の疾患、障害、または状態を治療、予防、または改善するためのキットを提供し、このキットは、（ｉ）本明細書に記載のａｐｏ（ａ）特異的阻害剤と、任意に（ｉｉ）本明細書に記載の第２の薬剤または療法を含む。

【0388】

本発明のキットは、本明細書に記載の併用療法によって本明細書に記載の疾患、障害、または状態を治療、予防、または改善するためのキットを用いるための取扱説明書をさらに含み得る。

Ｂ．ある特定の化合物

【0389】

ある特定の実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび共役体を含む共役アンチセンス化合物を提供する。

ａ．ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド

【0390】

ある特定の実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、連結したヌクレオシドを含み、各ヌクレオシドは、糖部分および核酸塩基を含む。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造は、化学的特徴（例えば、修飾および修飾パターン）ならびに核酸塩基配列（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列、同一性、および標的核酸の配列）の点から考慮され得る。
ｉ．ある特定の化学的特徴

【0391】

ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾を含む。ある特定のそのような実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を含む。

１．ある特定の糖部分

【0392】

ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、修飾糖部分を含む１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。１個以上の糖修飾ヌクレオシドを含むそのような化合物は、天然に存在する糖部分を含むヌクレオシドのみを含むオリゴヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ安定性の強化または標的核酸との結合親和性の増大等の望ましい特性を有し得る。ある
特定の実施形態において、修飾糖部分は、置換糖部分である。ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代理物である。そのような糖代理物は、置換糖部分の置換に対応する１つ以上の置換を含み得る。

【0393】

ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、２’位および／または５’位の置換基を含むが、これらに限定されない１個以上の非架橋糖糖置換基を含む置換糖部分である。２’位に好適な糖置換基の例として、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ_３（「ＯＭｅ」または「Ｏ−メチル」）、および２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３（「ＭＯＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、２’位の糖置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_１０置換アルキル、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、式中、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルである。５’位の糖置換基の例には、５’−メチル（ＲまたはＳ）、５’−ビニル、および５’−メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、置換糖は、２個以上の非架橋糖置換基、例えば、２’−Ｆ−５’−メチル糖部分を含む（さらなる５’，２’−ビス置換糖部分およびヌクレオシドについては、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号を参照のこと）。

【0394】

２’−置換糖部分を含むヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシドと称される。ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドは、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒ_ｍ）−アルキル；Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒ_ｍ）−アルケニル；Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｒ_ｍ）−アルキニル；Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキニル、アラルキル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）；またはＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択される２’−置換基を含み、式中、各Ｒ_ｍおよびＲ_ｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルである。これらの２’−置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ_２）、チオール、チオアルコキシ（Ｓ−アルキル）、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルから独立して選択される１個以上の置換基とさらに置換され得る。

【0395】

ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＯＣＦ_３、Ｏ−ＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、およびＮ−置換アセトアミド（Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択される２’−置換基を含み、式中、各Ｒ_ｍおよびＲ_ｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルである。

【0396】

ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ_３、Ｏ−ＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、およびＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３から選択される２’−置換基を含む糖部分を含む。

【0397】

ある特定の実施形態において、２’−置換ヌクレオシドは、Ｆ、Ｏ−ＣＨ_３、およびＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択される２’−置換基を含む糖部分を含む。

【0398】

ある特定の修飾糖部分は、第２の環を形成して二環式糖部分をもたらす架橋糖置換基を含む。ある特定のそのような実施形態において、二環式糖部分は、４’フラノース環原子
と２’フラノース環原子との間に橋を含む。そのような４’から２’の糖置換基の例には、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−；４’−ＣＨ_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_３−２’、４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ_２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’（ｃＥｔ）；および４’−ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’；ならびにこれらの類似体（例えば、２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’−Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）−Ｏ−２’およびその類似体（例えば、２００９年１月８日に公開された国際公開第ＷＯ２００９／００６４７８号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（ＯＣＨ_３）−２’およびその類似体（例えば、２００８年１２月１１日に公開された国際公開第ＷＯ２００８／１５０７２９号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−２’（例えば、２００４年９月２日に公開されたＵＳ２００４／０１７１５７０号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’；ならびに４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−（式中、各Ｒが、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒが、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、または保護基である）（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４）；ならびに４’−ＣＨ_２−Ｃ（＝ＣＨ_２）−２’およびその類似体（２００８年１２月８日に公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１５４４０１号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0399】

ある特定の実施形態において、そのような４’から２’の橋は、独立して、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｃ（Ｒ_ｂ）−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_ａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ_ａ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_ｘ−、および−Ｎ（Ｒ_ａ）−から独立して選択される１〜４の結合基を含み、
式中、
ｘは、０、１、または２であり、
ｎは、１、２、３、または４であり、
各Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式ラジカル、置換Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｊ_１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ_１）であり、
各Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキル、または保護基である。

【0400】

二環式糖部分を含むヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドまたはＢＮＡと称される。二環式ヌクレオシドには、以下に示される、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ（ロックド核酸またはＬＮＡとも称される）、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束エチルまたはｃＥｔ
とも称される）、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−２’）ＢＮＡ、および（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ_２）_３−２’）ＢＮＡが含まれるが、これらに限定されず、

【化124】

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式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0401】

さらなる二環式糖部分は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９（２６）８３６２−８３７９（Ｊｕｌ．４，２００７）、Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７、Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３、米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、および同第７，３９９，８４５号、国際公開第ＷＯ２００４／１０６３５６号、同第ＷＯ１９９４／１４２２６号、同第ＷＯ２００５／０２１５７０号、および同第ＷＯ２００７／１３４１８１号、米国特許公開第ＵＳ２００４／０１７１５７０号、同第ＵＳ２００７／０２８７８３１号、および同第ＵＳ２００８／００３９６１８号、米国特許第１２／１２９，１５４号、同第６０／９８９，５７４号、同第６１／
０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、および同第６１／０９９，８４４号、ならびにＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号、および同第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号である。

【0402】

ある特定の実施形態において、二環式糖部分およびそのような二環式糖部分を組み込むヌクレオシドは、異性体配置によってさらに定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ配置またはβ−Ｄ配置であり得る。以前に、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）二環式ヌクレオシドが、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれている（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。

【0403】

ある特定の実施形態において、置換糖部分は、１個以上の非架橋糖置換基および１個以上の架橋糖置換基（例えば、５’−置換および４’−２’架橋糖）を含む（２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００７／１３４１８１号（ＬＮＡが例えば５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換されている）を参照のこと）。

【0404】

ある特定の実施形態において、修飾糖部分は、糖代理物である。ある特定のそのような実施形態において、天然に存在する糖の酸素原子は、例えば、硫黄、炭素、または窒素原子で置換される。ある特定のそのような実施形態において、そのような修飾糖部分は、上述の架橋および／または非架橋置換基も含む。例えば、ある特定の糖代理物は、４’−硫黄原子ならびに２’位（例えば、２００５年６月１６日に公開された米国特許出願第ＵＳ２００５／０１３０９２３号を参照のこと）および／または５’位での置換を含む。さらなる例として、４’−２’橋を有する炭素環式二環式ヌクレオシドが記載されている（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３、およびＡｌｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０を参照のこと）。

【0405】

ある特定の実施形態において、糖代理物は、５個の原子以外を有する環を含む。例えば、ある特定の実施形態において、糖代理物は、モルフォリノを含む。モルフォリノ化合物およびオリゴマー化合物におけるそれらの使用は、多数の特許および公開論文（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０、ならびに米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、および同第５，０３４，５０６号を参照のこと）で報告されている。本明細書で使用されるとき、「モルフォリノ」という用語は、以下の構造を有する糖代理物を意味する。

【化125】

[この文献は図面を表示できません]

【0406】

ある特定の実施形態において、モルフォリノは、例えば、上述のモルフォリノ構造由来の様々な置換基を付加または変更することによって修飾され得る。そのような糖代理物は、本明細書において「修飾モルフォリノ」と称される。

【0407】

別の例として、ある特定の実施形態において、糖代理物は、６員テトラヒドロピランを含む。そのようなテトラヒドロピランは、さらに修飾または置換され得る。そのような修飾テトラヒドロピランを含むヌクレオシドには、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：８４１−８５４を参照のこと）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、および以下の式ＶＩを有する化合物が含まれるが、これらに限定されず、

【化126】

[この文献は図面を表示できません]

式中、独立して、式ＶＩの前記少なくとも１個のテトラヒドロピランヌクレオシド類似体の各々について、
Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｔ_３およびＴ_４は各々、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合させるヌクレオシド間結合基であるか、またはＴ_３およびＴ_４のうちの一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合させるヌクレオシド間結合基であり、Ｔ_３およびＴ_４のうちの他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合共役基、または５’もしくは３’−末端基であり、
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、およびｑ_７は各々、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、または置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルであり、
Ｒ_１およびＲ_２の各々は、水素、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、およびＣＮの中から独立して選択され、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ_１であり、各Ｊ_１、Ｊ_２、およびＪ_３は、独立して、ＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである。

【0408】

ある特定の実施形態において、式ＶＩの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、およびｑ_７は各々、Ｈである。ある特定の実施形態において、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、およびｑ_７のうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。ある特定の実施形態において、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、およびｑ_７のうちの少なくとも１つは、メチルである。ある特定の実施形態において、式ＶＩのＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、Ｒ_１およびＲ_２のうちの一方がＦである。ある特定の実施形態において、Ｒ_１がフルオロであり、Ｒ_２がＨであり、Ｒ_１がメトキシであり、Ｒ_２がＨであり、Ｒ_１がメトキシエトキシであり、Ｒ_２がＨである。

【0409】

アンチセンス化合物への組み込みのためにヌクレオシドを修飾するために用いられ得る多くの他のビシクロおよびトリシクロ糖代理物環系も当技術分野で既知である（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，１０，８４１−８５４を参照のこと）。

【0410】

２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについては、２００８年８月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号を参照のこと）、ならびにリボシル環酸素原子のＳとの置換および２’位でのさらなる置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願第ＵＳ２００５−０１３０９２３号を参照のこと）、またはあるいは二環式核酸の５’−置換（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドが５’位で５’−メチルまたは５’−ビニル基でさらに
置換される、２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００７／１３４１８１号を参照のこと）等であるが、これらに限定されない修飾の組み合わせも提供される。炭素環式二環式ヌクレオシドのオリゴマー化および生化学的研究に加えて、それらの合成および調製も記載されている（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９を参照のこと）。

【0411】

ある特定の実施形態において、本開示は、修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。これらの修飾ヌクレオチドは、修飾糖、修飾核酸塩基、および／または修飾結合を含み得る。特異的修飾は、結果として生じるオリゴヌクレオチドが望ましい特徴を有するように選択される。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１個以上のＲＮＡ様ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１個以上のＤＮＡ様ヌクレオチドを含む。
２．ある特定の核酸塩基修飾

【0412】

ある特定の実施形態において、本開示のヌクレオシドは、１個以上の非修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、本開示のヌクレオシドは、１個以上の修飾核酸塩基を含む。

【0413】

ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、本明細書で定義されるユニバーサル塩基、疎水性塩基、乱交雑塩基、サイズ拡大塩基、およびフッ素化塩基から選択される。５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンには、本明細書で定義される、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル；５−プロピニルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−ＣoＣ−ＣＨ_３）ウラシルならびにシトシンおよびピリミジン塩基の
他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、乱交雑塩基、サイズ拡大塩基、およびフッ素化塩基が含まれる。さらに、修飾核酸塩基には、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンに置換される塩基も含まれ得る。さらに、核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される塩基、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９に開示される塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示される塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３−２８８によって開示される塩基が含まれる。

【0414】

上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のある特定の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、および同第６，００５，０９６号が含まれるが、これらに限定されず、これらのある特定の特許は、本出願と共同所有されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
３．ある特定のヌクレオシド間結合

【0415】

ある特定の実施形態において、本開示は、連結したヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。そのような実施形態において、ヌクレオシドは、任意のヌクレオシド間結合を用いて一緒に連結され得る。ヌクレオシド間結合基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または不在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、およびホスホロチオエート（ＰＳ）を含むが、これらに限定されない。代表的な非リン含有ヌクレオシド間結合基は、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）_２−Ｏ−）、およびＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−）を含むが、これらに限定されない。修飾結合は、天然ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変化させる、典型的には、増加させるために用いられ得る。ある特定の実施形態において、キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ混合物として、または別個の鏡像異性体として調製され得る。代表的なキラル結合は、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートを含むが、これらに限定されない。リン含有および非リン含有ヌクレオシド間結合の調製方法は、当業者に周知である。

【0416】

本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の不斉中心を含有し、それ故に、絶対立体化学の点で、（Ｒ）もしくは（Ｓ）、糖アノマー等の場合、αもしくはβ、またはアミノ酸等の場合、（Ｄ）もしくは（Ｌ）と定義され得る、鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の立体異性体配置を生じさせる。本明細書に提供されるアンチセンス化合物には、すべてのそのような考えられる異性体、ならびにそれらのラセミ形態および光学的に純粋な形態が含まれる。

【0417】

中性ヌクレオシド間結合には、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（３’−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−５’）、アミド−３（３’−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、アミド−４（（３’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−５’）、およびチオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−５’）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、中性ヌクレオシド間結合には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、硫化物、スルホン酸エステル、およびアミドを含む非イオン性結合が含まれる（例えば、
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３ ａｎｄ ４，４０−６５を参照のこと）。さらに、中性ヌクレオシド間結合には、混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分部分を含む非イオン性結合が含まれる。
４．ある特定のモチーフ

【0418】

ａ．ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾ヌクレオシド（例えば、修飾糖および／または修飾核酸塩基を含むヌクレオシド）ならびに／または１個以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。オリゴヌクレオチドにおけるそのような修飾のパターンは、本明細書においてモチーフと称される。ある特定の実施形態において、糖、核酸塩基、および結合モチーフは、互いに独立している。
ａ．ある特定の糖モチーフ

【0419】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、定義されたパターンまたは糖修飾モチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された１種類以上の修飾糖部分および／または天然に存在する糖部分を含む。そのようなモチーフは、本明細書で論じられる糖修飾および／または他の既知の糖修飾のうちのいずれかを含み得る。

【0420】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２個の外部領域または「ウィング」および中央もしくは内部領域または「ギャップ」を含むギャップマー糖モチーフを有する領域を含むか、またはそれからなる。ギャップマー糖モチーフの３個の領域（５’−ウィング、ギャップ、および３’−ウィング）は、ヌクレオシドの連続した配列を形成し、これらのウィングの各々のヌクレオシドの糖部分の少なくとも一部は、このギャップのヌクレオシドの糖部分の少なくとも一部とは異なる。具体的には、少なくとも、ギャップに最も近い（５’−ウィングの最も３’側のヌクレオシドおよび３’−ウィングの最も５’側のヌクレオシド）各ウィングのヌクレオシドの糖部分が、隣接するギャップヌクレオシドの糖部分とは異なり、それ故に、ウィングとギャップとの間の境界を定義する。ある特定の実施形態において、ギャップ内の糖部分は、互いに同一である。ある特定の実施形態において、ギャップは、ギャップの１個以上の他のヌクレオシドの糖部分とは異なる糖部分を有する１個以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、２個のウィングの糖モチーフは、互いに同一である（対称性糖ギャップマー）。ある特定の実施形態において、５’−ウィングの糖モチーフは、３’−ウィングの糖モチーフとは異なる（不斉糖ギャップマー）。
ｉ．ある特定の５’−ウィング

【0421】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜８個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜７個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜６個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、２〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、３〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、４または５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１〜３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１または２個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、２〜４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の
実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、２または３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、３または４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、１個のヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、２個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、６個の連結したヌクレオシドからなる。

【0422】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも２個の二環式ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも３個の二環式ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも４個の二環式ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、拘束エチルヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0423】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、非二環式修飾ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＯＭｅヌクレオシドである。

【0424】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個のリボヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングの各ヌクレオシドは、リボヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、５’−ウィングのヌクレオシドのうちの１個、２個以上、または各々は、ＲＮＡ様ヌクレオシドである。

【0425】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップ
マーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0426】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの５’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。
ｉｉ．ある特定の３’−ウィング

【0427】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜８個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜７個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜６個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、２〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、３〜５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、４または５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１〜３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１または２個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、２〜４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、２または３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、３または４個の連結したヌクレオシドからなる。

【0428】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、１個のヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、２個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、３個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、６個の連結したヌクレオシドからなる。

【0429】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレ
オシドは、拘束エチルヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

【0430】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも２個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも３個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも４個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、非二環式修飾ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＯＭｅヌクレオシドである。

【0431】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のリボヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングの各ヌクレオシドは、リボヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、５’−ウィングのヌクレオシドのうちの１個、２個以上、または各々は、ＲＮＡ様ヌクレオシドである。

【0432】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0433】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0434】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬ
ＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0435】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシド、少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシド、少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、少なくとも１個の非二環式修飾ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0436】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシド、少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシド、少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、少なくとも１個の２’−置換ヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0437】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＭＯＥヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。

【0438】

ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の二環式ヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個の拘束エチルヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーの３’−ウィングは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、少なくとも１個の２’−ＯＭｅヌクレオシド、および少なくとも１個の２’−デオキシヌクレオシドを含む。
ｉｉｉ．ある特定の中央領域（ギャップ）

【0439】

ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６〜２０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６〜１５個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャ
ップは、６〜１２個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６〜１０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６〜９個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６〜８個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６または７個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、７〜１０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、７〜９個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、７または８個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、８〜１０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、８または９個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、６個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、７個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、８個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、９個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、１０個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、１１個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、１２個の連結したヌクレオシドからなる。

【0440】

ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップの各ヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップの各ヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシドであるか、または「ＤＮＡ様」の修飾ヌクレオシドである。そのような実施形態において、「ＤＮＡ様」とは、ギャップマーおよびＲＮＡ分子を含む二本鎖がＲＮａｓｅ Ｈを活性化することができるようにヌクレオシドがＤＮＡと同様の特徴を有することを意味する。例えば、ある特定の条件下で、２’−（ａｒａ）−Ｆは、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化を支援することが示されており、それ故に、ＤＮＡ様である。ある特定の実施形態において、ギャップマーのギャップの１個以上のヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシドではなく、ＤＮＡ様でもない。ある特定のそのような実施形態において、ギャップマーは、それでもやはり、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化を支援する（例えば、非ＤＮＡヌクレオシドの数または設置のおかげで）。

【0441】

ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上の修飾ヌクレオシドによって中断された一続きの非修飾２’−デオキシヌクレオシドを含み、それ故に、３個のサブ領域（２つの一続きの、１個以上の２’−デオキシヌクレオシドおよび一続きの１個以上の中断修飾ヌクレオシド）をもたらす。ある特定の実施形態において、いずれの一続きの非修飾２’−デオキシヌクレオシドも、５、６、または７個のヌクレオシドより短い。ある特定の実施形態において、そのような短い続きは、短いギャップ領域を用いることによって達成される。ある特定の実施形態において、短い一続きは、より長いギャップ領域を中断することによって達成される。

【0442】

ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、ｃＥｔ、ＦＨＮＡ、ＬＮＡ、および２−チオ−チミジンの中から選択される１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、１個の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、５’−Ｍｅおよび５’−（Ｒ）−Ｍｅの中から選択される５’−置換糖部分を含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、２個の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、３個の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形
態において、ギャップは、４個の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、２個以上の修飾ヌクレオシドを含み、各修飾ヌクレオシドは同一である。ある特定の実施形態において、ギャップは、２個以上の修飾ヌクレオシドを含み、各修飾ヌクレオシドは異なる。

【0443】

ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上の修飾結合を含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上のメチルホスホネート結合を含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、２個以上の修飾結合を含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、１個以上の修飾結合および１個以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、１個の修飾結合および１個の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、ギャップは、２個の修飾結合および２個以上の修飾ヌクレオシドを含む。

ｂ．ある特定のヌクレオシド間結合モチーフ

【0444】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、定義されたパターンまたは修飾ヌクレオシド間結合モチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、交互のヌクレオシド間結合モチーフを有する領域を含む。ある特定の実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは、均一に修飾されたヌクレオシド間結合の領域を含む。ある特定のそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって均一に連結された領域を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって均一に連結される。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択される。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートから選択され、少なくとも１個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

【0445】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも７個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１１個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１３個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１４個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。

【0446】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも７個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１
０個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の１２個の連続したホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１個のブロックを含む。ある特定のそのような実施形態において、少なくとも１個のそのようなブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。ある特定のそのような実施形態において、少なくとも１個のそのようなブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端の３個のヌクレオシド内に位置する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１５個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１４個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１３個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１１個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、９個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、８個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、７個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、６個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５個未満のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
ｃ．ある特定の核酸塩基修飾モチーフ

【0447】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、定義されたパターンまたは核酸塩基修飾モチーフでオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って配置された核酸塩基に対する化学修飾を含む。ある特定のそのような実施形態において、核酸塩基修飾は、ギャップモチーフで配置される。ある特定の実施形態において、核酸塩基修飾は、交互のモチーフで配置される。ある特定の実施形態において、各核酸塩基が修飾される。ある特定の実施形態において、核酸塩基のうちのいずれも化学修飾されない。

【0448】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基のブロックを含む。ある特定のそのような実施形態において、ブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する。ある特定の実施形態において、ブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端の３個のヌクレオチド内に存在する。ある特定のそのような実施形態において、ブロックは、オリゴヌクレオチドの５’末端に存在する。ある特定の実施形態において、ブロックは、オリゴヌクレオチドの５’末端の３個のヌクレオチド内に存在する。

【0449】

ある特定の実施形態において、核酸塩基修飾は、オリゴヌクレオチドの特定の位置における天然塩基の機能である。例えば、ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各プリンまたは各ピリミジンが修飾される。ある特定の実施形態において、各アデニンが修飾される。ある特定の実施形態において、各グアニンが修飾される。ある特定の実施形態において、各チミンが修飾される。ある特定の実施形態において、各シトシンが修飾される。ある特定の実施形態において、各ウラシルが修飾される。

【0450】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのシトシン部分のうちのいくつかもしくはすべてが５−メチルシトシン部分であるか、またはいずれも５−メチルシトシン部分ではない。本明細書において、５−メチルシトシンは、「修飾核酸塩基」ではない。したがって、別途示されない限り、非修飾核酸塩基は、５−メチルを有するシトシン残基および５−メチルを欠くシトシン残基の両方を含む。ある特定の実施形態において、すべてまたはいくつかのシトシン核酸塩基のメチル化状態が特定される。

【0451】

ある特定の実施形態において、核酸塩基に対する化学修飾は、ある特定の共役基の核酸塩基への結合を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各プリンまたは各ピリミジンは、共役基を含むように任意に修飾され得る。
ｄ．ある特定の全長

【0452】

ある特定の実施形態において、本開示は、様々な範囲の長さのうちのいずれかのオリゴヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｘ〜Ｙ個の連結したヌクレオシドからなり、ここで、Ｘは、その範囲の最小数のヌクレオシドを表し、Ｙは、その範囲の最大数のヌクレオシドを表す。ある特定のそのような実施形態において、ＸおよびＹは各々、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０から独立して選択されるが、但し、ＸがＹ以下であることを条件とする。例えば、ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、８〜９、８〜１０、８〜１１、８〜１２、８〜１３、８〜１４、８〜１５、８〜１６、８〜１７、８〜１８、８〜１９、８〜２０、８〜２１、８〜２２、８〜２３、８〜２４、８〜２５、８〜２６、８〜２７、８〜２８、８〜２９、８〜３０、９〜１０、９〜１１、９〜１２、９〜１３、９〜１４、９〜１５、９〜１６、９〜１７、９〜１８、９〜１９、９〜２０、９〜２１、９〜２２、９〜２３、９〜２４、９〜２５、９〜２６、９〜２７、９〜２８、９〜２９、９〜３０、１０〜１１、１０〜１２、１０〜１３、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、１０〜２０、１０〜２１、１０〜２２、１０〜２３、１０〜２４、１０〜２５、１０〜２６、１０〜２７、１０〜２８、１０〜２９、１０〜３０、１１〜１２、１１〜１３、１１〜１４、１１〜１５、１１〜１６、１１〜１７、１１〜１８、１１〜１９、１１〜２０、１１〜２１、１１〜２２、１１〜２３、１１〜２４、１１〜２５、１１〜２６、１１〜２７、１１〜２８、１１〜２９、１１〜３０、１２〜１３、１２〜１４、１２〜１５、１２〜１６、１２〜１７、１２〜１８、１２〜１９、１２〜２０、１２〜２１、１２〜２２、１２〜２３、１２〜２４、１２〜２５、１２〜２６、１２〜２７、１２〜２８、１２〜２９、１２〜３０、１３〜１４、１３〜１５、１３〜１６、１３〜１７、１３〜１８、１３〜１９、１３〜２０、１３〜２１、１３〜２２、１３〜２３、１３〜２４、１３〜２５、１３〜２６、１３〜２７、１３〜２８、１３〜２９、１３〜３０、１４〜１５、１４〜１６、１４〜１７、１４〜１８、１４〜１９、１４〜２０、１４〜２１、１４〜２２、１４〜２３、１４〜２４、１４〜２５、１４〜２６、１４〜２７、１４〜２８、１４〜２９、１４〜３０、１５〜１６、１５〜１７、１５〜１８、１５〜１９、１５〜２０、１５〜２１、１５〜２２、１５〜２３、１５〜２４、１５〜２５、１５〜２６、１５〜２７、１５〜２８、１５〜２９、１５〜３０、１６〜１７、１６〜１８、１６〜１９、１６〜２０、１６〜２１、１６〜２２、１６〜２３、１６〜２４、１６〜２５、１６〜２６、１６〜２７、１６〜２８、１６〜２９、１６〜３０、１７〜１８、１７〜１９、１７〜２０、１７〜２１、１７〜２２、１７〜２３、１７〜２４、１７〜２５、１７〜２６、１７〜２７、１７〜２８、１７〜２９、１７〜３０、１８〜１９、１８〜２０、１８〜２１、１８〜２２、１８〜２３、１８〜２４、１８〜２５、１８〜２６、１８〜２７、１８〜２８、１８〜２９、１８〜３０、１９〜２０、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３、１９〜２４、１９〜２５、１９〜２６、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２９、１９〜３０、２０〜２１、２０〜２２、２０〜２３、２０〜２４、２０〜２５、２０〜２６、２０〜２７、２０〜２８、２０〜２９、２０〜３０、２１〜２２、２１〜２３、２１〜２４、２１〜２５、２１〜２６、２１〜２７、２１〜２８、２１〜２９、２１〜３０、２２〜２３、２２〜２４、２２〜２５、２２〜２６、２２〜２７、２２〜２８、２２〜２９、２２〜３０、２３〜２４、２３〜２５、２３〜２６、２３〜２７、２３〜２８、２３〜２９、２３〜３０、２４〜２５、２４〜２６、２４〜２７、２４〜２８、２４〜２９、２４〜３０、２５〜２６、２５〜２７、
２５〜２８、２５〜２９、２５〜３０、２６〜２７、２６〜２８、２６〜２９、２６〜３０、２７〜２８、２７〜２９、２７〜３０、２８〜２９、２８〜３０、または２９〜３０個の連結したヌクレオシドからなり得る。ある範囲またはある特定の数にかかわらず、化合物のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数が限定される実施形態において、この化合物は、それでもやはり、さらなる他の置換基をさらに含み得る。例えば、８〜３０個のヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、３１個のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを除外するが、別途示されない限り、そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、１個以上の共役基、末端基、または他の置換基をさらに含み得る。

【0453】

さらに、オリゴヌクレオチドが全長範囲および特定の長さを有する領域によって説明され、かつそれらの領域の特定の長さの合計が全長範囲の上限未満である場合、オリゴヌクレオチドは、特定の領域の長さを超えてさらなるヌクレオシドを有し得るが、但し、ヌクレオシドの総数が全長範囲の上限を超えないことを条件とする。
５．ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの化学的モチーフ

【0454】

ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学構造的特徴は、それらの糖モチーフ、ヌクレオシド間結合モチーフ、核酸塩基修飾モチーフ、および全長によって特徴付けられる。ある特定の実施形態において、そのようなパラメータは各々、互いに独立している。したがって、ギャップマー糖モチーフを有するオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、修飾されても修飾されなくてもよく、糖修飾のギャップマー修飾パターンに従っても従わなくてもよい。したがって、糖ギャップマーのウィング領域内のヌクレオシド間結合は、互いに同一であるか、または異なり得、ギャップ領域のヌクレオシド間結合と同一であるか、または異なり得る。同様に、そのような糖ギャップマーオリゴヌクレオチドは、糖修飾のギャップマーパターンから独立して１個以上の修飾核酸塩基を含み得る。当業者であれば、そのようなモチーフが組み合わされて様々なオリゴヌクレオチドを作成し得ることを認識する。

【0455】

ある特定の実施形態において、ヌクレオシド間結合およびヌクレオシド修飾の選択は、互いに独立していない。

ｉ．ある特定の配列および標的

【0456】

ある特定の実施形態において、本発明は、標的核酸に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなアンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズすることができ、少なくとも１つのアンチセンス活性をもたらす。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、１個以上の標的核酸に特異的にハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、標的核酸に対して、ハイブリダイゼーションを可能にし、かつアンチセンス活性をもたらすのに十分な相補性と、任意の非標的に対して、特異的ハイブリダイゼーションが所望される条件下（例えば、生体内または治療的使用のために生理学的条件下、かつ生体外アッセイの場合、アッセイが実行される条件下）で非標的核酸配列への非特異的ハイブリダイゼーションを回避するか、または減少させるのに不十分な相補性とを有する領域を含む核酸塩基配列と、を有する。ある特定の実施形態において、標的および非標的が両方ともに標的配列を含むが、オリゴヌクレオチドは、標的と非標的との間で選択的である。そのような実施形態において、選択性は、一方の核酸分子と比較した他方の核酸分子の標的領域の相対近接性に起因し得る。

【0457】

ある特定の実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチドの全長にわたって標的核酸に完全に相補的なオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に９９％相補的である。ある特定
の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に９５％相補的である。ある特定の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、標的核酸に９０％相補的である。

【0458】

ある特定の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、標的核酸に８５％相補的である。ある特定の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、標的核酸に８０％相補的である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸に完全に相補的であり、かつオリゴヌクレオチドの全長にわたって標的核酸に少なくとも８０％相補的な領域を含む。ある特定のそのような実施形態において、完全な相補性の領域は、６〜１４核酸塩基長である。

【0459】

ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ領域および末端領域を含む。ある特定のそのような実施形態において、ハイブリダイズ領域は、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、標的核酸に完全に相補的である。ある特定の実施形態において、ハイブリダイズ領域は、標的核酸と比較して、１つのミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、ハイブリダイズ領域は、標的核酸と比較して、２つのミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、ハイブリダイズ領域は、標的核酸と比較して、３つのミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、末端領域は、１〜４個の末端ヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、末端ヌクレオシドは、３’末端に存在する。ある特定の実施形態において、末端ヌクレオシドのうちの１個以上は、標的核酸に相補的ではない。

【0460】

アンチセンス機構は、標的核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを伴う任意の機構を含み、このハイブリダイゼーションは、生物学的効果をもたらす。ある特定の実施形態において、そのようなハイブリダイゼーションは、例えば、標的核酸の翻訳、転写、またはスプライシングを伴う細胞機構の同時に起こる阻害または刺激による標的核酸分解または占有のいずれかをもたらす。

【0461】

標的ＲＮＡの分解を伴う一種のアンチセンス機構は、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介アンチセンスである。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス化合物が哺乳類細胞におけるＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発することが当技術分野で既知である。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のＤＮＡ様オリゴヌクレオチド媒介阻害の効率を大幅に向上させる。

