特許 6594860 シアル酸付加の定量的調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6594860

(24)【登録日】2019年10月4日

(45)【発行日】2019年10月23日

(54)【発明の名称】シアル酸付加の定量的調節

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/18 20060101AFI20191010BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20191010BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20191010BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20191010BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20191010BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20191010BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20191010BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/18ZNA

   C12P19/44

   C12N15/56

   C12N15/54

   C12P21/02 A

   !C12N9/10

   !C12N9/24

【請求項の数】9

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-515718(P2016-515718)

(86)(22)【出願日】2014年5月16日

(65)【公表番号】特表2016-520315(P2016-520315A)

(43)【公表日】2016年7月14日

(86)【国際出願番号】EP2014060101

(87)【国際公開番号】WO2014191240

(87)【国際公開日】20141204

【審査請求日】2017年5月8日

(31)【優先権主張番号】13169714.6

(32)【優先日】2013年5月29日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】13175390.7

(32)【優先日】2013年7月5日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】エンゲル，アルフレート

(72)【発明者】

【氏名】グライフ，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ユング，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ミューラー，ライナー

(72)【発明者】

【氏名】ゾベック，ハラルト

(72)【発明者】

【氏名】ズップマン，ベルンハルト

(72)【発明者】

【氏名】マリク，セバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】トマン，マルコ

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１４９９９９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１３／０５０３３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１４３７１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１９９８９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３７１６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０８３６８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５０９５１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１１３８６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS，２０１２年 ５月３０日，Vol. 382, No. 1，pp. 167-176

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １９／００−２１／０８

Ｃ１２Ｎ ９／１０

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分おけるα２，６グリコシド結合を加水分解する方法であって、該部分はシアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造であり、該方法は、
（ａ）前記糖タンパク質のグリカン部分において末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含むシアル酸付加糖タンパク質または糖脂質を、水溶液中で提供し；
（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩをインキュベーションし、ここで該Ｎ末端一部切除は配列番号１の１位〜８９位の連続配列である；
それによって、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分中のα２，６グリコシド結合を加水分解する工程を含む、前記方法。

【請求項2】

調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法であって
（ａ）緩衝塩、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲のｐＨ、及び二価イオンを含有し、０℃〜４０℃の範囲の温度である水溶液中、グリコシル化ターゲット分子を提供し、ここで、ターゲット分子が糖タンパク質および糖脂質より選択され、ターゲット分子が、複数のアンテナを含み、アンテナの少なくとも２つが各々、末端構造として、ガラクトシル残基中のＣ６位でヒドロキシル基を含むβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有し；
（ｂ）工程（ａ）のターゲット分子を、第一のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩと、そしてドナー化合物として、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはその機能的同等物の存在下で、インキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基［＝α２，６シアル酸付加末端アンテナ残基］を形成し、それによって、シアル酸付加ターゲット分子を提供し、ここで該Ｎ末端一部切除は配列番号１の１位〜８９位の連続配列である；続いて、
（ｃ）工程（ｂ）のシアル酸付加ターゲット分子を、第二のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩとインキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基中のα２，６グリコシド結合を加水分解し；
それによって、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する
工程を含む、前記方法。

【請求項3】

工程（ｂ）および（ｃ）の間に、ターゲット分子のシアル酸付加を定量的に決定する、請求項２記載の方法。

【請求項4】

工程（ｃ）の後、ターゲット分子のシアリル化を定量的に決定する、請求項２または３記載の方法。

【請求項5】

工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、同じ容器中で連続して行う、請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。

【請求項6】

ターゲット分子が、ＩｇＧクラスの精製免疫グロブリン分子である、請求項２〜５のいずれか一項記載の方法。

【請求項7】

ターゲット分子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４より選択される免疫グロブリンクラスのモノクローナル抗体である、請求項２〜６のいずれか一項記載の方法。

【請求項8】

測定した量のターゲット分子を用いて、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、同じ容器中で連続して行う、ここで工程（ｂ）を２４時間行い、そして続く工程（ｃ）を７２時間またはそれより長く行い、そしてここで、一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が６０％〜７５％である、請求項６または７記載の方法。

【請求項9】

ターゲット（免疫グロブリン）分子：ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ分子の重量対重量［ｗ／ｗ］比が１０：１であり、各々が８０％またはそれより高い相対純度を有する、請求項８記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、Ｎ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）欠失を有する特定のグリコシルトランスフェラーゼ変異体の使用に関する。以前の知見とは対照的に、特定の一部切除、特に、それぞれの野生型ポリペプチドの最初の８９ Ｎ末端アミノ酸を含む一部切除欠失を有するヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ(ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ)の変異体がシアリダーゼ酵素活性を示すことが見出された。本開示に文書化される基本的な発見は、グリコシル部分のトランスファーならびにその加水分解を触媒することが可能なこの酵素の変異体が存在することである。したがって、開示するのは、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの特定の例示的な変異体、該酵素をコードする核酸、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ変異体を組換え的に産生するための方法および手段、ならびにその使用、特に免疫グロブリンなどの糖タンパク質の一部であるグリカン部分の末端アクセプター基に、定量的に調節された方式でシアル酸付加するための使用である。

【発明の概要】

【0002】

トランスフェラーゼ（ＥＣ２）は、１つの物質から別の物質への官能基のトランスファーを触媒する。酵素のスーパーファミリーであるグリコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質、糖脂質およびグリコサミノグリカンの炭水化物部分を合成する際に関与する。特定のグリコシルトランスフェラーゼは活性化された糖ドナーの単糖部分をアクセプター分子に連続してトランスファーすることによって、オリゴ糖を合成する。したがって、「グリコシルトランスフェラーゼ」は、ヌクレオチドドナーから、ポリペプチド、脂質、糖タンパク質または糖脂質のアクセプター部分への糖部分のトランスファーを触媒する。このプロセスはまた、「グリコシル化」としても知られる。例えば糖タンパク質の構造部分である炭水化物部分はまた、「グリカン」とも呼ばれる。グリカンは、すべての既知の翻訳後タンパク質修飾のうち、最もよく見られる修飾を構成する。グリカンは、接着、免疫反応、神経細胞遊走および軸索伸張のように多様な、広い範囲の生物学的認識プロセスに関与する。糖タンパク質の構造部分として、グリカンはまた、タンパク質フォールディング、ならびにタンパク質安定性および生物学的活性の補助においても役割を果たす。

【0003】

グリコシルトランスフェラーゼ触媒において、単糖単位グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＵＡ）およびキシロースは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−α−Ｄ誘導体として活性化され；アラビノースは、ＵＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化され；マンノース（Ｍａｎ）およびフコースは、それぞれ、ＧＤＰ−α−ＤおよびＧＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化され；そしてシアル酸（＝Ｎｅｕ５Ａｃ；＝ＳＡ）は、β−Ｄ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ誘導体として活性化される。

【0004】

多くの異なるグリコシルトランスフェラーゼがグリカン合成に寄与する。糖タンパク質の炭水化物部分の構造的多様性は特に大きく、そしてこれは、複雑な生合成経路によって決定される。真核生物において、糖タンパク質のグリカン部分の生合成は、小胞体（「ＥＲ」）およびゴルジ体の管腔で行われる。糖タンパク質の単一（分枝または直鎖）炭水化物鎖は、典型的には、ＮまたはＯ連結グリカンである。翻訳後プロセシング中、炭水化物は、典型的には、アスパラギンを通じて（「Ｎ連結グリコシル化」）、あるいはセリンまたはスレオニンを通じて（「Ｏ連結グリコシル化」）、ポリペプチドに連結される。グリカン合成は、ＮまたはＯ連結のいずれであっても（＝「Ｎ／Ｏ連結」）、いくつかの異なる膜係留グリコシルトランスフェラーゼの活性によって達成される。糖タンパク質は、１またはそれより多いグリカン連結アミノ酸（＝「グリコシル化部位」）を含むことも可能である。特定のグリカン構造は、直鎖または分枝いずれでもよい。分枝は、炭水化物の顕著な特徴であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびポリペプチドには典型的な直鎖性質とは対照的である。これらの基本的構築ブロック、単糖が非常に不均一であることと組み合わせて、グリカン構造は高い多様性を示す。さらに、特定の糖タンパク質種のメンバーでは、特定のグリコシル化部位に付着するグリカンの構造は多様であることも可能であり、したがって、それぞれの糖タンパク質種の微少不均一性を生じ、すなわちポリペプチド部分の同じアミノ酸配列を共有する種が生じる。

【0005】

シアリルトランスフェラーゼ（＝「ＳＴ」）は、ドナー化合物から（ｉ）糖脂質またはガングリオシドの末端単糖アクセプター基への、または（ｉｉ）糖タンパク質のＮ／Ｏ連結グリカンの末端単糖アクセプター基への、シアル酸（＝５−Ｎ−アセチルノイラミン酸＝Ｎｅｕ５Ａｃ＝ＮＡＮＡ）残基のトランスファーを触媒する、グリコシルトランスフェラーゼである。ヒトＳＴ種を含む哺乳動物シアリルトランスフェラーゼに関しては、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（＝ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ＝ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）である共通のドナー化合物がある。シアル酸残基のトランスファーはまた、「シアル酸付加する」および「シアル酸付加」とも称される。

