特許 6592600 抗ＣＧＲＰ／抗ＩＬ−２３二重特異性抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6592600

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】抗ＣＧＲＰ／抗ＩＬ−２３二重特異性抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20191007BHJP

   C07K 16/26 20060101ALI20191007BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20191007BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20191007BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20191007BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20191007BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   C07K16/26

   C07K16/24

   C12N15/13

   C12N15/62 Z

   C12N15/63 Z

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61P37/02

   A61P29/00

   A61P1/00

   A61P1/04

   A61P17/06

   A61P19/02

   A61P19/00

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 U

   A61K39/395 Y

【請求項の数】20

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2018-521993(P2018-521993)

(86)(22)【出願日】2015年10月30日

(65)【公表番号】特表2019-501114(P2019-501114A)

(43)【公表日】2019年1月17日

(86)【国際出願番号】US2015058362

(87)【国際公開番号】WO2017074428

(87)【国際公開日】20170504

【審査請求日】2018年4月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・ジャン・ベンスホップ

(72)【発明者】

【氏名】バレット・アラン

(72)【発明者】

【氏名】ローン・リー・ミリカン・ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン・ブローティガム・バイドラー

【審査官】 田名部 拓也

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５３２１４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１３７９６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１４−０７３１２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Robert Mabry et al.，Protein Engineering, Design & Selection，２０１０年，vol.23, no.3，115-127

【文献】 Christoph Spiess et al.，Molecular Immunology，２０１５年，67，95-106

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００ − １６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及び２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、二重特異性抗体であって、
（ａ）前記ＩｇＧが、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）を含み、各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号３であり、
（ｂ）各ｓｃＦｖが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含み、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９であり、
各ｓｃＦｖが各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のＮ末端で、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して、前記ＩｇＧ抗体に各ＩｇＧ ＨＣのＣ末端で連結され、Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号２３であり、
各ｓｃＦｖの前記ＨＣＶＲ２が前記ＨＣＶＲ２のＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して、同一のｓｃＦｖの前記ＬＣＶＲ２に同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のＮ末端で連結され、Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号２４であり、
前記二重特異性抗体が、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）及びヒトＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する、前記二重特異性抗体。

【請求項2】

各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８である、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号９である、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号３であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８であり、Ｌ１のアミノ酸配列が、配列番号２３であり、Ｌ２のアミノ酸配列が、配列番号２４である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

各ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号３であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が、配列番号９であり、Ｌ１のアミノ酸配列が、配列番号２３であり、Ｌ２のアミノ酸配列が、配列番号２４である、請求項１または３に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体のＨＣ、ｓｃＦｖ、第１のポリペプチドリンカーＬ１、及び第２のポリペプチドリンカーＬ２を含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。

【請求項7】

前記コードされたポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２である、請求項６に記載のＤＮＡ分子。

【請求項8】

請求項６または請求項７に記載のＤＮＡ分子、及び請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体のＬＣを含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む、発現ベクターであって、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号３である、前記発現ベクター。

【請求項9】

請求項７に記載のＤＮＡ分子、及び請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体のＬＣを含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む、組み換え宿主細胞であって、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号３であり、前記細胞が、請求項４または請求項５に記載の二重特異性抗体を発現することができる、前記細胞。

【請求項10】

請求項４または請求項５に記載の二重特異性抗体を生成するためのプロセスであって、
ａ）前記二重特異性抗体が発現されるような条件下で、請求項９に記載の組み換え宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記宿主細胞から、前記発現された二重特異性抗体を回収するステップと、
を含む、前記プロセス。

【請求項11】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、ならびに１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項12】

自己免疫疾患の治療のための、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記自己免疫疾患が、乾癬性関節炎または強直性脊椎炎である、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

治療における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

自己免疫疾患の治療における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１７に記載の使用のための二重特異性抗体。

【請求項19】

前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１８に記載の使用のための二重特異性抗体。

【請求項20】

前記自己免疫疾患が、乾癬性関節炎または強直性脊椎炎である、請求項１７に記載の使用のための二重特異性抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学の分野、特にカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）及びインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）に対して指向された二重特異性抗体の新規分野にある。本発明の二重特異性抗体は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、ならびに強直性脊椎炎（ＡＳ）を含む自己免疫疾患の治療に有用であることが期待される。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患は、身体がそれ自身の組織に対する免疫応答を生成することから生じる。自己免疫疾患はしばしば慢性であり、衰弱性かつ致命的であり得る。一般的にＣＤ及びＵＣなどの障害の群を表すＩＢＤは、病理学的に腸管炎症及び上皮損傷を特徴とする一般的な慢性再発性自己免疫疾患である。ＰｓＡ及びＡＳなどの他の形態の慢性自己免疫疾患は、中軸骨格及び／または周辺骨格に影響を与え得る。

【0003】

インターロイキン２３（ＩＬ−２３）は、慢性炎症の誘導に必要とされる様々な炎症細胞の活性化において重要であると考えられているヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−２２分泌の上流調節因子であると考えられているＩＬ−２３は、ｐ４０サブユニットに共有結合的に対合したｐ１９サブユニット（ＩＬ２３ｐ１９）からなる（ｐ４０サブユニットはまた、サイトカインＩＬ−１２とも共有される）。更に、ＩＬ−２３は、メモリー／病原性Ｔ細胞炎症応答において重要な役割を果たすものとして、及び自然リンパ球細胞の炎症活性の調節において役割を果たすものとして関連付けられている。サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−２２のＩＬ−２３調節が、ＩＢＤを含む炎症疾患及び他の自己免疫疾患に関連付けられるという証拠が存在する。

【0004】

ＣＧＲＰは、中枢神経系及び末梢神経系の神経によって分泌される３７アミノ酸長の神経ペプチドである。ＣＧＲＰは、末梢神経系及び中枢神経系の両方において感覚神経内に広く分布しており、多数の異なる生物学的活性を呈する。例えば、それは強力な血管拡張剤であり、微小血管系はそれに対して感受性である。三叉神経及び他の神経線維から放出されるとき、ＣＧＲＰは、特定の細胞表面受容体に結合することによって、その生物学的応答を媒介すると考えられている。ＣＧＲＰは、疼痛シグナル伝達の調節及び／または伝達において、ならびに神経原性炎症において役割を果たすと考えられている。ＣＧＲＰは感覚神経の刺激時に放出されるため、ＣＧＲＰは片頭痛において役割を果たすことが報告されている。ＣＧＲＰの放出は、三叉神経線維の刺激時、これらの線維によって神経支配される組織中の血管透過性及び後続する血漿タンパク質漏出（血漿タンパク質血管外漏出）を増加させる。更に、研究は、片頭痛を患う患者におけるＣＧＲＰの注入が、片頭痛様症状をもたらしたことを報告している。

【0005】

ＩＢＤなどの自己免疫疾患の現在のＦＤＡ承認治療としては、急性炎症の治療にしばしば使用されるコルチコステロイド、ならびに（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、及びＨＵＭＩＲＡ（登録商標）などの）その多くが体内のＴＮＦαの標的化及び中和を試みるバイオ生成物が挙げられる。ＰｓＡの治療に承認されている別のバイオ生成物としては、サイトカインＩＬ−１２及びＩＬ−２３の共有ｐ４０サブユニットの標的化を試みるＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）が挙げられる。現在の治療は、患者の一部において、いくつかの自己免疫疾患の症状を低減し、その進行を緩徐にする有効性を実証している。しかしながら、患者の大部分は、現在利用可能な治療に対して非応答性である（例えば、寛解の誘導はＴＮＦα中和によって治療したＣＤ患者のうちの３０〜５０％に生じるにすぎず、治療の１２ヶ月後、ＴＮＦα中和に対する応答の喪失が２３〜４６％の患者において生じる）。自己免疫疾患の代替的な療法としては、米国特許第９，０２３，３５８号に開示されるものなどのＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する抗体が挙げられる。

【0006】

自己免疫疾患の現在承認されている治療が疾患の炎症態様を治療する一方で、該治療は関連する疼痛の治療においては無効であることが判明している。抗ＴＮＦα療法に対して応答性であるＩＢＤ（ＣＤ及びＵＣ）を患う患者においてですら、疼痛は残存する。自己免疫疾患に関連する炎症は、痛覚過敏及びアロディニアをもたらす疼痛に対する中枢性感作を駆動すると考えられている。結果として、炎症の鎮静後ですら疼痛が存在し得、高い割合の患者が鎮痛剤の服用を継続する。ＩＢＤを患う患者における疼痛の標準的療法は、ＮＳＡＩＤＳ、ＣＯＸ−２阻害剤、及びアヘン剤を含む鎮痛剤である。現在のところ、ＩＢＤを患う患者は、生物学的療法の導入前及び後の両方で、類似した数の鎮痛剤処方を調剤している。米国特許第９，０７３，９９１号に記載されるものなどのＣＧＲＰに結合する抗体が、片頭痛の治療として示唆されている。