【0462】

ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能な部分を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、１個以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、細胞標的部分（細胞標的基とも称される）を含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、分岐基を含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、１個以上のテザーを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、炭水化物または炭水化物クラスターを含む。
ｉｉ．ある特定の切断可能な部分

【0463】

ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能な部分を含む。ある特定のそのような実施形態において、切断可能な部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能な部分は、細胞標的部分に直接結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能な部分は、共役リンカーに結合する。ある特定の実施形態に
おいて、切断可能な部分は、ホスフェートまたはホスホジエステルを含む。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能なヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。ある特定の実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、プリン、置換プリン、ピリミジン、または置換ピリミジンから選択される任意に保護された複素環式塩基を含む。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン、アデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、グアニン、および２−Ｎ−イソブチリルグアニンから選択される任意に保護された複素環式塩基を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合され、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合によってリンカーに結合される２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合され、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合によってリンカーに結合される２’−デオキシアデノシンである。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合され、かつホスホジエステル結合によってリンカーに結合される２’−デオキシアデノシンである。

【0464】

ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位に結合される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２’位に結合される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のいずれかによってリンカーに結合される。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、ホスホジエステル結合によってリンカーに結合される。ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能な部分を含まない。

【0465】

ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、標的細胞によって内部に取り入れられた後にのみ、複合体が動物に投与された後に切断される。細胞内で切断可能な部分が切断され、それにより活性アンチセンスオリゴヌクレオチドを放出する。理論によって束縛されることを望むものではないが、切断可能な部分が細胞内で１個以上のヌクレアーゼによって切断されることが考えられる。ある特定の実施形態において、１個以上のヌクレアーゼは、切断可能な部分とリンカーとの間のホスホジエステル結合を切断する。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、以下の中から選択される構造を有し、

【化127】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｂｘ、Ｂｘ_１、Ｂｘ_２、およびＢｘ_３の各々は、独立して、複素環式塩基部分である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、以下の中から選択される構造を有する。

【化128】

[この文献は図面を表示できません]

ｉｉｉ．ある特定のリンカー

【0466】

ある特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含む。ある特定のそのような実施形態において、リンカーは、切断可能な部分に共有結合される。ある特定のそのような実施形態において、リンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。ある特定の実施形態において、リンカーは、細胞標的部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含み、タンパク質結合部分への共有結合もさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、テザーリガンドの結合のために複数の位置を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、テザーリガンドの結合のために複数の位置を含み、分岐基に結合されない。ある特定の実施形態において、リンカーは、１個以上の切断可能な結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含まない。

【0467】

ある特定の実施形態において、リンカーは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル（−Ｓ−）、およびヒドロキシルアミノ（−Ｏ−Ｎ（Ｈ）−）基から選択される基を含む少なくとも１個の線状基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、アルキル、アミド、およびエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、アルキルおよびエーテル基から選択され
る基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、少なくとも１個のリン結合基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、少なくとも１個のホスホジエステル基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、少なくとも１個の中性結合基を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、細胞標的部分および切断可能な部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、細胞標的部分およびアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、細胞標的部分、切断可能な部分、および固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、細胞標的部分、切断可能な部分、固体支持体、およびタンパク質結合部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、１個以上の切断可能な結合を含む。

【0468】

ある特定の実施形態において、リンカーは、足場基に共有結合される線状基を含む。ある特定の実施形態において、足場は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、およびヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、足場は、アルキル、アミド、およびエーテル基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、足場は、少なくとも１個の単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態において、足場は、少なくとも２個の単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態において、線状基は、足場基に共有結合され、足場基は、切断可能な部分およびリンカーに共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、足場基に共有結合され、足場基は、切断可能な部分、リンカー、および固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、足場基に共有結合され、足場基は、切断可能な部分、リンカー、およびタンパク質結合部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、線状基は、足場基に共有結合され、足場基は、切断可能な部分、リンカー、タンパク質結合部分、および固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態において、足場基は、１個以上の切断可能な結合を含む。

【0469】

ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分を含む。ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質を含むが、これらに限定されない脂質である。ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、Ｃ１６〜Ｃ２２長鎖飽和もしくは不飽和脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタン、または１−ペンタフルオロプロピルである。

【0470】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化129】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、ｐは、１〜６である。

【0471】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化130】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0472】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化131】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜２０である。

【0473】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化132】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｌは、独立して、リン結合基または中性結合基であり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0474】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化133】

[この文献は図面を表示できません]

【0475】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化134】

[この文献は図面を表示できません]

【0476】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化135】

[この文献は図面を表示できません]

【0477】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化136】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜２０である。

【0478】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化137】

[この文献は図面を表示できません]

【0479】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化138】

[この文献は図面を表示できません]

【0480】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化139】

[この文献は図面を表示できません]

【0481】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の構造を有する。

【化140】

[この文献は図面を表示できません]

【0482】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは、以下の構造を有する。

【化141】

[この文献は図面を表示できません]

【0483】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化142】

[この文献は図面を表示できません]

【0484】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化143】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

ｉｖ．ある特定の細胞標的部分

【0485】

ある特定の実施形態において、共役基は、細胞標的部分を含む。ある特定のそのような細胞標的部分は、アンチセンス化合物の細胞取り込みを増加させる。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、分岐基、１個以上のテザー、および１個以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞標的部分は、分岐基、１個以上のテザー、１個以上のリガンド、および１個以上の切断可能な結合を含む。
１．ある特定の分岐基

【0486】

ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基および少なくとも２個のテザーリガンドを含む標的部分を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、共役リンカーを結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、切断可能な部分を結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、リンカーおよびテザーリガンドの各々に共有結合される。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、およびエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、１個以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基を含まない。

【0487】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化144】

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【化145】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
ｊは、１〜３であり、
ｍは、２〜６である。

【0488】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化146】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
ｍは、２〜６である。

【0489】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化147】

[この文献は図面を表示できません]

【0490】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化148】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ_１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0491】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化149】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ_１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0492】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有し、

【化150】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ａ_１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0493】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有する。

【化151】

[この文献は図面を表示できません]

【0494】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有する。

【化152】

[この文献は図面を表示できません]

【0495】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下の中から選択される構造を有する。

【化153】

[この文献は図面を表示できません]

２．ある特定のテザー

【0496】

ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基に共有結合される１個以上のテザーを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、結合基に共有結合される１個以上のテザーを含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、およびポリエチレングリコール基から選択される１個以上の基を含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、ホスホジエステルおよびポリエチレングリコール基から選択される１個以上の基を含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、エーテル、およびアミド基から選択される１個以上の基を含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル、置換アルキル、ホスホジエステル、エーテル、およびアミド基から選択される１個以上の基を含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキルおよびホスホジエステルから選択される１個以上の基を含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１個のリン結合基または中性結合基を含む。

【0497】

ある特定の実施形態において、テザーは、１個以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、ホスホジエステル基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、リン結合基または中性結合基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。

【0498】

ある特定の実施形態において、各テザーは、リガンドと分岐基との間に約８〜約２０の原子鎖長を含む。ある特定の実施形態において、各テザー基は、リガンドと分岐基との間に約１０〜約１８の原子鎖長を含む。ある特定の実施形態において、各テザー基は、約１３の原子鎖長を含む。

【0499】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化154】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
各ｐは、１〜約６である。

【0500】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化155】

[この文献は図面を表示できません]

【0501】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化156】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0502】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化157】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｌは、リン結合基または中性結合基のいずれかであり、
Ｚ_１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ_２であり、
Ｚ_２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、または置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、または置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキであり、
各ｍ_１は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_１は、各テザーに対して０
を超える。

【0503】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有する。

【化158】

[この文献は図面を表示できません]

【0504】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下の中から選択される構造を有し、

【化159】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｚ_２は、ＨまたはＣＨ_３であり、
各ｍ_１は、独立して、０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_１は、各テザーに対して０を超える。

【0505】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下

【化160】

[この文献は図面を表示できません]

の中から選択される構造を有し、
式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

【0506】

ある特定の実施形態において、テザーは、リン結合基を含む。ある特定の実施形態において、テザーは、いかなるアミド結合も含まない。ある特定の実施形態において、テザーは、リン結合基を含み、いかなるアミド結合も含まない。
３．ある特定のリガンド

【0507】

ある特定の実施形態において、本開示は、各リガンドがテザーに共有結合されるリガンドを提供する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、標的細胞において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するように選択される。ある特定の実施形態において、哺乳類肝臓細胞の表面において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態において、肝アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物である。ある特定の実施形態において、各リガンドは、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、およびフコースから独立して選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ある特定の実施形態において、標的部分は、２〜６個のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、標的部分は、３個のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、標的部分は、３個のＮ−アセチルガラクトースアミンリガンドを含む。

【0508】

ある特定の実施形態において、リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾炭水化物
、多価炭水化物クラスター、多糖、修飾多糖、または多糖誘導体である。ある特定の実施形態において、リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えば、アミノ糖は、当技術分野で既知の任意の数の化合物、例えば、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース（ＧａｌＮＡｃ）、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（β−ムラミン酸）、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、およびＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン、およびＮ−グリコロイル−α−ノイラミン酸から選択され得る。例えば、チオ糖は、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、およびエチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコ−ヘプトピラノシドからなる群から選択され得る。

【0509】

ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、文献内で一般にＮ−アセチルガラクトサミンと称される２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「Ｎ−アセチルガラクトサミン」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、β形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、β形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースはどちらも、同義に使用され得る。したがって、１つの形態が示される構造において、これらの構造は、他の形態も同様に含むよう意図される。例えば、α形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの構造が示される場合、この構造は、他の形態も同様に含むよう意図される。ある特定の実施形態において、ある特定の好ましい実施形態において、β形態：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースが好ましい実施形態である。

【化161】

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【化162】

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【化163】

[この文献は図面を表示できません]

【0510】

ある特定の実施形態において、１個以上のリガンドは、以下の中から選択される構造を有し、

【化164】

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式中、各Ｒ_１は、ＯＨおよびＮＨＣＯＯＨから選択される。

【0511】

ある特定の実施形態において、１個以上のリガンドは、以下の中から選択される構造を有する。

【化165】

[この文献は図面を表示できません]

【0512】

ある特定の実施形態において、１個以上のリガンドは、以下の中から選択される構造を有する。

【化166】

[この文献は図面を表示できません]

【0513】

ある特定の実施形態において、１個以上のリガンドは、以下の中から選択される構造を有する。

【化167-1】

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ｉ．ある特定の共役体

【0514】

ある特定の実施形態において、共役基は、上述の構造的特徴を含む。ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有し、

【化167-2】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0515】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化168】

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【0516】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有し、

【化169】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｚは、Ｈまたは結合固体支持体であり、
Ｑは、アンチセンス化合物であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｂｘは、複素環式塩基部分である。

【0517】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化170】

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【0518】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化171】

[この文献は図面を表示できません]

【0519】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化172】

[この文献は図面を表示できません]

【0520】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化173】

[この文献は図面を表示できません]

【0521】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化174】

[この文献は図面を表示できません]

【0522】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化175】

[この文献は図面を表示できません]

【0523】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化176】

[この文献は図面を表示できません]

【0524】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化177】

[この文献は図面を表示できません]

【0525】

ある特定の実施形態において、共役体は、ピロリジンを含まない。

【0526】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化178】

[この文献は図面を表示できません]

【0527】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化179】

[この文献は図面を表示できません]

【0528】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化180】

[この文献は図面を表示できません]

【0529】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化181】

[この文献は図面を表示できません]

【0530】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化182】

[この文献は図面を表示できません]

【0531】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化183】

[この文献は図面を表示できません]

【0532】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化184】

[この文献は図面を表示できません]

【0533】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化185】

[この文献は図面を表示できません]

【0534】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化186】

[この文献は図面を表示できません]

【0535】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化187】

[この文献は図面を表示できません]

【0536】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は、以下の構造を有する。

【化188】

[この文献は図面を表示できません]

【0537】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化189】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、６〜１１個の連続結合原子の置換または非置換テザーである。

【0538】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化190】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、１０個の連続結合原子の置換または非置換テザーである。

【0539】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化191】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１１個の連続結合原子の置換または非置換テザーであり、前記テザーは、正確に１個のアミド結合を含む。

【0540】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化192】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ＹおよびＺは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から独立して選択される。

【0541】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化193】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ＹおよびＺは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換もしくは非置換アルキル基、または正確に１個のエーテルもしくは正確に２個のエーテル、アミド、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、もしくはホスホロチオエートを含む基から独立して選択される。

【0542】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化194】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ＹおよびＺは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換または非置換アルキル基から独立して選択される。

【0543】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化195】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｍおよびｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２から独立して選択される。

【0544】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化196】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｍは、４、５、６、７、または８であり、ｎが、１、２、３、または４である。

【0545】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化197】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続結合原子の置換または非置換テザーであり、Ｘは、エーテル基を含まない。

【0546】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化198】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、８個の連続結合原子の置換または非置換テザーであり、Ｘは、エーテル基を含まない。

【0547】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化199】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続結合原子の置換または非置換テザーであり、前記テザーは、正確に１個のアミド結合を含み、Ｘは、エーテル基を含まない。

【0548】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化200】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続結合原子の置換または非置換テザーであり、前記テザーは、アミド結合および置換または非置換Ｃ_２〜Ｃ_１１アルキル基からなる。

【0549】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化201】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、またはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から選択される。

【0550】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化202】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換もしくは非置換アルキル基、またはエーテル、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、もしくはホスホロチオエートを含む基から選択される。

【0551】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し
、

【化203】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１〜Ｃ_１２置換または非置換アルキル基から選択される。

【0552】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化204】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。

【0553】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞標的部分は、以下の構造を有し、

【化205】

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式中、ｎは、４、５、６、７、または８である。

ｂ．ある特定の共役アンチセンス化合物

【0554】

ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化206】

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式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0555】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化207】

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式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。
ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１個の切断可能な結合を含む。
ある特定のそのような実施形態において、分岐基は、少なくとも１個の切断可能な結合を含む。
ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１個の切断可能な結合を含む。

【0556】

ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。

【0557】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化208】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0558】

ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化209】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0559】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化210】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能な部分であり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0560】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有し、

【化211】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0561】

ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１個の切断可能な結合を含む。

【0562】

ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１個の切断可能な結合を含む。

【0563】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する。

【化212】

[この文献は図面を表示できません]

【0564】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する。

【化213】

[この文献は図面を表示できません]

【0565】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する。

【化214】

[この文献は図面を表示できません]

【0566】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有する。

【化215】

[この文献は図面を表示できません]

【0567】

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能な部分、ならびに他の修飾のある特定の調製を教示する代表的な米国特許、米国特許出願公開物、および国際特許出願公開物には、米国特許第５，９９４，５１７号、同第６，３００，３１９号、同第６，６６０，７２０号、同第６，９０６，１８２号、同第７，２６２，１７７号、同第７，４９１，８０５号、同第８，１０６，０２２号、同第７，７２３，５０９号、同第２００６／０１４８７４０号、同第２０１１／０１２３５２０号、国際公開第ＷＯ２０１３／０３３２３０号、および同第ＷＯ２０１２／０３７２５４号が含まれるが、これらに限定されず、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0568】

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能な部分、ならびに他の修飾のある特定の調製を教示する代表的な出版物には、ＢＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａ Ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１８４６−１８５２、Ｂ
ＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１５３８−１５４６、ＬＥＥ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｗ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｇｌｙｃｏ−ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１１）１９：２４９４−２５００、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ
ａｌ．，“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ
ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（４０）：３７５７７−３７５８４、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００４）４７：５７９８−５８０８、ＳＬＩＥＤＲＥＧＴ ｅｔ ａｌ．，“ｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）４２：６０９−６１８、およびＶａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３（２），７５９−７７０が含まれるが、これらに限定されず、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0569】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈベースのオリゴヌクレオチド（ギャップマー等）またはスプライス調節オリゴヌクレオチド（完全修飾オリゴヌクレオチド等）、および少なくとも１つ、２つ、または３個のＧａｌＮＡｃ基を含む任意の共役基を含む。 ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は
、以下の参考文献：Ｌｅｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ，１９７８，６７，５０９−５１４、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８２，２５７，９３９−９４５、Ｐａｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，１９８３，２２，５３９−５４８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８４，２３，４２５５−４２６１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ，１９８７，４，３１７−３２８、Ｔｏｙｏｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９０，３１，２６７３−２６７６、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１５３８−１５４６、Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３，７５９−７７０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９７，３８，３４８７−３４９０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７６２−７６５、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ，２００１，１１，８２１−８２９、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，３７５７７−３７５８４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００３，３６２，３８−４３、Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ
Ｊ，２００４，２１，２２７−２４１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００６，１６（１９），５１３２−５１３５、Ｍａｉｅｒｈｏ
ｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００７，１５，７６６１−７６７６、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００８，１６，５２１６−５２３１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，１９，２４９４−２５００、Ｋｏｒｎｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，４２５，４３−４６、Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，２０１２，５１，７４４５−７４４８、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１８４６−１８５２、Ｓｌｉｅｄｒｅｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４２，６０９−６１８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００４，４７，５７９８−５８０８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００６，２６，１６９−１７５、ｖａｎ Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１１，４５７−４６４、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００４，１２６，１４０１３−１４０２２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，２０１２，７７，７５６４−７５７１、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０００，１４，１７８４−１７９２、Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，９３５−９４０、Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７−３２１、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００３，１４，１８−２９、Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ
Ｌｅｔｔ，２０１０，１２，５４１０−５４１３、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２，１２，１０３−１２８、Ｍｅｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９４，５，６１２−６２０、Ｔｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１３，２１，５２７５−５２８１、国際公開第ＷＯ１９９８／０１３３８１号、同第ＷＯ２０１１／０３８３５６号、同第ＷＯ１９９７／０４６０９８号、同第ＷＯ２００８／０９８７８８号、同第ＷＯ２００４／１０１６１９号、同第ＷＯ２０１２／０３７２５４号、同第ＷＯ２０１１／１２００５３号、同第ＷＯ２０１１／１００１３１号、同第ＷＯ２０１１／１６３１２１号、同第ＷＯ２０１２／１７７９４７号、同第ＷＯ２０１３／０３３２３０号、同第ＷＯ２０１３／０７５０３５号、同第ＷＯ２０１２／０８３１８５号、同第ＷＯ２０１２／０８３０４６号、同第ＷＯ２００９／０８２６０７号、同第ＷＯ２００９／１３４４８７号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１０／１４８０１３号、同第ＷＯ１９９７／０２０５６３号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２００２／０４３７７１号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１２／０６８１８７号、同第ＷＯ２００９／１２６９３３号、同第ＷＯ２００４／０２４７５７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１２／０８９３５２号、同第ＷＯ２０１２／０８９６０２号、同第ＷＯ２０１３／１６６１２１号、同第ＷＯ２０１３／１６５８１６号、米国特許第４，７５１，２１９号、同第８，５５２，１６３号、同第６，９０８，９０３号、同第７，２６２，１７７号、同第５，９９４，５１７号、同第６，３００，３１９号、同第８，１０６，０２２号、同第７，４９１，８０５号、同第７，４９１，８０５号、同第７，５８２，７４４号、同第８，１３７，６９５号、同第６，３８３，８１２号、同第６，５２５，０３１号、同第６，６６０，７２０号、同第７，７２３，５０９号、同第８，５４１，５４８号、同第８，３４４，１２５号、同第８，３１３，７７２号、同第８，３４９，３０８号、同第８，４５０，４６７号、同第８，５０１，９３０号、同第８，１５８，６０１号、同第７，２６２，１７７号、同第６，９０６，１８２号、同第６，６２０，９１６号、同第８，４３５，４９１号、同第８，４０４，８６２号、同第７，８５１，６１５；公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００９７２６４号、同第ＵＳ２０１１／００９７２６５号、同第ＵＳ２０１３／０００４４２７号、同第ＵＳ２００５／０１６４２３５号、同第ＵＳ２００６／０１４８７４０号、同第ＵＳ２００８／０２８１０４４号、同第ＵＳ２０１０／０２４０７３０号、同第ＵＳ２００３／０１１９７２４号、同第ＵＳ２００６／０１８３８８６号、同第ＵＳ２００８／０２０６
８６９号、同第ＵＳ２０１１／０２６９８１４号、同第ＵＳ２００９／０２８６９７３号、同第ＵＳ２０１１／０２０７７９９号、同第ＵＳ２０１２／０１３６０４２号、同第ＵＳ２０１２／０１６５３９３号、同第ＵＳ２００８／０２８１０４１号、同第ＵＳ２００９／０２０３１３５号、同第ＵＳ２０１２／００３５１１５号、同第ＵＳ２０１２／００９５０７５号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１２／０１５７５０９号、同第ＵＳ２０１２／０２３０９３８号、同第ＵＳ２０１３／０１０９８１７号、同第ＵＳ２０１３／０１２１９５４号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５１２号、同第ＵＳ２０１３／０２３６９６８号、同第ＵＳ２０１１／０１２３５２０号、同第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００８／０１０８８０１号、および同第ＵＳ２００９／０２０３１３２号のうちのいずれかにおいて見出される任意の共役基を含み、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
Ｃ．ある特定の用途および特徴

【0570】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、生体内で標的ＲＮＡの強力な減少を示す。ある特定の実施形態において、非共役アンチセンス化合物は、腎臓に蓄積する。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、肝臓に蓄積する。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、良好な耐容性を示す。そのような特性は、共役アンチセンス化合物を、代謝性、心臓血管、および他の疾患、障害、または状態に関与する標的ＲＮＡを含むが、これらに限定されない多くの標的ＲＮＡの阻害に特に有用にする。したがって、肝臓組織を、そのような疾患、障害、または状態に関連したＲＮＡを標的にする共役アンチセンス化合物と接触させることによって、そのような疾患、障害、または状態を治療する方法が本明細書に提供される。したがって、本発明の共役アンチセンス化合物を用いて、様々な代謝性、心臓血管、および他の疾患、障害、または状態のうちのいずれかを改善するための方法も提供される。

【0571】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、特定の組織濃度で非共役対応物よりも強力である。いかなる理論または機構によって束縛されることを望むことなく、ある特定の実施形態において、共役体は、共役アンチセンス化合物がより効率的に細胞に入るか、またはより生産的に細胞に入ることを可能にし得る。例えば、ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、その非共役対応物と比較して、より高い標的減少を示し得、共役アンチセンス化合物およびその非共役対応物は両方ともに、同一の濃度で組織に存在する。例えば、ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、その非共役対応物と比較して、より高い標的減少を示し得、共役アンチセンス化合物およびその非共役対応物は両方ともに、同一の濃度で肝臓に存在する。

【0572】

オリゴヌクレオチドの生産的および非生産的な取り込みは、以前に論じられている（例えば、Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｅ．Ｗａｎｃｅｗｉｃｚ，ｅｔ ａｌ．（２００９）．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｏｓｅ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｖｅｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ２’−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＴＥＮ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７８（３）：２８４−９１、およびＫｏｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｔ．Ｍ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１１）：４７９５−８０７を参照のこと）。本明細書に記載の共役基は、生産的な取り込みを改善し得る。

【0573】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役基は、特定の種類の細胞または組
織に対する共役アンチセンス化合物の親和性を増加させることによって強度をさらに改善し得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役基は、１個以上の細胞表面受容体による共役アンチセンス化合物の認識を増加させることによって強度をさらに改善し得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役基は、共役アンチセンス化合物のエンドサイトーシスを促進することによって強度をさらに改善し得る。

【0574】

ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、共役アンチセンス化合物が細胞に入った後に共役体がアンチセンスオリゴヌクレオチドから切断されることを可能にすることによって強度をさらに改善し得る。したがって、ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチドに必要な用量よりも低い用量で投与され得る。

【0575】

ホスホロチオエート結合は、以前にアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれている。そのようなホスホロチオエート結合は、ヌクレアーゼに耐性を示すため、オリゴヌクレオチドの安定性を改善する。さらに、ホスホロチオエート結合は、ある特定のタンパク質にも結合し、肝臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積をもたらす。より少ないホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、肝臓にあまり蓄積せず、腎臓により多く蓄積する（例えば、Ｇｅａｒｙ，Ｒ．，“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２’−Ｏ−（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ Ｒａｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ-，Ｖｏｌ．２９６，Ｎｏ．３，８９０−８９７、およびＰｈ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，ｅｄ．，２００８を参照のこと）。ある特定の実施形態において、より少ないホスホロチオエートヌクレオシド間結合およびより多くのホスホジエステルヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、肝臓にあまり蓄積せず、腎臓により多く蓄積する。肝臓における疾患を治療する際、これは、（１）薬物が所望の作用部位（肝臓）にあまり到達せず、（２）薬物が尿に流出し、（３）腎臓が比較的高い濃度の、腎臓に毒性をもたらし得る薬物に曝露される、といったいくつかの理由のため、望ましくない。したがって、肝臓疾患の場合、ホスホロチオエート結合は、重要な利益を提供する。

【0576】

しかしながら、ある特定の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって均一に連結されたオリゴヌクレオチドの投与は、１つ以上の炎症誘発反応を誘導する（例えば、Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１９９６ Ｓｅｐ；１２８（３）：３２９−３８．“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．を参照されたく、例えば、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，ｐａｇｅｓ ３４２−３５１，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，ｅｄ．，２００８も参照のこと）。ある特定の実施形態において、ヌクレオシド間結合の多くがホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの投与は、１つ以上の炎症誘発反応を誘導する。

【0577】

ある特定の実施形態において、炎症誘発作用の程度は、いくつかの可変物（例えば、骨格修飾、オフ標的作用、核酸塩基修飾、および／またはヌクレオシド修飾）に依存し得る（例えば、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ａ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，ｐａｇｅｓ ３４２−３５１，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，ｅｄ．，２００８を参照されたい）。ある特定の実施
形態において、炎症誘発作用の程度は、１つ以上の可変物を調整することによって軽減され得る。例えば、所与のオリゴヌクレオチドの炎症誘発作用の程度は、任意の数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合をホスホジエステルヌクレオシド間結合に置き換え、それによりホスホロチオエートヌクレオシド間結合の総数を減少させることによって軽減され得る。

【0578】

ある特定の実施形態において、ホスホロチオエート結合の数を減少させることが望ましく、そうすることで、安定性を失うことも、肝臓から腎臓への分布を変化させることもなく減少させることができる。例えば、ある特定の実施形態において、ホスホロチオエート結合の数は、ホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に置き換えることによって減少され得る。そのような実施形態において、より少ないホスホロチオエート結合およびより多くのホスホジエステル結合を有するアンチセンス化合物は、より低い炎症誘発反応を誘導するか、全く誘導しない。より少ないホスホロチオエート結合およびより多くのホスホジエステル結合を有するアンチセンス化合物はより低い炎症誘発反応を誘導するが、より少ないホスホロチオエート結合およびより多くのホスホジエステル結合を有するアンチセンス化合物は、肝臓に蓄積せず、より多くのホスホロチオエート結合を有するアンチセンス化合物と比較して、同一または同様の用量で有効性がより低くあり得る。したがって、ある特定の実施形態において、複数のホスホジエステル結合および複数のホスホロチオエート結合を有するが、安定性および肝臓への良好な分布も有するアンチセンス化合物を設計することが望ましい。

【0579】

ある特定の実施形態において、ホスホロチオエート結合のうちのいくつかが炎症誘発性の低いホスホジエステルヌクレオシド間結合と置き換えられる場合でも、共役アンチセンス化合物は、非共役対応物と比較して、肝臓により多く蓄積し、腎臓にはあまり蓄積しない。ある特定の実施形態において、ホスホロチオエート結合のうちのいくつかが炎症誘発性の低いホスホジエステルヌクレオシド間結合と置き換えられる場合でも、共役アンチセンス化合物は、その非共役対応物と比較して、肝臓により多く蓄積し、その非共役対応物ほど尿に排泄されない。ある特定の実施形態において、共役体を使用することで、より強力でより良好な耐性のアンチセンス薬物を設計することが可能になる。実際には、ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、非共役対応物よりも大きい治療指数を有する。これは、炎症誘発応答の危険性がより低く、かつ腎毒性の危険性もより低いため、共役アンチセンス化合物がより高い絶対用量で投与されることを可能にする。このより高い用量は、排除（代謝）が同様であると見込まれるため、低頻度で投薬されることを可能にする。さらに、上述のように、化合物がより強力であるため、治療活性を失うことなく次の投薬の前に濃度をより低くすることができ、さらに長い投薬間期間を可能にする。

【0580】

ある特定の実施形態において、いくつかのホスホロチオエート結合の包含がなお望ましい。例えば、末端結合がエキソヌクレアーゼに対して脆弱であるため、ある特定の実施形態において、これらの結合は、ホスホロチオエートまたは他の修飾結合である。２個のデオキシヌクレオシドを結合するヌクレオシド間結合がエンドヌクレアーゼに対して脆弱であるため、ある特定の実施形態において、これらのこれらの結合は、ホスホロチオエートまたは他の修飾結合である。デオキシヌクレオシドが結合デオキシヌクレオシドの５’側にある修飾ヌクレオシドとデオキシヌクレオシドとの間のヌクレオシド間結合がエンドヌクレアーゼに対して脆弱であるため、ある特定の実施形態において、これらのこれらの結合は、ホスホロチオエートまたは他の修飾結合である。修飾ヌクレオシドが結合の５’側にある、ある特定の種類の２個の修飾ヌクレオシド間、およびある特定の種類のデオキシヌクレオシドと修飾ヌクレオシドとの間のヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ消化に十分に耐性を示すため、この結合は、ホスホジエステルであり得る。

【0581】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、９個未満のホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、８個未満のホスホロチオエート結合を含む。

【0582】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の１個以上の共役基を含むアンチセンス化合物は、そのような１個以上の共役基を欠く親アンチセンス化合物と比較して、増加した活性および／または強度および／または耐容性を有する。したがって、ある特定の実施形態において、そのような共役基のオリゴヌクレオチドへの結合が望ましい。そのような共役基は、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に結合され得る。ある特定の事例において、５’末端での結合が合成的に望ましい。典型的には、オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の技法を用いて、３’末端ヌクレオシドの固体支持体への結合および３’から５’までのヌクレオシドの連続カップリングによって合成される。したがって、共役基が３’末端で所望される場合、（１）共役基を３’末端ヌクレオシドに結合させ、オリゴヌクレオチドのその後の調製のために、その共役ヌクレオシドを固体支持体に結合させるか、または（２）合成後に、共役基を完全なオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドに結合させることができる。これらの手段のいずれもあまり効率的ではなく、それ故に、これらはいずれも費用のかかる手段である。具体的には、共役ヌクレオシドの固体支持体への結合は、本明細書の実施例において実証されるが、非効率的なプロセスである。ある特定の実施形態において、共役基を５’末端ヌクレオシドに結合させることは、３’末端での結合よりも合成的に容易である。特徴のはっきりした標準の反応を用いて、非共役３’末端ヌクレオシドを固体支持体に結合させ、このオリゴヌクレオチドを調製することができる。その後、最終カップリングステップで共役基を有する５’ヌクレオシドを結合させることのみを必要とする。ある特定の実施形態において、これは、３’−共役オリゴヌクレオチドを調製するために典型的に行われる共役ヌクレオシドの固体支持体への直接結合よりも効率的である。本明細書の実施例は、５’末端での結合を実証する。加えて、ある特定の共役基は、合成利点を有する。例えば、リン結合基を含むある特定の共役基は、以前に報告された共役基（例えば、国際公開第ＷＯ／２０１２／０３７２５４号）を含む他の共役基よりも合成的に単純であり、かつ効率的に調製される。

