特許 6596066 マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6596066

(24)【登録日】2019年10月4日

(45)【発行日】2019年10月23日

(54)【発明の名称】マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20191010BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20191010BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20191010BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/689 ZZNA

   C12Q1/6844 Z

   C12N15/09 Z

【請求項の数】9

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2017-503844(P2017-503844)

(86)(22)【出願日】2015年7月7日

(65)【公表番号】特表2017-521086(P2017-521086A)

(43)【公表日】2017年8月3日

(86)【国際出願番号】US2015039362

(87)【国際公開番号】WO2016014240

(87)【国際公開日】20160128

【審査請求日】2018年7月2日

(31)【優先権主張番号】62/028,527

(32)【優先日】2014年7月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507051972

【氏名又は名称】アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タン，ニン

(72)【発明者】

【氏名】レッキー，グレゴール

(72)【発明者】

【氏名】パハラワッタ，ビハンガ

(72)【発明者】

【氏名】フランク，アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】ランピネン，ジョン

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２３１５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０００２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 SHARMA K. et al.，Indian Journal of Medical Microbiology，31(4) (2013)，p.370-373

【文献】 SHARMA K. et al.，J. Neurol.，258(2011)，p.1781-1787

【文献】 SHARMA K. et al.，Journal of Ophthalmic Inflammation and Infection，3 (2013)，25

【文献】 ANDERSEN A. B. et al.，Infection and Immunity，Vol.57, No.8 (1989)，p.2481-2488

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８−１／６８９７

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１〜９の核酸を含む、組成物。

【請求項2】

列挙した配列番号の１つ以上が標識を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

標識がフルオロフォアを含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

配列番号１０〜１２、配列番号１３〜１５、配列番号１６〜１８、配列番号１９〜２１、配列番号２２〜２４、配列番号２５〜２７、配列番号２８〜３０、配列番号３１〜３３及び配列番号３４〜３６からなる群から選択される１つ以上のプライマーとプローブのセットをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

反応混合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

反応混合物が試料を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

試料が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）標的核酸を含む、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物、及び
ｂ）核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬
を含む、キット。

【請求項9】

生体試料中のマイコバクテリウム・ツベルクロシス（ＭＴＢ）核酸を識別する方法であって、
ａ）対象由来の生体試料を、配列番号１〜９の核酸プライマー又はプローブと接触させるステップ、及び
ｂ）前記ＭＴＢ核酸の増幅を検出するステップ
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関する。特に、本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスを検出するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

マイコバクテリウム・ツベルクロシス（ＭＴＢ）は、世界中の公衆衛生にとって重大な脅威となっており、単一の感染因子に起因する全世界で最大の死亡原因（ｋｉｌｌｅｒ）としてＨＩＶ／エイズに次いで第２位である（Ｗａｒｒｅｎら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、２００６年７月、Ｉｎｔ Ｊ Ｔｕｂｅｒｃ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ．１０（７）巻：８１８−８２２頁）。ＣＤＣは、２０１１年において、推定８７０万人のＭＴＢの新規症例があり（ＨＩＶの同時感染は１３％）、ＨＩＶ陰性の個体のうちほぼ１００万件の死亡およびＨＩＶ陽性の人々のうち４３０，０００件の死亡を含む１４０万人の人々が、ＭＴＢにより死亡したと報告している。世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＭＴＢが２０１１年において女性の上位の死亡原因のうちの１つであり、ＨＩＶ陰性の女性のうち３００，０００人が死亡し、ＨＩＶ陽性の女性うち２００，０００人が死亡したと報告している。これは１５歳から４４歳の女性についての上位３つの死因のうちの１つである。ＭＴＢはまた、全死亡者のうちの４分の１となるＨＩＶに感染している人々の主要な死亡原因でもある。２０１１年において小児の中で推定５０万の症例があり、６４，０００人が死亡した。多剤耐性ＭＴＢ（ＭＤＲ−ＴＢ）が増加しており、調査した実質的に全ての国に存在している。地理的に、ＭＴＢの負荷はアジアおよびアフリカにおいて最も高い。ＷＨＯは、全体的にＭＴＢの症例の検出は低所得国（ＬＩＣ）において依然として６０％未満であり、世界全体で６６％のみであると報告している。すなわち、２０１１年においてＭＴＢに罹患している人々は推定８７０万人であり、活動性疾患を有する２９０万人が診断されておらず、国家的なＭＴＢ抑制プログラムに通知されていなかった。さらに、ＭＤＲ−ＭＴＢの症例の１９％のみが適切に診断され、通知されていた。新規ＭＴＢ患者の２０人に１人未満しか薬剤感受性試験を受けていなかった。ＭＴＢの蔓延のリスク、薬剤耐性株の出現の可能性およびＨＩＶ−１に感染している患者における疾患の重症度のために、低価格、迅速および正確なＭＴＢ分子試験が非常に重要である。慣用的な培養は時間がかかり、最大で６週間かかる可能性もある。抗酸性塗抹の顕微鏡検査が、マイコバクテリアを検出するための最も迅速な方法であるが、それは非感受性で非特異的である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ｗａｒｒｅｎら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、２００６年７月、Ｉｎｔ Ｊ Ｔｕｂｅｒｃ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ．１０（７）巻：８１８−８２２頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

（発明の要旨）
ＭＴＢの検出に有用な組成物および方法が本明細書に提供される。特に、特異的および高感度で試料中のＭＴＢを検出する、核酸増幅および検出手段のためのキット、試薬、反応混合物およびそれらに関連する方法が本明細書に提供される。このような組成物および方法は、喀痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）ならびに喀痰およびＢＡＬ試料のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣＬ）−ＮａＯＨ沈殿物のような異なるヒト試料中のＭＴＢ複合体を検出するためのプライマー、プローブ、プライマーセット、プライマーとプローブのセットおよび方法を含む。

【0005】

いくつかの実施形態において、配列番号１−９として本明細書に提供されるポリヌクレオチド試薬の２つ以上は組成物（例えば、試薬セット、キット、反応混合物など）中に組み合わされる。いくつかの実施形態において、核酸試薬の１つ以上または全ては検出可能な部分（例えば、合成標識）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のプライマーである配列番号１−４または７−８を含む。いくつかの実施形態において、組成物は１つ以上のプライマー対である配列番号１および２、３および４または７および８を含む。いくつかの実施形態において、組成物は配列番号５、６または９の１つ以上のプローブ（例えば、標識プローブ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物はプライマーとプローブのセット：配列番号１−２および５、３−４および６または７−９を含む。いくつかの実施形態において、組成物は配列番号７−９のような内部対照試薬を含む。いくつかの実施形態において、組成物は配列番号５および６を含む二重プローブシステムを含む。

【0006】

いくつかの実施形態において、組成物および方法は、プライマー、プローブ、プライマーセットおよび／またはプローブセットを有するポリヌクレオチド成分を含む試薬セットを利用する。いくつかの実施形態において、組成物のポリヌクレオチド成分は、上記のプライマー、プローブ、プライマーセットまたはプローブセットの組合せからなる。反応混合物として、組成物は、個々にまたは組み合わせて（例えば上記の組合せ）、このようなポリヌクレオチドおよび試料中に含まれる任意のポリヌクレオチドからなってもよい（すなわち、非試料核酸分子のみが配列番号１−９によって表されるポリヌクレオチドである。

【0007】

本明細書に提供されるプライマーセットは２つのプライマーを含み、例えばＰＣＲにおける標的配列の増幅に有用である。いくつかの実施形態において、組成物は、プライマーによって生成されたアンプリコンを検出する少なくとも２つのプライマーおよび１つ以上（例えば２つ以上）のプローブを含む。

【0008】

試料中のＭＴＢを検出するための方法もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）核酸増幅試薬、本明細書に記載されている少なくともポリヌクレオチドプライマーまたはプローブおよび少なくとも１つの標的配列を含有している可能性がある試験試料を含む反応混合物を形成するステップ、ならびに（ｂ）混合物を増幅条件に供して標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は生成したアンプリコンを検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、（ｃ）プローブを標的配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズして、プローブおよび標的配列に相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成するステップ、ならびに（ｄ）試験試料中のＭＴＢの存在の指標としてハイブリッドを直接的または間接的に検出するステップを含む。

【0009】

さらに、増幅がＰＣＲまたは同様のサーマルサイクリング増幅プロセスである場合、ステップ（ｂ）は標的配列コピーの数を増加させるために複数回反復されてもよい。

【0010】

別の実施形態によれば、ＭＴＢおよび１種以上のさらなる感染因子（例えばＨＩＶ）または他の核酸分子（例えばヒト配列）の両方が検出される。したがって、いくつかの実施形態において、組成物はこのような他の因子または核酸分子を検出するための試薬を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、組成物および方法はさらに対照試薬またはキット成分（例えば、陽性対照、陰性対照）を利用する。いくつかの実施形態において、対照試薬は合成標的核酸を含む。いくつかの実施形態において、対照試薬は、試料中に存在することが予想されるＭＴＢ、ヒトまたは他の配列を検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態において、合成または内因性に関わらず試料中の対照標的核酸は、ＭＴＢ標的核酸を増幅する増幅プライマーがまた、対照標的核酸も増幅するように選択される。いくつかのこのような実施形態において、ＭＴＢ標的核酸またはそれから生成されたアンプリコンを検出するプローブは対照標的またはそれから生成されたアンプリコンを検出しない。いくつかの実施形態において、対照標的核酸またはそれから生成されたアンプリコンを検出するが、ＭＴＢ標的核酸またはそれから生成されたアンプリコンを検出しない対照プローブが提供される。いくつかの実施形態において、定量するための内部標準が提供される。

【0012】

いくつかの実施形態において、上記で説明した試薬に加えてキットは、１つ以上の適切な容器、使用のための指示書、ソフトウェア（例えば、データ解析ソフトウェア）などを含む。いくつかの実施形態において、キットはポリヌクレオチドを標識するための試薬を含む。いくつかの実施形態において、キットにおける１つ以上の成分は凍結乾燥形態である。

【0013】

本開示の実施形態は、喀痰または気管支肺胞洗浄液およびそれらの沈殿物のような複合的な生体試料中のＭＴＢを識別するための組成物、キット、システムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、不活性化試薬ならびにＭＴＢを特異的および正確に分離し、識別できる単一のプローブまたは複数のプローブリアルタイム検出法を提供する。

【0014】

例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１および２、配列番号３および４または配列番号７および８から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つまたは３つ）のプライマー対を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は配列番号１−４および７−８を含む。いくつかの実施形態において、組成物は配列番号５、６または９から選択される少なくとも１つのプローブをさらに含む。

【0015】

さらなる実施形態は、配列番号１および２ならびに配列番号３および４のプライマー対のセットを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５、６または９から選択される少なくとも１つのプローブをさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号７および８のプライマー対をさらに含む。

【0016】

さらなる実施形態は、配列番号１−９の核酸の各々を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記の組成物は、配列番号１０−３６から選択される１つ以上の核酸配列を含むまたはそれらで置換されている。

【0017】

本開示の実施形態は、ａ）上述の組成物のいずれか、およびｂ）核酸増幅反応を実施するための少なくとも１種の試薬（例えば、核酸ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、緩衝液または不活性化試薬）を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、不活性化試薬は、水、洗浄剤、アルコールおよびＮａＯＨ（例えば、イソプロパノール、水酸化ナトリウム、ＴＷＥＥＮ−２０および水）を含む。

【0018】

他の実施形態において、本開示は、マイコバクテリウム（ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）・ツベルクロシス（ＭＴＢ）核酸にハイブリダイズした上述の組成物または核酸のいずれかを含む反応混合物を提供する。いくつかの実施形態において、ＭＴＢ標的核酸は挿入配列（ＩＳ）６１１０およびタンパク質抗原Ｂ（ＰＡＢ）の１つ以上（例えば、両方）である。

【0019】

さらなる実施形態において、本開示は、ａ）対象由来の生体試料を、上述の核酸プライマーまたはプローブのいずれかと接触させるステップ、およびｂ）核酸プライマーまたはプローブのＭＴＢ核酸との結合を直接的または間接的に検出するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を識別する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ｃ）結合が検出される場合、試料中のＭＴＢの存在を決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出するステップはリアルタイムＰＣＲ検出による。いくつかの実施形態において、方法は、不活性化緩衝液を使用して試料中のＭＴＢを不活性化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、試料は、喀痰、気管支肺胞洗浄液［ＢＡＬ］または喀痰およびＢＡＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン［ＮＡＬＣ］の沈殿物である。いくつかの実施形態において、方法は、不活性後に試料からＤＮＡを抽出するステップをさらに含む。

【0020】

さらに他の実施形態は、ａ）不活性化試薬により生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、１つ以上のプライマー対および１つ以上の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0021】

さらなる実施形態は、ａ）イソプロパノール、水酸化ナトリウム、ＴＷＥＥＮ−２０および水を含む不活性化試薬により前記生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４から選択される１つ以上のプライマー対ならびに配列番号５および６から選択される１つ以上の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）前記試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0022】

さらなる実施形態は、ａ）不活性化試薬により前記生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４から選択される１つ以上のプライマー対ならびに配列番号５および６から選択される１つ以上の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0023】

他の実施形態は、ａ）不活性化試薬により生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４から選択される１つ以上のプライマー対ならびに配列番号５および６から選択される１つ以上の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）リアルタイムＰＣＲアッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0024】

さらに他の実施形態は、ａ）不活性化試薬により生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）前記ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４から選択される１つ以上のプライマー対ならびに配列番号５および６から選択される１つ以上の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施してＩＳ６１１０およびＰＡＢから選択される１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0025】

特定の実施形態において、本開示は、ａ）不活性化試薬により生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４のプライマー対ならびに配列番号５および６の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0026】