【0007】

そのような代替的な療法に対する１つのアプローチとしては、自己免疫疾患の異なる態様（例えば、疾患の病理及び関連する疼痛）を治療する、２つの異なるバイオ生成物（例えば、抗体）の同時投与を挙げることができる。同時投与は、２つの別個の生成物の注射または２つの異なる抗体の同時製剤の単一注射のいずれかを必要とする。２つの注射が用量及び適時選択の柔軟性を許容する一方で、服薬遵守及び疼痛の両方のために、それは患者にとっては不都合である。更に、同時製剤は用量のいくらかの柔軟性を提供し得る一方で、２つの抗体の異なる分子的特徴のために、（比較的高濃度で）許容可能な粘度を有し、かつ両方の抗体の化学的及び物理的安定性を促進する製剤条件を見出すことは、しばしば非常に困難または不可能である。更に、同時投与及び同時製剤は２つの異なる薬物療法の相加的費用を伴い、これは患者及び／または支払人の費用を増加させ得る。

【0008】

したがって、疾患改変特性及び疼痛管理特性の両方を有する自己免疫疾患の治療のための代替的な療法に対する必要性が残存し、好ましくはそのような代替的な療法は二重特異性抗体を含む。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ）及び２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む二重特異性抗体を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】原文に記載なし。

【発明を実施するための形態】

【0011】

より具体的には、本発明は、ＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）該ＩｇＧが、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）を含み、各ＨＣが、重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を含み、各軽鎖が、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１〜３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２であり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１６であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１８であり、
（ｂ）各ｓｃＦｖが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含み、ＨＣＶＲ２が、ＨＣＤＲ４〜６を含み、ＬＣＶＲ２が、ＬＣＤＲ４〜６を含み、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列が、配列番号１３であり、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列が、配列番号１４であり、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列が、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列が、配列番号１９であり、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列が、配列番号２０であり、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列が、配列番号２１または配列番号２２であり、
各ｓｃＦｖが各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のＮ末端で、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して、該ＩｇＧ抗体に各ＩｇＧ ＨＣのＣ末端で連結され、
各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２が、ＨＣＶＲ２のＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して、同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２に同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のＮ末端で連結される、二重特異性抗体を提供する。

【0012】

本発明の二重特異性抗体は、ＣＧＲＰ及びＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する。

【0013】

好ましくは、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号２１である。

【0014】

更に好ましくは、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号２２である。

【0015】

本発明の二重特異性抗体の更なる一実施形態において、各ＨＣのＨＣＶＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５であり、各ＬＣのＬＣＶＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８または配列番号９である。

【0016】

好ましくは、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８である。

【0017】

更に好ましくは、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号９である。

【0018】

本発明の二重特異性抗体の依然更なる一実施形態において、各ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８または配列番号９である。

【0019】

好ましくは、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８である。

【0020】

更に好ましくは、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号９である。

【0021】

本発明の上記の実施形態の好ましい一態様において、Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号２３であり、Ｌ２のアミノ酸配列は、配列番号２４である。

【0022】

本発明の二重特異性抗体の好ましい一実施形態において、各ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８であり、Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号２３であり、Ｌ２のアミノ酸配列は、配列番号２４である。

【0023】

本発明の二重特異性抗体の更に好ましい一実施形態において、各ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号４であり、各ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３であり、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６であり、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は、配列番号９であり、Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号２３であり、Ｌ２のアミノ酸配列は、配列番号２４である。

【0024】

本発明の二重特異性抗体の構築時、化学的及び物理的安定性に関連付けられる重要な問題に対処した。標的化される両方の抗原（ＣＧＲＰ及びＩＬ−２３のｐ１９サブユニット）に対する結合親和性を維持しながら、物理的安定性分子の発現、一本鎖断片可変領域（ｓｃＦｖ）のＶＨ／ＶＬ界面の安定化、熱及び塩依存性安定性の増加、凝集の低下、高濃度での溶解性の増加、ならびに／または二重特異性抗体の結合表面における静電分布の再平衡化などの、二重特異性抗体に関連付けられ得る無数の問題を全て十分に克服するために、出発二重特異性抗体における多くの変更が必要とされた。

【0025】

本発明の二重特異性抗体は、熱安定性かつ物理的安定性である。更に、本発明の二重特異性抗体はまた、低凝集も呈し得る。更に、本発明の二重特異性抗体はまた、ヒトＣＧＲＰ及びヒトＩＬ２３ｐ１９（ＩＬ−２３のｐ１９サブユニット）も中和するだけでなく、両方のリガンドに同時に結合もし得る。現在主張される抗体はまた、２つの異なる別個の抗体の異なる分子的特徴を満たさなくてはならない製剤条件を見出す課題も回避し得る。

【0026】

本発明の第１の二重特異性抗体のＩｇＧ部分は、２つの同一の重鎖（ＩｇＧ ＨＣ）（配列番号４）を含む。

【0027】

各ＩｇＧ ＨＣはそのＣ末端で、第１のポリペプチドリンカー（Ｌ１）（配列番号２３）を介して、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する同一のｓｃＦｖ部分に結合される。

【0028】

各重鎖ｓｃＦｖ部分（ＨＣＶＲ２）（配列番号６）はそのＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）（配列番号２４）を介して、ｓｃＦｖ軽鎖（ＬＣＶＲ２）（配列番号８）に結合される。

【0029】

ＩｇＧ_４ ＨＣのＮ末端残基から開始し、ｓｃＦｖ ＬＣのＣ末端残基で終結する、本発明の第１の二重特異性抗体の各同一の重鎖部分の完全直鎖状アミノ酸配列は、配列番号１に提供される。

【0030】

同様に、可変ドメインのＮ末端残基から開始し、ＬＣカッパ定常領域のＣ末端残基で終結する、本発明の第１の二重特異性抗体の各同一のＬＣの完全アミノ酸配列は、配列番号３に提供される。

【0031】

例証される本発明の第１の二重特異性抗体の様々な領域と、リンカーとの関係は、以下の通りである（アミノ酸の番号付けは、直鎖番号付けを適用し、可変ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づき、ＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、表１（ａ）〜（ｃ））に反映されているように、周知のＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））及びＮｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１））の番号付け慣習に基づく。

【表1-a】

【表1-b】

【表1-c】

【0032】

例証される本発明の第２の二重特異性抗体、ＬＣＤＲ６は、例証される本発明の第２の二重特異性抗体のＬＣＤＲ６が以下の配列、ＱＴＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２２）を有するように、配列番号１の６８４（Ｑ６８４Ｔ）位でスレオニン（Ｔ）をグルタミン（Ｑ）に置換する操作された単一アミノ酸変化を組み込む。いかなる追加の変化もなされず、結果として、例証される本発明の第２の二重特異性抗体の全ての残りのアミノ酸配列は、上述の例証される第１の二重特異性抗体のものと同一である。

【0033】

ＩｇＧ_４ ＨＣのＮ末端残基から開始し、ｓｃＦｖ ＬＣのＣ末端残基で終結する、配列番号２２を有するＬＣＤＲ６を含む、本発明の第２の二重特異性抗体の各同一の重鎖部分の完全直鎖状アミノ酸配列は、配列番号２に提供される。

【0034】

同様に、ＬＣ可変ドメインのＮ末端残基から開始し、ＬＣ定常領域のＣ末端残基で終結する、本発明の第２の二重特異性抗体の各同一のＬＣの完全アミノ酸配列は、配列番号３に提供される。

【0035】

本発明は、ＨＣのそれぞれがＬＣのそれぞれと鎖間ジスルフィド結合を形成し、ＨＣのそれぞれが他のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、ｓｃＦｖのそれぞれがＨＣＶＲ２とＬＣＶＲ２との間に鎖間ジスルフィド結合を形成する、二重特異性抗体を更に提供する。表１（ａ）及び（ｂ）に提示される、例証される本発明の二重特異性抗体に従うと、ＨＣのそれぞれ及びＬＣのそれぞれの鎖間ジスルフィド結合が、ＨＣのシステイン残基１３３（配列番号１及び配列番号２のもの）とＬＣのシステイン残基２１４（配列番号３のもの）との間に形成され、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合が、２つのＨＣ間に形成され、第１の鎖間ジスルフィド結合が、ＨＣのシステイン残基２２５（配列番号１または配列番号２のもの）と他方のＨＣのシステイン残基２２５（配列番号１または配列番号２のもの）との間に形成され、第２の鎖間ジスルフィド結合が、ＨＣのシステイン残基２２８（配列番号１または配列番号２のもの）と他方のＨＣのシステイン残基２２８（配列番号１または配列番号２のもの）との間に形成され、ｓｃＦｖの鎖内ジスルフィド結合が、ＨＣＶＲ２のシステイン残基５０３（配列番号１または配列番号２のもの）とＬＣＶＲ２のシステイン残基６９４（配列番号１または配列番号２のもの）との間に形成される。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態に従うと、ＨＣのグリコシル化を含む二重特異性抗体が提供される。表１（ａ）及び（ｂ）に例証される本発明の二重特異性抗体に従うと、ＨＣのグリコシル化は、配列番号１または配列番号２のアスパラギン残基２９６で生じる。