【0583】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、対象に投与される。そのような実施形態において、本明細書に記載の１個以上の共役基を含むアンチセンス化合物は、そのような１個以上の共役基を欠く親アンチセンス化合物と比較して、増加した活性および／または強度および／または耐容性を有する。機構によって束縛されることなく、共役基が、標的細胞または組織への分布、送達、および／または取り込みに役立つと考えられる。ある特定の実施形態において、標的細胞または組織に入ると、共役基のすべてまたは一部が切断されて、活性オリゴヌクレオチドを放出することが望ましい。ある特定の実施形態において、すべての共役基がオリゴヌクレオチドから切断される必要はない。例えば、実施例２０において、共役オリゴヌクレオチドをマウスに投与し、各々がオリゴヌク
レオチドに残った共役基の異なる部分を含むいくつかの異なる化学種を検出した（表２３ａ）。この共役アンチセンス化合物は、良好な強度を示した（表２３）。したがって、ある特定の実施形態において、共役基の複数の部分的切断のそのような代謝物プロファイルは、活性／強度を妨げない。それにもかかわらず、ある特定の実施形態において、プロドラッグ（共役オリゴヌクレオチド）が単一の活性化合物を産出することが望ましい。ある特定の事例において、活性化合物の複数の形態が見出される場合、各形態の相対量および活性を決定する必要があり得る。ある特定の実施形態において、規制調査が要求される場合（例えば、ＵＳＦＤＡまたは対応物）、単一の（または主に単一の）活性種を有することが望ましい。ある特定のそのような実施形態において、そのような単一の活性種が共役基の任意の部分を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが望ましい。ある特定の実施形態において、５’末端の共役基は、共役基の完全な代謝をもたらす可能性が高い。機構によって束縛されることなく、５’末端（例えば、５’ヌクレアーゼ）の代謝に関与する内因性酵素が３’対応物よりも活性／効率的であり得る。ある特定の実施形態において、これらの特定の共役基は、単一の活性種への代謝により従順である。ある特定の実施形態において、ある特定の共役基は、オリゴヌクレオチドへの代謝により従順である。
Ｄ．アンチセンス

【0584】

ある特定の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。そのような実施形態において、オリゴマー化合物は、標的核酸に相補的である。ある特定の実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡである。ある特定の実施形態において、標的核酸は、非コードＲＮＡである。ある特定の実施形態において、標的核酸は、タンパク質をコードする。ある特定の実施形態において、標的核酸は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、小非コードＲＮＡを含む非コードＲＮＡ、およびプロモーター指向性ＲＮＡから選択される。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、２個以上の標的核酸に少なくとも部分的に相補的である。例えば、本発明のオリゴマー化合物は、マイクロＲＮＡ模倣物であり、これは、典型的には、複数の標的に結合する。

【0585】

ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも７０％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも８０％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも９５％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも９８％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の核酸塩基配列に１００％相補的な核酸塩基配列を有する部分を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の全長にわたって、標的核酸の核酸塩基配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％相補的である。

【0586】

アンチセンス機構は、オリゴマー化合物の標的核酸とのハイブリダイゼーションを伴う任意の機構を含み、このハイブリダイゼーションは、生物学的効果をもたらす。ある特定の実施形態において、そのようなハイブリダイゼーションは、例えば、標的核酸の、または標的核酸が別の方法で相互作用し得る核酸の翻訳、転写、またはポリアデニル化を伴う細胞機構の同時に起こる阻害または刺激により、標的核酸の分解または占有のいずれかをもたらす。

【0587】

標的ＲＮＡの分解を伴う一種のアンチセンス機構は、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介アンチセンスである。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌ
クレアーゼである。「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス化合物が哺乳類細胞におけるＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発することが当技術分野で既知である。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のＤＮＡ様オリゴヌクレオチド媒介阻害の効率を大幅に向上させる。

【0588】

アンチセンス機構には、ＲＩＳＣ経路を利用するＲＮＡｉ機構も含まれるが、これらに限定されない。そのようなＲＮＡｉ機構には、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ機構が含まれるが、これらに限定されない。そのような機構は、マイクロＲＮＡ模倣物および／または抗マイクロＲＮＡの作成を含む。

【0589】

アンチセンス機構には、マイクロＲＮＡまたはｍＲＮＡ以外の非コードＲＮＡをハイブリダイズさせるか、または模倣する機構も含まれるが、これに限定されない。そのような非コードＲＮＡには、１個以上の核酸の転写または翻訳をもたらすプロモーター指向性ＲＮＡならびに短いＲＮＡおよび長いＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0590】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ化合物である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役体を含むオリゴマーオリゴヌクレオチドは、ｓｓＲＮＡ化合物である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役体を含むオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴマー化合物と対合されて、ｓｉＲＮＡを形成する。ある特定のそのような実施形態において、第２のオリゴマー化合物は、共役体も含む。ある特定の実施形態において、第２のオリゴマー化合物は、任意の修飾または非修飾核酸である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ化合物におけるアンチセンス鎖である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ化合物におけるセンス鎖である。共役オリゴマー化合物が二本鎖ｓｉＲｎＡである実施形態において、共役体は、センス鎖に、アンチセンス鎖に、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在し得る。
Ｃ．アポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））

【0591】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、任意のａｐｏ（ａ）核酸を標的とするある特定の実施形態において、標的核酸は、臨床的に関連するａｐｏ（ａ）標的タンパク質をコードする。そのような実施形態において、標的核酸の調節は、臨床的利益をもたらす。

【0592】

標的プロセスは、アンチセンス相互作用が生じて所望の効果が結果的に生じるように、通常、標的核酸内の少なくとも１個の標的領域、セグメント、または部位の決定を含む。

【0593】

ある特定の実施形態において、標的領域は、核酸の構造的に定義された領域である。例えば、ある特定のそのような実施形態において、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義された核酸領域もしくは標的セグメントを包含し得る。

【0594】

ある特定の実施形態において、標的セグメントは、共役アンチセンス化合物が標的とされる標的領域の少なくとも約８核酸塩基部分である。標的セグメントは、標的セグメントのうちの１個の５’末端から少なくとも８個の連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る（残りの核酸塩基は、標的セグメントの５’末端のすぐ上流で開始し、ＤＮＡまたはＲＮＡが約８〜約３０個の核酸塩基を含むまで続く連続した一続きの同一のＤＮＡまたはＲＮＡである）。標的セグメントは、標的セグメントのうちの１個の３’末端から少なくとも８個の連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列によっても表される（残りの核酸塩基は、標的セグメントの３’末端のすぐ下流で開始し、ＤＮＡまたは
ＲＮＡが約８〜約３０個の核酸塩基を含むまで続く連続した一続きの同一のＤＮＡまたはＲＮＡである）。標的セグメントは、標的セグメントの配列の内部部分から少なくとも８個の連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列によっても表され、共役アンチセンス化合物が約８〜約３０個の核酸塩基を含むまでいずれかの方向または両方向に延在し得る。

【0595】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物は、本明細書に記載されるように修飾され得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、本明細書に記載の修飾糖部分、非修飾糖部分、または修飾および非修飾糖部分の混合物を有し得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、本明細書に記載の修飾ヌクレオシド間結合、非修飾ヌクレオシド間結合、または修飾および非修飾ヌクレオシド間結合の混合物を有し得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、本明細書に記載の修飾核酸塩基、非修飾核酸塩基、または修飾および非修飾核酸塩基の混合物を有し得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、本明細書に記載のモチーフを有し得る。

【0596】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物は、本明細書に記載されるように共役され得る。

【0597】

１個のａｐｏ（ａ）タンパク質は、ジスルフィド結合を介して単一のアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）タンパク質に連結されて、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））粒子を形成する。このａｐｏ（ａ）タンパク質は、特にクリングルＩＶ２型反復ドメイン内のプラスミノーゲンと高度の相同性を共有する。ａｐｏ（ａ）のクリングル反復ドメインは、その血栓形成促進特性および抗線維素溶解特性に関与し得、アテローム性動脈硬化進行を高める可能性があると考えられる。Ａｐｏ（ａ）は、ＩＬ−６によって転写調整され、ＩＬ−６阻害剤（トシリズマブ）で治療されたリウマチ性関節炎患者の研究において、治療から３ヶ月後に血漿レベルが３０％低下した。Ａｐｏ（ａ）は、酸化リン脂質に優先的に結合し、血管炎症を増強することが示されている。さらに、研究は、Ｌｐ（ａ）粒子がまた、内皮透過性を刺激し、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型発現を誘導し、マクロファージインターロイキン−８分泌を活性化し得ることを示唆する。重要なことに、最近の遺伝的関連研究は、Ｌｐ（ａ）が、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、および腹部大動脈瘤の独立した危険因子であったことを明らかにした。さらに、早発性冠動脈疾患（ＰＲＯＣＡＲＤＩＳ）研究において、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．は、冠状動脈性心臓病と血漿中のＬｐ（ａ）濃度との間の強固な独立した関連性を説明している。さらに、Ｓｏｌｆｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．は、血清中のＬｐ（ａ）の増加が、アルツハイマー病（ＡＤ）の危険性の増加に関係し得ることを示唆した。ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンス化合物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００５／０００２０１号および米国特許第ＵＳ２０１０−０３３１３９０号に以前に開示されている。Ａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ−ＡＰＯＡ_Ｒｘを第Ｉ相臨床試験において評価して、その安全性プロファイルを試験した。

Ａｐｏ（ａ）核酸を標的にするある特定の共役アンチセンス化合物

【0598】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００５５７７．２（配列番号１として本明細書に組み込まれる）；ヌクレオチド３２３００００〜３３８００００から切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿００７４２２．１２（配列番号２として本明細書に組み込まれる）；ヌクレオチド６５１２００００〜６５２５８０００から切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿０２５７４１．１５（配列番号３として本明細書に指定される）；およびＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００５５７７．１（配列番号４として本明細書に組み込まれる）の配列を有するＡｐ
ｏ（ａ）核酸を標的にする。ある特定のそのような実施形態において、共役アンチセンス化合物は、配列番号１〜４のうちのいずれかの核酸塩基配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。

【0599】

ある特定の実施形態において、配列番号１〜４のうちのいずれかの核酸塩基配列を標的にする共役アンチセンス化合物は、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のうちのいずれかの核酸塩基配列から選択される少なくとも８個の連続した核酸塩基配列を含む。ある特定の実施形態において、配列番号１〜４のうちのいずれかを標的にする共役アンチセンス化合物は、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のうちのいずれかの核酸塩基配列から選択される核酸塩基配列を含む。

【表1】

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Ａｐｏ（ａ）治療指標

【0600】

ある特定の実施形態において、本発明は、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にする共役アンチセンス化合物を用いて対象におけるａｐｏ（ａ）の発現を調節するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）の発現が低下する。

【0601】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、対象を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、医薬組成物中のａｐｏ（ａ）核酸を標的にする共役アンチセンス化合物を用いて対象を治療するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、個体は、ａｐｏ（ａ）関連疾患を有する。ある特定の実施形態において、個体は、Ｌｐ（ａ）関連疾患を有する。ある特定の実施形態において、個体は、炎症性、心臓血管、および／もしくは代謝性疾患、障害、または状態を有する。

【0602】

ある特定の実施形態において、対象は、炎症性、心臓血管、および／もしくは代謝性疾患、障害、または状態を有する。

【0603】

ある特定の実施形態において、心臓血管疾患、障害、または状態には、乳糜血症、高トリグリセリド血症、大動脈弁狭窄症、動脈瘤（例えば、腹部大動脈瘤）、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠状動脈性心臓病、脂質異常症、高コレステロール血症、脂質異常症、高血圧症、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、発作等が含まれるが、これらに限定されない。

【0604】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載のａｐｏ（ａ）を標的にする化合物は、心臓血管疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、この化合物を動物に投与することにより、未処理の動物と比較して、これらの動物におけるＬＤＬおよびコレステロールレベルを低下させることができる。ある特定の実施形態において、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるａｐｏ（ａ）の阻害に関連し得る。

【0605】

ある特定の実施形態において、心臓血管疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、定量化可能であり得る。例えば、ＬＤＬまたはコレステロールレベルは、例えば、標準の脂質試験によって測定および定量化され得る。そのようなマーカーについて、ある特定の実施形態において、マーカーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のうちのいずれか２つによって定義される範囲に減少し得る。

【0606】

心臓血管疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善することを必要とする対象における心臓血管疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善するための方法も提供される。ある特定の実施形態において、心臓血管疾患、障害、または状態に関連した症状の発症率を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態において、心臓血管疾患、障害、または状態に関連した症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態において、方法は、治療的に有効な量のａｐｏ（ａ）核酸を標的にする化合物をそれを必要とする個体に投与することを含む。

【0607】

心臓血管疾患、障害、または状態は、多くの身体的症状を特徴とし得る。心臓血管疾患、障害、または状態に関連した当業者に既知の任意の症状は、本明細書に記載の化合物および方法を用いて予防されるか、治療されるか、改善されるか、またはさもなければ調節され得る。ある特定の実施形態において、症状は、アンギナ、胸痛、息切れ、動悸、衰弱、目まい、嘔気、発汗、頻脈、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔のしびれ、肢のしびれ、跛行または筋けいれん、腹部腫脹、または発熱のうちのいずれかであり得るが、これらに限定されない。

【0608】

ある特定の実施形態において、代謝性疾患、障害、または状態には、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、肥満、インスリン抵抗性、代謝症候群、および糖尿病
性脂質異常症が含まれるが、これらに限定されない。

【0609】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載のａｐｏ（ａ）を標的にする化合物は、代謝性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、この化合物を動物に投与することにより、未処理の動物と比較して、これらの動物におけるグルコースおよびインスリン耐性レベルを低下させることができる。ある特定の実施形態において、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるａｐｏ（ａ）の阻害に関連し得る。

【0610】

ある特定の実施形態において、代謝性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、定量化可能であり得る。例えば、グルコースレベルまたはインスリン耐性は、当技術分野で既知の標準の試験によって測定および定量化され得る。そのようなマーカーについて、ある特定の実施形態において、マーカーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲に減少し得る。別の例において、インスリン感受性は、当技術分野で既知の標準の試験によって測定および定量化され得る。そのようなマーカーについて、ある特定の実施形態において、マーカーは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲に増加し得る。

【0611】

代謝性疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善することを必要とする対象における代謝性疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善するための方法も提供される。ある特定の実施形態において、代謝性疾患、障害、または状態に関連した症状の発症率を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態において、代謝性疾患、障害、または状態に関連した症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態において、方法は、治療的に有効な量のａｐｏ（ａ）核酸を標的にする化合物をそれを必要とする個体に投与することを含む。

【0612】

代謝性疾患、障害、または状態は、多くの身体的症状を特徴とし得る。代謝性疾患、障害、または状態に関連した当業者に既知の任意の症状は、本明細書に記載の化合物および方法を用いて予防されるか、治療されるか、改善されるか、またはさもなければ調節され得る。ある特定の実施形態において、症状は、過剰な尿産生（多尿症）、過剰な口渇および水分摂取の増加（多渇症）、視界のぼやけ、体重減少、および嗜眠のうちのいずれかであり得るが、これらに限定されない。

【0613】

ある特定の実施形態において、炎症性疾患、障害、または状態には、大動脈弁狭窄症、大動脈弁狭窄症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、および血栓塞栓性疾患、障害、または状態が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の血栓塞栓性疾患、障害、または状態には、発作、血栓症、心筋梗塞、および末梢血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。

【0614】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載のａｐｏ（ａ）を標的にする化合物は、炎症性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、この化合物を動物に投与することにより、未処置動物と比較して、これらの動物における炎症性サイトカインまたは他の炎症マーカーのレベルを低下させることができる。ある特定の実施形態において、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるａｐｏ（ａ）の阻害に関連し得る。

【0615】

ある特定の実施形態において、炎症性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、
定量化可能であり得る。例えば、サイトカインレベルは、当技術分野で既知の標準の試験によって測定および定量化され得る。そのようなマーカーについて、ある特定の実施形態において、マーカーは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲に減少し得る。

【0616】

炎症性疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善することを必要とする対象における炎症性疾患、障害、または状態に関連した症状を予防、治療、または改善するための方法も提供される。ある特定の実施形態において、炎症性疾患、障害、または状態に関連した症状の発症率を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態において、炎症性疾患、障害、または状態に関連した症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態において、方法は、治療的に有効な量のａｐｏ（ａ）核酸を標的にする化合物をそれを必要とする個体に投与することを含む。

【0617】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の治療的に有効な量の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、ａｐｏ（ａ）関連疾患、障害、または状態を有する個体を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態において、個体は、上昇したａｐｏ（ａ）レベルを有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の治療的に有効な量の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、または状態を有する個体を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態において、個体は、上昇したＬｐ（ａ）レベルを有する。ある特定の実施形態において、個体は、炎症性、心臓血管、および／もしくは代謝性疾患、障害、または状態を有する。ある特定の実施形態において、治療的に有効な量のａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物の投与は、ａｐｏ（ａ）またはＬｐ（ａ）レベルを監視することを伴う。ある特定の実施形態において、治療的に有効な量のａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物投与は、炎症性、心臓血管、および／もしくは代謝性疾患、またはａｐｏ（ａ）の発現に関連した他の疾患過程のマーカーを監視して、アンチセンス化合物への個体の応答を決定することを伴う。医師がａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンス化合物の投与への個体の応答を用いることにより、化合物での治療的介入の量および期間を決定することができる。

【0618】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲でａｐｏ（ａ）発現の減少をもたらす。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）発現は、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ以下、９０ｍｇ／ｄＬ以下、８０ｍｇ／ｄＬ以下、７０ｍｇ／ｄＬ以下、６０ｍｇ／ｄＬ以下、５０ｍｇ／ｄＬ以下、４０ｍｇ／ｄＬ以下、３０ｍｇ／ｄＬ以下、２０ｍｇ／ｄＬ以下、または１０ｍｇ／ｄＬ以下に減少する。

【0619】

ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にするアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲のＬｐ（ａ）発現の減少をもたらす。ある特定の実施形態において、Ｌｐ（ａ）発現は、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬ以下、１９０ｍｇ／ｄＬ以下、１８０ｍｇ／ｄＬ以下、１７５ｍｇ／ｄＬ以下、１７０ｍｇ／ｄＬ以下、１６０ｍｇ／ｄＬ以下、１５０ｍｇ／ｄＬ以下、１４０ｍｇ／ｄＬ以下、１３０ｍｇ／ｄＬ以下、１２０ｍｇ／ｄＬ以下、１１０ｍｇ／ｄＬ以下、１００ｍｇ／ｄＬ以下、９０ｍｇ／ｄＬ以下、８０ｍｇ／ｄＬ以下、７０ｍｇ／ｄＬ以下、６０ｍｇ／ｄＬ以下、５５ｍｇ／ｄＬ以下、５０ｍｇ／ｄＬ以下、４５ｍｇ／ｄＬ以下、４０
ｍｇ／ｄＬ以下、３５ｍｇ／ｄＬ以下、３０ｍｇ／ｄＬ以下、２５ｍｇ／ｄＬ以下、２０ｍｇ／ｄＬ以下、１５ｍｇ／ｄＬ以下、または１０ｍｇ／ｄＬ以下に減少する。

【0620】

ある特定の実施形態において、本発明は、ａｐｏ（ａ）核酸を標的にする共役アンチセンス化合物を用いて薬剤を調製するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、ａｐｏ（ａ）を標的にする共役アンチセンス化合物を含む医薬組成物を用いて、炎症性、心臓血管、および／もしくは代謝性疾患、障害、または状態に罹患するか、またはこれらにかかりやすい患者を治療するための薬剤を調製する。

Ａｐｏ（ａ）治療集団

【0621】

高Ｌｐ（ａ）レベルを有するある特定の対象は、様々な疾患を発症する危険性が著しく高い（Ｌｉｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２０１１，４１２：７９７−８０１；Ｓｏｌｆｒｉｚｚ ｅｔ ａｌ．）．高Ｌｐ（ａ）レベルを有する多くの対象において、現在の治療は、Ｌｐ（ａ）レベルを安全なレベルに低下させることができない。Ａｐｏ（ａ）は、Ｌｐ（ａ）の形成に重要な役割を果たし、それ故にａｐｏ（ａ）を減少させることが、Ｌｐ（ａ）を減少させ、Ｌｐ（ａ）に関連した疾患を予防、治療、または改善する。

【0622】

ある特定の実施形態において、本明細書に開示される化合物および方法での治療は、上昇したａｐｏ（ａ）レベルおよび／またはＬｐ（ａ）レベルを有するヒト動物に適応される。ある特定の実施形態において、ヒトは、１０ｍｇ／ｄＬ以上、２０ｍｇ／ｄＬ以上、３０ｍｇ／ｄＬ以上、４０ｍｇ／ｄＬ以上、５０ｍｇ／ｄＬ以上、６０ｍｇ／ｄＬ以上、７０ｍｇ／ｄＬ以上、８０ｍｇ／ｄＬ以上、９０ｍｇ／ｄＬ以上、または１００ｍｇ／ｄＬ以上のａｐｏ（ａ）レベルを有する。ある特定の実施形態において、ヒトは、１０ｍｇ／ｄＬ以上、１５ｍｇ／ｄＬ以上、２０ｍｇ／ｄＬ以上、２５ｍｇ／ｄＬ以上、３０ｍｇ／ｄＬ以上、３５ｍｇ／ｄＬ以上、４０ｍｇ／ｄＬ以上、５０ｍｇ／ｄＬ以上、６０ｍｇ／ｄＬ以上、７０ｍｇ／ｄＬ以上、８０ｍｇ／ｄＬ以上、９０ｍｇ／ｄＬ以上、１００ｍｇ／ｄＬ以上、１１０ｍｇ／ｄＬ以上、１２０ｍｇ／ｄＬ以上、１３０ｍｇ／ｄＬ以上、１４０ｍｇ／ｄＬ以上、１５０ｍｇ／ｄＬ以上、１６０ｍｇ／ｄＬ以上、１７０ｍｇ／ｄＬ以上、１７５ｍｇ／ｄＬ以上、１８０ｍｇ／ｄＬ以上、１９０ｍｇ／ｄＬ以上、２００ｍｇ／ｄＬ以上のＬｐ（ａ）レベルを有する。

Ｄ．ある特定の医薬組成物

【0623】

ある特定の実施形態において、本開示は、１個以上のアンチセンス化合物を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、そのような医薬組成物は、好適な薬剤的に許容される希釈剤または担体を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、滅菌生理食塩溶液および１個以上のアンチセンス化合物を含む。ある特定の実施形態において、そのような医薬組成物は、滅菌生理食塩溶液および１個以上のアンチセンス化合物からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物および滅菌水を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物および滅菌水からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの水である。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１個以上のアンチセンス化合物および滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる。ある特定の実施形態において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードのＰＢＳである。

【0624】

ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、医薬組成物または製剤を調製するために薬剤的に許容される活性および／または不活性物質と混合され得る。組成物および医薬組成物を製剤化するための方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むが、これらに限定されないいくつかの基準に依存する。

【0625】

アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、任意の薬剤的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩を包含する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物への投与時に、生物学的に活性な代謝物またはその残渣を（直接的または間接的に）提供することができる１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。したがって、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の薬剤的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬剤的に許容される塩、および他の生物学的等価物を対象とする。好適な薬剤的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。

【0626】

プロドラッグは、体内で内因性ヌクレアーゼによって切断されて活性アンチセンスオリゴヌクレオチドを形成するオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端におけるさらなるヌクレオシドの組み込みを含み得る。

【0627】

脂質部分は、様々な方法で核酸療法において用いられている。ある特定のそのような方法において、核酸は、カチオン性脂質と中性脂質の混合物から作られた事前形成されたリポソームまたはリポプレックスに導入される。ある特定の方法において、モノまたはポリカチオン性脂質とのＤＮＡ複合体は、中性脂質の存在なしで形成される。ある特定の実施形態において、脂質部分は、特定の細胞または組織への薬剤の分布を増加させるように選択される。ある特定の実施形態において、脂質部分は、脂肪組織への薬剤の分布を増加させるように選択される。ある特定の実施形態において、脂質部分は、筋肉組織への薬剤の分布を増加させるように選択される。

【0628】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、１個以上の修飾オリゴヌクレオチドおよび１個以上の賦形剤を含む。ある特定のそのような実施形態において、賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンから選択される。

【0629】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、送達系を含む。送達系の例として、リポソームおよびエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の送達系は、疎水性化合物を含む医薬組成物を含むある特定の医薬組成物の調製に有用である。ある特定の実施形態において、ジメチルスルホキシド等のある特定の有機溶媒が用いられる。

【0630】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、特定の組織または細胞型に本開示の１個以上の薬剤を送達するように設計された１個以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、ある特定の実施形態において、医薬組成物は、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームを含む。

【0631】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、共溶媒系を含む。ある特定のそのような共溶媒系は、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を含む。ある特定の実施形態において、そのような共溶媒系は、疎水性化合物に用いられる。そのような共溶媒系の非限定的な例にはＶＰＤ共溶媒系があり、これは、３ｗ／ｖ％のベンジルアルコール、８ｗ／ｖ％の非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）、および６５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール３００を含
む無水エタノールの溶液である。そのような共溶媒系の割合は、それらの溶解度および毒性特性を著しく変化させることなく大幅に変化し得る。さらに、共溶媒成分の同一性は変化し得、例えば、他の界面活性剤をポリソルベート８０（商標）の代わりに使用してもよく、ポリエチレングリコールの画分サイズは変化し得、他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンに取って代わり得、他の糖または多糖は、デキストロースと置き換わり得る。

【0632】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、経口投与のために調製される。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、口腔投与のために調製される。

【0633】

ある特定の実施形態において、医薬組成物は、注入による投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内等）のために調製される。ある特定のそのような実施形態において、医薬組成物は、担体を含み、水溶液、例えば、水または生理学的に相溶性の緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的生理食塩水緩衝液等の中で製剤化される。ある特定の実施形態において、他の成分（例えば、溶解に役立つか、または防腐剤の役目を果たす成分）が含まれる。ある特定の実施形態において、注入可能な懸濁液は、適切な液体担体、懸濁化剤等を用いて調製される。注入用のある特定の医薬組成物は、単位剤形で、例えば、アンプル単位で提供されるか、または多用量容器内に提供される。注入用のある特定の医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであり、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。注入用の医薬組成物における使用に好適なある特定の溶媒には、親油性溶媒および脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、およびリポソームが含まれるが、これらに限定されない。水性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。任意に、そのような懸濁液は、好適な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。

【0634】

ある特定の実施形態において、医薬組成物は、経粘膜投与のために調製される。ある特定のそのような実施形態において、浸透する障壁に適切な浸透剤が製剤化において用いられる。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で既知である。

【0635】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、治療的に効果的な量のオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、治療的に効果的な量は、疾患の症状を防止するか、疾患の症状を軽減するか、もしくは疾患の症状を改善するか、または治療される対象の生存期間を延長させるのに十分な量である。治療的に効果的な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0636】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される１個以上の修飾オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして製剤化される。ある特定の実施形態において、生体内投与時に、プロドラッグは、オリゴヌクレオチドの生物学的に、薬剤的に、または治療的により活性な形態に化学変換される。ある特定の実施形態において、プロドラッグは、対応する活性形態よりも投与し易いため、有用である。例えば、ある特定の事例において、プロドラッグは、対応する活性形態よりも生物学的に利用可能である（例えば、経口投与によって）。ある特定の事例において、プロドラッグは、対応する活性形態と比較して、改善された溶解度を有し得る。ある特定の実施形態において、プロドラッグは、対応する活性形態よりも水溶性が低い。ある特定の事例において、そのようなプロドラッグは、水溶解度が移動性に害を及ぼす細胞膜にわたって優れた透過性を有する。ある特定の実施形態において、プロドラッグは、エステルである。ある特定のそのような実施形態において、エステルは、投与時にカルボン酸に代謝的に加水分解される。ある特定の事例において、カルボ
ン酸含有化合物は、対応する活性形態である。ある特定の実施形態において、プロドラッグは、酸基に結合される短ペプチド（ポリアミノ酸）を含む。ある特定のそのような実施形態において、ペプチドは、投与時に切断されて、対応する活性形態を形成する。

【0637】

ある特定の実施形態において、本開示は、細胞内の標的核酸の量または活性を低減させる、組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、動物内に存在する。ある特定の実施形態において、動物は、哺乳動物である。ある特定の実施形態において、動物は、齧歯動物である。ある特定の実施形態において、動物は、霊長類である。ある特定の実施形態において、動物は、非ヒト霊長類である。ある特定の実施形態において、動物は、ヒトである。

【0638】

ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を動物に投与する方法を提供する。好適な投与経路には、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸内投与、経腸投与、局所投与、坐薬投与、吸入による投与、髄腔内投与、脳室内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、眼内投与、腫瘍内投与、ならびに非経口（例えば、静脈内、筋肉内、髄内、および皮下）投与が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、薬学的髄腔内薬が投与されて、全身曝露ではなく局所曝露を達成する。例えば、医薬組成物は、所望の罹患部に（例えば、肝臓に）直接注入され得る。

参照による非限定的な開示および組み込み

【0639】

本明細書に記載のある特定の化合物、組成物、および方法がある特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例証する役目のみを果たし、それを限定するようには意図されていない。本出願に列挙される参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号等の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0640】

本出願に添付される配列表が必要に応じて各配列を「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のいずれか一方と特定するが、実際には、それらの配列は、化学修飾の任意の組み合わせで修飾され得る。当業者であれば、修飾オリゴヌクレオチドを説明するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のそのような指定が、ある特定の事例において、任意であることを容易に認識する。例えば、２’−ＯＨ糖部分およびチミン塩基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの天然２’−Ｈの場合、２’−ＯＨ）または修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡの天然ウラシルの場合、チミン（メチル化ウラシル））と記載され得る。

【0641】

したがって、配列表中のものを含むが、これらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然または修飾ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するよう意図される。さらなる例であって制限するものではなく、核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するオリゴヌクレオチドは、修飾または非修飾にかかわらず、ＲＮＡ塩基、例えば、配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するオリゴヌクレオチド、ならびに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」等のいくつかのＤＮＡ塩基およびいくつかのＲＮＡ塩基を有するオリゴヌクレオチド、ならびに「ＡＴ^ｍｅＣＧＡＵＣＧ」等の他の修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような核酸塩基配列を有する任意のオリゴヌクレオチドを包含し、式中、^ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。

【実施例】

【0642】

以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を例証するものであり、限定するものではない。さらに、特定の実施形態が提供される場合、本発明者らは、それらの特定の実施
形態の一般的適用を企図している。例えば、特定のモチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有するさらなるオリゴヌクレオチドへの合理的な支持を提供する。同様に、例えば、特定の高親和性修飾が特定の位置に出現する場合、同一の位置での他の高親和性修飾は、別途示されない限り、好適であると見なされる。

実施例１：ホスホラミダイト（化合物１、１ａ、および２）の調製のための一般的方法

【化216】

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【0643】

化合物１、１ａ、および２を、本明細書に記載される当技術分野で周知の手順通りに調製した（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２１（４），１１２２−１１２５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５（５），１５６９−１５８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，２００８，５２（１），５５３−５５４）、ならびに公開されたＰＣＴ国際出願（国際公開第ＷＯ２０１１／１１５８１８号、同第ＷＯ２０１０／０７７５７８号、同第ＷＯ２０１０／０３６６９８号、同第ＷＯ２００９／１４３３６９号、同第ＷＯ２００９／００６４７８、および同第ＷＯ２００７／０９００７１号）、ならびに米国特許第７，５６９，６８６号も参照のこと）。