【0006】

シアル酸付加糖タンパク質のグリカン構造において、（１またはそれより多い）シアリル部分は、通常、オリゴ糖の末端位に見られる。末端、すなわち曝露される位であるため、シアル酸は、多くの異なる生物学的認識現象に関与し、そして異なる種類の生物学的相互作用において働くことも可能である。糖タンパク質中に１より多いシアル酸付加部位が存在してもよく、すなわちシアリルトランスフェラーゼの基質として働くことが可能であり、そしてシアル酸残基のトランスファーに適したアクセプター基であることも可能な部位が存在してもよい。こうした１より多い部位は、原理上、糖タンパク質の異なるグリコシル化部位に係留される、複数の直鎖グリカン部分の末端であることも可能である。さらに、分枝グリカンは、シアル酸付加が起こりうる複数の部位を有しうる。

【0007】

現在の知識によれば、末端シアル酸残基は、（ｉ）ガラクトシル−Ｒに連結されるα２→３（α２，３）、（ｉｉ）ガラクトシル−Ｒに連結されるα２→６（α２，６）、（ｉｉｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミニジル−Ｒに連結されるα２→６（α２，６）、（ｉｖ）Ｎ−アセチルグルコサミニジル−Ｒに連結されるα２→６（α２，６）、および（ｖ）シアリジル−Ｒに連結されるα２→８／９（α２，８／９）、式中、−Ｒはアクセプター基質部分の残りを示す、に見出されうる。したがって、シアリルコンジュゲート（＝「シアル酸付加」）の生合成において活性であるシアリルトランスフェラーゼは、一般的に、それぞれの単糖アクセプター基質にしたがって、そして触媒するグリコシド結合の３、６または８／９位にしたがって命名され、そして分類される。したがって、当該技術分野に知られる文献において、例えばＰａｔｅｌ ＲＹら， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６（２００６）１０８−１１６において、真核生物シアリルトランスフェラーゼに対する言及は、グリコシド結合を形成する間に、Ｎｅｕ５Ａｃ残基がトランスファーされるアクセプター糖残基のヒドロキシル位に応じて、例えば（ｉ）ＳＴ３Ｇａｌ、（ｉｉ）ＳＴ６Ｇａｌ、（ｉｉｉ）ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ、または（ｖ）ＳＴ８Ｓｉａとされる。より一般的な方式において、シアリルトランスフェラーゼに対する言及はまた、例えばＳＴ３、ＳＴ６、ＳＴ８とされることも可能である；したがって、「ＳＴ６」は、具体的には、α２，６シアル酸付加を触媒するシアリルトランスフェラーゼを含む。

【0008】

二糖部分β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）は、糖タンパク質のＮ連結グリカンのアンテナにしばしばある末端残基であるが、また、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質にも存在しうる。酵素、β−ガラクトシド−α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（＝「ＳＴ６Ｇａｌ」）は、グリカンの末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃまたはグリカンの分枝（＝「アンテナ」）のα２，６−シアル酸付加を触媒することが可能である。この一般的な側面に関しては、ＤａｌｌＯｌｉｏ Ｆ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ １７（２０００）６６９−６７６の文書に言及される。ヒトおよび他の哺乳動物において、ＳＴ６Ｇａｌのいくつかの種があるようである。本開示は特に、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（＝ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；ＩＵＢＭＢ酵素命名法にしたがってＥＣ ２．４．９９．１）を扱うが、これに限定されない。

【0009】

シアリルトランスフェラーゼのＳＴ６群は、２つの下位群、ＳＴ６ＧａｌおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃを含む。ＳＴ６Ｇａｌ酵素の活性は、グリカン中の末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃまたはグリカンのアンテナの一部である未結合（ｆｒｅｅ）ガラクトシル残基のＣ６ヒドロキシル基への、Ｎｅｕ５Ａｃ残基のトランスファーを触媒し、それによって、グリカンにおいて、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ部分のガラクトシル残基に連結された末端シアル酸残基α２→６を形成する。グリカン中に生じる新規に形成される末端部分は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃである。

【0010】

本文書提出時点で、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の野生型ポリペプチドは、公的にアクセス可能なＮＣＢＩデータベースにおいて「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５９０７．１」として開示された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１１５４４５）。コード配列を含むさらなる情報は、データベースエントリー「ＧｅｎｅＩＤ：６４８０」内にコンパイルされるハイパーリンクとして提供される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６４８０）。

【0011】

哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、他の哺乳動物ゴルジ常在グリコシルトランスフェラーゼと、（ｉ）短い細胞質Ｎ末端テール、（ｉｉ）膜貫通断片、その後、（ｉｉｉ）様々な長さのステム領域および（ｉｖ）ゴルジ体の管腔に向いたＣ末端触媒ドメインを含む、いわゆる「ＩＩ型構造」を共有する（Ｄｏｎａｄｉｏ Ｓ．ら Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８５（２００３）３１１−３２１中）。哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、その触媒ドメイン中に有意な配列相同性を示すようである。

【0012】

Ｄｏｎａｄｉｏ Ｓ．らは、ＣＨＯ細胞において、ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのいくつかのＮ末端一部切除変異体を発現させ、そして最初の３５、４８、６０および８９アミノ酸を含むＮ末端欠失が、突然変異酵素を生じるが、それにもかかわらず、なおシアル酸を外因性アクセプターにトランスファーする活性を有する。

【0013】

グリコシル化は、タンパク質フォールディング、安定性、および生物学的活性の制御に影響を及ぼす、タンパク質の重要な翻訳後修飾である。シアリル部分（＝シアル酸、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ）は、通常、Ｎグリコシル化の末端位で曝露され、そしてしたがって生物学的認識およびリガンド機能の主要な寄与因子であり、例えば末端シアル酸を特徴とするＩｇＧは、より少ない炎症反応および増加した血清半減期を誘導することが示された。

【0014】

定義されるグリカン構造の酵素的合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、抗体などの療法タンパク質のＮグリコシル化を導くツールとなりつつある。原核生物起源のグリコシルトランスフェラーゼは、通常、複雑な糖タンパク質構造に作用しないため、哺乳動物起源のシアリルトランスフェラーゼが好ましい。例えば、Ｂａｒｂら（２００９）は、単離されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いて、免疫グロブリンＧのＦｃ断片の非常に強力なシアル酸付加型を調製した。しかし、療法適用のための組換えＳＴ６Ｇａｌ−Ｉへのアクセスは、なお、多様な宿主（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））において、低発現および／または劣った活性のため、制限されている。

【0015】

当該技術分野には、複雑なターゲット分子、例えば糖タンパク質または糖脂質にｉｎ ｖｉｔｒｏでシアル酸付加するために、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが好適に使用可能であることが知られる。しかし、反対の反応（シアリダーゼ活性、グリカン部分からの末端シアリル残基の加水分解的切断）は、典型的には、ノイラミニダーゼによって提供される。本発明者らによる独自の発見は、しかし、哺乳動物起源のシアリルトランスフェラーゼの変異体が、シアリダーゼ活性を示すというものである。実際、Ｎ末端が一部切除されたヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ−Ｉの特定の変異体は、（ｉ）ターゲット糖タンパク質のシアル酸付加、および（ｉｉ）シアル酸付加ターゲット糖タンパク質からのシアリル残基の加水分解的切断の両方のために使用可能である。変異体酵素の動力学の調節に応じて、シアル酸付加を定量的に調節することも可能である。すなわち、本開示は、ターゲット分子の２またはそれより多く、あるいはさらにすべてのアクセプター部位にシアル酸付加するのとは対照的に、いくつかのアクセプター部位のうちの１つのみにシアル酸付加することを可能にする手段、方法および条件を提供する。

【0016】

これは、特に免疫グロブリンの、そしてまた他のグリコシル化ターゲット分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ糖鎖工学分野において、いくつかの異なるアプローチのための道を開く。本明細書において、特に、そして例示的に、主に一シアル酸付加または二シアル酸付加された免疫グロブリンＧ分子産生を生じる方法を提供する。しかし、シアル酸付加しようとするターゲット分子の定量的シアル酸付加調節を伴う、いくつかの他のｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸付加アプローチが実行可能となり、そしてこれらを本開示から推定することも可能である。

【0017】

特定の態様において、本文書は、ＨＥＫ２９３細胞における一過性遺伝子発現によって、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ、ＥＣ ２．４．９９．１；データベースエントリーＰ１５９０７）のΔ８９ Ｎ末端一部切除変異体の高収率の発現をさらに開示し、収量は１００ｍｇ／Ｌに達し、驚くほど特徴的なシアル酸付加活性を特徴とする。

【0018】

発明の概要
第一の側面において、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分であって、シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である前記部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用を開示する。

【0019】

さらなる側面において、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分であって、シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である前記部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解する方法であって、（ａ）前記糖タンパク質のグリカン部分において末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含むシアル酸付加糖タンパク質または糖脂質を、水溶液中で提供し；（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩをインキュベーションし；それによって、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分中のα２，６グリコシド結合を加水分解する工程を含む、前記方法を開示する。