【0037】

本明細書に提供されるアミノ酸配列を考慮すれば、当業者は、この知識を使用して、本明細書に上述される任意の二重特異性抗体またはその断片をコードし、発現するＤＮＡ分子を設計することができる。したがって、本発明は、本発明に従う二重特異性抗体またはその断片をコードする全てのＤＮＡ配列を包含する。

【0038】

特に、本発明は、本発明の二重特異性抗体のＨＣ、ｓｃＦｖ、第１のポリペプチドリンカーＬ１、及び第２のポリペプチドリンカーＬ２を含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。

【0039】

本発明の一実施形態に従うと、コードされたポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１である。

【0040】

本発明の代替的な一実施形態に従うと、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２である。

【0041】

本発明はまた、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。

【0042】

本発明はまた、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。

【0043】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体のＨＣ、ｓｃＦｖ、第１のポリペプチドリンカーＬ１、及び第２のポリペプチドリンカーＬ２を含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む組み換え宿主細胞も提供し、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２であり、ＤＮＡ分子は、本発明の二重特異性抗体のＬＣを含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３であり、細胞は、本発明の二重特異性抗体を発現することができ、該二重特異性抗体は、ＩＬ２３ｐ１９に結合する２つのｓｃＦｖに共役したＣＧＲＰに結合するＩｇＧを含む。

【0044】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体のＨＣ、ｓｃＦｖ、第１のポリペプチドリンカーＬ１、及び第２のポリペプチドリンカーＬ２を含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子で形質転換された組み換え宿主細胞も提供し、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２であり、ＤＮＡ分子は、本発明の二重特異性抗体のＬＣを含むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３であり、該二重特異性抗体は、ＩＬ２３ｐ１９に結合する２つのｓｃＦｖに共役したＣＧＲＰに結合するＩｇＧを含む。

【0045】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体を生成するためのプロセスも提供し、このプロセスは、二重特異性抗体が発現されるような条件下で、本発明の組み換え宿主細胞を培養することと、発現された二重特異性抗体を回収することとを含む。

【0046】

本発明はまた、該プロセスによって生成される、本発明に従う二重特異性抗体も提供する。

【0047】

好ましくは、組み換え宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、及びＣＯＳ細胞からなる群から選択される哺乳動物宿主細胞である。

【0048】

本発明はまた、自己免疫疾患の治療を必要とする患者に、有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法も提供する。

【0049】

本発明はまた、ＣＤ及び／またはＵＣなどのＩＢＤの治療を必要とする患者に、有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む、ＣＤ及び／またはＵＣなどのＩＢＤを治療する方法も提供する。

【0050】

本発明はまた、ＰｓＡ及び／または強直性脊椎炎の治療を必要とする患者に、有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む、ＰｓＡ及び／または強直性脊椎炎を治療する方法も提供する。

【0051】

本発明はまた、治療における使用のための、本発明の二重特異性抗体も提供する。

【0052】

本発明はまた、ＣＤ及び／またはＵＣなどのＩＢＤを含む自己免疫疾患の治療における使用のための、本発明の二重特異性抗体も提供する。

【0053】

本発明はまた、ＰｓＡ及び／または強直性脊椎炎を含む自己免疫疾患の治療における使用のための、本発明の二重特異性抗体も提供する。

【0054】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。

【0055】

本発明の別の実施形態は、潰瘍性大腸炎及び／またはクローン病の治療のための薬物の製造における、本発明の二重特異性抗体の使用を含む。

【0056】

本発明の更なる一実施形態は、乾癬性関節炎及び／または強直性脊椎炎の治療のための薬物の製造における、本発明の二重特異性抗体の使用を含む。

【0057】

定義
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に共役した免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ）を含む分子を指す。本明細書で言及される場合、本発明の二重特異性抗体は、ＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖを含み、各ｓｃＦｖは、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のＮ末端で、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して、該ＩｇＧ抗体に各ＩｇＧ ＨＣのＣ末端で連結され、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２は、ＨＣＶＲ２のＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して、同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２に同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のＮ末端で連結される。本発明の二重特異性抗体のＩｇＧ及びｓｃＦｖは、２つの異なる抗原（それぞれ、ＣＧＲＰ及びＩＬ−２３のｐ１９サブユニット）に特異的に結合する。注目すべきことに、本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットには結合するが、ＩＬ−１２と共有されるＩＬ−２３のｐ４０サブユニットには結合しない。

【0058】

本明細書で言及される場合、「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）という用語は、ポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して接続された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含むポリペプチド鎖を指す。更に、本明細書で言及され（かつ以下の模式図に表され）る場合、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２は、ａ）そのＮ末端で、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して、ＩｇＧの１つのＨＣのＣ末端に連結され、ｂ）Ｌ１は、そのＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して、同一のｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のＮ末端に連結される。更に、本発明の各ｓｃＦｖは、（かつ以下の模式図に表される場合）同一のポリペプチド鎖のＨＣＶＲ２のシステイン残基とＬＣＶＲ２のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド結合を含む。

【化1】

【0059】

本明細書で互換的に使用される「親（ｐａｒｅｎｔ）抗体」または「親（ｐａｒｅｎｔａｌ）抗体」は、例えば、アミノ酸置換及び構造変化を通して、二重特異性抗体のＩｇＧ及びｓｃＦｖのうちの１つの調製において使用されるアミノ酸配列によってコードされた抗体である。親抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であり得る。

【0060】

「Ｋａｂａｔ番号付け」または「Ｋａｂａｔ標識付け」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当該技術分野において認識されているこれらの用語は、ある抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内で他のアミノ酸残基よりも可変的である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。

【0061】

「Ｎｏｒｔｈ番号付け」または「Ｎｏｒｔｈ標識付け」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当該技術分野において認識されているこれらの用語は、ある抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内で他のアミノ酸残基よりも可変的である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指し、少なくとも部分的に、（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１）に記載される多数の結晶構造との親和性伝播クラスター化に基づく。

【0062】

「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物を指し、好ましくはこの用語は、ヒトを指す。特定の実施形態において、対象、好ましくはヒトは、ＩＬ−２３及びＣＧＲＰの両方の生物活性のレベルの低下またはその低下から恩恵を被る、疾患または障害または病態（例えば、自己免疫障害）を更に特徴とする。別の実施形態において、対象、好ましくはヒトは、ＩＬ−２３及びＣＧＲＰの両方の生物活性のレベルの低下またはその低下から恩恵を被る、障害、疾患、または病態を発症するリスクにあることを更に特徴とする。

【0063】

二重特異性抗体の操作
本発明の二重特異性抗体の構築時、化学的及び物理的安定性に関連付けられる重要な問題に遭遇した。遭遇した問題は、不良な発現から無発現、不良な濾過回収率、低い熱安定性、高い塩依存性凝集、ダイアボディ形成（及び濾過を通してダイアボディを低減する上での課題）、高い溶液粘度、低い結合親和性、ならびに交差反応性を含んだ。

【0064】

例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ型式化二重特異性抗体を構築する上での初期の試みは、親ＩＬ−２３抗体（米国特許第９，０２３，３５８号に記載されるＩＬ−２３抗体）が二重特異性抗体のＩｇＧ抗体部分を含み、親ＣＧＲＰ抗体（例えば、米国特許第９，０７３，９９１号を参照されたい）が二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分を含む、構築物を含んだ。初期に試みられた他の構築物はｓｃＦｖ部分を含む親ＩＬ−２３抗体を含んだ一方で、ＣＧＲＰ抗体は二重特異性抗体のＩｇＧ部分を含んだ。更に、初期の構築物は、重鎖及び軽鎖の両方の場合、それぞれアミノ末端またはカルボキシル末端を含む様々な配置で、ＩｇＧ部分に共役したｓｃＦｖ部分を含んだ。更に、初期の構築物は、ＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２の配置の異なるｓｃＦｖ部分を含んだ（例えば、ＩｇＧ部分（ＣまたはＮ末端）−リンカー１−ＬＣＶＲ２またはＨＣＶＲ２−リンカー２−ＬＣＶＲ２またはＨＣＶＲ２のうちの他方）。更に、親ＩＬ−２３抗体構築物は、重鎖生殖系列フレームワークＶＨ５−５１及び１−６９と、軽鎖生殖系列フレームワークＶＫ０２、ＶＫ１２、及びＶＫＢ３との組み合わせを含んだ。親ＣＧＲＰ抗体構築物（ＩｇＧ部分を含む場合）は、定常領域（ＣＨ）内に（天然ＩｇＧ_４に由来する）３つのアミノ酸変異を有するＩｇＧ_４サブクラス構造を含んだ。初期構築物は、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。しかしながら、（上述の）初期に生成された二重特異性構築物は、１つ以上の上述の化学的及び／または物理的問題（複数可）を呈した。例えば、ｓｃＦｖ部分がＮ末端に位置する構築物は、ｓｃＦｖ部分がＣ末端に位置する構築物と比較して、複数の安定性の問題を呈する。