実施例２：化合物７の調製

【化217】

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【0644】

化合物３（２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄガラクトピラノースまたはガラクトサミンペンタアセテート）は、市販のものである。化合物５を公開された手順（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３４，２６９２）に従って調製した。

実施例３：化合物１１の調製

【化218】

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【0645】

化合物８および９は、市販のものである。
実施例４：化合物１８の調製

【化219】

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【0646】

化合物１１を実施例３に例証される手順通りに調製した。化合物１４は、市販のものである。化合物１７を、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，５７９８−５８０８）によって報告された同様の手順を用いて調製した。
実施例５：化合物２３の調製

【化220】

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【0647】

化合物１９および２１は、市販のものである。
実施例６：化合物２４の調製

【化221】

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【0648】

化合物１８および２３を実施例４および５に例証される手順通りに調製した。
実施例７：化合物２５の調製

【化222】

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【0649】

化合物２４を実施例６に例証される手順通りに調製した。

実施例８：化合物２６の調製

【化223】

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【0650】

化合物２４を実施例６に例証される手順通りに調製する。

実施例９：３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物２９）の一般的調製

【化224】

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【化225】

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【0651】

保護されたＧａｌＮＡｃ_３−１は、以下の構造を有する。

【化226】

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【0652】

共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａは、以下の式を有する。

【化227】

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【0653】

固体支持体結合保護ＧａｌＮＡｃ_３−１（化合物２５）を実施例７に例証される手順通りに調製した。３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含むオリゴマー化合物２９を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準の手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１および１ａ）を実施例１に例証される手順通りに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列および組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序および量を調整して、本明細書に記載のギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される既定の組成および塩基配列を有し得る。

実施例１０：５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物３４）の一般的調製

【化228】

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【0654】

Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（商標）３０は、市販のものである。５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１クラスターを含むオリゴマー化合物３４を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準の手順を用いて調製する（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅ
ｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１および１ａ）を実施例１に例証される手順通りに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列および組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序および量を調整して、本明細書に記載のギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される既定の組成および塩基配列を有し得る。
実施例１１：化合物３９の調製

【化229】

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【0655】

化合物４、１３、および２３を実施例２、４、および５に例証される手順通りに調製し
た。化合物３５をＲｏｕｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，１２，２３４６−２３５３に公開された同様の手順を用いて調製する。
実施例１２：化合物４０の調製

【化230】

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【0656】

化合物３８を実施例１１に例証される手順通りに調製する。
実施例１３：化合物４４の調製

【化231】

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【0657】

化合物２３および３６を実施例５および１１に例証される手順通りに調製する。化合物４１を、国際公開第ＷＯ２００９０８２６０７号に公開された同様の手順を用いて調製する。
実施例１４：化合物４５の調製

【化232-1】

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【0658】

化合物４３を実施例１３に例証される手順通りに調製する。
実施例１５：化合物４７の調製

【化232-2】

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【0659】

化合物４６は、市販のものである。
実施例１６：化合物５３の調製

【化232-3】

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【0660】

化合物４８および４９は、市販のものである。化合物１７および４７を実施例４および１５に例証される手順通りに調製する。
実施例１７：化合物５４の調製

【化233】

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【0661】

化合物５３を実施例１６に例証される手順通りに調製する。
実施例１８：化合物５５の調製

【化234】

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【0662】

化合物５３を実施例１６に例証される手順通りに調製する。
実施例１９：固相技法による３’位にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ ６４７５３５、６４７５３６、および６５１９００の調製）

【0663】

別途明記されない限り、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬および溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロックおよび固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、および^ｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドおよび２’−ＭＯＥに用いた。

【0664】

カラムに充填されたＧａｌＮＡｃ_３−１を充填したＶＩＭＡＤ固体支持体（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）におけるホスホラミダイトカップリング方法を用いて、ＡＳＯ合成を、ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡｅＫＴＡオリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）上で実行した。このカップリングステップについて、固体支持体の充填に対して４倍超過したホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイト縮合を１０分間行った。すべての他のステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の６％ジクロロ酢酸の溶液を用いて、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、無水ＣＨ_３ＣＮ中の４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）を活性剤として用いた。ホスホロチオエート結合を、３分間の接触時間で、１：１のピリジン／ＣＨ_３ＣＮのキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液との硫化によって導入した。６％の水を含有するＣ
Ｈ_３ＣＮ中の２０％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、１２分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を得た。

【0665】

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、４５分間の接触時間で、トリエチルアミンとアセトニトリルの１：１（ｖ／ｖ）の混合物を用いて脱保護した。固体支持体結合ＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。

【0666】

その後、非結合ＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強力なアニオン交換カラム上での高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝３０％ＣＨ_３ＣＮ水溶液中１００ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝Ａ中１．５Ｍ ＮａＢｒ、６０分後０〜４０％のＢ、流量１４ｍＬ／分−１、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラム上でのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期充填に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣカップリングＭＳ分析によって特徴付けた。

【0667】

当技術分野で周知の標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて共役体を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。

【0668】

これらの方法を用いて、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個の別個のアンチセンス化合物を調製した。以下の表１７に要約されるように、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個のアンチセンス化合物の各々は、同一の核酸塩基配列を有し、ＩＳＩＳ ３０４８０１は、すべてのホスホロチオエート結合を有する５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、ＩＳＩＳ ６４７５３５は、ＧａｌＮＡｃ_３−１をその３’末端で共役させたことを除いて、ＩＳＩＳ ３０４８０１と同一であり、ＩＳＩＳ ６４７５３６は、その化合物のある特定のヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることを除いて、ＩＳＩＳ ６４７５３５と同一であった。表１７にさらに要約されるように、ＳＲＢ−１を標的とする２個の別個のアンチセンス化合物を合成した。ＩＳＩＳ ４４０７６２は、すべてのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する２−１０−２ ｃＥｔギャップマーであり、ＩＳＩＳ ６５１９００は、その３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含めたことを除いて、ＩＳＩＳ ４４０７６２と同一であった。

【表2】

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【0669】

下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−１」は、先に実施例９に示された構造を有する共役基を示す。Ｇａ
ｌＮＡｃ_３−１が、ＡＳＯを共役体の残りに連結させる切断可能なアデノシンを含み、「ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ」と指定されることに留意されたい。上述の表でこの命名法を用いて、共役体の一部であるアデノシンを含む全核酸塩基配列を示す。したがって、上述の表において、「Ａ_ｄｏ」を省略して「ＧａｌＮＡｃ_３−１」で終了する配列を列記することもできる。下付き文字「ａ」を用いて切断可能なヌクレオシドまたは切断可能な部分を欠く共役基の部分を示すこの慣例をこれらの実施形態にわたって用いる。切断可能な部分を欠く共役基のこの部分は、本明細書において「クラスター」または「共役クラスター」または「ＧａｌＮＡｃ_３クラスター」と称される。ある特定の事例において、これは、そのクラスターおよびその切断可能な部分を別々に提供することによって共役基を説明するのに好都合である。
実施例２０：ｈｕＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩの用量依存的アンチセンス阻害

【0670】

それぞれヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とし、かつ上に記載されるＩＳＩＳ ３０４８０１およびＩＳＩＳ ６４７５３５を別々に試験し、用量依存的試験において、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを阻害するそれらの能力について評価した。
処理

【0671】

ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期で維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも７日間順化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過して滅菌した。注入のためにＡＳＯを０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0672】

ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１もしくは６４７５３５を、０．０８、０．２５、０．７５、２．２５、もしくは６．７５μｍｏｌ／ｋｇで、または対照としてＰＢＳを、週１回２週間、腹腔内注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終用量の投与から４８時間後に血液を各マウスから採取し、マウスを屠殺し、組織を収集した。
ＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡ分析

【0673】

標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、マウスの肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に規準化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡに対して相対的に決定した。以下の結果を、ＰＢＳ処理対照に規準化された各処理群のＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示し、「％ＰＢＳ」で表示する。各ＡＳＯの半数効果濃度（ＥＤ_５０）も以下の表１８に提示する。

【0674】

例証されるように、ＰＢＳ対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がＡｐｏＣ ＩＩＩ ＲＮＡを減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。

【表3】

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ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析（比濁アッセイ）

【0675】

２０１３年３月２９日の出版前にオンラインで公開されたＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって報告された手順を用いて、血漿ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析を決定した。

【0676】

マウスから単離した約１００μＬの血漿を、希釈することなく、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床分析器および市販の比濁ＡｐｏＣ ＩＩＩアッセイ（Ｋａｍｉｙａ、カタログ番号ＫＡＩ−００６、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて分析した。アッセイプロトコルを供給業者が説明する通りに実行した。

【0677】

以下の表１９に示されるように、ＰＢＳ対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質を減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。

【表4】

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【0678】

血漿トリグリセリドおよびコレステロールを、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７、１９５９）（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３７，９１１−９１７，１９５９）（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ
，３７，９１１−９１７，１９５９）を用いて抽出し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ臨床分析器および市販の試薬を用いて測定した。

【0679】

トリグリセリドレベルを、ＰＢＳを注入したマウスに対して相対的に測定し、「％ＰＢＳ」で表示する。結果を表２０に提示する。例証されるように、両方のアンチセンス化合物がトリグリセリドレベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。

【表5】

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【0680】

血漿試料をＨＰＬＣによって分析して、総コレステロールの量およびコレステロール（ＨＤＬおよびＬＤＬ）の異なる画分の量を決定した。結果を表２１および２２に提示する。例証されるように、両方のアンチセンス化合物が総コレステロールレベルを低下させ、ＬＤＬを低下させ、ＨＤＬを上昇させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。ＨＤＬレベルの増加およびＬＤＬレベルの減少は、ＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害の心臓血管の有益な影響である。

【表6】

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【表7】

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薬物動態分析（ＰＫ）

【0681】

ＡＳＯのＰＫも評価した。肝臓および腎臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。試料をＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳを利用するＭＳＤ１で分析した。全長ＩＳＩＳ ３０４８０１および６４７５３５の組織レベル（μｇ／ｇ）を測定し、結果を表２３に提供する。例証されるように、総全長アンチセンス化合物の肝臓濃度は、これら２個のアンチセンス化合物と同様であった。したがって、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物が肝臓でより活性であるが（上のＲＮＡおよびタンパク質データによって実証されるように）、肝臓内で著しく高い濃度では存在しない。実際には、計算されたＥＣ_５０（表２３に提供される）は、共役化合物の強度の観察された増加が蓄積の増加に完全に起因するわけではないことを裏付ける。この結果は、共役体が、肝臓蓄積単独以外の機構によって、恐らくアンチセンス化合物の細胞への生産的な取り込みを改善することによって、強度を改善したことを示唆する。

【0682】

結果は、腎臓におけるＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物の濃度が、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くアンチセンス化合物の濃度よりも低いことも示す。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が要求されない治療的指標において、腎臓への曝露は、腎毒性の危険性を有し、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、より迅速なクリアランスをもたらす。したがって、非腎臓標的の場合、腎臓蓄積は望ましくない。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役が腎臓蓄積を減少させることを示唆する。

【表8】

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【0683】

ＩＳＩＳ ６４７５３５の代謝物も特定し、それらの質量を高分解能質量分析によって確認した。観察された代謝物の切断部位および構造を以下に示す。標準の手順を用いて全長ＡＳＯの相対％を計算し、結果を表２３に提示する。ＩＳＩＳ ６４７５３５の主な代謝物は、全共役体を欠く全長ＡＳＯ（すなわち、ＩＳＩＳ ３０４８０１）であり、これは、以下に示される切断部位Ａでの切断に由来する。さらに、他の切断部位に由来するさらなる代謝物も観察された。これらの結果は、細胞内の酵素によって切断され得るか、またはサイトゾルの還元環境下で切断し得るか、またはエンドソームおよびリゾソーム内の酸性ｐＨに適応性のある、ＧａｌＮＡｃ_３−１糖とＡＳＯとの間のエステル、ペプチド、ジスルフィド、ホスホラミデート、またはアシルヒドラゾン等の他の切断可能な結合の導入も有用であり得ることを示唆する。

【表9】

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【化235】

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【化236】

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【化237】

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実施例２１：単回投与試験におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害

【0684】

それぞれヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とし、かつ表１７に記載されるＩＳＩＳ ３０４８０１、６４７５３５、および６４７５３６を、単回投与試験において、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを阻害するそれらの能力についてさらに評価した。
処理

【0685】

ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期に維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも７日間順化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過して滅菌し
た。注入のためにＡＳＯを０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0686】

ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１、６４７５３５、もしくは６４７５３６（上述のもの）、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、腹腔内注入した。処理群は、３匹の動物から成り、対照群は、４匹の動物から成った。治療前および最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。

【0687】

試料を収集し、分析して、肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル、血漿トリグリセリド、ならびにＨＤＬおよびＬＤＬ画分を含むコレステロールを決定し、上述（実施例２０）のように評価した。これらの分析からのデータを、以下の表２４〜２８に提示する。血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。ＡＬＴおよびＡＳＴレベルは、アンチセンス化合物がすべての投与量で良好な耐性であったことを示した。

【0688】

これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）と比較して、３’末端ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５および６４７５３６）の強度の改善を示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体およびいくつかのホスホジエステル結合を含むＩＳＩＳ ６４７５３６は、同一の共役体を含むＩＳＩＳ ６４７５３５と同程度に強力であり、ＡＳＯ内のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【表10】

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【表11】

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【表12】

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【表13】

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【表14】

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【0689】

これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体がアンチセンス化合物の強度を改善することを裏付ける。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物の同等の強度も示し、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、混合結合（６個のホスホジエステル結合を有するＩＳＩＳ ６４７５３６）および同一のアンチセンス化合物の完全なホスホロチオエートバージョン（ＩＳＩＳ ６４７５３５）を有する。

【0690】

ホスホロチオエート結合は、アンチセンス化合物にいくつかの特性を提供する。例えば、これらは、ヌクレアーゼ消化に抵抗し、タンパク質に結合し、腎臓／尿ではなく肝臓における化合物の蓄積をもたらす。これらは、肝臓における兆候を治療する際に特に望ましい特性である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、炎症性応答とも関連している。したがって、化合物におけるホスホロチオエート結合の数を減少させることにより、炎
症の危険性の減少が見込まれるが、肝臓中の化合物の濃度も低下させ、腎臓および尿中の濃度を増加させ、ヌクレアーゼの存在下で安定性を低下させ、全体の強度を低下させる。これらの結果は、ある特定のホスホロチオエート結合がホスホジエステル結合に置換されたＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物が、肝臓における標的に対して、完全なホスホロチオエート結合を有する対応物と同程度に強力であることを示す。そのような化合物は、より炎症誘発性が低いと見込まれる（ＰＳの減少が炎症性効果の減少をもたらすことを示す実験を説明する実施例２４を参照のこと）。

実施例２２：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役修飾ＡＳＯの影響

【0691】

それぞれＳＲＢ−１を標的とし、かつ表１７に記載されるＩＳＩＳ ４４０７６２および６５１９００を、用量依存的試験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＲＢ−１を阻害するそれらの能力について評価した。
処理

【0692】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の４８時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に規準化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡに対して相対的に決定した。以下の結果を、ＰＢＳ処理対照に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示し、「％ＰＢＳ」で表示する。

【0693】

表２９に例証されるように、両方のアンチセンス化合物がＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（ＩＳＩＳ ６５１９００）を含むアンチセンス化合物は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ４４０７６２）よりもはるかに強力であった。これらの結果は、異なる標的に相補的であり、かつ異なる化学修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の強度利益が観察されることを示し、この事例において、修飾ヌクレオシドは、拘束エチル糖部分（二環式糖部分）を含む。

【表15】

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実施例２３：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）アッセイプロトコル

【0694】

ＢＤ Ｖａｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ法を用いてｈＰＢＭＣアッセイを実行した。ＵＳ ＨｅａｌｔｈＷｏｒｋｓ ｃｌｉｎｉｃ（Ｆａｒａｄａｙ ＆ Ｅｌ Ｃａｍｉｎｏ Ｒｅａｌ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）においてインフォームドコンセントを得た志願ドナー由来の全血試料を得て、４〜１５個のＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ８ｍＬチューブ（ＶＷＲカタログ番号ＢＤ３６２７５３）内に収集した。ＰＢＭＣアッセイデータシートを用いて、各ドナーのＣＰＴチューブ内の開始合計全血量の近似値を記録した。

【0695】

血液試料を、チューブの８〜１０回の穏やかな反転による遠心分離の直前に再度混合した。ＣＰＴチューブを、水平（スイングアウト）ローター内で、室温（１８〜２５℃）で３０分間、ブレーキオフで１５００〜１８００ＲＣＦで遠心分離した（２７００ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）。細胞を（Ｆｉｃｏｌｌとポリマーゲル層との間の）バフィーコート界面から回収し、５０ｍＬの滅菌円錐チューブに移し、最大５個のＣＰＴチューブ／５０ｍＬの円錐チューブ／ドナーをプールした。その後、細胞をＰＢＳ（Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋を含まない；ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄した。チューブを最大５０ｍＬまで満たし、数回反転させて混合した。その後、試料を、室温で１５分間、３３０×ｇで遠心分離し（１２１５ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上澄みを吸引した。チューブを穏やかに回転させて細胞ペレットを取り除き、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（約１ｍＬ／１０ｍＬの開始全血量）中に再懸濁した。６０μＬの試料を、６００μＬのＶｅｒｓａＬｙｓｅ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ０９７７７）を有する試料バイアル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にピペット注入し、１０〜１５秒間穏やかにボルテックスした。試料を室温で１０分間インキュベートさせ、計数前に再度混合した。ＰＢＭＣ細胞型を用いたＶｉｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞懸濁液を計数した（１：１１の希釈係数を他のパラメータで保存した）。生細胞／ｍＬおよび生存率を記録した。細胞懸濁液をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で１×１０^７生ＰＢＭＣ／ｍＬに希釈した。

【0696】

細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ）の５０μＬ／ウェル中に５×１０^５でプレーティングした。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で希釈した２倍濃度のオリゴ／対照の５０μＬ／ウェルを実験テンプレートに従って添加した（合計１００μＬ／ウェル）。プレートを振盪器に設置し、約１分間混合させた。３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした後、プレートを４００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、ＭＳＤサイトカインアッセイ（すなわち、ヒトＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、およびＭＣＰ−１）のために上澄みを除去した。

実施例２４：ｈＰＢＭＣアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯの炎症誘発作用の評価

【0697】

表３０に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、実施例２３に記載されるプロトコルを用いたｈＰＢＭＣアッセイにおいて炎症誘発作用について評価した。ＩＳＩＳ ３５３５１２は、このアッセイにおいてＩＬ−６放出に対する高応答物として知られる内部標準物である。ｈＰＢＭＣを新鮮な志願ドナーから単離し、０、０．０１２８、０．０６４、０．３２、１．６、８、４０、および２００μｍ濃度のＡＳＯで処理した。

【0698】

ＩＬ−６のレベルを一次読み出しとして用いた。標準の手順を用いてＥＣ_５０およびＥ_ｍａｘを計算した。結果を２つのドナー由来のＥ_ｍａｘ／ＥＣ_５０の平均比率として表し、「Ｅ_ｍａｘ／ＥＣ_５０」で表示する。より低い比率は、炎症誘発応答の相対的減少を示し、より高い比率は、炎症誘発応答の相対的増加を示す。

【0699】

試験化合物に関して、炎症誘発性が最も低い化合物は、ＰＳ／ＰＯ結合ＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６１６４６８）であった。ＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、その非共役対応物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもわずかに炎症誘発性が低かった。これらの結果は、いくつかのＰＯ結合の組み込みが炎症誘発反応を減少させ、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の添加が化合物の炎症誘発性を高めず、炎症誘発応答を減少させ得ることを示す。したがって、混合ＰＳ／ＰＯ結合およびＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の両方を含むアンチセンス化合物が、完全ＰＳ結合アンチセンス化合物（ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の有無にかかわらず）と比較して、より低い炎症誘発応答をもたらすことが予想されるであろう。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物、特に減少したＰＳ含有量を有するものの炎症誘発性がより低いことを示す。

【0700】

総合して、これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役化合物、特に減少したＰＳ含有量を有するものを、対応物であるＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠く完全ＰＳアンチセンス化合物よりも高い用量で投与することができることを示唆する。これらの化合物の半減期が実質的に異なることが予想されないため、そのようなより高い投与量は、結果として低頻度の投薬につながる。ＧａｌＮＡｃ_３−１共役化合物がより強力であり（実施例２０〜２２を参照のこと）、化合物の濃度が所望のレベル未満に低下した時点で再投薬が必要であるため、実際には、そのような投与の頻度はさらに低く、そのような所望のレベルは、強度に基づく。

【表16】

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【0701】

下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「Ａ_ｄｏ’−ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ」は、示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される、実施例９に示される構造ＧａｌＮＡｃ_３−１を有する共役体を示す。

【表17】

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実施例２５：生体外におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役修飾ＡＳＯの影響

【0702】

上述のＩＳＩＳ ３０４８０１および６４７５３５を生体外で試験した。トランスジェニックマウス由来の２５，０００細胞／ウェルの密度の初代肝細胞を、０．０３，０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、および２０μｍ濃度の修飾オリゴヌクレオチドで処理した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定し、ｈＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。

【0703】

標準の方法を用いてＩＣ_５０を計算し、結果を表３２に提示する。例証されるように、対照ＩＳＩＳ ３０４８０１と比較して、同程度の強度がＩＳＩＳ ６４７５３５で処理した細胞において観察された。

【表18】

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【0704】

この実験において、生体内で観察されるＧａｌＮＡｃ_３−１共役の大きな強度利益は、生体外では観察されなかった。生体外での初代肝細胞におけるその後の遊離取り込み実験は、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドと比較して、様々なＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの強度の増加を示した（実施例６０、８２、および９２を参照のこと）。
実施例２６：ＡｐｏＣ ＩＩＩ ＡＳＯ活性へのＰＯ／ＰＳ結合の影響

【0705】

ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１もしくはＩＳＩＳ ６１６４６８（両方ともに上述のもの）またはＰＢＳ処理対照を、２５ｍｇ／ｋｇで週１回２週間、腹腔内注入した。処理群は、３匹の動物から成り、対照群は、４匹の動物から成った。治療前および最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。

【0706】

試料を収集し、分析して、上述のように肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質レベルを決定した（実施例２０）。これらの分析からのデータを、以下の表３３に提示する。

【0707】

これらの結果は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ３０４８０１）と比較して、ウィングにＰＯ／ＰＳを有するアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６１６４６８）の強度の減少を示す。

【表19】

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実施例２７：化合物５６

【化238】

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【0708】

化合物５６は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されているか、またはＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製することができる。
実施例２８：化合物６０の調製

【化239】

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【0709】

化合物４を実施例２に例証される手順通りに調製した。化合物５７は、市販のものである。化合物６０を構造分析で確認した。

【0710】

本明細書に提示されるものを含むが、これらに限定されない他の単保護された置換または非置換アルキルジオールを用いて既定の組成を有するホスホラミダイトを調製することができるため、化合物５７は、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。

実施例２９：化合物６３の調製

【化240】

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【0711】

化合物６１および６２を、Ｔｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，３，５６６−５７７、およびＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００７，６３（１９），３９８２−３９８８によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。

【0712】

あるいは、化合物６３を、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．の科学文献および特許文献（Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００３，１２，１８３８−１８４０）、ならびにＫｉｍ ｅｔ ａｌ．の公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００４０６３２０８号に報告される手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３０：化合物６３ｂの調製

【化241】

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【0713】

化合物６３ａを、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，７４（９），１７３１−１７３７によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３１：化合物６３ｄの調製

【化242】

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【0714】

化合物６３ｃを、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，９（５），４５１−４５３によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３２：化合物６７の調製

【化243】

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【0715】

実施例２に例証される手順通りに化合物６４を調製した。化合物６５を、Ｏｒ ｅｔ ａｌ．の公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００９００３００９号によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。本明細書に提示されるものを含むが、これらに限定されない他の保護基を用いることができるため、化合物６５に用いた保護基は、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。
実施例３３：化合物７０の調製

【化244】

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【0716】

実施例２に例証される手順通りに化合物６４を調製した。化合物６８は、市販のものである。本明細書に提示されるものを含むが、これらに限定されない他の保護基を用いることができるため、化合物６８に用いた保護基は、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。
実施例３４：化合物７５ａの調製

【化245】

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【0717】

化合物７５をＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製する。

【0718】

実施例３５：化合物７９の調製

【化246】

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【0719】

化合物７６をＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製した。
実施例３６：化合物７９ａの調製

【化247】

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【0720】

化合物７７を実施例３５に例証される手順通りに調製する。
実施例３７：固体支持体による５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含む共役オリゴマー化合物８２の調製のための一般的方法（方法Ｉ）

【化248】

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【化249】

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【0721】

ＧａｌＮＡｃ_３−２は、以下の構造を有する。

【化250】

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【0722】

共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａは、以下の式を有する。

【化251】

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【0723】

ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準の手
順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト化合物５６および６０を、それぞれ、実施例２７および２８にそれぞれ例証される手順通りに調製した。本明細書に提示されるものを含むが、これらに限定されない他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて、５’末端にホスホジエステル結合共役基を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序および量を調整して、任意の既定の配列および組成を有する本明細書に記載のオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例３８：５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むオリゴマー化合物８２の調製のための代替方法（方法ＩＩ）

【化252】

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【0724】

ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準の手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃ_３−２クラスターホスホラミダイト（化合物７９）を実施例３５に例証される手順通りに調製した。こ
の代替方法は、合成の最終ステップでのホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体のオリゴマー化合物への一段階導入を可能にする。本明細書に提示されるものを含むが、これらに限定されない他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて５’末端にホスホジエステル共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序および量を調整して、任意の既定の配列および組成を有する本明細書に記載のオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例３９：固体支持体による５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−３共役体（５’末端結合のためにＧａｌＮＡｃ_３−１修飾されたもの）を含むオリゴマー化合物８３ｈの調製のための一般的方法

【化253】

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【化254】

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【0725】

化合物１８を実施例４に例証される手順通りに調製した。化合物８３ａおよび８３ｂは、市販のものである。ホスホジエステル結合ヘキシルアミンを含むオリゴマー化合物８３ｅを標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて調製した。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理することにより、５’−ＧａｌＮＡｃ_３−３共役オリゴマー化合物（８３ｈ）を得た。

【0726】

ＧａｌＮＡｃ_３−３は、以下の構造を有する。

【化255】

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【0727】

共役基ＧａｌＮＡｃ_３−３のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、以下の式を有する。

【化256】

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実施例４０：固体支持体による３’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−４共役体を含むオリゴマー化合物８９の調製のための一般的方法

【化257】

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【化258】

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【化259】

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【0728】

ＧａｌＮＡｃ_３−４は、以下の構造を有する。

【化260】

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【0729】

式中、ＣＭは、切断可能な部分である。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、以下のものである：

【化261】

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【0730】

共役基ＧａｌＮＡｃ_３−４のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−４_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−４_ａは、以下の式を有する。

【化262】

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【0731】

保護されたＵｎｙｌｉｎｋｅｒ機能化固体支持体化合物３０は、市販のものである。化合物８４を、文献に報告される手順と同様の手順を用いて調製する（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，２７，３０３５−３０４１、およびＨｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４８４２−４８４９を参照のこと）。

【0732】

ホスホラミダイト構築ブロック（化合物６０および７９ａ）を実施例２８および３６に例証される手順通りに調製する。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて、既定の配列および組成を有する３’末端にホスホジエステル結合共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定するようには意図されていない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序および量を調整して、任意の既定の配列および組成を有する本明細書に記載のオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例４１：固相技法による５’位にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２（Ｂｘがアデニンである実施例３７を参照のこと）共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ ６６１１３４の調製）

【0733】

別途明記されない限り、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬および溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロックおよび固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、および^ｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。ホスホラミダイト化合物５６および６０を用いて、５’末端のホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を合成した。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をb−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドおよび２’−ＭＯＥに用いた。

【0734】

カラムに充填されたＶＩＭＡＤ固体支持体（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ
ａｌ．，２００３）におけるホスホラミダイトカップリング方法を用いて、ＡＳＯ合成を、ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡｅＫＴＡオリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）上で実行した。このカップリングステップについて、固体支持体の初期充填に対して４倍超過したホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイトカップリングを１０分間行った。すべての他のステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の６％ジクロロ酢酸の溶液を用いて、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、無水ＣＨ_３ＣＮ中の４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）を活性剤として用いた。ホスホロチオエート結合を、３分間の接触時間で、１：１のピリジン／ＣＨ_３ＣＮのキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液との硫化によって導入した。６％の水を含有するＣＨ_３ＣＮ中の２０％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、１２分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を得た。

【0735】

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、４５分間の接触時間で、トルエン中の２０％ジエチルアミン（ｖ／ｖ）を用いて脱保護した。固体支持体結合ＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。
その後、非結合ＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強力なアニオン交換カラム上での高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝３０％ＣＨ_３ＣＮ水溶液中１００ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝Ａ中１．５Ｍ ＮａＢｒ、６０分後０〜４０％のＢ、流量１４ｍＬ／分−１、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラム上でのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期充填に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣカップリングＭＳ分析によって特徴付けた。

【表20】

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【0736】

下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａの構造は、実施例３７に示される。

実施例４２：固相技法による５’位にＧａｌＮＡｃ_３−３共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ ６６１１６６の調製）

【0737】

ＩＳＩＳ ６６１１６６の合成を、実施例３９および４１に例証される手順と同様の手順を用いて実行した。

【0738】

ＩＳＩＳ ６６１１６６は、５’位がＧａｌＮＡｃ_３−３共役体を含む５−１０−５ＭＯＥギャップマーである。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣカップリングＭＳ分析によって特徴付けた。

【表21】

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【0739】

下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「５’−ＧａｌＮＡｃ_３−３ａ」の構造は、実施例３９に示される。

実施例４３：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’末端でのホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２の用量依存的試験（Ｂｘがアデニンである実施例３７および４１を参照のこと）

【0740】

５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＩＳＩＳ ６６１１３４（実施例４１を参照のこと）を、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ４４０７６２および６５１９００（３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体、実施例９を参照のこと）を比較のために試験に含め、先の表１７に記載する。

処理

【0741】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、６６１１３４、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に規準化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡに対して相対的に決定した。以下の結果を、ＰＢＳ処理対照に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示し、「％ＰＢＳ」で表示する。前記方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に提示する。

【0742】

表３５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体（ＩＳＩＳ ６６１１３４）または３’末端に連結されたＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（ＩＳＩＳ ６５１９００）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４４０７６２）と比較して、強度の大幅な改善を示した。さらに、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＩＳＩＳ ６６１１３４は、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ ６５１９００と比較して、等効力であった。

【表22】

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【0743】

３’ＧａｌＮＡｃ_３−１および５’ＧａｌＮＡｃ_３−２の構造は、先の実施例９および３７に記載されている。

薬物動態分析（ＰＫ）

【0744】

高用量群（７ｍｇ／ｋｇ）のＡＳＯのＰＫを試験し、実施例２０に例証される様式と同一の様式で評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。６６１１３４（５’ＧａｌＮＡｃ_３−２）およびＩＳＩＳ ６５１９００（３’ＧａｌＮＡｃ_３−１）の全長代謝物を特定し、これらの質量を高分解能質量分析によって確認した。結果は、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＡＳＯ（ＩＳＩＳ
６６１１３４）に対して検出された主な代謝物が、ＩＳＩＳ ４４０７６２であったことを示した（データ示されず）。検出可能なレベルでさらなる代謝物は観察されなかった。その対応物とは異なり、先の表２３ａに報告された代謝物と同様のさらなる代謝物が、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６５１９００）で観察された。これらの結果は、ホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−１またはＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を有することで、それらの強度を損なうことなくＡＳＯのＰＫプロファイルを改善し得ることを示唆する。

