特許 6596336 核酸ナノ構造の自己集合

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6596336

(24)【登録日】2019年10月4日

(45)【発行日】2019年10月23日

(54)【発明の名称】核酸ナノ構造の自己集合

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20191010BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/10 ZZNA

【請求項の数】38

【全頁数】153

(21)【出願番号】特願2015-524427(P2015-524427)

(86)(22)【出願日】2013年7月24日

(65)【公表番号】特表2015-530874(P2015-530874A)

(43)【公表日】2015年10月29日

(86)【国際出願番号】US2013051891

(87)【国際公開番号】WO2014018675

(87)【国際公開日】20140130

【審査請求日】2016年5月19日

(31)【優先権主張番号】61/773,715

(32)【優先日】2013年3月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/675,309

(32)【優先日】2012年7月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】イン，ペン

(72)【発明者】

【氏名】シー，ウィリアム，エム．

(72)【発明者】

【氏名】ケ，ヨンガング

(72)【発明者】

【氏名】オン，ルヴィーナ，エル．

【審査官】 金田 康平

(56)【参考文献】

【文献】 Interface Focus，２０１１年，Vol.1, No.5，pp.702-724

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも３２ヌクレオチドの長さを有し、かつ、単一のリン酸結合によって相互につなぎ合わされた２個の隣接する逆平行ヘリックスを形成するように配置された４つのドメインを含み、オリゴヌクレオチドの各々に１つある、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションにより約９０°の二面角を形成するように配置されている、２個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、核酸構造物。

【請求項2】

同じヘリックスに寄与する同じオリゴヌクレオチドからの２つの隣接するドメインが１６±２ヌクレオチドの長さの合計長さを有する、請求項１に記載の核酸構造物。

【請求項3】

前記構造物は、少なくとも４つのドメインを各々が含む５個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドのうち４個が、第５の前記一本鎖オリゴヌクレオチドの別々のドメインにハイブリダイズされており、それによりハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの各対の間に約９０°の二面角を形成している、請求項１に記載の核酸構造物。

【請求項4】

前記少なくとも４つのドメインは、等しいヌクレオチド長さである、請求項１に記載の核酸構造物。

【請求項5】

各オリゴヌクレオチドが、２つ以上のユニークドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項6】

少なくとも１つのドメインが、ポリチミン（Ｔ）オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項7】

少なくとも２つのドメインが、ポリチミン（Ｔ）オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項8】

各ドメインが、長さが８ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項9】

前記構造物は、一本鎖２ドメインオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項10】

前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項11】

前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の核酸構造物。

【請求項12】

前記オリゴヌクレオチドは、架橋されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項13】

前記構造物は、１００個、５００個、又は１０００個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項14】

全ての前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列がユニークである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項15】

複数個の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸構造物。

【請求項16】

前記核酸構造物は、３Ｄ構造物を形成するようにハイブリダイズされている、請求項１５に記載の複数個の核酸構造物。

【請求項17】

前記３Ｄ構造物は、直方体構造物、円柱状構造物、シート、ハニカム構造物、又は六方格子構造物である、請求項１６に記載の複数個の核酸構造物。

【請求項18】

前記３Ｄ構造物は、Ｚ結晶、ＺＸ結晶、Ｙ結晶、Ｘ結晶又はＸＹ結晶である、請求項１６に記載の複数個の核酸構造物。

【請求項19】

前記構造物の複数個中の各一本鎖オリゴヌクレオチドが、ユニークである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の複数個の核酸構造物。

【請求項20】

請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の複数個の核酸構造物を含む、組成物。

【請求項21】

単一のリン酸結合によって相互につなぎ合わされた２個の隣接する逆平行ヘリックスを形成するように配置されている少なくとも４つのドメインを各々が含み、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドが、物質的に別のオリゴヌクレオチドに各々ある、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションにより、約９０°の二面角を形成するように配置されており、かつ、オリゴヌクレオチドの各々が、少なくとも３２ヌクレオチドの長さを有する、複数個のユニーク一本鎖オリゴヌクレオチドを一つの容器内でアニーリングすることを含む、方法。

【請求項22】

同じヘリックスに寄与する同じオリゴヌクレオチドからの２つの隣接するドメインが１６±２ヌクレオチドの長さの合計長さを有する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ほぼ等しいモル濃度で存在する、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

アニーリングが、ある時間の期間にわたる温度遷移によって起こる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記温度遷移は、高温から略室温への温度の変化である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記温度遷移は、約９０℃から略室温への温度の変化である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記アニーリングは、１２〜２４時間の期間にわたって起こる、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３２ヌクレオチド長である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

各ドメインが、長さが８ヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

Ｎｘ×Ｎｙ×Ｎｚボクセルとして配置された、一本鎖オリゴヌクレオチドの三次元（３Ｄ）コンピュータ生成キャンバスを提供することと（ここで、
Ｎは、ハイブリダイズすると約９０°の二面角を形成する、別々の一本鎖オリゴヌクレオチドからの、２つの相補的なハイブリダイズしたドメインが含まれる、単一の８ｂｐ領域であり、ここで、オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも３２ヌクレオチドの長さを有し、かつ、単一のリン酸結合によって相互につなぎ合わされた２個の隣接する逆平行ヘリックスを形成するように配置された４つのドメインを含み、
Ｘは、前記３Ｄキャンバスのｘ軸に沿った任意の数であり、
Ｙは、前記３Ｄキャンバスのｙ軸に沿った任意の数であり、且つ
Ｚは、前記３Ｄキャンバスのｚ軸に沿った任意の数である）、
所望の形状及び／又はサイズの３Ｄ核酸構造が生じるように、前記３Ｄコンピュータ生成キャンバスから１つ以上のボクセルを取り除くことと、
前記３Ｄ核酸構造の集合に対して、必要な一本鎖オリゴヌクレオチドのサブセットを特定することと、を含む、方法。

【請求項33】

第２のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされている、少なくとも４つのドメインを含む、第１のオリゴヌクレオチドを含む、組成物であって、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記４つのドメインのうちの１つでハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成しており、ここで、オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも３２ヌクレオチドの長さを有し、前記第１のオリゴヌクレオチドの４つのドメインは、単一のリン酸結合によって相互につなぎ合わされた２個の隣接する逆平行ヘリックスを形成するように配置されている、組成物。

【請求項34】

第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドの残りのドメインのうちの１つで、前記第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第３のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

第４のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドの残りのドメインで、前記第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第４のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記第２、第３及び第４のオリゴヌクレオチドは、２つのドメイン、３つのドメイン、４つのドメイン、又は５つ以上のドメインからなる、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

前記第２、第３及び第４のオリゴヌクレオチドは、１個、２個、３個又はそれ以上のオリゴヌクレオチドに対して各々ハイブリダイズされており、それによりハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している、請求項３５又は３６に記載の組成物。

【請求項38】

各々物質的に別のオリゴヌクレオチドからの、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションが、ダブルヘリックスとなる、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号、及び２０１３年３月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７７３，７１５号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

政府支援
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により交付された１ＤＰ２ＯＤ００４６４１及び１ＤＰ２ＯＤ００７２９２、海軍研究事務所（Office of Naval Research）により交付されたＮ００００１４０９１１１８及びＮ０００１４１０１０８２７、陸軍研究事務所学際的大学研究イニシアチブ（Army Research Office Multidisciplinary University Research Initiative）により交付されたＷ９１１ＮＦ−１２−１−０４２０及びＷ９１１ＮＦ１２１０２３８、海軍研究事務所若手研究者プログラム（Office of Naval Research Young Investigator Program）により交付されたＮ０００１４１１１０９１４、及び米国国立科学財団（National Science Foundation）により交付されたＣＣＦ１０５４８９８に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。

【0003】

発明の分野
本発明の態様及び実施形態は、核酸ナノテクノロジーの分野に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）などの情報高分子の自己集合は、高度な合成分子ナノ構造及びデバイスを作製する効果的な手法を提供する（N.C. Seeman, Nature 421, 427 (2003)）。自己集合核酸ナノ構造の基本的な設計原理は、適切な物理的条件下で核酸鎖が相補セグメントの対合により自己組織化して所定のナノ構造になるように核酸鎖の配列相補性をコードすることである。この基本原理から（N.C. Seeman, J. Theor. Biol. 99, 237 (1982)）、研究者らは、格子（E. Winfree, et al. Nature 394, 539 (1998)；H. Yan, et al. Science 301, 1882 (2003)；H. Yan, et al. Proc. Natl. Acad. of Sci. USA 100, 8103 (2003)；D. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 126, 2324 (2004)；P.W.K. Rothemund, et al. PLoS Biology 2, 2041 (2004)）、リボン（S.H. Park, et al. Nano Lett. 5, 729 (2005)；P. Yin, et al. Science 321, 824 (2008)）、チューブ（H. Yan Science (2003)；P. Yin (2008)）、定義された形状を有する有限の二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）オブジェクト（J. Chen, N. C. Seeman, Nature 350, 631 (1991)；P. W. K. Rothemund, Nature 440, 297 (2006)；Y. He, et al. Nature 452, 198 (2008)；Y. Ke, et al. Nano. Lett. 9, 2445 (2009)；S. M. Douglas, et al. Nature 459, 414 (2009)；H. Dietz, et al. Science 325, 725 (2009)；E. S. Andersen, et al. Nature 459, 73 (2009)；T. Liedl, et al. Nature Nanotech. 5, 520 (2010)；D. Han, et al. Science 332, 342 (2011)）、及び巨視的結晶（J. P. Meng, et al. Nature 461, 74 (2009)）など、多様な合成核酸ナノ構造を作り出してきた（N.C. Seeman (2003)；W.M. Shih, C. Lin, Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 276 (2010)）。並行して、ピンセット（B. Yurke, et al. Nature 406, 605 (2000)）、スイッチ（H. Yan, et al. Nature 415, 62 (2002)）、ウォーカー（W. B. Sherman, N. C. Seeman, Nano Letters 4, 1203 (2004)；P. Yin, et al. Nature 451, 318 (2008)；T. Omabegho, et al. Science 324, 67 (2009)）及び回路（P. Yin (2008)；G. Seelig, et al. Science 314, 1585 (2006)；L. Qian, E. Winfree, Science 332, 1196 (2011)）を含め、多くの動的デバイスが作製されている（J. Bath, A. J. Turberfield Nature Nanotech. 2, 275 (2007)）。加えて、ＤＮＡ及びＲＮＡは技術的に意味のある形で他の機能分子と連動し得るため、合成核酸ナノ構造には多様な用途が見込まれる。研究者らは合成ＤＮＡ／ＲＮＡナノ構造及びデバイスを、機能性材料の配列指図（E A. Aldaye, et al. Science 321, 1795 (2008)）、バイオイメージングプローブの開発（H. M. T. Choi, et al. Nature Biotechnol. 28, 1208 (2010)）、生細胞における分子経路の組織化及び調節（S. Venkataraman, et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 16777 (2010)；C. J. Delebecque, et al. Science 333, 470 (2011)）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）タンパク質ナノ構造決定の促進（M. J. Berardi, et al. Nature 476, 109 (2011)）に使用している。

【0005】

メガダルトンナノスケールの２Ｄ形状（P.W.K. Rothemund (2006)）及び３Ｄ形状（S.M. Douglas (2009)；E.S. Andersen (2009)；D. Han (2011)）を組み立てる効果的な方法はＤＮＡ折り紙であり、ここでは長い「足場」鎖が、短い「ステープル」鎖との相互作用によって、予め設計された形状に折り畳まれる。長い足場鎖成分（多くの場合にウイルスゲノムＤＮＡ）が必要なため、ＤＮＡ折り紙ナノ構造の配列及び材料の選択肢は限られてきた。さらに、典型的には形状毎に新しい足場の配設、従って完全に異なるステープル鎖セットが必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の概要
本発明は、既知であり、予め決められており、且つひいてはサイズ、形状及び複雑さが制御される、核酸構造を自己集合させる方法、並びにこの核酸構造それ自体を広く提供する。より具体的には、様々な態様において、本発明は、ＤＮＡ折り紙手法で不可欠なより長い足場鎖を必要とすることなしに、定義され且つ予め決められたオリゴヌクレオチドのサブセットを用いて複雑な核酸構造を生成するモジュール式の方法を提供する。本発明の核酸構造は、通常は一段階アニーリング反応で局所的相互作用を介して配列特異的に自己集合する。核酸構造、及びかかる構造の生成に使用される一本鎖オリゴヌクレオチドは、該構造内の各位置のオリゴヌクレオチド、従ってヌクレオチド配列が既知となるように設計される。この情報が、定義され且つ制御された方式に従った構造の修飾を容易にする。

【0007】

本発明は、一部には、既知の位置にある既知のオリゴヌクレオチドで構成される、所望の高さ、奥行き及び幅の３Ｄキャンバスを理論的出発点として用い、任意の所定の形状及びサイズの三次元（３Ｄ）核酸構造を作成する方法を提供する。キャンバス全体を構成するオリゴヌクレオチドの一つのサブセットのみを選択することにより、エンドユーザーは実質的に任意のサイズ、形状及び複雑さの核酸構造を生成することができる。

【0008】

核酸構造を形成するオリゴヌクレオチドは、主としてドメインを含む。通常は、一つのオリゴヌクレオチド中のドメインが、他のオリゴヌクレオチド中のドメインとハイブリダイズする。いくつかのオリゴヌクレオチドは４ドメインオリゴヌクレオチドであり、各ドメインが別のオリゴヌクレオチドにあるドメインとハイブリダイズする。各ドメインが１つのオリゴヌクレオチドの近くに配置されている、相補ドメインのハイブリダイゼーションにより、二本鎖が形成される（一つのオリゴヌクレオチド上の一つのドメインが別の近くにあるオリゴヌクレオチドの別のドメインと結合する）。概して、各ドメインが物質的に別のオリゴヌクレオチドに配置されている、相補ドメインのハイブリダイゼーションにより、約９０°の二面角が形成される。本発明の核酸構造は、核酸二本鎖（即ち、ハイブリダイズした又は部分的にハイブリダイズした一対のオリゴヌクレオチド）で構成され、ここで隣接する二重鎖は単一のリン酸結合で連結される（即ちクロスオーバー）。概して、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすると隣接する二重鎖が生じる。場合によっては、自己集合中、４ドメインオリゴヌクレオチドは、（その４つのうちの）２つのドメインが１つの二重鎖にあり、且つ残りの２つのドメインが隣の二重鎖にあるようならせん状のコンホメーションをとる。

【0009】

本発明はまた、核酸構造の生成に用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドも提供する。異なる複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここでそれらの複数個の性質及び組成は、所望の構造の形状、サイズ及び複雑さを含め、設計に依存する。本明細書でさらに詳細に説明するとおり、これらの複数個は、通常２ドメイン又は４ドメインオリゴヌクレオチドを含む（しかしながら、複数個に３つのドメイン又は４つより多いドメインが含まれてもよい）。場合によっては、ドメインは等しいヌクレオチド長さ（例えば８ｎｔ長さ）である。一つのオリゴヌクレオチドの各ドメインはユニークであってもよく（即ちそれは、各オリゴヌクレオチドにつき１つのみ存在するか、又は各核酸構造につき１つのみ存在するヌクレオチド配列を有し得る）、又はオリゴヌクレオチド中の１つのみ、２つ又は３つ又はそれ以上のドメインがユニークであってもよい。核酸構造中の各一本鎖オリゴヌクレオチドはユニークであってもよく（即ちそれは、各構造につき１つのみ存在し得る）、又はそれは、１つ、２つ、３つ、又はさらに多く存在してもよい。そのドメインの１つ又は複数がユニークでない場合であっても、その構造として、オリゴヌクレオチドがユニークであってもよいと理解される。

【0010】

本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド及び核酸構造は、その本質としてはモジュール式である。本発明の方法は、既知のオリゴヌクレオチドのサブセットを取り入れ、除外し及び／又は修飾（置換を含む）することによって、様々な形状の核酸構造を作製することに充てる。本明細書に記載される方法は、例えば配列特異性に基づいた互いの構造をアニーリングすることにより、かかる核酸構造を互いにモジュール式に組み立てることを企図する。これらの実施形態の一部では、互いにアニーリングされる核酸構造は共通の形状を有し得る（例えば、両方ともに立方体又は抽象的な形状であってもよい）。この方法はまた、２つ以上の核酸構造を、その核酸構造の一体部分であっても又はそうでなくてもよいリンカーを使用して互いに連結することにより作製される複合核酸構造も企図する。これらの実施形態において、互いに連結される核酸構造は同じ形状であっても、又は異なる形状であってもよい。

【0011】

核酸構造の合成方法もまた、本明細書において企図される。合成方法は、複数個の既知の一本鎖オリゴヌクレオチドを単一の容器内で結合するステップと、それらのオリゴヌクレオチドを好適な条件下に予め決められた方式で自己集合させるステップとを含み得る。同様に、２個以上の核酸構造を単一の容器内に組み合わせ、好適な条件下に予め決められた方式でヌクレオチド配列相補性に基づき自己集合させることにより、より大きい核酸構造を形成し得る。

【0012】

従って、一態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの各々に１つある、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションにより約９０°の二面角を形成するように配置されている、少なくとも４つのドメインを各々が含む、２個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、核酸構造を提供する。

【0013】

一部の実施形態では、この構造は、少なくとも４つのドメインを各々が含む５個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、前記一本鎖オリゴヌクレオチドのうち４個が、第５の前記一本鎖オリゴヌクレオチドのドメインとは別にハイブリダイズされており、それによりハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの各対の間に約９０°の二面角を形成している。

【0014】

一部の実施形態では、少なくとも４つのドメインは、等しいヌクレオチド長さである。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドが、２つ以上のユニークドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのドメインが、ポリチミン（Ｔ）オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのドメインが、ポリチミン（Ｔ）オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各ドメインが、長さが８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記核酸構造は、一本鎖２ドメインオリゴヌクレオチドをさらに含む。

【0015】

一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、架橋されている。

【0016】

一部の実施形態では、前記構造は、１００個、５００個、又は１０００個の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、全ての前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列がユニークである。一部の実施形態では、全ての前記ドメインは、配列がユニークである。一部の実施形態では、ポリＴドメインを除く、全ての前記ドメインは、配列がユニークである。

【0017】

別の態様において、本発明は、前述の核酸構造のいずれかの複数個を提供する。一部の実施形態では、前記核酸構造は、３Ｄ構造を形成するようにハイブリダイズされている。一部の実施形態では、前記３Ｄ構造は、ｘ方向に「ｘ」ヘリックス、ｙ方向に「ｙ」ヘリックス、及びｚ方向に「ｚ」塩基（又は塩基対）で定義されている。一部の実施形態では、前記３Ｄ構造は、直方体構造、円柱状構造、シート、ハニカム構造、又は六方格子構造である。一部の実施形態では、前記３Ｄ構造は、Ｚ結晶、ＺＸ結晶、Ｙ結晶、Ｘ結晶又はＸＹ結晶である。

【0018】

一部の実施形態では、前記複数個の構造中の各一本鎖オリゴヌクレオチドが、ユニークである。

【0019】

別の態様において、本発明は、前述の核酸構造のいずれかの複数個を含む、組成物を提供する。

【0020】

別の態様において、本発明は、物質的に別のオリゴヌクレオチドに各々ある、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションにより、約９０°の二面角を形成するように配置されている、少なくとも４つのドメインを含む、複数個のユニーク一本鎖オリゴヌクレオチドを一つの容器内でアニーリングすることを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドは、４ドメイン及び２ドメインオリゴヌクレオチドを含む。

【0021】

一部の実施形態では、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ほぼ等しいモル濃度で存在する。一部の実施形態では、前記アニーリングは、ある時間の期間にわたる温度遷移によって起こる。一部の実施形態では、前記温度遷移は、高温から略室温への温度変化である。一部の実施形態では、前記温度遷移は、約９０℃から略室温への温度変化である。

【0022】

一部の実施形態では、前記アニーリングは、約１２〜２４時間の期間にわたって起こる。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３２ヌクレオチドである。一部の実施形態では、各ドメインは、長さが８ヌクレオチドである。

【0023】

一部の実施形態では、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。

【0024】

別の態様において、本発明は、Ｎ_ｘ×Ｎ_ｙ×Ｎ_ｚボクセルとして配置された、一本鎖オリゴヌクレオチドの三次元（３Ｄ）コンピュータ生成キャンバスを提供することと（ここで、Ｎは、ハイブリダイズすると約９０°の二面角を形成する、別々の一本鎖オリゴヌクレオチドからの、２つの相補的なハイブリダイズしたドメインが含まれる、単一の８ｂｐ領域であり、Ｘは、前記３Ｄキャンバスのｘ軸に沿った任意の数であり、Ｙは、前記３Ｄキャンバスのｙ軸に沿った任意の数であり、且つＺは、前記３Ｄキャンバスのｚ軸に沿った任意の数である）；所望の形状及び／又はサイズの３Ｄ核酸構造が生じるように、前記３Ｄコンピュータ生成キャンバスから１つ以上のボクセルを取り除くことと；前記３Ｄ核酸構造の集合に対して、必要な一本鎖オリゴヌクレオチドのサブセットを特定することとを含む、方法を提供する。

【0025】

別の態様において、本発明は、第２のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされている、少なくとも４つのドメインを含む、第１のオリゴヌクレオチドを含む、組成物であって、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記４つのドメインのうちの１つでハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している、組成物を提供する。

【0026】

一部の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドの残りのドメインのうちの１つで、前記第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第３のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している。一部の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドの残りのドメインで、前記第１のオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされており、それにより前記第１及び第４のオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している。一部の実施形態では、各々物質的に別のオリゴヌクレオチドは、２つの相補ドメインのハイブリダイゼーションが、ダブルヘリックスとなる。一部の実施形態では、前記第２、第３及び第４のオリゴヌクレオチドは、２つのドメイン、３つのドメイン、４つのドメイン、又は５つ以上のドメインからなる。一部の実施形態では、前記第２、第３及び第４のオリゴヌクレオチドは、１個、２個、３個又はそれ以上のオリゴヌクレオチドに対して各々ハイブリダイズされており、それによりハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの間に９０°の二面角を形成している。

【0027】

前述の概念及び以下でさらに詳細に考察するさらなる概念のあらゆる組み合わせが（かかる概念が互いに矛盾しない限りにおいて）、本明細書に開示される発明の主題の一部であるものとして企図されることが理解されなければならない。詳細には、本開示の最後に掲載する特許請求の範囲の主題のあらゆる組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部であるものとして企図される。また、本明細書で明示的に用いられる用語であって、参照によって援用される任意の開示にも同様に現れ得る用語は、本明細書に開示される特定の概念と最も矛盾のない意味に従うべきであることもまた理解されなければならない。

【0028】

図面の簡単な説明
これらの図は必ずしも一定の縮尺でなく、むしろ、本明細書で考察される様々な概念を概略的に例示して強調が加えられていることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1A】図１Ａは、３２ヌクレオチド４ドメイン一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（本明細書ではＤＮＡ「ブロック」又はＤＮＡ「ブリック」とも同義的に称される）の概略図である。各ドメインが長さが８ヌクレオチドである。連結しているドメイン２及びドメイン３が「ヘッドドメイン」であり；ドメイン１及びドメイン４が「テイルドメイン」である。

【図1B】図１Ｂは、ＤＮＡブロック及びその結合相互作用を描く２つのモデルの概略図である。

【図1C】図１Ｃは、６Ｈ（ヘリックス）×６Ｈ×４８Ｂ（ｂｐ）直方体三次元ＤＮＡナノ構造のらせん構造を示す分子モデルの概略図である。各鎖がユニーク配列を有する。挿入図は、Ｘ鎖とＹ鎖との対を示す。

【図1D】図１Ｄは、６Ｈ×６Ｈ×４８Ｂ直方体のＬＥＧＯ（登録商標）モデルの概略図である。各ブロックがユニーク配列を有する。各層の境界に半分のブロック（即ち、２ドメインオリゴヌクレオチド）がある。

【図1E】図１Ｅは、ＤＮＡブロックが自己集合した６Ｈ×６Ｈ×４８Ｂ直方体の概略図である。これらのブロックは、各ブロックの配列のユニークさのため、自己集合中における互換性はない。この６Ｈ×６Ｈ×４８Ｂを３Ｄ「分子キャンバス」として使用して、これらのブロックのサブセットを使用するより小さい形状を構築することができる。

【図1F】図１Ｆは、大きい１０×１０×１０ボクセル「３Ｄキャンバス」から設計して組み立てた、複雑な任意の３Ｄ形状の概略図である。各ボクセルが、例えば、２個の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基対合によって形成された４ドメインオリゴヌクレオチドの、単一ドメイン（例えば８ヌクレオチドドメイン）の二重鎖に相当する。

【図2A】図２Ａは、ＤＮＡブロックナノ構造を自己集合させるための一段階熱的アニーリングの概略図である。

【図2B】図２Ｂは、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂナノ構造のアガロースゲル電気泳動の画像を示す。このナノ構造は、以下の条件で自己集合させた：２４時間又は７２時間アニーリング勾配、各ＤＮＡ鎖につき１００ｎＭ又は２００ｎＭ、ｐＨ７．９の０．５×ＴＥ緩衝液、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０ｍＭのＭｇＣｌ_２濃度。各アガロースゲルについて、レーンＭは１ｋｂラダーを示し、レーン１〜８は、漸増ＭｇＣｌ_２濃度でアニーリングした６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造を示す。産物バンド（灰色の矢印によって指示される）を３ｋｂマーカーバンド（黒色の矢印によって指示される）と比較することにより、各条件の自己集合収率を推定する。２００ｎＭ（各鎖につき）の鎖を４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２で７２時間アニーリングしたとき、最大収率が達成された。