【0065】

二重特異性抗体の静電表面を計算し、荷電したパッチを特定し、破壊した。広範なタンパク質安定性研究を実行し、構築された二重特異性抗体を熱安定性特性ならびに（それぞれの親抗体との比較での）ＣＧＲＰ及びＩＬ−２３結合特性についてスクリーニングした。

【0066】

したがって、化学的及び物理的改変を行って、本発明の二重特異性抗体の化学的及び物理的安定性を改善した。ｓｃＦｖ形式の親ＩＬ−２３抗体に対する改変を、ＨＣＤＲ４、ＨＣＤＲ５、ＬＣＤＲ４、ＬＣＤＲ５、及びＬＣＤＲ６において行って、化学的及び物理的安定性を改善した。構築されたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを、以下の式、ＣＧＲＰ ＩｇＧ（Ｃ−末端）−Ｌ１−ＨＣＶＲ２−Ｌ２−ＬＣＶＲ２に従って、ＩＬ−２３ ｓｃＦｖ形式に組み合わせた。ＩＬ−２３ ｓｃＦｖを安定化するためのジスルフィド結合を、ＩＬ−２３ ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２（Ｇ５０３Ｃ）とＬＣＶＲ２（Ｇ６９４Ｃ）との間に操作した（アミノ酸の番号付けは、表１（ａ）及び（ｂ）に提示の例証される二重特異性抗体に基づいて、直鎖状番号付けを適用する）。更に、エフェクター機能の低減をもたらす、Ｆｃ受容体媒介炎症機構に結合する能力または補体を活性化する能力の低減のため、二重特異性抗体のＩｇＧ部分内の親ＣＧＲＰ抗体をＩｇＧ_４サブクラスに操作した。これらの化学的及び物理的改変を含む、操作したＩＬ−２３ ｓｃＦｖ構築物ＣＧＲＰＩｇＧ構築物を、発現ベクターに挿入した。

【0067】

より具体的には、本発明の二重特異性抗体は、ＩｇＧ_４−ＰＡＡ Ｆｃ部分を含有する。ＩｇＧ_４−ＰＡＡ Ｆｃ部分は、２２７位にセリンからプロリンへの変異（Ｓ２２７Ｐ、配列番号１または配列番号２）、２３３位にフェニルアラニンからアラニンへの変異（Ｆ２３３Ａ、配列番号１または配列番号２）、及び２３４位にロイシンからアラニンへの変異（Ｌ２３４Ａ、配列番号１）を有する。Ｓ２２７Ｐ変異は、半抗体形成（ＩｇＧ_４抗体内の半分子の動的交換の現象）を防ぐヒンジ変異である。Ｆ２３３Ａ及びＬ２３４Ａ変異は、既に低いヒトＩｇＧ_４アイソタイプのエフェクター機能を更に低減する。

【0068】

ＩｇＧ_４サブクラスとしてのＣＧＲＰ ＩｇＧと、６つの異なるＣＤＲ変異（米国特許第９，０２３，３５８号に記載される親ＩＬ−２３抗体と比較して、Ｋ２８Ｐ及びＴ５８ＶでのＨＣＶＲ２（配列番号６）、ならびにＬ３０Ｇ、Ｌ５４Ｋ、Ｅ５５Ｌ、及びＭ９０Ｑ／Ｍ９０ＴでのＬＣＶＲ２（配列番号８または配列番号９））（表１（ａ）及び（ｂ）に反映される、例証される二重特異性抗体に表される、Ｋ４８７Ｐ及びＴ５１７ＶでのＨＣＶＲ２、ならびにＬ６２４Ｇ、Ｌ６４８Ｋ、Ｅ６４９Ｌ、及びＭ６８４Ｑ／Ｍ６８４ＴでのＬＣＶＲ２、アミノ酸の番号付けは、表１（ａ）及び（ｂ）に提示される、例証される二重特異性抗体に基づいて、直鎖状番号付けを適用する）とを有するＩＬ−２３ ｓｃＦｖを含有する二重特異性抗体を、初期の構築物において実証される発現、（親分子と比較して、ＩＬ−２３の）親和性、及び熱安定性の問題を改善するものとして特定した。Ｍ９０Ｔ変異（配列番号９、（米国特許第９，０２３，３５８号に記載される親ＩＬ−２３抗体との比較で）は、ＣＧＲＰ及びＩＬ−２３ｐ１９への結合に悪影響を与えずに分子の光安定性を改善することが見出されている。更に、これらの変異は、カニクイザルにおいてクリアランス率の有意な低減をもたらした。上記の改変のうちのいずれも、親単一抗体の初期の特徴においては特定されなかった。

【0069】

二重特異性抗体の結合及び活性
本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＧＲＰ及びヒトＩＬ２３ｐ１９の両方に結合し、インビトロまたはインビボで、少なくとも１つのヒトＣＧＲＰ生物活性及び少なくとも１つのヒトＩＬ−２３生物活性を中和する。本発明の二重特異性抗体は、インビトロで、ＣＧＲＰの存在及び不在下でＩＬ−２３の阻害剤である。本発明の二重特異性抗体は、インビトロで、ＩＬ−２３の存在及び不在下でＣＧＲＰの阻害剤である。

【0070】

例証される本発明の第１の二重特異性抗体（二重特異性抗体１）は、ヒトＣＧＲＰに対して２６．０±２６．０ｐＭの範囲内の、及びヒトＩＬ２３ｐ１９に対して２１３．０±１８４．０ｐＭの３７℃での結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有することを特徴とする。

【0071】

例証される本発明の第２の二重特異性抗体（二重特異性抗体２）は、ヒトＣＧＲＰに対して約７７．０ｐＭの、及びヒトＩＬ２３ｐ１９に対して２１５ｐＭの３７℃での結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有することを特徴とする。

【0072】

本二重特異性抗体はＣＧＲＰを効果的に中和し、この中和は飽和量のヒトＩＬ−２３の存在によっては影響されない。本二重特異性抗体はヒトＩＬ−２３を効果的に中和し、この中和は飽和量のヒトＣＧＲＰの存在によっては影響されない。

【0073】

二重特異性抗体の発現
それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指向することができる発現ベクターは、当該技術分野において周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチド（複数可）の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであり得る。（ＨＣ、ｓｃＦｖ、Ｌ１、及びＬ２を含む）第１のポリペプチド鎖ならびに（ＬＣを含む）第２のポリペプチド鎖は、それらが１つのベクター内で作動可能に連結している異なるプロモーターから独立して発現されても、またはあるいは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、それらが２つのベクター（１つが第１のポリペプチド鎖を発現し、１つが第２のポリペプチド鎖を発現する）内で作動可能に連結している異なるプロモーターから独立して発現されてもよい。

【0074】

宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、または第１及び第２のポリペプチド鎖の両方を発現する、１つ以上の発現ベクターで安定かつ一過的にトランスフェクト、形質転換、形質導入、または感染されている細胞を含む。本発明の二重特異性抗体を生成する宿主細胞株の作製及び単離は、当該技術分野において既知である標準的技術を使用して達成され得る。哺乳動物細胞は、二重特異性抗体の発現に好ましい宿主細胞である。具体的な哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＤＧ−４４、及びＣＨＯである。好ましくは、二重特異性抗体は、宿主細胞が培養され、二重特異性抗体が回収または精製され得る培地に分泌される。

【0075】

抗体の哺乳動物発現がグリコシル化をもたらすことは、当該技術分野において周知である。典型的には、グリコシル化は、抗体のＦｃ領域内の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で生じる。Ｎ−グリカンは典型的には、アスパラギンに結合する。例として、表１（ａ）及び（ｂ）に提示される、例証される二重特異性抗体の各ＨＣは、配列番号１または配列番号２のアスパラギン残基２９６でグリコシル化される。

【0076】

二重特異性抗体が分泌されている培地は、従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は、従来の方法を使用して、タンパク質ＡまたはＧカラムに適用され、そこから溶出され得る。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって、効果的に除去され得る。生成物は、例えば、−７０℃で直ちに凍結されても、冷蔵されても、または凍結乾燥されてもよい。

【0077】

いくつかの例において、本発明の二重特異性抗体を生成するためのプロセスは、ダイアボディの形成をもたらし得る。ダイアボディは、ｓｃＦｖの二価形成物であり、ＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２領域が単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、可変ドメインが同一のポリペプチド鎖の相補ドメインと対合する代わりに、可変ドメインが他のポリペプチド鎖または異なる分子の相補ドメインと対合する。例えば、二重特異性抗体が第１のポリペプチド（便宜上１Ａ及び１Ｂとし、１Ａ及び１ＢのそれぞれがＨＣ、ｓｃＦｖ、Ｌ１、及びＬ２を含む）、ならびに２つの第２のポリペプチド（便宜上２Ａ及び２Ｂとし、２Ａ及び２ＢのそれぞれがＬＣを含む）を含む場合、１ＡのＨＣＶＲ２は、１ＡのＬＣＶＲ２と対合する代わりに、１ＢのＬＣＶＲ２の相補ドメインと対合する。