実施例４４：ＳＲＢ−１を標的とする３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（実施例９を参照のこと）を含むＡＳＯのアンチセンス阻害へのＰＯ／ＰＳ結合の影響

【0745】

それぞれＳＲＢ−１を標的とする３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ
６５５８６１および６５５８６２を、単回投与試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１を阻害するそれらの能力について試験した。親非共役化合物ＩＳＩＳ ３５３３８２を比較のために試験に含めた。

【0746】

ＡＳＯは５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、ギャップ領域は、１０個の２’−デオキシリボヌクレオシドを含み、各ウィング領域は、５個の２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。ＡＳＯを先の実施例１９に例証される方法と同様の方法を用いて調製し、以下の表３６に示す。

【表23】

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【0747】

下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−１」の構造は、実施例９に示される。
処理

【0748】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６５５８６２、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。治療前および最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に規準化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡに対して相対的に決定した。以下の結果を、ＰＢＳ処理対照に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示し、「％ＰＢＳ」で表示する。前記方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に報告する。

【0749】

表３７に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、ＰＢＳ処理対照と比較して、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５５８６１および６５５８６２）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、強度の大幅な改善を示した。さらに、混合ＰＳ／ＰＯ結合を有するＩＳＩＳ ６５５８６２は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ６５５８６１）と比較して、強度の改善を示した。

【表24】

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【0750】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。臓器重量も評価した。結果は、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＳＯで処理したマウスにおいて、トランスアミナーゼレベル（表３８）の増加も臓器重量（データ示されず）の増加も観察されなかったことを示した。さらに、混合ＰＳ／ＰＯ結合を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６５５８６２）は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ６５５８６１）と比較して、同様のトランスアミナーゼレベルを示した。

【表25】

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実施例４５：ＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）の調製

【化263-1】

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【化263-2】

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【0751】

化合物４（９．５ｇ、２８．８ｍｍｏｌｅ）を化合物１０３ａまたは１０３ｂ（３８ｍｍｏｌｅ）で個別に処理し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＴＭＳＯＴｆ（０．５当量）および分子篩で処理し、室温で１６時間撹拌した。この時点で、セライトを通して有機層を濾過し、その後、重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、８０％超の収率で化合物１０４ａおよび１０４ｂを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0752】

化合物１０４ａおよび１０４ｂを化合物１００ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、９０％超の収率で化合物１０５ａおよび１０５ｂを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0753】

化合物１０５ａおよび１０５ｂを化合物９０１ａ〜ｄと同一の条件下で化合物９０と個別に処理して、化合物１０６ａ（８０％）および１０６ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0754】

化合物１０６ａおよび１０６ｂを化合物９６ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、１０７ａ（６０％）および１０７ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0755】

化合物１０７ａおよび１０７ｂを化合物９７ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、４０〜６０％の収率で化合物１０８ａおよび１０８ｂを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0756】

化合物１０８ａ（６０％）および１０８ｂ（４０％）を化合物１００ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、８０％超の収率で化合物１０９ａおよび１０９ｂを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0757】

化合物１０９ａを化合物１０１ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、３０〜６０％の収率で化合物１１０ａを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。あるいは、化合物１１０ｂを化合物１０９ｂから開始して同様の様式で調製することができる。
実施例４６：ＰＦＰエステル（オリゴヌクレオチド１１１）との共役のための一般的手順；ＩＳＩＳ ６６６８８１（ＧａｌＮＡｃ_３−１０）の調製

【0758】

標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、精製した。５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（５０μＬ）中に溶解した３当量の選択されたＰＦＰエステル化ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈殿した場合、すべてのＰＦＰエステルが溶液中に存在するまでＤＭＳＯを添加した。室温で約１６時間混合した後、反応が完了した。結果として生じた溶液を水で希釈して１２ｍＬにし、その後、３０００Ｄａの質量カットオフでスピンフィルターに３０００ｒｐｍで沈降させた。このプロセスを２回繰り返して、小分子不純物を除去した。その後、この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で２．５時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥させて、ＧａｌＮＡｃ_３共役オリゴヌクレオチドを得た。

【化264】

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【0759】

オリゴヌクレオチド１１１をＧａｌＮＡｃ_３−１０と共役する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１０のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、以下のＧａｌＮＡｃ_３−１０で合成されたオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６６８８１）に示される−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１０（ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化265】

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【0760】

この一般的手順に従って、ＩＳＩＳ ６６６８８１を調製した。標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６０２５４）を合成し、精製した。ＩＳＩＳ ６６０２５４（４０ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（５０μＬ）中に溶解した３当量のＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）を添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈殿した場合、ＰＦＰエステルを完全に溶解するためにさらなるＤＭＳＯ（６００μＬ）が必要であった。室温で約１６時間混合した後、反応が完了した。この溶液を水で希釈して全体積１２ｍＬにし、３０００Ｄａの質量カットオフでスピンフィルターに３０００ｒｐｍで沈降させた。このプロセスを２回繰り返して、小分子不純物を除去した。この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で２．５時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥させて、９０重量％の収率でＩＳＩＳ ６６６８８１（４２ｍｇ、４．７μｍｏｌ）を得た。

【表26】

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【0761】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。
実施例４７：ＧａｌＮＡｃ_３−８を含むオリゴヌクレオチド１０２の調製

【化266】

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【化267】

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【化268】

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【0762】

三酸９０（４ｇ、１４．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（８．９ｍＬ、５２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。Ｂｏｃ−ジアミン９１ａまたは９１ｂ（６８．８７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）とともに添加し、反応物を室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超還元し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で油に還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、約８０％の収率で化合物９２ａおよび９２ｂを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0763】

化合物９２ａまたは９２ｂ（６．７ｍｍｏｌｅ）を２０ｍＬのジクロロメタンおよび２０ｍＬのトリフルオロ酢酸で、室温で１６時間処理した。結果として生じた溶液を蒸発させ、その後、メタノール中に溶解し、ＤＯＷＥＸ−ＯＨ樹脂で３０分間処理した。結果として生じた溶液を濾過し、減圧下で油に還元して、８５〜９０％の収率の化合物９３ａおよび９３ｂを得た。

【0764】

化合物７または６４（９．６ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（３．７ｇ、９．６ｍｍｏｌｅ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）で１５分間処理した。これに、化合物９３ａまたは９３ｂ（３ｍｍｏｌｅ）のいずれかを添加し、
室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超還元し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で油に還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、２０〜４０％の収率で化合物９６ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0765】

化合物９６ａ〜ｄ（０．７５ｍｍｏｌｅ）を、ラネーニッケル上で３時間、エタノール（７５ｍＬ）中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、エタノールを減圧下で除去して、８０〜９０％の収率で化合物９７ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0766】

化合物２３（０．３２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（０．２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．３８ｍｍｏｌｅ）を個別に添加し、室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超還元し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で油に還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、３０〜４０％の収率で化合物９８ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0767】

化合物９９（０．１７ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（０．２９ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．５１ｍｍｏｌｅ）を個別に添加し、室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超還元し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で油に還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、４０〜６０％の収率で化合物１００ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0768】

化合物１００ａ〜ｄ（０．１６ｍｍｏｌｅ）を、１０％Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ上で３時間、メタノール／酢酸エチル（１：１、５０ｍＬ）中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、有機物を減圧下で除去して、８０〜９０％の収率で化合物１０１ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0769】

化合物１０１ａ〜ｄ（０．１５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）およびピリジン（０．０１６ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）中に個別に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．０３４ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超還元し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で油に還元した。結果として生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→５％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、約８０％の収率で化合物１０２ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳおよびプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【化269】

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【0770】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−８共役基を含むオリゴマー化合物１０２を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−８のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。好ましい一実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0771】

ＧａｌＮＡｃ_３−８（ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化270】

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実施例４８：ＧａｌＮＡｃ_３−７を含むオリゴヌクレオチド１１９の調製

【化271】

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【化272】

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【0772】

文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載される手順に従って化合物１１２を合成した。

【0773】

化合物１１２（５ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（２２ｍＬ／２２ｍＬ）中に溶解した。炭素（０．５ｇ）上水酸化パラジウムを添加した。反応混合物を室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、そのパッドを１：１メタノール／酢酸エチルで洗浄した。濾液と洗浄物を合わせ、濃縮乾固させて、化合物１０５ａ（定量的）を得た。この構造を、ＬＣＭＳによって確認した。

【0774】

化合物１１３（１．２５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．２ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２．８ｍＬ、１６．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１７ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物１０５ａ（３．７７ｇ、８．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、油を得た。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中１０〜２０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１４（１．４５ｇ、３０％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0775】

化合物１１４（１．４３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（４ｍＬ／４ｍＬ）中に溶解した。炭素（湿性、０．１４ｇ）上パラジウムを添加した。反応混
合物を水素で洗い流し、室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液と洗浄物を一緒に合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物１１５（定量的）を得た。この構造を、ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0776】

化合物８３ａ（０．１７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ中の化合物１１５（１．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過した。有機層を濃縮乾固させ、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中３〜１５％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１６（０．８４ｇ、６１％）を得た。この構造を、ＬＣ ＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【化273】

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【0777】

化合物１１６（０．７４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（５ｍＬ／５ｍＬ）中に溶解した。炭素（湿性、０．０７４ｇ）上パラジウムを添加した。反応混合物を水素で洗い流し、室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液と洗浄物を一緒に合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物１１７（０．７３ｇ、９８％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0778】

化合物１１７（０．６３ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（７２μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液に注いだ。この混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。このジク
ロロメタン溶液を濃縮乾固させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタン中５〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１８（０．５１ｇ、７９％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ、ならびに^１Ｈおよび^１Ｈおよび^１９Ｆ ＮＭＲによって確認した。

【化274】

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【0779】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−７共役基を含むオリゴマー化合物１１９を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−７のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0780】

ＧａｌＮＡｃ_３−７（ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化275】

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実施例４９：ＧａｌＮＡｃ_３−５を含むオリゴヌクレオチド１３２の調製

【化276】

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【0781】

化合物１２０（１４．０１ｇ、４０ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１４．０６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（８０ｍＬ）中に溶解した。トリエチルアミン（１１．２ｍＬ、８０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物１２１（１０ｇ、ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。さらなるトリエチルアミン（４．５ｍＬ、３２．２８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（１：１の酢酸エチル：ヘキサン；Ｒｆ＝０．４７）によって反応を監視した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）中に取り込み、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×１５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１５０ｍＬ）、およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。乾燥剤を濾去し、有機層を回転蒸発によって濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中３５〜５０％ＥｔＯＡｃを用いて溶出して、化合物１２２（１５．５０ｇ、７８．１３％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。質量（ｍ／ｚ）５８９．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0782】

水（２０ｍＬ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（９２．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、メタノール（１５ｍＬ）中に溶解した冷却した化合物１２２の溶液（７．７５ｇ、１３．１６ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌し、ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって監視した。反応混合物を減圧下で濃縮して、半分の体積にした。残りの溶液を氷浴中で冷却して、濃縮ＨＣｌを添加して中和した。反応混合物を希釈し、ＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で抽出し、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。エマルジョンを形成し、一晩静置した後に取り除いた。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、化合物１２３（８．４２ｇ）を得た。残留塩は、過剰な質量の推定原因である。ＬＣＭＳは、この構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。Ｍ．Ｗ．計算値：５７４．３６、Ｍ．Ｗ．実測値：５７５．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【化277】

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【0783】

文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９５８−９６３）に記載される手順に従って化合物１２６を合成した。

【化278】

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【化279】

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【0784】

化合物１２３（７．４１９ｇ、１２．９１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．４９ｇ、２５．８２ｍｍｏｌ）、および化合物１２６（６．３３ｇ、１６．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）中に溶解し、結果として生じた反応混合物を氷浴中で冷却した。これに、Ｎ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（４．４２ｍＬ、２５．８２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢｏｐ（８．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、続いて、Ｂｏｐカップリング試薬（１．１７ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で添加した。氷浴を除去し、溶液を室温まで温めた。１時間後に反応が完了し、ＴＬＣ（８９：１０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡＡ）によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ
ＮａＨＳＯ_４（３×１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１００ｍＬ）、およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣を５０％ヘキサン／ＥｔＯＡＣ：１００％ＥｔＯＡｃの勾配でのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の発泡体として化合物１２７（９．４ｇ）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）７７８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0785】

トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ）をジクロロメタン（１２ｍＬ）中の化合物１２７（１．５７ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下でトルエン（３０ｍＬ）と共蒸発乾固させた。得られた残渣をアセトニトリル（３０ｍ
Ｌ）およびトルエン（４０ｍＬ）と２回共蒸発させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物１２８（１．６７ｇ）を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）４７８．２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0786】

丸底フラスコ内で、化合物７（０．４３ｇ、０．９６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（０．０３５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を一緒に合わせ、減圧下で、Ｐ_２Ｏ_５上で４時間乾燥させ、その後、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、５分間撹拌した。これに無水ＤＭＦ（０．２ｍＬ）およびＮ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）中の化合物１２８（０．２０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で、アルゴン雰囲気下で撹拌した。３０分間後に反応が完了し、ＬＣＭＳおよびＴＬＣ（７％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×２０ｍＬ）、およびブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をジクロロメタン中５〜１５％ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１２９（９６．６ｍｇ）を得た。ＬＣ ＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致する。質量（ｍ／ｚ）８８３．４［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0787】

２０ｍＬのシンチレーションバイアル内で化合物１２９（０．０９ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）中に溶解した。これに、少量の１０％Ｐｄ／Ｃ（０．０１５ｍｇ）を添加し、反応容器をＨ_２ガスで洗い流した。反応混合物を室温で１８時間、Ｈ_２雰囲気下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液洗浄物を一緒にプールし、減圧下で濃縮して、化合物１３０（０．０８ｇ）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。質量（ｍ／ｚ）８３８．３［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0788】

１０ｍＬの先の尖った丸底フラスコに、化合物１３０（７５．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、０．３７Ｍピリジン／ＤＭＦ（２００μＬ）、および撹拌棒を添加した。この溶液に、０．７Ｍトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル／ＤＭＦ（１００μＬ）を撹拌しながら滴加した。１時間後に反応が完了し、ＬＣ ＭＳによって決定した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨＣｌ_３（約１０ｍＬ）中に溶解した。有機層をＮａＨＳＯ_４（１Ｍ、１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）、およびブライン（１０ｍＬ）にそれぞれ３回分配した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、化合物１３１（７７．７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳは、この構造と一致した。さらに精製することなく使用した。質量（ｍ／ｚ）９２１．３［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【化280】

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【0789】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−５共役基を含むオリゴマー化合物１３２を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−５のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0790】

ＧａｌＮＡｃ_３−５（ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化281】

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実施例５０：ＧａｌＮＡｃ_４−１１８を含むオリゴヌクレオチド１４４の調製

【化282-1】

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【化282-2】

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【0791】

化合物１３４の合成。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄフラスコに、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、およびアセトニトリルで洗浄したアミノメチルＶＩＭＡＤ樹脂（２．５ｇ、４５０μｍｏｌ／ｇ）を添加した。この樹脂は、アセトニトリル（４ｍＬ）中で膨潤した。２０（１．０ｍｍｏｌ、０．７４７ｇ）、ＴＢＴＵ（１．０ｍｍｏｌ、０．３２１ｇ）、アセトニトリル（５ｍＬ）、およびＤＩＥＡ（３．０ｍｍｏｌ、０．５ｍＬ）を添加して、化合物１３３を１００ｍＬの丸底フラスコ内で事前に活性化した。この溶液を５分間撹拌させ、その後、振盪しながらＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄフラスコに添加した。懸濁液を３時間振盪させた。反応混合物を排出し、樹脂をアセトニトリル、ＤＭＦ、およびＤＣＭで洗浄した。ＤＣＭ中５００ｎｍ（消光係数＝７６０００）でＤＭＴカチオンの吸光度を測定することにより新たな樹脂充填を定量化し、２３８μｍｏｌ／ｇであると決定した。無水酢酸溶液中で１０分間３回懸濁することにより、この樹脂をキャップした。

【0792】

反復性Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成方法を用いて、固体支持体結合化合物１４１を合成した。少量の固体支持体を回収し、アンモニア水（２８〜３０重量％）中に６時間懸濁した。切断された化合物をＬＣ−ＭＳによって分析し、観察された質量は、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）１０６３．８［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0793】

固相ペプチド合成方法を用いて、固体支持体結合化合物１４２を合成した。

【化283】

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【0794】

ＤＮＡ合成装置において標準の固相合成を用いて、固体支持体結合化合物１４３を合成した。

【0795】

固体支持体結合化合物１４３をアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で１６時間加熱した。溶液を冷却し、固体支持体を濾過した。濾液を濃縮し、残渣を水中に溶解し、強アニオン交換カラム上でＨＰＬＣによって精製した。全長化合物１４４を含有する画分を一緒にプールし、脱塩した。結果として生じたＧａｌＮＡｃ_４−１１共役オリゴマー化合物をＬＣ−ＭＳによって分析し、観察された質量は、その構造と一致した。

【0796】

共役基ＧａｌＮＡｃ_４−１１のＧａｌＮＡｃ_４クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_４−１１_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0797】

ＧａｌＮＡｃ_４−１１（ＧａｌＮＡｃ_４−１１_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化284】

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実施例５１：ＧａｌＮＡｃ_３−６を含むオリゴヌクレオチド１５５の調製

【化285】

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【0798】

文献（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，２２９，５４−６０）に記載されるように、化合物１４６を合成した。

【化286】

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【0799】

化合物４（１５ｇ、４５．５５ｍｍｏｌ）および化合物３５ｂ（１４．３グラム、５７ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）中に溶解した。活性化分子篩（４A、２ｇ、粉
末）を添加し、反応物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌させた。ＴＭＳ−ＯＴｆを添加し（４．１ｍＬ、２２．７７ｍｍｏｌ）、反応物を室温で一晩撹拌させた。完了した時点で、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｍＬ）および粉砕氷（約１５０ｇ）を注いで反応物を反応停止処理した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１２（１６．５３ｇ、６３％）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、予想した化合物と一致した。

【0800】

化合物１１２（４．２７ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間泡立てて反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上水酸化パラジウム、４００ｍｇ）を添加し、この溶液を通して水素ガスを３０分間泡立てた。完了した時点で（ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中１０％ＭｅＯＨ）およびＬＣＭＳ）、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１０５ａ（３．２８ｇ）を得た。ＬＣＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0801】

化合物１４７（２．３１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３．９ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）、続いて、ＨＢＴＵ（４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約１５分間撹拌させた。これに、乾燥ＤＭＦ中の化合物１０５ａ（３．３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、窒素雰囲気下で２時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液およびブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中２〜５％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１４８（３．４４ｇ、７３％）
を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、予想した生成物と一致した。

【0802】

化合物１４８（３．３ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間泡立てて反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上水酸化パラジウム）を添加した（３５０ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間泡立てた。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）およびＬＣＭＳ）、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１４９（２．６ｇ）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。残渣を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

【化287】

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【0803】

化合物１４６（０．６８ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解した。これに、ＤＩＥＡ（４５０μＬ、２．６ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＨＢＴＵ（１．９６ｇ、０．５．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５分間、窒素下で撹拌させた。無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物１４９（２．６ｇ）の溶液を添加した。ＤＩＥＡを添加することにより（必要に応じて）、反応物のｐＨをｐＨ＝９〜１０に調整した。反応物を室温で２時間、窒素下で撹拌させた。完了した時点で、反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１５０（０．６２ｇ、２０％）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0804】

化合物１５０（０．６２ｇ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間泡立てて反応混合物をパージした。パールマン触
媒（炭素上水酸化パラジウム）を添加した（６０ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間泡立てた。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）およびＬＣＭＳ）、触媒を濾去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１５１（０．５７ｇ）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。この生成物を４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

【化288】

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【0805】

化合物８３ａ（０．１１ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７５μＬ、１ｍｍｏｌ）およびＰＦＰ−ＴＦＡ（９０μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、その後３０分間かけて徐々にオレンジ色になった。ＴＬＣおよびＬＣＭＳによって反応の進行を監視した。完了した時点で（ＰＦＰエステルの形成）、ＤＭＦを中の化合物１５１（０．５７ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより（必要に応じて）、反応物のｐＨをｐＨ＝９〜１０に調整した。反応混合物を窒素下で約３０分間撹拌した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中２〜１０
％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１５２（０．３５ｇ、５５％）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0806】

化合物１５２（０．３５ｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間泡立てて反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上水酸化パラジウム）を添加した（３５ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間泡立てた。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）およびＬＣＭＳ）、触媒を濾去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１５３（０．３３ｇ、定量的）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。

【0807】

化合物１５３（０．３３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を窒素下で撹拌しながら無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６５μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＰＦＰ−ＴＦＡ（３５μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約３０分間撹拌した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、徐々にオレンジ色になった。さらにＮ，−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより、反応混合物のｐＨをｐＨ＝９〜１０で維持した。ＴＬＣおよびＬＣＭＳによって反応の進行を監視した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１５４（０．２９ｇ、７９％）を得た。ＬＣＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【化289】

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【0808】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−６共役基を含むオリゴマー化合物１５５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−６のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0809】

ＧａｌＮＡｃ_３−６（ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化290】

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実施例５２：ＧａｌＮＡｃ_３−９を含むオリゴヌクレオチド１６０の調製

【化291】

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【0810】

文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載される手順に従って化合物１５６を合成した。

【0811】

化合物１５６（１８．６０ｇ、２９．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）中に溶解した。炭素（６．１５ｇ、１０重量％、充填（乾燥ベース）、マトリックス炭素粉末、湿式）上パラジウムを添加した。反応混合物を室温で１８時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで完全に洗浄した。合わせた濾液を洗浄し、濃縮乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中５〜１０％メタノールで溶出して、化合物１５７（１４．２６ｇ、８９％）を得た。質量（ｍ／ｚ）５４４．１［Ｍ−Ｈ］⁻。

【0812】

化合物１５７（５ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中に溶解した。ＨＢＴＵ（３．６５ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３．７３ｍＬ、７８．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、化合物４７（２．９６ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液に注いだ。この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中５０％酢酸エチルで溶出して、化合物１５８（８．２５ｇ、７３．３％）を得た。この構造を、ＭＳおよび^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0813】

化合物１５８（７．２ｇ、７．６１ｍｍｏｌ）を減圧下でＰ_２Ｏ_５上で乾燥させた。乾燥させた化合物を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中に溶解した。これに、１Ｈ−テトラゾール（０．４３ｇ、６．０９ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルイミダゾール（０．３ｍＬ、３．８１ｍｍｏｌ）および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．６５ｍＬ、１１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中５０〜９０％酢酸エチルで溶出して、化合物１５９（７．８２ｇ、８０．５％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳおよび^３１Ｐ ＮＭＲ分析によって確認した。

【化292】

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【0814】

共役基標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−９を含むオリゴマー化合物１６０を調製した。化合物１５９の３つの単位を固体支持体に、続いて、ヌクレオチドホスホラミダイトにカップリングした。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理して、化合物１６０を得た。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−９のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−９（ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化293】

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実施例５３：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１ａおよびＧａｌＮＡｃ_３−３ａ）の調製のための代替手順

【化294】

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【0815】

ラクトン１６１をジアミノプロパン（３〜５当量）またはＭｏｎｏ−Ｂｏｃ保護ジアミノプロパン（１当量）と反応させて、アルコール１６２ａまたは１６２ｂを得た。非保護プロパンジアミンを上述の反応で用いた場合、過剰なジアミンを高真空下で蒸発させて除去し、ＣｂｚＣｌを用いて１６２ａ中の遊離アミノ基を保護して、カラムクロマトグラフ
ィーによって精製した後に、白色の固体として１６２ｂを得た。アルコール１６２ｂをＴＭＳＯＴｆの存在下で化合物４とさらに反応させ１６３ａを得て、触媒水素化を用いてＣｂｚ基を除去することにより、これを１６３ｂに変換した。ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル１６４を、三酸１１３（実施例４８を参照のこと）をＤＭＦ（０．１〜０．５Ｍ）中のＰＦＰＴＦＡ（３．５当量）およびピリジン（３．５当量）と接触させることによって調製した。トリエステル１６４をアミン１６３ｂ（３〜４当量）およびＤＩＰＥＡ（３〜４当量）と直接反応させて、化合物１８を得た。上述の方法は、中間体精製を大幅に促進し、実施例４に記載される手順を用いて形成される副生成物の形成を最小限に抑える。
実施例５４：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１ａおよびＧａｌＮＡｃ_３−３ａ）の調製のための代替手順

【化295】

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【0816】

先の実施例５３に概説される手順を用いて酸１１３からトリＰＦＰエステル１６４を調製し、モノＢｏｃ保護ジアミンと反応させて、本質的に定量的な収率で１６５を得た。Ｂｏｃ基を塩酸またはトリフルオロ酢酸で除去して、トリアミンを得て、これをＤＩＰＥＡ等の好適な塩基の存在下でＰＦＰ活性化酸１６６と反応させて、化合物１８を得た。

【0817】

ＤＭＦ中のＰＦＰＴＦＡ（１〜１．２当量）およびピリジン（１〜１．２当量）で処理することにより、ＰＦＰ保護Ｇａｌ−ＮＡｃ酸１６６を対応する酸から調製した。次いで、アセトニトリルおよび水中のＴＥＭＰＯ（０．２当量）およびＢＡＩＢを用いて酸化することにより、前駆酸を対応するアルコールから調製した。先の実施例４７に記載される条件を用いて１，６−ヘキサンジオール（または１，５−ペンタンジオールもしくは他の
ｎ値の他のジオール）（２〜４当量）およびＴＭＳＯＴｆと反応させることにより、前駆アルコールを糖中間体４から調製した。

実施例５５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−１、３、８、および９の比較）

【0818】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。様々なＧａｌＮＡｃ_３共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかに結合させた。

【表27】

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【0819】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0820】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−９の構造は、先の実施例５２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３の構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−８の構造は、先の実施例４７に示した。

処理

【0821】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６６４０７８、６６１１６１、６６５００１、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0822】

表４０に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、３’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−１およびＧａｌＮＡｃ_３−９共役体（ＩＳＩＳ ６５５８６１およびＩＳＩＳ ６６４０７８）ならびに５’末端に連結されたＧａｌＮＡｃ_３−３およびＧａｌＮＡｃ_３−８共役体（ＩＳＩＳ ６６１１６１およびＩＳＩＳ ６６５００１）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、強度の大幅な改善を示した。さらに、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−９共役体を含むＩＳＩＳ ６６４０７８は、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ ６５５８６１と比較して、本質的に等効力であった。それぞれ、ＧａｌＮＡｃ_３−３またはＧａｌＮＡｃ_３−９を含む５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６６１１６１およびＩＳＩＳ ６６５００１は、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５５８６１およびＩＳＩＳ ６６４０７８）と比較して、強度を増加させた。

【表28】

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【0823】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表に示す。

【表29】

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実施例５６：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−１、２、３、５、６、７、および１０の比較）

【0824】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。３’末端にＧａｌＮＡｃ_３共役基を結合させたＩＳＩＳ ６５５８６１を除いて、様々なＧａｌＮＡｃ_３共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させた。

【表30】

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【0825】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0826】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａの構造は、先の実施例３７に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａの構造は、先の実施例４９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａの構造は、先の実施例５１に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、先の実施例４８に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、先の実施例４６に示した。

処理

【0827】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６６４５０７、６６１１６１、６６６２２４、６６６９６１、６６６９８１、６６６８８１、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0828】

表４３に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、強度の大幅な改善を示した。５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、強度のわずかな増加を示した。

【表31】

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【0829】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表４４に示す。

【表32】

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実施例５７：生体内におけるＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの作用持続時間試験

【0830】

マウスに以下に示される用量を１回注入し、ＡｐｏＣ−ＩＩＩおよび血漿トリグリセリド（血漿ＴＧ）レベルを４２日間にわたって監視した。各群におけるヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する３匹のトランスジェニックマウスを用いて、この試験を実行した。

【表33】

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【0831】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（Ｐ
Ｓ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0832】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。

【表34】

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【0833】

上の表に見られるように、作用持続時間は、非共役オリゴヌクレオチドと比較して、３’−共役基の添加とともに増加した。共役完全ＰＳオリゴヌクレオチド６４７５３５と比較して、共役混合ＰＯ／ＰＳオリゴヌクレオチド６４７５３６の作用持続時間がさらに増加した。
実施例５８：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−１およびＧａｌＮＡｃ_４−１１の比較）

【0834】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ４４０７６２を非共役標準物として含めた。共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させた。

【0835】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１１_ａの構造ＧａｌＮＡｃは、先の実施例５０に示した。

処理

【0836】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、６６３７４８、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１
ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0837】

表４７に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。３’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−１およびＧａｌＮＡｃ_４−１１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５１９００およびＩＳＩＳ ６６３７４８）は、非共役アンチセンスオ
リゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４４０７６２）と比較して、強度の大幅な増加を示した。２個の共役オリゴヌクレオチド、ＧａｌＮＡｃ_３−１およびＧａｌＮＡｃ_４−１１は、等効力であった。

【表35】

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【0838】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0839】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表４８に示す。

【表36】

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実施例５９：生体内におけるＦＸＩを標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯの影響

【0840】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験においてマウスにおけるＦＸＩのアンチセンス阻害について試験した。ＩＳＩＳ ４０４０７１を非共役標準物として含めた。共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド
の切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させた。

【表37】

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【0841】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0842】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。

処理

【0843】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４０４０７１、６５６１７２、６５６１７３、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で週２回３週間、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いて血漿ＦＸＩタンパク質レベルも測定した。ＰＢＳ処理対照に規準化する前に（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を用いて）ＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡに対して相対的に決定した。以下の結果を、各処理群のＦＸＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。データをＰＢＳ処理対照に規準化し、「％ＰＢＳ」で表示する。前記方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に提示する。

【表38】

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【0844】

表５０に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的
様式でＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを低下させた。３’−ＧａｌＮＡｃ_３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４０４０７１）と比較して、強度の大幅な増加を示した。ＰＳ結合のうちのいくつかをＰＯ（ＩＳＩＳ
６５６１７３）と置き換えることによって、これら２個の共役オリゴヌクレオチドの間で強度の増加がさらに提供された。

【0845】

表５０ａに例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＦＸＩタンパク質レベルを低下させた。３’−ＧａｌＮＡｃ_３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４０４０７１）と比較して、強度の大幅な増加を示した。ＰＳ結合のうちのいくつかをＰＯ（ＩＳＩＳ ６５６１７３）と置き換えることによって、これら２個の共役オリゴヌクレオチドの間で強度の増加がさらに提供された。

【表39】

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【0846】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビン、総アルブミン、ＣＲＥ、およびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表に示す。

【表40】

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実施例６０：生体外におけるＳＲＢ−１を標的とする共役ＡＳＯの影響

【0847】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験において初代マウス肝細胞におけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＩＳＩＳ ３５３３８２を非共
役標準物として含めた。共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合させた。

【表41】

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【0848】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0849】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−８ａの構造は、先の実施例４７に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−９ａの構造は、先の実施例５２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−６ａの構造は、先の実施例５１に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−２ａの構造は、先の実施例３７に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１０ａの構造は、先の実施例４６に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−５ａの構造は、先の実施例４９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

処理

【0850】

上に列記されるオリゴヌクレオチドを、２５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、かつ０．０３、０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、または２０ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドで処理した初代マウス肝細胞において生体外で試験した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された総ＲＮＡ含有量に従ってＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを調整した。