【図2C】図２Ｃは、未精製の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造と精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造とを比較するアガロースゲル電気泳動の画像を示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１は、図２Ｂ及び図２Ｃに示す最適条件でアニーリングした未精製の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造を示す。レーン２は、精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造を示す。灰色の矢印は６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ産物バンドを指示する。

【図2D】図２Ｄは、精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。高倍率画像が、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂの、それぞれＸ−Ｙ平面、Ｘ−Ｚ平面及びＹ−Ｚ平面投影に対応する完全な構造（本明細書では「粒子」とも称される）の３つの図を示す。高倍率ＴＥＭ画像の右側にコンピュータ生成投影図を示す。

【図2E】図２Ｅは、様々な寸法の３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造の概略設計を示す。

【図2F】図２Ｆは、図２Ｅの３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造のＴＥＭ画像を示す。

【図2G】図２Ｇは、３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造のアガロースゲル電気泳動の画像を示す。ナノ構造の各群について、レーンＭは１ｋｂラダーを示し；他のレーンは、図２Ｅにおけるその設計に一致する数字が表示される。精製及びＴＥＭイメージングのため産物バンド（灰色の矢印によって指示される）を抽出した。

【図3A】図３Ａは、１０ボクセル×１０ボクセル×１０ボクセル三次元キャンバスの概略図である。

【図3B】図３Ｂは、３Ｄキャンバスから（この場合、内部から）不要なボクセルを取り除くことにより設計された目的の核酸構造の概略図である。

【図3C】図３Ｃは、所望の構造／形状を形成するのに必要なオリゴヌクレオチド鎖のコンピュータ生成リストを示す概略図である。構造は、残りのボクセルを認識して必要なオリゴヌクレオチドのリストを生成するコンピュータプログラムによって解析した。次に液体ハンドリングロボットが各形状用の鎖を混合する。

【図3D】図３Ｄは、アガロースゲル電気泳動（左）及びＴＥＭイメージング（右）によって特徴付けられるアニーリング後のナノ構造の画像を示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。主産物バンドを矢印で示す。

【図3E】図３Ｅは、様々な（特定の形状の）例示的ナノ構造の画像を示す。各構造の最上部の画像が３Ｄモデルを表し、その下にコンピュータ生成投影図が続く。画像は、ＴＥＭを使用して視覚化した６つの異なる構造／粒子及び未加工のＴＥＭ画像から平均した。一部の構造は、削除したボクセル（即ち、削除したオリゴヌクレオチドドメイン）を強調する追加的な３Ｄ透視図と共に示す。図３Ｅの１００個の異なる核酸構造の作製に使用した個々のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号６８４２〜１１２９６（即ち、それぞれ鎖０〜４４５４）で示される（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の表１４も参照のこと）。表２は、各形状について、使用した鎖の総数及び各鎖のリスト（括弧内）を示す（２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の表１５も参照のこと）。

【図4A】図４Ａは、下の層までのクロスオーバーを取り除いた図１に示される６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造の最上部のＤＮＡ鎖の概略図である。

【図4B】図４Ｂは、３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂ構造のＴＥＭ画像を示す。右上の挿入図は設計のモデルを示す。右下の挿入図はナノ構造の高倍率画像を含む。

【図4C】図４Ｃは、図４Ｂの３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂ構造の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像を示す。挿入図はこの構造の高倍率画像を含む。

【図4D】図４Ｄは、ハニカム格子３Ｄ ＤＮＡナノ構造の形成用に設計された４種の鎖の概略図である。

【図4E】図４Ｅは、８４塩基対３Ｄナノ構造の鎖ダイヤグラムの概略図である。右下の画像は、円形のヘリックス束の拡大画像を示す。

【図4F】図４Ｆは、６Ｈ×６Ｈ×８４Ｂ−ＨＣ（ハニカム格子）３Ｄ ＤＮＡナノ構造のＴＥＭ画像を示す。挿入図は、構造／粒子の別の投影の拡大画像を示す。

【図4G】図４Ｇは、六方格子３Ｄ ＤＮＡナノ構造の形成用に設計された２種の鎖の概略図である。

【図4H】図４Ｈは、５４ｂｐ ３Ｄナノ構造の鎖ダイヤグラムの概略図である。右下の画像は、円形のヘリックス束の拡大画像を示す。鎖の色は図４Ｄに示すものと一致する。

【図4I】図４Ｉは、６Ｈ×７Ｈ１０８Ｂ−ＨＬ（六方格子）３Ｄ ＤＮＡナノ構造のＴＥＭ画像を示す。挿入図は、構造／粒子の別の投影の拡大画像を示す。

【図5A】図５Ａは、ＤＮＡブリック内の各ドメインを区別するＬＥＧＯ（登録商標）様モデルを示す。図５Ａは、ＤＮＡブリックをその向きに基づき北ブリック、西ブリック、南ブリック、又は東ブリックと称し得ることを示す。矢印が３’末端を指示する。

【図5B】図５Ｂは、ＤＮＡブリック内の各ドメインを区別するＬＥＧＯ（登録商標）様モデルを示す。２つの相補的な８ヌクレオチドドメインのハイブリダイゼーションによって相互作用する２つのブリックを示す。

【図5C】図５Ｃは、図６の４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ直方体のＬＥＧＯ（登録商標）様モデルである。各ブリックが、異なる色によって示されるとおり、ユニーク配列を有する。Ｚ＋方向において、ＤＮＡブリックは各層内で同じ向きを有する；ＤＮＡブリックは、Ｚ＋方向に沿って連続する層の一層毎に９０°反時計回りに回転する。

【図6A】図６Ａは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ直方体３Ｄナノ構造（又は４ボクセル×４ボクセル×８ボクセル）の円柱モデルを示す。各ボクセルが、ＸブリックとＹブリックとの対の塩基対合によって形成される８塩基対二重鎖に相当する。

【図6B】図６Ｂは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。３Ｄ鎖ダイヤグラムを示す。各鎖がそのユニーク配列を有する。

【図6C】図６Ｃは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。３Ｄ鎖ダイヤグラムを示す。各鎖がそのユニーク配列を有する。

【図6D】図６Ｄは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。本発明者らのカスタムプログラムが使用するcaDNAnoフォーマットでヘリックス及び鎖ダイヤグラムを示す。図６Ｄは、Ｚ−方向を見下ろすＸ−Ｙ断面を示す。

【図6E】図６Ｅは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。本発明者らのカスタムプログラムが使用するcaDNAnoフォーマットでヘリックス及び鎖ダイヤグラムを示す。図Ｅは、全ての鎖の詳細な鎖ダイヤグラムを示す。列の数字がヘリックスを表す。上部及び下部の数字が、Ｚ軸に沿った塩基対の位置を指示する。Ｘブリックは濃い灰色の線によって表され、Ｙブリックは薄い灰色の線によって表される。矢印は鎖の３’末端を指示する。

【図6F】図６Ｆは、ＤＮＡ三次元ナノ構造の鎖ダイヤグラムを示す。全てのＸブリック及びＹブリックを示す３Ｄ鎖ダイヤグラムを示す。

【図7A】図７Ａは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。３２ヌクレオチドＤＮＡブリックを示す。

【図7B】図７Ｂは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。同じ３２ｎｔ鎖を表す別の図を示す。各８ヌクレオチドセグメントがＡ、Ｂ、Ｃ又はＤと表示される。

【図7C】図７Ｃは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。Ｘブリックとその４つの隣接するＹブリックとの間の相互作用を示す。相補性が、同様の色及び関連付ける記号によって指示される。例えば、セグメントＡはセグメントＡ^＊と相補的である；これらの２つのセグメントはまた、対応する色によっても示される。

【図7D】図７Ｄは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。Ｘブリックを示し、及びその４つの隣接するＹブリックが近接して示される。

【図7E】図７Ｅは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。Ｘブリックとその４つの隣接するＹブリックとの間の連結を示す球棒モデルを示す。これらは四面体構造を形成し、Ｘブリックが中心にあり、且つ４つのＹブリックの各々が頂点を占める。

【図7F】図７Ｆは、ＸブリックとＹブリックとの間の連結を示す。大規模なＤＮＡ鎖集合の連結パターンがダイヤモンド格子に似ていることを示す。

【図8A】図８Ａは、ランダム配列及び設計配列を含む６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。この実験に使用した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造を示す。サンプルは全て、７２時間アニーリングプロトコルを使用して自己集合させた。

【図8B】図８Ｂは、ランダム配列及び設計配列を含む６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。ランダム配列設計による６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造の自己集合をアッセイするアガロースゲルを示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１〜レーン６は、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｍＭ ＭｇＣｌ_２によって２００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂを示す。１〜６の各レーンに２０μＬのサンプルを加える。

【図8C】図８Ｃは、ランダム配列及び設計配列を含む６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。設計配列を含む６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂの自己集合をアッセイするアガロースゲルを示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１〜レーン６は、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｍＭ ＭｇＣｌ^２によって２００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂを示す。１〜６の各レーンに２０μＬのサンプルを加える。

【図9A】図９Ａは、４８ヌクレオチド境界鎖設計を示す。３Ｄ構造の５Ｈ×５Ｈ×４８Ｂ円柱モデルを示す。

【図9B】図９Ｂは、４８ヌクレオチド境界鎖設計を示す。Ｙ１層が５つのヘリックス、即ちＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５を含むことを示す。Ｙ１層におけるＸブリックのみを示す。境界上の一部の鎖（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ）は、短い１６ヌクレオチド境界鎖を形成する。

【図9C】図９Ｃは、４８ヌクレオチド境界鎖設計を示す。これらの短い１６ヌクレオチド境界鎖のほとんどが、その左側で３２ヌクレオチド鎖と連結して４８ヌクレオチド境界鎖を形成し得ることを示す。

【図10A】図１０Ａは、４８ヌクレオチド境界鎖を含み且つ境界鎖を含まない６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。１６ヌクレオチドの短い境界鎖及び４８ヌクレオチドの長い境界鎖の試験に使用した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造を示す。１６ヌクレオチド境界鎖を使用するこの設計は、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓと称される。本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜７８、１５７〜２２５及び２９５〜３３６で示される（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１も参照のこと）。４８ヌクレオチド境界鎖を使用する設計は、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂと称される。本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は、配列番号７９〜１５６及び２２６〜２９４で示される（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１も参照のこと）。サンプルは全て、３日間アニーリングプロトコルを使用して自己集合させた。

【図10B】図１０Ｂは、４８ヌクレオチド境界鎖を含み且つ境界鎖を含まない６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓ構造の自己集合をアッセイするアガロースゲルを示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１〜レーン８は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２によって１００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓ構造を示す。レーン９〜１６は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２によって２００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓ構造を示す。２０μＬのサンプルを１〜１６の各レーンに加えた。

【図10C】図１０Ｃは、４８ヌクレオチド境界鎖を含み且つ境界鎖を含まない６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体の自己集合を示す。６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造の自己集合をアッセイするアガロースゲルを示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１〜レーン８は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２によって１００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造を示す。レーン９〜１６は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２によって２００ｎＭ濃度で自己集合した６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造を示す。２０μＬのサンプルを１〜１６の各レーンに加えた。

【図11】図１１は、アガロースゲル電気泳動に基づく６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の収率分析を示す。各鎖２００ｎＭを、７２時間アニーリングプロトコルで、且つ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む０．５×トリス緩衝液中において、７２時間アニーリング勾配を使用して自己集合させた。１０μＬのサンプルを各レーンに加えた。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。左側の薄い灰色の囲み線のバンドは、６０ｎｇ ＤＮＡに対応する３０００ｂｐラダーバンドを指示する。このバンドを、産物の収率を計測する標準として使用した。４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２で形成された産物バンドを囲み線に入れて印を付ける。各産物バンドの下側に、産物バンドの絶対質量値及びパーセンテージ収率の両方を示す。

【図12A】図１２Ａは、ＴＥＭ画像に基づくアガロースゲル電気泳動精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の収率分析を示す。精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂの代表的なＴＥＭ画像である。中間の灰色で丸く囲んだ粒子は、目に見える欠陥のない「良好」な粒子と分類される。薄い灰色／白色で丸く囲んだ粒子／構造は、軽微な欠陥を有する「軽微な欠陥」粒子と分類される。濃い灰色で丸く囲んだ粒子は、重大な欠陥を有するか又はさらには壊れている「重大な欠陥」粒子と分類される。

【図12B】図１２Ｂは、ＴＥＭ画像に基づくアガロースゲル電気泳動精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の収率分析を示す。精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂの「良好」、「軽微な欠陥」、及び「重大な欠陥」粒子の例を示す。

【図12C】図１２Ｃは、ＴＥＭ画像に基づくアガロースゲル電気泳動精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の収率分析を示す。データは収率を示し、「良好」、「軽微な欠陥」、及び「重大な欠陥」の下の数字がカウントされた粒子の数を示す。

【図13A】図１３Ａは、修飾３Ｄ構造の設計戦略を示す。５Ｈ×５Ｈ×４８Ｂ ３Ｄ構造の円柱モデルを示す。各ボクセルが８塩基対である。

【図13B】図１３Ｂは、修飾３Ｄ構造の設計戦略を示す。当初の戦略を用いて設計された５Ｈ×５Ｈ×４８Ｂ構造のＸ１層を示す。Ｘ１層のＹブリックのみを示す。４８ヌクレオチド境界鎖（図１０）が実施されていることに留意されたい。矢印及びアスタリスク（＊）は、修飾されたバージョンを生成するためクロスオーバーが取り除かれる位置を指示する。

【図13C】図１３Ｃは、修飾３Ｄ構造の設計戦略を示す。修飾設計を使用する５Ｈ×５Ｈ×４８Ｂ構造のＸ１層を示す。当初の設計と比較して４つのクロスオーバーが取り除かれ、同じ二重鎖に位置する鎖の対を一体に合わせることにより新しい鎖（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ）が組み込まれた。

【図14A】図１４Ａは、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ構造のアガロースゲル及びＴＥＭ収率を示す。６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ構造のアガロースゲルアッセイを示す。レーン１は、対照サンプルとしての６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造を示す。レーン２は、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ構造を示す。両方のサンプルとも、同じ条件でアニーリングされる（各鎖につき２００ｎｍ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む０．５×トリス緩衝液、７２時間アニーリング勾配）。６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ設計は６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂより２．９倍高い収率を生じる。

【図14B】図１４Ｂは、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ構造のアガロースゲル及びＴＥＭ収率を示す。精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ構造の代表的なＴＥＭ画像及びＴＥＭ収率を示す。本発明の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は、配列番号３３７〜５９０で示される（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表６も参照のこと）。

【図15】図１５は、３Ｈ×３Ｈ、４Ｈ×４Ｈ、６Ｈ×６Ｈ、６Ｈ×１０Ｈ、及び８Ｈ×１２Ｈ構造のアガロースゲル収率分析を示す。これらの構造は、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む０．５×トリス緩衝液中で７２時間アニーリング勾配を使用して自己集合させた。各鎖の濃度は２００ｎＭであった。１０μＬのサンプルを各レーンに加えた。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。矢印で指示される、６０ｎｇのＤＮＡに対応する３０００塩基対バンドを、アニーリング産物の収率を計測する標準として使用した。各産物バンドの下側に、産物バンドの絶対質量値及びパーセンテージ収率の両方を示す。

【図16A】図１６Ａは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。この図で用いる記号を示す。

【図16B】図１６Ｂは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。４つの８ヌクレオチドランダム配列ドメインを含む典型的な鎖を示す。各８ヌクレオチドドメインは、８塩基対ボクセル、即ちＶ１、Ｖ２、Ｖ３、又はＶ４内に位置する。Ｖ１及びＶ２は同じヘリックス上にある。Ｖ３及びＶ４は別の隣接するヘリックス上にある。

【図16C】図１６Ｃは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。４つの８ヌクレオチドランダム配列ドメインを含む鎖に由来する他の種類の鎖を示す。４つの８塩基対ボクセルのうち１つが取り除かれると、当該の８塩基対ボクセルに対応するその８ヌクレオチドドメインが８個の連続するＴに変えられることを示す。

【図16D】図１６Ｄは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。４つの８ヌクレオチドランダム配列ドメインを含む鎖に由来する他の種類の鎖を示す。４つの８塩基対ボクセルのうち２つが取り除かれると、それらの８塩基対ボクセルに対応するその２つの８ヌクレオチドドメインが８個の連続するＴに変えられるか、或いは欠失するかのいずれかであることを示す。後者の例は、２つの取り除かれた８塩基対ボクセルが同じヘリックス由来である場合に起こる。

【図16E】図１６Ｅは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。４つの８ヌクレオチドランダム配列ドメインを含む鎖に由来する他の種類の鎖を示す。４つの８塩基対ボクセルのうち３つが取り除かれると、同じヘリックスからの２つの取り除かれたボクセルに対応する２つの８ヌクレオチドドメインが欠失することを示す。第３の取り除かれたボクセルに対応する別の８ヌクレオチドドメインは、８個の連続するＴに変えられる。

【図16F】図１６Ｆは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。４つの８ヌクレオチドランダム配列ドメインを含む鎖に由来する他の種類の鎖を示す。Ｂに示す各鎖に関して、２種類の４８ヌクレオチド境界鎖が作り出されることを示す。

【図16G】図１６Ｇは、３Ｄキャンバスから複雑な形状を作成するための鎖の設計を示す。各鎖が、それが充当されるボクセルの位置で識別されることを示す。数字の各対が１つのボクセルに相当する。１番目の数字はヘリックスを指示し、２番目の数字はヘリックス上のボクセル位置を指示する。数字（０、０）は８個の連続するチミジン（Ｔ）を含むドメイン又は空のドメインを意味する。

【図17】図１７は、３Ｄ形状を設計するためのワークフロー図を示す。

【図18A】図１８Ａは、３Ｄ形状エディティングインタフェースの図を示す。１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバスを示す。各球体が１つのボクセルに相当する。

【図18B】図１８Ｂは、３Ｄ形状エディティングインタフェースの図を示す。不要なボクセルを取り除くことによる形状エディティングがどのように行われるかを示す。図１８Ｃ及び図１８Ｂはそれぞれ、図１８Ａの１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバス及び図１８Ｂの形状に対応するcaDNAnoファイルを示す。３Ｄ描写からcaDNAnoフォーマットへの変換は、カスタムプログラムにより行った。

【図18C】図１８Ｃは、３Ｄ形状エディティングインタフェースの図を示す。図１８Ｃ及び図１８Ｂはそれぞれ、図１８Ａの１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバス及び図１８Ｂの形状に対応するcaDNAnoファイルを示す。３Ｄ描写からcaDNAnoフォーマットへの変換は、カスタムプログラムにより行った。

【図19A】図１９Ａは、交互の鎖を含む３Ｄ構造設計を示す。４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−Ａ（交互設計）構造の円柱モデルを示す。各ボクセルが８塩基対に相当する。

【図19B】図１９Ｂは、交互の鎖を含む３Ｄ構造設計を示す。４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−Ａ構造における鎖の詳細を示す。鎖は層に沿って互い違いの方向に向いている。例えば、Ｘ１層のＹブリックとＸ２層のＹブリックとは逆方向に、それぞれ−Ｚ方向及び＋Ｚ方向を向いている。従って、各鎖の方向は「左」（Ｌ）又は「右」（Ｒ）と表される。

【図19C】図１９Ｃは、交互の鎖を含む３Ｄ構造設計を示す。交互設計戦略を試験するために使用した６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ−Ａ構造を示す。

【図19D】図１９Ｄは、交互の鎖を含む３Ｄ構造設計を示す。アガロースゲル電気泳動アッセイの結果を示す。レーンＭは１ｋｂラダーを示す。レーン１は６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ−Ａ構造を示す。これらの構造は、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む０．５×トリス緩衝液中で７２時間アニーリング勾配を使用して自己集合させた。各鎖の濃度は２００ｎＭである。産物に対応する特徴的な明るいバンドをゲルから抽出した。

【図19E】図１９Ｅは、交互の鎖を含む３Ｄ構造設計を示す。アガロースゲル精製後の６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ−Ａ構造のＴＥＭ画像を示す。スケールバーは縮小画像について１００ｎＭ、及び拡大画像について２０ｎｍである。

【図20A】図２０Ａは、従来のＤＮＡ組立て手法の提案される組立て機構（上）を、本発明のＤＮＡ結晶の提案される組立て機構（下）と比較して示す。予め組み立てられた複数の鎖のブロックではなしに、むしろ個々のＤＮＡ鎖が、成長するＤＮＡ結晶に直接組み込まれるため、規定の奥行き及び三次元特徴を有する複雑な結晶を構築するための普遍的且つロバストなフレームワークが可能となる。

【図20B】図２０Ｂは、９０°の角度を形成する一対の３２ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡブリックの鎖モデル（上）及びブリックモデル（下）を示す。

【図20C】図２０Ｃは、左上から時計回りに、６Ｈ（ヘリックス）×６Ｈ×２４Ｂ（塩基対）直方体構造のモデルを最も詳細なものから最も詳細でないものの順に示す：ブリックが灰色の濃さの違いで表示される鎖モデル、ブリックが灰色の濃さの違いで表示されるブリックモデル、全てのブリックが薄い灰色で表示されるブリックモデル、及びブリックを示さずＤＮＡヘリックスを表す円柱モデル。ブリックは互いに異なる配列を有する。Ｚ軸はＤＮＡヘリックスと平行である。

【図20D】図２０Ｄは、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体から設計された一次元（１Ｄ）、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）ＤＮＡブリック結晶のモデルを示す。Ｚ軸に沿った１Ｄ結晶成長を示す。

【図20E】図２０Ｅは、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体から設計された一次元（１Ｄ）、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）ＤＮＡブリック結晶のモデルを示す。Ｚ軸及びＸ軸に沿った２Ｄ結晶成長を示す。

【図20F】図２０Ｆは、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体から設計された一次元（１Ｄ）、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）ＤＮＡブリック結晶のモデルを示す。Ｘ軸及びＹ軸に沿った２Ｄ結晶成長を示す。

【図20G】図２０Ｇは、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体から設計された一次元（１Ｄ）、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）ＤＮＡブリック結晶のモデルを示す。

【図20H】図２０Ｈは、トンネル及び周期的な空洞を含む１Ｄ Ｚ結晶を示す。図１０Ｈ〜図２０Ｋは、チャネル、トンネル及び空洞を含むＤＮＡ結晶の円柱モデルを示す。

【図20I】図２０Ｉは、２群の平行なトンネルを含む２Ｄ ＺＸ結晶を示す。図１０Ｈ〜図２０Ｋは、チャネル、トンネル及び空洞を含むＤＮＡ結晶の円柱モデルを示す。

【図20J】図２０Ｊは、周期的な空洞を含む２Ｄ ＸＹ結晶を示す。図１０Ｈ〜図２０Ｋは、チャネル、トンネル及び空洞を含むＤＮＡ結晶の円柱モデルを示す。

【図20K】図２０Ｋは、周期的な空洞を含む３Ｄ ＺＸＹ結晶を示す。結晶の単位格子は青色のボックスを使用して示される。矢印は、結晶成長の方向を指示する。図１０Ｈ〜図２０Ｋは、チャネル、トンネル及び空洞を含むＤＮＡ結晶の円柱モデルを示す。

【図20L】図２０Ｌは、三次元空間における複雑なＤＮＡ結晶を示す。

【図20M】図２０Ｍは、本発明のＤＮＡブリック結晶の提案される組立て機構を、ＤＮＡ折り紙結晶の提案される組立て機構と比較して示す。上：６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ ＤＮＡブリック直方体が伸長して二次元成長結晶を形成する。ブリックは個々に結晶に組み込まれる。下：６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ ＤＮＡ折り紙直方体が伸長して二次元成長結晶を形成する。各直方体が正確に形成され、次に結晶に組み込まれる必要がある。両方の結晶とも、繰り返し情報単位が濃い灰色で指示される。

【図21A】図２１Ａは、６Ｈ×６Ｈ、８Ｈ×８Ｈ、及び１０Ｈ×１０Ｈ ＤＮＡバンドル結晶、右巻きらせんチャネルを有する８Ｈ×８Ｈ ＤＮＡバンドル結晶、三角形断面を有する４３Ｈ ＤＮＡバンドル結晶、及び六角形断面を有する４４Ｈ ＤＮＡバンドル結晶のモデル及びＴＥＭ画像を示す。

【図21B】図２１Ｂは、トンネルを有するＤＮＡバンドル結晶のモデル及びＴＥＭ画像：２Ｈ×４Ｈトンネルを有する８Ｈ×８Ｈ ＤＮＡバンドル結晶、２Ｈ×２Ｈトンネル及び垂直８Ｈ×２Ｈ×２４Ｂトンネルを含む８Ｈ×８Ｈ ＤＮＡバンドル結晶、６Ｈ×６Ｈトンネルを有する１２Ｈ×１２Ｈ ＤＮＡバンドル結晶を示す。各結晶の繰り返し単位を、円柱モデルにおける濃い灰色の領域として表す。