いくつかの実施形態において、本開示は、ａ）イソプロパノール、水酸化ナトリウム、ＴＷＥＥＮ−２０および水を含む不活性化試薬により生体試料を不活性化して、不活性化した試料を生成するステップ、ｂ）不活性化した試料からＤＮＡを抽出するステップ、ｃ）ＤＮＡを、配列番号１および２ならびに配列番号３および４のプライマー対ならびに配列番号５および６の核酸プローブと接触させるステップ、ｄ）増幅アッセイを実施して１つ以上のＭＴＢ核酸標的を増幅するステップ、ならびにｅ）試料中の標的の存在を識別するステップを含む、生体試料中のＭＴＢ核酸を検出する方法を提供する。

【0027】

さらなる実施形態が本明細書に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本明細書に提供される技術のいくつかの実施形態におけるＭＴＢアッセイワークフロー図を示す。

【図2】４６個のＭＴＢの系統発生的および地理的に多様なＭＴＢ分離株の検出からのデータを示す。

【図3】試料調製についてのＭＴＢアッセイワークフロー図を示す。

【図4】ＭＴＢ複合ゲノムＤＮＡが、アッセイ包括性を決定するために試験されたときに決定した平均サイクル数値を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

ＭＴＢの検出に有用な組成物および方法が本明細書に提供される。特に、試料中のＭＴＢを特異的および高感度で検出する、核酸増幅および検出手段のためのキット、試薬、反応混合物およびそれらに関連する方法が本明細書に提供される。

【0030】

いくつかの実施形態において、ＭＴＢの核酸配列またはその相補体と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。これらのポリヌクレオチドは、試料中に存在する場合、ＭＴＢを増幅し、ＭＴＢの存在を特異的に検出する用途が見出されている。例示的なポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１−９または１０−３６によって記載されている。

【0031】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているアッセイは、複数（例えば２つ）の異なるＭＴＢ特異的プライマー／プローブセットを利用する。例えば、いくつかの実施形態において、第１のセットはマルチコピー挿入エレメント、ＩＳ６１１０（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９０年；１８巻：１８８頁）を検出するように設計され、第２のセットは単一コピー遺伝子であるＰＡＢ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＢ、Ｈａｎｓｅｎ ＥＢ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８９年；５７巻：２４８１−２４８８頁）を検出するように設計されている。ＩＳ６１１０を欠損している（Ｍａｔｈｅｍａ Ｂら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６年；１９巻：６５８−６８５頁）またはＰＡＢ遺伝子を欠失している（Ｇｉｌｐｉｎ ＣＭら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００２年；４０巻：２３０５−２３０７頁）ＭＴＢ株が報告されているので、両方の標的の使用は偽陰性結果のリスクを最小化する。本明細書に記載されている実験により、二重標的戦略が高い信頼性によりＭＴＢゲノムＤＮＡの検出をもたらすことが実証された。

【0032】

マイコバクテリアの細胞壁は、親油性分子および多糖の複合的な構造のために、従来の細胞溶解技術に対して耐性がある。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＴＢ検出アッセイは、ＴＢ細胞溶解およびゲノムＤＮＡ放出について最適化したインキュベーション温度および混合条件によりグアニジニウムチオシアネート−磁性微粒子精製法を利用する。本明細書に記載されているアッセイの実施形態の開発の間に行われた実験により、試料ＤＮＡ抽出法がＴＢ細胞溶解についての機械的なビーズビーティング（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）と同等の効率であることが示された。

【0033】

さらなる実験により、６６個のＭＴＢ複合体ＤＮＡ（８種の異なるＭＴＢ複合体種を含む）全てがアッセイによって検出されたことが実証された。アッセイの信頼性は４つの方法で評価された。第１に、アッセイの特異性は８０個の潜在的に異なる交差反応物を試験することによって評価された。潜在的な交差反応物のどれも検出されなかった。第２に、偽陽性またはキャリーオーバーが陰性試料において検出されるかどうかを決定するために高陽性ＭＴＢ試料が陰性試料と共に処理される、キャリーオーバー評価を実施した。偽陽性は観察されなかった。第３に、様々な潜在的に干渉する物質がアッセイ性能に対するそれらの影響について試験された。干渉が観察された８．３％および５．０％のウシ粘液を除いて、干渉は観察されなかった。この干渉は、粘液濃度が２．５％以下に低下した場合に除去された。臨床検体が試験された場合、無効なＩＣの結果を有する検体の割合は０．３％であり、本明細書に記載されている試料調製法が効果的にＰＣＲ阻害剤を除去したことが実証された。このことは、プロトコルのロバスト性の証拠を提供し、ウシ粘液によって引き起こされる干渉の影響がアッセイに重要でない可能性が高いことを示す。最後に、低陽性（３倍のＬＯＤ）および陰性パネルを試験するために、複数の使用者が複数のｍ２０００機器システムまたは手動による試料調製を使用する、再現性試験が実施された。１００％の再現性が観察された。これらのデータにより、分析試験および臨床試料試験に使用される場合、アッセイのロバスト特性が支持される。

【0034】

ＭＴＢ検出アッセイの臨床的有用性は、保存された試料および予め採取された試料の両方を使用して５つの国においてＴＢを有すると疑われる患者から採取した喀痰およびＮＡＬＣ検体を試験することによって評価された。全体のアッセイ感度は９３％であったが、それは、塗抹陽性培養陽性試料では９９％であり、塗抹陰性培養陽性試料では８１％であった。特異性は９７％であった。米国内からの非ＴＢと思われる集団からの分析的特異性試験および喀痰試料試験の結果は全て１００％の特異性を示した。臨床的特異性はアッセイ結果と培養結果との比較に基づいて決定された。

【0035】

本明細書に記載されている技術の実施形態は、高い感度および特異性によるハイスループット、自動ＭＴＢ検出を提供する。従来の培養アッセイと比較して、この技術は、臨床検体におけるマイコバクテリアの直接検出を可能にすることによってＴＢの迅速な診断を顕著に改善する。このアッセイは、従来の抗酸性塗抹の顕微鏡検査と比較して優れた感度および特異性を提供する。現在のＭＴＢ診断アッセイとの相違は培養陽性および塗抹陰性集団（試料中のＴＢ濃度が低い）における感度の欠如である。本明細書に提供される技術の実施形態はその相違を埋める。本明細書に提供されるアッセイは、喀痰試料を用いて作業することが困難な場合でさえも、非常に低い阻害率によりロバストである。このことは、無効な試料の反復試験に必要とされる時間を低減させる。いくつかの実施形態において、より大きな標的感度および標的領域における突然変異／欠失によって引き起こされる偽陰性アッセイ結果のより少ない可能性を提供する、マルチコピーＭＴＢ標的が調べられる。実施形態は特有で効果的なＭＴＢ不活性化法をさらに提供する。

【0036】

本明細書に使用されている場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、第２の核酸に検出可能で特異的に結合する核酸の能力を指す。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸とのかなりの量の検出可能な結合を最小化するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。特異的ハイブリダイゼーションを達成するために使用され得るストリンジェントな条件は当該技術分野において公知である。

【0037】

本明細書に使用されている場合、「標的配列」または「標的核酸配列」とは、ＭＴＢもしくは検出されるべき他の配列（例えばＨＩＶ）またはそれらの相補体の核酸配列を意味し、それは本明細書に提供されるポリヌクレオチドの１つ以上を使用して増幅、検出または増幅および検出の両方をされる。さらに、標的配列という用語は時々、二本鎖核酸配列を指すが、当業者は、標的配列はまた、一本鎖であってもよいことを認識する。標的が二本鎖である場合、ポリヌクレオチドプライマー配列は、好ましくは、標的配列の両方の鎖を増幅する。多かれ少なかれ特定の生物に対して特異的である標的配列が選択されてもよい。例えば、標的配列は、全ての属、１つより多い属、種または亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、分離株または生物の他のサブセットに特異的であり得る。

【0038】

本明細書に使用されている場合、「試験試料」という用語は、生物、生体液、環境試料またはＭＴＢ標的配列を含有する疑いがあるもしくはそれを潜在的に含有する他の試料から採取された試料を意味する。試験試料は、例えば、組織、血液、唾液、喀痰、喀痰のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）−ＮａＯＨ沈殿物、粘液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、汗、尿、尿道スワブ、頸部スワブ、泌尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼球レンズ液、脳脊髄液、乳液、腹水、滑液、腹膜液、羊水、発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物などのような任意の生物源から採取されてもよい。試験試料は、（ｉ）供給源から直接得られたものとして使用されてもよく、または（ｉｉ）試料の特性を変化させるための前処理後に使用されてもよい。したがって、試験試料は、例えば、血液から血漿または血清を調製すること、細胞またはウイルス粒子を破壊すること、固体材料から液体を調製すること、粘性流体を希釈すること、液体を濾過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、干渉成分を不活性化すること、試薬を添加すること、核酸を精製することなどによって使用前に前処理されてもよい。

【0039】

本明細書に使用されている場合、「標識」という用語は、検出および任意に定量できる特性または特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば（限定されないが）、放射性同位体、フルオロフォア、ケミルミノフォア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などのように直接的に検出可能であってもよく、または標識は、例えば、特異的結合メンバーのように間接的に検出可能であってもよい。直接的に検出可能な標識は、標識の検出および／または定量を可能にするために、例えば、基質、トリガー試薬、クエンチング部分、光などのようなさらなる成分を必要としてもよいことが理解される。間接的に検出可能な標識が使用される場合、それらは典型的に「コンジュゲート」と組み合わせて使用される。コンジュゲートは、典型的に、直接的に検出可能な標識に結合またはカップリングしている特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当該技術分野において周知であり、例えば、特異的結合メンバーの特異的結合特性または標識の検出可能な特性を破壊しない任意の化学的手段および／または物理的手段を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「特異的結合メンバー」とは、結合対のメンバー、例えば、化学的または物理的手段を介して、例えば、分子の１つが他の分子と特異的に結合する２つの異なる分子を意味する。抗原および抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対には、限定することを意図しないが、アビジンおよびビオチン、ハプテンおよびハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子または基質および酵素などが含まれる。

【0040】

ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡまたは（限定されないがＰＮＡのような）ＲＮＡもしくはＤＮＡ模倣物およびそれらの誘導体およびそれらの同族体の核酸ポリマーである。したがって、ポリヌクレオチドには、天然に存在する核酸塩基、糖およびヌクレオシド間（骨格）共有結合から構成されるポリマーならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するポリマーが含まれる。そのような修飾または置換された核酸ポリマーは、当該技術分野において周知であり、本発明の目的のために、「類似体」と称されている。調製の容易さのためおよび当業者によく知られているように、ポリヌクレオチドは、好ましくは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の修飾または非修飾ポリマーである。

【0041】

有用なポリヌクレオチド類似体には、修飾骨格を有するポリマーまたは非天然ヌクレオシド間結合が含まれる。修飾骨格には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネートのような、骨格中にリン原子を保持しているものならびに短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格のような、リン原子をもはや有していないものが含まれる。このようなリンを含有していない骨格の例はモルホリノ結合である（例えば、米国特許第５，１８５，４４４号、同第５，０３４，５０６号および同第５，１４２，０４７号を参照のこと。それらの全ては参照により本明細書に組み込まれている。）。修飾された核酸ポリマー（類似体）は１つ以上の修飾された糖部分を含有していてもよい。例えば、糖部分は、２’位における２−メトキシエトキシ（２−ＭＯＥ）基による置換によって修飾されていてもよい（例えば、Ｍａｒｔｉｎら、（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、７８巻：４８６−５０４頁を参照のこと。）。

【0042】

実施形態はまた、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方が新たな基で置き換えられている、ＲＮＡまたはＤＮＡ模倣物である類似体を意図する。これらの模倣物において、塩基単位は標的配列とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このような模倣物の例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である（参照により本明細書に組み込まれている、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１４９７−１５００頁、国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２）。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ−窒素原子に直接的または間接的に結合している。

【0043】

意図されるポリヌクレオチドは、核酸分子が、置換、化学的手段、酵素的手段または天然に存在するヌクレオチド以外の部分を用いた、例えば、本明細書に記載されているように標識として機能する部分を用いた他の適切な手段によって共有結合的に修飾されている誘導体をさらに含んでもよい。

【0044】

本発明はさらに、配列番号１−９または１０−３６に記載されている核酸配列を有するポリヌクレオチドの相同体を包含する。相同体は、上記のように標的配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を破壊しない、配列番号１−９または１０−３６のいずれか１つに記載されている一次配列において少なくとも１つの変化を有する核酸である。したがって、一次配列は、例えば、配列番号１−９または１０−３６のヌクレオチドの１つ以上の例えば、挿入、付加、欠失または置換によって変化されていてもよい。したがって、配列番号１−９または１０−３６に開示されている配列の断片である相同体は、配列番号１−９または１０−３６の核酸配列の少なくとも約７、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上のヌクレオチドの連続配列を有していてもよく、上記のように標的配列と特異的にハイブリダイズする能力を保持する。通常、相同体は、配列番号１−９または１０−３６に記載されている核酸配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する。そのような配列に関する同一性は、配列を整列させ、必要な場合、最大の同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の既知のポリヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドの百分率として本明細書に定義されている。ヌクレオチド配列での末端（５’または３’）または内部の欠失、伸長または挿入は、同一性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。

【0045】

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＭＴＢ標的配列に特異的にハイブリダイズするプライマーおよびプローブ、例えば、ＭＴＢ標的配列と特異的にハイブリダイズできる、前記核酸配列の類似体および／または誘導体ならびにそれらの相同体を含む、配列番号１−９または１０−３６に記載されている核酸配列のいずれか１つを有する核酸分子を含む。以下に記載されているように、ポリヌクレオチドは、ＭＴＢを増幅または検出するためのプライマーおよび／またはプローブとしての用途が見出されている。