【0851】

標準の方法を用いてＩＣ_５０を計算し、結果を表５３に提示する。結果は、オリゴヌクレオチドの細胞への進入を人工的に促進するために試薬も電気穿孔技法も用いない遊離取り込み条件下で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）よりも肝細胞において著しく強力であったことを示す。

【表42】

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【0852】

^ａ複数回の実行の平均。
実施例６１：ＧａｌＮＡｃ_３−１２を含むオリゴマー化合物１７５の調製

【化296】

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【化297】

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【化298】

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【化299】

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【0853】

化合物１６９は、市販のものである。ベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレート
を化合物１７１に添加することによって化合物１７２を調製した。ＰＦＰ−ＴＦＡおよびＤＩＥＡをＤＭＦ中の５−（ベンジルオキシ）−５−オキソペンタン酸に添加することによって、ベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレートを調製した。実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１２共役基を含むオリゴマー化合物１７５を化合物１７４から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１２のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１２（ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化300】

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実施例６２：ＧａｌＮＡｃ_３−１３を含むオリゴマー化合物１８０の調製

【化301】

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【化302】

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【化303】

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【0854】

実施例２に示される一般的手順を用いて、化合物１７６を調製した。実施例４９に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１３共役基を含むオリゴマー化合物１８０を化合物１７７から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１３のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１３（ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化304】

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実施例６３：ＧａｌＮＡｃ_３−１４を含むオリゴマー化合物１８８の調製

【化305】

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【0855】

化合物１８１および１８５は、市販のものである。実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１４共役基を含むオリゴマー化合物１８８を化合物１８７から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１４のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１４（ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化306】

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実施例６４：ＧａｌＮＡｃ_３−１５を含むオリゴマー化合物１９７の調製

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【化307】

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【0856】

化合物１８９は、市販のものである。実施例３１に示される一般的手順を用いて、化合物１９５を調製した。標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１５共役基を含むオリゴマー化合物１９７を化合物１９４および１９５から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１５のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）
−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１５（ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化308】

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実施例６５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−３、１２、１３、１４、および１５の比較）

【0857】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。ＧａｌＮＡｃ_３共役基の各々を、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能な部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させた。

【表43】

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【0858】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0859】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１２ａの構造は、先の実施例６１に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１４ａの構造は、先の実施例６３に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−
１５ａの構造は、先の実施例６４に示した。

処理

【0860】

６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６６１１６１、６７１１４４、６７００６１、６７１２６１、６７１２６２、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回または２回、皮下注入した。２回投与されたマウスは、第１の投与の３日後に第２の投与を受けた。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0861】

表５５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。単回用量を受けた動物と２回の用量を受けた動物との間で標的ノックダウンの著しい差は観察されなかった（ＩＳＩＳ ３５３３８２の投与量３０および２×１５ｍｇ／ｋｇ、ならびにＩＳＩＳ ６６１１６１の投与量５および２×２．５ｍｇ／ｋｇを参照のこと）。ホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ_３−３、１２、１３、１４、および１５共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３３５３８２）と比較して、強度の大幅な増加を示した。

【表44】

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【0862】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な差は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表５６に示す。

【表45】

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実施例６６：５’−ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害への様々な切断可能な部分の影響

【0863】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＧａｌＮＡｃ_３共役基の各々を、ホスホジエステルの連結したヌクレオシドの切断可能な部分（ＣＭ）によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させた。

【表46】

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【0864】

大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0865】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示した。

処理

【0866】

６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ６６１１６１、６７０６９９、６７０７００、６７０７０１、６７１１６５、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0867】

表５８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的
様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。様々な切断可能な部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、同様の強度を示した。

【表47】

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【0868】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な差は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表５６に示す。

【表48】

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実施例６７：ＧａｌＮＡｃ_３−１６を含むオリゴマー化合物１９９の調製

【化309】

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【0869】

実施例７および９に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１６共役基を含むオリゴマー化合物１９９を調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１６のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１６_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１６（ＧａｌＮＡｃ_３−１６_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化310】

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実施例６８：ＧａｌＮＡｃ_３−１７を含むオリゴマー化合物２００の調製

【化311】

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【0870】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１７共役基を含むオリゴマー化合物２００を調製した。ＧａｌＮＡｃ_３−１７のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１７（ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化312】

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実施例６９：ＧａｌＮＡｃ_３−１８を含むオリゴマー化合物２０１の調製

【化313】

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【0871】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１８共役基を含むオリゴマー化合物２０１を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１８のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化314】

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実施例７０：ＧａｌＮＡｃ_３−１９を含むオリゴマー化合物２０４の調製

【化315】

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【0872】

実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１９共役基を含むオリゴマー化合物２０４を化合物６４から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１９のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１９（ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化316】

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実施例７１：ＧａｌＮＡｃ_３−２０を含むオリゴマー化合物２１０の調製

【化317】

[この文献は図面を表示できません]

【0873】

ＰＦＰ−ＴＦＡおよびＤＩＥＡを、トリフリン酸無水物を６−アミノヘキサン酸に添加することによって調製したアセトニトリル中の６−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ヘキサン酸に添加することによって、化合物２０５を調製した。反応混合物を８０℃に加熱し、その後、室温まで下げた。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２０共役基を含むオリゴマー化合物２１０を化合物２０８から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２０のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２０（ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａ−ＣＭ−）の構造を以下
に示す。

【化318】

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実施例７２：ＧａｌＮＡｃ_３−２１を含むオリゴマー化合物２１５の調製

【化319】

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【0874】

化合物２１１は、市販のものである。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２１５を化合物２１３から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２１のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−２１_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２１（ＧａｌＮＡｃ_３−２１_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化320】

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実施例７３：ＧａｌＮＡｃ_３−２２を含むオリゴマー化合物２２１の調製

【化321】

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【化322】

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【0875】

ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを用いて、化合物２２０を化合物２１９から調製した。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２２１を化合物２２０から調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２２
のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−２２_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能な部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２２（ＧａｌＮＡｃ_３−２２_ａ−ＣＭ−）の構造を以下に示す。

【化323】

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実施例７４：５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害への様々な切断可能な部分の影響

【0876】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＧａｌＮＡｃ_３共役基の各々を、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させた。

【表49】

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【0877】

すべての表において、大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0878】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１７ａの構造は、先の実施例６８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１８ａの構造は、実施例６９に示した。

処理

【0879】

６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表６０に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0880】

表６１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同様の強度を示し、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【表50】

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【0881】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスに対して相対的に測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表６２に示す。

【表51】

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実施例７５：５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの薬物動態分析

【0882】

実施例６５、６６、および７４に記載される治療手順に従って得た肝臓試料を用いて、上の表５４、５７、および６０におけるＡＳＯのＰＫを評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出し、内部標準とともにＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。適切なＵＶピークを統合することによってすべての代謝物の合わせた組織レベル（μｇ／ｇ）を測定し、適切な抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を用いて、共役体（この場合、ＩＳＩＳ番号３５３３８２の「親」）を欠く全長ＡＳＯの組織レベルを測定した。

【表52】

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【0883】

上の表６３における結果は、特にＧａｌＮＡｃ_３共役基を有するオリゴヌクレオチドとＧａｌＮＡｃ_３共役基を有しないオリゴヌクレオチドとの間の投薬の差を考慮に入れた場合、オリゴヌクレオチド投与の７２時間後に、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むオリゴヌクレオチドの肝臓組織レベルが、ＧａｌＮＡｃ３共役基を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）の肝臓組織レベルよりも高かったことを示す。さらに、７２時間までに、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含む各オリゴヌクレオチドの４０〜９８％が親化合物に代謝され、ＧａｌＮＡｃ_３共役基がオリゴヌクレオチドから切断されたことを示す。
実施例７６：ＧａｌＮＡｃ_３−２３を含むオリゴマー化合物２３０の調製

【化324】

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【化325】

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【0884】

化合物２２２は、市販のものである。４４．４８ｍＬ（０．３３ｍｏｌ）の化合物２２２をピリジン（５００ｍＬ）中の塩化トシル（２５．３９ｇ、０．１３ｍｏｌ）で１６時間処理した。その後、反応物を蒸発させて油にし、ＥｔＯＡｃ中に溶解し、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。酢酸エチルを濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、続いて、ＣＨ_２Ｃｌ_２中１０％メタノールで溶出して、無色の油として化合物２２３を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。１０ｇ（３２．８６ｍｍｏｌ）の１−トシルトリエチレングリコール（化合物２２３）を、ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（１０．６８ｇ、１６４．２８ｍｍｏｌ）で、室温で１７時間処理した。その後、反応混合物を水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水で３回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させて、５．３ｇの化合物２２４（９２％）を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。１−アジドトリエチレングリコール（化合物２２４、５．５３ｇ、２３．６９ｍｍｏｌ）および化合物４（６ｇ、１８．２２ｍｍｏｌ）を、４Ａ分子篩（５ｇ）およびジクロロメタン（１００ｍＬ）中のＴＭＳＯＴｆ（１．６５ｍＬ、９．１１ｍｍｏｌ）で、不活性雰囲気下で処理した。１４時間後、反応物を濾過して篩を除去し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中２〜４％メタノールの勾配で溶出して、化合物２２５を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２５（１１．９ｇ、２３．５９ｍｍｏｌ）をパールマン触媒上で、ＥｔＯＡｃ／メタノール（４：１、２５０ｍＬ）中で水素化した。８時間後、触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、化合物２２６を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。

【0885】

化合物２２７を生成するために、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のニトロメタントリスプロピオン酸（４．１７ｇ、１５．０４ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（１０．３ｍＬ、６０．１７ｍｍｏｌ）の溶液をペンタフルオロトリフルオロアセテート（９．０５ｍＬ、５２．６５ｍｍｏｌ）で液滴処理した。３０分間後、反応物を氷水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、その後、ヘプタンから再結晶化して、白色の固体として化合物２２７を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２７（１．５ｇ、１．９３ｍｍ
ｏｌ）および化合物２２６（３．７ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５ｍＬ）中で、室温で２時間撹拌した。その後、反応物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中２〜１０％メタノールの勾配で溶出して、化合物２２８を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２８（１．７ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）中のラネーニッケル（約２ｇ、湿性）で、水素雰囲気下で処理した。１２時間後、触媒を濾去し、有機層を蒸発させて固体にし、これを次のステップで直接使用した。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。この固体（０．８７ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中のベンジルグルタル酸（０．１８ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２７３．７μＬ、１．６ｍｍｏｌ）で処理した。１６時間後、ＤＭＦを減圧下で６５℃で除去して油にし、この油をジクロロメタン中に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を蒸発させた後、化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中２〜２０％メタノールの勾配で溶出して、カップリング生成物を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。ベンジルエステルをパールマン触媒で、水素雰囲気下で１時間脱保護した。その後、この触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、酸を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。酸（４８６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。ピリジン（５３．６１μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴンでパージした。ペンタフルオロトリフルオロアセテート（４６．３９μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に緩徐に添加した。反応物の色が淡黄色からワイン色に変化し、少しの煙を発し、この煙をアルゴン流で吹き飛ばした。反応物を室温で１時間撹拌させた（反応の完了をＬＣＭＳによって確認した）。この溶媒を減圧下（回転蒸発）で７０℃で除去した。残渣をＤＣＭで希釈し、１Ｎ ＮａＨＳＯ_４、ブライン、飽和重炭酸ナトリウム、および再度ブラインで洗浄した。有機物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて、黄色の脆性発泡体として２２５ｍｇの化合物２２９を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。

【0886】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２３共役基を含むオリゴマー化合物２３０を化合物２２９から調製した。ＧａｌＮＡｃ_３−２３共役基のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−２３（ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化326】

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実施例７７：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0887】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【表53】

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【0888】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−９ａは、実施例５２に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａは、実施例７１に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａは、実施例７６に示した。

処理

【0889】

６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各々に、表６４に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0890】

表６５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【表54】

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【0891】

標準のプロトコルを用いて、血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）も測定した。総ビリルビンおよびＢＵＮも評価した。体重の変化を評価し、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびＢＵＮ値を、以下の表６６に示す。

【表55】

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実施例７８：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むアンギオテンシノーゲンを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0892】

以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験において正常血圧のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおけるアンギオテンシノーゲン（ＡＧＴ）のアンチセンス阻害について試験した。

【表56】

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【0893】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。

処理

【0894】

６週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの各々に、表６７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にラットを屠殺した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡレベルを決定した。全アンギオテンシノーゲンＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＪＰ２７４１２、ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を用いて、１：２０，０００で希釈したＡＧＴ血漿タンパク質レベルを測定した。以下の結果を、ＰＢＳ対照に規準化された各処理群の肝臓におけるＡＧＴ
ｍＲＮＡレベルまたは血漿におけるＡＧＴタンパク質レベルの平均パーセントとして提示する。

【0895】

表６８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質レベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【表57】

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【0896】

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ならびに体重も測定した。結果を以下の表６９に示す。

【表58】

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実施例７９：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

【0897】

以下の表７０に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【表59】

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【0898】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示した。

処理

【0899】

ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する６〜８週齢のトランスジェニックマウスの各々に、表７０に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、３匹の動物から成った。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後７２時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、および６週間時点のレベルを決定した。実施例２０に記載されるように、血漿トリグリセリドおよびＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを測定した。以下の結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の血漿トリグリセリドおよびＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして提示し、親オリゴヌクレオチドの投与量がＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドの投与量の３倍であったにもかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドが共役基（ＩＳＩＳ ３０４８０１）を有しない親オリゴヌクレオチドよりも長い作用持続時間を示したことを示す。

【0900】

【表60】

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実施例８０：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むα−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0901】

以下の表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるＡ１ＡＴの用量依存的阻害試験において試験した。

【表61】

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【0902】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示した。

処理

【0903】

６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各々に、表７２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡレベルを決定した。マウスα１−抗トリプシンＥＬＩＳＡ（カタログ番号４１−Ａ１ＡＭＳ−Ｅ０１、Ａｌｐｃｏ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて、Ａ１ＡＴ血漿タンパク質レベルを決定した。以下の結果を、ＰＢＳ対照に規準化された各処理群の肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示する。

【0904】

表７３に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡおよびＡ１ＡＴ血漿タンパク質レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、親（ＩＳＩＳ ４７６３６６）よりも著しく強力であった。

【表62】

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【0905】

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼおよびＢＵＮレベルを測定した。体重および臓器重量も測定した。結果を以下の表７４に示す。体重を、ベースラインと比較した％として示す。臓器重量を、ＰＢＳ対照群と比較した体重の％として示す。

【表63】

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実施例８１：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＡ１ＡＴを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

【0906】

表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

処理

【0907】

６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各々に、表７２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。投薬の前日に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後５、１２、１９、および２５日時点のレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルを測定した（実施例８０を参照のこと）。以下の結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルの平均パーセントとして提示する。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４７６３６６）よりも強力であり、かつより長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６７８３８１、６７８３８２、６７８３８３、および６７８３８４）は、概して、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６３２６）よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

【表64】

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実施例８２：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体外におけるアンチセンス阻害

【0908】

処理の２時間前に、初代マウス肝細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。表７６に列記されるオリゴヌクレオチドをウィリアムＥ培地に２、１０、５０、または２５０ｎＭで添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。オリゴヌクレオチド添加の１６時間後に細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｅ ３０００ ＢｉｏＲｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを精製した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、ＩＣ_５０値を決定した。結果は、様々な異なるＧａｌＮＡｃ共役基および様々な異なる切断可能な部分を含むオリゴヌクレオチドが、生体外遊離取り込み実験において、ＧａｌＮＡｃ共役基を欠く親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２および６６６８４１）よりも著しく強力であることを示す。

【表65-1】

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【表65-2】

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【0909】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａは、実施例４９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａは、実施例５１に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａは、実施例４７に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａは、実施例５２に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａは、実施例６１に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａは、実施例６３に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａは、実施例６４に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａは、実施例６８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａは、実施例６９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａは、実施例７１に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａは、実施例７６に示した。
実施例８３：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含む第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0910】

以下の表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける第ＸＩ因子の用量依存的阻害試験において試験した。

【表66】

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【0911】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示した。

処理

【0912】

６〜８週齢のマウスの各々に、以下に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて肝臓における第ＸＩ因子ｍＲＮＡレベルを測定し、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンに規準化した。肝臓トランスアミナーゼ、ＢＵＮ、およびビリルビンも測定した。以下の結果を、ＰＢＳ対照に規準化された各処理群の平均パーセントとして提示する。

【0913】

表７８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓における第ＸＩ因子ｍＲＮＡを低下させた。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４０４０７１）よりも強力であったことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、および６７８３４９）は、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６１７３）よりもさらに強力であった。

【表67】

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実施例８４：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含む第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

【0914】

表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

処理

【0915】

６〜８週齢のマウスの各々に、表７７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。投薬の前日に尾出血によって血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後３、１０、および１７日間時点のレベルを決定した。Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の第ＸＩ因子捕捉およびビオチン化検出抗体（それぞれ、カタログ番号ＡＦ２４６０およびＢＡＦ２４６０）、ならびにＯｐｔＥＩＡ試薬セットＢ（カタログ番号５５０５３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。以下の結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示する。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ
４０４０７１）よりも強力であり、より長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、および６７８３４９）は、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６１７３）よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

【表68】

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実施例８５：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0916】

表７６に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

処理

【0917】

６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの各々に、表７６に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の４８時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果を、生理食塩水（対照）に規準化された各処理群の肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。

【0918】

表８０および８１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【表69】

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【表70】

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【0919】

標準のプロトコルを用いて、肝臓トランスアミナーゼレベル、総ビリルビン、ＢＵＮ、および体重も測定した。各処理群の平均値を以下の表８２に示す。

【表71】

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実施例８６：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0920】

以下の表８３に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトＴＴＲ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）のアンチセンス阻害について試験した。

処理

【0921】

８週齢のＴＴＲトランスジェニックマウスの各々に、以下の表に列記されるオリゴヌクレオチドおよび投与量またはＰＢＳを、週１回３週間、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。この実験を通して様々な時点で尾出血を実行し、血漿ＴＴＲタンパク質、ＡＬＴ、およびＡＳＴレベルを測定し、表８５〜８７に報告した。動物を屠殺した後、血漿ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびヒトＴＴＲレベルを測定し、体重、臓器重量、および肝臓におけるヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルも測定した。臨床分析器（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるヒトＴＴＲ
ｍＲＮＡレベルを決定した。表８４〜８７に提示される結果は、各処理群の平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのＰＢＳ群の平均値と比較した平均値である。体重は、個々の処理群それぞれを屠殺するまでのベースラインからの平均体重変化率である。示される臓器重量は、動物の体重に規準化されており、各処理群の平均規準化臓器重量を、ＰＢＳ群の平均規準化臓器重量と比較して提示する。

【0922】

表８４〜８７において、「ＢＬ」は、第１の投与の直前に測定したベースラインを示す。表８４および８５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＴＴＲ発現レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であった。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドおよび混合ＰＳ／ＰＯヌクレオシド間結合は、ＧａｌＮＡｃ共役体および完全ＰＳ結合を含むオリゴヌクレオチドよりもさらに強力であった。

【表72】

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【0923】

表８５の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１の構造は、実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａの構造は、実施例７０に示した。

【表73】

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【表74】

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【表75】

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【表76】

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実施例８７：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドの単回投与による生体内における作用持続時間

【0924】

ＩＳＩＳ番号４２０９１５および６６０２６１（表８３を参照のこと）を、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。ＩＳＩＳ番号４２０９１５、６８２８８３、および６８２８８５（表８３を参照のこと）も、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

処理

【0925】

ヒトＴＴＲを発現する８週齢の雄トランスジェニックマウスの各々に、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４２０９１５または１３．５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６６０２６１を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。投薬前に尾出血を実行して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１０、１７、２４、および３９日目のレベルを決定した。実施例８６に記載されるように、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。以下の結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして提示する。

【表77】

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処理

【0926】

ヒトＴＴＲを発現する雌トランスジェニックマウスの各々に、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４２０９１５、１０．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８２８８３、または１０．０ｍｇ／ｋｇの６８２８８５を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。投薬前に尾出血を実行して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１０、１７、２４、および３９日目のレベルを決定した。実施例８６に記載されるように、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。以下の結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして提示する。

【表78】

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【0927】

表８８および８９における結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であり、より長い作用持続時間を有することを示す。
実施例８８：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＭＮを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるスプライシング調節

【0928】

表９０に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるヒト運動ニューロン生存（ＳＭＮ）のスプライシング調節について試験した。

【表79】

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【0929】

ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、先の実施例４８に示した。「Ｘ」は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）によって生成された５’一次アミンを示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ｂは、以下に示されるリンカーの−ＮＨ−Ｃ_６−Ｏ部分を欠くＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造を示す。

【化327】

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【0930】

ＩＳＩＳ番号７０３４２１および７０３４２２は、モルフォリノオリゴヌクレオチドであり、これら２個のオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、モルフォリノヌクレオチドである。

処理

【0931】

ヒトＳＭＮを発現する６週齢のトランスジェニックマウスに、表９１に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を１回皮下注入した。各処理群は、２匹の雄および２匹の雌から成った。投与の３日後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲを用いて、エキソン７を有する場合とエキソン７を有しない場合の肝臓におけるヒトＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を用いて総ＲＮＡを測定した。ＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを総ｍＲＮＡに規準化し、生理食塩水処理群の平均にさらに規準化した。結果として生じたエキソン７を含むＳＭＮ ｍＲＮＡとエキソン７を欠くＳＭＮ ｍＲＮＡとの平均比を表９１に示す。結果は、スプライシングを調節し、かつＧａｌＮＡｃ共役体を含む完全修飾オリゴヌクレオチドが、ＧｌａＮＡｃ共役体を欠く
親オリゴヌクレオチドよりも肝臓におけるスプライシングの変化に著しく強力であることを示す。さらに、この傾向は、２’−ＭＯＥおよびモルフォリノ修飾オリゴヌクレオチドを含む複数の化学修飾において維持される。

【表80】

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実施例８９：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むアポリポタンパク質Ａ（Ａｐｏ（ａ））を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0932】

以下の表９２に列記されるオリゴヌクレオチドを、トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏ（ａ）の用量依存的阻害試験について試験した。

【表81】

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【0933】

ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。

処理

【0934】

８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各々に、表９２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計６回の投与で、皮下注入した。各処理群は、３〜４匹の動物から成った。第１の投与の前日に、かつ各投与後週１回、尾出血を実行して、血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを決定した。最終投与の２日後にマウスを屠殺した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いてＡｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルを決定し、肝臓トランスアミナーゼレベルを決定した。表９３におけるｍＲＮＡおよび血漿タンパク質の結果を、ＰＢＳ処理群と比較した処理群の平均パーセントとして提示する。血漿タンパク質レベルをＰＢＳ群のベースライン（ＢＬ）値にさらに規準化した。平均絶対トランスアミナーゼレベルおよび体重（ベースライン平均と比較した％）が表９４に報告される。

【0935】

表９３に例証されるように、オリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓に
おけるＡｐｏ（ａ）ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質レベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、より長い作用持続時間を有した。表９４に例証されるように、トランスアミナーゼレベルおよび体重はオリゴヌクレオチドの影響を受けず、オリゴヌクレオチドが良好な耐容性を示したことを示す。

【表82】

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【表83】

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実施例９０：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0936】

以下の表９５に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトＴＴＲ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）のアンチセンス阻害について試験した。

処理

【0937】

ＴＴＲトランスジェニックマウスの各々に、表９６に列記されるオリゴヌクレオチドおよび投与量またはＰＢＳを、週１回３週間、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。第１の投与の前に、尾出血を実行して、ベースライン（ＢＬ）での血漿ＴＴＲタンパク質レベルを決定した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。臨床分析器（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルを決定した。表９６に提示される結果は、各処理群の平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのＰＢＳ群の平均値と比較した平均値である。「ＢＬ」は、第１の投与の直前に測定したベースラインを示す。表９６に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＴＴＲ発現レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であり
、ホスホジエステルまたはデオキシアデノシンの切断可能な部分を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠く親と比較して、強度の著しい改善を示した（ＩＳＩＳ番号６８２８８３および６６６９４３対４２０９１５、ならびに実施例８６および８７を参照のこと）。

【表84】

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【0938】

表９５の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示した。

【表85】

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実施例９１：非ヒト霊長類におけるＧａｌＮＡｃ_３共役体を含む第ＶＩＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0939】

以下の表９７に列記されるオリゴヌクレオチドを、無限用量増加試験（ｎｏｎ−ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ，ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）においてサルにおける第ＶＩＩ因子のアンチセンス阻害について試験した。

処理

【0940】

処置した（ｎｏｎ−ｎａiｖｅ）サルの各々に、増加用量の表９７に列記されるオリゴ
ヌクレオチドまたはＰＢＳを、０、１５、および２９日目に皮下注入した。各処理群は、４匹の雄および１匹の雌から成った。第１の投与の前とその後の様々な時点で、血液採取を実行して、血漿第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを決定した。ＥＬＩＳＡによって第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを測定した。表９８に提示される結果は、第１の投与の直前に測定したベースライン（ＢＬ）でのＰＢＳ群の平均値と比較した各処理群の平均値である。表９８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で第ＶＩＩ因子の発現レベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、サルにおいてＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【表86】

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【0941】

表９７の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示した。

【表87】

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実施例９２：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡｐｏ−ＣＩＩＩを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる初代肝細胞におけるアンチセンス阻害

【0942】

初代マウス肝細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、マウスＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表９９に列記されるオリゴヌクレオチドを、０．４６、１．３７、４．１２、または１２．３５、３７．０４、１１１．１１、もしくは３３３．３３ｎＭまたは１．００μｍで添加した。オリゴヌクレオチドとともに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを精製した
。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、ＩＣ_５０値を決定した。結果は、切断可能な部分がホスホジエステル結合デオキシアデノシンかホスホジエステル結合デオキシアデノシンかにかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。

【表88】

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【0943】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示した。
実施例９３：混合ウィングおよび５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0944】

表１００に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【表89】

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【0945】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。

処理

【0946】

６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表１００に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに規準化した。結果を、生理食塩水対照群と比較した各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示する。表１０１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含み、かつ完全ｃＥｔまたは混合糖修飾のいずれかのウィングを有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、かつ完全ｃＥｔ修飾ウィングを含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【0947】

体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、およびＢＵＮも測定し、各処理群の平均値を表１０１に示す。体重を、オリゴヌクレオチド投与の直前に測定したベースライン体重（％ＢＬ）と比較した平均体重率として示す。

【表90】

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実施例９４：２’−糖修飾および５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0948】

表１０２に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【表91】

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【0949】

下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示す。完全な表の説明文については、実施例７４を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

処理

【0950】

実施例９３に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果を以下の表１０３に示し、ＧａｌＮＡｃ共役体を含む２’−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドと２’−ＯＭｅ修飾オリゴヌクレオチドとが両方ともに、共役体を欠くそれぞれの親オリゴヌクレオチドよ
りも著しく強力であったことを示す。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、およびＢＵＮの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性であったことを示した。

【表92】

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実施例９５：二環式ヌクレオシドおよび５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0951】

表１０４に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【表93】

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【0952】

下付き文字「ｇ」は、フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを示し、下付き文字「ｌ」は、２’−Ｏ−ＣＨ_２−４’橋を含むロックドヌクレオシドを示す。他の省略形については、実施例７４の表の説明文を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

処理

【0953】

実施例９３に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果を以下の表１０５に示し、ＧａｌＮＡｃ共役体および様々な二環式ヌクレオシド修飾を含むオリゴヌクレオチ
ドが、共役体を欠くが二環式ヌクレオシド修飾を含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体およびフルオロ−ＨＮＡ修飾を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠くがフルオロ−ＨＮＡ修飾を含む親よりも著しく強力であった。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、およびＢＵＮの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性であったことを示した。

【表94】

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実施例９６：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿タンパク質結合

【0954】

ＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表７０に列記されるオリゴヌクレオチドおよびＡｐｏ（ａ）を標的とする表１０６におけるオリゴヌクレオチドを限外濾過アッセイにおいて試験して、血漿タンパク質結合を評価した。

【表95】

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【0955】

表の説明文については、実施例７４を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

【0956】

Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ限外濾過ユニット（３０，０００ＮＭＷＬ、低結合再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を３００μＬの０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０で事前に条件付け、２０００ｇで１０分間遠心分離し、その後、Ｈ_２Ｏ中３００μＬの３００μｇ／ｍＬ対照オリゴヌクレオチド溶液で事前に条件付け、２０００ｇで１６分間遠心分離した。これらの試験で用いる表７０および１０６の各試験オリゴヌクレオチドのフィルターへの非特異的結合を評価するために、Ｈ_２Ｏ中３００μＬの２５０ｎｇ／ｍＬオリゴヌクレオチド溶液（ｐＨ７．４）を事前に条件付けたフィルターに設置し、２０００ｇで１６分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡアッセイによって濾過していない試料および濾過した試料を分析して、オリゴヌクレオチド濃度を決定した。３つの複製物を用いて各試料の平均濃度を得た。濾過していない試料と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿の不在下でフィルターによって回収されたオリゴヌクレオチドの割合（％回収）を決定する。

【0957】

薬物を使用していない健常なヒト志願者、カニクイザル、およびＣＤ−１マウス由来のＫ３−ＥＤＴＡ中に収集された凍結全血漿試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入した。試験オリゴヌクレオチドを、２つの濃度（５μｇ／ｍＬおよび１５０μｇ／ｍＬ）で血漿の１．２ｍＬの一定分量に添加した。各スパイクした血漿試料の一定分量（３００μＬ）を事前に条件付けられたフィルターユニット内に設置し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした直後に２０００ｇで１６分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡによって、濾過してスパイクした血漿試料および濾過していないスパイクした血漿試料の一定分量を分析して、各試料中のオリゴヌクレオチドの濃度を決定した。１つの濃度毎に３つの複製物を用いて、各試料中の結合オリゴヌクレオチドおよび非結合オリゴヌクレオチドの平均割合を決定した。濾過していない試料の濃度と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿タンパク質に結合されていない血漿中のオリゴヌクレオチドの割合（％非結合）を決定する。各オリゴヌクレオチドの％非結合を％回収で割ることによって、最終非結合オリゴヌクレオチド値を非特異的結合に対して補正する。最終％非結合値を１００から差し引くことによって、最終％結合オリゴヌクレオチド値を決定する。各種の血漿において試験した２つの濃度のオリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍＬおよび１５０μｇ／ｍＬ）の結果を表１０７に示す。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基が血漿タンパク質結合に大きな影響を与えないことを示す。さらに、完全ＰＳヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドも混合ＰＯ／ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドも血漿タンパク質に結合し、完全ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドは、混合ＰＯ／ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドよりも若干高い程度に血漿タンパク質に結合する。

【表96】

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実施例９７：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むＴＴＲを標的とする修飾オリゴヌクレオチド

【0958】

ＧａｌＮＡｃ共役体を含む表１０８に示されるオリゴヌクレオチドを、ＴＴＲを標的とするように設計した。

【表97】

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【0959】

表１０８の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１の構造は、実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａの構造は、実施例７０に示した。
実施例９８：ｈＰＭＢＣアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの炎症誘発作用の評価