【図22A】図２２Ａは、４層、６層、１０層及び２０層ＺＸ結晶の円柱モデルを示す。

【図22B】図２２Ｂは、図２２ＡのＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図22C】図２２Ｃは、図２１Ａ及び図２１Ｂの折り畳まれた結晶のＴＥＭ画像を示す。矢印は、結晶の厚さの計測位置を指示する。

【図22D】図２２Ｄは、２Ｈ×２Ｈ平行チャネルを含む６層結晶の円柱モデルを示す：（左から右に）２群の交差チャネル−ＤＮＡヘリックス軸に平行な２Ｈ×２ＨチャネルとＤＮＡヘリックス軸に垂直な２Ｈ×３２Ｂチャネルとを含む６層結晶；２Ｈ×６Ｈ×３２Ｂポアを含む６層結晶；２群の接触のないトンネル−ＤＮＡヘリックス軸に平行な２Ｈ×２ＨトンネルとＤＮＡヘリックス軸に垂直な２Ｈ×２４Ｂトンネルとを含む１０層結晶。この２群のトンネルはＤＮＡヘリックスの２層によって隔てられる。各結晶の繰り返し単位は、円柱モデルにおける濃い灰色の領域として指示される。

【図22E】図２２Ｅは、図２２Ｄにおける結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図23A】図２３Ａは、中実ＸＹ結晶のモデルを示す：６４ｂｐ。各結晶について円柱モデル（上）及びＴＥＭ画像（下）が示される。

【図23B】図２３Ｂは、中実ＸＹ結晶のモデルを示す：１２８ｂｐ。各結晶について円柱モデル（上）及びＴＥＭ画像（下）が示される。

【図23C】図２３Ｃは、中実ＸＹ結晶のモデルを示す：１９２ｂｐ。各結晶について円柱モデル（上）及びＴＥＭ画像（下）が示される。

【図23D】図２３Ｄは、中実ＸＹ結晶のモデルを示す：２５６ｂｐ。各結晶について円柱モデル（上）及びＴＥＭ画像（下）が示される。

【図23E】図２３Ｅは、２Ｈ×２Ｈ×６４Ｂ平行ポアを含むＸＹ結晶のモデルを示す。

【図23F】図２３Ｆは、２Ｈ×２Ｈ×１２８Ｂ平行ポアを含むＸＹ結晶のモデルを示す。

【図23G】図２３Ｇは、ＸＹ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶の３つの投影図のクライオＥＭ ３Ｄ再構成画像を示す。

【図23H】図２３Ｈは、ＸＹ−３２Ｈ×１２８Ｂ−ポア結晶の３つの投影図のクライオＥＭ ３Ｄ再構成画像を示す。矢印は、結晶の厚さの計測位置を指示する。

【図23I】図２３Ｉは、４Ｈ×３２Ｂ平行チャネルを含む９６ｂｐ結晶を示す。

【図23J】図２３Ｊは、チューブの軸に垂直な３２ｂｐヘリックスにより形成されるチューブ結晶を示す。結晶の単位格子は、濃い灰色のボックスを使用して示される。

【図24A】図２４Ａは、個別のオブジェクトからどのように伸長した結晶が設計されるかを示す鎖ダイヤグラムを示す。（Ａ）左上、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体個別ＤＮＡブリック構造。左下、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体の横断面。右、６Ｈ×６Ｈ×２４Ｂ直方体の詳細な鎖ダイヤグラム。左及び右の数字がヘリックスを指示する。上及び下の数字がＺ軸に沿った塩基対の位置を指示する。Ｘブリックは濃い灰色の線で表され、Ｙブリックは薄い灰色の線で表される。

【図24B】図２４Ｂは、個別のオブジェクトからどのように伸長した結晶が設計されるかを示す鎖ダイヤグラムを示す。（Ｂ）一次元成長：Ｚ成長、Ｘ成長、及びＹ成長の連結パターン。

【図24C】図２４Ｃは、個別のオブジェクトからどのように伸長した結晶が設計されるかを示す鎖ダイヤグラムを示す。（Ｃ）二次元成長：ＺＸ成長及びＸＹ成長の連結パターン。

【図24D】図２４Ｄは、個別のオブジェクトからどのように伸長した結晶が設計されるかを示す鎖ダイヤグラムを示す。Ｚ−６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図25A】図２５Ａは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−８Ｈ×８Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図25B】図２５Ｂは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−１０Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図25C】図２５Ｃは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−６Ｈ×６Ｈ×１２８Ｂ−らせん結晶。

【図25D】図２５Ｄは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−４３Ｈ×３２Ｂ−三角形結晶。

【図25E】図２５Ｅは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−４４Ｈ×３２Ｂ−六角形結晶。

【図25F】図２５Ｆは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−５６Ｈ×３２Ｂ−トンネル結晶。

【図25G】図２５Ｇは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−６０Ｈ×６４Ｂ−トンネル結晶。

【図25H】図２５Ｈは、Ｚ結晶のＴＥＭ画像を示す。Ｚ−１０８Ｈ×３２Ｂ−トンネル結晶。

【図26A】図２６Ａは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図26B】図２６Ｂは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図26C】図２６Ｃは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−４Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図26D】図２６Ｄは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−４Ｈ×２０Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶。

【図26E】図２６Ｅは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−チャネル結晶。

【図26F】図２６Ｆは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−交差チャネル結晶。

【図26G】図２６Ｇは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶。

【図25H】図２５Ｈは、ＺＸ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＺＸ−９６Ｈ×６４Ｂ−交差トンネル結晶。

【図27A】図２７Ａは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−４８Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶。

【図27B】図２７Ｂは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−６４Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶；

【図27C】図２７Ｃは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶；

【図27D】図２７Ｄは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×１２８Ｂ−直方体結晶；

【図27E】図２７Ｅは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×１９２Ｂ−直方体結晶；

【図27F】図２７Ｆは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×２５６Ｂ−直方体結晶；

【図27G】図２７Ｇは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶；

【図27H】図２７Ｈは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−３２Ｈ×１２８Ｂ−ポア結晶；及び

【図25I】図２５Ｉは、ＸＹ結晶のＴＥＭ画像を示す。ＸＹ−８Ｈ×４Ｈ×９６Ｂ−チャネル結晶。

【図28A】図２８Ａは、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体二次元成長結晶設計（上）及びどのようにこの構造を使用してチューブを形成することができるか（下）を示す。

【図28B】図２８Ｂは、Ｘ軸に沿って拡張する４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体繰り返し単位を示す。

【図28C】図２８Ｃは、４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体繰り返し単位の投影図を示す。Ｚ軸に沿ってクロスオーバーが非対称に分布する：クロスオーバーの半分は直方体の中間点に位置し、残りの半分は直方体の左端に位置する。

【図29】図２９は、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−チューブ結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図30】図３０は、６０ｍＭのＭｇＣｌ_２において組み立てたＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−チューブ結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図31】図３１は、交互に並ぶＤＮＡブリックを使用したＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図32A】図３２Ａは、Ｘ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶設計及びＴＥＭ画像を示す。

【図32B】図３２Ｂは、Ｘ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶設計及びＴＥＭ画像を示す。濃色の領域が繰り返し単位を表す。

【図33A】図３３Ａは、オフセット−ＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶の設計を示す。濃色の部分が繰り返し単位を表す。

【図33B】図３３Ｂは、オフセット−ＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図33C】図３３Ｃは、オフセット−ＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶の鎖ダイヤグラムを示す。

【図34A】図３４Ａは、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶に最密に充填された１０ナノメートル金ナノ粒子の平行線のモデルを示す。

【図34B】図３４Ｂは、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６チャネル結晶に最密に充填された１０ナノメートル金ナノ粒子の平行線のＴＥＭ画像を示す。

【図34C】図３４Ｃは、単一の鎖状金ナノ粒子の高倍率ＴＥＭ画像を示す。

【図34D】図３４Ｄは、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶の上表面及び底表面に形成された最密充填金ナノ粒子単層のモデルを示す。

【図34E】図３４Ｅは、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶の上表面及び底表面に形成された最密充填金ナノ粒子単層のＴＥＭ画像を示す。

【図34F】図３４Ｆは、縁部が曲線状のＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶の高倍率ＴＥＭ画像を示す。薄い灰色の矢印は、２つの金ナノ粒子単層が見える湾曲の位置を指示する。

【図35A】図３５Ａは、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶の設計を示す。濃色の部分が繰り返し単位を表す。

【図35B】図３５Ｂは、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶のＴＥＭ画像を示す。

【図35C】図３５Ｃは、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶の鎖ダイヤグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本明細書は、ファイル名「H0498.70443WO00 - Sequence Listing」、作成日２０１３年７月２３日、及びサイズ２．３４ＭＢの別個のＡＳＣＩＩテキストファイルとして本明細書と共に提出された配列表を、全体として参照によりさらに援用する。

【0031】

発明の詳細な説明
本発明は、その最も広義の意味において、予め決められた、従って制御された形状、サイズ及び複雑さの核酸構造を作成する方法、そのように作成された構造、及びこの方法で使用されるオリゴヌクレオチド複数個に関する。本発明は、一部には、選ばれた複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを自己集合させて制御された形状、サイズ、複雑さ及び修飾の３Ｄ核酸構造を形成し得るという予想外の知見に基づいている。とりわけ、複数個の比較的短い（例えば、ＤＮＡ折り紙技法に必要な足場鎖と比べて）一本鎖オリゴヌクレオチドのみを使用して様々な予め決められた形状及び制御されたサイズの安定した３Ｄ核酸構造を形成し得ることは、意外であると考えられた。

【0032】

より詳細には、本発明の様々な態様は、一本鎖２ドメイン又は４ドメインオリゴヌクレオチド（本明細書では「核酸ブリック」又は「ＤＮＡブリック」とも称される）を使用して、核酸ナノ構造のモジュール式自己集合を三次元にまで広げる方法に関する。この方法の普遍性は、２個の８ＭＤａ直方体、共通の直方体「３Ｄキャンバス」から構築された１０２個の入り組んだ三次元（３Ｄ）形状、及び交互に充填する幾何学的配置に従うモジュール式核酸モチーフから組み立てられた１９個の三次元ナノ構造を含む１２３個のナノ構造の設計及び特徴付けに成功したことにより実証された。また、本明細書には、様々な態様において、単純な三次元モデルを所望の対応する核酸構造の生成に必要な一組の核酸鎖に変換するコンピュータプログラムも提供される。

【0033】

本発明の核酸構造は、予め決められた又は既知の方法で三次元形状に（配列特異的アニーリングによって）配置された複数のオリゴヌクレオチドを含む。結果として、構造中の各オリゴヌクレオチドの位置は既知となる。このようにして、構造は、特定の位置で例えばオリゴヌクレオチドを加え、取り除き又は置き換えることにより、修飾することができる。この構造はまた、特定の位置に例えば部分を取り付けて修飾することもできる。これは、出発物質として修飾オリゴヌクレオチドを使用することによるか、又は構造が形成された後に特定のオリゴヌクレオチドを修飾することにより達成され得る。従って、得られる構造における出発オリゴヌクレオチドの各々の位置が既知であることにより、構造にアドレサビリティが付与される。

【0034】

本発明の核酸構造は、場合によっては、一本鎖オリゴヌクレオチドの自己集合プロセスを介して作成され得る。こうした自己集合方法では、一本鎖オリゴヌクレオチドを単一の容器内に組み合わせ、配列相補性に基づき互いにアニーリングさせる。場合によっては、このアニーリングプロセスは、オリゴヌクレオチドを高温に置くことと、次に配列特異的結合に有利となるように温度を徐々に下げることとを含む。本明細書で使用されるとき、用語「自己集合」は、オリゴヌクレオチド（及び場合によっては核酸構造）が、配列特異的な形で、予測された形で且つ外部制御（例えば、オリゴヌクレオチド又は核酸構造を逐次的に加えることによる）なしに互いにアニーリングする能力を指す。

【0035】

従って本発明は、とりわけ、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物、様々な予め決められた又は既知のサイズ、形状、複雑さ及び修飾の核酸構造を作成する方法、様々な予め決められた又は既知のサイズ、形状、複雑さ及び修飾の核酸構造、核酸の複数個であって、自己集合して三次元核酸構造を形成し得るかかる複数個、２個以上の核酸構造を含む複合構造、及びかかる複合構造を作成する方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸構造及び複合構造を使用する方法も提供する。本発明のこれらの態様及び実施形態は、本明細書にさらに詳細に記載される。

【0036】

核酸構造
本発明の核酸構造は、配列特異的な形で互いに結合して３Ｄ形状を形成する複数個のオリゴヌクレオチドで構成される。本発明のオリゴヌクレオチドは４つのドメインを有し得るが、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上のドメインを有し得る。ドメインの数は、少なくとも一部には、オリゴヌクレオチドの長さに依存する。従って、例えば２００ヌクレオチドを超える大きさの長いオリゴヌクレオチドは、２０個より多いドメインを有することができる。図１Ａ及び図５Ａは４ドメインオリゴヌクレオチドの概略図を提供し、各ドメインが８ヌクレオチドを有する。核酸構造を生じさせるアニーリングプロセスの前は、オリゴヌクレオチドは一本鎖形態である。ドメイン及び／又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はランダムであってよい（但し、ドメイン間で必要なハイブリダイゼーションが起こるものとする）。本明細書にさらに詳細に記載されるとおり、一部のドメインはポリＴ配列を有する。従って、一部の構造は、ランダム配列ドメインとポリＴドメインとで構成される。

【0037】

オリゴヌクレオチドは、例えば４つの隣接する８ヌクレオチドドメインを有し、合計３２ヌクレオチドの長さの「ブリック（brick）」（ＬＥＧＯ（登録商標）ブロック（brick）と同様、以下参照）として概念化することができる。これらのドメインは、それぞれ１、２、３、４と称され得る（図１Ａ）（明確にするため、場合によってこれらの図は、「Ｘ」ブリックの４つのドメインを指示してＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４ドメインを参照し、「Ｙ」ブリックの４つのドメインを指示してＹ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４ドメインを参照し得る）。各ＤＮＡブリックは、場合によっては互いに異なるヌクレオチド配列を担持する。全てのＤＮＡブリックが、目的の構造に組み込まれたときに同一の全体形状、即ち単一のリン酸結合によってつなぎ合わされた２個の１６塩基対（１６ｍｅｒ）逆平行ヘリックスをとる。結合に隣接するこの２つのドメインは「ヘッド」ドメインと称され、他の２つは「テイル」ドメインと称される。配列「ａ」を担持するテイルドメインを含むＤＮＡブリックは、立体特異的な形で相補的な「ａ^＊」ヘッドドメインを含む隣接ブリックと生産的に相互作用することができる。ブリック間で対が形成される毎に、９０°の二面角を作り出すように充填された３つの平行なヘリックスが画定される（図１Ｂ上）；この角度は、８塩基対のＤＮＡの４分の３右巻きらせん状のねじれに由来する。

【0038】

ＬＥＧＯ（登録商標）様モデルは、本明細書では、設計を単純な方法で描くために用いられ得る（図１Ｂ下及び図５）。このモデルは詳細ならせん構造及び鎖の極性には目をつぶるが、アスペクト比及びＤＮＡブリック間の相互作用に対する一部の向きの制約に関する情報は保持する：ヘリックス軸と同じ方向を指し示す、２つの突出する丸い差込み部が、２つのテイルドメインに相当し；凹んだ丸い穴を有する２つの連結された立方体が、２つのヘッドドメインに相当する。ブリックは、２種類の向き、水平又は垂直のうちの一方をとらなければならない（図１Ｂ）。これらの２つのブリックが、差込み部を穴に挿入することとして表されるハイブリダイゼーションによって連結すると、９０°の角度を形成する。挿入は、適合する極性（説明を簡潔にするため、本モデルではこれは図式的には描かれない）の相補配列を持つ差込み部と穴との間のみで可能である。鎖の極性及びブリック間の相互作用に対する立体特異的な制約を特定するさらなる詳細なＬＥＧＯ（登録商標）様モデルを、図５に示す。

【0039】

図５は、本明細書で北、西、南、及び東と称される向きを有する連続的な８塩基対の層に沿った核酸ブリックを示す。北向き及び南向きのブリックは、各ダブルヘリックスから１つのヘリックスを含むサブセットに限定され得る。同様に、西向き及び東向きのブリックは、相補的なサブセットのヘリックスに限定され得る（図６も参照のこと）。従って、北及び南に向くブリックを併せてＹブリックとしてまとめ、西及び東に向くブリックを併せてＸブリックとしてまとめることが好都合であり得る。ドメイン間ハイブリダイゼーションの点で、図５では、あるオリゴヌクレオチド上のテイルドメインと別のオリゴヌクレオチドのヘッドドメインの間に連結があり得る。ここで、異なる突起形状（テイルドメイン１及び４について）及び適合する空洞（ヘッドドメイン２及び３について）を使用するＬＥＧＯ（登録商標）モデルを示す。テイルドメインＹ４及びヘッドドメインＸ２の連結が示される（図５Ｂ）。加えて、これらの形状及び空洞は、ブリックの対に強制的に９０°の二面角を形成させるように設計される。

【0040】

６Ｈ（ヘリックス）×６Ｈ（ヘリックス）×４８Ｂ（塩基対）直方体ナノ構造（図１Ｃ、図１Ｄ）において、この設計の構造周期性を説明することができる。ブリックは、そのヘッドドメインを含む８塩基対層にまとめることができる。ブリックは、連続する８塩基対層に沿って９０°の時計回りの回転を伴い、従ってブリックの向き及び配置の点で４層毎に繰り返し単位となる。例えば、図１Ｄにおける１番目及び５番目の８塩基対層が同じ配置のブリックを共有し得る。８塩基対層の中では、全てのブリックが同じ向きを共有し、それらの穴の対がラインを画定する連結鎖を形成し得る。これらの連結鎖を横方向に互い違いの配置で充填すると、この層によって画定される平面が敷かれる。各層の境界上では、一部の核酸ブリックが半分のブリックに二等分される必要があり（即ち、２ドメインオリゴヌクレオチド）、これは２つのドメインを含む単一のヘリックスに相当する。直方体は核酸ブリックから一段階反応で自己集合することができる。場合によっては、各ブリックが、その予め設計された位置にのみ嵌まるように仕向けられるユニーク配列を有し得る。そのモジュール性により、予め設計された核酸ブリックナノ構造を使用して、ブリックのサブセットから組み立てられる、より小さいカスタムの任意形状を構築することができる（図１Ｅ）。

【0041】

Ｌｅｇｏ様モデルは、各８ｂｐ二重鎖の位置情報のみを含む３Ｄモデルにさらに抽象化することができる。１０Ｈ×１０Ｈ×８０Ｂ直方体が１０×１０×１０ボクセルを含む３Ｄキャンバスとして概念化され、各ボクセルが８ｂｐ二重鎖に対応する（図１Ｅ）。この３Ｄキャンバスに基づき、初めにコンピュータプログラムが、完全体のブリック及び半分のブリックを含む、任意のカスタム形状の構築に使用することのできる完全な一組のＤＮＡブリックを生成する。次に設計者は、３Ｄモデリングソフトウェアを使用して、３Ｄキャンバスから不要なボクセルを取り除くことにより（３Ｄスカルプティングに似たプロセス）目標の形状を定義するだけでよい。続いてコンピュータプログラムが形状を解析し、その形状を自己集合させるのに的確なオリゴヌクレオチド（ブリック）のサブセットを自動で選択し得る。

【0042】

核酸構造は合成の前に設計されてもよく、合成過程で特定の選択オリゴヌクレオチドを使用することにより、そのサイズ、形状、複雑さ及び修飾が指定され、且つ制御され得る。構造における各ドメイン及び各オリゴヌクレオチドの位置は既知であり、特定の形状のナノ構造を合成する前に提供される。

【0043】

典型的には、オリゴヌクレオチドの各ドメインはユニーク配列を有する。一対の隣接するオリゴヌクレオチドが、それらのオリゴヌクレオチドの一方に各々位置する２つの相補ドメイン（例えば、ヘッドドメイン１とテイルドメイン３）のハイブリダイゼーションによって二重鎖を形成する（図１Ｂ上）。しかしながら、場合によっては、オリゴヌクレオチドの特定のドメインが核酸構造における別のドメインと結合しないこともある。そのような例では、構造中にポリＴドメインを有するオリゴヌクレオチドが、好ましくは境界に、且つ一本鎖であるポリＴドメインをもたらす構成で存在する。従って、一部の実施形態では、４ドメイン（又はそれ以上の）オリゴヌクレオチドの少なくとも１つ又は少なくとも２つのドメインが、ポリＴドメイン（例えばＴヌクレオチドからなる）であり得る。

【0044】

場合によっては、核酸構造中の少なくとも１つのドメインがユニークであり、これは、そのドメインが当該の構造に１回のみ現れることを意味する。構造は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個又はそれ以上のユニークドメインを含めた、１つ以上のユニークドメインを含み得る。一部の実施形態では、構造中のドメインの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、又は９０％がユニークである。例として、構造は、各々がその構造中に１回のみ現れる第１の複数個のドメインを含むことができ、これらのユニークドメインは構造中の全ドメインの７５％に存在し得るとともに、各々がその構造中に２回以上現れる第２の複数個のドメインを含むことができ、これらの繰り返しドメインは構造中の全ドメインの２５％に相当し得る。他の割合もまた可能であることは明らかであろう。一部の実施形態では、構造中のあらゆるドメインがユニークである。一部の実施形態では、ポリＴドメインを除く構造中のあらゆるドメインがユニークである。複合構造（即ち、スペーサー−リンカーで互いに連結された２個以上の核酸構造を含む構造）中のあらゆるドメインがユニークであっても、又はユニークでなくてもよい。

【0045】

場合によっては、構造中のダブルヘリックスにおける少なくとも１つのドメインがユニークであり、これは、そのドメインが当該のダブルヘリックスに１回のみ現れることを意味する。ドメインは同じ構造内の他のヘリックスに存在してもよく、従って場合によっては、核酸構造全体の文脈ではユニークでないこともある。ヘリックスに、当該のヘリックスの文脈でユニークなドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上あり得る。ヘリックス中のユニークドメインは、当該のヘリックス中のドメインの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、９０％、又は１００％に相当し得る。ヘリックス中のユニークドメインは、構造の末端又はその近傍に位置し得る。ヘリックス中のユニークドメインは互いに隣接していてもよく、又は互いに離間されていてもよい。それらは繰り返しドメイン（即ち、ヘリックスに２回以上現れるドメイン）によって互いに離されていてもよい。

【0046】

構造は、ユニークドメインを有する１つ以上のヘリックスを含み得る。この種類のヘリックスは、構造中に存在するヘリックスの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％又は１００％に相当し得る。この種類のヘリックスが構造中に２つ以上存在する場合、それらは互いに隣接していてもよく、又はユニークドメインを含まないヘリックスを含め、他のヘリックスによって離されていてもよい。例として、ユニークドメインを有するヘリックスが、構造において、ユニークドメインを含まないヘリックスと交互に並び得る。

【0047】

従って、場合によっては、核酸構造は、１つ以上のユニークドメインを各々有する２つ以上のヘリックスを含むことができ、ここでドメインは個々のヘリックスそれ自体の文脈でユニークであり、且つ場合により、構造全体としての文脈の中でユニークである。個々のヘリックスにおけるユニークドメインが構造中の他のヘリックスに存在し得る。個々のヘリックスにおけるユニークドメインが、構造中の他のヘリックスにおけるユニークドメインであり得る。

【0048】

場合によっては、構造中の１つ以上のヘリックスが、各々、完全にユニークドメインで構成されてもよく、これは、それらのドメインの各々が各ヘリックスにつき１回のみ現れるか又は各構造につき１回のみ現れることを意味する。

【0049】

従って、場合によっては、本発明の核酸構造は少なくとも１つのユニークダブルヘリックスを含む。ユニークダブルヘリックスは、構造中のいかなる他のヘリックスとも異なるドメイン組成を有するヘリックスである。従ってユニークダブルヘリックスは、構造中のいかなる他のヘリックスとも異なるヌクレオチド配列もまた有し得る。

【0050】

さらに他の例では、本発明の核酸構造は、ユニークドメインで構成されるある領域と、ユニークでない又は繰り返しドメインで構成される別の領域とを含むように設計され得る。

【0051】

記載される構造は、少なくとも一部には、Ｘ方向に形成される複数のヘリックスと、Ｙ方向に形成される複数のヘリックスと、かかるヘリックスの奥行き（かかるヘリックスの塩基対の数によって指示される）とに基づき定義され得る。そのように形成される（及び参照される）ヘリックスは、別個のオリゴヌクレオチドからハイブリダイズする複数個のドメインで構成されるため、不連続なヘリックスであり得る（即ち、ヘリックスにおいてその長さに沿って二本鎖ニックがあり得る）ことが理解されるべきである。本発明の方法は、直方体、例えば３Ｈ×３Ｈ（×３２ｂ、×６４ｂ、×１２８ｂ、×２５６ｂ、×５１２ｂ、×１０２４ｂ）、４Ｈ×４Ｈ（×３２ｂ、×６４ｂ、×１２８ｂ、×２５６ｂ、×５１２ｂ）、６Ｈ×６Ｈ（×３２ｂ、×６４ｂ、×１２８ｂ、×２５６ｂ）、１２Ｈ×１２Ｈ×４８ｂ、円柱、例えば６Ｈ×１０Ｈ（×３２ｂ、×６４ｂ、×１２８ｂ）、鎖、例えば３０Ｈ×１Ｈ×１２６ｂ、ハニカム格子、例えば６Ｈ×６Ｈ×８４ｂ−ＨＣ、及び六方格子、例えば６Ｈ×７Ｈ×１０８ｂ−ＨＬを含めた、種々のサイズの３Ｄキャンバス（それから様々な任意の形状の核酸構造を形成し得る）の生成に使用されている。