【0078】

治療使用
本明細書で使用される場合、「治療」及び／または「治療すること」は、本明細書に記載される障害の進行の緩徐化、妨害、抑止、制御、または停止が存在し得る全てのプロセスを指すことが意図されるが、全ての障害症状の完全な消失は必ずしも示さない。治療は、ＣＧＲＰ及び／もしくはＩＬ−２３のレベルの低下またはＣＧＲＰ及び／もしくはＩＬ−２３の生物活性の低下から恩恵を被る、哺乳動物における、特にヒトにおける、疾患または病態の治療のための本発明の二重特異性抗体の投与を含み、（ａ）疾患の更なる進行を阻害すること、すなわち、その発達を抑止することと、（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくは障害の退行を引き起こすか、またはその症状もしくは合併症を緩和することとを含む。

【0079】

本発明の二重特異性抗体は、ＩＢＤ（ＣＤ及びＵＣなど）、ＰｓＡ、ならびに強直性脊椎炎を含む自己免疫疾患を治療することが期待される。

【0080】

薬学的組成物
本発明の二重特異性抗体は、患者への投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。本発明の二重特異性抗体は、単独で、または単回用量もしくは複数回用量で薬学的に許容される担体及び／もしくは希釈剤とともに、患者に投与され得る。そのような薬学的組成物は、選択された投与様式に適切であるように設計され、薬学的に許容される希釈剤、担体、ならびに／または賦形剤（分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、及び安定剤など）が必要に応じて使用される。該組成物は、例えば、開業医にとって一般に既知である製剤化技術の概要を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２に開示される従来の技術に従って設計され得る。薬学的組成物に好適な担体としては、本発明の二重特異性抗体と組み合わせたときに分子の活性を保持し、かつ患者の免疫系とは非反応性である、任意の材料が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、二重特異性抗体、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

【0081】

本発明の二重特異性抗体を含む薬学的組成物は、本明細書に記載される疾患もしくは障害のリスクにあるか、またはそれを呈する患者に、標準的投与技術を使用して投与され得る。

【0082】

本発明の薬学的組成物は、「有効」量の本発明の二重特異性抗体を含有する。有効量は、所望される治療結果を達成するのに（投薬量及び期間及び投与手段で）必要な量を指す。有効量の二重特異性抗体は、疾患の状態、個体の年齢、性別、体重、ならびに抗体または抗体部分が個体において所望される応答を誘発する能力などの要因に従って変動し得る。有効量はまた、二重特異性抗体のいかなる毒性または有害効果よりも、治療上有益な効果が勝るようなものでもある。

【実施例】

【0083】

別段述べられる場合を除いて、実施例全体を通して言及される、例証される二重特異性抗体は、上記の表１（ａ）及び（ｂ）に明記される、例証される本発明の二重特異性抗体を指す。

【0084】

二重特異性抗体の発現及び精製
上記の表１（ａ）及び（ｂ）に明記される、例証される本発明の二重特異性抗体（二重特異性抗体１）を、本質的に以下のように発現させ、精製する。ＩｇＧ ＨＣ−リンカーＬ１−ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２−リンカーＬ２−ｓｃＦｖ ＬＣＶＲ２を含むポリペプチド（配列番号１のポリペプチド）をコードするＤＮＡポリヌクレオチド配列、及びＩｇＧ ＬＣを含むポリペプチド（配列番号３のポリペプチド）をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチド配列を含有する、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）発現ベクターを、電気穿孔によってＧＳノックアウトチャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ）にトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ初期プロモーター（サルウイルス４０Ｅ）及びＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後の細胞は、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択を受ける。ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用して、選択の厳密性を増加させる。宿主細胞ゲノムの転写活性領域に発現ベクターｃＤＮＡを組み込んだ細胞が、内在的レベルのＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にする。これらのマスターウェルを二重特異性抗体の発現についてスクリーニングし、その後、無血清懸濁培養物中で拡大して、生成に使用する。例証される二重特異性抗体が分泌されている浄化培地を、２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）などの適合性緩衝剤で平衡化したタンパク質Ａ親和性カラムに適用する。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。例えば、２０ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）などのｐＨステップまたは勾配によって、結合した二重特異性抗体を溶出させ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）緩衝剤で中和する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって、二重特異性抗体画分を検出し、その後、プールする。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって、効果的に除去され得る。二重特異性抗体１には、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する。一般的な技術を使用して、二重特異性抗体１を濃縮及び／または無菌濾過する。これらのクロマトグラフィーステップ後の二重特異性抗体１の純度は、９７％超（単量体）である。二重特異性抗体は、−７０℃で直ちに凍結されても、４℃で数ヶ月間保管されてもよい。

【0085】

二重特異性抗体１と比較して、６８４（Ｑ６８４Ｔ）位でスレオニン（Ｔ）をグルタミン（Ｑ）に置換する（配列番号１対配列番号２）、操作された単一アミノ酸変化を組み込む、例証される本発明の第２の二重特異性抗体（本明細書以下、二重特異性抗体２と呼ぶ）を、一過的にトランスフェクトされたＣＨＯ中で、ならびにタンパク質Ａ及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによって発現させる。ＩｇＧ ＨＣ−リンカーＬ１−ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２−リンカーＬ２−ｓｃＦｖ ＬＣＶＲ２を含むポリペプチド（配列番号２のポリペプチド）をコードするＤＮＡポリヌクレオチド配列、及びＩｇＧ ＬＣを含むポリペプチド（配列番号３のポリペプチド）をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチド配列を含有するグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）発現ベクターを、ポリエチレイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｉｍｉｎｅ）による化学処理によってＧＳノックアウトチャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ）に一過的にトランスフェクトする。残りの発現及び精製ステップは、二重特異性抗体１のものと同一である。これらのクロマトグラフィーステップ後の二重特異性抗体２の純度は、９８％超（単量体）である。

【0086】

ＩＬ−２３及びＣＧＲＰに対する二重特異性抗体の結合親和性
ヒトＣＧＲＰ及びヒトＩＬ−２３の結合親和性を、ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５重量体積％の表面活性剤Ｐ２０）泳動緩衝剤で使用準備したＢｉａｃｏｒｅ３０００機器で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定する。４つ全てのフローセル（Ｆｃ）に固定化タンパク質Ａ（標準的ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成）を含有するＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐ／Ｎ ＢＲ−１０００−１２）を使用して、捕捉方法論を用いた。泳動緩衝剤中に希釈することによって、約２μｇ／ｍＬで二重特異性抗体試料を調製する。泳動緩衝剤中に希釈することによって、２５、１２．５、６．２５、３．１３、０．７８、０．３９、０．２０、０．１０、及び０（ブランク）ｎＭの最終濃度でヒトＩＬ−２３を調製する。泳動緩衝剤中に希釈することによって、１２．５、６．２５、３．１３、０．７８、０．３９、０．２０、０．１０、及び０（ブランク）ｎＭの最終濃度でヒトＣＧＲＰを調製する。

【0087】

各分析サイクルは、（１）異なる二重特異性抗体試料を、ヒトＩＬ−２３またはＣＧＲＰのいずれかからの２０−１００ＲＵ最大応答シグナルを促進するレベルで、別個のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、及びＦｃ４）上に捕捉することと、（２）１００μＬ／分、１２０秒間で、４つ全てのＦｃに各ヒトＩＬ−２３またはヒトＣＧＲＰ濃縮を注射し、その後、６００秒間緩衝剤フローに戻して、解離相を監視することと、（３）１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）を、３０秒間１０μＬ／分で全てのセルに注射することによって、チップ表面を再生することと、（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動緩衝剤中でチップ表面を平衡化することとからなる。標準的二重参照を使用してデータを処理し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）を使用して１：１の結合モデルに対してフィットさせて、会合速度（ｋ_ｏｎ、Ｍ^−１ｓ^−１単位）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ、ｓ^−１単位）、及びＲ_ｍａｘ（ＲＵ単位）を決定する。Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの関係から平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算し、これはモル単位によるものである。

【表2】

【表3】

【0088】

これらの結果は、本発明の例証される二重特異性抗体が、３７℃でヒトＩＬ−２３及びヒトＣＧＲＰに結合することを実証する。

【0089】

二重特異性抗体の溶解性及び安定性分析
（ａ）溶解性
二重特異性抗体１を、１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する及び有さない（それぞれＣ６及びＣ６Ｎと省略））中に透析する。分子量フィルター（Ａｍｉｃｏｎ３０ｋＤａ限外濾過フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）を通した遠心分離によって、５０または約１００ｍｇ／ｍＬのいずれかまで試料を濃縮する。両方の試料の一部分に、０．０２体積％の最終濃度になるまでＴｗｅｅｎ−８０を添加する（それぞれＣ６Ｔ及びＣ６ＮＴと更に省略）。冷蔵条件及び室温条件下での溶解性、凍結解凍安定性、及び保管安定性について、選択製剤を分析する。