【0046】

ポリヌクレオチドは様々な技術によって調製され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）から入手可能なもののような市販の装置を使用して固相合成を使用して調製され得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような修飾されたポリヌクレオチドも容易に調製され得る（例えば、米国特許第５，４６４，７４６号、同第５，４２４，４１４号および同第４，９４８，８８２号を参照のこと）。

【0047】

ポリヌクレオチドは、試験試料中のＭＴＢ核酸の検出もしくは定量または両方のためのプローブとして直接的に利用され得る。試験試料は適切なハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドの少なくとも１つと接触され、次いで標的配列とポリヌクレオチドの少なくとも１つとの間のハイブリダイゼーションが検出される。検出は直接的であってもよく、または間接的であってもよい。いくつかの実施形態において、プローブと標的との間のハイブリッドが直接的に検出される。いくつかの実施形態において、ハイブリッドは、例えば、プローブとＭＴＢ標的との間の二本鎖の存在下で生じる酵素反応によって生成された反応副生成物を検出することによって、間接的に検出される（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）。

【0048】

ポリヌクレオチドは１つ以上の検出可能な標識を組み込んでもよい。検出可能な標識は、直接的または間接的に検出され得る特性または特徴を有する分子または部分であり、その標的配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力に悪影響を与えないように選択される。

【0049】

検出標識は、以前に定義されている「標識」と同じ定義を有し、「捕捉標識」は、典型的に、伸長産物および任意のそのような産物に関連するプローブを他の増幅反応物から分離するために使用される。特異的結合メンバー（以前に定義されている通り）はこの目的によく適している。また、この方法に従って使用されるプローブは、それらがハイブリダイゼーション条件下で伸長されないように、それらの３’末端でブロックされ得る。プローブの伸長を阻止する方法は周知であり、当業者にとって選択の問題である。

【0050】

標識がプライマーによって増幅された産物を検出するために利用される場合、プライマー配列は、任意に、捕捉標識または検出標識のいずれかにより標識され得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、ＭＴＢ標的核酸とハイブリダイズする３’部分およびそれから生成された伸長産物に非ＭＴＢ配列を導入する５’部分を含む。このような５’部分は、例えば、次世代シークエンシング技術において使用するための合成タグ配列を含んでもよい。

【0051】

いくつかの実施形態において、プローブは、プライマー配列によって生成された伸長産物またはアンプリコンとハイブリダイズするために使用され、典型的には、プライマー配列を含まない配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、プライマーが捕捉標識により標識される場合、プローブは検出標識により標識され、その逆も同様であることを注意した上で、プライマー配列と同様に、プローブ配列もまた、捕捉標識または検出標識のいずれかにより標識されてもよい。コピー配列／プローブハイブリッドが形成すると、コピー配列およびプローブ配列上の異なる標識（すなわち、捕捉および検出標識）が、このようなハイブリッドを分離し、検出するために使用され得る。

【0052】

ポリヌクレオチドはサンドイッチ型アッセイにおける捕捉プローブとしての使用にも適している。簡潔に述べると、ポリヌクレオチド捕捉プローブは、固体支持体に結合され、プローブ：標的ハイブリッドが捕捉プローブと試験試料中に存在する任意の標的核酸との間に形成されるように適切なハイブリダイゼーション条件下で試験試料と接触される。１つ以上の適切な洗浄ステップの後、プローブ：標的ハイブリッドは、通常、第２の「開示」プローブによって検出され、またはハイブリッド分子を認識する特異的抗体によって検出される。

【0053】

実施形態はまた、改変された核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるポリヌクレオチドの使用を意図する。例えば、米国特許第５，６２７，０３０号は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて検出信号を増幅するための方法を開示している。開示されたアッセイにおいて、第１のポリヌクレオチドプローブ配列は適切な条件下で標的配列にハイブリダイズされ、続いてプローブ：標的ハイブリッドが免疫捕捉され、固定化される。次いで、多くの反復配列単位を含有する第２のポリヌクレオチドプローブがプローブ：標的ハイブリッドのプローブ成分にハイブリダイズされる。検出は多くの標識された核酸配列プローブのハイブリダイゼーションによって達成され、反復配列単位の各々に対する１つは第２のプローブに存在する。したがって、複数の標識プローブの第２のプローブとの結合は、検出信号を増幅し、アッセイの感度を増加させる。

【0054】

ＭＴＢヌクレオチド配列の増幅および検出
ポリヌクレオチドは、試験試料中のＭＴＢを増幅および／または検出するためのプライマーまたはプローブとして使用され得る。本明細書に提供されるプライマー／プローブセットは、少なくとも２つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブを含む。これらのプライマー／プローブセットは核酸増幅技術に従って利用され得る。したがって、任意の特定のプライマー／プローブセットにおけるプライマーが標的配列を増幅させるために利用され得る。ほとんどの場合、プローブは、１つ以上のプライマーによって生成された標的配列のコピーにハイブリダイズし、一般に、増幅反応の過程の間に生成された標的配列の任意のコピーの検出を容易にする。プライマー／プローブセットの全ては、適切なプライマーおよびプローブが組み合わされる場合、ＭＴＢを特異的および高感度で検出するための核酸増幅手段に従って利用され得る。または、本明細書に提供されるプライマー／プローブセットの個々のプライマーおよびプローブは、代替的に本明細書に提供されるプライマー／プローブセットに記載されているもの以外のプライマーおよび／またはプローブと組み合わせて使用されてもよいことが意図される。いくつかの実施形態において、２つのプライマーおよびプローブセットが２つの異なるＭＴＢ標的配列を検出するために利用される。

【0055】

増幅手段には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＴＭＡ、ローリングサークル増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。当業者は、特定の増幅技術における使用に関して、プライマーが修飾される必要があり得、例えば、ＳＤＡに関して、プライマーは、制限エンドヌクレアーゼについての認識部位を構成するその５’末端付近にさらなるヌクレオチドを含むことを理解する。同様に、ＮＡＳＢＡに関して、プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを構成する５’末端付近にさらなるヌクレオチドを含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、特定の基準が、増幅反応のためのプライマーを選択する場合に考慮される。例えば、プライマー対が増幅反応のために必要とされる場合、プライマーは、３’二本鎖を形成する可能性が最小となるように選択されるべきであり、融解温度（Ｔ_Ｍ）が標的配列に対するアニーリングを最適化し、非特異的アニーリングの量を最小化するのに十分に類似するように選択されるべきである。

【0057】

いくつかの実施形態において、増幅方法は、（ａ）核酸増幅試薬、少なくとも１つのプライマー／プローブセットおよび少なくとも１つの標的配列を含有することが疑われている試験試料を含む反応混合物を形成するステップ、ならびに（ｂ）混合物を増幅条件に供して、標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも１つのコピーを生成するステップを含む。上記の方法のステップ（ｂ）は、例えば、反応混合物を１０から１００回の間、典型的には約２０から約６０回の間、より典型的には約２５から約４５回の間、サーマルサイクルすることによって、（検出方法におけるステップ（ｃ）の前に）任意の適切な回数反復されてもよい。

【0058】

核酸増幅試薬には、限定されないが、少なくともポリメラーゼ活性を有する酵素、マグネシウムまたはマンガンのような酵素補因子、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）ならびに例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸およびデオキシチミン三リン酸のようなデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が含まれる。

【0059】

増幅条件は一般に、１つ以上の核酸配列のアニーリングおよび伸長を促進する条件である。

【0060】

上記のように、ポリヌクレオチドを使用した標的核酸配列の増幅によって産生された特定のアンプリコンは様々な方法によって検出され得る。例えば、増幅反応に使用されるプライマーの１つ以上は、アンプリコンが増幅反応の後に従来技術によって直接的に検出され得るように標識され得る。または、増幅反応に使用されるプライマーの１つの標識型からなるプローブまたは標識されているプライマー配列とは異なり、増幅された配列の領域と相補的である第３のポリヌクレオチドが、増幅反応が完了した後に添加されてもよい。次いで、混合物は適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に供され、標識が従来の方法によって検出される。

【0061】

上記のように産生された増幅産物は標的配列の増幅の間または後に検出され得る。増幅（例えば、リアルタイムＰＣＲ）の間の標的配列の増幅を検出するための方法は、上記に概説されており、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号に記載されている。または、増幅産物はプローブにハイブリダイズされ、次いで他の反応成分から分離され、微粒子および標識プローブを使用して検出される。

【0062】

標的核酸配列の増幅および検出の両方を単一の閉じた反応容器中で同時に行うことを可能にする手段が有利であることは容易に理解される。そのような手段は、増幅後の処理ステップにおける「キャリーオーバー」汚染のリスクを回避し、また、ハイスループットスクリーニングまたはアッセイおよび手段の自動化への適応も容易にする。さらに、この種の手段は増幅反応の「リアルタイム」モニタリングおよび「エンドポイント」モニタリングを可能にする。この種の手段に特によく適しているプローブ分子の例には、分子ビーコンプローブおよびＴＡＱＭＡＮプローブが含まれる。ＴＡＱＭＡＮプローブは、一般に、フルオロフォアにより５’末端においておよびクエンチャーにより３’末端において標識されている標的配列に相補的なポリヌクレオチドから構成される二重標識蛍光核酸プローブである。遊離プローブにおいて、フルオロフォアおよびクエンチャーの近接により、フルオロフォアが内部でクエンチされることが確実にされる。増幅反応の伸長段階の間、プローブはポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、フルオロフォアが放出される。次いで、放出されたフルオロフォアは蛍光を発することができ、したがって検出可能な信号を生成する。

【0063】

いくつかの実施形態において、「分子ビーコン」プローブが利用される。分子ビーコンプローブは、例えば、米国特許第６，１５０，０９７号、同第５，９２５，５１７号および同第６，１０３，４７６号（それらの全体は参照により本明細書に組み込まれている。）に記載されている。基本的に、分子ビーコンは、ステムループ（ヘアピン）構造を形成することができるポリヌクレオチドプローブである。ループは標的配列に相補的な配列を含有する一本鎖構造であるのに対して、ステムは典型的に標的配列と無関係であり、二本鎖領域を形成するために自己ハイブリダイズする。標的配列に相補的であり、自己ハイブリダイズすることもできるヌクレオチドはまた、ステム領域の一部を形成し得る。ステムの一方のアームにフルオロフォア部分が結合し、他方のアームにクエンチャー部分が結合する。ポリヌクレオチドがヘアピン形状をとる場合、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、したがってフルオロフォアによって放出されたエネルギーはクエンチャーによって吸収され、熱として放出され、その結果、フルオロフォアの内部クエンチングをもたらす。ポリヌクレオチドがその標的配列に結合すると、フルオロフォアおよびクエンチャーは空間的に分離され、フルオロフォアは検出可能な信号を生成する蛍光を発することができる。

【0064】

用途が見出されているフルオロフォアの例には、限定されないが、ジハロ−（Ｃ_１からＣ_８）ジアルコキシカルボキシフルオレセインのようなフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）、５−カルボキシローダミン、シアニン色素などが含まれる。クエンチャーには、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｓｔｉｏｎ）（ＢＨＱ）色素などが挙げられる。

【0065】

いくつかの実施形態において、定量的アッセイが利用される。いくつかのこのような実施形態において、内部標準が反応に利用される。このような内部標準は一般に対照標的核酸配列および対照ポリヌクレオチドプローブを含む。内部標準は任意にさらなるプライマー対をさらに含んでもよい。これらの対照プライマーの一次配列はＭＴＢポリヌクレオチドと無関係であり得、対照標的核酸配列に特異的であり得る。または、対照標的配列がＭＴＢプライマーを結合するように設計されている場合、さらなるプライマーが使用される必要はない。試験試料中の標的核酸の量は、「エンドポイント」法または「リアルタイム」法を使用して定量され得る。

【0066】

いくつかの実施形態において、ＭＴＢ検出アッセイはハイスループットアッセイとして提供される。ハイスループットアッセイに関して、反応成分は、通常、マルチウェルマイクロタイタープレートのようなマルチ容器担体またはプラットフォーム内に収容され、これにより、異なる試験試料を含有する複数のアッセイ反応物を同じアッセイにおいてモニターすることができる。いくつかの実施形態において、高度に自動化されたハイスループットアッセイが、スクリーニングまたはアッセイプロセスの効率を向上させるために利用される。試料および試薬ピペッティング、液体分注、時間調節温置、マイクロアレイへの試料の形式合わせ、マイクロプレートのサーモサイクリングおよび適切な検出器におけるマイクロプレート読み取りのような多くの手段についての自動化能力のように、多くのハイスループットスクリーニングまたはアッセイシステムが現在市販されており、その結果、スループット時間が非常に速くなった。いくつかの実施形態において、反応はマイクロ流体デバイス（例えば、カード）において実施される。

【0067】

ポリヌクレオチド、方法、およびキットは、ＭＴＢ核酸の検出および／または定量のための臨床または研究状況において有用である。したがって、これらの状況において、ポリヌクレオチドは、対象におけるＭＴＢ感染を診断するため、またはＭＴＢに感染した対象におけるＭＴＢ標的核酸配列の量をモニターするためのアッセイにおいて使用され得る。対象における細菌の量をモニターすることは、抗菌療法に対する反応を識別またはモニターする際に特に重要である。