【0020】

さらにさらなる側面において、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法であって、（ａ）水溶液中、およびグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許可する条件下で、グリコシル化ターゲット分子を提供し、ここで、ターゲット分子が糖タンパク質および糖脂質より選択され、ターゲット分子が、複数のアンテナを含み、アンテナの少なくとも２つが各々、末端構造として、ガラクトシル残基中のＣ６位でヒドロキシル基を含むβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有し；（ｂ）工程（ａ）のターゲット分子を、第一のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩと、そしてドナー化合物として、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはその機能的同等物の存在下で、インキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基（単数または複数）［＝α２，６シアル酸付加末端アンテナ残基（単数または複数）］を形成し、それによって、シアル酸付加ターゲット分子を提供し；（ｃ）工程（ｂ）のシアル酸付加ターゲット分子を、第二のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩとインキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基中のα２，６グリコシド結合を加水分解し；それによって、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する工程を含む、前記方法を開示する。

【0021】

さらにさらなる側面において、ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、調製物中の二シアル酸付加ターゲット分子の量が約３５％〜約９０％であり、調製物が本明細書に開示するような方法によって得られる、グリコシル化ターゲット分子の調製物を開示する。

【0022】

さらにさらなる側面において、ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、調製物中の一シアル酸付加ターゲット分子の量が約６０％〜約７５％であり、調製物が本明細書に開示するような方法によって得られる、グリコシル化ターゲット分子の調製物を開示する。

【0023】

さらにさらなる側面において、ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、調製物中の一および二シアル酸付加ターゲット分子の量が調節された量であり、調製物が本明細書に開示するような方法によって得られる、グリコシル化ターゲット分子の調製物を開示する。

【0024】

さらにさらなる側面において、薬学的組成物を調製するための、本明細書開示のグリコシル化免疫グロブリン分子の調製物の使用を開示する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】精製組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：分子量マーカー；レーン２：精製酵素、５μｇをゲル上に装填した。

【図2】組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いたＭＡＢ＜ＩＬ−１Ｒ＞のシアル酸付加の時間経過。

【図3-1】異なるシアル酸付加ターゲット分子種の相対含量の決定に関する基礎として取ったマススペクトルによって示されるような、組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉによって触媒される、Ｇ２＋２ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡの形成の動力学。

【図3-2】異なるシアル酸付加ターゲット分子種の相対含量の決定に関する基礎として取ったマススペクトルによって示されるような、組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉによって触媒される、Ｇ２＋２ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡの形成の動力学。

【図3-3】異なるシアル酸付加ターゲット分子種の相対含量の決定に関する基礎として取ったマススペクトルによって示されるような、組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉによって触媒される、Ｇ２＋２ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡの形成の動力学。

【図4】ＣＴＰによる組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性の阻害。末端ガラクトース残基を含むグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ、「アシアロ」）、一シアル酸付加グリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）および二シアル酸付加グリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）の相対量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が別に明白に示さない限り、一般的に複数の指示対象が含まれる。本明細書において、「複数」は、１より多いことを意味する。例えば、複数は、少なくとも２、３、４、５またはそれより多くを指す。具体的に言及されるかまたは文脈より明らかでない限り、本明細書において、用語「または」は包括的であると理解される。

【0027】

具体的に言及されるかまたは文脈より明らかでない限り、本明細書において、用語「約」は、当該技術分野の通常の許容の範囲内と理解され、例えば平均の２標準偏差以内である。「約」は、言及する値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解されうる。文脈から別に明らかでない限り、本明細書に提供するすべての数値は、用語「約」によって修飾可能である。

【0028】

用語「アミノ酸」は、一般的に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質内に取り込まれうる、任意の単量体単位を指す。本明細書において、用語「アミノ酸」には、以下の２０の天然または遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸が含まれる：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは、「任意のアミノ酸」と定義されるべきである。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えばＳｔｒｙｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第５版， Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２００２）に示される。さらなるアミノ酸、例えばセレノシステインおよびピロールリジンもまた、遺伝的にコードされうる（Ｓｔａｄｔｍａｎ（１９９６）“Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎ，” Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５：８３−１００およびＩｂｂａら（２００２）“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ： ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ，” Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １２（１３）：Ｒ４６４−Ｒ４６６）。用語「アミノ酸」にはまた、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば修飾側鎖および／または主鎖を有する）、およびアミノ酸類似体も含まれる。例えば、Ｚｈａｎｇら（２００４）“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１（２４）：８８８２−８８８７、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４） “Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｃｏｄｏｎ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１（２０）：７５６６−７５７１、Ｉｋｅｄａら（２００３） “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． １６（９）：６９９−７０６、Ｃｈｉｎら（２００３） “Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３５）：９６４−９６７、Ｊａｍｅｓら（２００１） “Ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． １４（１２）：９８３−９９１、Ｋｏｈｒｅｒら（２００１） “Ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ａｍｂｅｒ ａｎｄ ｏｃｈｒｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ： Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９８（２５）：１４３１０−１４３１５、Ｂａｃｈｅｒら（２００１） “Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ ａｎ Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ Ｔｏｘｉｃ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ，” Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８３（１８）：５４１４−５４２５、Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら（２０００） “Ａ Ｍｕｔａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｕｔｉｌｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｏｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（５１）：４０３２４−４０３２８、およびＢｕｄｉｓａら（２００１） “Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｛ｂｅｔａ｝−（ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）ａｌａｎｉｎｅｓ ａｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １０（７）：１２８１−１２９２を参照されたい。さらに例示するため、アミノ酸は、典型的には、置換または非置換アミノ基、置換または非置換カルボキシ基、および１またはそれより多い側鎖または基、あるいはこれらの基いずれかの類似体を含む有機酸である。例示的な側鎖には、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組み合わせが含まれる。他の代表的なアミノ酸には、限定されるわけではないが、光活性化可能架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有または非共有相互作用するアミノ酸、光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）および／または光異性体化可能（ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ）アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的切断可能および／または光切断可能アミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１またはそれより多い毒性部分を含むアミノ酸が含まれる。

【0029】

用語「タンパク質」は、リボソーム翻訳プロセスの産物としてのポリペプチド鎖（アミノ酸配列）を指し、ここでポリペプチド鎖は翻訳後フォールディングプロセスを経て、三次元タンパク質構造を生じる。用語「タンパク質」はまた、１またはそれより多い翻訳後修飾、例えば（限定されるわけではないが）グリコシル化、リン酸化、アセチル化およびユビキチン化を含むポリペプチドもまた含む。

【0030】

本明細書に開示するような任意のタンパク質、特に本明細書に開示するような組換え産生タンパク質は、特定の態様において、「タンパク質タグ」を含むことも可能であり、該タグは、組換えタンパク質上に遺伝的に移植されるペプチド配列である。タンパク質タグは、タンパク質分解によってタグの除去を促進する、特異的プロテアーゼ切断部位を持つリンカー配列を含むことも可能である。特定の態様として、ターゲットタンパク質に「アフィニティタグ」を付随させて、アフィニティ技術を用いてターゲットが未精製生物学的供給源から精製可能であるようにする。例えば、供給源は、ターゲットタンパク質を発現する、形質転換された宿主生物、または形質転換された宿主生物によってターゲットタンパク質が分泌される培養上清であってもよい。アフィニティタグの特定の態様には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、広く用いられるタンパク質タグであり、特定の金属キレートマトリックスへの結合を促進する。

【0031】

用語「キメラタンパク質」、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」の各々は、等しく、そのアミノ酸配列が少なくとも２つの別個のタンパク質由来のアミノ酸配列の下位配列の融合産物に相当するタンパク質を指す。融合タンパク質は、典型的には、アミノ酸配列の直接操作によっては産生されず、むしろ、キメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。

【0032】

用語「組換え」は、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。用語「組換え核酸」によって、本明細書において、一般的に、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで元来形成され、天然に通常見られない形である核酸を意味する。したがって、直鎖型の単離された突然変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、または通常連結されていないＤＮＡ分子を連結することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、どちらも、本発明の目的のため、組換えと見なされる。ひとたび組換え核酸が作製され、そして宿主細胞内に再導入されると、非組換え的に、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ操作よりもむしろ、宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏ細胞機構を用いて、複製するであろう；しかし、ひとたび組換え的に産生されたこうした核酸は、続いて非組換え的に複製されるが、なお、本発明の目的のため、組換えと見なされる。「組換えタンパク質」または「組換え的に産生されたタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち上述のような組換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。

【0033】

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置された際、「機能可能であるように連結され」ている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これらがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、該配列に機能可能であるように連結されており；あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。

【0034】

用語「宿主細胞」は、単細胞原核生物および真核生物（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、および放線菌）、ならびに細胞培養中で増殖している場合のより高次の植物または動物由来の単細胞の両方を指す。

【0035】

用語「ベクター」は、外来ＤＮＡ片を挿入することが可能な、典型的には二本鎖のＤＮＡ片を指す。ベクターは例えばプラスミド起源のものであってもよい。ベクターは、宿主細胞中のベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有する。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に天然には見られないＤＮＡであり、例えばベクター分子を複製するか、選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードするか、あるいは導入遺伝子をコードする、異種ＤＮＡと定義される。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞内に輸送するために用いられる。ひとたび宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立にまたはそれと同時に複製することも可能であり、そしてベクターおよびその挿入ＤＮＡの数コピーを生成することも可能である。さらに、ベクターはまた、挿入ＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、または別の方式で挿入ＤＮＡの複数コピーのＲＮＡへの複製を引き起こす、必要な要素も含有することも可能である。いくつかの発現ベクターは、さらに、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させ、そして／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接する配列要素を含有する。したがって、挿入ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多くの分子が迅速に合成可能である。