【0052】

構造は、少なくとも一部には、複数個の既知のオリゴヌクレオチドを単一の容器においてアニーリングすることにより形成される。図２Ａは、オリゴヌクレオチドブロックナノ構造を自己集合させるための一段階熱的アニーリングの概略図を示す。この図は、予想される直方体構造の概略図を示す。図２Ｄは、アニーリングプロセス後の精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。高倍率画像は、６Ｈ×１０Ｈ×１２８ＢのそれぞれＸ−Ｙ平面、Ｘ−Ｚ平面及びＹ−Ｚ平面投影に対応する３つの完全なナノ構造像を示す。拡大ＴＥＭ画像の右側にコンピュータ生成投影図が示される。アニーリングプロセス後のゲル電気泳動分析は、最適条件でアニーリングした未精製の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造（レーン１）及び精製した６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ構造（レーン２）を示す。灰色の矢印は６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ産物バンドを指す。特定のサイズの三次元形状を生成するのに用い得る既知のオリゴヌクレオチドプールから出発して、異なる形状及び／又はサイズの構造を形成するため、選択のオリゴヌクレオチドがプールから除外され得る。

【0053】

これらの方法を使用して作成し得る様々な構造を図３Ｅに示す。また、かかる方法によって得られるアニーリング後産物も示す。本発明は、構造の内部にあるオリゴヌクレオチドの除外を企図する。例として、図３Ｂは、内部が空洞のパターン（即ち、任意のオリゴヌクレオチドを欠く予め決められた領域）を有する構造を例示する。

【0054】

従って、場合によってはエンドユーザーは、構造の各位置に存在する特定のオリゴヌクレオチドを知ったうえで、核酸構造、例えば特定の長さ、幅及び奥行き寸法を有する直方体を設計する。実際には、エンドユーザーは、構造内の各オリゴヌクレオチドの正確な位置を示す物理的マップを有する。マップ内の（従って核酸構造内の）位置毎の各オリゴヌクレオチドのアイデンティティが分かっていることにより、エンドユーザーは、出発点として特定の構造を用いて特定のパターン又は形状を操作することが可能になる。かかる操作は、組み合わされて核酸構造を形成するオリゴヌクレオチドの混合物から１つ以上の既知のオリゴヌクレオチドを除外することにより、及び／又は追加的な既知のオリゴヌクレオチドを取り入れることにより行うことができる。

【0055】

従って、例として及び本明細書において実証されるとおり、エンドユーザーは、特定の長さ（Ｙ軸）、幅（Ｘ軸）及び奥行き（Ｚ軸）を有し、且つ複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される三次元立方体を設計し得る。エンドユーザーは、格子の各位置におけるオリゴヌクレオチドのアイデンティティを知っている。立方体それ自体を合成できることに加え、エンドユーザーは、その立方体を出発点として使用して１つ以上の他の核酸構造を設計し、合成することもできる。本明細書において実証されるとおり、立方体全体を作り上げるために用いられるであろうプールから１個及び通常はそれ以上のオリゴヌクレオチドを除外することにより、様々な形状の核酸構造が合成され得る。これらの形状には、限定なしに、図３Ｅに示される形状の任意のものが含まれる。

【0056】

従って本発明は、数多くの異なる核酸構造を、各構造をデノボで設計する必要なしに合成する方法を提供する。むしろ、立方体などの最初の核酸構造から出発して、単純に、予め選択したオリゴヌクレオチドを除外し、及び／又は予め選択したオリゴヌクレオチドを取り入れるだけで、様々な他の核酸構造を形成し得る。このように、エンドユーザーは一本鎖オリゴヌクレオチドをモジュール式に使用し、所望の核酸構造の最終的な形状及びサイズに応じて複数個のうちのメンバーを取り入れ又は除外する。複数個のオリゴヌクレオチドメンバー間の相互作用は、認め得るほどの変化を及ぼさないものと考えられ、従ってエンドユーザーが新しい核酸構造毎に本質的にゼロから設計する必要はない。代わりに、エンドユーザーは所望の形状、サイズ及び複雑さの核酸構造を形成するため、各オリゴヌクレオチドのストックを調製し、様々なストックを、構造におけるその相対頻度に対応する相対濃度で、且つ単一の容器において互いに組み合わせる。

【0057】

所望の形状及びサイズの核酸構造における一本鎖オリゴヌクレオチドの選択及び配置は、手動で、又はコンピュータアルゴリズムにより行うことができる。かかるコンピュータアルゴリズムの例はUniquimerであり、これは一般に公開されていて利用可能である。

【0058】

本明細書の図の一部に示されるとおり、本発明の核酸構造のサイズはアニーリングプロセスの間に制御し得る。このサイズ制御は、１つ以上のユニークドメイン、又は１つ以上のユニークヘリックスを有する構造を設計し、従ってアニーリングプロセスにおいて選択のオリゴヌクレオチド集合を使用することにより達成される。従って核酸構造のサイズもまた、典型的には予め決められている。

【0059】

核酸構造のサイズは、その寸法の１つ、２つ又は３つの距離によって表され得る。かかる寸法は、各々独立して、ナノメートル又はマイクロメートル長さ、又はそれ以上であり得る。例として、構造は、５〜１００ナノメートル、５〜５００ナノメートル、５〜１０００ナノメートル、例えば１０〜１００ナノメートル、１０〜５００ナノメートル、又は１０〜１０００ナノメートルの範囲の長さ、幅及び／又は奥行きを各々有する１つ、２つ又は３つの寸法を含み得る。一部の実施形態では、構造は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｍ又はそれ以上の１つ以上の寸法を有し得る。

【0060】

核酸構造のサイズはまた、ダブルヘリックスの数並びにそれらのダブルヘリックスの長さによっても提示され得る。ダブルヘリックスの長さは、ヘリックス中のヘリックスターンの数として表され得る。本発明は、ナノメートル及びマイクロメートルスケール、及びそれ以上の構造の作成を企図することが理解されるべきである。

【0061】

一部の実施形態では、核酸構造は、２、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、１２０、１６０、２００、２４０、２８０、３２０、又は３６０個のヘリックスを含み得る。例えば、核酸構造は、６ヘリックス（Ｈ）×６Ｈ×６４塩基対（ｂｐ）構造（即ち、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ）として提示され得る。構造の他の例には、限定なしに、３Ｈ×３Ｈ×６４Ｂ構造、３Ｈ×３Ｈ×１２８Ｂ構造、３Ｈ×３Ｈ×２５６Ｂ構造、３Ｈ×３Ｈ×５１２Ｂ構造、３Ｈ×３Ｈ×１０２４Ｂ構造、４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ構造、４Ｈ×４Ｈ×１２８Ｂ構造、４Ｈ×４Ｈ×２５６Ｂ構造、４Ｈ×４Ｈ×５１２Ｂ構造、４Ｈ×４Ｈ×１０２４Ｂ構造、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ構造、６Ｈ×６Ｈ×１２８Ｂ構造、６Ｈ×６Ｈ×２５６Ｂ構造、６Ｈ×６Ｈ×５１２Ｂ構造、６Ｈ×６Ｈ×１０２４Ｂ構造、８Ｈ×８Ｈ×６４Ｂ構造、８Ｈ×８Ｈ×１２８Ｂ構造、８Ｈ×８Ｈ×２５６Ｂ構造、８Ｈ×８Ｈ×５１２Ｂ構造、８Ｈ×８Ｈ×１０２４Ｂ構造、１２Ｈ×１２Ｈ×６４Ｂ構造、１２Ｈ×１２Ｈ×１２８Ｂ構造、１２Ｈ×１２Ｈ×２５６Ｂ構造、１２Ｈ×１２Ｈ×５１２Ｂ構造、又は１２Ｈ×１２Ｈ×１０２４Ｂ構造が含まれる。さらなる例には、限定なしに、６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ、４Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ、８Ｈ×１２Ｈ×３２Ｂ、８Ｈ×１２Ｈ×６４Ｂ、８Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ、４Ｈ×２４Ｈ×１２０Ｂ、３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂ、６Ｈ×７Ｈ×１０８Ｂの構造が含まれる。

【0062】

本発明の核酸構造は任意の形状又は形態をとり得る。本発明の方法を使用して作り出され得る様々な形状及び形態の例を、図３Ａ〜図３Ｅ、図２１Ａ〜図２１Ｃ、図２２Ａ〜図２２Ｅ及び図２３Ａ〜図２３Ｄに示す。重要なことに、本発明の方法を使用すると、核酸構造の形状、形態及びサイズを、構造における全ての位置のオリゴヌクレオチドのアイデンティティ（従って配列）の情報に基づき厳密に制御して予め決めるとともに、従って予め設計することが可能になる。

【0063】

本明細書において考察されるとおり、核酸構造は、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを単一のアニーリング反応で組み合わせてアニーリングし、所望の形状、サイズ、複雑さ及び修飾の核酸構造を生じさせることにより合成し得る。本発明はまた、別個の小さい核酸構造を互いにアニーリングすることによるモジュール方式の核酸構造の合成も企図する。

【0064】

一部の実施形態では、核酸及び／又は構造は、それらを高温に供し、次に徐冷プロセスに供することによりアニーリングされる。高温は、約５０℃、約４５℃、又は約４０℃であってもよく、冷却プロセスは、溶液を略室温（例えば約２５℃）に冷却することを意図する。冷却時間は数分間、数時間、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０時間、又はそれ以上、例えば２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６又は１６８時間であってもよい。

【0065】

一部の実施形態では、核酸構造は結晶様の構造（本明細書では「結晶」と称される）である。結晶は、個別の三次元ＤＮＡブリック構造間に「連結」ブリックを使用することにより組み立てられ得る。一部の実施形態では、結晶の組立て（「成長」とも称される）は非階層的であってもよく、一方、他の実施形態では、結晶の組立ては階層的であってもよい。本明細書におけるＤＮＡブリック結晶の非階層的成長とは、初めに繰り返し機能単位を形成しない、個々のＤＮＡブリックからの結晶の組立てを指す。従って、結晶が成長するに伴い個々のＤＮＡブリックが結晶に個々に組み込まれる。かかる実施形態では、ＤＮＡブリック結晶は、連結ブリックがサイズ及び機能の点で他のブリックと同じである繰り返し単位に基づき設計され得る。対照的に、本明細書におけるＤＮＡブリック結晶の階層的成長とは、「予め形成された」繰り返し機能単位（例えば、ＤＮＡブリックから予め形成されたより大きい構造）からの結晶の組立てを指す。一部の実施形態では、個別のＤＮＡブリック設計の表面上にあるＤＮＡブリックが、個々の構造を連結し、且つＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿った結晶の成長を個々に伸ばして一次元成長結晶を生じるように修飾され得る。一部の実施形態では、個別のＤＮＡブリック設計の表面上にあるＤＮＡブリックが、個々の構造を連結し、且つＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿った結晶の成長を組み合わせで伸ばして二次元成長結晶又は三次元成長結晶を生じるように修飾され得る。

【0066】

Ｚ軸に沿った多量体化を達成するため、第１のドメイン層の配列が、一部の実施形態では最後のドメイン層の配列と相補的であるように修飾されてもよい。Ｘ軸又はＹ軸に沿った多量体化は、Ｘ軸又はＹ軸に沿った境界上のブリックを新しい３２ｎｔブリックに置換することにより達成され得る。これらの新しい３２ｎｔブリックの各々は、直方体のある側面と相補的な２つのドメインと、直方体の反対側の側面と相補的な別の２つのドメインとを含み得る。従って、これらの３２ｎｔブリックは、直方体単量体を連結して継続的成長を達成し得る。

【0067】

本明細書で使用されるとき、「Ｚ結晶」は、Ｚ軸に沿って延在する一次元結晶を指す。同様に、「Ｘ結晶」又は「Ｙ結晶」は、それぞれＸ軸又はＹ軸に沿って延在する一次元結晶を指す。「ＺＸ結晶」は、Ｚ軸及びＸ軸に沿って延在する二次元結晶を指す。「ＸＹ結晶」は、Ｘ軸及びＹ軸に沿って延在する二次元結晶を指す。図２０Ｆは、三次元空間における複雑なＤＮＡ結晶を示す。異なる設計の繰り返し単位を使用して、規定の寸法及びパターンのＤＮＡブリック結晶を作成することができる。従って、結晶設計は、「［成長方向］−［繰り返し単位のサイズ］−［その形状の基本的特徴］」のように命名される。例えば、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶は、４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ直方体の繰り返し単位に基づき設計される二次元結晶（ＸＹ結晶）である。個別のＤＮＡブリック構造と同様に、ＤＮＡブリック結晶の配列は、本明細書に提供される教示に従い、ランダムに生成され得る。

【0068】

結晶は、ＤＮＡブリック（精製した又は未精製の）をほぼ等しい比率（例えば、各鎖につき１００ｎｍ）で緩衝液（例えば、ＴＥ／ＭｇＣｌ_２）中に組み合わせ、次に一段階熱的アニーリングを７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８時間、又はそれ以上実施することにより組み立てられ得る。

【0069】

他の実施形態では、本発明は、全ての構造の同時的な混合及びアニーリングと比較したときの、構造の時差的又は逐次的添加（及びアニーリング）を企図する。逐次的添加は、より複雑性の高い構造の合成に特に有用であり得る。場合によっては、これらの及び他のアニーリング方法を静的環境で又はフロー下で行うことができる。フロー環境では、後続の成分の添加前に、アニーリングされていないオリゴヌクレオチド又は核酸構造を取り除くことが可能である。

【0070】

本発明はまた、核酸構造の複数個も提供する。本明細書で使用されるとき、用語の複数個は２つ以上を意味し、用語の集合と同義的に使用され得る。かかる複数個には、１０、５０、１００、５００、１０００個又はそれ以上の構造が含まれ得る。かかる複数個は様々な程度の均一性を有してもよく、これは、サイズ、形状、複雑さ及び／又は修飾に関して複数個中における核酸構造の割合が互いに同じであることを意味する。従って複数個の構造は、ある種の特徴を有する構造において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％均一であり得る。例として、複数個の直方体形状構造は少なくとも５０％均一であってよく、これは、当該の複数個におけるその構造の少なくとも５０％が直方体形状であることを意味する。

【0071】

かかる複数個は単分散であってもよく、これは、それらのメンバーが、サイズ、形状、複雑さ及び／又は修飾を含む１つ以上の特徴の点で同じであってもよいことを意味する。複数個は、これらの特徴の全てについて単分散であってもよい。

【0072】

複数個における均一性（及び逆に不均一性）の程度は、限定はされないが、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）又は透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、及びゲル電気泳動を含むいくつかの技法を用いて決定され得る。これらの技法は、実施例で考察するとおり、調製された構造集合における均一性の程度の決定に用いられている。重要なことに、本明細書に提供されるアニーリング方法は、優勢な核酸構造種を有する集合を、再現性をもって生じることが分かっている。さらに、当該の優勢種は、本発明の設計及びマッピング手法を用いて意図された種と同じであるものと思われる。

【0073】

複数の図に示されるとおり、場合によっては、核酸構造が形成された後にもなお、一本鎖のドメインがあり得る。これは、例えば境界に存在し得る。かかる境界は、図に提供される構造の左右の境界によって表される。本発明では、かかるドメインの性質がアニーリングプロセスの効率及び収率に影響を及ぼし得ることが見出されている。より具体的には、これらの一本鎖領域が混合ヌクレオチド配列である場合、構造が凝集し易くなり、収率が低下する。かかる凝集は、こうした一本鎖領域のヌクレオチド配列を操作することにより低減できる。具体的には、配列中のポリＴである一本鎖領域は凝集を起こし難く、構造の収率が良くなる。ポリＡ及びポリＣ配列もまた用いられ得る。従って、一部の実施形態では、構造に特定の一本鎖ドメインが存在し得るとともに、かかるドメインは配列が互いに同じであり得る。

【0074】

特定の実施形態において、境界領域は、ポリＴドメインと混合配列の他のドメインとの混合物で構成されてもよく、但し、その構造が実質的に凝集しないものとする。このような例では、混合配列ドメインを使用して２つ以上の構造を互いにアニーリングすることができる。かかるドメインの数は、６、８、１０個又はそれ以上であり得る。

【0075】

本発明の構造は、合成中又は合成後に修飾され得る。構造は、合成中に、修飾されたオリゴヌクレオチドを使用して修飾されてもよい。例えば、構造の生成に使用される１つ以上のオリゴヌクレオチドを目的の部分とコンジュゲートしてもよい。修飾オリゴヌクレオチドは、本発明の構造を生成するために使用することができ、但し、オリゴヌクレオチドが所望の構造を形成するために必要とされるとおりの他のオリゴヌクレオチドと結合する能力が、かかる修飾によって妨げられないものとする。それに加えて又は代えて、構造は合成後に修飾されてもよい。

【0076】

任意の修飾が企図され、但し、その修飾によって別段意図される場合を除き、それがオリゴヌクレオチドの互いのアニーリングを妨げず、且つそれが構造の安定性を低下させないものとする。修飾は、限定はされないが、本質的に化学的又は酵素的であってよい。修飾には、核酸コンジュゲート部分の使用が関わり得る。この部分は、限定なしに、本質的に金属性、有機的及び無機的であってよい。この部分は、構造中のオリゴヌクレオチドを認識して結合することが可能な核酸とコンジュゲートされ得る。かかる核酸は、例として、三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドであってもよい。他の場合には、１つ以上の非核酸部分が構造に永久に又は一過性に、共有結合的に又は非共有結合的に、結合され得る。本発明は、ユニーク及び／又は非ユニークオリゴヌクレオチドが修飾され得ることを企図する。構造中のオリゴヌクレオチドは、それ自体が、構造に寄与しない、むしろ部分と構造の結合に使用される１つ以上のドメインとコンジュゲートされ得る。構造中の各オリゴヌクレオチド及び各ドメインの位置を予め決定し得るため、最終的に得られる構造に対する各修飾の位置もまた予め決定し得ることが理解されるべきである。換言すれば、構造における各オリゴヌクレオチドの位置情報が、構造のアドレサビリティを促進する。

【0077】

加えて、本明細書は、２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号と共に提出された付属書類を全体としてさらに援用し、これは本発明の一部のナノ構造の作製に使用される様々なオリゴヌクレオチド配列を提供する。本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ｓ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１〜７８、１５７〜２２５及び２９５〜３３６で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３Ａに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１も参照のこと）。

【0078】

【表1】

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【0079】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号７９〜１５６及び２２６〜２９４で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１も参照のこと）。

【0080】

【表2】

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【0081】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ−Ｍ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号３３７〜５９０で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表４に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表２も参照のこと）。

【0082】

【表3】

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【0083】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるランダムオリゴヌクレオチド配列は配列番号５９１〜７３７で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表５Ａに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表３も参照のこと）。

【0084】

【表4】

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【0085】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される設計されたオリゴヌクレオチド配列は配列番号７３８〜８８４で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表５Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表３も参照のこと）。

【0086】

【表5】

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【0087】

本発明の４Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ核酸構造の作製に使用される一組のオリゴヌクレオチド配列は配列番号８８５〜１２２０で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表６Ａに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表４も参照のこと）。

【0088】

【表6】

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【0089】

本発明の４Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ核酸構造の作製に使用される別の一組のオリゴヌクレオチド配列は配列番号１２２１〜１５５６で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表６Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表４も参照のこと）。

【0090】

【表7】

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【0091】

本発明の４Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ核酸構造の作製に使用されるさらに別の一組のオリゴヌクレオチド配列は配列番号１５５７〜１８９２で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表６Ｃに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表４も参照のこと）。

【0092】

【表8】

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【0093】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１８９３〜２３５１で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表７に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表５も参照のこと）。

【0094】

【表9】

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【0095】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号２３５２〜２８１０で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表８に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表６も参照のこと）。

【0096】

【表10】

[この文献は図面を表示できません]

【0097】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜２８２２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表９Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３１９５〜３２０３で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表９Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0098】

【表11】

[この文献は図面を表示できません]

【0099】

【表12】

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【0100】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜２８３４で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１０Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３２０３〜３２１２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１０Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0101】

【表13】

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【0102】

【表14】

[この文献は図面を表示できません]

【0103】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜２８５８で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１１Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３２１３〜３２２１で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１１Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0104】

【表15】

[この文献は図面を表示できません]

【0105】

【表16】

[この文献は図面を表示できません]

【0106】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜２９０６で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１２Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３２２２〜３２３０で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１２Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0107】

【表17】

[この文献は図面を表示できません]

【0108】

【表18】

[この文献は図面を表示できません]

【0109】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×５１２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜３００２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１３Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×５１２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３２３１〜３２３９で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１３Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0110】

【表19】

[この文献は図面を表示できません]

【0111】

【表20】

[この文献は図面を表示できません]

【0112】

本発明の３Ｈ×３Ｈ×１０２４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号２８１１〜３１９４で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１４Ａに示す。本発明の３Ｈ×３Ｈ×１０２４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４０〜３２４８で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１４Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表７も参照のこと）。

【0113】

【表21】

[この文献は図面を表示できません]

【0114】

【表22】

[この文献は図面を表示できません]

【0115】

【表23】

[この文献は図面を表示できません]

【0116】

【表24】

[この文献は図面を表示できません]

【0117】

本発明の４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４９〜３２７２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１５Ａに示す。本発明の４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３６３３〜３６４６で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１５Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表８も参照のこと）。

【0118】

【表25】

[この文献は図面を表示できません]

【0119】

【表26】

[この文献は図面を表示できません]

【0120】

本発明の４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４９〜３２９６で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１６Ａに示す。本発明の４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３６４７〜３６６０で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１６Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表８も参照のこと）。

【0121】

【表27】

[この文献は図面を表示できません]

【0122】

【表28】

[この文献は図面を表示できません]

【0123】

本発明の４Ｈ×４Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４９〜３３４４で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１７Ａに示す。本発明の４Ｈ×４Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３６６１〜３６７４で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１７Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表８も参照のこと）。

【0124】

【表29】

[この文献は図面を表示できません]

【0125】

【表30】

[この文献は図面を表示できません]

【0126】

本発明の４Ｈ×４Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４９〜３４４０で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１８Ａに示す。本発明の４Ｈ×４Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３６７５〜３６８８で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１８Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表８も参照のこと）。

【0127】

【表31】

[この文献は図面を表示できません]

【0128】

【表32】

[この文献は図面を表示できません]

【0129】

本発明の４Ｈ×４Ｈ×５１２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３２４９〜３６３２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１９Ａに示す。本発明の４Ｈ×４Ｈ×５１２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号３６８９〜３７０２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表１９Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表８も参照のこと）。

【0130】

【表33】

[この文献は図面を表示できません]

【0131】

【表34】

[この文献は図面を表示できません]

【0132】

【表35】

[この文献は図面を表示できません]

【0133】

【表36】

[この文献は図面を表示できません]

【0134】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３７０３〜３７６２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２０Ａに示す。本発明の６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４１８３〜４２０９で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２０Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表９も参照のこと）。

【0135】

【表37】

[この文献は図面を表示できません]

【0136】

【表38】

[この文献は図面を表示できません]

【0137】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３７０３〜３８２２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２１Ａに示す。本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４２１０〜４２３６で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２１Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表９も参照のこと）。

【0138】

【表39】

[この文献は図面を表示できません]

【0139】

【表40】

[この文献は図面を表示できません]

【0140】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３７０３〜３９４２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２２Ａに示す。本発明の６Ｈ×６Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４２３７〜４２６３で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２２Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表９も参照のこと）。

【0141】

【表41】

[この文献は図面を表示できません]

【0142】

【表42】

[この文献は図面を表示できません]

【0143】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号３７０３〜４１８２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２３Ａに示す。本発明の６Ｈ×６Ｈ×２５６Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４２６４〜４２９０で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２３Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表９も参照のこと）。

【0144】

【表43】

[この文献は図面を表示できません]

【0145】

【表44】

[この文献は図面を表示できません]

【0146】

【表45】

[この文献は図面を表示できません]

【0147】

【表46】

[この文献は図面を表示できません]

【0148】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４２９１〜４３９４で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２４Ａに示す。本発明の６Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４７０７〜４７４９で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２４Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１０も参照のこと）。

【0149】

【表47】

[この文献は図面を表示できません]

【0150】

【表48】

[この文献は図面を表示できません]

【0151】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４２９１〜４４９８で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２５Ａに示す。本発明の６Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４７５０〜４７９２で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２５Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１０も参照のこと）。

【0152】

【表49】

[この文献は図面を表示できません]

【0153】

【表50】

[この文献は図面を表示できません]

【0154】

本発明の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４２９１〜４７０６で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２６Ａに示す。本発明の６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号４７９３〜４８３５で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２６Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１０も参照のこと）。

【0155】

【表51】

[この文献は図面を表示できません]

【0156】

【表52】

[この文献は図面を表示できません]

【0157】

本発明の８Ｈ×１２Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４８３６〜５００７で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２７Ａに示す。本発明の８Ｈ×１２Ｈ×３２Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号５４８２〜５５４５で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２７Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１１も参照のこと）。

【0158】

【表53】

[この文献は図面を表示できません]

【0159】

【表54】

[この文献は図面を表示できません]