【0068】

いくつかの実施形態において、二重標的アッセイは試料不活性化と組み合わせてリアルタイムＰＣＲを使用して実施される。様々な試料が使用され得るが、臨床的に関連性の高い試料には、喀痰（誘発または喀出）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料または喀痰およびＢＡＬ試料のＮ−アセチル−Ｌシステイン（ＮＡＬＣ）処理した沈殿物の塗抹陽性または塗抹陰性検体が含まれる。これらの試料により提示された課題は、分子アッセイ、細胞溶解および細胞不活性化を干渉し得る多数の成分を含有する喀痰の分子複雑性を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、試料不活性化ステップは、ＭＴＢを含有し得る臨床検体に関連している感染リスクを減少させるために実施される。感染リスクの減少は、例えば、臨床試料を不活性化試薬とインキュベートすることによって達成される（以下の実施例３を参照のこと）。

【0070】

いくつかの実施形態において、アッセイはＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐシステムのような自動リアルタイムＰＣＲ検出システムとの使用に適している。したがって、いくつかの実施形態において、アッセイを行う前に、試料がそのようなシステムとの使用のために調製される。例えば、いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡの調製は磁性微粒子ベースの技術（Ａｂｂｏｔｔ ｍＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＤＮＡ）を使用して実施される。これは、自動試料調製のためのＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐを使用して実施されてもよく、または手動試料調製プロトコルを使用して実施されてもよい。いくつかの実施形態において、内部対照（ＩＣ）、陽性対照および陰性対照は、プロセスが正確に進行していることを実証するために試料調製の開始から処理される。

【0071】

増幅に関して、いくつかの実施形態において、精製された試料ＤＮＡおよびマスターミックスがＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器を使用して、または手動で９６ウェルＰＣＲプレートに添加される。添加後、各プレートは密閉され、ＰＣＲ増幅がＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔに移される。

【0072】

いくつかの実施形態において、ＭＴＢ増幅産物の存在は、ＭＴＢプローブのリアルタイム蛍光信号を測定することによって、アニーリング／伸長ステップの間に検出される。ＩＣ増幅産物の存在はＩＣプローブのリアルタイム蛍光信号を測定することによって検出される。いくつかの実施形態において、ＭＴＢおよびＩＣプローブは、標的特異的結合配列、プローブの５’末端に共有結合した蛍光部分およびプローブの３’末端に共有結合したクエンチング部分からなる一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。ＭＴＢまたはＩＣ標的配列の非存在下で、プローブの蛍光はクエンチされる。ＭＴＢまたはＩＣ標的配列の存在下で、ＭＴＢまたはＩＣプローブは、蛍光発光および検出を可能にする、アニーリング／伸長ステップの間、標的におけるそれらの相補配列に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＭＴＢプローブは異なる蛍光色素（ＭＴＢ標的プローブについてＦＡＭ（商標）、ＩＣについてＱｕａｓａｒ（登録商標））により標識され、したがってＭＴＢおよびＩＣの増幅産物を同じ反応において同時に検出することができる。

【0073】

いくつかの実施形態において、ステップは核酸汚染を回避するために行われる。例えば、いくつかの実施形態において、汚染は最小化される。なぜなら、ＰＣＲ増幅およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは密閉されたマルチウェルプレート内で行われ、検出は反応容器（例えば、プレートウェル）を開ける必要なく自動的に実施され、エアロゾルバリアピペットチップは全てのピペッティングのために使用され、ピペットチップは使用後に廃棄され、個別の専用領域がＭＴＢアッセイを実施するために使用されるからである。

【0074】

いくつかの実施形態において、上記試薬はキットおよび／またはシステム（例えば、本明細書に記載されている自動試料取り扱いおよびアッセイ機器を含むシステム）の形態で提供される。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、以下を含み、本質的に以下からなり、または以下からなる：
１．ＭＴＢ内部対照（４つのバイアル、１つのバイアル当たり０．４ｍＬ）、キャリアＤＮＡを有する緩衝液中の０．０１％未満の非感染性線状ＤＮＡプラスミド。
防腐剤：アジ化ナトリウムおよび０．１５％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０。

【0075】

２．増幅試薬パック（４つのパック、２４回の試験／パック）。各試薬パックは、安定剤を有する緩衝液中に１つのボトル（０．０７８ｍＬ）のＤＮＡポリメラーゼ（５．４から５．９単位／μＬ）を含有する。１ボトル（０．５３１４ｍＬ）のＭＴＢ増幅試薬。０．１％未満の合成オリゴヌクレオチド（１つ以上の標的プライマーセットおよびプローブ、内部対照についてのプライマーセットおよびプローブ）および参照色素を有する緩衝液中の０．６％未満のｄＮＴＰ。防腐剤：アジ化ナトリウムおよび０．１５％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０。１ボトル（０．７７８ｍＬ）の活性化試薬。緩衝液中の３８ｍＭの塩化マグネシウム。防腐剤：アジ化ナトリウムおよび０．１５％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０。

【0076】

３．ＭＴＢ陰性対照（８つのバイアル、１つのバイアル当たり１．６ｍＬ）、緩衝液、防腐剤：アジ化ナトリウムおよび０．１５％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０。

【0077】

４．ＭＴＢ陽性対照（８つのバイアル、１つのバイアル当たり１．６ｍＬ）、キャリアＤＮＡを有する緩衝液中の０．０１％未満の非感染性線状ＤＮＡプラスミド。防腐剤：アジ化ナトリウムおよび０．１５％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０。

【0078】

いくつかの実施形態において、ＭＴＢの全ての形態が検出される（例えば、プライマーおよびプローブは試料中に存在し得る全てのＭＴＢ核酸標的配列を識別するように選択される。）。いくつかの実施形態において、抗生物質耐性株（例えば、リファンピシン、イソニアジド）のような特定のＭＴＢ配列が検出される。

【実施例】

【0079】

以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0080】

［実施例１］
例示的なアッセイワークフロー
この実施例は、試料中のＭＴＢを検出するためのリアルタイムＰＣＲを行うための特定の効果的な手法を記載している。いくつかの実施形態において、リアルタイムＰＣＲ法は以下のステップを含み、または以下からなる：
１．不活性化試薬（ＩＲ）を使用した試料（例えば、喀痰、気管支肺胞洗浄液［ＢＡＬ］ならびに喀痰およびＢＡＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン［ＮＡＬＣ］沈殿物）におけるＭＴＢの不活性化。いくつかの実施形態において、不活性化試薬は、イソプロパノール、水酸化ナトリウム、ＴＷＥＥＮ−２０および水を含み、またはそれらからなる。
２．ＤＮＡが試薬を使用して不活性化した試料から抽出される、試料調製；試料調製は自動ｍ２０００ｓｐ機器（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して実施され、または手動で実施される。
３．精製された試料およびアッセイＰＣＲ成分が９６ウェル光学反応プレートまたは他のマルチチャンバ反応支持体に一緒に加えられる、ＰＣＲアセンブリ；これはｍ２０００ｓｐを使用して実施され、または手動で実施される。
４．９６ウェル光学反応プレートの手動密閉およびｍ２０００ｒｔ機器へのプレートの移送。
５．自動ｍ２０００ｒｔ機器を使用したＰＣＲ産物の増幅および検出；患者の結果はｍ２０００ｒｔワークステーションに自動的に報告される。このワークフローの図式的概要は図１に示されている。

【0081】

［実施例２］
標的選択およびプライマー／プローブ設計
いくつかの実施形態において、二重標的戦略がＭＴＢ複合体を検出するために利用される。２つの標的には挿入配列（ＩＳ）６１１０およびタンパク質抗原Ｂ（ＰＡＢ）が含まれる。以下の表１を参照のこと：

【0082】

【表1】

【0083】

二重標的戦略の使用は標的配列の突然変異または欠失によって引き起こされる偽陰性結果を阻止する。

【0084】

ＩＳ６１１０およびＰＡＢ標的配列の検出に用途が見出されているプローブおよびプライマーには表２のものが含まれる。

【0085】

【表2】

【0086】

表３は、検出ＭＴＢ標的配列に使用するための代替のプライマーおよびプローブを提供する。ＩＳ６１１０およびＰＡＢに加えて、さらなる標的には、ｒＰＯＢ（ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードする単一コピー遺伝子、リファンピシン耐性突然変異の約９５％の部位）、ＳｅｎＸ３−ＲｅｇＸｅ（調節タンパク質をコードする単一コピー遺伝子）、ｈｓｐ６５（熱ショックタンパク質をコードする単一コピー遺伝子）およびＭＰＢ６４（２３ＫＤＡタンパク質をコードする単一コピー遺伝子）が含まれる。

【0087】

【表3】

【0088】

［実施例３］
試料不活性化
この実施例は試料不活性化ステップを行うための例示的な試薬および方法を記載している。

【0089】

不活性化試薬（ＩＲ）の調製
利用した材料：
・ポリプロピレンまたはガラス容器
・１０Ｍ ＮａＯＨ
・イソプロパノール
・ＴＷＥＥＮ−２０
・精製水
ＩＲの調製：
５００ｍＬに必要な材料の体積
１０Ｍ ＮａＯＨ ２０ｍＬ
精製水 １７９．１ｍＬ
イソプロパノール ３００ｍＬ
ＴＷＥＥＮ−２０ ０．９ｍＬ
１． １７９．１ｍＬの水を空のポリプロピレンまたはガラス容器（ポリスチレン容器の使用は避ける）に添加する。
２． ０．９ｍＬのＴＷＥＥＮ−２０を容器に添加する。
３． ２０ｍＬの１０Ｍ ＮａＯＨを容器に添加する。
４． ３００ｍＬのイソプロパノールを容器に添加する。
５． 成分を２０回反転させて混合する。
使用または最大１ヶ月間周囲温度にて保存。

【0090】

不活性化手段：
１． 凍結した場合、検体を１５から３０℃にて解凍する。
２． 不活性化する検体の体積を推定する。
３． １：３の比（例えば、１ｍＬの検体＋３ｍＬのＩＲ）（好ましい検体体積は０．３から１０ｍＬである。）にてＩＲを添加する。
４． 容器を反転させてＩＲと検体との間の接触を確実にする。
５． 混合物を２０から３０秒間ボルテックスする。
６． 混合物を周囲温度にて少なくとも１時間、好ましくは２４時間以下の間インキュベートする。混合物をインキュベーション期間内の２０から３０分にて２０から３０秒間、最後に１回ボルテックスする。

【0091】

［実施例４］
試料調製法：
実施例１のＭＴＢアッセイは、喀痰、ＢＡＬおよび喀痰またはＢＡＬ試料のＮＡＣＬ−ＮａＯＨ沈殿物を処理するためにＡｂｂｏｔｔ自動ｍ２０００ｓｐ機器を使用し、または手動による方法を使用し、増幅および検出のためにＡｂｂｏｔｔ自動ｍ２０００ｒｔ機器を使用する。両方のプロセスは試料からのＤＮＡ抽出を必要とし、両方のＤＮＡ精製はＡｂｂｏｔｔ ｍＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ_ＤＮＡからのＤＮＡ ＧＰＲ（リスト６Ｋ１２−２４）試料調製試薬を使用して実施される。

【0092】

試料調製試薬および方法（溶解ステップ、洗浄ステップ、溶出ステップ、チップ再使用手配などを含む）は、阻害喀痰またはＴＢ不活性化試薬（ＩＲ）のキャリーオーバーに起因するＰＣＲ反応に対する阻害効果を低減させるために最適化され、したがってＩＲ処理された試料中のＩＲを除去するための遠心分離は必要ではない。この手段はまた、高陽性から近くの陰性試料までのキャリーオーバーを低減させるために最適化される。試料調製はまた、効果的なＤＮＡ回収およびＰＣＲのためにＴＢ細胞破砕を確実にするために最適化される。

【0093】

リアルタイムＰＣＲ：
９６ウェル光学反応プレートにおけるＰＣＲ反応アセンブリ（手動またはｍ２０００ｓｐによるいずれか）の後、９６ウェルプレートを手動で密閉し、ｍ２０００ｒｔに移して増幅およびリアルタイム蛍光検出反応を実施する。患者の結果はｍ２０００ｒｔワークステーションにおいて自動的に報告される。ＭＴＢアッセイは、試料の有効性対照、試料抽出および増幅効率の対照として内部対照核酸配列を検出する。表４は例示的なＰＣＲサイクリング条件を提供する。

【0094】

【表4】

【0095】

以下の実施例に示されたデータに関して、４２のアッセイカットオフを使用した。つまり、Ｃｔ値が４２未満の試料はＭＴＢ検出とみなされ、一方、アッセイＣｔ値が４２超の試料はＭＴＢ非検出とみなされる。

【0096】

ｍ２０００ｒｔでのアッセイ実行は製造業者の推奨プロトコルに従う。１つのそのような例は以下のステップを含む：
１．９６個のＩＲ処理した試料を１回の実行ごとに実施する。１つの陰性対照および１つの陽性対照が各実行に含まれ、したがって最大で９４個のＩＲ処理した試料を１回の実行ごとに処理することができる。

【0097】

２．使用前に、ＩＲ処理した試料を３から５秒間ボルテックスする。ピペットを使用して、ＩＲ処理した試料を反応容器に移す。このステップの間、ＩＲ処理した試料中の目に見える微粒子の移動を最小化する。

【0098】

３．アッセイ対照、ＩＣおよび増幅試薬を２から８℃または１５から３０℃にて解凍する。解凍すると、ＩＣは、使用前に最大１４日間、２から８℃にて閉じた状態で保存することができる。解凍すると、対照は、使用前に最大２４時間、２から８℃にて保存することができる。任意の増幅試薬の延長した使用特性を使用しない場合：２から８℃または１５から３０℃にて新たな増幅試薬を解凍する。解凍すると、増幅試薬は、使用前に最大２４時間、２から８℃にて保存することができる。任意の増幅試薬の延長した使用特性を使用する場合：実行に使用する新たなおよび／または部分的な増幅試薬パックを選択する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ操作マニュアル（リスト番号９Ｋ２０−０６またはそれ以上）、増幅試薬パック在庫管理に関係する説明書についての操作説明書を参照のこと。増幅試薬パックは同じロット番号を有すべきである。