【0036】

用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用可能であり、そしてリボース核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー、あるいはその類似体に対応させうる、ポリマーを指す。これには、ＲＮＡおよびＤＮＡなどのヌクレオチドのポリマー、ならびにその合成型、修飾型（例えば化学的にまたは生化学的に修飾された型）、および混合ポリマー（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡサブユニット両方を含む）が含まれる。例示的な修飾には、メチル化、１またはそれより多い天然存在ヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、ペンデント（ｐｅｎｄｅｎｔ）部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレ−ター、アルキル化剤、および修飾連結（例えばアルファアノマー核酸等）が含まれる。やはり含まれるのは、水素結合および他の化学的相互作用を通じて、設計される配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する、合成分子である。典型的には、ヌクレオチド単量体は、ホスホジエステル結合を通じて連結されるが、核酸合成型は、他の連結を含んでもよい（例えばＮｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００， １９９１）に記載されるようなペプチド核酸）。核酸は、例えば、染色体または染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ、およびプライマーであってもよいし、またはこれらを含んでもよい。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよいし、そして任意の特定の長さに限定されない。別に示されない限り、特定の核酸配列は、明確に示す任意の配列に加えて、相補配列を含むかまたはコードする。

【0037】

用語「グリコシル化」は、アクセプター基にグリコシル残基を共有カップリングさせる化学反応を示す。１つの特定のアクセプター基は、ヒドロキシル基、例えば別の糖のヒドロキシル基である。「シアル酸付加」は、グリコシル化の特定の型であり、アクセプター基をシアル酸（＝Ｎ−アセチルノイラミン酸）残基と反応させる。こうした反応は、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をドナー化合物または補助基質として用いて、典型的にはシアリルトランスフェラーゼ酵素によって触媒される。

【0038】

「シアル酸付加」は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する条件下での、該活性（特定の場合、シアリルトランスフェラーゼ酵素活性）の結果の特定の態様である。一般的に、当業者は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素反応を実行可能である（＝「グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する」）水性緩衝液が、特にｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲、より具体的にはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲に緩衝可能な、さらにより具体的には約ｐＨ６．５の溶液に緩衝可能な、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、または別の緩衝塩などの緩衝塩を用いて緩衝される必要があることを認識する。緩衝剤はさらに、限定されるわけではないがＮａＣｌなどの中性塩を含有することも可能である。さらに、特定の態様において、当業者は、二価イオン、例えばＭｇ^２＋またはＭｎ^２＋を含む塩、例えば限定されるわけではないがＭｇＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２を水性緩衝液に添加することを考慮することも可能である。当該技術分野に知られるグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許容する条件には、周囲温度（室温）が含まれるが、より一般的には、０℃〜４０℃、特に１０℃〜３０℃、特に２０℃の範囲の温度が含まれる。

【0039】

用語「グリカン」は、多糖またはオリゴ糖、すなわち、酸加水分解に際して、複数の単糖を生じる多量体化合物を指す。糖タンパク質は、典型的にはアスパラギンまたはアルギニンを通じて（「Ｎ連結グリコシル化」）あるいはセリンまたはスレオニンを通じて（「Ｏ連結グリコシル化」）、ポリペプチド鎖の側鎖に共有結合している、１またはそれより多くのグリカン部分を含む。

【0040】

複雑なグリカン構造の酵素的合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、複雑な生理活性糖タンパク質を得るための魅力的なアプローチである。例えば、Ｂａｒｂら Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（２００９）９７０５−９７０７は、単離されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いて、免疫グロブリンＧのＦｃ断片の非常に強力なシアル酸付加型Ｆｃ断片を調製した。しかし、糖タンパク質の療法的適用に対する関心が大きくなるにつれて、シアリルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼへの要求は増加しつつある。糖タンパク質のシアル酸付加を増加させるかまたは修飾する異なる戦略は、Ｂｏｒｋ Ｋ．ら Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ９８（２００９）３４９９−３５０８に記載された。魅力的な戦略は、組換え産生タンパク質（例えば限定されるわけではないが、免疫グロブリンおよび増殖因子）、特に療法タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸付加である。この目的に向けて、いくつかの研究グループが、形質転換生物におけるシアリルトランスフェラーゼの発現、および組換え産生シアリルトランスフェラーゼの精製を記載した。原核生物起源のグリコシルトランスフェラーゼは、通常、複雑な糖タンパク質（例えば抗体）に対しては作用しないため、哺乳動物起源由来のシアリルトランスフェラーゼが優先して研究された。

【0041】

本開示、および本文書のすべての側面、ならびに本明細書の側面および態様の対象である特定の糖タンパク質は、限定なしに、細胞表面糖タンパク質および血清中に可溶性型で存在する糖タンパク質（「血清糖タンパク質」）、特に哺乳動物起源である糖タンパク質を含む。「細胞表面糖タンパク質」は、該糖タンパク質の部分が、表面糖タンパク質のポリペプチド鎖の膜係留部分によって、膜表面上に位置し、そして膜表面に結合しており、膜が生物学的細胞の一部である、糖タンパク質と理解される。用語「細胞表面糖タンパク質」はまた、細胞表面糖タンパク質の単離型、ならびに例えばタンパク質分解的切断によって、またはこうした可溶性断片の組換え産生によって、膜係留部分から分離されている、その可溶性断片も含む。「血清糖タンパク質」は、血清中に存在する糖タンパク質、すなわち全血の非細胞部分、例えば細胞性血液構成要素の沈降後の上清中に存在する血液タンパク質と理解される。限定なしに、具体的に考慮され、そして具体化される血清糖タンパク質は、免疫グロブリンである。本明細書に言及する特定の免疫グロブリンは、ＩｇＧ群（ガンマ重鎖によって特徴付けられる）、特に任意の４つのＩｇＧ下位群に属する。本明細書の開示、側面および態様に関して、用語「血清糖タンパク質」はまた、モノクローナル抗体を含み；人工的なモノクローナル抗体は、当該技術分野に周知であり、そして例えばハイブリドーマ細胞により、または形質転換宿主細胞を用いて組換え的に、産生可能である。さらなる血清特異的糖タンパク質は、キャリアータンパク質、例えば血清アルブミン、フェチュイン、またはフェチュインがメンバーであるヒスチジンリッチ糖タンパク質スーパーファミリーの別の糖タンパク質メンバーである。さらに、限定なしに、本明細書のすべての開示、側面および態様に関して、具体的に考慮され、そして具体化される血清糖タンパク質は、グリコシル化タンパク質シグナル伝達分子である。この群の特定の分子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。

【0042】

糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作のため、グリコシルトランスフェラーゼを効率的なツールとして使用可能である（Ｗｅｉｊｅｒｓ ２００８）。哺乳動物起源のグリコシルトランスフェラーゼは基質としての糖タンパク質と適合する一方、細菌グリコシルトランスフェラーゼは、通常、オリゴ糖のようなより単純な基質を修飾する。このため、糖タンパク質のグリカン部分における合成変化は、都合よくは、選択ツールとして哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを用いて行われる。しかし、糖鎖工学において、グリコシルトランスフェラーゼを大規模適用するためには、適切な酵素が多量に（すなわち産業量で）入手可能であることが必要である。本明細書の開示は、特に、１またはそれより多いアクセス可能なガラクトシル基質部分を持つターゲット糖タンパク質の定量的に調節されたｉｎ ｖｉｔｒｏシアル酸付加のために使用可能な、（ｉ）ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉシアリルトランスフェラーゼ活性および（ｉｉ）シアリダーゼ活性を持つタンパク質を提供する。適切なターゲットには、一方で、アシアロ糖タンパク質、すなわちシアリダーゼの作用によってシアル酸残基が除去されている糖タンパク質が含まれる。もう一方で、二シアル酸付加糖タンパク質はシアリダーゼ活性の基質として働きうる。非常に好適なことに、アシアロ、一シアル酸付加および二シアル酸付加免疫グロブリンが特異的な基質であり、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリンがそうである。

【0043】

メチロトローフ酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを発現させ、そして宿主生物の分泌経路に対して、発現されるポリペプチドをターゲティングする一方、組換え産生ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの異なる一部切除変異体を観察した。一般的に、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ由来タンパク質をクロマトグラフィ精製し、そして特に質量分析によって、そしてＮ末端からのアミノ酸配列を決定する（エドマン分解）することによって分析した。これらの手段によって、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除、特にＮ末端一部切除を詳細に性質決定した。

【0044】

いくつかの顕著な一部切除変異体が、形質転換ピキア属株の上清中で同定された。変異体は、おそらく、酵母細胞からの分泌経過中の部位特異的タンパク質分解的切断から生じうるか、あるいは培養ピキア属株の上清中に存在する１またはそれより多い細胞外プロテアーゼによるタンパク質内分解的（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断から生じうる。

【0045】

同定される一部切除変異体各々は、「デルタ」（＝「Δ」）表示を与えられ、これは、配列番号１に記載する野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩポリペプチドのＮ末端から数えたそれぞれの一部切除欠失の最後のアミノ酸位の数字を示す。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの特定のＮ末端一部切除変異体Δ８９をより詳細に研究した。