【0960】

表１０９に列記されるオリゴヌクレオチドを、実施例２３および２４に記載されるようにｈＰＭＢＣアッセイにおいて炎症誘発作用について試験した（オリゴヌクレオチドの説明については、表３０、８３、９５、および１０８を参照のこと）。ＩＳＩＳ ３５３５１２は、正の対照として用いられる高応答物であり、他のオリゴヌクレオチドは、表８３、９５、および１０８に記載されるものである。１人の志願ドナー由来の血液を用いて表１０９に示される結果を得た。結果は、混合ＰＯ／ＰＳヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが、完全ＰＳ結合を有する同一のオリゴヌクレオチドと比較して、著しく低い炎症誘発応答をもたらしたことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基は、このアッセイにおいて大きく影響しなかった。

【表98】

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実施例９９：アシアロ糖タンパク質受容体に対するＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性

【0961】

アシアロ糖タンパク質受容体に対する表１１０に列記されるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの説明については、表７６を参照のこと）の結合親和性を、競合的受容体結合アッセイにおいて試験した。競合相手のリガンドであるα１−酸糖タンパク質（ＡＧＰ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中で１Ｕノイラミニダーゼ−アガロースとともに３７℃で１６時間インキュベートし、シアル酸アッセイまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のいずれかで９０％を超える脱シアル化を確認した。Ａｔｓｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎ；３２（１）：１７３−８１を参照のこと）の手順に従って、一塩化ヨウ素を用いてＡＧＰをヨウ素化した。この方法において、脱シアル化α１−酸糖タンパク質（ｄｅ−ＡＧＰ）を、１０ｍＭ塩化ヨウ素、Ｎａ^１２５Ｉ、および０．２５Ｍ ＮａＯＨ中の１Ｍグリシンに添加した。室温で１０分間インキュベートした後、３ ＫＤＭＷＣＯスピンカラムを利用してこの混合物を２回濃縮することによって、^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰを遊離^１２５Ｉから分離した。このタンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＥＣ−３カラム（７．８×３００ｍｍ）およびβ−ＲＡＭカウンタを装備したＨＰＬＣシステムにおいて標識効率および純度について試験した。^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰおよびＡＳＯを含有する様々なＧａｌＮＡｃクラスターを利用した競合実験を以下の通りに実行した。ヒトＨｅｐＧ２細胞（１０^６細胞／ｍＬ）を、２ｍＬの適切な成長培地中の６ウェルプレートにプレーティングした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＭＥＭ培地を用いた。細胞を、それぞれ、５％および１０％ＣＯ_２で、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。実験前に細胞をＦＢＳを有しない培地で洗浄した。細胞を、２％ＦＢＳを有する適切な成長培地を含有する１ｍＬの競合混合物、１０^−８Ｍ ^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ、および１０^−１１〜１０^−５Ｍの範囲の濃度のＡＳＯを含有するＧａｌＮＡｃクラスターとともに、３７℃で３０分間インキュベートした。１０^−２Ｍ ＧａｌＮＡｃ糖の存在下で非特異的結合を決定した。細胞をＦＢＳを有しない培地で２回洗浄して、非結合^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰおよび競合相手であるＧａｌＮＡｃ ＡＳＯを除去した。１％β−メルカプトエタノールを含有するＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液を用いて、細胞を溶解した。１０分間の短時間凍結／解凍サイクル後に溶解物を丸底アッセイチューブに移し、γ−カウンタでアッセイした。非特異的結合を差し引いた後に、^１２５Ｉタンパク質カウントを最も低いＧａｌＮＡｃ−ＡＳＯ濃度カウントの値で割った。非線形回帰アルゴリズムを用いた単一部位競合結合等式に従って阻害曲線を当てはめて、結合親和性（Ｋ_Ｄ）を計算した。

【0962】

表１１０における結果を５つの異なる日に実行した実験から得た。上付き文字「ａ」の付いたオリゴヌクレオチドの結果は、２つの異なる日に実行した実験の平均である。結果は、５’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがヒトＨｅｐＧ２細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合し、３’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドよりも１．５〜１６倍高い親和性を有することを示す。

【表99】

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実施例１００：生体内におけるＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0963】

以下の表１１１ａに列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【表100】

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【0964】

ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。

処理

【0965】

ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雌トランスジェニックマウスの各々に、表１１１ｂに列記されるオリゴヌクレオチドおよび投与量またはＰＢＳを、週１回、合計６回の投与で、皮下注入した。各処理群は、３匹の動物から成った。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のＡｐｏ（ａ）タンパク質のベースラインレベル、ならびに第１の投与後７２時間、１週間、および２週間時点のレベルを決定した。第１の投与後３週間、４週間、５週間、および６週間時点でさらに血液を採取する。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。表１１１ｂにおける結果を、ベースラインレベル（％ＢＬ）に規準化された各処理群の血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示し、結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）発現の強力な減少を示したことを示す。この強力な影響は、完全ＰＳヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドおよび混合ＰＯおよびＰＳ結合を含むオリゴヌクレオチドにおいて観察された。

【表101】

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実施例１０１：安定した部分を介して連結されたＧａｌＮＡｃクラスターを含むオリゴヌクレオチドによるアンチセンス阻害

【0966】

表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドを生体内におけるマウスＡＰＯＣ−ＩＩＩ発現の阻害について試験した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの各々に、表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。ＩＳＩＳ ４４０６７０で処理した各マウスは、２、６、２０、または６０ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。ＩＳＩＳ ６８０７７２または６９６８４７で処理した各マウスは、０．
６、２、６、または２０ｍｇ／ｋｇを受けた。ＩＳＩＳ ６９６８４７のＧａｌＮＡｃ共役基は、安定した部分（容易に切断可能なホスホジエステル含有結合の代わりにホスホロチオエート結合）を介して連結されている。投与の７２時間後に動物を屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに規準化した。結果を、生理食塩水対照群と比較した各処理群のＡＰＯＣ−ＩＩＩ
ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして表１１２に提示する。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドが、共役基を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、切断可能な部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６８０７７２）は、安定した部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６９６８４７）よりもさらに強力であった。

【表102】

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【0967】

ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。
実施例１０２：ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓における分布

【0968】

ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないＩＳＩＳ ３５３３８２（表３６を参照のこと）およびＧａｌＮＡｃ共役体を含むＩＳＩＳ ６５５８６１（表３６を参照のこと）の肝臓における分布を評価した。雄ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＩＳＩＳ ３５３３８２または６５５８６１を、表１１３に列記される投与量で１回、皮下注入した。２匹の動物から成った１８ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ６５５８６１群を除いて、各処理群は、３匹の動物から成った。投与の４８時間後に動物を屠殺して、オリゴヌクレオチドの肝臓における分布を決定した。１細胞当たりのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の数を測定するために、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン標識（ＭＳＤ ＴＡＧ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを検出するために用いるオリゴヌクレオチドプローブに共役させた。表１１３に提示される結果は、１細胞当たり何百万ものオリゴヌクレオチド分子単位の各処理群のオリゴヌクレオチドの平均濃度である。結果は、等価用量で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、全肝臓および肝細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも高い濃度で存在したことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、非実質肝臓細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも低い濃度で存在した。１細胞当たりの肝細胞および非実質肝臓細胞におけるＩＳＩＳ ６５５８６１の濃度が同様であった一方で、肝臓は、約８０体積％肝細胞であった。したがって、肝臓内に存在するＩＳＩＳ ６５５８６１オリゴヌクレオチドの大部分が肝細胞内に見られる一方で、肝臓内
に存在するＩＳＩＳ ３５３３８２オリゴヌクレオチドの大部分は、非実質肝臓細胞内に見られた。

【表103】

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実施例１０３：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間

【0969】

以下の表１１４に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【表104】

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【0970】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示した。

処理

【0971】

ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する雌トランスジェニックマウスの各々に、表１１４に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、３匹の動物から成った。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１４、２１、２８、３５、および４２日間のレベルを決定した。実施例２０に記載されるように、血漿トリグリセリドおよびＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを測定した。表１１５における結果を、ベースラインレベルに規準化された各処理群の血漿トリグリセリドおよびＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして提示する。実施例７９の表７１における結果と以下の表１１５における結果の比較は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合の両方を含むオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む等価オリゴヌクレオチドよりも増加した作用持続時間を示したことを示す。

【表105】

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実施例１０４：５’−ＧａｌＮＡｃ_２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化328】

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【0972】

化合物１２０は市販されており、化合物１２６の合成は実施例４９に記載されている。化合物１２０（１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３９ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（１．６４ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７５ｍＬ、１０．１ｍｍｏｌ）を添加した。約５分後、アミノヘキサン酸ベンジルエステル（１．３６ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）をこの反応物に添加した。３時間後、反応混合物を１００ｍＬの１Ｍ ＮａＨＳＯ４に注ぎ、２×５０ｍＬ酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、３×４０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ_３および２倍ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：１：１）によって精製して、化合物２３１を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３１（１．３４ｇ、２．４３８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエン（３×１０ｍＬ）と共蒸発させた。残渣を減圧下で乾燥させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物２３２を得た。化合物１６６の合成は、実施例５４に記載される。化合物１６６（３．３９ｇ、５．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。化合物２３２（１．３ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）の溶液をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｍＬ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、その後、水（８０ｍＬ）に注ぎ、水層をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×８０ｍＬ）、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×８０ｍＬ）、およびブライン（２×８０ｍＬ）で洗浄し、その後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２３３を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３３（０．５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）および酢酸エチル（２．２ｍＬ）中に溶解した。炭素上パラジウム（１０重量％Ｐｄ／Ｃ、湿性、０．０７ｇ）を添加し、反応混合物を水素雰囲気下で３時間撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、濃縮して、カルボン酸を得た。カルボン酸（１．３２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、クラスター遊離酸）をＤＭＦ（３．２ｍＬ）中に溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）およびＰＦＰＴＦＡ（０．３０ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を水（４０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。上述のように標準の後処理を完了して、化合物２３４を得た。ＬＣＭＳおよびＮＭＲは、その構造と一致した。実施例４６に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド２３５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−２４のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−２４_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_２−２４（ＧａｌＮＡｃ_２−２４_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化329】

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実施例１０５：ＧａｌＮＡｃ_１−２５共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化330】

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【0973】

化合物１６６の合成は、実施例５４に記載される。実施例４６に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド２３６を調製した。

【0974】

あるいは、以下に示されるスキームを用いてオリゴヌクレオチド２３６を合成し、実施例１０に記載される手順を用いて、化合物２３８を用いてオリゴヌクレオチド２３６を形成した。

【化331】

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【0975】

共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２５のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２５_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２５（ＧａｌＮＡｃ_１−２５_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化332】

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実施例１０６：５’−ＧａｌＮＡｃ_２または５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0976】

表１１６および１１７に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。
処理

【0977】

６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、２、７、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４４０７６２；または０．２、０．６、２、６、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８６２２１、６８６２２２、もしくは７０８５６１；または生理食塩水を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに規準化した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＥＤ_５０結果を、表１１６および１１７に提示する。以前の研究において、三価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドが二価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、これは、次いで、一価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことが示されたが（例えば、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１６，５２１６−５２３１（２００８）を参照のこと）、表１１６および１１７に示されるように、一価、二価、および三価ＧａｌＮＡｃクラスターを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、同様の強度でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【表106】

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【0978】

表の説明文については、実施例９３を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、実施例６２に示し、ＧａｌＮＡｃ_２−２４ａの構造は、実施例１０４に示した。

【表107】

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【0979】

表の説明文については、実施例９３を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_１−２５ａの構造は、実施例１０５に示した。

【0980】

実施例７５に記載される手順を用いて、表１１６および１１７における肝臓中のオリゴヌクレオチドの濃度も評価した。以下の表１１７ａおよび１１７ｂに示される結果は、肝臓組織のオリゴヌクレオチド（μｇ）／ｇ単位のＵＶによって測定された各処理群の平均総アンチセンスオリゴヌクレオチド組織レベルである。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ共役基を欠く同一の用量のオリゴヌクレオチドよりも著しく高いレベルで肝臓に蓄積したことを示す。さらに、それらのそれぞれの共役基に
１、２、または３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて同様のレベルで肝臓に蓄積した。上記のＫｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．の文献参照を考慮すると、これは意外な結果であり、上の表１１６および１１７に示される活性データと一致する。

【表108】

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【表109】

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実施例１０７：ＧａｌＮＡｃ_１−２６またはＧａｌＮＡｃ_１−２７共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化333】

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【0981】

ＤＭＦ中ＨＢＴＵおよびＤＩＥＡを用いて、オリゴヌクレオチド２３９を化合物４７（実施例１５を参照のこと）と酸６４（実施例３２を参照のこと）とのカップリングによって合成する。結果として生じたアミド含有化合物をホスフィチル化し、その後、実施例１０に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２６のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２６_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２６（ＧａｌＮＡｃ_１−２６_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化334】

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【0982】

ＧａｌＮＡｃ_１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するために、実施例７に記載される手順を用いて、化合物４７と６４の反応から形成されたアミドを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチド合成を完了して、オリゴヌクレオチド２４０を形成する。

【化335】

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【0983】

共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２７のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２７_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２７（ＧａｌＮＡｃ_１−２７_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化336】

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実施例１０８：生体内におけるＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害

【0984】

以下の表１１８に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける単回投与試験において試験した。

【表110】

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【0985】

ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。

処理

【0986】

ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雄トランスジェニックマウスの各々に、表１１９に列記されるオリゴヌクレオチドおよび投与量またはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物から成った。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のＡｐｏ（ａ）タンパク質のベースラインレベルおよび第１の投与後の１週間時点のレベルを決定した。週１回約８週間、さらに血液を採取する。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。表１１９における結果を、ベースラインレベル（％ＢＬ）に規準化された各処理群の血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示し、結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）タンパク質の発現を低下させたことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を含まないオリゴヌクレオチドよりもさらに強力なＡｐｏ（ａ）発現の減少を示した。

【表111】

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実施例１０９：ＧａｌＮＡｃ_１−２８またはＧａｌＮＡｃ_１−２９共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化337】

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【0987】

オリゴヌクレオチド２４１を実施例７１に記載される手順と同様の手順を用いて合成して、ホスホラミダイト中間体を形成し、続いて、実施例１０に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２８のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２８_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２８（ＧａｌＮＡｃ_１−２８_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化338】

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【0988】

ＧａｌＮＡｃ_１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するために、実施例７１に記載される手順と同様の手順を用いてヒドロキシル中間体を形成し、その後、実施例７に記載される手順を用いてこれを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチド合成を完了させて、オリゴヌクレオチド２４２を形成する。

【化339】

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【0989】

共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２９のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２９_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２９（ＧａｌＮＡｃ_１−２９_ａ−ＣＭ）の構造を以下に示す。

【化340】

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実施例１１０：ＧａｌＮＡｃ_１−３０共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化341】

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【0990】

ＧａｌＮＡｃ_１−３０共役基を含むオリゴヌクレオチド２４６（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−３０のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−３０_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｙは、切断可能な部分の一部である。ある特定の実施形態において、Ｙは、安定した部分の一部であり、切断可能な部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_１−３０_ａの構造を以下に示す。

【化342】

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実施例１１１：ＧａｌＮＡｃ_２−３１またはＧａｌＮＡｃ_２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【化343】

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【0991】

ＧａｌＮＡｃ_２−３１共役基を含むオリゴヌクレオチド２５０（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−３１のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−３１_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、切断可能な部分の一部である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能な部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_２−３１_ａの構造を以下に示す。

【化344】

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【0992】

ＧａｌＮＡｃ_２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成を以下に示す。

【化345】

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【0993】

ＧａｌＮＡｃ_２−３２共役基を含むオリゴヌクレオチド２５２（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−３２のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−３２_ａ）を任意の切断可能な部分と組み合わせて、様々な共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、切断可能な部分の一部である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能な部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_２−３２_ａの構造を以下に示す。

【化346】

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実施例１１２：ＧａｌＮＡｃ_１共役体を含む修飾オリゴヌクレオチド

【0994】

ＳＲＢ−１を標的とする表１２０のオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ_１共役基で合成して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含有する共役基を含むオリゴヌクレオチドの強度をさらに試験した。

【表112】

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実施例１１３：ヒト初代肝細胞におけるヒトアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））の時間依存的アンチセンス阻害

【0995】

以前の出版物（その内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００５／０００２０１号）から選択されたギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒト初代肝細胞における単回投与アッセイにおいて試験した。細胞をＴｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から得て、１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）３’（本明細書において配列番号５と指定される、順方向配列ＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧ；本明細書において配列番号６と指定される、逆方向配列ＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＣ；本明細書において配列番号７と指定される、プローブ配列ＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴ）を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。さらに、ヒトａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢ（本明細書において配列番号８と指定される、順方向配列ＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＴ；本明細書において配列番号９と指定される、逆方向配列ＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴ；本明細書において配列番号１０と指定される、プローブ配列ＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧ）を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現に規準化した。結果を、未処理の対照細胞に対するａｐｏ（ａ）の阻害パーセントとして以下の表に提示する。

【表113】

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【0996】

いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用量応答アッセイにおけるさらなる試験のために選択した。

【0997】

選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒト初代肝細胞において、以下の表に指定されるように、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、または３００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで試験した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）３’を用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現に規準化した。結果を、未処理の対照細胞に対するａｐｏ（ａ）の阻害パーセントとして提示する。

【表114】

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【0998】

ＩＳＩＳ １４４３６７は、他のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも良好な有効性および用量依存性を示した。したがって、ＩＳＩＳ １４４３６７を、本明細書に開示される新たに設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの強度を比較するための基準アンチセンスオリゴヌクレオチドと見なした。
実施例１１４：トランスジェニックマウス初代肝細胞におけるヒトａｐｏ（ａ）のアンチセンス阻害

【0999】

ａｐｏ（ａ）核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを新たに設計し、生体外におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡへのそれらの影響について試験した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、同様の培養条件を有した一連の平行実験において強度について試験した。ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウス由来の初代肝細胞（Ｆｒａｚｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５．９：４２４−４３１）をこの研究で用いた。３５，０００細胞／ウェルの密度の肝細胞を、電気穿孔法を用いて１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトプライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。各実験の結果を以下の別々の表に提示する。ＩＳＩＳ １４４３６７を新たなアンチセンスオリゴヌクレオチドの基準として使用し、この研究にも含めた。結果を、未処理の対照細胞に対するａｐｏ（ａ）の阻害パーセントとして提示する。合計１，５１１個のギャップマーをこれらの培養条件下で試験した。さらなる試験のために選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを以下の表に提示し、各表は、別々の実験を表す。

【1000】

新たに設計されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは、２０ヌクレオシド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオシドからなり、各々５個のヌクレオシドを含む５’方向および３’方向のウィングセグメントに隣接する。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシドおよび３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体にわたるヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体にわたるすべてのシトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【1001】

ａｐｏ（ａ）標的配列は、複数のクリングル反復配列を含有し、それ故に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがクリングル配列を標的とするか否かに応じて、ａｐｏ（ａ）の１個以上の領域を標的とし得る。「開始部位」とは、ギャップマーがヒト配列において標的とする最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」とは、ギャップマーがヒト配列において標的とする最も３’側のヌクレオシドを指す。ａｐｏ（ａ
）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それがクリングル反復を標的とするか否かに応じて、２つ以上の「開始部位」または「終止部位」を有し得る。

【1002】

表に列記される大半のギャップマーは、１００％の相補性で、本明細書において配列番号１と指定されるヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００５５７７．２）または本明細書において配列番号２と指定されるヒトａｐｏ（ａ）ゲノム配列（ヌクレオチド３２３００００〜３３８００００から切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿００７４２２．１２）のいずれか、またはこれら両方の１個以上の領域を標的にする。「該当なし」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１００％の相補性でその特定の配列を標的としないことを示す。

【表115】

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【表116-1】

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【表116-2】

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【表116-3】

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【表117】

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【表118】

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【表119】

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【表120】

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【表121】

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【表122】

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【表123】

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【表124】

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【表125】

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実施例１１５：トランスジェニックマウス初代肝細胞におけるａｐｏ（ａ）の時間依存的アンチセンス阻害

【1003】

生体外におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す上述の研究由来のギャップマーを選択し、同様の培養条件を有する一連の平行実験において、様々な用量でトランスジ
ェニックマウス初代肝細胞において試験した。細胞を３５，０００／ウェルの密度でプレーティングし、電気穿孔法を用いて、０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５００μＭ、または１．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。Ａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。結果を、未処理の対照細胞に対する阻害パーセントとして提示する。

【1004】

これらの研究の各々の結果を以下に提示される表に示し、各表は、別々の実験を表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ_５０）もこれらの表に提示する。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞において、時間依存的様式で著しく低下した。新たに設計されたオリゴヌクレオチドの強度を、基準オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４４３６７と比較した。

【表126】

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【表127】

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【表128】

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【表129】

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【表130】

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【表131】

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【表132】

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【表133】

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【表134】

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【1005】

上の表に提示されるように、ＩＳＩＳ ４９４１５７（配列番号１２）、ＩＳＩＳ ４９４１５８（配列番号１３）、ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４１６０（配列番号１５）、ＩＳＩＳ ４９４１６１（配列番号１６）、ＩＳＩＳ ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ ４９４１６４（配列番号１９）、ＩＳＩＳ ４９４１６５（配列番号２０）、ＩＳＩＳ ４９４１６７（配列番号２２）、ＩＳＩＳ ４９４１６８（配列番号２３）、ＩＳＩＳ ４９４１６９（配列番号２４）、ＩＳＩＳ ４９４１７０（配列番号２５）、ＩＳＩＳ ４９４２３０（配列番号１０５）、ＩＳＩＳ ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ
４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ ４９４２８７（配列番号３０）、ＩＳＩＳ ４９４２８８（配列番号３１）、ＩＳＩＳ ４９４２９０（配列番号３２）、ＩＳＩＳ ４９４２９１（配列番号３３）、ＩＳＩＳ ４９４２９２（配列番号３５）、ＩＳＩＳ ４９４２９４（配列番号３６）、ＩＳＩＳ ４９４２９９（配列番号３７）、ＩＳＩＳ ４９４３００（配列番号３８）、ＩＳＩＳ ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ ４９４３０２（配列番号４０）、ＩＳＩＳ ４９４３０３（配列番号４１）、ＩＳＩＳ ４９４３０４（配列番号４２）、ＩＳＩＳ ４９４３０５（配列番号４３）、ＩＳＩＳ ４９４３０６（配列番号４４）、ＩＳＩＳ ４９４３１１（配列番号４７）、ＩＳＩＳ ４９４３３４（配列番号４８）、ＩＳＩＳ ４９４３３６（配列番号４９）、ＩＳＩＳ ４９４３３７（配列番号５０）、ＩＳＩＳ ４９４３３８（配列番号１３３）、ＩＳＩＳ ４９４３７１（配列番号５７）、ＩＳＩＳ ４９４３７２（配列番号５８）、ＩＳＩＳ ４９４３７３（配列番号５９）、ＩＳＩＳ ４９４３７４（配列番号６０）、ＩＳＩＳ ４９４３７５（配列番号６１）、ＩＳＩＳ ４９４３８６（配列番号６２）、ＩＳＩＳ ４９４３８９（配列番号６５）、ＩＳＩＳ ４９４３９０（配列番号６６）、ＩＳＩＳ ４９４３９２（配列番号６８）、ＩＳＩＳ ４９４４６６（配列番号１０８）、ＩＳＩＳ ４９４４７０（配列番号１０９）、ＩＳＩＳ ４９４４７２（配列番号１１０）、ＩＳＩＳ ４９４５２１（配列番号５１）、ＩＳＩＳ ４９４５３０（配列番号５３）、ＩＳＩＳ ４９８２２９（配列番号７５）、ＩＳＩＳ ４９８２３８（配列番号７６）、ＩＳＩＳ ４９８２３９（配列番号７７）、ＩＳＩＳ ４９８２４０（配列番号７８）、ＩＳＩＳ ４９８２４１（配列番号７９）、ＩＳＩＳ ４９８２４３（配列番号８１）
、ＩＳＩＳ ４９８３７９（配列番号７０）、ＩＳＩＳ ４９８４０８（配列番号７１）、ＩＳＩＳ ４９８４３３（配列番号７２）、ＩＳＩＳ ４９８４３４（配列番号７３）、ＩＳＩＳ ４９８４３５（配列番号７４）、ＩＳＩＳ ４９８５１７（配列番号８５）、ＩＳＩＳ ４９８５２３（配列番号９２）、ＩＳＩＳ ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ ４９８５２５（配列番号９４）、ＩＳＩＳ ４９８５５０（配列番号９７）、ＩＳＩＳ ４９８５８０（配列番号１０３）、ＩＳＩＳ ４９８５８１（配列番号１０４）、ＩＳＩＳ ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）、ＩＳＩＳ ４９８８３３（配列番号８６）、ＩＳＩＳ ４９８８７５（配列番号８９）、およびＩＳＩＳ ４９９０２０（配列番号９０）は、ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも強力であった。
実施例１１６：トランスジェニックマウス初代肝細胞におけるａｐｏ（ａ）の時間依存的アンチセンス阻害

【1006】

上述の研究由来の強力なギャップマーをさらに選択し、同様の培養条件を有する一連の研究において、様々な用量でトランスジェニックマウス初代肝細胞において試験した。細胞を３５，０００／ウェルの密度でプレーティングし、電気穿孔法を用いて、以下の表に指定されるように、０．０４９μＭ、０．１４８μＭ、０．４４４μＭ、１．３３３μＭ、または４．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。Ａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。結果を、未処理の対照細胞に対する阻害パーセントとして提示する。

【1007】

これらの研究の各々の結果を以下に提示される表に示し、各表は、別々の実験を表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ_５０）もこれらの表に提示する。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞において、時間依存的様式で著しく低下した。新たに設計されたオリゴヌクレオチドの強度を、基準オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４４３６７と比較した。以下の表に提示されるように、ＩＳＩＳ ４９４１５７（配列番号１２）、ＩＳＩＳ ４９４１５８（配列番号１３）、ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４１６０（配列番号１５）、ＩＳＩＳ ４９４１６１（配列番号１６）、ＩＳＩＳ ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ ４９４１６４（配列番号１９）、ＩＳＩＳ ４９４２３０（配列番号１０５）、ＩＳＩＳ ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ ４９４２８７（配列番号３０）、ＩＳＩＳ ４９４２９０（配列番号３２）、ＩＳＩＳ ４９４２９２（配列番号３５）、ＩＳＩＳ ４９４３００（配列番号３８）、ＩＳＩＳ ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ ４９４３０２（配列番号４０）、ＩＳＩＳ ４９４３０３（配列番号４１）、ＩＳＩＳ ４９４３０４（配列番号４２）、ＩＳＩＳ ４９４３０５（配列番号４３）、ＩＳＩＳ ４９４３０６（配列番号４４）、ＩＳＩＳ ４９４３１０（配列番号４６）、ＩＳＩＳ ４９４３１１（配列番号４７）、ＩＳＩＳ ４９４３３７（配列番号５０）、ＩＳＩＳ ４９４３７１（配列番号５７）、ＩＳＩＳ ４９４３７２（配列番号５８）、ＩＳＩＳ ４９４３７５（配列番号６１）、ＩＳＩＳ ４９４３８８（配列番号６４）、ＩＳＩＳ ４９４３８９（配列番号６５）、ＩＳＩＳ ４９４３９０（配列番号６６）、ＩＳＩＳ ４９４３９２（配列番号６８）、ＩＳＩＳ ４９４４６６（配列番号１０８）、ＩＳＩＳ ４９４４７０（配列番号１０９）、ＩＳＩＳ ４９４４７２（配列番号１１０）、ＩＳＩＳ ４９８２３８（配列番号７６）、ＩＳＩＳ ４９８２３９（配列番号７７）、ＩＳＩＳ ４９８４３３（配列番号７２）、ＩＳＩＳ ４９８４３４（配列番号
７３）、ＩＳＩＳ ４９８４３５（配列番号７４）、ＩＳＩＳ ４９８５２３（配列番号９２）、ＩＳＩＳ ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ ４９８５２５（配列番号９４）、ＩＳＩＳ ４９８５８０（配列番号１０３）、およびＩＳＩＳ ４９８５８１（配列番号１０４）は、ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも強力であった。

【表135】

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【表136】

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【表137】

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【表138】

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【表139】

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実施例１１７：トランスジェニックマウス初代肝細胞におけるヒトａｐｏ（ａ）のアンチセンス阻害

【1008】

ａｐｏ（ａ）核酸を標的とするさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを新たに設計し、生体外におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡへのそれらの影響について試験した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、同様の培養条件を有した一連の実験において試験した。ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウス由来の初代肝細胞をこの研究に用いた。３５，０００細胞／ウェルの密度の肝細胞を、電気穿孔法を用いて１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトプライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。各実験の結果を以下の別々の表に提示する。ＩＳＩＳ １４４３６７も比較のためにこの研究に含めた。結果を、未処理の対照細胞に対するａｐｏ（ａ）の阻害パーセントとして提示する。合計２３１個のアンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらの培養条件下で試験した。さらなる研究のために選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを以下に提示する。

【1009】

新たに設計されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを３−１０−４ ＭＯＥギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは、１７ヌクレオシド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオシドからなり、それぞれ、３個のヌクレオシドおよび４個のヌクレオシドを含む５’方向および３’方向のウィングセグメントに隣接する。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシドおよび３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体にわたるヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体にわたるすべてのシトシン残基は、５−メチルシトシンである。

【1010】

ａｐｏ（ａ）標的配列は、複数のクリングル反復配列を含有し、それ故に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがクリングル配列を標的とするか否かに応じて、ａｐｏ（ａ）の１個以上の領域を標的とし得る。「開始部位」とは、ギャップマーがヒト配列において標的とする最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」とは、ギ
ャップマーがヒト配列において標的とする最も３’側のヌクレオシドを指す。ａｐｏ（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それがクリングル反復を標的とするか否かに応じて、２つ以上の「開始部位」または「終止部位」を有し得る。

【1011】

表に列記される大半のギャップマーは、１００％相補性で、本明細書において配列番号１と指定されるヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００５５７７．２）または本明細書において配列番号２と指定されるヒトａｐｏ（ａ）ゲノム配列（ヌクレオチド３２３００００〜３３８００００から切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＴ＿００７４２２．１２）のいずれか、またはこれら両方の複数の領域を標的にする。「該当なし」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１００％の相補性でその特定の配列を標的としないことを示す。

【表140-1】

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【表140-2】

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【表141】

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【表142】

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実施例１１８：トランスジェニックマウス初代肝細胞におけるａｐｏ（ａ）の時間依存的アンチセンス阻害

【1012】

上述の研究由来の強力なギャップマーをさらに選択し、同様の培養条件を有する一連の
研究において、様々な用量でトランスジェニックマウス初代肝細胞において試験した。細胞を３５，０００／ウェルの密度でプレーティングし、電気穿孔法を用いて、以下の表に指定されるように、０．１５６μＭ、０．３１３μＭ、０．６２５μＭ、１．２５０μＭ、２．５００μＭ、または５．０００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。Ａｐｏ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。結果を、未処理の対照細胞に対する阻害パーセントとして提示する。

【1013】

これらの研究の各々の結果を以下に提示される表に示し、各研究を別々の表に表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ_５０）もこれらの表に提示する。