【0099】

４．各対照を使用前に毎回２から３秒間で３回ボルテックスする。気泡または泡状物が発生していないことを確実にする。見つけた場合、それらを各管について新たな滅菌ピペットチップを用いて除去する。バイアルの底に液体をもたらすようにベンチ上のバイアルを軽くたたくことによってボルテックスの後、各バイアルの内容物が底にあることを確実にする。

【0100】

５．Ａｂｂｏｔｔ ｍＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＤＮＡボトルを穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。開封時に試薬ボトルのいずれかにおいて結晶が観察された場合、結晶が消失するまで試薬を室温にて平衡させる。結晶が溶解するまで試薬を使用しない。気泡または泡状物が生成しないことを確実にし、存在する場合、各ボトルについて新たなチップを使用して滅菌ピペットチップにより除去する。注記：ｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡを２００ｍＬの試薬容器に注ぐ前に、ｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡが完全に再懸濁するまで、激しく混合し、またはボルテックスする。

【0101】

６．ＩＣバイアルを使用前に毎回２から３秒間で３回ボルテックスする。気泡または泡状物が生成しないことを確実にし、存在する場合、滅菌ピペットチップにより除去する。

【0102】

７．内部対照の用途のみのために専用の目盛り付き精密ピペットを使用して、１８０μＬのＩＣをｍＬｙｓｉｓＤＮＡ緩衝液の１つのボトルに添加する。容器を５から１０回穏やかに反転させることによって混合して泡立ちを最小化する。ｍＬｙｓｉｓＤＮＡ緩衝液の各ボトルは最大で４８個の試料調製を支援する。４９個から９６個の試料について１８０μＬのＩＣをｍＬｙｓｉｓＤＮＡ緩衝液の第２のボトルに添加する。任意の増幅試薬の延長した使用特性を使用する場合、ＩＣの部分的バイアルに再びキャップをして、２回目の使用のために２から８℃にて保存することができる。

【0103】

８．２５ｍＬのＵＳＰグレード１９０から２００のプルーフエタノール（９５から１００％のエタノール）をｍＬｙｓｉｓＤＮＡ緩衝液＋ＩＣ試薬ボトルに添加する。変性剤を含有するエタノールは使用しない。容器を穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。４９個から９６個の試料について、２５ｍＬのエタノールをｍＬｙｓｉｓＤＮＡ緩衝液＋ＩＣの第２のボトルに添加する。穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。

【0104】

９．７０ｍＬのＵＳＰグレード１９０から２００のプルーフエタノール（９５から１００％のエタノール）をｍＷａｓｈ２ＤＮＡボトルに添加する。変性剤を含有するエタノールは使用しない。ｍＷａｓｈ２ＤＮＡの各ボトルは最大で４８個の反応を支援する。穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。

【0105】

１０．陰性および陽性対照ならびに患者の検体をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ試料ラックに入れる。

【0106】

１１．５ｍＬの反応容器をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐの１ｍＬのサブシステムキャリアに入れる。

【0107】

１２．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ操作マニュアル、操作説明書に記載されているように、Ａｂｂｏｔｔ ｍＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＤＮＡ試薬を含有するキャリアラックおよびＡｂｂｏｔｔ ９６ディープウェルプレートをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐワークテーブルの上にロードする。

【0108】

１３．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ操作マニュアル、操作説明書に記載されているように、実行試料抽出（Ｒｕｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）スクリーンから、試料抽出プロトコルを選択し、開始する。注記：増幅試薬を取り扱う前に手袋を交換する。

【0109】

１４．試料調製が完了した後、増幅試薬パックおよびマスターミックスバイアル（必要に応じて）をＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐワークテーブル上にロードする。各増幅試薬パックは最大２４個の反応を支援する。１個から２４個の試料について１セットの試薬、２５個から４８個の試料について２セット、４９個から７２個の試料について３セットおよび７３個から９６個の試料について４セットを解凍する。増幅試薬は使用前に完全に解凍していることを確実にする。ベンチ上で直立位置においてバイアルを軽くたたくことによって内容物がバイアルの底にあることを確実にする。増幅試薬のバイアルのキャップを取り外す。任意の増幅試薬の延長された使用特性を使用する場合、新たなおよび部分的な試薬パックの組合せを使用することができる。任意の増幅試薬の延長された使用特性を使用しない場合、新たな試薬パックのみを使用することができる。ベンチ上で直立位置においてバイアルを軽くたたくことによって、新たな増幅試薬パックの内容物が増幅試薬を開封する前にバイアルの底にあることを確実にする。２回目に使用する部分的な増幅試薬パックは軽くたたかない。軽くたたくことによって、キャップ内のマスターミックス体積の損失が生じる場合がある。キャップを取り外す。新たな増幅試薬パックを２回目の使用のために保存する場合、バイアルを保存のために再びキャップする。試薬バイアルに再びキャップをするために元のキャップを再使用することを計画している場合、元のキャップを取っておいて、使用する。試薬バイアルに再びキャップをするために未使用のキャップを使用することを計画している場合、元のキャップは捨てる。部分的な増幅パックはＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐワークテーブル上の新たな増幅パックの左側にロードする。増幅試薬パックを機器にしっかりと固定することを確実にする。

【0110】

１５．対応する試料調製抽出と一致するランマスターミックス添加スクリーンから適切なディープウェルプレートを選択する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐマスターミックス添加プロトコルを開始する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ操作マニュアル、操作説明書のセクションに記載されている指示に従う。注記：増幅マスターミックスおよび試料溶出液のＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートへの組み込み（ステップ１５）は、試料調製の完了後１時間以内に開始しなければならない。注記：Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔプロトコル（ステップ２０）は、マスターミックス添加プロトコルの開始から９０分以内に始めなければならない。注記：ステップ１５の後に何らかの理由で実行が中止された場合、増幅試薬を捨て、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐマスターミックス添加プロトコル（ステップ１５）を反復する場合、新たな９６ウェルＰＣＲプレートを使用しなければならない。

【0111】

１６．増幅領域においてＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔのスイッチを入れ、初期化する。注記：Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔはウォームアップに１５分を必要とする。注記：試料調製領域に戻る前に実験着および手袋を交換する。

【0112】

１７．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器が試料の添加およびマスターミックスを完了した後、Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートをＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースに置く。

【0113】

１８．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ操作マニュアル、操作説明書のセクションに従ってＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートを密閉する。完了したＰＣＲプレートの結果をＣＤに（またはネットワーク接続を介してマッピングされたＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔに直接）エクスポートする。

【0114】

いくつかの実施形態において、手動試料調製法が利用される。そのような方法の一例は以下の通りである：
１．増幅試薬を１５から３０℃または２から８℃にて解凍する。このステップは試料調製手段の完了前に開始することができる。

【0115】

２．磁性ラックのセットごとに１２個の試料を処理する。陰性対照および陽性対照が各実行に含まれているので、最大で１０個の検体を処理することができる。以下のこれらのステップによって処理するために検体を調製する：注記：試料抽出を開始する前に患者の検体を不活性化しなければならない。

【0116】

３．ＭＴＢ陰性対照の１つの管、ＭＴＢ陽性対照の１つの管およびＭＴＢ内部対照の１つのバイアルを１５から３０℃または２から８℃にて解凍する。解凍してから、ＩＣをすぐに処理しない場合、使用前に最大１４日間、２から８℃にて保存する。解凍してから、対照をすぐに処理しない場合、使用前に最大２４時間、２から８℃にて保存する。使用前に毎回、対照およびＩＣを２から３秒間で３回ボルテックスする。バイアルの底に液体をもたらすようにベンチ上でバイアルを軽くたたくことによって、ボルテックスした後、各バイアルの内容物が底にあることを確実にする。気泡または泡状物が生成しないことを確実にし、存在する場合、各バイアルに対して新たなチップを使用して滅菌ピペットチップにより除去する。

【0117】

４．Ａｂｂｏｔｔ ｍＳａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍＤＮＡ試薬パックを開封する。開封時に試薬ボトルのいずれかにおいて結晶が観察された場合、結晶が消失するまで試薬を室温にて平衡させる。結晶が溶解するまで試薬を使用しない。

【0118】

５．７０ｍＬのＵＳＰグレード１９０から２００のプルーフエタノール（９５から１００％のエタノール）をｍＷａｓｈ ２ＤＮＡボトルに添加することによってｍＷａｓｈ ２ＤＮＡを調製する。変性剤を含有するエタノールは使用しない。穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。注記：延長された使用のためにエタノールが既に添加されていることを示すためにｍＷａｓｈ ２ＤＮＡボトルをマークする。

【0119】

６．２５ｍＬのＵＳＰグレード１９０から２００のプルーフエタノール（９５から１００％のエタノール）をｍＬｙｓｉｓＤＮＡボトルに添加することによってｍＬｙｓｉｓＤＮＡを調製する。変性剤を含有するエタノールは使用しない。５から１０回穏やかに反転させて混合し、泡立ちを最小化する。注記：延長された使用のためにエタノールが既に添加されていることを示すためにｍＬｙｓｉｓＤＮＡボトルをマークする。

【0120】

７．手動による実行に必要なｍＬｙｓｉｓＤＮＡ溶液の体積を計算する：（１．８５ｍＬのｍＬｙｓｉｓＤＮＡ×試料の数）。必要な体積のｍＬｙｓｉｓＤＮＡ溶液を、全体積を保持するのに十分な大きさのポリプロピレン容器にピペットで移す。手動による実行に必要なＩＣの体積を計算する：（３．５１μＬのＩＣ×試料の数）。内部対照の用途のみに専用の精密ピペットを使用して、必要な体積のＩＣを、手動による実行に必要なｍＬｙｓｉｓＤＮＡ溶液を含有するポリプロピレン溶液に添加する。１０から１５回穏やかに反転させることによってｍＬｙｓｉｓＤＮＡ溶液およびＩＣ混合物を混合して泡立ちを最小化する。最初の使用後、部分的なＩＣバイアルを最大１４日間、２から８℃にて保存し、さらに１回使用することができる。

【0121】

８．使用前にｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡボトルおよびｍＷａｓｈ １ＤＮＡボトルを除いて全ての試薬ボトルを５から１０回穏やかに反転させて均質な溶液を確実にする。ｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡボトルはステップ１１において混合する。

【0122】

９．温度が制御された乾燥加熱ブロックをオンにする。第１のブロックを５８℃に設定する。第２のブロックを８０℃に設定する。注記：加熱ブロックの温度を確認する。加熱ブロックが正確な温度になるまで処理しない。

【0123】

１０．全ての必要な管を標識する：溶解インキュベーションおよびｍＷａｓｈ １ＤＮＡステップについて１つの試料につき１つの５ｍＬ反応容器。第１および第２のｍＷａｓｈ ２ＤＮＡならびに溶出ステップについて１つの試料につき１つの１．５ｍＬの微量遠心管。溶出について１つの試料または１つの９６ウェルポリプロピレンプレートにつき１つの１．５ｍＬの微量遠心管。

【0124】

１１．各試料について標識された５ｍＬの反応容器を加熱していないスタンドに置く。粒子が懸濁状態になり、沈殿した粒子がボトルの底にもはや見られなくなるまで、ボルテックスし、または激しく振盪することによってｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡを再懸濁する。粒子を再懸濁した後、精密ピペッタおよび滅菌２００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、５０μＬのｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡを各反応容器に添加する。

【0125】

１２．各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、１．７５ｍＬ（２×８７５μＬ）のｍＬｙｓｉｓＤＮＡを反応容器に添加する。

【0126】

１３．各試料について精密ピペッタおよび未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、０．８ｍＬの対照および検体を適切な反応容器に添加する。均一な懸濁液が得られるまで、８００μＬの体積を５から１０回、吸引し、分注することによって各試料／ｍＬｙｓｉｓＤＮＡ混合物を混合する。注記：泡立ちを回避するために液体をゆっくり吸引し、分注する。

【0127】

１４．５ｍＬの反応容器を５８℃の加熱ブロックに移す。

【0128】

１５．タイマーを開始し、１５分間インキュベートする。

【0129】

１６．各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用したインキュベーション後、８００μＬを吸引し、分注することによって混合物を５回混合する。

【0130】

１７．タイマーを開始し、５８℃の加熱ブロックにおいてさらに１０分間インキュベートする。

【0131】

１８．各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用したインキュベーション後、８００μＬを吸引し、分注することによって混合物を５回混合する。

【0132】

１９．タイマーを開始し、５８℃の加熱ブロックにおいてさらに１０分間インキュベートする。

【0133】

２０．インキュベーションが完了した後、反応容器を磁性捕捉スタンドに２分間置き、粒子を反応容器の側面に捕捉させる。

【0134】

２１．反応容器が磁性捕捉スタンドにある状態で、各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップまたは使い捨てトランスファーピペットを使用して、各反応容器からｍＬｙｓｉｓＤＮＡを注意深く取り除き、流体を液体廃棄容器に捨てる。できるだけ完全に流体を取り除く。捕捉した磁性粒子は、かき乱さず、または吸引しない。

【0135】

２２．磁性ラックから反応容器を取り除き、非磁性ラックに移す。ｍＷａｓｈ １ＤＮＡ（洗浄）。

【0136】

２３．各試料について精密ピペッタおよび未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、８００μＬのｍＷａｓｈ １ＤＮＡを試料に添加し、ピペットチップにより吸引し、分注することによって穏やかに１０回混合することによって洗浄液中で磁性粒子を再懸濁する。必要な場合、粒子を反応容器の側面から洗浄する。注記：ｍＷａｓｈ １ＤＮＡ洗浄液を添加する場合、はね返りを回避するために液体をゆっくり分注する。