【0090】

Ｃ６及びＣ６Ｎ製剤において、溶解性は、９５ｍｇ／ｍＬ超の二重特異性抗体濃度として特性評価される。上述のように濃縮した後、沈殿または相分離について試料を室温で目視検査し、その後、暗所で、４℃にて１週間保管し、再目視検査する。−５℃で更に１週間、及び−１０℃で更に１週間保管した後、同一の試料に対してこの手順を繰り返す（溶解した物質のレベルのために、試料は凍結しないことに留意されたい）。溶解性分析の結果を、表４に示す。二重特異性抗体１は、いずれの製剤または保管温度においても、いかなる目に見える沈殿または相分離も示さなかった。

【表4】

【0091】

（ｂ）凍結解凍安定性
製造中、精製された医薬品有効成分（ＡＰＩ）は典型的には、薬物製品（ＤＰ）の前方処理まで凍結状態で保持される。二重特異性抗体１を、高濃度での凍結解凍安定性について試験する。Ｃ６及びＣ６Ｎ中、５０及び１００ｍｇ／ｍＬの製剤を、３回の緩徐な凍結解凍サイクルに供する。凍結及び解凍の速度は、より大きな製造容器内で生じる速度を模倣するように制御する。真空下にない棚凍結乾燥器を使用して、温度サイクルを表５に示されるように制御する。

【表5】

【0092】

３回のサイクル後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、材料を高分子量（ＨＭＷ）ポリマー形成及び１０ミクロン超の粒子の光遮蔽について分析する。結果を、表６に示す。二重特異性抗体１は、全ての試験条件下で一貫して低い割合のＨＭＷポリマーをもたらした。

【表6】

【0093】

（ｃ）冷蔵及び室温安定性
ジェネリック薬物製品（ＤＰ）製剤、１０ｍＭのクエン酸、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する及び有さない（それぞれＣ６Ｔ及びＣ６ＮＴと省略））下の冷蔵及び室温安定性を、２及び４週間の保持時間後、ＳＥＣ及び粒子計数によって評価する。結果を、それぞれ表７及び８に示す。データは、二重特異性抗体１が低い可溶性（ＨＭＷ％）及び不溶性（１０ミクロン以上の粒子数）安定性を有することを実証する。

【表7】

【表8】

【0094】

（ｄ）粘度
室温で、４つの製剤（Ｃ６、Ｃ６Ｎ、Ｃ６Ｔ、及びＣ６ＮＴ）中１００ｍｇ／ｍＬで、二重特異性抗体１の粘度を分析する。２５℃で、１０００秒−１の剪断速度を使用して、ｍ−ＶＲＯＣ（Ｒｈｅｏｓｅｎｓｅ）で測定を行う。結果を表９に示し、Ｃ６Ｎ及びＣ６ＮＴ製剤の両方における二重特異性抗体１の有意に低い粘度を例証する。粘度の有意な低減は、塩含有製剤中の二重特異性抗体１について観察される。

【表9】

【0095】

（ｅ）光安定性
二重特異性抗体１及び二重特異性抗体２の光安定性を、１つの製剤条件（Ｃ６ＮＴ）下、５０ｍｇ／ｍＬタンパク質の濃度で特性評価する。二重特異性抗体１を、２０％のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）Ｅｘｐｅｒｔ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ推奨の曝露レベル（Ｑ１Ｂ−Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ：Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｏｖ １９９６）に曝露する。これは、可視光の２４０，０００ルクス時間、及び４０ワット時間／ｍ^２の近ＵＶ光に等しい。カタログ０４０３０−３０７−ＣＷ可視ランプ及び０４０３０−３０８近ＵＶランプを備えたＢａｈｎｓｏｎ ＥＳ２０００光チャンバ（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｂａｈｎｓｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用する。８，０００ルクスの強度の可視光に３０時間、及び１０ワット／ｍ^２の近ＵＶ光に４時間、試料を曝露する。全ての曝露は、タイプＩホウケイ酸ガラスのＨＰＬＣバイアル内、２５℃である。曝露後、ＨＭＷポリマー形成パーセントをＳＥＣによって決定し、表１０に示す。結果は、二重特異性抗体２内のＱ６８４Ｔ変異（配列番号１対配列番号２）が、分子の光安定性を著しく改善することを実証する。

【表10】

【0096】

ＩＬ−２３及びＣＲＧＰの同時結合
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、本発明の二重特異性抗体がヒトＩＬ−２３及びヒトＣＧＲＰに同時に結合し得るかどうかを判定する。２５℃で平衡化した、ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５重量体積％の界面活性剤Ｐ２０）泳動緩衝剤で、この機器を使用準備する。４つ全てのフローセル（Ｆｃ）に固定化タンパク質Ａ（標準的ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成）を含有するＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｐ／Ｎ ＢＲ１０００−１２）を使用して、二重特異性抗体の捕捉方法論を用いる。二重特異性抗体１及び２を泳動緩衝剤中に希釈し、個々のフローレーンに注射して、約９００ＲＵの抗体を捕捉する。泳動緩衝剤中１０ｎＭのヒトＣＧＲＰを二重特異性抗体表面に注射し、結合を観察する。二重特異性抗体内の全てのＣＧＲＰ結合部位が飽和することを確実にするために、２０ｎＭ及びその後４０ｎＭのＣＧＲＰペプチドの追加の注射を行う。結合シグナルの無〜最小の増加が観察され、これは、全ての利用可能な抗ＣＧＲＰ結合部位が占有されていることを証明する。その後、１５０ｎＭのヒトＩＬ−２３溶液を注射する。二重特異性抗体がＣＧＲＰ及びＩＬ−２３の両方に同時に結合することができる場合、シグナル増加が観察されるはずである。二重特異性抗体１及び２について、結合シグナルの有意な増加が観察され、したがって、これらの二重特異性抗体がヒトＣＧＲＰ及びヒトＩＬ−２３の両方に同時に結合することができることを実証する

【0097】

二重特異性抗体１は、ヒトＩＬ−１２には結合しない
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器を使用して、本発明の二重特異性抗体がヒトＩＬ−１２に結合するかどうかを判定する。述べられない限り、試薬及び材料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入し、測定は２５℃で実行し、ＨＢＳ−Ｐ緩衝剤（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５重量体積％の界面活性剤Ｐ−２０、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））を泳動緩衝剤及び試料緩衝剤として使用する。アミンカップリングキットを使用して、タンパク質Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＣＭ５センサーチップのフローセル１、２、３、及び４に固定化する。二重特異性抗体１（２μｇ／ｍＬに希釈）をまずフローセル２に捕捉する（８０μＬ／分で５秒間の注射によって、二重特異性抗体１捕捉の４６０の応答単位（ΔＲＵ）をもたらす）。フローセル１は、タンパク質Ａのみの対照である。次に、ヒトＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２分間注射（６６７ｎＭ）し、いかなる追加の結合シグナルも観察されない（０ΔＲＵ）。ＩＬ−１２に対して特異的な市販の抗体（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）の商品名で販売される抗ヒトＩＬ−１２抗体）は、ヒトＩＬ−１２に結合する。

【0098】

結果は、二重特異性抗体１がヒトＩＬ−１２には結合しないことを実証する。更に、同一のチップを使用して、抗ＩＬ−１２特異的抗体はヒトＩＬ−１２に結合する。

【0099】

Ｋｉｔ２２５細胞内、インビトロでのＩＬ−２３媒介Ｓｔａｔ３活性の阻害
Ｋｉｔ２２５は、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病を有する患者から確立されたヒトＴ細胞株である。Ｋｉｔ２２５細胞はＩＬ−２３Ｒを天然に発現し、ＳＴＡＴ３のリン酸化及びＳＴＡＴ３パスウェイの活性化によってヒトＩＬ−２３に応答する。ＩＬ−２３がＳＴＡＴ３パスウェイを活性化する能力は、ＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ構築物で安定的にトランスフェクトされたＫｉｔ２２５細胞内のルシフェラーゼ活性を測定することによって評価される。

【0100】

Ｋｉｔ２２５−Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ（クローン３）細胞を、アッセイ培地（１０％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２、及び１×ペニシリンプラスピューロマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０）内で通例通り培養する。アッセイ当日、５００×ｇで５分間（ＲＴ）の遠心分離によって細胞を収集し、大量の無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中に再懸濁する。１ウェル当たり５０，０００個のＫｉｔ２２５細胞（５０μＬ中）を、白色／透明底部のＴＣ処理した９６ウェルプレートに添加し、ヒトＩＬ−２３の存在下、抗体で処理する。