【0046】

原核生物、例えば大腸菌およびバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス、ならびに哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞を含む、多様な宿主生物における、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ野生型タンパク質の、ならびにΔ８９一部切除変異体の発現のために、発現ベクターを構築した。ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ８９一部切除変異体のための発現構築物を含むベクターを分子的に組み立て、それによって、いくつかの発現系におけるヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ８９変異体を組換え的に産生する手段を提供する。組換え的に発現された酵素、すなわち一部切除変異体の精製を容易にするため、構築物にコードされるポリペプチドには、場合によって、Ｎ末端Ｈｉｓタグが含まれた。

【0047】

特定の一連の実験において、ピキア・パストリス株ＫＭ７１Ｈにおける増殖のため、発現構築物をベクター内に挿入した。発現は、典型的には、ＡＯＸ１プロモーターなどの誘導性プロモーターによって調節された。発現された一次翻訳産物を形質転換宿主の分泌経路にターゲティングすることが可能なリーダーペプチドに、Ｈｉｓタグ化一部切除変異体をさらに融合させた。翻訳後プロセシングには、したがって、Ｈｉｓタグ化一部切除変異体の周囲培地内への分泌が含まれ、一方、リーダーペプチドは、分泌機構のエンドプロテアーゼによって切断された。

【0048】

形質転換ピキア属細胞を典型的には液体培地中で培養する。発現誘導後、形質転換細胞を特定の時間培養して、それぞれのターゲットタンパク質を産生した。培養工程の終結後、細胞および培養中に存在する他の不溶性物質を、上清から分離した。透明な上清中の一部切除変異体Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを分析した。しかし、Ｎｉ−キレートアフィニティマトリックスを装填したクロマトグラフィカラムを用いて、上清から酵素を精製しようとする試みは、活性酵素がカラム上に保持されず、フロースルー中に見られたため、失敗した。陽イオン交換樹脂を用いた酵素（野生型および変異体）の精製は、にもかかわらず、非常に濃縮された酵素調製物を生じた。しかしこの精製法は、一般的に、酵素活性に負に影響を及ぼすようであった。

【0049】

本明細書に開示するような側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、糖タンパク質中のグリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒可能な変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼである。特に、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質グリカン中のＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の形成を触媒し、それによって、遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成可能である。本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様において、α２，６グリコシド結合の加水分解を触媒可能な変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ由来であり、配列番号１記載のヒトβ−ガラクトシド−α２，６−シアリルトランスフェラーゼＩからアミノ酸欠失によって得られ、前記配列はＮ末端からの欠失によって一部切除されている。本明細書に開示するようなすべての側面のさらなる特定の態様において、Ｎ末端からの一部切除欠失は、配列番号１の１位〜８９位の連続配列である。

【0050】

本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、本明細書に開示するような任意の態様にしたがった、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。融合タンパク質または融合ポリペプチドは、２またはそれより多いポリペプチドのアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドである。２またはそれより多いポリペプチドは、相補的機能を有してもよく、ポリペプチドの一方は、補助的な機能的特性を提供してもよいし、またはポリペプチドの一方は、融合ポリペプチド中の他のものとは関連しない機能を有してもよい。細胞内小器官ターゲティングまたは保持配列を含む１またはそれより多いポリペプチドを、望ましいポリペプチドと融合させて、特定の細胞性小器官に望ましいポリペプチドをターゲティングするか、または望ましいポリペプチドを細胞内に保持することも可能である。融合ポリペプチドの発現、精製および／または検出を補助するキャリアー配列を含む１またはそれより多いポリペプチドを、望ましいポリペプチド（例えばＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＧＳＴ融合体等）と融合させてもよい。特定の融合パートナーには、融合ポリペプチドを発現させる宿主生物の分泌経路に融合ポリペプチドの変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ部分を導くことが可能な、Ｎ末端リーダーペプチドが含まれる。それによって、細胞外空間および周囲培地中の分泌が促進される。さらに、本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、本明細書に開示するような任意の態様にしたがった変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、または本明細書に開示するような任意の態様にしたがって変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを部分として含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様において、ヌクレオチド配列には、配列番号３の９５位〜１０４８位の配列が含まれる。

【0051】

さらに、本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、ターゲット遺伝子、および発現ベクターで形質転換された宿主生物におけるターゲット遺伝子の発現を促進する配列を含む、発現ベクターであり、ここで、ターゲット遺伝子は、本明細書に開示するようなヌクレオチド配列を含む。

【0052】

さらに、本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、形質転換された宿主生物であり、ここで、宿主生物は、本明細書に開示するような発現ベクターで形質転換されている。特に都合よくは、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞を用いて、本明細書に開示するような解説を実施することも可能である。これらの細胞の特定の利点は、これらが、トランスフェクション、それに続く培養、およびターゲット遺伝子の一過性発現に非常に適したターゲットであることである。したがって、ＨＥＫ細胞を効率的に用いて、組換え発現によって、ターゲットタンパク質を産生することも可能である。非常に都合よくは、発現構築物が翻訳産物を、分泌経路に導くように設計して、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼまたは融合ポリペプチドの分泌を導く。にもかかわらず、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、周知の代替物であり、そして形質転換および本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様のための代替宿主生物として本明細書に含まれる。

【0053】

さらに、本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターで形質転換された宿主生物において発現し、ここでポリペプチドが形成され、それによって変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法である。

【0054】

先の知見にしたがって、グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端一部切除変異体は、膜貫通ドメインを欠如しているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで好適に用いられる。したがって、こうした変異体は、溶液中でグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し、そして実行するために有用である。驚くべきことに、特に、Ｎ末端一部切除変異体Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、例えばグリコシル化抗体とインキュベーションした際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる活性を提示することが見出され、そして本明細書において、これを開示する。したがって、本開示の特定の態様ならびに本明細書のすべての側面および態様は、二シアル酸付加糖タンパク質、すなわち糖タンパク質の１またはそれより多いグリカン部分に２つの別個の末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含む糖タンパク質のＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒可能な変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、１つのみのα２，６グリコシド結合を加水分解する。さらに特定の態様において、二シアル酸付加糖タンパク質は、二シアル酸付加ＩｇＧ免疫グロブリンである。

【0055】

例示的な例として、ＩｇＧ−ＦｃグリカンＧ２は、アンテナ分枝の末端に２つのガラクトース部分を有し、これはシアル酸付加可能である。適切な反応条件下で、Ｎ末端一部切除変異体Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、二シアル酸付加Ｇ２グリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含むＩｇＧの合成を、免疫グロブリンＦｃ部分で触媒する。しかし、インキュベーション時間を延長した際、酵素変異体は、二シアル酸付加（Ｇ２＋２ＳＡ）抗体から１つのシアル酸部分を除去することが可能なシアリダーゼとして作用し、一シアル酸付加（Ｇ２＋１ＳＡ）抗体を生じる。この活性は、予期せず発見され、そして内因性のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）活性に相当するようであり、これまでのところ、哺乳動物ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素に関しては記載されてきていない。

【0056】

ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉに関する基本的な刊行物において、該酵素は、いかなるシアリダーゼ活性も含有しないと言及された。Ｓｔｉｃｈｅｒら Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ８（１９９１）４５−５４を参照されたい。本発明の驚くべき発見の観点から、同じ酵素を使用して、そして酵素の反応動力学を調節することで、一または二シアル酸付加グリカンを含む糖タンパク質を優先的に合成することが可能になる。さらなる利点は、両方の活性、シアル酸付加活性およびシアリダーゼ活性が、同じ酵素によって、同じ反応容器中で提供されることである。

【0057】

本開示中に文書化される一般的な発見は、しかし、糖タンパク質中のグリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒可能な、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、特に本開示にしたがったグリコシルトランスフェラーゼが存在することである。驚くべき発見は、すでに知られるシアリルトランスフェラーゼ（シアル酸付加）活性に加えて、少なくとも配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩに関して特に示されるように、慣用的なシアリルトランスフェラーゼだけでなく、この酵素によって仲介されるシアリダーゼ酵素活性もあることであった。興味深いことに、例示的な例において、これらの２つの活性は同時には観察されず、これは部分的に、予期せぬ発見を説明する可能性がある。図２に示すように、シアリルトランスフェラーゼ活性は、最初に優先的であり、そしてシアリダーゼ活性は、インキュベーション中の後の段階のみで明らかとなり、この理由はこの時点では明らかでない。にもかかわらず、同じ酵素の２つの別個の活性の明らかな認識は、例えばインキュベーション時間を変化させることによって、ターゲット分子のシアル酸付加の度合いを調節することを可能とする。

【0058】

したがって、本明細書に開示するような別の側面、およびすべての他の側面の特定の態様は、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、特にＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分であって、シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である前記部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用である。特定の態様において、シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質は、それぞれ、二シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質である。

【0059】

こうした使用の特定の態様、およびさらに本明細書に開示するようなすべての側面の別の態様は、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分であって、シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である前記部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解する方法であって、（ａ）前記糖タンパク質のグリカン部分において末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含むシアル酸付加糖タンパク質または糖脂質を、水溶液中で提供し；そして（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分と、本明細書に開示するような変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをインキュベーションし；それによって、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分中のα２，６グリコシド結合を加水分解する工程を含む、前記方法である。特に、加水分解反応によって放出されるシアリル残基を、α２，６結合で、グリカン中のアンテナ構造の末端にあるβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンに連結する。