【0137】

２４．洗浄液および粒子を標識した１．５ｍＬの微量遠心管に移す。

【0138】

２５．管を磁性捕捉スタンドに１分間置いて管の側面に粒子を捕捉させる。

【0139】

２６．管が磁性捕捉スタンドにある状態で、各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、各管からｍＷａｓｈ １ＤＮＡを注意深く取り除き、流体を液体廃棄容器に捨てる。できるだけ完全に流体を取り除く。捕捉した磁性粒子は、かき乱さず、または吸引しない。

【0140】

２７．磁性ラックから管を取り除き、非磁性ラックに移す。ｍＷａｓｈ ２ＤＮＡ（１回目の洗浄）。

【0141】

２８．各試料について精密ピペッタおよび未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、８００μＬのｍＷａｓｈ ２ＤＮＡを試料に添加し、ピペットチップにより吸引し、分注することによって穏やかに５から１０回混合することによって洗浄液中で磁性粒子を再懸濁する。必要な場合、管の側面から粒子を洗浄する。注記：ｍＷａｓｈ ２ＤＮＡ洗浄液を添加する場合、はね返りを回避するために液体をゆっくり分注する。

【0142】

２９．管を磁性捕捉スタンドに１分間置いて粒子を管の側面に捕捉させる。

【0143】

３０．管が磁性捕捉スタンドにある状態で、各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、各管からｍＷａｓｈ ２ＤＮＡを注意深く取り除き、流体を液体廃棄容器に捨てる。できるだけ完全に流体を取り除く。捕捉した磁性粒子は、かき乱さず、または吸引しない。

【0144】

３１．管を磁性ラックから取り除き、非磁性ラックに移す。ｍＷａｓｈ ２ＤＮＡ（２回目の洗浄）。

【0145】

３２．各試料について精密ピペッタおよび未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、８００μＬのｍＷａｓｈ ２ＤＮＡを試料に添加し、ピペットチップにより吸引し、分注することによって穏やかに５から１０回混合することによって洗浄液中で磁性粒子を再懸濁する。必要な場合、管の側面から粒子を洗浄する。注記：ｍＷａｓｈ ２ＤＮＡ洗浄液を添加する場合、はね返りを回避するために液体をゆっくり分注する。

【0146】

３３．管を磁性捕捉スタンドに１分間置いて粒子を管の側面に捕捉させる。

【0147】

３４．管が磁性捕捉スタンドにある状態で、各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、各管からｍＷａｓｈ ２ＤＮＡを注意深く取り除き、流体を液体廃棄容器に捨てる。できるだけ完全に流体を取り除く。捕捉した磁性粒子は、かき乱さず、または吸引しない。

【0148】

３５．磁性ラックから管を取り除き、８０℃の加熱ブロックに移し、エタノールの蒸発を可能にするためにキャップを開いた状態で１５分間インキュベートする。

【0149】

３６．各試料について精密ピペッタおよび未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、２５０μＬのｍＥｌｕｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒＤＮＡを試料に添加し、ピペットチップにより吸引し、分注することによって流体中で磁性粒子を再懸濁する。必要な場合、管の側面から粒子を洗浄する。

【0150】

３７．管を８０℃の加熱ブロックに入れ、タイマーを開始し、４分間インキュベートする。

【0151】

３８．８０℃の加熱ブロックから管を取り出す。各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、２００μＬを吸引し、分注することによって試料およびｍＥｌｕｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒＤＮＡ混合物を４回混合する。

【0152】

３９．管を８０℃の加熱ブロックに戻す。タイマーを開始し、４分間インキュベートする。

【0153】

４０．８０℃の加熱ブロックから管を取り除き、磁性捕捉スタンドに１分間置いて粒子を管の側面に捕捉させる。

【0154】

４１．管が磁性捕捉スタンドにある状態で、各試料について未使用の滅菌１０００μＬエアロゾルバリアピペットチップを使用して、溶出した試料を管から注意深く取り除く。捕捉した微粒子は、かき乱さず、または吸引しない。溶出した試料は、未使用の標識した１．５ｍＬの微量遠心管または９６ウェルポリプロピレンプレートに入れることができる。注記：Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレート内への増幅マスターミックスおよび試料溶出液のアセンブリ（ステップ４８）は、試料調製の完了後、１時間以内に開始しなければならない。

【0155】

４２．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ機器をオンにし、初期化する。注記：Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔはウォームアップするのに１５分を必要とする。

【0156】

４３．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ試験オーダーを作成する。Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ操作マニュアルの操作説明書の段落を参照のこと。プロトコルスクリーンから、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイ増幅プロトコルを選択する。注記：試薬調製領域に戻る前に手袋を取り外す。

【0157】

４４．増幅マスターミックスを調製する。注記：全ての試薬調製は専用の試薬調製領域において行われるべきである。増幅試薬を扱う前に手袋を交換する。増幅試薬パックをボルテックスせず、または反転させない。各増幅試薬パックは最大２４個の反応を支援する。使用前に増幅試薬が完全に解凍していることを確実にする。増幅試薬を開封する前に、バイアルの底に液体がもたらされるように増幅試薬パックをベンチ上で直立位置において軽くたたくことによって増幅試薬パックの内容物が底にあることを確実にする。以下のように増幅試薬を識別する：活性化試薬（試薬１）：；ＭＴＢ増幅試薬（試薬２）；ＤＮＡポリメラーゼ（試薬３）；キャップを取り除き、捨てる。試薬の使用のみに専用の目盛り付き精密ピペットを使用して、２９８μＬの活性化試薬（試薬１）および４１８μＬのＭＴＢ増幅試薬（試薬２）をＤＮＡポリメラーゼボトル（試薬３）に添加してマスターミックスを作製する。穏やかに上下に５回ピペット操作することによって混合する。泡状物の発生を回避する。

【0158】

４５．マスターミックスの内容物をＤＮＡポリメラーゼボトルから１．５ｍＬの微量遠心管（リスト番号４Ｊ７１−５０または等価物）内にピペットにより入れる。穏やかに上下に５回ピペット操作することによって混合する。泡状物の発生を回避する。

【0159】

４６．Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートをＡｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースに置いて汚染を防ぐ。Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートの底の蛍光物質による汚染は、ＭＴＢアッセイを妨げる可能性があり得る。Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートは、汚染を最小化するためにＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースにより保持し、移送すべきである。

【0160】

４７．試薬の使用のみに専用の精密ピペットを使用して、増幅マスターミックスの２５μＬアリコートを、試料および対照を実行するために使用されるＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートの各ウェルに分注する。目盛り付きリピートピペッタを使用することができる。カラム１（上部から底部）から開始して、左から右へ各々の連続するカラムに移動する順序でマスターミックスを添加する。２５μＬが各ウェルに分注されていることを目視で確認する。ＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースにおけるＡｂｂｏｔｔ ９６−ウェル光学反応プレートを試料調製領域に移す。

【0161】

４８．各試料について目盛り付きピペッタおよび未使用の滅菌した２００μＬのエアロゾルバリアピペットチップを使用して、２５μＬの各溶出試料をＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートに移す。各試料を移送している間、上下に３から５回ピペット操作することによって最終反応物を混合する。合計５０μＬが各ウェルに分注されていることを目視で確認する。

【0162】

４９．Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ操作マニュアル、操作説明書のセクションにおける指示に従ってＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートを密閉する。

【0163】

５０．ＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースにおけるＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートを５０００ｇにて５分間遠心分離する。

【0164】

５１．ＡｂｂｏｔｔスプラッシュフリーサポートベースにおけるＡｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートを増幅領域に移送する。注記：Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔプロトコル（ステップ５２）は、マスターミックス添加およびＰＣＲプレート調製（ステップ４４）の開始後、９０分以内に開始しなければならない。

【0165】

５２．Ａｂｂｏｔｔ ９６ウェル光学反応プレートをＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ機器に置き、作成した試験オーダーを選択し（ステップ４３）、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔ操作マニュアル、操作説明書のセクションに記載されているようにＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイ適用プロトコルを開始する。実行の完了時に、アッセイ結果がＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｒｔにおいて報告される。

【0166】

［実施例５］
実験データ−不活性化
ＩＲ ＴＢ死滅効果を評価した。この実験において、ＭＴＢ含有試料（不活性化前に既知のＭＴＢ濃度に希釈した培養ＭＴＢおよびＭＴＢ含有ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ沈殿物）を実施例３の不活性化手段に供した。不活性化後、過剰の不活性化試薬を遠心分離／洗浄によって除去し、生存細胞を最大４２日または６週間ＭＧＩＴ培養物に入れた。この期間はＭＴＢ培養に推奨される最も長い時間であり、ほとんどのＭＴＢ陽性検体は、培養の開始から２０日以内に検出可能な培養物の増殖を生じる）。以下の表５は不活性化後、培養試料を試験したときに得られた結果を示す。不活性化していないＭＴＢからなる陽性対照（ＰＣ）は、予想される２０日のタイムフレーム内に増殖を実証したが、陰性対照（ＮＣ）は増殖を示さなかった。

【0167】

【表5】

【0168】

これらのデータにより、ＭＴＢを不活性化するための不活性化手段の効果が実証される。

【0169】

［実施例６］
分析的包括性
ＭＴＢ複合体の８種の亜種および２０個の試料（Ｍ．ツベルクロシス、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ボビスＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、Ｍ．カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ）、Ｍ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．カプラエ（Ｍ．ｃａｐｒａｅ）、Ｍ．ピンニペディ（Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ．））をＡＴＣＣから得（Ｍ．カネッティはＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから受け取った。）、１０から１００個のゲノムＤＮＡコピー／反応を試験した（表６を参照のこと）。８種全ての亜種を両方のレベルにおいて検出した。

【0170】

【表6】

【0171】

Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た４６個の系統発生的および地理的に多様なＭＴＢ分離ＤＮＡ（５０％超がＭＤＲを有する）について２５から１００個のゲノムＤＮＡコピー／反応を試験した（図２）。試験した全ての亜種を検出した。

【0172】

［実施例７］
分析的特異性
１ｅ５から１ｅ７個のゲノム／ｍＬの標的濃度における異なるマイコバクテリア、ウイルスおよび他の微生物（ｎ＝８０）ならびに１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬにおける培養微生物から精製した核酸をＭＴＢ陰性対照に添加して、ＭＴＢ陰性検体についてのＭＴＢアッセイの結果に対する潜在的交差反応物の効果を評価した。１×１０^６から１×１０^７個のゲノム／ミリリットルの標的濃度における異なるマイコバクテリア、ウイルスおよび他の微生物ならびに１ｅ６ｃｆｕ／ｍＬにおける培養微生物から精製した核酸をＭＴＢ陽性試料に添加して、ＭＴＢ陽性検体についてのＭＴＢアッセイ結果に対する潜在的交差反応物の効果を評価した。陰性対照における熱不活性化したＭＴＢ細胞ストックを１０００個のコピー／ｍＬ（ゲノムＤＮＡ曲線を使用して定量した）の標的濃度に希釈することによってＭＴＢ陽性試料を調製した。潜在的交差反応により試験したＭＴＢ陰性試料はどれも検出されなかった。潜在的交差反応により試験した８０個全てのＭＴＢ陽性試料は検出された。

【0173】

【表7】

【0174】

［実施例８］
分析的感度
４０ｃｆｕ／ｍＬにおけるＭＴＢパネル、株Ｈ３７Ｒｖを、プールしたＭＴＢ陰性喀痰において連続希釈して感度パネルを生成した。各希釈液について１６個の複製を試験した。１６０倍以下の全ての希釈において１００％の検出率を観察した。結果を表８に示す。

【0175】

【表8】

【0176】

［実施例９］
臨床的特異性
培養陰性ＮＡＣＬ試料（ｎ＝１５５）、喀痰（ｎ＝２３）およびＢＡＬ（ｎ＝２８）試料（ＮＡＣＬ試料はＭＴＢの疑いのある集団に由来した。喀痰およびＢＡＬ試料はＴＢ症状を有さない患者に由来した。）を試験して臨床的特異性を決定した（以下の表１０にまとめたデータを参照のこと）。喀痰およびＢＡＬ試料に対する特異性は１００％であった。ＮＡＬＣ試料に対する特異性は９８．７％であり、全体の特異性は９９％であった。

【0177】

【表9】

【0178】

【表10】

【0179】

リアルタイムＭＴＢにより、比較物のアッセイと比較して下限の試料において良好な感度が示された。

【0180】

［実施例１０］
ＭＴＢアッセイの分析的および臨床的性能
この実施例はリアルタイムＭＴＢ検出アッセイの分析性能を記載している。

【0181】

材料および方法
リアルタイムＭＴＢアッセイについてのワークフローは図１に記載している。

【0182】

試料不活性化
以下の成分：２０ｍＬの１０Ｍ ＮａＯＨ、３００ｍＬのイソプロパノール、０．９ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０および１７９．１ｍＬの精製水を組み合わせることによって５００ｍＬの不活性化試薬（ＩＲ）を調製した。調製すると、ＩＲは室温にて最大１ヶ月間安定であった。凍結した場合、検体（未処理の検体または処理したＮＡＬＣ沈殿物）を１５°から３０℃にて解凍した。およそ３体積のＩＲを各体積の試料に添加した（最小の許容可能な検体体積は０．３ｍＬである。）。試料の種類（未処理またはＮＡＬＣ沈殿物）に関係なく同じ体積比の試料：ＩＲを維持した。最初の時間の室温のインキュベーションの間、混合物を各々２０から３０秒間で２回ボルテックスした。有効なインキュベーション時間は１から２４時間であった。不活性化プロセスはバイオフード下で行った。完了すると、不活性化した試料をバイオフード下から取り除き、次いでバイオフードの外側で試料調製に供した。不活性化プロセスは、喀痰のＮＡＬＣ沈殿物に添加した培養ＭＴＢ、ＭＴＢ陽性臨床ＮＡＬＣ沈殿物およびＭＴＢ塗抹／培養陽性喀痰試料を使用して３つの異なる実験室にてＭＴＢ生存率を効果的に減少させることが実証された（Ｑｉ Ｃ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｗ Ａｂｂｏｔｔ ＲｅａｌＴｉｍｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、２４ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （ＥＣＣＭＩＤ） ２０１４年）。