【0101】

各試験について、１ウェル当たり２５μＬの４×抗体溶液を添加する。０〜１２６７９０ｐＭの二重特異性抗体１の用量範囲を評価する（二重特異性抗体１のＭＷに基づく最終濃度、ＭＷ＝１９７１７８Ｄａ）。２５μＬの４×ヒトＩＬ−２３（ｈＩＬ−２３）を、（ＭＷ＝６００００Ｄａに基づいて）５０ｐＭの最終濃度になるまで各ウェルに添加する。「培地単独」及び「ｈＩＬ−２３単独」対照には、アッセイ培地を単独で使用する。０〜１０００００ｐＭの用量範囲（抗体２のＭＷに基づく最終濃度、ＭＷ＝１５００００Ｄａ）で試験した、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットを標的化するＩＬ−２３中和抗体（陽性対照抗体）を陽性対照として使用する。０〜１２６，７９０ｐＭの用量範囲（ＭＷ＝１５００００Ｄａに基づく最終濃度）で試験した、アイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ）を陰性対照として使用する。試験は３連で実行する。９６ウェルプレートを組織培養インキュベーター（３７℃、９５％の相対湿度、５％のＣＯ２）内に４時間置く。１００μＬ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、処理時にアッセイを停止させる。ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ３）を使用して、プレートを読み取る。結果を濃度として表し、５０％のＩＬ−２３誘導性Ｓｔａｔ３活性は、二重特異性抗体１または陽性対照抗体のいずれかによって阻害され（ＩＣ_５０）、データの４つのパラメータのシグモイド曲線フィットを使用して計算される（Ｓｉｇｍａプロット）。

【0102】

結果は、抗体１が、濃度依存的な様式で、Ｋｉｔ２２５細胞内のヒトＩＬ−２３誘導性Ｓｔａｔ３活性を阻害することを実証する。阻害は、陽性対照抗体について観察される阻害と同等である（二重特異性抗体１の１６７１±２３６ｐＭのＩＣ_５０対陽性対照抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体の４６６±３１ｐＭ）。

【0103】

ＣＧＲＰの存在下のＩＣ_５０は上述のものと同等であるため、アッセイへの５０ｎＭのＣＧＲＰの添加は、二重特異性抗体１の活性を改変しない。

【0104】

陰性対照抗体は、いかなる試験濃度でも、Ｋｉｔ２２５細胞内のＳｔａｔ３活性を阻害しない。

【0105】

二重特異性抗体１はヒトＩＬ−２３を効果的に中和し、ＩＬ−２３阻害はＣＧＲＰの存在によっては影響されない。

【0106】

インビトロでの、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＣＧＲＰによって誘導されるｃＡＭＰ生成の阻害
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、ＣＧＲＰ受容体を内在的に発現するヒト神経芽細胞腫細胞株である。この受容体は、細胞内Ｇαｓタンパク質に機能的にカップリングされている。受容体を天然アゴニストで刺激すると、ＣＧＲＰペプチドはｃＡＭＰの合成の増加をもたらす。細胞内に存在するｃＡＭＰの量は、標準的インビトロ技術を使用して検出することができるため、このパラメータを受容体活性の基準として使用する。

【0107】

培養したＳＫ−Ｎ−ＭＣを、１０％の熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補助したＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）内で、約７０％のコンフルエンスになるまで成長させる。新鮮な培地を提供した後、細胞を３７℃で一晩インキュベートする。アッセイ当日、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して細胞を剥離させ、アッセイ緩衝剤（Ｍｇ^＋＋及びＣａ^＋＋を１：２で混合したＨＢＳＳ／ＤＰＢＳ、３．３ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０３％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＩＢＭＸ）中に再懸濁し、３０００〜５０００個／ウェルで、３８４ウェルのポリＤ−リジンコーティングされた白色プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種する。

【0108】

二重特異性抗体１を、１０ｎＭから０．５ｐＭまで、アッセイ緩衝剤中１：３に希釈する（二重特異性抗体のＭＷは２００ｋＤａである）。希釈した二重特異性抗体１、陽性対照抗体（米国特許第９，０７３，９９１号に記載されるＣＧＲＰ中和抗体）、またはアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ）を、ヒトＩＬ−２３（１０ｎＭ、最終濃度）または等体積の緩衝剤と混合し、細胞とともに室温で３０分間インキュベートする。ヒトＣＧＲＰペプチド（Ｂａｃｈｅｍ Ｈ−１４７０）をそのＥＣ_８０濃度（０．８ｎＭ）で添加し、プレートを室温で６０分間インキュベートする。小分子基準拮抗剤（Ｋｂ＝０．０１ｎＭ）である１０ｎＭのＢＩＢＮ４０９６（Ｔｏｃｒｉｓ）を使用して、シグナルウィンドウを確立する。ＨＴＲＦ技術（均一時間分解蛍光測定、Ｃｉｓｂｉｏ）を販売者の説明書に従って使用して、細胞内ｃＡＭＰの量を定量化する。簡潔には、溶解緩衝剤中のｃＡＭＰ−ｄ２共役体及び抗ｃＡＭＰ−クリプテート共役体を、処理した細胞とともに室温で６０〜９０分間インキュベートする。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用してＨＴＲＦシグナルを直ちに検出して、６６５〜６２０ｎＭでの蛍光の比率を計算する。各実験のために生成したｃＡＭＰ標準曲線を使用して、生データをｃＡＭＰ量（ピコモル／ウェル）に変換する。４つのパラメータの理論曲線フィッティングプログラム（ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ｖ５．３．１．２２またはＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ｖ１２．０．４）を使用して、濃度応答曲線の上下範囲から相対ＥＣ_５０値を計算し、等式Ｋｂ＝（ＩＣ５０）／［１＋（［Ａｇ］／ＥＣ５０）］を使用して、アゴニスト補正ＩＣ５０値としてＫｂ値を推定する。

【0109】

結果は、二重特異性抗体１が、用量依存的な様式で、ＣＧＲＰ刺激ｃＡＭＰ生成を阻害することを実証し、推定Ｋｂは０．０２ｎＭであり、最大効果は基準拮抗剤及び陽性対照抗体によって生成されたものに等しい。１０ｎＭのヒトＩＬ−２３の存在は、二重特異性抗体１または陽性対照抗体による阻害には影響を与えなかった。アイソタイプ対照抗体は、いかなる試験濃度でも、ＣＧＲＰ誘導性ｃＡＭＰ生成を阻害しなかった。

【表11】

【0110】

インビボでのヒトＩＬ−２３誘導性マウスＩＬ−２２生成の阻害
ヒトＩＬ−２３の投与は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスにおいてインビボでのマウスＩＬ−２２の発現を誘導する。

【0111】

二重特異性抗体１が、インビボでのマウスＩＬ−２２のヒトＩＬ−２３誘導性発現を遮断するかどうかを理解するために、正常なＢａｌｂ／ｃマウス（Ｎ＝５）に、６７ｎｍ／ｋｇの例証される二重特異性抗体１（分子量２００ｋＤａ）、またはアイソタイプ対照抗体（陰性対照抗体として使用されるヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ、６７ｎｍｏｌ／ｋｇ、分子量１５０ｋＤａ）のいずれかを腹腔内注射する。注射の２日後、マウスを５０ｎｍｏｌ／ｋｇのヒトＩＬ−２３の腹腔内注射によって負荷する。ヒトＩＬ−２３負荷の５時間後、マウスを屠殺し、血清を収集する。市販のＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８８−７４２２−８８）を製造者の説明書に従って使用して、収集した血清をマウスＩＬ−２２発現について分析する。

【表12】

【0112】

結果は、二重特異性抗体１がｍＩＬ−２２発現のヒトＩＬ−２３誘導性増加を遮断することを実証する。二重特異性抗体１で処置したマウスの血清中のマウスＩＬ−２２レベルは、ナイーブマウスの血清中で観察されたマウスＩＬ−２２レベルと同等である（ｐ＜０．０００１、不等分散によるｔ検定）。アイソタイプ対照抗体は、マウスＩＬ−２２のヒトＩＬ−２３誘導性発現を阻害しない。二重特異性抗体１は、インビボでヒトＩＬ−２３を効果的に中和する。

【0113】

二重特異性抗体１の投与は、ラット皮膚血流中のカプサイシン誘導性増加を防ぐ
カプサイシン誘導性レーザードプラ撮像（ＬＤＩ）血流法は、皮膚に局所的に適用され、炎症を誘導するカプサイシン溶液に基づき、これは、ＬＤＩを使用して監視され得る血流の局所的変化によって検出される。この方法は、一過性受容器電位陽イオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）受容体のカプサイシン活性化、その後、皮膚の血管でのＣＧＲＰの局所的放出及びＣＧＲＰ受容体の活性化に依存する。カプサイシン誘導性皮膚血管拡張モデルは、前臨床（ラット、非ヒト霊長類（ＮＨＰ））モデルにおける標的結合を評価するために適用されており、臨床への橋渡しである。この研究の目的は、二重特異性抗体１が、ラット腹部皮膚においてＣＧＲＰ媒介カプサイシン誘導性皮膚血管拡張を防ぐことができるかどうかを判定することである。