【0060】

特定の態様において、そして特定の利点を伴い、変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩである。さらなる特定の態様において、加水分解反応およびグリコシルトランスフェラーゼ活性の触媒は、競合様式で行われる。しかし、シアル酸付加のため、２またはそれより多いアクセプター部位を持つ基質ターゲット分子を考慮すると、反応を促進するために利用可能な十分なドナー化合物がある限り、グリコシルトランスフェラーゼ活性によって、すべての可能な部位がシアル酸付加されるようになる点は注目に値する。配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのこの特性を本開示に例示する。したがって、二シアル酸付加ＩｇＧ分子は主に、８時間続くシアル酸付加反応の例示的なインキュベーションにおいて得られる。しかし、８時間またはそれより長いインキュベーション時間後、増加する量の一シアル酸付加ＩｇＧ分子が観察された。一つのありうる結論は、一および二シアル酸付加ＩｇＧ分子の比が２つの競合反応：トランスファーおよび加水分解の動的平衡の結果であるというものでありうる。あるいは、シアル酸反応混合物中の条件は、例えばドナー化合物枯渇のありうる結果として、時間とともに変化しうる。にもかかわらず、一シアル酸付加ＩｇＧ分子の実質的な量は、例示されるように、７２時間の長期インキュベーション後であっても保持される。

【0061】

本明細書に開示するようなすべての側面の特定の態様において、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法であって
、（ａ）水溶液中、およびグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許可する条件下で、グリコシル化ターゲット分子を提供し、ここで、ターゲット分子が糖タンパク質および糖脂質より選択され、ターゲット分子が、複数のアンテナを含み、アンテナの少なくとも２つが各々、末端構造として、ガラクトシル残基中のＣ６位でヒドロキシル基を含むβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有し；（ｂ）工程（ａ）のターゲット分子を、第一のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩと、そしてドナー化合物として、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはその機能的同等物の存在下で、インキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それによってシアル酸付加ターゲット分子を提供し；工程（ｂ）のシアル酸付加ターゲット分子を、第二のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩとインキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基中のα２，６グリコシド結合を加水分解し；それによって、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する工程を含む、前記方法を提供する。

【0062】

こうして調節されたシアル酸付加は、望ましい度合いのシアル酸付加を伴う、一、二およびより高次のシアル酸付加糖タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する新規手段として提供される。したがって、ＩｇＧ分子で望ましい技術的効果を示すことによって例示されるが、本明細書中の開示にしたがった使用はまた、グリコシルトランスフェラーゼ活性に関して、糖タンパク質が、２またはそれより多い末端アンテナβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含むという条件で、類似の方式で、他の糖タンパク質をプロセシングすることも可能にする。同じ論拠は、糖脂質にも類似の方式で適用される。

【0063】

特定の例において、Ｇ２＋０ＳＡ（アクセプター部位にシアル酸付加なし）として特徴付けられる、組換えヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍａｂ）、ならびにＥＰＯ（＝エリスロポエチン）を、シアル酸付加実験において、ターゲットとして用いた（３０μｇ酵素／３００μｇターゲットタンパク質）。Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを標準的反応条件下で用い、そしてＧ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡ（一シアル酸付加）およびＧ２＋２ＳＡ（二シアル酸付加）状態を質量分析によって分析した。

【0064】

発現率が高く、そして効率的な精製法があるため、Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、大量に、そして高純度で入手可能である。変異体酵素は、モノクローナル抗体がその単なる一例である、高分子量基質で活性である。インキュベーション時間に応じて、Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは基質として二アンテナ性グリカンを伴うモノクローナル抗体を用いたシアル酸付加実験において、異なる性能を示す。変異体Δ８９を用いると、より短いインキュベーション期間後は、好ましくは二シアル酸付加グリカンが非常に好適に得られる一方、Δ８９を用いた同一の条件下で、より長いインキュベーション期間後は、一シアル酸付加グリカンが得られる。

【0065】

四アンテナグリカンもまた、基質として許容される（データ未提示）。結果は、どちらの変異体も療法抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ糖鎖工学のために成功裡に使用可能であることを立証する。

【0066】

本明細書に提供するような解説を実施することによって、ヒトＳＴ６−Ｇａｌ−Ｉの組換えΔ８９変異体は、より多量に入手可能な酵素である。すでに入手可能なドナー基質（補助基質として用いる活性化糖）とともに、タンパク質の定量的に調節されたｉｎ ｖｉｔｒｏ糖鎖工学のための試薬の非常に好適なセットが提供される。

【0067】

以下の項目はさらに、開示の特定の側面、および本明細書に提供する解説を実施するための特定の態様を提供する。
１． 糖タンパク質において、グリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒することが可能な変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0068】

２． 糖タンパク質グリカンにおけるＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の形成を触媒することがさらに可能である、項目１記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0069】

３． 加水分解が遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成する、項目１および２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
４． 糖タンパク質グリカンの部分である、アクセプター基β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンの末端ガラクトシル残基中のＣ６位のヒドロキシル基と、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のＮ−アセチルノイラミン酸残基を反応させることによって、α２，６グリコシド結合の形成を達成する、項目１〜３のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0070】

５． 変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ由来のアミノ酸交換またはアミノ酸欠失によって得られる、項目１〜３のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0071】

６． 変異体ポリペプチドが、Ｎ末端からの欠失によって一部切除された、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する野生型哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む、項目５記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0072】

７． Ｎ末端からの欠失が、配列番号１の１位〜８９位の配列である、項目６記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
８． 変異体ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列である、項目６および７のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0073】

９． 変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端がアフィニティタグに融合している、項目１〜８のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
１０． アフィニティタグが、４、５、６またはそれより多い連続ヒスチジン残基を含む、項目９記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0074】

１１． ペプチダーゼ切断部位が、アフィニティタグおよび変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の間に位置する、項目９および１０のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。

【0075】

１２． 変異体ポリペプチドがＮ末端メチオニン残基をさらに含む、項目１〜１１のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ。
１３． 項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。

【0076】

１４． 項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
１５． 項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合ポリペプチドのポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。

【0077】

１６． 発現ベクターで形質転換されている宿主生物において、ターゲット遺伝子の発現を促進する配列に機能可能であるように連結されたターゲット遺伝子を含む発現ベクターであって、ターゲット遺伝子が、項目１４および１５のいずれか記載のヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクター。

【0078】

１７． 項目１６記載の発現ベクターで形質転換されている、形質転換宿主生物。
１８． 生物が酵母細胞および哺乳動物細胞より選択される、項目１７記載の形質転換宿主生物。

【0079】

１９． 生物が、ＨＥＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、項目１９記載の形質転換宿主生物。

【0080】

２０． 糖タンパク質におけるグリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒可能な変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え的に産生する方法であって、項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を、形質転換宿主生物において発現し、ここでポリペプチドが形成され、それによって変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを産生する工程を含む、前記方法。

【0081】

２１． 産生された酵素が、宿主生物から分泌される、項目２０記載の方法。
２２． 宿主生物が真核細胞である、項目２０および２１のいずれか記載の方法。
２３． 宿主生物が、酵母細胞および哺乳動物細胞より選択される、項目２２記載の方法。

【0082】

２４． 宿主生物が、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、項目２３記載の方法。
２５． 変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを精製する、項目２０〜２４のいずれか記載の方法。

【0083】

２６． シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質におけるグリカンの末端構造である、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解するための、項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、または項目１３記載の融合タンパク質の使用。

【0084】

２７． 変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩである、項目２６記載の使用。

【0085】

２８． 糖タンパク質が、細胞表面糖タンパク質、グリコシル化タンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化免疫グロブリン、およびウイルス起源のグリコシル化タンパク質からなる群より選択される、項目２６および２７のいずれか記載の使用。

【0086】

２９． 糖タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＥＰＯ、およびアシアロフェチュインからなる群より選択される、項目２６および２７のいずれか記載の使用。

【0087】

３０． Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分におけるα２，６グリコシド結合を加水分解する方法であって、該部分はシアル酸付加糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造であり、該方法は、
（ａ）前記糖タンパク質のグリカン部分において末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含むシアル酸付加、および特定の態様において、二シアル酸付加糖タンパク質または糖脂質を、水溶液中で提供し；
（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分と、項目１〜１２のいずれか記載の変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをインキュベーションし；
それによって、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分中のα２，６グリコシド結合を加水分解する
工程を含む、前記方法。

【0088】

３１． 変異体哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、Ｎ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩである、項目３０記載の方法。

【0089】

３２． 糖タンパク質が、細胞表面糖タンパク質、グリコシル化タンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化免疫グロブリン、およびウイルス起源のグリコシル化タンパク質からなる群より選択される、項目３０および３１のいずれか記載の方法。

【0090】

３３． 工程（ａ）を、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許可する条件下で実行する、項目３０〜３２のいずれか記載の方法。
３４． 工程（ｂ）を、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許可する条件下で実行する、項目３０〜３３のいずれか記載の方法。