【0183】

試料調製
ＩＲ処理した検体およびアッセイ対照をｍ２０００ｓｐ機器上にロードし、そこで、グアニジニウムチオシアネート−磁性微粒子技術を使用してＤＮＡを分離して核酸を捕捉し、続いて洗浄して未結合の成分を除去した。試料調製の開始時に内部対照（ＩＣ）を添加した。結合した核酸を溶出し、９６ディープウェルプレートに移送した。試料調製の完了時に、ｍ２０００ｓｐを使用して、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、塩化マグネシウム活性化試薬ならびにプライマー、プローブおよびｄＮＴＰを含有するオリゴヌクレオチド試薬からなる増幅マスターミックスを作製した。ｍ２０００ｓｐを使用して、マスターミックスの２５μｌアリコート、続いて抽出した溶出液の２５μｌアリコートを９６ウェル光学反応プレートに分注した。プレートを手動で密閉し、リアルタイムＰＣＲのためにｍ２０００ｒｔに移送した。ｍ２０００ｓｐの代替として、試料調製、マスターミックス調製およびＰＣＲプレートセットアップを手動で行うことができる。

【0184】

増幅および検出
ｍ２０００ｒｔ機器を増幅およびリアルタイム蛍光検出のために使用した。ＭＴＢ複合体メンバーの検出（Ｗａｒｒｅｎ ＲＭら、Ｉｎｔ Ｊ Ｔｕｂｅｒｃ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ ２００６年；１０巻：８１８−８２２頁）を２セットのプライマー；挿入エレメントＩＳ６１１０を標的とするもの（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９０年；１８巻：１８８頁）およびＰＡＢ遺伝子を標的とするもの（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＢ、Ｈａｎｓｅｎ ＥＢ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８９年；５７巻：２４８１−２４８８頁）の使用によって達成した。ＭＴＢ複合体検出のための信号は、蛍光標識したプローブの使用により生成した。ＭＴＢ二重標的プローブは各々、５’末端においてフルオロフォアＦＡＭおよび３’末端においてブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ１）により標識する。したがって、ＩＳ６１１０およびＰＡＢの両方からのＭＴＢ信号を同じＦＡＭチャネルにおいて検出する。ＦＡＭ蛍光信号を検出する増幅サイクルは、元の試料中に存在するＭＴＢ ＤＮＡ濃度の対数に比例する。内部対照（ＩＣ）についてのプローブを、ＩＣおよび標的信号を単一のＰＣＲウェルにおいて区別することができるように５’においてＱｕａｓａｒおよび３’末端においてブラックホールクエンチャーＢＨＱ２により標識する。

【0185】

アッセイ対照
最低でも陰性対照の１つの複製および陽性対照の１つの複製を使用して実行の妥当性を決定した。陰性対照はＴＥ緩衝液および防腐剤からなった。陽性対照は、１．５ｇ／ｍＬのポリｄＡ：ｄＴおよび防腐剤を有するＴＥ緩衝液中で希釈したＩＳ６１１０およびＰＡＢ標的配列の両方を含有するプラスミドＤＮＡからなった。ＩＣは、１．５ｇ／ｍＬのポリｄＡ：ｄＴおよび防腐剤を有するＴＥ緩衝液中で希釈したカボチャヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＨＰＲ）配列挿入物を含有するプラスミドＤＮＡからなった。試料調製の開始時にＩＣを添加し、これは、試料調製物回収、試料阻害および増幅効率についての対照として役立つ。ＩＣは不活性化手段についての対照ではなかった。各試料と実行対照との間のＩＣ閾値サイクル（Ｃｔ）値の差を使用して、各試料の結果の妥当性を評価した。

【0186】

パネルおよび臨床検体
ＭＴＢ複合体亜種：１９個のＭＴＢ複合体亜種ＤＮＡ試料はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、１個（Ｍ．カネッティ）は親切にもＩｂｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって与えられた。Ｍ．アフリカヌム２５４２０、Ｍ．アフリカヌム３５７１１、Ｍ．ボビス３５７３５、Ｍ．ボビス１９２７４、Ｍ．ボビスＢＣＧ ３５７４６、Ｍ．ボビスＢＣＧ ３５７４７Ｄ、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプラエＢＡＡ−８２４Ｄ、Ｍ．ミクロティ１１１５２、Ｍ．ミクロティ１９４２２、Ｍ．ピンニペディＢＡＡ−６８８Ｄ、ＭＴＢ ２５１７７Ｄ−５（Ｈ３７Ｒａ）、ＭＴＢ ２５６１８Ｄ−５（Ｈ３７Ｒｖ）、ＭＴＢ ＢＡＡ−２２３６Ｄ、ＭＴＢ ＢＡＡ−２２３７Ｄ、ＭＴＢ ２７２９４Ｄ、ＭＴＢ ＢＡＡ−２２３４Ｄ、ＭＴＢ ３５８２２Ｄ、ＭＴＢ ３５８３８Ｄ、ＭＴＢ ＢＡＡ−２２３５Ｄを含む合計２０個のＭＴＢ複合体株を試験した。さらに、３つの主要な遺伝子群および９つの遺伝子クラスターを含むＭＴＢ亜種の４６個の株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）のＤｒ．Ｂａｒｒｙ Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈから得た（Ｍａｔｈｅｍａ Ｂら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６年；１９巻：６５８−６８５頁）。ＡＴＣＣおよびＩｂｉｓから得た２０種のＭＴＢ複合体亜種のＤＮＡを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ法によって決定されているように、報告されたＤＮＡ濃度を使用して直接試験した。他の４６のＤＮＡ濃度は、３個の試料（このような測定は少ない体積および不純物に起因して得ることができなかった。）を除いてＡｂｂｏｔｔ ＭｏｌｅｃｕｌａｒにおいてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ測定を使用して決定した。これらの３個の試料は１：６００の試料対水の比にて希釈し、直接試験した。

【0187】

検出限界［ＬＯＤ］：１×１０^５コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬを標的とするＭＴＢ Ｈ３７ＲｖパネルをＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ（Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）によって調製した。Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘパネルの３つの１ｍＬアリコートを合わせ、３，０００×ｇにて１５分間遠心分離して、上清中の遊離ＭＴＢ ＤＮＡを除去した。細胞ペレットを３ｍＬのＴＥ緩衝液中に再懸濁して、１×１０^５ｃｆｕ／ｍＬの濃度を維持した。次いで細胞を喀痰のプールに添加し、これを、ビーズビーティングを使用して均質化して、以下のＭＴＢ含有希釈パネル：８０ｃｆｕ／ｍＬ、５０ｃｆｕ／ｍＬ、２５ｃｆｕ／ｍＬ、１０ｃｆｕ／ｍＬ、５ｃｆｕ／ｍＬ、１ｃｆｕ／ｍＬ、０．５０ｃｆｕ／ｍＬ、０．１０ｃｆｕ／ｍＬおよび０．０５ｃｆｕ／ｍＬを作製した。

【0188】

分析的特異性：分析的特異性パネルメンバーは以下のように収集した：サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス１およびバリセラ・ゾスターウイルスはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から得、６９個のマイコバクテリアおよび他の微生物種はＡＴＣＣから得、８個の細菌分離株はＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにおいて培養した。

【0189】

潜在的な干渉物質：以下の材料をこの試験のために得た：血液、ヒト細胞由来のＤＮＡ、胃酸、高張食塩水、生理食塩水、培養培地、ＮＡＬＣペレット材料、５つの抗ＴＢ薬（イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン、ピラジナミド、エタンブトール）およびウシ粘液。

【0190】

キャリーオーバー：２つの試料を調製した：アッセイ標的配列を含有する１×１０^７個のコピー／ｍＬのプラスミドを含有する高陽性ＭＴＢ試料および陰性試料。

【0191】

再現性：２つの試料を調製した：主張されているアッセイＬＯＤの約３倍のＭＴＢ濃度を含有する陽性試料および陰性試料。

【0192】

臨床検体：１９８個の喀痰検体は、ロシア、南アフリカ、ウガンダおよびベトナムにおけるＴＢの疑いのある患者からＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｏｓ Ｏｓｏｓ、ＣＡ）によって収集した。ベトナムからの１５０個の喀痰検体は、Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｎｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＦＩＮＤ）（Ｇｅｎｅｖａ、スイス）が運営している検体バンクから得た。２３４個のＮＡＬＣ検体は、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）から得た。全ての患者の検体は倫理的ガイドラインの下で収集した。患者のＨＩＶ状態は決定されなかった。全ての検体について、塗抹（利用可能な場合）および培養試験を収集場所の近くで実施し、一方、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイ試験をＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにおいて実施した。

【0193】

結果
ＭＴＢ複合体亜種検出
この試験は、ＭＴＢアッセイに使用される特異的プライマーおよびプローブが、以下の８種のＭＴＢ複合体亜種：Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．ボビス、Ｍ．ボビスＢＣＧ、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプラエ、Ｍ．ミクロッティ、Ｍ．ピンニペディおよびＭ．ツベルクロシスを検出するかどうかを決定するために行った。２セットの精製したＭＴＢ複合体ＤＮＡを試験した。第１のセットの２０個の精製したＤＮＡは代表的な前述のＭＴＢ亜種を含有した。各々の精製したＤＮＡを２つの濃度（１００および１０個のゲノム／反応）にて試験し、１つの濃度につき４つの複製を試験した。１つの反応レベルにつき１００個のＭＴＢゲノムにおいて、２０個のＭＴＢ株の各々の４個の全ての複製を検出した。１つの反応レベルにつき１０個のＭＴＢゲノムにおいて、１７個の株の４個の全ての複製を検出した。３個の株（２個のＭ．ボビスおよび１個のＭ．ボビスＢＣＧ）について、４個の複製のうち２個を検出した（図４）。ＭＴＢ亜種由来の４６個のＭＴＢ株の第２のセットを２つの濃度：１００個のゲノム／反応および２５個のゲノム／反応にて試験した。各ＤＮＡの４つの複製を各濃度にて試験した。試験した複製の全ては両方の濃度にて陽性であった（図２）。

【0194】

検出限界（ＬＯＤ）
９つのレベルの希釈系列を、ガラスビーズで均質化した喀痰プール中で希釈したＭＴＢ株Ｈ３７Ｒｖ細胞から作製した。希釈系列におけるパネルメンバーを以下の濃度：８０ｃｆｕ／ｍＬ、５０ｃｆｕ／ｍＬ、２５ｃｆｕ／ｍＬ、１０ｃｆｕ／ｍＬ、５ｃｆｕ／ｍＬ、１ｃｆｕ／ｍＬ、０．５０ｃｆｕ／ｍＬ、０．１０ｃｆｕ／ｍＬおよび０．０５ｃｆｕ／ｍＬに標的化した。各パネルメンバーの２０個の複製を、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイを使用して４回の実行にわたって試験した。この試験はＭＴＢアッセイの１つのロットおよび対照試薬を使用して行った。この試験についての有意水準は０．０５であった。各標的濃度について検出率を計算した（表１１）。プロビット回帰モデルを、独立変数として標的濃度（Ｘ）および応答変数として検出率Ｐ（Ｙ＝１）により、ＳＡＳにおけるＰＲＯＣ ＰＲＯＢＩＴを使用して標的濃度および検出率に基づいて適合した。データのプロビット分析により、９５％の確率で検出したＭＴＢの濃度は２．４５ｃｆｕ／ｍＬ（９５％ＣＩ １．４４−６．１０ｃｆｕ／ｍＬ）であることを決定した。ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイの主張されている分析的感度は、ＭＴＢ Ｈ３７Ｒｖ株を使用してプールした均質化した喀痰において１７ｃｆｕ／ｍＬである。

【0195】

分析的特異性
８０個の潜在的交差反応物の各々をＭＴＢ陽性試料およびＭＴＢ陰性試料の両方において試験した。１×１０^５から１×１０^７個のコピーまたはゲノム／ｍＬの標的化濃度にて各々の潜在的に交差反応しているマイコバクテリウム、ウイルスまたは他の微生物由来の核酸をＭＴＢ陽性試料（１，０００個のＭＴＢゲノム／ｍＬを含有する）およびＭＴＢ陰性試料に添加した。１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬの標的濃度にて培養した微生物をＭＴＢ陽性試料およびＭＴＢ陰性試料に添加した。８０個全ての陰性試料についてのアッセイ結果を、「ＭＴＢ非検出」と報告した。８０個全てのＭＴＢ含有試料についてのアッセイ結果を、「ＭＴＢ検出」と報告した（表７）。