【表143】

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【表144】

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【表145】

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【表146】

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【1014】

Ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞において、時間依存的様式で著しく低下した。新たに設計されたオリゴヌクレオチドの強度を、基準オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４４３６７と比較した。上の表に提示されるように、ＩＳＩＳ ５１０５４２（配列番号１１１）、ＩＳＩＳ ５１０５４５（配列番号１１４）、ＩＳＩＳ ５１０５４６（配列番号１１５）、ＩＳＩＳ ５１０５４７（配列番号１１６）、ＩＳＩＳ ５１０５４８（配列番号１１７）、ＩＳＩＳ ５１０５４９（配列番号１１８）、ＩＳＩＳ ５１０５９５（配列番号１１９）、ＩＳＩＳ ５１０５９７（配列番号１２０）、ＩＳＩＳ ５１０５９８（配列番号１２１）、ＩＳＩＳ ５１０７０１（配列番号１２７）、ＩＳＩＳ ５１０７０２（配列番号１２８）、ＩＳＩＳ ５１０７０４（配列番号１２９）、ＩＳＩＳ ５１２９４４（配列番号１２３）、ＩＳＩＳ ５１２９４７（配列番号１２４）、ＩＳＩＳ ５１２９５８（配列番号１２５）、およびＩＳＩＳ ５１２９５９（配列番号１２６）は、ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも強力であった。
実施例１１９：ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスにおけるヒトａｐｏ（ａ）の生体内におけるアンチセンス阻害の影響

【1015】

ヒトａｐｏ（ａ）遺伝子を有するトランスジェニックマウス（Ｆｒａｚｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５．９：４２４−４３１）を以下に記載される研究において利用した。上述の生体外におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの統計的に有意な阻害を示したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを、このモデルにおいてさらに評価した。
研究１

【1016】

雌ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期で維持し、標準の実験食餌を不断給餌した。これらのマウスを、各４匹のマウスから成る処理群に分けた。これらの群に、ＩＳＩＳ ４９４１５９、ＩＳＩＳ ４９４１６０、ＩＳＩＳ ４９４１６１、ＩＳＩＳ ４９４１６２、ＩＳＩＳ ４９４１６３、ＩＳＩＳ ４９４２３０、ＩＳＩＳ ４９４２４３、ＩＳＩＳ ４９４２４４、ＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、ＩＳＩＳ ４９４３０４、ＩＳＩＳ ４９４４６６、ＩＳＩＳ ４９４４７０、ＩＳＩＳ ４９４４７２、ＩＳＩＳ ４９８２３９、ＩＳＩＳ ４９８４０８、ＩＳＩＳ ４９８５１７、ＩＳＩＳ ４９４１５８、ＩＳＩＳ ４９４３１１、ＩＳＩＳ ４９４３３７、ＩＳＩＳ ４９４３７２、ＩＳＩＳ ４９８２３８、ＩＳＩＳ ４９８５２３、ＩＳＩＳ ４９８５２５、ＩＳＩＳ ５１０５４８、ＩＳＩＳ ５１２９４４、ＩＳＩＳ ５１２９４７、またはＩＳＩＳ ５１２９５８を、２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間、腹腔内注入した。１つのマウス群に、ＰＢＳを週２回２週間、腹腔内注入した。このＰＢＳ群を対照群とした。最終投与の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析を行った。
ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害

【1017】

全ＲＮＡをこれらの処理群のうちのいくつかの肝臓から抽出し、ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。

【表147】

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【1018】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９４３０１（配列番号３９）、およびＩＳＩＳ ４９８４０８（配列番号７１）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも強力であった。

ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質の阻害

【1019】

Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、すべての処理群由来の血漿ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質を測定した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。

【表148】

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【1020】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４２４４（配列番号８２）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ ４９４３０１（配列番号３９）、およびＩＳＩＳ ４９４３０２（配列番号４０）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）と同程度の強度であるか、またはそれより強力であった。

研究２

【1021】

ＩＳＩＳ ４９４１５９、ＩＳＩＳ ４９４１６１、ＩＳＩＳ ４９４１６２、ＩＳＩＳ ４９４１６３、およびＩＳＩＳ ４９４２４３を、このトランスジェニックモデルに
おいてさらに評価した。ＩＳＩＳ １４４３６７を比較のために含めた。
処理

【1022】

雌ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスを、各４匹のマウスから成る処理群に分けた。これらの群に、ＩＳＩＳ １４４３６７、ＩＳＩＳ ４９４１５９、ＩＳＩＳ ４９４１６１、ＩＳＩＳ ４９４１６２、ＩＳＩＳ ４９４１６３、またはＩＳＩＳ ４９４２４３を、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間、腹腔内注入した。１つのマウス群に、ＰＢＳを週２回２週間、腹腔内注入した。このＰＢＳ群を対照群とした。最終投与の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析を行った。
ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害

【1023】

全ＲＮＡをこれらの処理群の肝臓から抽出し、ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。

【表149】

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【1024】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著し
い阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４１６１（配列番号１６）、４９４１６２（配列番号１７）、およびＩＳＩＳ ９４１６３（配列番号１８）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも有効であった。ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下

【1025】

処理群から血液を採取し、Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの減少パーセントとして表す。

【表150】

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【1026】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルの著しい阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ ４９４１６１（配列番号１６）、ＩＳＩＳ ４９４１６２（配列番号１７）、およびＩＳＩＳ
４９４１６３（配列番号１８）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも有効であった。
研究３

【1027】

ＩＳＩＳ ４９４２４４、ＩＳＩＳ ４９４２８３、およびＩＳＩＳ ４９４２８４を、このモデルにおいてさらに評価した。ＩＳＩＳ １４４３６７を比較のために含めた。処理

【1028】

雌ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスを、各４匹のマウスから成る処理群に分けた。これらの群に、ＩＳＩＳ １４４３６７、ＩＳＩＳ ４９４２４４、ＩＳＩＳ ４９４２８３、またはＩＳＩＳ ４９４２８４を、０．７５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間、腹腔内注入した。１つのマウス群に、ＰＢＳを週２回２週間、腹腔内注入した。このＰＢＳ群を対照群とした。最終投与の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析を行った。
ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害

【1029】

全ＲＮＡをこれらの処理群の肝臓から抽出し、ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。

【表151】

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【1030】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、およびＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも有効であった。
ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下

【1031】

処理群から血液を採取し、Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの減少パーセントとして表す。

【表152】

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【1032】

データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルの著しい阻害を示す。ＩＳＩＳ ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ ４９４２８３（配列番号２６）、およびＩＳＩＳ ４９４２８４（配列番号２７）は、基準ＩＳＩＳ １４４３６７（配列番号１１）よりも有効であった。
研究４

【1033】

ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、およびＩＳＩＳ ４９４３１１を、このモデルにおいてさらに評価した。
処理

【1034】

雄ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスを、各４匹のマウスからなる処理群に分けた。各そのような群に、ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ
４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、またはＩＳＩＳ ４９４３１１を、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間、腹腔内注入した。３匹マウスからなる１群に、ＰＢＳを週２回２週間、腹腔内注入した。このＰＢＳ群を対照群とした。最終投与の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析を行った。
ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害

【1035】

全ＲＮＡをこれらの処理群の肝臓から抽出し、ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ ４９４３０２（配列番号 ４０）、およびＩＳＩＳ ４９４３１１（配列番号４
７）によるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい阻害を示す。

【表153】

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ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下

【1036】

処理群から血液を採取し、Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの減少パーセントとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、およびＩＳＩＳ ４９４３１１によるａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルの著しい低下を示す。

【表154】

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【1037】

研究５

【1038】

ＩＳＩＳ ４９４３７２、ＩＳＩＳ ４９８５２４、ＩＳＩＳ ４９８５８１、ＩＳＩ
Ｓ ４９８７２１、およびＩＳＩＳ ４９８８３３を、このモデルにおいてさらに評価した。
処理

【1039】

雌ヒトａｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスを、各４匹のマウスから成る処理群に分けた。これらの群に、ＩＳＩＳ ４９４３７２、ＩＳＩＳ ４９８５２４、ＩＳＩＳ ４９８５８１、ＩＳＩＳ ４９８７２１、またはＩＳＩＳ ４９８８３３を、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回２週間、腹腔内注入した。３匹マウスからなる１群に、ＰＢＳを週２回２週間、腹腔内注入した。このＰＢＳ群を対照群とした。最終投与の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析を行った。
ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害

【1040】

全ＲＮＡをこれらの処理群の肝臓から抽出し、ヒトａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４３７２（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ ４９８５８１（配列番号１０４）、およびＩＳＩＳ ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）によるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい阻害を示す。

【表155】

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ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの低下

【1041】

処理群から血液を採取し、Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒトａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果を以下の表に提示し、ＰＢＳ対照と比較したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの減少パーセントとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４３７２（配列番号２８）、ＩＳＩＳ ４９８５８１（配列番号１０４）、およびＩＳＩＳ ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）によるａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルの著しい減少を示す。

【表156】

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実施例１２０：齧歯類モデルにおけるヒトａｐｏ（ａ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性

【1042】

ヒトａｐｏ（ａ）を標的とするギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＤ１マウスおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける耐容性研究のために上述の研究から選択した。齧歯類は、内因性ａｐｏ（ａ）を発現せず、それ故に、これらの研究は、動物におけるａｐｏ（ａ）の阻害によって引き起こされ得る任意の表現型の変化ではなく、動物における各ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性を試験した。
ＣＤ１マウスにおける耐容性：研究１

【1043】

ＣＤ１（登録商標）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）は、多目的マウスモデルであり、多くの場合、安全性および有効性試験に利用される。マウスを、上述の研究から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
処理

【1044】

雄ＣＤ１マウス群に、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４９４１５９、ＩＳＩＳ ４９４１６１、ＩＳＩＳ ４９４１６２、ＩＳＩＳ ４９４２４４、ＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、ＩＳＩＳ ４９４３１１、ＩＳＩＳ ４９４３３７、ＩＳＩＳ ４９４３７２、およびＩＳＩＳ ５１０５４８を、週２回６週間、皮下注入した。６週齢の雄ＣＤ１マウスの１群に、ＰＢＳを、週２回６週間、皮下注入した。最終投与の４８時間後にマウスを安楽死させ、臓器および血漿をさらなる分析のために採取した。
血漿化学マーカー

【1045】

肝臓および腎臓機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、クレアチニン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果を以下の表に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲を外れて肝臓または腎臓機能マーカーのうちのいずれかのレベルの変化
を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを、さらなる研究から除外した。

【表157】

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臓器重量

【1046】

研究の最後に肝臓、脾臓、および腎臓重量を測定し、以下の表に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲を外れて臓器重量の任意の変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを、さらなる研究から除外した。

【表158】

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Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける耐容性

【1047】

Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、安全性および有効性評価のために用いられる多目的モデルである。これらのラットを上述の研究から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化を評価した。
処理

【1048】

雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット群に、３０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４９４１５９、ＩＳＩＳ ４９４１６１、ＩＳＩＳ ４９４１６２、ＩＳＩＳ ４９４２４４、ＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８５、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、ＩＳＩＳ ４９４３１１、ＩＳＩＳ ４９４３３７、ＩＳＩＳ ４９４３７２、およびＩＳＩＳ ５１０５４８を、週２回８週間、皮下注入した。６匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの１群に、ＰＢＳを、週２回８週間、皮下注入した。最終投与の４８時間後にラットを安楽死させ、臓器および血漿をさらなる分析のために採取した。
血漿化学マーカー

【1049】

肝臓および腎臓機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、クレアチニン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果を以下の表に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲を外れて肝臓または腎臓機能マーカーのうちのいずれかのレベルの変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを、さらなる研究から除外した。

【表159】

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腎臓機能

【1050】

腎臓機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、総タンパク質およびクレアチニンの尿レベルを測定した。結果を以下の表に提示し、ｍｇ／ｄＬ単位で表す。

【表160】

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臓器重量

【1051】

研究の最後に肝臓、脾臓、および腎臓重量を測定し、以下の表に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲を外れて臓器重量の任意の変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを、さらなる研究から除外した。

【表161】

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【1052】

齧歯類耐容性研究の結果は、概して、すべての耐容性マーカーをスクリーニングしたことを考慮して、ＩＳＩＳ ４９４３７２が、ＣＤ１マウスモデルとＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットモデルの両方において最も耐性の高いアンチセンス化合物であったことを示した。
実施例１２１：ＣＤ１マウスにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態

【1053】

ＣＤ１マウスをＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処理し、肝臓および腎臓におけるオリゴヌクレオチド濃度を評価した。
処理

【1054】

４匹のＣＤ１マウス群各々に、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、またはＩＳＩＳ ４９４３７２を、週２回６週間、皮下注入した。最終投与の２日後にこれらのマウスを屠殺した。肝臓を分析のために採取した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定

【1055】

総オリゴヌクレオチド濃度の濃度を測定した。用いた方法は、フェノール−クロロホルム（液体−液体）抽出の後に固相抽出が続く以前に公開された方法（Ｌｅｅｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を修正したものである。内部標準物（ＩＳＩＳ ３５５８６８、２７−ｍｅｒ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴ（本明細書において配列番号１３１と指定される））を抽出前に添加した。較正曲線を用いて組織試料濃度を計算し、定量下限（ＬＬＯＱ）は、約１．１４μｇ／ｇであった。その後、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ）を用いて半減期を計算した。

【1056】

結果を以下の表に提示し、肝臓または腎臓組織μｇ／ｇとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４３７２が肝臓および腎臓において許容濃度であったことを示す。

【表162】

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実施例１２２：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態

【1057】

雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処理し、肝臓および腎臓におけるオリゴヌクレオチド濃度を評価した。
処理

【1058】

４匹のラット群各々に、１０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、またはＩＳＩＳ ４９４３７２を、週２回３週間、皮下注入した。最終投与の２日後にラットを屠殺した。肝臓を分析のために採取した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定

【1059】

総オリゴヌクレオチド濃度の濃度を測定した。用いた方法は、フェノール−クロロホルム（液体−液体）抽出の後に固相抽出が続く以前に公開された方法（Ｌｅｅｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を修正したものである。内部標準物（ＩＳＩＳ ３５５８６８、２７−ｍｅｒ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴ（本明細書において配列番号１３１と指定される））を抽出前に添加した。較正曲線を用いて組織試料濃度を計算し、定量下限（ＬＬＯＱ）は、約１．１４μｇ／ｇであった。その後、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ）を用いて半減期を計算した。

【1060】

結果を以下の表に提示し、肝臓または腎臓組織μｇ／ｇとして表す。データは、ＩＳＩＳ ４９４３７２が肝臓および腎臓において許容濃度であったことを示す。

【表163】

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実施例１２３：カニクイザルにおけるヒトａｐｏ（ａ）を標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響

【1061】

カニクイザルを、上述の研究から選択されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。この研究に着手した時点では、カニクイザルゲノム配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースからは入手不可能であり、それ故に、カニクイザル遺伝子配列との交差反応を確認することはできなかった。代わりに、カニクイザルにおいて用いたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を、相同性についてアカゲザル配列と比較した。アカゲザル配列と相同性を有するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドがカニクイザル配列と完全に交差反応することも予想される。

【1062】

試験されるヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アカゲザルｍＲＮＡ配列（ＸＭ＿００１０９８０６１．１（本明細書において配列番号１３２と指定される））とも交差反応する。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列との間の相補性が高いほど、ヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザル配列と交差反応することができる可能性が高くなる。配列番号１３２の各オリゴヌクレオチドの開始部位および終止部位を以下の表に提示する。各アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１３２における２つ以上の領域を標的とし、複数の開始部位を有する。「開始部位」とは、ギャップマーがアカゲザル配列において標的とする最も５’側のヌクレオチドを指す。「ミスマッチ」とは、ヒトオリゴヌクレオチド配列とアカゲザル配列との間のミスマッチしたヌクレオチドの数を指す。

【1063】

肝臓および腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド耐容性、ならびにそれらの薬物動態プロファイルを評価した。

【表164】

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処理

【1064】

研究前に、これらのサルを少なくとも３０日間隔離し、この期間中、これらの動物を一般健康状態について毎日監視した。これらのサルは、２〜４歳であり、体重２〜４ｋｇであった。無作為に割り当てられた４匹の雄カニクイザルの７群各々に、適切な大きさのステンレス製の投与針およびシリンジを用いて、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、サルの背部の４つの部位のうちの１つに皮下注入した。１回の投与につき１つの部位に時計回りに注入した。これらのサルに、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４９４２８３、ＩＳＩＳ ４９４２８４、ＩＳＩＳ ４９４２８６、ＩＳＩＳ ４９４３０１、ＩＳＩＳ ４９４３０２、またはＩＳＩＳ ４９４３７２を、負荷用量として１週目に週４回（１、３、５、および７日目）、その後、２〜１２週目に週１回投与した。８匹のカニクイザルの対照群に、ＰＢＳを、１週目に３回４回（１、３、５、および７日目）、その後、２〜
１２週目に週１回皮下注入した。

【1065】

この研究期間中、これらのサルを、病気または苦痛の兆候について少なくとも１日１回監視した。処理により一時的または軽度を超える疼痛もしくは苦痛、損傷、または疾病を経験した任意の動物を、研究責任者と相談した後に獣医により疼痛を緩和するための承認鎮痛剤または薬剤を用いて処理した。不良な健康状態または瀕死の可能性のある状態にある任意の動物を、さらなる監視および安楽死の可能性のために特定した。例えば、ＩＳＩＳ ４９４３０２の処理群における１匹の動物が５６日目に瀕死で見つかり、安楽死させた。予定された動物の安楽死を、深麻酔下での瀉血により、８６日目および８７日目に行った。この実施例に記載のプロトコルは、動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたものである。
標的減少
ＲＮＡ分析

【1066】

８６日目に、ＲＮＡを、ａｐｏ（ａ）のリアルタイムＰＣＲ分析のために、ヒトプライマープローブセットＡＢＩ Ｈｓ００９１６６９１＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照に対するａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして提示する。以下の表に示されるように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、ＰＢＳ対照と比較して、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの著しい減少をもたらした。

【1067】

別のクリングル含有タンパク質であるプラスミノーゲンのｍＲＮＡレベルも測定した。ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理は、プラスミノーゲンのｍＲＮＡレベルを変化させなかった。

【表165】

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タンパク質分析

【1068】

異なる日に、１ｍＬの血液を、すべての研究用サルの橈側皮静脈、伏在静脈、または大腿静脈から採取した。血液試料を、血漿分離のためにＫ２−ＥＤＴＡを含有する管に入れた。これらの管を、室温で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離して、血漿を得た。Ａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＡｐｏ（ａ）タンパク質レベルを分析した。結果を、ベースラインからのレベルの変化パーセントとして提示する。以下の表に示されるように、いくつかのＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、ＰＢＳ対照と比較して、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの著しい減少をもたらした。具体的には、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理は、カニクイザルのａｐｏ（ａ）の血漿タンパク質レベルを減少させた。

【1069】

ａｐｏＢのタンパク質レベルもこれらの研究群において測定した。ａｐｏ（ａ）のアンチセンス阻害は、ａｐｏＢレベルに影響を及ぼさなかった。

【表166】

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耐容性研究
体重および臓器重量測定

【1070】

動物の健康全般へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重および臓器重量を８６日目に測定した。体重を測定し、以下の表に提示する。臓器重量を測定し、データを以下の表に提示する。結果は、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理が、サルの体重および臓器重量の観点において、良好な耐性を示したことを示す。

【表167】

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【表168】

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肝臓機能

【1071】

肝機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、サルを血液採取の前に一晩絶食させた。各動物から約１．５ｍＬの血液を採取し、血清分離のために抗凝血剤を有しない管に入れた。これらの管を室温で最低９０分間保管し、その後、室温で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離して、血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、様々な肝臓機能マーカーのレベルを測定した。ＡＬＴおよびＡＳＴの血漿レベルを測定し、結果を以下の表に提示し、ＩＵ／Ｌ単位で表す。肝臓機能マーカーであるビリルビンも同様に測定し、以下の表に提示し、ｍｇ／ｄＬ単位で表す。結果は、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理が、サ
ルにおける肝臓機能の観点において、良好な耐性を示したことを示す。

【表169】

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Ｃ反応性タンパク質レベル分析

【1072】

カニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの任意の炎症効果を評価するために、血液試料を分析用に採取した。サルを血液採取の前に一晩絶食させた。各動物から約１．５ｍＬの血液を採取し、血清分離のために抗凝血剤を有しない管に入れた。これらの管を室温で最低９０分間保管し、その後、室温で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離して、血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、肝臓において合成され、かつ炎症のマーカーとしての機能を果たすＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定した。結果は、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理がサルにおいていかなる炎症も引き起こさなかったことを示す。

【表170】

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補体Ｃ３分析

【1073】

カニクイザルにおける補体経路へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの任意の影響を評価するために、血液試料を８４日目（投与前）および８５日目（投与の２４時間後）に分析用に採取した。各動物から約０．５ｍＬの血液を採取し、血清分離のために抗凝血剤を有しない管に入れた。これらの管を室温で最低９０分間保管し、その後、室温で１０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離して、血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いてＣ３を測定した。結果は、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理がサルにおける補体経路にいかなる影響も引き起こさなかったことを示す。

【表171】

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血液学

【1074】

血液学的パラメータへのカニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、約０．５ｍＬの血液の血液試料を８７日目に利用可能な研究用動物の各々からＫ_２−ＥＤＴＡを含有する管に収集した。ＡＤＶＩＡ１２０血液学的分析装置（Ｂａｙｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、試料を、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、ならびに血小板数について分析した。データを以下の表に提示する。

【1075】

データは、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理が、サルにおける血液学的パラメータの観点において、良好な耐性を示したことを示す。

【表172】

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実施例１２４：カニクイザルにおけるＩＳＩＳ ４９４３７２の薬理学的活性の特徴付け

【1076】

ＩＳＩＳ ４９４３７２の薬理学的活性を、１３週間にわたって化合物が投与され、かつ別の１３週間にわたって回復させたサルにおける肝臓のａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡおよび血漿ａｐｏ（ａ）レベルを測定することによって特徴付けた。
処理

【1077】

無作為に割り当てられた１４匹の雄および雌カニクイザルの５群各々に、適切な大きさのステンレス製の投与針およびシリンジを用いて、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、サルの背部（肩甲部）の４つの部位のうちの１つに皮下注入した。これらのサルに、以下の表に示されるように、負荷用量として１週目に週４回（１、３、５、および７日目）、その後、維持用量として２〜１３週目に週１回投与した。１週目の負荷用量をｍｇ／ｋｇ／用量で表し、２〜１３週目の維持用量をｍｇ／ｋｇ／週で表す。

【表173】

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【1078】

肝臓試料を、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの分析のために、研究の中間期、終了期、および回復期に動物から採取した。加えて、異なる日に血漿試料を収集して、ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。この非臨床研究を、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品安全性試験実施基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ））規制の連邦法第２１章第５８条に従って行った。
ＲＮＡ分析

【1079】

肝臓試料を３０、９３、および１８２日目にサルから収集し、凍結させた。手短に、凍結した肝臓の一片（０．２ｇ）を２ｍＬのＲＬＴ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）中で均質化した。結果として生じた溶解物をＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムに適用した。精製および定量化後、組織をＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。リアルタイム蛍光ＲＴ−ＰＣＲ検出を用いるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列決定システムを用いて、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。アッセイは、蛍光レポーターおよび反対側の端に消光染料で標識された標的特異的プローブに基づく。プローブをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって加水分解し、反応中に検出され得るレポーター染料の蛍光発光の増加をもたらす。アカゲザルａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ転写物（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＸＭ＿００１０９８０６１．２（配列番号１３２）配列の１５１２位を標的とするプローブセット（ＡＢＩ Ｒｈｅｓｕｓ ＬＰＡプローブセットＩＤ Ｒｈ０２７８９２７５＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、カニクイザルの肝臓におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を用いてＡｐｏ（ａ）発現を規準化した。結果を、ＰＢＳ対照に対するａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして提示する。

【1080】

以下の表に示されるように、ＩＳＩＳ ４９４３７２での処理は、ＰＢＳ対照と比較して、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの時間依存的減少をもたらした。３０日目に、肝臓におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ発現は、時間依存的様式で、それぞれ、１２ｍｇ／ｋｇ／週および４０ｍｇ／ｋｇ／週の投与コホートにおいて７４％および９９％減少した。これらの減少は、一方向ＡＮＯＶＡ（ダネット多重比較試験、Ｐ＜０．０５）により、統計的に有意である。

【1081】

回復期にＡｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルも測定した。最終投与後８８日目の肝臓における発現レベルは、依然として、それぞれ、１２ｍｇ／ｋｇ／週および４０ｍｇ／ｋｇ／週の投与コホートにおいて４９％および６９％減少した。

【表174】

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タンパク質分析

【1082】

市販のａｐｏ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０−１１０６−０１、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて約２０μｌの血漿を分析した。アッセイプトロコルを製造業者が説明する通りに実行した。結果を１日目（投与前）のａｐｏ（ａ）血漿タンパク質濃度からの変化パーセントとして以下の表に提示する。ダネット多重比較試験を用いた１日目のベースライン血漿ａｐｏ（ａ）からの統計的に有意な差には星印が付いている。

【1083】

血漿ａｐｏ（ａ）タンパク質の最大減少は、９３日目までにすべての投与コホートで観察された。回復期において、４０ｍｇ／ｋｇ／週の投与コホートにおけるａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルは、それぞれ、回復の４週間後および１３週間後（１２１日目および１８２日目）にベースラインの２２％および９３％であった。１２ｍｇ／ｋｇ／週のコホートにおける回復率は、４０ｍｇ／ｋｇ／週のコホートで見られた回復率と類似していた。

【表175】

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【表176】

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実施例１２５：ヒトＡｐｏ（ａ）を標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度測定

【1084】

４０センチポアズ（ｃＰ）を超える粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするために、上述の研究から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。４０ｃＰを超える粘度を有するオリゴヌクレオチドは、最適粘度未満を有するであろう。

【1085】

ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド（３２〜３５ｍｇ）をガラス製のバイアルに秤量し、１２０μＬの水を添加し、バイアルを５０℃で加熱することによりアンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液に溶解させた。予熱した試料の一部（７５μＬ）をマイクロ粘度計（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）にピペットで移した。マイクロ粘度計の温度を２５℃に設定し、試料の粘度を測定した。８５℃、２６０ｎＭでのＵＶ読み取り（Ｃａｒｙ ＵＶ機器）のために、予熱した試料の別の一部（２０μＬ）を１０ｍＬの水にピペットで移した。結果を以下の表に提示し、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液の大半の粘度が上述の基準下で最適であることを示す。最適でなかったものを「粘性」と表示する。特に、ＩＳＩＳ ４９４３７２の粘度が上述の基準下で最適であった。

【表177】

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ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］
修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的な少なくとも８個の連続した核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８０％相補的である、化合物。
［態様２］
前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の等長部分に相補的な少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続した核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含む、態様１に記載の化合物。
［態様３］
修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９００〜３９２３の等長部分に相補的な少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８０％相補的である、化合物。
［態様４］
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である、態様１〜３のいずれかに記載の化合物。
［態様５］
修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８、最小９、最小１０、最小１１、少なくとも１２、最小１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、最小１７、最小１８、最小１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
［態様６］
修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８、最小９、最小１０、最小１１、少なくとも１２、最小１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、最小１７、最小１８、最小１９、または２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
［態様７］
前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である、態様１〜６のいずれかに記載の化合物。
［態様８］
前記修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である、態様１〜６のいずれかに記載の化合物。
［態様９］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、態様１〜のいずれかに記載の化合物。
［態様１０］
前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、態様９に記載の化合物。
［態様１１］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１２］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも２個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１３］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも３個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１４］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも４個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１５］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも５個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１６］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも６個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１７］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも７個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、態様１０に記載の化合物。
［態様１８］
前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合およびホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される、態様１１〜１７のいずれかに記載の化合物。
［態様１９］
前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、態様１〜８のいずれかに記載の化合物。
［態様２０］
ＩＳＩＳ ４９４３７２および共役基からなる化合物。
［態様２１］
前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾糖を含む、態様１〜２０のいずれかに記載の化合物。
［態様２２］
少なくとも１個の修飾糖が二環糖である、態様２１に記載の化合物。
［態様２３］
少なくとも１個の修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’橋を含み、式中、ｎが、１または２である、態様２１に記載の化合物。
［態様２４］
少なくとも１個のヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、態様１〜２３のいずれかに記載の化合物。
［態様２５］
前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、態様２４に記載の化合物。
［態様２６］
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ
連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが、修飾糖を含む、態様１〜２５のいずれかに記載の化合物。
［態様２７］
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５、１６、または２０個の連結したヌクレオシドからなる、態様１〜２６のいずれかに記載の化合物。
［態様２８］
修飾オリゴヌクレオチドおよび共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結したヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８のうちのいずれかの等長部分に相補的なａ少なくとも８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１０個の連結したデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の連結したヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が、５−メチルシトシンである、化合物。

［態様１７６］
以下の式

【化105a】

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を有する化合物であって、
式中、ｘが、ＧａｌＮＡｃを含む共役基である、化合物。
［態様１７７］
以下の式

【化106a】

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を有する化合物。
［態様１７８］
以下の式

【化107a】

[この文献は図面を表示できません]

を有する化合物。
［態様１７９］
以下の式

【化108a】

[この文献は図面を表示できません]

を有する化合物であって、
式中、Ｒ^１が、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（ＭＯＥ）であり、Ｒ^２が、Ｈであるか、またはＲ^１およびＲ^２が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^１が、−Ｏ−であり、Ｒ^２が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^１およびＲ^２が直接連結され、
同一の環上、独立して、各環のＲ^３とＲ^４の各対について、Ｒ^３が、Ｈおよび−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択され、Ｒ^４が、Ｈであるか、またはＲ^３およびＲ^４が一緒になって橋を形成するかのいずれかであり、そこで、Ｒ^３が、−Ｏ−であり、Ｒ^４が、−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、結果として生じる橋が、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−から選択されるように、Ｒ^３およびＲ^４が直接連結され、
Ｒ^５が、Ｈおよび−ＣＨ_３から選択され、
Ｚが、Ｓ⁻およびＯ⁻から選択される、化合物。
［態様１８０］
態様１〜１７９のいずれかに記載の前記化合物またはその塩と、薬剤的に許容される担体または希釈剤のうちの少なくとも１つと、を含む、組成物。
［態様１８１］
態様１〜１８０のいずれかに記載の前記化合物を含むプロドラッグ。
［態様１８２］
動物に態様１〜１８１のいずれかに記載の前記化合物または組成物を投与することを含む、方法。
［態様１８３］
前記動物がヒトである、態様１８１に記載の方法。
［態様１８４］
前記化合物の投与が、心臓血管、代謝性、および／もしくは炎症性疾患行を予防するか、治療するか、改善するか、またはその進行を遅らせる、態様１８１に記載の方法。
［態様１８５］
前記化合物または組成物と第２の薬剤を共投与することを含む、態様１８２に記載の方法。
［態様１８６］
前記化合物または組成物と前記第２の薬剤が同時に投与される、態様１８５に記載の方法。
［態様１８７］
前記投与が非経口投与である、態様１７６に記載の方法。
［態様１８８］
前記投与が皮下投与である、態様１７６に記載の方法。
［態様１８９］
動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させる方法であって、前記動物に態様１〜１８１のいずれかに記載の前記化合物または組成物を投与して、前記動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させることを含む、方法。
［態様１９０］
動物におけるＬｐ（ａ）レベルを減少させる方法であって、前記動物に態様１〜１８１のいずれかに記載の前記化合物または組成物を投与して、前記動物におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させることを含む、方法。
［態様１９１］
治療に用いるための態様１〜１９０のいずれかに記載の前記化合物を含む組成物。
［態様１９２］
ａｐｏ（ａ）の上昇および／またはＬｐ（ａ）の上昇に関連した疾患を治療するか、予防するか、またはその進行を遅らせる際に用いられる、態様１９１に記載の化合物。
［態様１９３］
前記疾患が、炎症性、心臓血管、もしくは代謝性疾患、障害、または状態である、態様１９１に記載の化合物。

【配列表】

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