【0091】

３５． 調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法であって
（ａ）水溶液中、およびグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を許可する条件下で、グリコシル化ターゲット分子を提供し、ここで、ターゲット分子が糖タンパク質および糖脂質より選択され、ターゲット分子が、複数のアンテナを含み、アンテナの少なくとも２つが各々、末端構造として、ガラクトシル残基中のＣ６位でヒドロキシル基を含むβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有し；
（ｂ）工程（ａ）のターゲット分子を、第一のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩと、そしてドナー化合物として、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、またはその機能的同等物の存在下で、インキュベーションすることによって、１またはそれより多い１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それによって、シアル酸付加ターゲット分子を提供し；
（ｃ）工程（ｂ）のシアル酸付加ターゲット分子を、第二のあらかじめ決定された時間に渡って、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩとインキュベーションすることによって、１またはそれより多い末端アンテナＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基中のα２，６グリコシド結合を加水分解し；
それによって、調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する
工程を含む、前記方法。

【0092】

３６． 工程（ｂ）および（ｃ）の間に、ターゲット分子のシアル酸付加を定量的に決定する、項目３５記載の方法。
３７． 工程（ｃ）の後、ターゲット分子のシアル酸付加を定量的に決定する、項目３５および３６のいずれか記載の方法。

【0093】

３８． 工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、同じ容器中で連続して行う、項目３５〜３７のいずれか記載の方法。
３９． ターゲット分子が、精製免疫グロブリン分子である、項目３５〜３８のいずれか記載の方法。

【0094】

４０． 単一の免疫グロブリン分子が２つのアンテナを含み、各アンテナが、ガラクトシル残基中のＣ６位にヒドロキシル基を伴う末端構造β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有する、項目３９記載の方法。

【0095】

４１． 免疫グロブリン分子がＩｇＧクラスのものである、項目４０記載の方法。
４２． 測定した量のターゲット分子を用いて、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、同じ容器中で連続して行う、ここで工程（ｂ）を０時間〜約２４時間行い、そして続く工程（ｃ）を０時間行い、そしてここで、二シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約３５％〜約９０％である、項目４１記載の方法。

【0096】

４３． 工程（ｂ）を約０時間〜約２時間行い、そして二シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約８０％〜約９０％である、項目４２記載の方法。
４４． 工程（ｂ）を約２時間〜約８時間行い、そして二シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約８０％〜約９０％である、項目４２記載の方法。

【0097】

４５． 一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約１０％〜約６０％である、項目４２〜４４のいずれか記載の方法。
４６． 一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約１０％〜約１５％である、項目４３および４４のいずれか記載の方法。

【0098】

４７． 測定した量のターゲット分子を用いて、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、同じ容器中で連続して行う、ここで工程（ｂ）を２４時間行い、そして続く工程（ｃ）を０時間〜約７２時間またはそれより長く行い、そしてここで、一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約６０％〜約７５％である、項目４１記載の方法。

【0099】

４８． 工程（ｃ）を約０時間〜２４時間行い、そして一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約６０％〜約７０％である、項目４７記載の方法。
４９． 工程（ｃ）を約２４時間〜４８時間行い、そして一シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約７０％〜約７５％である、項目４７記載の方法。

【0100】

５０． 二シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約２０％〜約３５％である、項目４７〜４９のいずれか記載の方法。
５１． 二シアル酸付加ターゲット分子の相対量が約１０％〜約２０％である、項目４８および４９のいずれか記載の方法。

【0101】

５２． ターゲット（免疫グロブリン）分子：ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ分子の重量対重量［ｗ／ｗ］比が１０：１であり、各々が８０％またはそれより高い相対純度を有する、項目４２〜４９のいずれか記載の方法。

【0102】

５３． ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、二シアル酸付加ターゲット分子の量が約３５％〜約９０％であり、調製物が項目４１〜４６のいずれか記載の方法によって得られる、グリコシル化ターゲット分子の調製物。

【0103】

５４． ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、一シアル酸付加ターゲット分子の量が約６０％〜約７５％であり、調製物が項目４７〜５１のいずれか記載の方法によって得られる、グリコシル化ターゲット分子の調製物。

【0104】

５５． ターゲット分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子であり、ここで、一および二シアル酸付加ターゲット分子の量が調節された量であり、調製物が項目４１〜５１のいずれか記載の方法によって得られる、シアル酸付加ターゲット分子の調製物。

【0105】

５６． 薬学的組成物を調製するための、項目５５記載のシアル酸付加免疫グロブリン分子の調製物の使用。
５７．調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する方法であって、項目３５〜５２のいずれか記載の方法を実行する工程を含み、工程（ｃ）の後に、測定された量のシチジン三リン酸（ＣＴＰ）を水溶液に添加し、それによって配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端一部切除ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩを阻害し、それによって調節された量のシアリル残基を含むシアル酸付加ターゲット分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する工程を含む工程（ｄ）が続く、前記方法。

【0106】

５８． 水溶液中のＣＴＰ濃度が０．５ｍＭ〜１．５ｍＭであり、そして特に約０．６７ｍＭである、項目５７記載の方法。

【実施例】

【0107】

以下の実施例は、開示の特定の態様、およびその多様な使用の例示である。これらは、例示目的のために示し、そして開示を限定するとは解釈されないものとする。
実施例１
シアリルトランスフェラーゼ酵素活性のための試験
アシアロフェチュイン（脱シアル酸化フェチュイン、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をアクセプターとして用い、そしてＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡ（ＣＭＰ−９−フルオレセイニル−ＮｅｕＡｃ）をドナー基質として用いた（Ｂｒｏｓｓｍｅｒ， Ｒ． ＆ Ｇｒｏｓｓ Ｈ．Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４７， １７７−１９３）。ドナー化合物からアシアロフェチュインへのシアル酸のトランスファーを測定することによって、酵素活性を決定した。反応混合物（３５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．０３５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０７％ＢＳＡ）は、５１μＬの総体積中、２．５μｇの酵素試料、５μＬアシアロフェチュイン（２０ｍｇ／ｍｌ）および２μＬ ＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡ（１．０ｍｇ／ｍｌ）を含有した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。１０μＬの阻害剤ＣＴＰ（１０ｍＭ）を添加することによって反応を停止した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５で平衡化したＰＤ１０脱塩カラム上に、反応混合物を装填した。平衡緩衝液を用いて、カラムからフェチュインを溶出させた。分画サイズは１ｍＬであった。蛍光分光計を用いて、形成されたフェチュイン濃度を決定した。励起波長は４９０ｎｍであり、発光を５２０ｎｍで測定した。酵素活性をＲＦＵ（相対蛍光単位）として表した。１００００ＲＦＵ／μｇは、０．０８３９ｎｍｏｌ／μｇｘ分の比活性に同等である。

【0108】

実施例２
ＳＤＳゲル電気泳動
ＮｕＰＡＧＥゲル（４〜１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、分析ＳＤＳゲル電気泳動を行った。試料（３６μｌ）を１２μｌ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、そして８５℃で２分間インキュベーションした。典型的には５μｇタンパク質を含有するアリコットをゲル上に装填した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ゲルを染色した。

【0109】

実施例３
エドマン分解によるＮ末端配列決定
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た試薬およびデバイスを用いたエドマン分解によって、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現された変異体のＮ末端配列を分析した。ＰｒｏＳｏｒｂ試料調製カートリッジ（カタログ番号４０１９５０）およびＰｒｏＢｌｏｔｔ Ｍｉｎｉ ＰＫ／１０膜（カタログ番号０１１９４）の取扱説明書に記載されるように試料調製を行った。配列決定のため、Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク質配列決定プラットフォームを用いた。

【0110】

実施例４
質量分析
ＨＥＫ細胞中で発現させたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの変異体の分子マスを質量分析において分析した。したがって、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのグリコシル化および脱グリコシル化型を調製し、そしてＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｋｅｒｓ 英国）およびＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ ４．１ソフトウェアを用いて分析した。

【0111】

実施例５
グリコシル化ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
質量分析測定のため、試料をエレクトロスプレー培地（２０％アセトニトリル＋１％ギ酸）中で緩衝した。ｉｌｌｕｓｔｒａ^ＴＭ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ^ＴＭ Ｇ−２５カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で緩衝液交換を行った。１ｍｇ／ｍｌ濃度の２０μｇシアリルトランスフェラーゼ変異体を、あらかじめ平衡化したカラムに適用し、そして遠心分離によって、溶出させた。生じた溶出液をエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。

【0112】

実施例６
脱グリコシル化ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
脱グリコシル化のため、シアリルトランスフェラーゼの試料を変性させ、そして還元した。１００μｇのシアリルトランスフェラーゼに、４５μＬ変性緩衝液（６Ｍグアニジニウム塩酸）および１３μＬ ＴＣＥＰ（０．１ｍＭ、変性緩衝液中に希釈）を添加した。さらに、適切な体積の超純水を添加し、グアニジニウム塩酸の全体の濃度が約４Ｍになるようにした。試料を３７℃で１時間インキュベーションした後、あらかじめ超純水で平衡化したＳｐｉｎＲ ６ Ｔｒｉｓカラム（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて、緩衝液を交換した。全試料をカラム上に適用し、そして遠心分離によって溶出させた。生じた溶出液に、５．５μｌの０．１Ｕ／μｌ溶液のＰＮＧアーゼＦを添加し、そして３７℃で一晩インキュベーションした。その後、試料を３０％ＡＣＮおよび１％ＦＡに調節し、そしてエレクトロスプレーイオン化質量分析によって分析した。