【0114】

二重特異性抗体１、陽性対照（米国特許第９，０７３，９９１号に記載されるＣＧＲＰ中和抗体）、及びアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ）を、ＰＢＳ中に調製する。ＬＤＩ測定の５日前に、ルイスラット（１群当たりｎ＝８）を４ｍｇ／ｋｇのそれぞれの抗体で皮下処置し、実験前に一晩絶食させる。研究操作者は、処置に対して盲検である。実験当日、ラット腹部を剪毛し、ＬＤＩ機器（Ｍｏｏｒ ＬＤＩ Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｉｍａｇｅｒ、モデルＬＤＩ２−ＩＲ）下、加熱空気チャンバ内の加熱パッド上にラットを置く。研究全体を通して、温度及びＢＰ監視のために直腸温度計及び血圧測定用カフを使用する。スキャニング前の約２０分間、２．０±０．５％のイソフルラン麻酔下で、ラットを安定化する。この安定化期間中、（可視の血管及び高基礎血流範囲から離れた）３つのネオプレンＯリングの正確な位置付けのために、予備スキャンを得る。ベースライン温度（約３７℃）が安定化した後、撮像スキャンを２回のベースラインスキャンで開始する。第２のスキャンの完了後、８μＬのカプサイシン溶液を３つのＯリングのそれぞれに適用する（６０μＬのＥｔＯＨ、４０μＬのＴｗｅｅｎ２０、及び１００μＬの精製Ｈ_２Ｏの溶液中５０ｍｇのカプサイシン）。２．５分毎のスキャンで、スキャニングを更に２５分間継続する。スキャンの完了後、心臓穿刺を介して血液試料を得て、血漿を分析する。対象となる領域の分析のためにＭｏｏｒ ｖ．５．３ソフトウェアを、ならびに所与の時点での対象となる領域からのシグナルの平均化及びベースライン（ベースライン値は２回のベースラインスキャンの平均であった）からの変化パーセントとして報告される血流の変化の分析のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートを使用して、ＬＤＩ反復スキャンを分析する。分析したデータをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ６に入力して、グラフ化する。ＡＮＯＶＡ、その後、テューキーの多重比較を使用して、統計分析する。結果を図１に例証する（ｎ＝８、ＡＮＯＶＡとともにテューキーの多重比較、＊＊＊アイソタイプ対照抗体と比較してｐ＜０．００１）。

【0115】

二重特異性抗体１及び陽性対照抗体は、ＣＧＲＰ媒介カプサイシン誘導性皮膚血管拡張を阻害する。対照的に、アイソタイプ対照抗体は、ＣＧＲＰ媒介カプサイシン誘導性皮膚血管拡張を阻害しない。

【0116】

サルにおける二重特異性抗体１の非臨床薬物動態
二重特異性抗体１の血清薬物動態を、以下のように決定する。雄のカニクイザルに、６．７ｍｇ／ｋｇの本発明の二重特異性抗体１（ＰＢＳの溶液（ＰＨ７．４）中に調製）を静脈内（Ｎ＝１）または皮下（Ｎ＝２）のいずれかで投与する。

【0117】

血液試料（約１ｍＬ）を収集（大腿静脈から（例えば、抗凝固剤を含有しない）血清分離管へと静脈内で、かつ血清へと処理）を、用量前ならびに後続して、用量の１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２４０、３３６、５０４、及び６７２時間後に収集する。定量的ＭＳによって、血清試料を総ＩｇＧについて分析する。ビオチン化ヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４９−０８）及びストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズで、試料を免疫沈降させる。免疫沈殿後、試料を還元し、アルキル化し、トリプシン消化する。選択されたトリプシンペプチドを抗体曝露の代替基準として使用して、総ＩｇＧ濃度を決定する。Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＣ／ＭＳシステムを使用して、データの検出及び統合を実行する。

【0118】

１００％のカニクイザル血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）中への既知の量の例証される二重特異性抗体の希釈によって、試験抗体の標準曲線を生成する。二重特異性抗体１の標準曲線範囲は、（それぞれ１２，８００ｎｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬの定量化の上限及び下限で）２５〜１２，８００ｎｇ／ｍＬである。

【0119】

ゼロ時間（抗体投与）から投与の６７２時間後までの濃度対時間プロファイルを使用して、薬物動態パラメータ（クリアランス値）を計算し、Ｐｈｏｅｎｉｘ（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ６．４、Ｃｏｎｎｅｃｔ１．４）を使用して、非区画分析を介して決定する。結果を、表１３にまとめる。

【表13】

配列
第１のコードされたポリペプチド；ＩｇＧ ＨＣ、Ｌ１、ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２、Ｌ２、及びｓｃＦｖ ＬＣＶＲ２（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＧＮＹＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＹＥＧＴＧＫＴＶＹＩＱＫＦＡＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＤＹＶＳＧＦＧＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＲＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＧＶＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＷＤＴＧＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＨＩＧＫＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＳＫＬＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

第２のコードされたポリペプチド；ＩｇＧ ＨＣ、Ｌ１、ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２、Ｌ２、及びｓｃＦｖ ＬＣＶＲ２（配列番号２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＧＮＹＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＹＥＧＴＧＫＴＶＹＩＱＫＦＡＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＤＹＶＳＧＦＧＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＲＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＧＶＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＷＤＴＧＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＨＩＧＫＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＳＫＬＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＴＹＷＳＴＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

第３のコードされたポリペプチド；ＩｇＧ ＬＣ（配列番号３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＧＹＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＤＡＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

ＩｇＧ重鎖（配列番号４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＧＮＹＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＹＥＧＴＧＫＴＶＹＩＱＫＦＡＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＤＹＶＳＧＦＧＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬ

ＩｇＧ重鎖可変領域１（ＨＣＶＲ１）（配列番号５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＧＮＹＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＹＥＧＴＧＫＴＶＹＩＱＫＦＡＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＳＤＹＶＳＧＦＧＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

ｓｃＦｖ重鎖可変領域２（ＨＣＶＲ２）（配列番号６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＲＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＧＶＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＷＤＴＧＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

ＩｇＧ軽鎖可変領域１（ＬＣＶＲ１）（配列番号７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＧＹＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＤＡＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

ｓｃＦｖ軽鎖可変領域２（ＬＣＶＲ２）（配列番号８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＨＩＧＫＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＳＫＬＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＴＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

ｓｃＦｖ軽鎖可変領域２（配列番号９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＤＨＩＧＫＦＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＳＫＬＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＴＹＷＳＴＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

ＨＣＤＲ１（配列番号１０）
ＫＡＳＧＹＴＦＧＮＹＷＭＱ

ＨＣＤＲ２（配列番号１１）
ＡＩＹＥＧＴＧＫＴＶＹＩＱＫＦＡＤ

ＨＣＤＲ３（配列番号１２）
ＡＲＬＳＤＹＶＳＧＦＧＹ

ＨＣＤＲ４（配列番号１３）
ＫＡＳＧＹＰＦＴＲＹＶＭＨ

ＨＣＤＲ５（配列番号１４）
ＹＩＮＰＹＮＤＧＶＮＹＮＥＫＦＫＧ

ＨＣＤＲ６（配列番号１５）
ＡＲＮＷＤＴＧＬ

ＬＣＤＲ１（配列番号１６）
ＲＡＳＫＤＩＳＫＹＬＮ

ＬＣＤＲ２（配列番号１７）
ＹＹＴＳＧＹＨＳ

ＬＣＤＲ３（配列番号１８）
ＱＱＧＤＡＬＰＰＴ

ＬＣＤＲ４（配列番号１９）
ＫＡＳＤＨＩＧＫＦＬＴ

ＬＣＤＲ５（配列番号２０）
ＹＧＡＴＳＫＬＴ

ＬＣＤＲ６（配列番号２１）
ＱＱＹＷＳＴＰＦＴ

ＬＣＤＲ６（配列番号２２）
ＱＴＹＷＳＴＰＦＴ

ポリペプチドリンカー１（配列番号２３）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

ポリペプチドリンカー２（配列番号２４）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

ＦＲＨ１−１（配列番号２５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣ

ＦＲＨ１−２（配列番号２６）
ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ

ＦＲＨ１−３（配列番号２７）
ＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣ

ＦＲＨ１−４（配列番号２８）
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

ＦＲＨ２−１（配列番号２９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣ

ＦＲＨ２−２（配列番号３０）
ＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧ

ＦＲＨ２−３（配列番号３１）
ＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣ

ＦＲＨ２−４（配列番号３２）
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

ＦＲＬ２−１（配列番号３３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ

ＦＲＬ２−２（配列番号３４）
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩ

ＦＲＬ２−３（配列番号３５）
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ

ＦＲＬ２−４（配列番号３６）
ＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

ＦＲＬ１−１（配列番号３７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ

ＦＲＬ１−２（配列番号３８）
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩ

ＦＲＬ１−３（配列番号３９）
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ

ＦＲＬ１−４（配列番号４０）
ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

重鎖定常領域（配列番号４１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬ

軽鎖定常領域（配列番号４２）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]