【0160】

本発明の８Ｈ×１２Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４８３６〜５１７９で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２８Ａに示す。本発明の８Ｈ×１２Ｈ×６４Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号５５４６〜５６０９で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２８Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１１も参照のこと）。

【0161】

【表55】

[この文献は図面を表示できません]

【0162】

【表56】

[この文献は図面を表示できません]

【0163】

【表57】

[この文献は図面を表示できません]

【0164】

本発明の８Ｈ×１２Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用されるコアオリゴヌクレオチド配列は配列番号４８３６〜５４８１で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２９Ａに示す。本発明の８Ｈ×１２Ｈ×１２８Ｂ核酸構造の作製に使用される末端オリゴヌクレオチド配列は配列番号５６１０〜５６７１で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表２９Ｂに示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１１も参照のこと）。

【0165】

【表58】

[この文献は図面を表示できません]

【0166】

【表59】

[この文献は図面を表示できません]

【0167】

【表60】

[この文献は図面を表示できません]

【0168】

【表61】

[この文献は図面を表示できません]

【0169】

本発明の４Ｈ×２４Ｈ×１２０Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号５６７２〜６３５５で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３０に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１２も参照のこと）。

【0170】

【表62】

[この文献は図面を表示できません]

【0171】

本発明の１２Ｈ×１２Ｈ×４８Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号６３５６〜６８４１で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３１に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１３も参照のこと）。

【0172】

【表63】

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【0173】

１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバスからの図３Ｅの形状の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号６８４２〜１１２９６（それぞれ鎖０〜４４５４）で示され、対応するボクセル座標をそれぞれ表３２に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１４も参照のこと）。

【0174】

【表64】

[この文献は図面を表示できません]

【0175】

【表65】

[この文献は図面を表示できません]

【0176】

【表66】

[この文献は図面を表示できません]

【0177】

【表67】

[この文献は図面を表示できません]

【0178】

【表68】

[この文献は図面を表示できません]

【0179】

【表69】

[この文献は図面を表示できません]

【0180】

【表70】

[この文献は図面を表示できません]

【0181】

【表71】

[この文献は図面を表示できません]

【0182】

【表72】

[この文献は図面を表示できません]

【0183】

【表73】

[この文献は図面を表示できません]

【0184】

【表74】

[この文献は図面を表示できません]

【0185】

【表75】

[この文献は図面を表示できません]

【0186】

【表76】

[この文献は図面を表示できません]

【0187】

【表77】

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【0188】

本発明の３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１１２９７〜１１５０２で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３３に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１６も参照のこと）。

【0189】

【表78】

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【0190】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×８４Ｂ−ＨＣ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１１５０３〜１１６６７で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３４に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１７も参照のこと）。

【0191】

【表79】

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【0192】

本発明の６Ｈ×７Ｈ×１０８Ｂ−ＨＬ核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１１６６８〜１１９３５で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３５に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１８も参照のこと）。

【0193】

【表80】

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【0194】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ（バージョン１）核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１１９３６〜１２０４１で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３６に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表１９も参照のこと）。

【0195】

【表81】

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【0196】

本発明の６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ（バージョン２）核酸構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチド配列は配列番号１２０４２〜１２２０３で示され、対応する５’末端の座標をそれぞれ表３７に示す（参照によって本明細書に援用される２０１２年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６７５，３０９号の付属書類、表２０も参照のこと）。

【0197】

【表82】

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【0198】

一本鎖オリゴヌクレオチド
本発明の核酸構造は、配列特異的な形で互いにアニーリングする複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して設計及び作成される。オリゴヌクレオチドは、その長さ、その配列、及びそのドメイン組成によって特徴付けられ得る。そのドメインの数及び配列が、各オリゴヌクレオチドの結合活性及び位置を左右する。そのドメイン数が、典型的には、構造において各オリゴヌクレオチドが結合するオリゴヌクレオチドの数を左右する。

【0199】

場合によっては、構造の作成に使用されるオリゴヌクレオチドは偶数個のドメインを含む。各オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２つのドメインを含む。一部の実施形態では、構造の作成に使用されるオリゴヌクレオチドは２ドメイン及び４ドメインオリゴヌクレオチドであってもよい。また、限定なしに２ドメイン及び６ドメインオリゴヌクレオチド、３ドメイン及び６ドメインオリゴヌクレオチド、２ドメイン及び８ドメインオリゴヌクレオチド、４ドメイン及び８ドメインオリゴヌクレオチドなどを含め、他の組み合わせのオリゴヌクレオチドを使用して構造を形成することも可能である。

【0200】

ドメインは、本明細書で使用されるとき、ヌクレオチド配列（即ち、その相補体に配列特異的な形で結合する能力を有する複数の隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体）を指す。複数個のオリゴヌクレオチド又は核酸構造におけるドメインは、別のオリゴヌクレオチドのドメインにアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチドの全てのドメインの集合的な相補性が、かかるオリゴヌクレオチドの自己集合による核酸構造の形成を促進する。

【0201】

ドメイン長さは様々であり得る。同じオリゴヌクレオチドからの２つの隣接するドメインが同じヘリックスに寄与する状況では、２つのドメインの長さは相互に関連し得る。例として、あるドメインが長さｘを有し、且つ他のドメインが長さｙを有し、但しｘ＋ｙは約１６である（但し、ｘ及びｙの各々は１以上であるものとする）。

【0202】

一部の実施形態では、同じヘリックスに寄与する同じオリゴヌクレオチドからの２つの隣接するドメインが約１６±２ヌクレオチドの長さの合計長さを有し得る。従って、単一のドメインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７ヌクレオチドの長さを有し得る。２つの隣接するドメインは、例えば、１４、１５、１６、１７又は１８ヌクレオチドの総合計長さを有し得る。２ドメインオリゴヌクレオチドは、例えば１６±２ヌクレオチドの長さを有し得る。４ドメインオリゴヌクレオチドは、例えば３２±４ヌクレオチドの長さを有し得る。

【0203】

一部の重要な実施形態では、ドメインが８ヌクレオチドの長さを有し、２つの隣接するドメインが１６ヌクレオチドの長さを有し、及び４ドメインオリゴヌクレオチドが３２ヌクレオチドの長さを有する。本発明は、１６ヌクレオチドの倍数である長さを有する２つの隣接するドメイン（両方が単一のヘリックスに寄与する）を有するオリゴヌクレオチドを企図することが理解されるべきである。

【0204】

典型的には所与の合成方法又は得られる構造において、同じ数のドメインを有するオリゴヌクレオチドは長さも同じであり得る。例として、一実施形態において、全ての４ドメインオリゴヌクレオチドが同じ長さであり、全ての２ドメインオリゴヌクレオチドが同じ長さ（しかしながらこの長さは、４ドメインオリゴヌクレオチドの長さとは異なり得る）であり得る。より具体的には、一部の実施形態は、ある長さ（例えば、ｎヌクレオチド）の４ドメインオリゴヌクレオチドと、その長さの半分（例えば、ｎ／２ヌクレオチド）である２ドメインオリゴヌクレオチドとを使用する。

【0205】

本発明は、任意の数の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む核酸構造を企図する。例として、核酸構造は、限定なしに、４個程の少なさの及び１０００個（又はそれ以上）もの多さのオリゴヌクレオチドを含み得る。同様に、核酸構造の生成に使用される複数個のオリゴヌクレオチドは、限定なしに、４種類程の少なさの異なるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド配列により定義されるとき）及び１０００種（又はそれ以上）もの多さの異なるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド配列により定義されるとき）を含み得る。従って、実施形態に応じて、核酸構造は、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個、又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。同様に、実施形態に応じて、核酸構造の生成に使用される複数個のオリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００種、又はそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0206】

様々なオリゴヌクレオチド配列が本明細書によって添付の援用される付属書類に提供される。付属書類は、本明細書に記載されるとおりの、様々な形状及びサイズの３Ｄキャンバスを形成するために必要なオリゴヌクレオチドを示す。

【0207】

本発明の文脈においてオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤ型ＤＮＡ及びＬ型ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにその様々な修飾を含む。修飾は塩基修飾、糖修飾、及び骨格修飾を含む。これらの非限定的な例を以下に提供する。

【0208】

本発明において用いられ得るＤＮＡ変種の非限定的な例は、Ｌ−ＤＮＡ（文献で公知の、ＤＮＡの骨格鏡像異性体）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビスＰＮＡクランプ、擬相補的ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又は上記の共核酸、例えばＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸である。本発明の産物及び方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、本質的に均一であっても又は不均一であってもよいことが理解されるべきである。例として、それらは本質的に完全にＤＮＡであってもよく、又はＤＮＡ及び非ＤＮＡ（例えばＬＮＡ）単量体又は配列で構成されてもよい。従って、核酸エレメントの任意の組み合わせが用いられ得る。オリゴヌクレオチド修飾によりオリゴヌクレオチドは一定の条件下でより安定化し、及び／又は分解を受け難くなり得る。例えば、場合によっては、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性である。

【0209】

オリゴヌクレオチドは、均一な骨格（例えば、全てがリン酸ジエステル又は全てがホスホロチオエート）又は不均一な（又はキメラの）骨格を有し得る。ホスホロチオエート骨格修飾により、オリゴヌクレオチドは一定の条件下で（天然のリン酸ジエステル骨格核酸と比較したとき）ヌクレアーゼの影響を受け難くなり、従ってより安定する。オリゴヌクレオチドにより高い安定性を提供し得る他の結合には、限定なしに、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホロチオエート結合、ボラノホスホネート結合、ペプチド結合、アルキル結合、デホスホ型結合などが含まれる。従って、場合によっては、オリゴヌクレオチドは天然に存在しない骨格を有する。

【0210】

オリゴヌクレオチドはインビトロで合成され得る。核酸の合成方法もまた、自動核酸合成を含め、当該技術分野において公知である。ホスホロチオエート結合を含む骨格など、及びキメラ修飾骨格を含むものを含め、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデート又はＨ−ホスホン酸ケミストリーのいずれかを用いる自動化技術を使用して合成され得る（F. E. Eckstein, “Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach” IRL Press, Oxford, UK, 1991、及びM. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)）。例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるとおり、アリール−及びアルキル−ホスホン酸結合を作ることができ；及び例えば米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２，５７４号に記載されるとおり、アルキルホスホトリエステル結合（ここでは荷電酸素部分がアルキル化される）を、市販の試薬を使用して自動固相合成により調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾及び置換を作る方法が記載されている。Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544；Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165；Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129；及びHunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417。

【0211】

それに加えて又は代えて、オリゴヌクレオチドはその糖に修飾を含み得る。例えば、β−リボース単位又はβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位を修飾糖単位に置き換えることができ、ここで修飾糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、アラビノース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルリボースから選択され、好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルリボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ_２〜Ｃ_６）アルケニルリボース、２’−［Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ_２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロヘキソピラノース、及び炭素環式（例えば、Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320に記載される）及び／又は開鎖糖類似体（例えば、Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223に記載される）及び／又はビシクロ糖類似体（例えば、Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481に記載される）である。

【0212】

オリゴヌクレオチドは、その塩基に修飾を含み得る。修飾塩基としては、修飾シトシン（５−置換シトシン（例えば、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ジフルオロメチルシトシン、及び非置換又は置換５−アルキニルシトシンなど）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−アザシトシン、２−メルカプトシトシン、イソシトシン、擬イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシン又はフェノキサジン）、並びにウラシル及びその誘導体（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ブロモビニルウラシル、４−チオウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−プロピニルウラシル）、修飾グアニン、例えば、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニンなど）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えばＮ２−メチルグアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えばＮ６−メチルアデニン、８−オキソアデニン）、８−置換グアニン（例えば８−ヒドロキシグアニン及び８−ブロモグアニン）、及び６−チオグアニンが挙げられる。核酸は、ユニバーサル塩基（例えば３−ニトロピロール、Ｐ−塩基、４−メチルインドール、５−ニトロインドール、及びＫ−塩基）及び／又は芳香環系（例えばフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ベンズイミダゾール又はジクロロベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る特定の塩基対は、Yang et al. NAR, 2006, 34(21):6095-6101によって報告されるｄＺ及びｄＰ非標準核酸塩基対である。ピリミジン類似体であるｄＺは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドンであり、及びプリン類似体であるそのワトソン・クリック相補体ｄＰは、２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−１’−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オンである。

【0213】

合成方法
本発明は、核酸構造をアニーリングプロセスによって合成することを企図する。一つの手法では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特定され、且つ（例えばBioneerなどの市販業者を使用して）合成された後、限定はされないがチューブ、ウェル、バイアルなどの単一の容器に組み合わされる。使用されるオリゴヌクレオチドのモル量は、所望の構造における各オリゴヌクレオチドの頻度及び所望の構造の量に依存し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは等しいモル濃度で存在し得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドが約２００ｎＭの濃度で存在し得る。オリゴヌクレオチドは溶液中に置かれる。好ましくは、溶液は緩衝されるが、アニーリング反応は緩衝剤がなくても起こり得る。溶液は、限定はされないがＭｇ^２＋などの、二価陽イオンをさらに含み得る。陽イオン又は塩濃度は様々であり得る。例示的濃度は約４９０ｍＭである。溶液はまた、オリゴヌクレオチドの分解を防ぐため、ＥＤＴＡ又は他のヌクレアーゼ阻害薬も含み得る。

【0214】

アニーリング反応は、溶液を加熱し、次にその溶液をゆっくりと放冷することにより行われる。反応の温度は、ヘアピン構造などの任意の望ましくない二次構造を融解し、且つオリゴヌクレオチド種が他の非相補的なオリゴヌクレオチドと誤って結合しないことを確実にするのに十分な高さでなければならない。従って温度は、一部の実施形態では初めに約１００℃、約９５℃、約９０℃、約８５℃、８０℃、７５℃、７０℃、６５℃又は６０℃に上昇させ得る。温度は、容器を湯浴中又は加熱ブロックに置くか、又はＰＣＲ機械などの温度制御が可能なデバイスに置くことにより上昇させ得る。容器はその環境に数秒間又は数分間保たれ得る。典型的には、約１〜１０分間のインキュベーションで十分である。

【0215】

高温でのインキュベーションが完了した後、いくつかの方法で温度を降下させ得る。温度は、温度を特定の大きさだけ降下させて、特定の時間にわたりその温度を維持した後に再び温度を降下させるコンピュータアルゴリズムを使用する自動化された方法で降下させ得る。かかる自動化された方法は、温度をステップ毎に１度ずつ又はステップ毎に数度ずつ降下させることを含み得る。従って容器は同じデバイスで加熱及び冷却が行われ得る。

【0216】

例示的プロセスを提供する。約８０℃から約２４℃への温度降下を生じさせるためには、温度を１度ずつ増加させて１度につき３分の速度で（即ち、８０℃で３分間、７９℃で３分間等）８０℃から６１℃に変化させる。次に温度を１度ずつ増加させて且つ１度につき約１２０分の速度で（即ち、６０℃で１２０分間、５９℃で２１０分間等）６０℃から２４℃に変化させる。このプロセスの総アニーリング時間は約１７時間である。本発明において、これらの条件下で、オリゴヌクレオチドは予め決められた所望の形状及びサイズの核酸構造に自己集合する。

【0217】

具体的なアニーリングプロセスの例は、５ｍＭ トリス−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液中の１００個の２００ｎＭオリゴヌクレオチドを用い、及びこの溶液を約９０℃に加熱し、次に溶液を約２４℃まで、上記に記載したとおり８０℃〜６１℃の間は１度の降下につき３分及び６０℃〜２４℃の間は１度の降下につき１２０分で約７３時間にわたり冷却する。

【0218】

複合構造
本発明は、本明細書に記載される核酸構造それ自体を、高次構造又は複合構造の形成のため本質的に単量体又は構成単位として使用し得ることをさらに企図する。本発明の複合構造は、スペーサー−リンカーを使用して互いにつなぎ合わされた核酸構造で構成される。リンカーは、典型的には核酸構造の一体部分ではないが、それらは好適な官能基を介して構造に結合し得る。２個以上の核酸構造を一体に結合するこの能力により、より大きいサイズ及び高い複雑さの構造を作成することが可能となる。

【0219】

これらの複合構造の寸法は、限定なしに、５００ｎｍ〜１００ミクロン、又は１〜１０００ミクロンの範囲であり得る。

【0220】

応用
本発明の核酸構造は、ナノメートル又はミクロンスケールで１つ以上の部分を正確に位置決めし、且つ重要なことには配置する能力によって利益を受け得る適用を含め、様々な適用に用いられ得る。

【0221】

例として、構造を、エレクトロニクス、プラズモニクス、及び量子コンピューティング適用で有用なものなどの、無機材料の配列又はパターンニング用鋳型として使用することができる。核酸構造に結合させ得る部分としては、金属粒子、例えば金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブなどが挙げられる。このようにして、本発明により提供される核酸構造が、ナノメートル精度及び制御でその上に他の部分を配列し得る及び／又は他の構造を合成し得る足場として働く。例えば、カーボンナノチューブを機能分子エレクトロニクスシステムに組織化することができ；調節可能な幾何学的配列の金ナノ粒子を使用して、機能分子エレクトロニクス回路及び新規プラズモニクス回路を作製することができ；組織化された、予め決められた配列の磁性粒子を使用して、ナノインダクタ又は記憶デバイスを作製することができ；及び組織化された、予め決められた配列の量子ドットを使用して、新規量子コンピュータを作製することができる。

【0222】

一部の実施形態では、部分（例えば金ナノ粒子）は、例えば実施例５に記載するとおり、部分及び核酸構造に連結した相補一本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基対合によって本発明の核酸構造に結合させてもよい。従って、一部の実施形態では、金ナノ粒子などの部分は、以下のとおり個別のパターンで配列され得る。特定の位置（例えば、ポア及び／又はチャネルの内部）に一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ポリＡオリゴヌクレオチド、又は隣接アデニンヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチド）を含む本発明の核酸構造を、その核酸構造の一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ポリＴオリゴヌクレオチド、又は隣接チミジンヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチド）に連結した（例えば、それと共有結合的に、又は非共有結合的に結合した）部分と接触させる。一部の実施形態では、一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチドは約２〜約１５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、一本鎖ポリＮオリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチドの一本鎖ポリＡ、一本鎖ポリＴオリゴヌクレオチド、一本鎖ポリＧオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ポリＣオリゴヌクレオチドである。

【0223】

他の態様において、本発明は、本発明の核酸構造を金属化してエレクトロニクス構成部品を作製し得ることを企図する。ＤＮＡチューブがナノワイヤに金属化されている。本発明の核酸構造の制御された金属化を用いて、とりわけ、制御された直径、ひいては制御された電子特性を有するナノワイヤを作製することができる。さらに、本発明により提供されるストラットベースの核酸構造の制御された金属化によって、新規分子エレクトロニクス部品及び回路を作製することができる。

【0224】

核酸構造はまた、生体分子又は有機分子の鋳型としても使用することができる。かかる鋳型化された分子及びシステムは、例えば診断及び研究適用において有用であり得る。生体分子又は有機分子としては、限定なしに、タンパク質及びペプチド、例えば、抗体及び抗体断片、酵素及び酵素ドメイン、受容体及び受容体ドメイン、生体リガンド、例えばホルモン及び他のシグナル伝達部分、多糖、細胞、細胞凝集体などが挙げられる。ＤＮＡ格子上にタンパク質を鋳型化する様々な戦略が実証されている。タンパク質をプログラム可能なナノメートル精度で規定の幾何学的パターンに組織化することを用いて、例えば、生体モータータンパク質の協調的挙動を研究することができる。特定の核酸構造はまた、細胞又は組織培養においても用いられ得る。これらの実施形態では、例として、成長因子及び細胞外マトリックス成分などの生物学的部分で構造が機能化され得る。このようにして、機能化された構造が培養下で配列され、二次元又は三次元インビボ環境を模倣し得る。さらなる例として、任意の特定の生物学的部分に関する濃度勾配を呈する高次元機能化構造を作成し得ることが企図される。次にこれらのシステムを使用して、あらゆる細胞型の細胞の発生、分化及び／又は挙動を研究することができる。さらに他の例では、本発明の高次構造を、インビトロ又はインビボでの細胞の成長及び分化の足場として使用することができる。

【0225】

これらの様々な応用において、本発明は、本発明の構造で構成される核酸足場が鋳型でなくなった後、それが保持されてもよく、又は（例えば消化又は分解によって）取り除かれてもよいことをさらに企図する。例えば、目標が予め決められた配列の金粒子を作り出すことであり、且つかかる粒子が核酸足場とは無関係に所望のとおりに互いに連結されている場合、足場は取り除かれてもよく、後に金ナノ粒子網のみが残り得る。

【0226】

アルゴリズム、プログラム及びコンピュータシステム
本発明は、特定の形状及びサイズの３Ｄ核酸構造を生成するアルゴリズムを企図する。こうしたアルゴリズムは十分なサイズの３Ｄキャンバスの出発点を含み、ここではキャンバスのいずれの位置に寄与するオリゴヌクレオチド及びドメインも既知である。次にエンドユーザーがキャンバス内に所望の構造を定義し、アルゴリズムが、かかる構造の生成においてどのオリゴヌクレオチドが取り入れられるべきか、どれが除外されるべきか、及びどれが置き換えられるべきかを特定する。例示的アルゴリズムステップを図１７のプログラム１、２及び３に示す。本発明は、かかるアルゴリズムが手動で又はコンピュータ手段により実行され得ることを企図する。

【0227】

本発明の一部の実施形態との関連で用いられ得るコンピュータシステムの例示的実装は、１つ以上のプロセッサ及び１つ以上のコンピュータ可読非一時的記憶媒体（例えば、メモリ及び１つ以上の不揮発性記憶媒体）を含み得る。プロセッサは、メモリ及び不揮発性記憶デバイスへの書込みデータ及びそこからの読取りデータを任意の好適な方式で制御するものであってよく、本明細書に記載される本発明の態様がこの点で限定されることはない。本明細書に記載される任意の機能を実施するため、プロセッサは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（例えばメモリ）（これが、プロセッサによって実行される命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体として働く）に記憶された１つ以上の命令を実行し得る。

【0228】

本発明の特定の上述の実施形態は、数多くの方法のいずれで実装されてもよい。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア又はそれらの組み合わせを使用して実装され得る。ソフトウェアに実装される場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピュータに提供されるものであれ、又は複数のコンピュータ間に分散するものであれ、任意の好適なプロセッサ又は一群のプロセッサ上で実行することができる。上記に記載する機能を実施する任意の構成要素又は一群の構成要素は、総称的に、上記で考察した機能を制御する１つ以上の制御器と見なされ得ることが理解されなければならない。この１つ以上の制御器は、マイクロコード又はソフトウェアを使用して上記に記載した機能を実施するようにプログラムされる専用ハードウェア、又は汎用ハードウェア（例えば１つ以上のプロセッサ）によるなど、数多くの方法で実装することができる。

【0229】

この点で、本発明の実施形態の１つの実装が、プロセッサ上で実行されると本発明の実施形態の上記で考察した機能を実施するコンピュータプログラム（例えば、複数個の命令）がコード化された少なくとも１つの非一時的コンピュータ可読記憶媒体（例えば、コンピュータメモリ、フロッピーディスク、コンパクトディスク、テープ等）を含むことが理解されなければならない。コンピュータ可読記憶媒体は、そこに記憶されたプログラムを任意のコンピュータリソースにロードして本明細書で考察される本発明の態様を実装することができるような可搬型であってもよい。加えて、実行時に上記で考察した機能を実施するコンピュータプログラムに関する言及は、ホストコンピュータ上で動くアプリケーションプログラムに限定されないことが理解されなければならない。むしろ、用語のコンピュータプログラムは、本明細書では、プロセッサをプログラムして本発明の上記で考察した態様を実装するために用いることのできる任意の種類のコンピュータコード（例えば、ソフトウェア又はマイクロコード）を指して総称的な意味で用いられる。

【0230】

以下の実施例は例示を目的として含められ、本発明の範囲を限定する意図はない。

【実施例】

【0231】

実施例
実施例１．全スケールにわたる３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造の自己集合
本発明者らの方法をより良く理解し、且つその能力を実証するため、様々なサイズ及びアスペクト比の３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造を設計し、試験した（図２）。

【0232】

ランダム配列設計。オリゴヌクレオチドの配列（「ＤＮＡブリック」とも称される）は、塩基対（Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ）を３Ｄナノ構造にランダムに割り当てることにより設計した。本発明者らは、初めにランダム配列又は特別に設計した配列のいずれかを含む２つのバージョンの６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂを試験し、同等な自己集合結果を観察した（図８）。本発明者らはまた、４Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂで３組のランダム配列も試験し、同様に同程度の自己集合収率を観察した（データは示さず）。これらの結果に基づき、本発明者らはランダム配列を使用してさらなるナノ構造を設計した。配列は、カスタムプログラム及びmfold, rna, Albanyウェブサイトで利用可能なプログラムであるUNAfoldを併用することにより生成した。初めに、以下の３つの基準を考慮することにより、第１のオリゴヌクレオチドセットの配列（Ｘブリック）を生成した：（１）鎖の結合エネルギーを平滑化する（各鎖が同程度のＧＣ含量を有する）；（２）各鎖の二次構造を最小限に抑える；及び（３）配列対称性を低下させる。次に、第１のセットとのその相補性に従い、第２のオリゴヌクレオチドセット（Ｙブリック）を生成した。ランダム配列及び特別に設計した配列を使用して組み立てた構造の産物収率は同程度であった。本明細書では、ほとんどのナノ構造の合成にランダム配列設計戦略が用いられるが、この配列設計戦略がまた用いられてもよく、進行中の研究で探索しているところである。