【0113】

実施例７
哺乳動物宿主細胞における一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）のためのｐＭ１ＭＴ発現構築物のクローニング
エリスロポエチン・シグナルペプチド配列（Ｅｐｏ）および２アミノ酸（「ＡＰ」）のペプチドスペーサーを用いて、ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの一部切除変異体Δ８９を一過性発現のためにクローニングした。Ｅｐｏ−ＡＰ−Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物のため、コドン最適化したｃＤＮＡを合成した。配列番号３を参照されたい。天然リーダー配列およびＮ末端タンパク質配列の代わりに、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード領域は、宿主細胞株の分泌機構によって発現されたポリペプチドの正しいプロセシングを確実にするため、エリスロポエチン・シグナル配列に加えてＡＰリンカー配列を宿する。さらに、発現カセットは、あらかじめ消化されたｐＭ１ＭＴベクター断片（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のマルチクローニングサイト内にクローニングするための、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を特徴とする。ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列の発現は、したがって、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター領域の調節下にあり、その後、発現制御のための「イントロンＡ」、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルが続く。

【0114】

ＨＥＫ細胞中のＥｐｏ−ＡＰ−Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築物の発現、および細胞上清へのΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質の分泌を、実施例８に記載するように行った。

【0115】

実施例８
ＨＥＫ細胞の形質転換、ならびに一過性発現および分泌
プラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）は、哺乳動物細胞培養において、タンパク質を産生する迅速な戦略である。組換えヒトタンパク質の高レベル発現のため、懸濁適応ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株に基づくＴＧＥプラットフォームを用いた。細胞を血清不含培地条件下、３７℃で振盪フラスコ中で培養した。製造者の指針にしたがって、２９３−Ｆｒｅｅ^ＴＭ（Ｍｅｒｃｋ）トランスフェクション試薬によって複合体化されたｐＭ１ＭＴ発現プラスミド（０．５〜１ｍｇ／Ｌ細胞培養）を用いて、細胞をおよそ２ｘ１０^６ｖｃ／ｍｌでトランスフェクションした。トランスフェクション３時間後、発現をブーストするため、ＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸（最終濃度４ｍＭ）を添加した（Ｂａｃｋｌｉｗａｌら（２００８）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ｅ９６）。各日、培養に６％（ｖ／ｖ）のダイズ・ペプトン加水分解産物に基づくフィードを補った。トランスフェクション７日後、遠心分離によって培養上清を収集した。

【0116】

実施例９
形質転換ＨＥＫ細胞上清からのヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのΔ８９ Ｎ末端一部切除変異体（Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の精製
実施例８に記載するように、ＨＥＫ細胞を形質転換した。実施例７に記載するように、発現構築物を調製した。特定のｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列は、Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ Ｎ末端一部切除変異体をコードするヌクレオチド配列であり、したがって、発現される構築物はＥｐｏ−ＡＰ−Δ８９−ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉであった。

【0117】

ＨＥＫ細胞発酵上清から、単純化精製プロトコルを用いて、変異体Ｅｐｏ−ＡＰ−Δ８９−ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを精製した。最初の工程において、０．１リットルの培養上清を濾過し（０．２μｍ）、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５）に対して溶液を透析した。緩衝液Ａで平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ ｆｆ（迅速流動）カラム（１．６ｃｍｘ２ｃｍ）上に透析物を装填した。１００ｍＬ緩衝液Ａで洗浄した後、１０ｍＬ緩衝液Ａおよび１０ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配で、酵素を溶出させ、その後、４８ｍＬの緩衝液Ａ＋２００ｍＭ ＮａＣｌを用いる洗浄工程を行った。分画（４ｍＬ）を分析ＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。

【0118】

酵素を含有する分画をプールし、そして緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０）に対して透析した。透析したプールを、緩衝液Ｂで平衡化したヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆカラム（０．５ｃｍｘ５ｃｍ）上に装填し、そして緩衝液Ｂ＋２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出させた。酵素を含有する分画（１ｍｌ）をプールし、そして緩衝液Ｂに対して透析した。タンパク質濃度を２８０ｎｍで決定した（Ｅ２８０ｎｍ［１ｍｇ／ｍｌ］＝１．９３１）。酵素の質量分析によって、Ｅｐｏ−ＡＰ−Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの構築物が、Ｎ末端アミノ酸ＡＰを含まずに分泌されることが示された。この驚くべき発見は、Ｅｐｏ部分を除去する一方で、シグナルペプチダーゼによる発現タンパク質の異常な切断があることを示す。組換えヒトΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉに関して、＞１１００ＲＦＵ／μｇの比活性と決定された。

【0119】

図１は、ＨＥＫ細胞からの精製組換えΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
実施例１０
Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いたヒト化モノクローナル抗体（ＭＡＢ）のシアル酸付加
高ガラクトシル化ヒト化モノクローナル抗体ＩｇＧ４ ＭＡＢ＜ＩＬ−１Ｒ＞（ＷＯ ２００５／０２３８７２）をシアル酸付加実験に用いた。反応混合物は、ＭＡＢ＜ＩＬ−１Ｒ＞（５５μｌの３５ｍＭ酢酸ナトリウム／Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．０中、３００μｇ）、ドナー基質ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（５０μｌの水中、１５０μｇ）およびシアリルトランスフェラーゼ（２０ｍＭリン酸カリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中、３０μｇ Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）を含有した。試料を、３７℃で、定義した時間、インキュベーションした。反応を停止するため、試料を−２０℃で凍結した。質量分析のため、１００μｌ変性緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム）および３０μｌ ＴＣＥＰ（０．１ｍＭ、変性緩衝液中で希釈）を試料に添加し、そして試料を３７℃で１時間インキュベーションした。あらかじめ平衡化したｉｌｌｕｓｔｒａ^ＴＭ Ｎａｐ５−カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、エレクトロスプレー培地（２０％ＡＣＮ、１％ＦＡ）中で試料を緩衝した。エレクトロスプレーイオン化質量分析によって試料を分析し、そしてＧ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡ Ｎグリカンの含量を決定した。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ 英国）を用い、用いたソフトウェアはＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ４．１であった。シアル酸付加の動力学を決定するため、反応を最長７２時間インキュベーションした。図２は、インキュベーション期間中、異なる時点の後に得た、異なってシアル酸付加されたターゲットタンパク質の相対量を示す。

【0120】

Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡの含量を質量分析によって決定した。変異体Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉに関して、インキュベーションの２時間後すでに、高含量（８８％）の二シアル酸付加型Ｇ２＋２ＳＡが得られた。図２を参照されたい。データはまた、Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの内因性のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）活性のため、Ｇ２＋０ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡの含量が再び、長期に渡って増加したことも示す。インキュベーション４８時間後、７１％のＧ２＋１ＳＡ含量が得られた。したがって、１つの単一酵素のみを用い、そして単にインキュベーション時間を変化させることによって、免疫グロブリンの一または二シアル酸付加型を、好ましく得ることが可能である。

【0121】

図３は、ＭＡＢ＜ＩＬ−１Ｒ＞の異なる試料の質量分析によって得られるスペクトルを示す。試料をｔ＝０の時点（下部パネル）、ｔ＝８ｈの時点（中央パネル）およびｔ＝４８ｈの時点（上部パネル）で採取した。Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡグリカンを含むＩｇＧ分子の質量スペクトルにおける１つの電荷状態の質量電荷（ｍ／ｚ）シグナルを示す。異なるシアル酸付加種の相対強度は、これらのシグナルから得られる。図２に対応して、ｔ＝０ｈでは、Ｇ２＋０ＳＡが主要グリカン種である。ｔ＝８ｈでは、Ｇ２＋２ＳＡのシグナルが主要な型であり、一方、ｔ＝４８ｈでは、Ｇ２＋１ＳＡが最も豊富な種である。決定された数値に関しては、図２を参照されたい。

【0122】

実施例１１
Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性の阻害
化合物、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）は、シアリルトランスフェラーゼの強力な阻害剤である（Ｓｃｕｄｄｅｒ ＰＲ ＆ Ｃｈａｎｔｌｅｒ ＥＮ ＢＢＡ ６６０（１９８１）１３６−１４１）。シアリダーゼ活性がΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの内因性活性であることを立証するため、阻害実験を行った。実験の最初の相において、Δ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＭＡＢ＜ＩＬ−１Ｒ＞のシアル酸付加を行って、高含量のＧ２＋２ＳＡを達成した（実施例１０を参照されたい）。インキュベーション７ｈ後、Ｇ２＋２ＳＡ含量は９４％であった。続いて、ＣＴＰを添加してΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性を阻害した（ＣＴＰの最終濃度：０．６７ｍＭ）。異なる時点で、試料を採取し、そしてＧ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡの含量を質量分析によって決定した。結果を図４に示す。図２に示す阻害剤不含条件に比較して、シアリダーゼ活性によって引き起こされるＧ２＋２ＳＡの分解は有意に減少した。インキュベーション７２ｈ後、７３％のＧ２＋２ＳＡがなお存在した。シアリルトランスフェラーゼ活性の既知の阻害剤によるシアリダーゼ活性の阻害は、どちらの活性もΔ８９ ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの同じ活性中心に位置することを強く示す。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【配列表】

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