【0196】

潜在的干渉物質
試験結果における干渉についての可能性を、呼吸器系に存在し得る物質により評価した。ＭＴＢ陰性およびＭＴＢ陽性（５００個のコピー／ｍＬ）試料を、レベルを高めたウシ粘液、血液、ヒト細胞由来のＤＮＡ、胃酸、高張食塩水、生理食塩水、培養培地、ＮＡＬＣペレット材料および５種の抗ＴＢ薬（イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン、ピラジナミド、エタンブトール）を有する各々の潜在的干渉物質の非存在下または存在下で試験した（表１２）。結果は、高レベルの血液、ヒト細胞由来のＤＮＡ、胃酸、高張食塩水、生理食塩水、培養培地、ＮＡＬＣペレット材料および５種の抗ＴＢ薬（イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン、ピラジナミド、エタンブトール）の存在下でＭＴＢアッセイの性能の干渉を示さなかった。ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイの干渉は、ウシ粘液の存在下で８．３％（５個全ての複製は偽陰性であり、または阻害された。）および５．０％（５つの複製のうちの１つは偽陰性であった。）にて観察された。２．５％以下のウシ粘液濃度にて干渉は見られなかった。

【0197】

キャリーオーバー
ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイを使用する場合、高陽性ＭＴＢ試料から陰性試料までのキャリーオーバーの可能性を評価するために、各々９６個の試料（陽性対照、陰性対照、１×１０^７個のコピー／ｍＬにて４６個の高陽性試料および４６個の陰性試料）からなる５回のｍ２０００システムを実行し、高陽性試料が陰性試料の中に散在していた。１×１０^７個のコピー／ｍＬの高陽性試料におけるＭＴＢ濃度は、ＭＴＢアッセイにより試験したＭＴＢ陽性集団の検体から得られた結果の９５％以上より早いＣｔ値をもたらした。このアッセイは、５回の実行において高陽性試料から２３０個の陰性試料までのキャリーオーバーを全く示さなかった。９６回の試料実行は８時間未満で完了した。

【0198】

再現性
再現性試験を実施して、ｍ２０００システムにおいてＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢアッセイの再現性およびＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器と手動の試料調製法との間の適合性を評価した。この試験は、主張しているＬＯＤレベルの３倍の陽性パネルおよび陰性パネルにより実施した。この試験はＭＴＢ増幅試薬の２つのロットを使用して４人の操作者によって行った：実施した２人の操作者はＡｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器を使用して実行し、実施した２人の操作者は手動の試料調製を使用して実行した。各々の試料調製法について、２人の操作者の各々は、ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢ増幅試薬の１つの特有のロットを使用し、１つのパネルメンバー当たり、５日間で１日１回、８個の複製、合計４０個の複製について各々のパネルメンバーを試験した（１つの方法につき１つのパネルメンバー当たり合計８０個の複製；ｍ２０００ｓｐ機器試料調製により合計１６０個を試験し、手動試料調製により合計１６０個を試験した。）。予想される結果との全体の一致は、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器または手動試料調製により調製した試料について９８．１％のより低い９５％ＣＩで１００％であった（１５９／１５９、１つの試料は機器のエラーのために無効であった。）。ＭＴＢアッセイは、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００ｓｐ機器およびＡｂｂｏｔｔ手動試料調製法の両方と適合する。

【0199】

臨床的感度および特異性
５８２人のＴＢの疑いのある患者の各々からの１つの喀痰または１つのＮＡＬＣ沈殿物を試験した。試料は、ロシア、南アフリカ、ウガンダ、米国およびベトナムから収集した。１つのアリコートでＭＴＢならびに２番目のアリコートで塗抹および培養物の試験を可能にするように各検体を分割した。試験試料を盲目にし、最終結果のデコーディングをＡＭ統計群によって実施した。ＭＴＢ試験について、２つの検体は無効なＩＣ結果を生じ、さらなる４つの検体の結果はｍ２０００エラーコードを与えた。阻害によって測定した無効な結果を有する臨床検体の頻度は０．３％（２／５８２）であり、一方、阻害および機器のエラーの両方を含む無効率は１．０％（６／５８２）であった。本明細書に記載されているＭＴＢアッセイおよび市販のＭＴＢ ＮＡＡＴの両方によって陽性であった５個の培養陰性検体は分析から除外した。合計５７１個の有効な試料をデータ分析のために含んだ。培養物に対する全体のＭＴＢ感度は９３％（１９８／２１２）であった。アッセイ感度は塗抹陽性、培養陽性検体において９９％（１４７／１４９）であり、塗抹陰性、培養陽性試料において８１％（５１／６３）であった。特異性は９７％（３４８／３５９）であった（表１３）。ＭＴＢ陰性試料のうちの７６個は非結核性マイコバクテリア（ＮＴＭ）を含んでいた。これらのうち、３８個はＭＡＣ（Ｍ．アビウム複合体）であり、７個はＭ．ゴルドネであり、５個はＭ．カンサシであり、５個はＭ．ケロネー／アブセサスであり、３個はＭ．キセノピであり、１８個は他のマイコバクテリ種を含んでいた。本明細書に記載されているＭＴＢアッセイにより、ＮＴＭ試料結果の全ては、４０のアッセイカットオフと比較して遅いＣＮ（＞３８）値を有する「ＭＴＢ検出」結果を生じた２つの試料を除いて「ＭＴＢ非検出」であった。ＮＴＭ集団の試験から得られた９７％の特異性値は、非ＮＴＭ集団を試験したときに観察された特異性と同様である。さらに米国集団内から採取した５００人の非ＴＢと思われる患者の喀痰試料は１００％のＴＢ陰性試験結果を示した。

【0200】

【表11】

【0201】

ＡｂｂｏｔｔリアルタイムＭＴＢデータのプロビット分析により、９５％の確率で検出したＭＴＢの濃度は、ＣＮカットオフ４０にて２．４５ｃｆｕ／ｍＬであったことが実証された（１．４４−６．１０ｃｆｕ／ｍＬの９５％信頼区間）。

【0202】

【表12】

【0203】

【表13】

【0204】

［実施例１１］
不活性化試薬
この実施例は、ＭＴＢ検出アッセイにおける使用のための不活性化試薬を記載している。このアッセイは、呼吸器検体（喀痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）ならびに喀痰および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）沈殿物中のＭＴＢ複合体ＤＮＡを検出するためのＮＡＡＴである。バイオセーフティーキャビネットの外側で試料の安全な試験を可能にするために、粘性試料を液化し、ＭＴＢ生存率を低下させるための試料不活性化試薬および手段を開発した。この試験は、試料不活性化手段の効果を評価し、不活性化試薬（ＩＲ）の安定性を決定することであった。

【0205】

粘性低下試験のために、１５０個の喀痰試料を１：２または１：３の比でＩＲ（０．６％の水酸化ナトリウム［ｗ／ｖ］、６０％のイソプロパノール［ｖ／ｖ］および１．８％のＴｗｅｅｎ−２０［ｖ／ｖ］）と混合した。混合物を激しくボルテックスし、室温にてインキュベートした。混合物をインキュベーションの２０から３０分後に再びボルテックスした。粘度の低下を、インキュベーションの３０分、６０分および２４時間後に目視検査によって評価した。

【0206】

不活性化試験について、２個のＭＴＢ臨床分離株およびＭＴＢ ＡＴＣＣ２７２９４分離株を使用して、１×１０^６、１×１０^７または１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの濃度の１ｍＬのＭＴＢ細胞懸濁液を、４ｍＬのプールしたＭＴＢ陰性ＮＡＬＣ処理した呼吸器試料と混合することによって偽ＭＴＢ陽性呼吸器試料を調製した。次いで各偽ＭＴＢ ＮＡＬＣ試料を１：２または１：３の比にてＩＲと混合した。１：２の試料対ＰＢＳ比にて滅菌ＰＢＳ緩衝液により処理した偽試料を陽性対照として使用した。１：２のＰＢＳ対ＮＡＬＣの比にて滅菌ＰＢＳをプールしたＭＴＢ陰性ＮＡＬＣ試料に添加することによって陰性対照を調製した。全ての試料／対照を激しくボルテックスし、室温にて６０分間インキュベートした。ボルテックスをインキュベーション内で３０分繰り返した。インキュベーションの終わりに、ＩＲ処理した試料を新たな５０ｍＬの管内に移し、ボルテックスし、３０００×ｇにて１５分間遠心分離した。沈殿物を１０ｍＬの滅菌ＰＢＳ中で再懸濁し、３０００×ｇにてさらに１５分間遠心分離した。ペレットを各々１０ｍＬの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。１ｍＬの懸濁液を使用して、マイコバクテリア増殖指標管（ＭＧＩＴ）に接種した。最終ＭＴＢを１−２×１０^４から１−２×１０^６ｃｆｕの範囲の各々のＭＧＩＴ培養物に添加した。さらに、合計５１個の喀痰のＭＴＢ陽性臨床ＮＡＬＣ沈殿物（２０個はＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌｌ由来および３１個はＬａｎｃｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来）を、同じ手段により１：３の試料対ＩＲの比にてＩＲ処理後の増殖について試験した。Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ由来の２０個の試料のうち１０個を１：２の試料対ＩＲ比にて処理した。残りの４１個の試料を１：３の試料対ＩＲ比により処理した。培養は、ＢＡＣＴＥＣ ＭＧＩＴ ９６０システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）により４２日間実施した。陽性増殖は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ａｃｃｕｐｒｏｂｅ（登録商標）システム（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により識別した。直接呼吸器試料（ＭＴＢ塗抹および培養陽性喀痰試料）の不活性化効率を実証するための初期試験もまた、以下の段落に記載されているＩＲ安定性試験と組み合わせて実施した。

【0207】

ＩＲについての最適な保存条件を決定するために、ＩＲの３つのアリコートを、ガラスまたはポリプロピレンボトル中で１５−３０℃および３３−３７℃の保存条件にて３９日間保存した。各保存条件におけるＩＲの各アリコートを外観および体積の変化について調べ、１：３の試料対ＩＲ比を使用して、ＳＡＧＥ Ｂｉｏ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ（Ｄｈａｋａ、バングラディシュ）およびＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｎｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＦＩＮＤ）ＭＴＢ検体バンクから得た１２個のＭＴＢ塗抹および培養陽性喀痰試料での３９日の保存後、ＭＴＢ不活性化効力について試験した。Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｕｆｆａｌｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から得たＭＴＢ株Ｈ３７Ｒｖ細胞パネルを陽性対照として使用した。

【0208】

粘性低下試験により、６０分のインキュベーションが試料の粘度を低下させるのに十分であることが示された。不活性化試験について、１×１０^８、１×１０^７および１×１０^６ｃｆｕ／ｍＬにて３つのＭＴＢ分離株により調製した偽ＭＴＢ試料のどれも、１：３の試料対ＩＲ比にてＩＲにより処理した後、ＭＴＢ増殖を示さなかった。１×１０^７ｃｆｕ／ｍＬのＭＴＢにより調製し、１：２の試料対ＩＲ比にてＩＲにより処理した１つのＩＲ処理済み試料は、インキュベーションの２７日後に増殖を示したが、試験した同じ細菌濃度における２回の反復は増殖について陰性を示した。２０個のＭＴＢ陽性ＮＡＬＣ喀痰沈殿物のどれも、１：２または１：３の試料対ＩＲ比におけるＩＲによる処理後、ＭＴＢ増殖を示さなかった。さらに、培養によってＭＴＢについて以前に試験して陽性であった３１個の臨床ＮＡＬＣ喀痰沈殿物は、１：３の試料対ＩＲ比にてＩＲ処理を受けた後、ＭＴＢ増殖について試験して陰性であった。

【0209】

保存後の外観の変化は３９日後に観察されなかった。０から６％の体積喪失が保存の３９日後に観察された。最も高い６％の体積喪失は、ＩＲが３３−３７℃にてポリプロピレン容器中で保存されたときに観察された。しかしながら、不活性化ＭＴＢに対するＩＲ溶液の効果は保存後に影響を受けなかった。１２個のＭＴＢ陽性喀痰試料は、上記の様々な濃度下で保存したＩＲにより処理した後、増殖を示さなかった。

【0210】

臨床試料中のいくつかのＭＴＢは、推奨されるＣｅｐｈｅｉｄ ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦ試料不活性化プロセス（１５分のインキュベーション時間および１：２の試料対試料試薬比）で残存したことは注目に値した（Ｂａｎａｄａ、Ｐ．Ｐら、２０１０年．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８巻：３５５１−３５５７頁）。著者らは、完全なＭＴＢ不活性化が長時間のインキュベーション時間を必要とし得ることを示唆した。本明細書に記載されている試験によって生成された実験データは、推奨されたボルテックスステップを使用して６０分間実施した試料不活性化が完全なＭＴＮ不活性化に十分であったことを実証した。

【0211】

１：２の試料対ＩＲ比を使用した場合、１×１０^７ＭＴＢ ｃｆｕ／ｍＬ培養物（ＭＧＩＴ培養物中に２×１０^５ｃｆｕ／ｍＬ）の１つの複製は、ＭＧＩＴ培養物のインキュベーションの２７日後に増殖を示した。以前の試験により、１０ｃｆｕ／ｍＬのＭＴＢを含有するＭＧＩＴ培養物が１６日のインキュベーション後に陽性になったことが示され、その結果により、１：２の試料対ＩＲ比を使用した場合、非常に少ない数のＭＴＢが不活性化プロセスを生き延びたことが示唆された（Ｔｏｒｔｏｌｉ、Ｅ．、Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１１）巻：３５７８−３５８２頁；Ｗａｌｌｉｓら、１９９９年．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、４３巻：２６００−２６０６頁）。最適な不活性化効率を達成するために、１：３の試料対ＩＲ比を不活性化実験の残りに使用した。

【0212】

結論として、この試験において評価したＩＲは、１：３の試料対ＩＲ比にて６０分間、ＩＲにより処理した場合、喀痰試料を液化することができ、臨床検体中のＭＴＢの効果的な不活性化を達成できた。この不活性化手段により、これらの試料を、適切な不活性化手段後にバイオセーフティーキャビネットの外側で安全に扱うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]