【0233】

保護体ＤＮＡブリック。対をなしていない一本鎖をＤＮＡ二重鎖の末端に含めることは、平滑末端スタッキングを軽減するのに有効であることが分かっている（P. W. K. Rothemund (2006)）。対をなしていない一本鎖８ｎｔドメインが、３Ｄナノ構造中の全てのＤＮＡ二重鎖のあらゆる５’末端又は３’末端から突き出る（図１Ｃ及び図１Ｄ）。これらの８ｎｔドメインの配列を、望ましくない相互作用を防ぐため、８つの隣接チミンに置き換えることができる。修飾されたヘッド又はテイルドメインを有するＤＮＡブロックは、それぞれ「ヘッド保護体」又は「テイル保護体」と称される。

【0234】

境界ＤＮＡブリック。１６ｎｔの半分のブリックを、そのヘリックスの方向に沿って先行する３２ｎｔの完全なブリックと合体させ、４８ｎｔ長の境界鎖を形成することができる（図９及び図１０）。本発明者らは、長い境界設計を実施したとき、恐らくは目的のナノ構造形成のヌクリエーションが加速したことに起因して、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂの自己集合が大幅に改善されたことを観察した。従って、この合体戦略を全ての３Ｄナノ構造に適用した。

【0235】

６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂの特徴付け。本発明者らは、初めに、４５９個の鎖（７６８０ｂｐ、Ｍ１３ベースのＤＮＡ折り紙と同程度のサイズ、設計詳細については図Ｓ１１、図Ｓ１２を参照のこと）からなる６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ直方体を構築した。未精製のＤＮＡ鎖を、細かい化学量論的調節は行うことなしに、公称上等しい比率で共に混合した。最適なアニーリング条件を決定するため、本発明者らは、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ自己集合に関して２つのアニーリング勾配（２４時間アニーリング及び７２時間アニーリング）、２つの鎖濃度（各鎖につき１００ｎＭ及び２００ｎＭ）、及び８つのＭｇＣｌ_２濃度（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍＭ）を試験した。次に等量の各サンプル（各鎖につき２ｐｍｏｌ）を臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色２％アガロースゲル電気泳動に供した（図２Ｂ、図２Ｃ）。３Ｄナノ構造の収率を、アガロースゲル電気泳動を使用して推定した。図１１は、かかるアッセイの一例を示す。アニーリングしたサンプルをアガロースゲル電気泳動に供して産物を遊離鎖及び不要な凝集物から分離した。産物バンドの蛍光強度（黒色の囲み線で示される）を３ｋ ｂｐラダーバンドの蛍光強度（灰色の囲み線で示される）と比較することにより、産物の収率を推定した。両方の蛍光強度とも、初めにバックグラウンドノイズで減算し、次に計算に使用した。ImageJソフトウェアを使用して強度を計測した：

【数1】

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次にパーセンテージ収率を以下のとおり計算する。

【数2】

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【0236】

二本鎖３ｋｂｐラダーと本発明者らの３Ｄ構造とでは、ＥｔＢｒ染色の効率が異なり得る。従って収率の絶対数が異なり得る。それでもなお、このアッセイは、ナノ構造間における自己集合結果の比較及び３Ｄ構造の最適なアニーリング条件のスクリーニングに特に有用である。以下の条件で最大収率（３７０ｎｇ、又は約４％）が達成された：各鎖につき２００ｎＭ、７２時間アニーリング、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２。この収率は、同程度のサイズ及びアスペクト比（１０Ｈ×６Ｈ、８Ｈ×８Ｈ、６Ｈ×１０Ｈ、及び４Ｈ×１６Ｈ）の３Ｄ ＤＮＡ折り紙に関する既報告の４％〜１４％収率と同等である（S. Douglas, et al., Nucleic Acids Research 37, 5001 (2009)）。折り紙ことは注目に値する。

【0237】

折り紙の収率は、

【数3】

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として推定される。過剰なステープル鎖の損失（通常足場鎖より５〜１０倍多い）は考慮しない。本明細書で使用される最適４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２は、３Ｄ折り紙の折り畳みに最適な３０ｍＭ（又はそれ以下）のＭｇＣｌ_２濃度（S. M. Douglas, et al., Nature 459, 414 (2009)）より高い。カラム精製した産物（約５０％の回収効率（図２Ｄ））は、アガロースゲル電気泳動により単一のバンドとして泳動し、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）下に予想された形態で見られ、計測された寸法は各塩基対高さにつき０．３４ｎｍ（±０．０１ｎｍＳＤ）及び各ヘリックス幅につき２．５ｎｍ（±０．２ｎｍＳＤ）であった。６Ｈ×１０Ｈ１２８Ｂのアガロースゲル精製後、ＴＥＭ画像において構造をカウントして収率もまた計算した。この「ＴＥＭ収率」は、精製した構造の安定性に関係する。ＴＥＭ画像中の粒子を、存在する欠陥の量及び程度に応じて「良好」、「軽微な欠陥」、又は「重大な欠陥」として分類した。全粒子のうちの良好な粒子の割合をカウントして最終的な収率を決定した。ほとんどの軽微な欠陥は構造のヘリックス末端に近い位置に生じ、鎖がこれらの位置で解離を受け易いことを示している可能性がある。加えて、これらの収率は、概して粒子の安定性の指標となる。イメージングバイアスが計測精度に影響を与え得ることは注目に値する。ＴＥＭ画像においてインタクトな粒子の割合をカウントすることにより、予想された５５％のＴＥＭ収率が得られた（図１２）。このＴＥＭ収率は、３Ｄ正方格子ＤＮＡ折り紙に関する既報告の収率（６Ｈ×１２Ｈ×８０Ｂについて２７％収率、８Ｈ×８Ｈ×９６Ｂについて５９％）（Y. Ke, et al., J.Am.Chem.Soc 131, 15903 (2009)）と同等である。

【0238】

ＤＮＡ二重鎖の両末端に位置する鎖は、１つのみ又は２つの８ｎｔランダム配列セグメントを有し、これが他の鎖との塩基対合に使用される（図１３Ｂ）。従って合理的な仮定は、これらの「ヘッド」鎖又は「テイル」鎖が、構造内部のより深くに位置する鎖と比較してアニーリング中に組み込まれ難く、アニーリング後に３Ｄ構造からの解離を受け易いというものである。これらの「ヘッド」鎖又は「テイル」鎖の組込み効率を高める設計戦略が３Ｄ構造の全体的な自己集合の質に有利となることが考えられる。本発明者らは、この仮説を、「ヘッド」鎖の組込み効率が向上するように修飾した設計（図１３Ｃ）で試験した。同様の修飾を「テイル」鎖にも同様に適用することができる。この設計方法は二段階を含む。（１）クロスオーバーの削除：矢印により指示されるとおり（図１３Ｂ）、クロスオーバーの第１列及び第２列が取り除かれる。（２）鎖の連結：図１３Ｃに示されるとおり、同じ二重鎖にある鎖の各対が共に合体され、より長い一本鎖を形成する。これらの新しい鎖は、３つのランダム配列ドメインを含む３２ｎｔ長であるか、或いは５つのランダム配列ドメインを含む４８ｎｔ長（境界鎖）である。６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂの「ヘッド保護体」を設計し直してそれらをその隣接する鎖と合体させることにより（図１３）、修飾されたバージョンの６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ−Ｍは、６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂと比べて１９０％の収率向上及び１７％のＴＥＭ収率向上を示した（図１４）。「ヘッド」鎖の修飾はＳＳＤ ３Ｄ構造の自己集合を向上させることが予想されるが、削除はクロスオーバー密度の低下をもたらし、それが、特に短いヘリックスの構造について、局所的な変形を生じさせ得る。従って、本発明者らはあくまでもこの修飾されたバージョンを、特別な設計規則を実施することにより３Ｄ構造を安定化させることができるという概念実証として試行するにとどめた。本明細書で使用される他の３Ｄ構造は、当初の戦略を用いて設計した。他の手法、例えば架橋結合（A. Rajendran, et al. J. Am. Chem. Soc. 133, 14488 (2011)）が、設計の柔軟性を犠牲にすることなく３Ｄ ＤＮＡナノ構造を安定化させるのにより一般的な方法であることが判明し得る。

【0239】

種々のサイズのナノ構造。９個のヘリックス、１６個のヘリックス、３６個のヘリックス、６０個のヘリックス、９６個のヘリックス、及び１４４個のヘリックスを含む６つのグループのナノ構造を設計し、次に先に６Ｈ×１０Ｈ×１２８Ｂ自己集合について特定した最適条件を使用してアニーリングした（データは示さず）。本発明者らは、３２ｂｐ長であるもの（従って隣接するヘリックスの各対の間に１つのクロスオーバーを含むもの）を除く全ての設計について正しい産物バンドを観察した（図２Ｇ及び図１５）。収率は１％未満から約８０％まで異なる（図１５）。３２ｂｐ長であるものを除き、各グループ内で設計が小さい程、より高いパーセンテージ収率を呈する。全ての設計のなかで最も高い収率（８０％）は、最も小さいオブジェクト３Ｈ×３Ｈ×６４Ｂ（１，２９６ｎｔ又は約０．４３ＭＤａ）について観察された。最も低い収率は、８Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ、４Ｈ×２４Ｈ×１２０Ｂ、及び１２Ｈ×１２Ｈ×４８Ｂについて観察され、これらの収率は低過ぎたため（１％未満）正確に計測できなかった。各ナノ構造のインタクトな粒子の計測寸法は本発明者らの設計と一致し、種々のサイズの３Ｄ自己集合の成功が示唆される（表１）。組み立てられた最も大きい（larget）ＤＮＡ構造は、８Ｈ×１２Ｈ×１２０Ｂ（７２８個の鎖によって形成される）及び４Ｈ×２４Ｈ×１２０Ｂ（７１０個の鎖によって形成される）であり、これらは分子量が同じであった（２４，５７６ｎｔ、又は約８ＭＤａ、Ｍ１３ベースのＤＮＡ折り紙と比べて６０％大型である）。

【0240】

実施例２．１０×１０×１０ボクセルキャンバスから作成される入り組んだ形状
本明細書に提供される教示に基づき、本明細書に記載される方法を用いて様々なキャンバス（及び次に構造）を生成し得ることが理解されるべきである。従ってある特定のキャンバスのこの例示は、非限定的なものである。

【0241】

本発明者らの手法のモジュール性は、１０Ｈ×１０Ｈ×８０Ｂ直方体（１０×１０×１０ボクセル）３Ｄキャンバスから作成した１０２個の形状の構築及び特徴付けの成功によって実証される（図３Ａ及び図１６）。各ボクセルが、Ｘ及びＹブロックの対の相互作用により形成された８ｂｐ（２．５ｎｍ×２．５ｎｍ×２．７ｎｍ）に対応する。

【0242】

【表83】

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【0243】

ＤＮＡブリック及び誘導体。３Ｄキャンバスの任意のＤＮＡブリックが、カスタム形状設計において境界ブリック（即ち層の縁部に露出している）又は保護体ブリック（即ち最初又は最後の層にある）のいずれにもなることができ、さらには両方同時にもなり得る。従って、各ブリックの修飾されたバージョンを、ドメイン削除（例えば、半分のブリックに二等分する）、ポリチミジン配列置換（例えば、保護体ブリックに変える）、及び境界ブリック合体（例えば、４８ｎｔ境界ブリックに変える）のあらゆる組み合わせで生成し、あらゆる可能性に対応した（図１６）。全部で４４５５個の鎖（合計１３８，２４０ｎｔ）がコンピュータプログラムにより生成され、任意の形状をヘッド／テイル保護体及びブリック長い境界ブリックと共に組み立て得ることが保証された。本明細書と共に提出される、本開示の一部と見なされるべき添付の付属書類に、例示的配列が提供される。

【0244】

設計プロセス。本発明者らは、初めに１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバスを構築した。ここでは各ＸＹＺボクセル（Ｚがヘリックス方向にある）が８ｂｐ二重鎖（２．５ｎｍ×２．５ｎｍ×２．７ｎｍ）に対応する。形状設計は、特定のボクセルセットを選択し、及び取り除くことを介して行われた。３Ｄ視覚化ソフトウェアを使用して３Ｄキャンバスをレンダリングすることにより、グラフィックインタフェース上でボクセルを編集し、単一ボクセル分解能で形状を設計及び視覚化することが可能であった（図３Ｂ及び図１７）。次に複数の形状のボクセル情報をカスタムプログラムにより解釈し、各形状の形成に関わる鎖のリストを生成した。続いてこのリストを加工することにより、自動液体ハンドリングロボットがソースプレートからＤＮＡ鎖を選択し、それらをピペットで産物プレートのウェルに移すように指図し、ハイスループット方式で多くの形状用の鎖を混合した。完全な設計ワークフローは図１７及び図１８に示す。

【0245】

３Ｄ形状の設計。図１６は、任意の３Ｄ形状の作成に使用される４ドメイン鎖及びその誘導体を示す。個別のＤＮＡ構造の自己集合は、往々にして望ましくない凝集によって損なわれ、この凝集は、構造が、（１）対をなさない一本鎖ドメイン、又は（２）ＤＮＡ二重鎖の保護されていない平滑末端を含むときに起こる。Ｃ〜Ｅに示す異なる種類の鎖は、任意の対をなさない一本鎖ドメインのＤＮＡ配列を８個の連続するＴに変えることによってこれらの２つの状況を回避するように設計される。この戦略により、合計１４種類の鎖誘導体が存在するようになり、任意の形状設計について１個、２個、又は３個のボクセルが存在しない場合のあらゆる可能性が網羅される。全１５種類の鎖（Ａ〜Ｅ）を取り入れる場合、いかなる任意の形状も８ｂｐ（１ボクセル）分解能で設計することができる。

【0246】

１４種の鎖誘導体のうち、本発明者らの設計及び実験においては、それらの８種のみが実際に実施された。残る６種の誘導体（図１６Ｄ及び図１６Ｅで＊が付される）のタイプの鎖は除外される。図１６Ｄにおける２つの取り除かれた誘導体は、本発明者らによる任意の形状の設計に生じる頻度が低いと考えられる。図１６Ｅにおける４つの取り除かれた誘導体は、僅か１個のみの８ｎｔランダム配列ドメインからなり、従ってＤＮＡ構造へのその組込みは安定性が低いと考えられる。本発明者らは、各形状について１００個より多い「１ボクセル」誘導体を組み込むことにより、２つの形状（形状４５及び形状５５、元の形状は図３Ｅを参照）を設計し直した。いずれの修飾形状も、アガロースゲル上に産物バンドがなかったことにより確認されるとおり（データは示さず）、任意の目標の構造を生じることができなかった。しかしながら、この単純な実験からは、個々の「１ボクセル」誘導体の組込み効率に関する何ら明確な示唆を得られない。これらの鎖誘導体が形状の境界にのみ存在することは注目に値する。上述の６種類の誘導体の除外は、実際には、形状の全体的な見掛けにほとんど影響を及ぼさないものと見られる。

【0247】

本発明者らはまた、２種類の４８ｎｔ「境界鎖」（図１０）を取り入れて形状の自己集合を向上させた。直前の節に記載したとおり、各４８ｎｔ「境界」鎖は３２ｎｔ鎖及び１６ｎｔ鎖の置換に使用される。本発明者らの設計には、全体で各鎖につき合計（９＋２）＝１１個のオリジナル及び誘導体が作り出された。３Ｄキャンバスの表面に位置する鎖は誘導体が少ないことに留意されたい。

【0248】

各鎖は、それが充当されるボクセルの位置で呼ばれる（図１６Ｇ）。数字の各対が１ボクセルを表す。最初の数字がヘリックスを指示し、２番目の数字がヘリックス上のボクセル位置を指示する。数字（０，０）は、８個の連続するＴを有するドメイン又は空のドメインを意味する。鎖のボクセル情報を使用して、形状を形成し得る鎖が特定される（図１７）。

【0249】

以下は、３Ｄ形状の設計方法の例である。

【0250】

全てのＤＮＡ鎖の生成：（１）カスタムプログラムを使用して３Ｄキャンバスを構築する（図６）。本発明者らは、本明細書では例として１０×１０×１０ボクセルキャンバスを使用した。（２）カスタムプログラムが、１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバスで作成することのできる任意の形状を自己集合させるための鎖及びその誘導体を生成する（Ｓ６．１．１節）。次に、全ての配列及びその対応するボクセル情報が、単一のテキストファイルALL-strand.txtに保存される。任意の形状を作成するための合計４４５５鎖（１３８，２４０ｎｔ）が生成された。

【0251】

３Ｄモデルの構築及び形状の編集：（３）市販の３Ｄモデリングソフトウェアを使用して（本発明者らはStrata（商標）３Ｄ（Strataウェブサイトにある）を使用した）、全ての１０×１０×１０ボクセルを含む３Ｄモデルを構築する。各ボクセルが小さい球体で表される（図１８Ａ）。市販のモデリングソフトウェアは、ボクセルを取り除き／追加し、且つ形状を様々な角度から視覚化するための利便性の高いツールを提供する。（４）図１８Ｂに示されるとおり、１０×１０×１０ボクセル３Ｄキャンバスからボクセルを取り除くことにより形状を設計する。この工程では、形状は単一ボクセル（８ｂｐ）分解能で設計される。各形状が単一のファイルにそのボクセル情報と共に保存される。

【0252】

ボクセル情報に基づく各形状の鎖の特定：（５）本発明者らのカスタムプログラムがボクセルファイルを読み出す。形状のボクセル情報に基づき、プログラムが配列ファイルALL-strand.txtを検索し、設計した形状を自己集合させるための鎖のリストを生成する。プログラムは、初めに、３２ｎｔ鎖及び１６ｎｔ鎖のみを検索して形状を生成する。次にプログラムは、４８ｎｔ「境界」鎖を形成するため３２ｎｔ鎖及び１６ｎｔ鎖の任意の対を一体に合わせることができるかどうかを決定する（図１６Ｆ）。そのようにできる場合、プログラムは３２ｎｔ鎖及び１６ｎｔ鎖を４８ｎｔ「境界」鎖に置換する。（６）上記に記載する本発明者らの鎖設計が理由で、一部のボクセルに、ALL-strand.txtにおける本発明者らの鎖が充当されないこともある。この検索プロセスの間、プログラムは、充当を受けられないボクセルを自動的に取り除き、鎖検索プロセスに戻る。ごく少数のボクセル（形状の境界上にある）のみが形状から取り除かれ、従って削除は形状の全体的な見掛けを変えないことに留意されたい。注記：コンピュータプログラムは複数の形状を操作することができる。そのためユーザは、初めにあらゆる形状を設計し、コンピュータプログラムを使用して全形状用の鎖のリストを同時に生成することができる。（７）プログラムが鎖の検索を終了し、全形状の鎖リストを生成する。また、各形状から削除されたボクセルも報告される。ユーザは、誤りがないか、又はボクセルが多く取り除かれ過ぎていないかを確認することができる。例えば、以下の出力は、形状２３（形状については図３Ｅを参照）から取り除かれた２１個のボクセルを示す：[[0, 1], [0, 10], [1, 10], [2, 1], [3, 10], [4, 1], [5, 10], [6, 1], [7, 10], [8, 1], [9, 10], [18, 10], [22, 10], [36, 10], [44, 10], [54, 10], [66, 10], [72, 10], [88, 10], [90, 9], [90, 10]]。

【0253】

この手順を実施して、１０２個の互いに異なる３Ｄ形状の組立てに成功した（図３Ｅ）。形状を同じアニーリング条件（０．５×ＴＥ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２緩衝液中７２時間アニーリング）でアニーリングし、アガロースゲル電気泳動及びＴＥＭイメージングにより（未精製のサンプルに関して）特徴付けた。

【0254】

形状１〜形状１７。中間の２層「連結ブロック」によって連結された２個の４Ｈ×１０Ｈ×８０Ｂブロックを各々が含む一群の形状（形状２〜１７）を使用して、基本的な設計制約を調べた。連結ブロックは、Ｙ軸（形状２〜９）又はＺ軸（形状１０〜１７）に沿って数が漸減するボクセルを有するように系統的に設計される。形状の対称性から、Ｘ軸に沿ったボクセルの除去は、Ｙ軸に沿ったボクセルの除去と同じ影響を有するはずである。アガロースゲル電気泳動の結果から、いずれの系も連結ブロックが小さくなるにつれ形状の安定性が低くなることが明らかになり（データは示さず）、しかしＺ軸連結の数を減らすと、Ｙ軸連結の数を減らすより安定性に大きい影響が及ぶように見えた。Ｙ軸に沿った２ボクセル連結のみを有する形状９は、壊れているナノ構造が５０％未満となった。対照的に、形状１７（Ｚ軸に沿った２ボクセル）の粒子の大多数が壊れており、もっともアガロースゲル及びＴＥＭ結果は、良好な粒子がごく一部形成されたことを確かに示している。総じて、これらの観察は、少なくとも２個の連続するＸ軸又はＹ軸ボクセル（２個のヘリックス）及び３個の連続するＺ軸ボクセル（２４ｂｐ）という、より安定性の高い特徴のための安全設計基準を示唆している。しかしながら、以下の実験で実証されるとおり、ある種の形状では、より小さい特徴（例えば、２個の連続するＺ軸ボクセル、形状３３〜３７）が安定的に存在し、ここでこれらの特徴は恐らく近接したボクセルによって強化されている）。

【0255】

中実形状１８〜３１。単純な幾何学的形状及びより入り組んだオブジェクトのＺ方向の突出を含むいくつかの中実形状を設計した。これらのオブジェクトの形成収率及び画像が、本発明者らの方法論の構造的完全性に関するさらなる情報を提供する。詳細には、いずれも１つの縁部のみに固定された３個のヘリックス厚さのアペンデージを含む形状２６及び２７は、時にこれらの突起部を含まずに又は突起部が欠損を含む形で見られることもある。従って、かかる薄い特徴は、本発明者らの設計基準の範囲内にあるにも関わらず、より支持された又はより厚い特徴と比べて安定性が低い。

【0256】

閉じた空洞形状３２〜４２。これまでに、箱（E.S. Andersen (2009)）、四面体（Y. Ke (2009)）、並びに球体及び楕円体（D. Han (2011)）を含め、閉じた空洞を備える３Ｄ ＤＮＡ折り紙のいくつかの例が実証されている。ここで、種々のサイズの直方体の空洞を備える一連の「空の箱」（形状３２〜３７）を作り出した。本明細書の結果は、より複雑な空洞設計（例えば、角リング、十字形、及び三角形）を実現可能であることも実証する（形状３８〜４２）。

【0257】

開いた空洞形状４３〜６２。様々な幅、奥行き及び幾何形状の単一の空洞（形状４３〜５３）並びに複数の平行な空洞（形状５４〜５６）を備える形状を構築した。交差しない垂直トンネル（形状５７）、曲がったトンネル（形状５８）、及び交差するトンネル（形状５９〜６０）を備える形状もまた構築した。さらに、結果から、形状６０〜６２により実証されるとおり、異なる角度から様々な外観図が作り出されるように直方体の外表面を修飾し得ることが示された。これらの形状は、本明細書に提示されるモジュール式自己集合によって実現可能な複雑さの好見本である。

【0258】

中実基体上に特徴が載った形状６３〜１００。１０×１０×６ボクセルの中実基体上にある４ボクセル厚さの細密な特徴又は個別の特徴を設計した。これらには、完全な一組の数字（形状６５〜７４）及びラテン文字（形状７５〜１００）が含まれた。同心円構造（形状６３及び６４）は、１ボクセル程の小ささの特徴を作成できることを示した。かかる観察は、さらに、２ヘリックス束×２４ｂｐの設計基準が、大まかに構造の周囲環境に依存することを示す。２Ｄ特徴と中実基体の厚さとの間のボクセル数の差が小さいため、ＴＥＭ画像は２つの表面間で低いコントラストを示す。それでもなお、この方法は、これらの３Ｄ特徴を使用して、本来２Ｄ平面では達成し得ない複数の部分が突出した特徴を作り出せる可能性を際立たせる。

【0259】

本明細書に記載されるほとんどの形状について、収率は数パーセント乃至３０パーセントであった（５個の３Ｄ ＤＮＡ折り紙ナノ構造の収率は７％〜４４％と報告された（１５））。僅か５個の形状のみが３０パーセントより高い収率であり、３個の形状は１パーセントより低い収率であった。様々な複雑な形状の作成が成功したにも関わらず、一部の形状は望ましくない特性を呈した。例えば、形状６０〜６２などの複雑な形状は、ＴＥＭ画像で示されるインタクトな粒子の割合が低かった（１％未満）。形状の一部の細密な特徴（例えば形状２７の２つのウィング）は損傷を受け得るか、又はさらには、アガロースゲルバンドから形状が抜き出された場合には完全に取り除かれ得る。４個の失敗した設計は、アガロースゲル上に明確な産物バンドを生じなかった（図Ｓ５５）。中実基体上に細密な特徴を有した２個の他の設計は、アガロースゲル上に強力なバンドを示した。しかしこれらの特徴はＴＥＭ画像において確認できなかった。最後の２つの形状については自己集合を成功であるとすることが可能であるが、特徴が小さ過ぎるため画像化できない。

【0260】

実施例３．３Ｄ ＤＮＡモジュール式自己集合の普遍性
モジュール式ＤＮＡ自己集合の汎用性についてさらに調べるため、以下の実験を行った：（１）ＤＮＡ折り紙によって実証されている、異なる格子ジオメトリを備える形状を設計する（P. W. K. Rothemund (2006)；S. M. Douglas (2009)；Y. Ke, et al. J.Am.Chem.Soc (2012)）、及び（２）他の種類のモジュール式ＤＮＡモチーフを使用して３Ｄ自己集合を試験する。

【0261】

単層（２Ｄ）ナノ構造。概念的に、単層（２Ｄ）ＤＮＡナノ構造は、３Ｄ ＤＮＡブロックナノ構造から層を「抽出」することにより構築できる（図４Ａ）。３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂを試験した（データは示さず）。これは１０．６７ｂｐ／ターン（３Ｄ設計用）ではなく１０．５ｂｐ／ターンとなるように意図的に（intensionally）修飾し、それにより比較的平坦なナノ構造を得た。収率は、アガロースゲル電気泳動の結果に基づき１８％と推定された（データは示さず）。３０Ｈ×１Ｈ×１２６Ｂの寸法は、ＡＦＭ画像を基準として各ｂｐにつき０．３１ｎｍ（±０．０１ｎｍＳＤ）、各ヘリックスにつき２．６ｎｍ（±０．３ｎｍＳＤ）であると計測された。

【0262】

３Ｄハニカム格子ナノ構造。次に本発明者らは、１０．８ｂｐ／ターン（ｂｐ当たり３３．３°のねじれ）の３Ｄハニカム格子及び六方格子ＤＮＡナノ構造を作った。３Ｄハニカム格子ＤＮＡナノ構造用に４種類の４ドメインＤＮＡ鎖を設計した（図４Ｄ、図４Ｅ）。６Ｈ×６Ｈ×８４Ｂ−ＨＣナノ構造を構築し、特徴付けることに成功した（図４Ｄ、及びデータは示さず）。ＴＥＭ画像の粒子は、１３ｎｍ（±０．９ｎｍＳＤ）×２２ｎｍ（±１．０ｎｍＳＤ）×２９ｎｍ（±１．２ｎｍＳＤ）であると計測された。収率は３０％であると推定された（データは示さず）。

【0263】

３Ｄ六方格子ＤＮＡナノ構造。３Ｄ六方格子ＤＮＡナノ構造を構築するように２種類の鎖を実現する：クロスオーバーによって連結された複数の９ｎｔドメインを有する直鎖及び２つの９ｎｔドメインを有する１８ｎｔ鎖（図４Ｇ、図４Ｈ）。６Ｈ×７Ｈ×１０８Ｂ−ＨＬナノ構造を構築し、特徴付けた（図４Ｉ、及びデータは示さず）。ＴＥＭ画像の粒子は、１３ｎｍ（±０．８ｎｍＳＤ）×１８ｎｍ（±１．１ｎｍＳＤ）×３５ｎｍ（±２．２ｎｍＳＤ）であると計測された。収率は２６％であると推定された（図Ｓ６４）。

【0264】

他のモチーフ設計。「一方向性」の設計とは対照的に、鎖はまた、３Ｄナノ構造において反対方向を向くように設計することもできる。ここで本発明者らは、奇数の層にある鎖がＺ−方向に向き、且つ偶数の層にある鎖がＺ＋方向に向く設計戦略を実証する（図１９Ｂ）。本発明者らは、６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ａ（交互設計）、及び２つの他のＤＮＡモチーフ設計を実施する２つの６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂナノ構造の自己集合を設計し、試験した（データは示さず）。アガロースゲル電気泳動及びＴＥＭイメージングによって６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−Ａの自己集合の成功が確認された。本発明者らの結果はまた、この鎖設計が他の２つのモチーフ設計と比べて大幅に高い収率であったことも実証した。ナノ構造のサイズに関わらず、かかる交互設計ではクロスオーバーは対称に配置される。これらの設計の成功から、汎用的なモジュール式ＤＮＡ自己集合方法が描き出された。

【0265】

実施例４．ＤＮＡブリック結晶
ＤＮＡブリック結晶の設計。全ての結晶を、天然のＢ型ＤＮＡの１０．５ｂｐ／ターンのねじれ密度から僅かに逸脱する１０．６７塩基対（ｂｐ）／ターンのねじれ密度を使用して設計した。組み立てられた構造において、ＤＮＡブリックは、４つの８ｎｔ結合ドメインを含む単純なＬＥＧＯ（登録商標）様ブリックモデル（図２０Ａ上）で表され得る３２ヌクレオチド（ｎｔ）鎖である。多くのブリック−各々が異なる配列を有する−が一段階アニーリング反応で規定の三次元構造に組み立てられる（図２０Ａ下）。

【0266】

個別の三次元ＤＮＡブリック構造間に「連結」ブリックを使用して、ＤＮＡブリック結晶を得た。この設計戦略は、小さい６Ｈ（ヘリックス）×６Ｈ（ヘリックス）×２４Ｂ（塩基対）直方体構造で実証された。個別のＤＮＡブリック設計の表面上のＤＮＡブリックは、個々の構造を連結し、且つＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿った結晶の成長を、一次元成長結晶が生じるように個々に伸ばすか、又は二次元成長結晶が生じるように組み合わせで伸ばすように修飾した（図２０Ｄ及び図２４Ａ〜図２４Ｃ）。Ｚ軸に沿った多量体化を達成するため、第１のドメイン層の配列を、最後のドメイン層と相補的になるように修飾した。Ｘ軸又はＹ軸に沿った多量体化は、Ｘ軸又はＹ軸に沿った境界上のブリックを新しい３２ｎｔブリックに置換することにより達成された。これらの新しい３２ｎｔブリックの各々は、直方体の一方の側に相補的な２つのドメインと、直方体の他方の側に相補的な別の２つのドメインとを含んだ。従って、これらの３２ｎｔブリックは直方体単量体を連結し、連続的な成長を達成する。

【0267】

ＤＮＡブリック結晶は繰り返し単位から設計したが、連結ブリックは他のブリックとサイズ及び機能が同じであった。従って、ＤＮＡ折り紙結晶の階層的成長とは異なり、本発明（inventoin）のＤＮＡブリック結晶の成長は非階層的であり得る（図２０Ｃ上）。初めに繰り返し基本単位を形成することなく、結晶の成長中、ブリックを個々に結晶に組み込んだ。情報階層−繰り返し単位におけるブリックの配列のユニークさ−は最終的な結晶構造において維持された。対照的に、ＤＮＡ折り紙結晶化は階層的プロセスであり、折り紙構造を完全に形成してから結晶に組み込まなければならない（図２０Ｃ下）。

【0268】

この設計戦略を使用して、本発明者らは、３つのグループの結晶を構築し、試験した：（１）Ｚ軸に沿って延在する一次元「ＤＮＡバンドル」結晶（Ｚ結晶と称される）；（２）Ｚ軸及びＸ軸に沿って延在する二次元「ＤＮＡマルチレイヤー」結晶（ＺＸ結晶と称される）；及び（３）Ｘ軸及びＹ軸に沿って延在する二次元「ＤＮＡフォレスト」結晶（ＸＹ結晶と称される）（図２０Ｄ及び図２０Ｅ）。異なる設計の繰り返し単位を使用して、規定の寸法及びパターンを有するＤＮＡブリック結晶を作成することができる（図２０Ｆ）。従って、結晶設計は、「［成長方向］−［繰り返し単位のサイズ］−［その形状の基本的特徴］」のようにして命名される。個別のＤＮＡブリック構造と同様に、全てのＤＮＡブリック結晶の配列は、本明細書に記載されるとおり、ランダムに生成した。

【0269】

全ての未精製ＤＮＡブリックを等モル比（各鎖１００ｎＭ）で１×ＴＥ／ＭｇＣｌ_２（５ｍＭトリス、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）緩衝液中に、細かい化学量論的調節は行うことなしに一緒に混合して結晶を組み立てた。次に混合物を一段階７２時間又は１６８時間熱的アニーリングに供し、続いて精製することなくＴＥＭイメージングを行った。各ＤＮＡヘリックスの有効直径は、全ての３Ｄ結晶において２．５ｎｍであると計測された。

【0270】

一次元成長ＤＮＡバンドル結晶（Ｚ結晶）。本発明者らは、初めに２つのグループのＺ結晶を作成した：（１）種々の断面形状を備える中実Ｚ結晶、これにはＺ−６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ、Ｚ−８Ｈ×８Ｈ×３２Ｂ、及びＺ−１０Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ、Ｚ−８Ｈ×８Ｈ×１２８Ｂ−らせん、Ｚ−４３Ｈ×３２Ｂ−三角形、及びＺ−４４Ｈ×３２Ｂ−六角形が含まれる（図２１Ａ）；及び（２）チューブ形状のＺ結晶、Ｚ−５６Ｈ×３２Ｂ−トンネル、Ｚ−６０Ｈ×６４Ｂ−トンネル、及びＺ−１０８Ｈ×３２Ｂ−トンネル（図２１Ｂ）。

【0271】

全てのＺ結晶が、ＴＥＭ画像において大域的な右巻きのねじれを呈した。大域的なねじれとは、１０．６７ｂｐ／ターンのアンダーワインディング設計により生成される応力に対する応答と理解される。ねじれの大きさは、Ｚ結晶の断面形状の影響を受けた。Ｚ結晶は容易に形成された。ほとんどのＺ結晶は、２４時間アニーリングプロトコルを使用して数マイクロメートルの長さに成長することができる。しかしながら、長いアニーリングプロトコル程、典型的にはより長いＺ結晶が得られる。従って、本発明者らは全てのＺ結晶について７２時間アニーリングプロトコルを使用した。

【0272】

３２ｂｐ繰り返し単位を使用して３つの中実Ｚ結晶を設計した。Ｚ結晶の正方形形状の断面は、それぞれ６Ｈ×６Ｈ、８Ｈ×８Ｈ、及び１０Ｈ×１０Ｈ直方体を含む。次に本発明者らは、より複雑な断面形状を備える結晶を作製した。Ｚ軸に沿ってらせんチャネルを示すＺ−８Ｈ×８Ｈ×１２８Ｂ−らせん結晶を構築することに成功した。チャネルはＴＥＭ画像で明確に見ることができる。次に本発明者らは、２つのより単純な設計を構築した：Ｚ−４３Ｈ×３２Ｂ−三角形及びＺ−４４Ｈ×３２Ｂ−六角形。いずれも、３つの正方形断面Ｚ結晶と同等の高い組立て品質を示した。

【0273】

次に３つのチューブ形状のＺ結晶を試験した。Ｚ−５６Ｈ×３２Ｂ−トンネルの断面は、２Ｈ×４Ｈ長方形が中心から取り除かれた８Ｈ×８Ｈ正方形である。Ｚ−１０８Ｈ×３２Ｂ−トンネルの断面は、６Ｈ×６Ｈ正方形が中心から取り除かれた１２Ｈ×１２Ｈ正方形である。Ｚ−６０Ｈ×６４Ｂ−トンネルは、このグループのなかで最も複雑な設計である。これは、Ｚ軸に沿った中心にある２Ｈ×２Ｈ正方形トンネルを含む。加えて、８Ｈ×２Ｈ×２４Ｂポアが、Ｚ軸に沿って６４ｂｐ毎に２Ｈ×２Ｈ正方形トンネルと交差する。ＴＥＭ画像は、設計されたＤＮＡヘリックスの半分のみを含むように見える多くの構造を示す。これは、周期的な８Ｈ×２Ｈ×２４ＢポアがＹ軸に沿った上半分と下半分との間の連結を弱めることに起因し得る。

【0274】

Ｚ結晶のさらなるＴＥＭ画像を図２５Ａ〜図２５Ｈに示す。

【0275】

二次元成長ＤＮＡマルチレイヤー結晶（ＺＸ結晶）。次に２つのグループのＺＸ結晶を構築した：（１）中実ＺＸ結晶−それぞれ４、６、１０、及び２０層のＤＮＡヘリックスを含むＺＸ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体、ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ−直方体、ＺＸ−４Ｈ×１０Ｈ×３２Ｂ−直方体及びＺＸ−４Ｈ×２０Ｈ×３２Ｂ−直方体（図２２Ａ〜図２２Ｃ）；及び（２）チャネル又はポアを備えるＺＸ結晶−ＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−チャネル、ＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−交差チャネル、ＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−ポア及びＺＸ−９６Ｈ×６４Ｂ−交差チャネル（図２２Ｄ及び図２２Ｅ）。

【0276】

本発明者らは、全てのＺＸ結晶が、Ｘ軸と比べてＺ軸に沿ってより速く成長したことを観察した。ある場合には（例えば、Ｘ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶）、Ｚ軸に沿った成長が大幅に速く、ＴＥＭ画像に現れるリボン様のＺＸ結晶が生じた。この現象は、Ｚ軸（ヘリックス軸）に沿った結晶成長がＸ軸又はＹ軸に沿った結晶成長より実現し易いことを示唆している。これは恐らく、（１）Ｚ軸の成長がより多くのπ−π塩基スタッキングをもたらすこと；及び／又は（２）Ｘ軸又はＹ軸の成長が負電荷を有するＤＮＡ骨格を互いに最密に充填するために余分なエネルギーペナルティを克服しなければならないことが理由と思われる。最も複雑なＺＸ結晶設計である、イメージング前に１６８時間アニーリングしたＺＸ−９６Ｈ×６４Ｂ−交差トンネルを除き、多くのＺＸ結晶を７２時間アニーリングプロトコルを使用して作製した。全てのＺＸ結晶が小さい右巻きねじれを示したが、これは１０．６７ｂｐ／ターンのアンダーワインディング設計によって生じるものである。結果として、本発明者らは、ＴＥＭ画像において結晶が時に屈曲し、それ自体に折り重なることを観察した。しかしながら、ＺＸ結晶のねじれの大きさは、屈曲位置が典型的にはＺＸ結晶上で数マイクロメートル離れて観察されたため、Ｚ結晶より大幅に小さいものと見られた。

【0277】

４層、６層、１０層、又は２０層のヘリックスを含んだ４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ単位から４つの中実ＺＸ結晶を設計した。ＺＸ結晶の厚さは、ＴＥＭ画像において結晶が折れる位置で直接計測した（図２２Ｃ）。４層、６層、１０層、及び２０層のＺＸ結晶の厚さは、それぞれ約１０ｎｍ、１５ｎｍ、２５ｎｍ及び５０ｎｍと計測され、結晶が完全に形成されたことが示され、各ＤＮＡヘリックスは直径約２．５ｎｍであった。本発明者らは、初めに、６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ−直方体単位から３つのＺＸ結晶を設計した。直方体から４個のヘリックスを取り除いてＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂチャネル設計を生成した。第２のＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−交差チャネル設計は、ＺＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−チャネルから２Ｈ×３２Ｂチャネルを取り除くことにより生成した。第３のＺＸ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂポア設計は、各直方体単位にＹ軸に沿った２Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ垂直ポアを含んだ。この設計は、恐らくはＸ軸に沿った連結が少ないことに起因して、細くて長い結晶を生じた。最も複雑なＺＸ結晶設計は、ＺＸ−９６Ｈ×６４Ｂ−交差トンネル結晶であった。その繰り返し単位は、Ｚ軸に沿って２Ｈ×２Ｈ×６４Ｂポアを有し、且つＸ軸に沿って１０Ｈ×２Ｈ×２４Ｂポアを有する１０Ｈ×１０Ｈ×６４Ｂ（６４００ｂｐ）直方体と考えることができる。互いに垂直に延在する２つのグループの接触のないトンネルが実現された。これらの２つのグループのトンネルは、２つのＤＮＡヘリックス中実層によって隔てられた。かかる合理的に設計された３Ｄ多孔質特徴は、従来の折り紙法を用いては実現が困難であった。

【0278】

ＺＸ結晶のさらなるＴＥＭ画像を図２６Ａ〜図２６Ｈに掲載する。

【0279】

二次元成長ＤＮＡフォレスト結晶（ＸＹ結晶）。最後に、本発明者らは、２つのグループのＸＹ結晶を作成した：（１）中実ＸＹ結晶−ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×１２８Ｂ−直方体、ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×１９２Ｂ−直方体、及びＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×２５６Ｂ−直方体（図２３Ａ及び図２３Ｂ）；及び（２）複雑なＸＹ結晶−ＸＹ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア、ＸＹ−３２Ｈ×１２８Ｂ−ポア、ＸＹ−４Ｈ×８Ｈ×９６Ｂ−チャネル、及びＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂチューブ（図２３Ｃ及び図２３Ｄ）。

【0280】

ＸＹ結晶は、ＤＮＡヘリックス軸に沿った成長を省く二次元成長結晶である。対照的に、前出の二次元ＤＮＡ結晶はいずれも、ＤＮＡヘリックス軸成長を実施する。Ｘ軸又はＹ軸に沿った結晶成長はＺ軸に沿った成長より難しいため、７２時間アニーリングプロトコルは多くの場合にＸＹ結晶を生じないか、又はＸ軸若しくはＹ軸に沿って数百ナノメートルより小さいＸＹ結晶を生じる。従って、本発明者らは、図２３における全てのＸＹ結晶について１６８時間アニーリングプロトコルを使用した。ＸＹ結晶の成長は等方性で、２つの成長方向（Ｘ軸及びＹ軸）が両方ともＤＮＡヘリックス軸と垂直であったため、明らかな方向選択性を示さなかった。

【0281】

ＸＹ結晶は、本発明者らの画像ではいかなる大域的な右巻きねじれも示さなかった。解析を単純化するため、本発明者らは、ＸＹ結晶がｎ個のヘリックスを含む完全な円柱を形成すると仮定した。円柱のラジアン単位の全体的なねじれθ＝ＴＬ／ＪＧ（式中、Ｔはアンダーワインディング設計がもたらす印加トルクであり、Ｌはヘリックスの長さであり、Ｇはヘリックスの剛性率であり、及びＪはねじれ係数である）。最初の３つのパラメータは一定と見なし得る。断面半径（ＸＹ面）の関数としての円のねじれ係数Ｊは、以下の式により近似することができる：Ｊ＝πｒ^４／２（式中、ｒは円断面半径である）。従って、θはｒ^４、又はｎ^２に反比例する。ＸＹ結晶が成長し、ｎが１に近付くと、大域的ねじれは速やかに軽減され、それ以上観察することができなくなる。

【0282】

ＸＹ結晶の表面の平坦性は、溶液中であってもゲスト分子の位置及び向きを正確に制御することができるため、一部の適用にとって望ましい特性である。対照的に、ねじれのある構造（例えばＺＸ結晶）又は柔軟性のある構造（例えば、単層ＤＮＡ折り紙結晶）の溶液中におけるコンホメーションは、正確に予測することが困難である。加えて、結晶が極めて多数のＤＮＡヘリックスを表面上に露出させているため、ＸＹ結晶は、物質を配置するのに容易なプラットフォームを提供する。機能化された材料は、各寸法において２．５ｎｍの分解能で最密に充填されたＤＮＡヘリックスの末端に簡便に連結することができる。

【0283】

４Ｈ×４Ｈ直方体単位から様々な厚さの中実ＸＹ結晶を設計した。異なる長さの４Ｈ×４Ｈ直方体単位を使用して、厚さ６４ｂｐ、１２８ｂｐ、１９２ｂｐ及び２５６ｂｐの４つのＸＹ結晶を生成した。これらの中実ＸＹ結晶の厚さは、それらが完全に平坦であったため、ＴＥＭイメージングから直接計測することができなかった。各塩基対がＢ型ＤＮＡにおける標準的な０．３３ｎｍ長さに対応する場合、これらの４つの結晶の厚さはそれぞれ約２１ｎｍ、４２ｎｍ、６３ｎｍ及び８４ｎｍとなるはずである。

【0284】

ＸＹ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア及びＸＹ−３２Ｈ×１２８Ｂ−ポア結晶を構築した。両方の設計とも、各寸法において４個のヘリックス（１０ｎｍ）により隔てられた周期的な２Ｈ×２Ｈ（５ｎｍ×５ｎｍ）ポアを含んだ。２つの結晶構造は、２１ｎｍ及び４２ｎｍ厚さの多孔質膜構造に似ていた。表面特徴を有する非多孔質構造を構築し得ることを実証するため、本発明者らは、ＸＹ−４Ｈ×８Ｈ×９６Ｂチャネル結晶を作成した。これは、中実６４ｂｐ（４２ｎｍ）高さの基体と平行チャネルとを含んだ。チャネルは幅が４個のヘリックス（１０ｎｍ）、高さが３２ｂｐ（２１ｎｍ）で、４層のヘリックスにより隔てられていた。

【0285】

ＸＹ結晶のさらなるＴＥＭ画像を図２７Ａ〜図２７Ｉに示す。

【0286】

特に興味深いＸＹ結晶はＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−チューブ結晶であった。これは、他のＸＹ結晶と同じ設計戦略を使用して設計した。この薄いＸＹ結晶（３２ｂｐ、又は１０．６ｎｍ）は、平坦な２Ｄ結晶ではなく、チューブ構造を形成した。理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、このチューブ形成がヘリックス間における連結の不均等な分布に起因すると仮定する（図２８Ａ〜図２８Ｃ）。ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−チューブにおけるヘリックスは比較的短いため、隣接するヘリックスの各対の間にある連結は１つのみである。この連結はＹ軸に沿って均等に分布している。Ｘ軸に沿っては、連結の半分が構造の中央に位置し、残る半分が構造の片側に位置する。従って、理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、結晶が反対側で拡張し、チューブを形成すると仮定する。これらのチューブは細く、数マイクロメートルの長さに成長することができる（図２９）。チューブの直径は、僅かな変動はあるものの、約１４〜２０ｎｍである。より高いＭｇＣｌ_２濃度の存在下でＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−チューブをアニーリングすると、Ｍｇ^２＋が負に荷電したＤＮＡヘリックス間の斥力を低減し得るため、より大きい直径のチューブを作製することができる。６０ｍＭ ＭｇＣｌ_２では、本発明者らは、１４０ｎｍ〜３００ｎｍの直径を有する多くのチューブを観察した（図３０）。我々の仮説をさらに試験するため、本発明者らは、ＤＮＡブリックが層間で交互に並ぶように配置されたＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×３２Ｂ−直方体結晶を設計した。この設計におけるヘリックス間の連結は、Ｘ軸及びＹ軸の両方に沿って対称に分布した。ＴＥＭ画像から、平坦な結晶構造が実証された（図３１）。より厚い６４ｂｐ、１２８ｂｐ、１９２ｂｐ及び２５６ｂｐのＸＹ結晶設計は、隣接するヘリックスの各対の間に２、４、６、及び８個の連結を有した。これらの設計について、ＴＥＭ画像に認識できる湾曲は観察されなかった。

【0287】

その他のＤＮＡブリック結晶。本発明者らは、（１）Ｘ軸に沿って延在する２つの一次元成長結晶及び（２）「オフセット」連結スキームを実現する二次元成長結晶を含め、ＤＮＡブリックから他のタイプのＤＮＡブリック結晶を組み立て得ることをさらに実証した。

【0288】

１Ｄ Ｘ結晶。Ｘ軸又はＹ軸に沿った繰り返し単位の成長により、別種の一次元成長結晶が生成された。本発明者らは、２つのＸ結晶を設計し、試験した（ＤＮＡブリック構造の対称性から、Ｘ結晶とＹ結晶とは極めて類似しているはずであることに留意されたい）：Ｘ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶（図３２Ａ）及びＸ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶（図３２Ｂ）。Ｘ−６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶は、中実６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体単位に基づき設計した。Ｘ−３２Ｈ×６４Ｂ−ポア結晶は、４個のヘリックスを中心から取り除いた６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ直方体単位を使用した。両方の結晶とも、数百ナノメートルの長さに成長し、ＴＥＭ画像において良好に形成されているように見えた。２つのＸ結晶の平均長さは、多数の短いＤＮＡヘリックスが最密に充填されることに起因して、Ｚ結晶と比べて大幅に短かった。

【0289】

オフセット２Ｄ ＺＸ結晶。前述の結晶は全て、図２０Ｂの連結スキームを使用して設計した：構造の伸長は、軸に沿って繰り返し単位を「完全一致」方式で連結することにより達成した。例えば、６Ｈ×６Ｈ×３２Ｂ−直方体Ｚ軸結晶を作成するため、繰り返し単位中のあらゆる二重鎖が次の繰り返し単位中の同じ二重鎖と連結するように設計した。しかしながら、各軸に沿った連結は、「オフセット」結晶を生成するようにシフトさせることができる。かかる戦略により、同じ基本の繰り返し単位からのより多くの結晶設計が可能となる。本発明者らは、オフセットスキームを使用して、Ｚ軸及びＸ軸に沿って６Ｈ×６Ｈ×６４Ｂ−直方体繰り返し単位を伸長する二次元成長結晶を構築した（図３３Ａ〜図３３Ｃ）。この設計では、結晶のＺ軸延在範囲が、Ｘ軸に沿って４個の二重鎖だけずれている；結晶のＸ軸延在範囲が、Ｚ軸に沿って３２ｂｐずれている。オフセット連結は、ＤＮＡブリック構造の周期性に起因して、以下の規則に従った：Ｘ軸又はＹ軸に沿ったずれは２個の二重鎖間隔毎に生じ；及びＺ軸に沿ったずれは３２ｂｐ間隔毎に生じる。

【0290】

実施例５．金ナノ粒子のパターニング
ＤＮＡ構造を鋳型として使用して、金ナノ粒子が個別のパターン（Kuzyk, A. et al. Nature 483, 311-314 (2012)；Acuna, G P et al. Science 338, 506-510 (2012)；Aldaye, F A & Sleiman, H F. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2204-2209 (2006)）及び単層の周期的パターン（Sharma, J. et al. Science 323, 112-116 (2009)）に配列されている。しかしながら、金ナノ粒子の最密充填周期パターン、特に多層パターンを形成することは、依然として難題である。ＤＮＡブリック結晶を使用した材料の配列を実証するため、本発明者らは、最密充填金ナノ粒子構造を設計し、構築した：（１）ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶上における平行金粒子ラインの２Ｄ配列（図３４Ａ及び図３４Ｂ）及び（２）ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４−直方体結晶の２つの表面上における平行金ナノ粒子単層の単純３Ｄ配列（図３４Ｃ〜図３４Ｅ）。

【0291】

ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６−チャネル結晶の設計及びＴＥＭ画像を、図３５Ａ〜図３５Ｃに示す。チャネルは奥行き２ヘリックス（５ナノメートル）及び幅３２ｂｐ（１０．６ナノメートル）である。隣接する平行チャネルは、Ｚ軸に沿って６４ｂｐ（２１．２ｎｍ）の距離だけ隔てられている。ポリＡ（１０個の連続するアデニン塩基）ＤＮＡ鎖で機能化された金ナノ粒子をＤＮＡ結晶上に配列した。チャネル内では、あらゆるヘリックス末端が、金ナノ粒子を捕捉するためのポリＴ一本鎖ＤＮＡを呈する。金ナノ粒子を、本発明者らの設計と一致する平行線状に配列することに成功した。各ライン内で、最密充填金ナノ粒子の単鎖が観察された。ライン状の金ナノ粒子間の平均距離は、明らかな欠陥がある一部の位置を除き、約２ナノメートルである（図３４Ｂ）。図２３Ｃに示されるとおり、２つの平行な金ナノ粒子単層をＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４−直方体結晶上に組み立てた。結晶は両方の表面上の各ヘリックス末端に、ポリＡ鎖で機能化された１０ナノメートル金ナノ粒子を捕捉するためのポリＴ配列を呈する。粒子間の平均距離は約１〜２ナノメートルであるものと見られた（図３４Ｄ）。構造は時に縁部が湾曲した（図３４Ｅ）。金ナノ粒子の２つの単層間の縁部間距離は、約２５ｎｍであると計測され、設計した結晶厚さと一致した。

【0292】

金ナノ粒子をミクロンスケールの秩序立った低次元アレイに並べることは、多様なプラスモン適用において必要とされる（Melosh, N. A. et al. Science 300, 112-115 (2003)；Qi, M. H. et al. Nature 429, 538-542 (2004)）。詳細には、２ｎｍ未満の面間間隔のナノ粒子アレイが、強力なプラズモンカップリングを呈するものと見込まれる（Qi, M. H. et al., 2004）。ＤＮＡナノ構造を鋳型として、金ナノ粒子がキラル（Qi, M. H. et al., 2004）、線状（Liu, N., et al. Science 332, 1407-1410 (2011)；Tang, C. B., et al. Science 322, 429-432 (2008)；Tavakkoli K. G., A. et al. Science 336, 1294-1298 (2012)）、及び分枝状パターン（Seeman, N.C. J. Theor. Biol. 99, 237-247 (1982); Chen, J. & Seeman, N. C. Nature 350, 631-633 (1991)）に配列されている。しかしながら、これらの構造のほとんどは個別の１００ｎｍ未満の構造であり、ミクロンスケールでの長い範囲に及ぶ秩序化を欠いている。加えて、粒子間の間隔を２ｎｍを切るまでに減らすこともまた難題である。本発明のＤＮＡ結晶の作製方法は、これらの難題に対処するユニークな方法を提供する。ポリＴ結合部位の表面分布を変化させることにより、金ナノ粒子をミクロンスケールの異なる２Ｄパターンで、最密充填パターンから２０ｎｍ鎖間間隔の金ナノ粒子鎖のアレイに至るまでプログラムした。ポリＴ結合部位の周期性はＤＮＡ結晶上で２．５ｎｍであり、これにより粒子間間隔は約２ｎｍに減少した。

【0293】

本発明者らの研究は、短い合成ＤＮＡから３Ｄ正方格子、ハニカム格子、及び六方格子ＤＮＡナノ構造を構築するための普遍化された手法を提供する。さらに、本発明者らはまた、多様な形状並びにチャネル及びポアなどの入り組んだ特徴を備える１０２個の入り組んだ３Ｄ形状も実証した。本発明者らのモジュール式の手法は、本発明者らの単純化したＬＥＧＯ（登録商標）様モデル及びコンピュータ支援設計プロセスを伴い、入り組んだ３Ｄナノ構造を設計する単純な方法を提供する。長い足場鎖がないため、３Ｄキャンバスにおける任意のボクセルを独立して追加し又は取り除くことができ、８ｂｐ分解能での形状設計が可能となる。ＤＮＡブリックのコンパクトさ及びモジュール性を利用して、本発明者らは入り組んだ特徴（細い空洞及び通路など）を有するナノ構造を組み立てることができたが、これを、各ステープル鎖成分が典型的には大幅にコンパクトさに欠け、且つ足場が全くモジュール式でないＤＮＡ折り紙を使用して達成するのは、困難であり得る。１０００ボクセル３Ｄ ＤＮＡキャンバスは、最大２^１０００〜１０^３００の潜在的可能性を提供する。しかしながら、完全な形状に自己集合するためには、各ボクセルがその隣接するボクセルの少なくとも１つと物質的に連結されなければならない。そのため構築することのできる実際の形状はそれより少ない。

【0294】

本発明者らは、ある種の大きい又は入り組んだ設計が脆弱性を呈し得ることを注記した。一例は３Ｈ×３Ｈ×１０２４Ｂであり、これはアガロースゲル精製後のＴＥＭイメージングの間にほとんどが壊れて断片となった。この問題に対処する一つの方法は、ナノ構造の一部の位置、特に「ウィークポイント」に対するより長い合成ＤＮＡ鎖の組込みを用いることである。これらの長い鎖は、足場鎖と同様、形状を強化し得る。

【0295】

入り組んだ３Ｄ形状を構築する能力により、ＤＮＡナノテクノロジーが対処し得る難題及び適用の範囲が広がり、例えば生合成機構を模倣する高度なＤＮＡデバイスを作成し、又は３Ｄ空間にゲスト分子を配列して様々な機能性ナノ材料を生成し得る。加えて、合成ＤＮＡから作成される３Ｄナノ構造により、研究者がその用途に応じたカスタム配列を設計することが可能になる。さらに、Ｌ−ＤＮＡ、化学修飾骨格を有するＤＮＡ、人工塩基を有するＤＮＡ、及びＲＮＡを含めた他の合成情報高分子を使用するモジュール式自己集合は、薬物デリバリー及び治療適用などの様々な適用に決定的に重要であることが判明し得る。

【0296】

本発明者らはまた、カスタム設計された寸法及びナノスケール特徴を有する複雑な３Ｄ ＤＮＡ結晶を構築するための普遍的方法論も提供している。これは、真のミクロンスケール３Ｄ周期構造を作成することが可能な初めてのボトムアップ式自己集合戦略であり、構造は、数ナノメートルの分解能で合理的に設計され得る繰り返し単位を使用して、メガダルトンのサイズに達し得る。様々な設計の周期的単位−数百塩基対から数千塩基対に至る−を使用して、本発明者らは、（１）最大１０８個の平行ヘリックスを含む１Ｄ成長ＤＮＡバンドル結晶；（２）最大２０層（５０ｎｍ）の厚さの２Ｄ成長ＤＮＡマルチレイヤー結晶；及び（３）最大２５６ｂｐ（８４ｎｍ）の高さの２Ｄ成長ＤＮＡフォレスト結晶を構築した。さらに、本発明者らは、複雑なナノメートルスケールの表面特徴、チャネル、及び多孔質パターンを本明細書に提供される３Ｄ結晶で実現できることを実証した。

【0297】

この組立て戦略は、ＤＮＡ折り紙及びＤＮＡタイルの結晶化に関する理解に基づく。本明細書におけるＤＮＡ折り紙結晶の組立ては、一段階アニーリング反応又は二段階アニーリング反応を用いて実施され得る。１回のアニーリング反応では、足場、５〜１０倍のステープル、及び連結鎖が共にアニーリングされる。理論によって拘束されるものではないが、ＤＮＡ折り紙単量体はアニーリングの早い段階で（高い温度で）正しく形成され、次にアニーリングの遅い段階で（低い温度で）互いにつなぎ合わされることで結晶が形成される必要があると考えられる。二段階アニーリング反応は、連結鎖を除く折り紙単量体の最初のアニーリングから始まり、続いて精製ステップがあることにより、折り紙単量体が得られる。精製された単量体は、次に連結鎖と混合され、その混合物が、最初のアニーリングステップより低い開始温度による第２のアニーリングに供される。いずれの場合にも、ＤＮＡ折り紙結晶の組立ては、２つの別個の段階、即ち単量体形成と単量体の結晶化とを経る階層的プロセスである。

【0298】

かかる階層的結晶化は、いくつかの潜在的難題をもたらし得る。第一に、単量体の形成と結晶化とが、２つの十分に離れたアニーリング段階で起こる必要があり得る。単量体が完全に形成される前に結晶化が始まると、欠陥のある単量体がある種の良く秩序立った結晶の成長を損なう可能性があり得る。第二に、ＤＮＡ折り紙単量体を結晶に組み込む動力学が、単量体の純然たる大きさ及び単量体の大量の負電荷のために緩徐であり得る。これらの要因は、結晶が妥当なアニーリング時間内に大きいサイズに達することを妨げ得る。第三に、結晶化の成功には、最終的にその系を最低エネルギー状態に至らせ得る単量体の組込み及び解離の繰り返しが関わる何らかのエラー修正が必要であり得る。大きい折り紙単量体では解離速度が遅くなり得るが、これは一部の結晶の欠陥を引き起こし得るか、又は結晶成長を妨げ得るかのいずれかである。

【0299】

本明細書に提供されるＤＮＡブリック結晶は、三次元空間において複雑なＤＮＡ結晶を作成するための新しい展望を明らかにする：結晶化中の高速の動力学を、繰り返し単位の情報の複雑さを損なうことなく達成することができる。標準化された構成要素−ＤＮＡブリックのような−を利用するモジュール式戦略を用いると、繰り返し単位が何千個もの塩基対を含むことができ、３Ｄ空間における複雑な設計が可能となる。結晶は、初めに複数の鎖からなる単位を形成する必要なしに、ＤＮＡブリックが結晶化する間の個々のブリックの組込みを通じて成長する。従って、本発明のモジュール式ＤＮＡブリック結晶では、情報の複雑性及び高速の結晶化動力学の両方が実現される。

【0300】

本発明の合理的に設計された自己集合ＤＮＡ結晶は、機能部分、例えば限定はされないが、タンパク質、核酸、金属粒子、量子ドット等の鋳型化に用いられ得る。かかるボトムアップ方式を用いると、ナノスケール特徴を有するミクロンスケールの周期的材料を製作することができる。この技術はトップダウンパターニングを用いたＤＮＡ結晶の配列を促進し、従ってナノテクノロジーの重要な目標の一つ、即ち効率的なナノスケールＤＮＡ自己集合を、例えばナノフォトニクス及びナノエレクトロニクスなどの適用の強力なトップダウン方式と組み合わせることが達成される。

【0301】

方法及び材料
サンプル調製。Integrated DNA Technology, Inc.又はBioneer CorporationによってＤＮＡ鎖が合成された。構造を組み立てるため、未精製のＤＮＡ鎖を、１０〜８０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補足した０．５×ＴＥ緩衝液（５ｍＭ トリス、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に、終濃度が各鎖につき１００ｎＭ又は２００ｎＭとなるように混合した（５００個より多い鎖を含むナノ構造に関しては、所望の２００ｎＭ濃度を達成するため蒸発ステップを実施した）。

【0302】

アニーリング勾配。次にＰＣＲサーモサイクラーにおいて、８０℃から６０℃への１時間にわたる高速線形冷却ステップ、次に６０℃から２４℃への２４時間又は７２時間線形冷却勾配により、鎖混合物をアニーリングした。これらのアニーリング勾配は、第２の冷却ステップの長さにちなみ、２４時間アニーリング又は７２時間アニーリングと命名した。

【0303】

アガロースゲル電気泳動及びサンプル精製。次にアニーリングしたサンプルを、氷水浴中、２パーセント天然アガロースゲル電気泳動（１１ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び０．００５％（ｖ／ｖ）ＥｔＢｒを補足した０．５×ＴＢＥ緩衝液に調製したゲル）に２時間供した。次に、目標のゲルバンドを切り出し、Freeze ’N Squeezeカラム（Bio-Rad Laboratories, Inc.）に置いた。カラムにおいてマイクロチューブ用乳棒でゲル断片を細かく粉砕し、次にカラムを７０００ｇで５分間遠心した。カラムに通して抽出したサンプルを、ＴＥＭ又はＡＦＭイメージング用に収集した。

【0304】

サンプル調製のロボットオートメーション。複雑な形状の設計を支援し、且つ液体ハンドリングロボット（Bravo、Agilent）を使用して鎖の混合を自動化するように、Python（http://www.python.org/）プログラムを設計した。各形状について、水溶液中１０μＭの各鎖のうち４μＬをピペットで取り、２ｍＬ未満の最終容量となるように混合した（正確な容量は目標形状の構成鎖の数により決定した）。次に混合物を真空遠心乾燥し（Savant Speedvac sc110）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む２００μＬの０．５×ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ロボットピペッティングのラウンド毎に４８個の形状を受け入れ、完了するまでに３〜４日間かかった。

【0305】

ＴＥＭイメージング。イメージングのため、３．５μＬアガロースゲル精製又は未精製サンプルをグロー放電炭素被覆ＴＥＭグリッドに４分間吸着させ、２５ｍＭ ＮａＯＨを含有する２％ギ酸ウラニル水溶液を使用して１分間染色した。８０ｋＶで動作させたJEOL JEM-1400を使用して、イメージングを実施した。

【0306】

ＡＦＭイメージング。Digital Instruments Nanoscope V制御器（Veeco）でSPM Multimodeを使用してＡＦＭ画像を取得した。４０μＬの０．５×ＴＥ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を伴う精製による５μＬの精製し、アニーリングしたサンプルを、新しく劈開したマイカの表面に加え、約２分間放置して吸収させた。時にサンプルの希釈を行い、所望のマイカ表面劈開を達成した。使用したＡＦＭティップは、SNL-10窒化ケイ素カンチレバーチップ（Veeco Probes）における短くて細いカンチレバーであった。

【0307】

結晶成長実験用の方法及び材料
サンプル調製。Integrated DNA Technology, Inc.又はBioneer CorporationによってＤＮＡ鎖が合成された。構造を組み立てるため、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２又は６０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補足した０．５×ＴＥ緩衝液（５ｍＭ トリス、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中１００μＭストックから、未精製のＤＮＡ鎖を等モル化学量論比で可能な限り高い濃度に混合した。

【0308】

アニーリング勾配。次にＰＣＲサーモサイクラーにおいて、８０℃から６０℃への１時間にわたる高速線形冷却ステップ、次に６０℃から２４℃への７２時間又は１６８時間線形冷却勾配により、鎖混合物をアニーリングした。アニーリング勾配は、第２の冷却ステップの長さにちなみ、７２時間アニーリング又は１６８時間アニーリングと命名した。

【0309】

ＴＥＭイメージング。イメージングのため、２．５μＬのアニーリングしたサンプルをグロー放電炭素被覆ＴＥＭグリッド上に２分間吸着させた。次に２５ｍＭ ＮａＯＨを含有する２％ギ酸ウラニル水溶液を使用して、グリッドを１０秒間染色した。８０ｋＶで動作させたJEOL JEM-1400 TEMを使用して、イメージングを実施した。

【0310】

１０ｎｍ金ナノ粒子上へのＤＮＡデコレーション。１０ｎｍ金ナノ粒子上へのチオール化したＤＮＡのコンジュゲーションを、以前記載されたとおり（Sharma, J. et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 7820-7821, (2008)）達成した。典型的な実験では、２０μＬの２．５μＭホスフィン被覆１０ｎｍ金ナノ粒子を、０．２５×ＴＢＥ緩衝液中の０．５μＬの２Ｍ ＮａＮＯ３及び０．６５μＬの１００μＭチオール化ＤＮＡと混合した。反応液を暗所において室温で３６時間インキュベートした。この後、反応液を１％アガロースゲル含有０．５×ＴＢＥ緩衝液に加えた。電気泳動を氷水浴上のゲルボックスにおいて９５Ｖで１時間実行した。乳棒で砕き、続いて「Freeze ’N Squeeze」ＤＮＡゲル抽出スピンカラム（Bio-Rad）を使用して室温で３分間、１０，０００ｒｐｍで遠心することにより、紫色のバンドが回収された。回収されたＤＮＡモールドを、後に使用するため４℃で暗所に保存した。チオール化ＤＮＡの配列は、５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−／３ＴｈｉｏＭＣ３−Ｄ／であった。

【0311】

金ナノ粒子デコレーション。１５μＬの４００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に、０．８μＬ（ＺＸ−４Ｈ×６Ｈ×９６Ｂ−チャネル結晶）又は０．６μＬ（ＸＹ−４Ｈ×４Ｈ×６４Ｂ−直方体結晶）ＤＮＡ試料を添加した。次に、０．２ｕＬの９５ｎＭ １０ｎｍ金ナノ粒子を導入した。５０回ピペッティングした後、反応混合物を暗所に室温で３時間放置した。

【0312】

【表84】

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【0313】

【表85】

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【0314】

【表86】

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【0315】

【表87】

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【0316】

【表88】

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【0317】

【表89】

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【0318】

【表90】

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【0319】

【表91】

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【0320】

【表92】

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【0321】

【表93】

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【0322】

【表94】

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【0323】

【表95】

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【0324】

【表96】

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【0325】

【表97】

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【0326】

【表98】

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【0327】

【表99】

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【0328】

【表100】

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【0329】

【表101】

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【0330】

【表102】

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【0331】

【表103】

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【0332】

【表104】

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【0333】

【表105】

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【0334】

【表106】

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【0335】

【表107】

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【0336】

【表108】

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【0337】

【表109】

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【0338】

【表110】

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【0339】

【表111】

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【0340】

【表112】

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【0341】

【表113】

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【0342】

均等物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載及び例示されているが、当業者は、本明細書に記載される機能を実施し及び／又はその結果及び／又は利点の１つ以上を達成するための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するであろうとともに、かかる変形例及び／又は改良例の各々は、本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であるように意図されること、及び実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成が、本発明の教示が使用される具体的な１つ又は複数の適用に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される具体的な本発明の実施形態の多くの均等物を認識し、又は通常と同じ程度の実験を用いて確認することができるであろう。従って、前述の実施形態が単に例として提供されること、及び添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載され且つ特許請求されるものとは別様に本発明の実施形態が実施され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法それぞれに関する。加えて、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせが、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が互いに矛盾し合わない限り、本開示の発明の範囲内に含まれ得る。

【0343】

本明細書において定義及び使用されるとおりの全ての定義が、辞書的定義、参照によって援用される文献中の定義、及び／又は定義される用語の通常の意味に優先することが理解されるべきである。

【0344】

本明細書に開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、各々の引用の主題に関して参照によって援用され、これは場合によっては、文献の全体を包含し得る。

【0345】

不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、明確にそれに反する旨が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されなければならない。

【0346】

語句「及び／又は」は、ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、そのように結合された要素、即ち、ある場合には連言的に存在し、且つ別の場合には選言的に存在する要素の「一方又は両方」を意味するものと理解されなければならない。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じように、即ちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されなければならない。「及び／又は」の節により具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されるそれらの要素と関係するか、それとも無関係かに関わらず、他の要素が場合により存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する言及は、「〜を含んでいる（comprising）」などのオープンエンド型の用語と併せて使用されるとき、一実施形態ではＡのみを指し（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみを指し（場合によりＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡ及びＢの両方を指す（場合により他の要素を含む）等となり得る。

【0347】

ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、「又は」は、上記に定義するとおりの「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されなければならない。例えば、リスト中で項目を分ける際、「又は」又は「及び／又は」は、包含的である、即ち、複数の要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つ（しかしまた２つ以上も含む）、及び場合により、さらなるリストに載っていない項目を含むものと解釈されなければならない。「〜のうち１つのみ」又は「〜のうち正確に１つ」など、反する旨が明示的に示される用語に限り、又は特許請求の範囲において「からなる（consisting of）」が用いられる場合にのみ、複数の要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指し得る。一般に、本明細書で使用されるとおりの用語「又は」は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「〜のうち１つ」、「〜のうち１つのみ」、又は「〜のうち正確に１つ」が前に付くとき、排他的な選択肢（即ち「一方又は他方で、しかし両方ではない」）を指示するものとのみ解釈されなければならない。「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。

【0348】

ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、１つ以上の要素のリストに関連して語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中にある要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙される一つ一つの要素の少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、且つ要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除するものでないと理解されなければならない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素と関係するか、それとも無関係かに関わらず、場合により存在し得ることも許容する。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（又は等価に、「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、又は等価に、「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの（場合により２つ以上を含む）Ａであり、Ｂが存在しない（及び場合によりＢ以外の要素を含む）ことを指し；別の実施形態では、少なくとも１つ（場合により２つ以上を含む）のＢであり、Ａが存在しない（且つ場合によりＡ以外の要素を含む）ことを指し；さらに別の実施形態では、少なくとも１つ（及び場合により２つ以上を含む）のＡ、且つ少なくとも１つ（場合により２つ以上を含む）のＢ（及び場合により他の要素を含む）を指す等となり得る。

【0349】

また、明確にそれに反する旨が示されない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも、方法のステップ又は行為が記載される順序に限られるわけではないことも理解されなければならない。

【0350】

特許請求の範囲では、並びに上記の明細書では、「〜を含む（comprising）」、「〜を備える（including）」、「〜を担持する（carrying）」、「〜を有する（having）」、「〜を含有する（containing）」、「〜が関わる（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「〜が含まれる（composed of）」などの全ての移行句は、オープンエンド型、即ち、包含するが限定はされないことを意味するものと理解されなければならない。移行句「〜からなる（consisting of）」及び「〜から本質的になる（consisting essentially of）」に限り、米国特許庁（United States Patent Office）の特許審査便覧（Manual of Patent Examining Procedures）第２１１１．０３章に記載されるとおり、それぞれクローズド型又はセミクローズド型移行句であるものとする。

【図1A】

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【図1B】

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【図1C】

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【図1D】

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【図1E】

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【図1F】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図2D】

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【図2E】

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【図2F-2G】

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【図3A】

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【図3B】

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【図3C】

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【図3D】

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【図3E】

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【図4A】

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【図4B】

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【図4C】

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【図4D】

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【図4E】

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【図4F】

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【図4G】

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【図4H】

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【図4I】

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【図5A】

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【図5B】

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【図5C】

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【図6A】

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【図6C】

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【図6D】

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【図6F】

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【図7A】

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【図7B】

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【図8A】

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【図8C】

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【図9A】

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【図9B】

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【図9C】

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【図10A】

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【図10B】

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【図10C】

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【図11】

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【図12A】

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【図12B】

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【図12C】

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【図13A】

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【図13B】

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【図13C】

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【図14A】

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【図14B】

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【図15-1】

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【図15-2】

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【図16A】

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【図16B】

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【図16C】

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【図16D】

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【図16E】

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【図16F】

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【図16G】

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【図17】

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【図18A】

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【図18B】

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【図18C】

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【図19A】

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【図19B】

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【図19C】

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【図19E】

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【図20A】

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【図20B】

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【図20C】

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【図20D】

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【図20E】

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【図20F】

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【図20G】

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【図20H】

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【図20I】

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【図20J】

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【図20K】

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【図20L】

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【図20M】

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【図21A】

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【図21B】

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【図21C】

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【図22A】

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【図22B】

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【図22C】

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【図22E】

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【図23A】

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【図23B】

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【図23F】

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【図23G】

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【図23H】

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【図23I】

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【図23J】

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【図24A-1】

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【図24A-2】

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【図24A-3】

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【図24B】

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【図24C】

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【図24D】

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【図25A】

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【図25B】

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【図25C】

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【図25D】

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【図25E】

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【図25F】

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【図25G】

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【図25H】

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【図26A】

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【図26B】

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【図26C】

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【図26D】

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【図26E】

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【図26F】

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【図26G】

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【図26H】

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【図27A】

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【図27B】

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【図27C】

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【図27D】

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【図27E】

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【図27F】

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【図27G】

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【図27H】

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【図27I】

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【図28A】

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【図28B】

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【図28C】

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【図29】

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【図30】

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【図31】

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【図32A】

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【図32B】

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【図33A】

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【図33B】

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【図33C】

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【図34A】

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【図34B】

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【図34C】

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【図34D】

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【図34E】

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【図34F】

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【図35A】

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【図35B】

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【図35C】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]