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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6598086
(24)【登録日】2019年10月11日
(45)【発行日】2019年10月30日
(54)【発明の名称】バチルス属の新規細菌およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20191021BHJP
A01N 63/02 20060101ALI20191021BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20191021BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20191021BHJP
A01N 25/04 20060101ALI20191021BHJP
C12R 1/07 20060101ALN20191021BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 E
A01N63/02 E
A01P21/00
A01P3/00
A01N25/04 102
C12R1:07
【請求項の数】13
【全頁数】49
(21)【出願番号】特願2017-507440(P2017-507440)
(86)(22)【出願日】2015年7月21日
(65)【公表番号】特表2017-525356(P2017-525356A)
(43)【公表日】2017年9月7日
(86)【国際出願番号】IN2015000294
(87)【国際公開番号】WO2016027279
(87)【国際公開日】20160225
【審査請求日】2017年6月19日
(31)【優先権主張番号】2331/DEL/2014
(32)【優先日】2014年8月16日
(33)【優先権主張国】IN
【微生物の受託番号】MTCC MTCC 5674
(73)【特許権者】
【識別番号】517039634
【氏名又は名称】ディーシーエム シュリラム リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】ドッダ，サントシュ クマー
(72)【発明者】
【氏名】パリハー，ドワーケッシュ シンフ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルマ，パレッシュ クマー
【審査官】
鈴木 優志
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２０１１／０２６２４１６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
米国特許第０６０６００５１（ＵＳ，Ａ）
【文献】
国際公開第９７／００２７４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２００３／０１８６８５２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２００３／００８２７９２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１４／０２８５２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０００−２５３８７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５２１９６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２０１０／０１４３３１６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開昭６２−１３５４９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００７／０５２３５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許第０５６６５３５４（ＵＳ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２００７／００９２４９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
韓国登録特許第１０−１３９０４５７（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】
Falcao et al.，Journal of Applied Microbiology，２０１４年 ６月，Vol.116, No.6，p.1584-1592
【文献】
Martinez-Absalon et al.，Genetics and Molecular Research，２０１２年，Vol.11, No.3，p.2665-2673
【文献】
Kumar et al.，Journal of Basic Microbiology，２０１２年，Vol.52，p.670-678
【文献】
El-Naggar et al.，African Journal of Microbiology Research，２０１４年 １月１５日，Vol.8, No.3，p.286-296
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １／００〜７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＤＷＰＩ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗菌および／または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を示す新規細菌である、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシス。
【請求項2】
抗菌および／または抗真菌活性を示す、請求項１に記載の枯草菌亜種シリラメンシスの培養濾液由来の抽出物。
【請求項3】
請求項１に記載の枯草菌亜種シリラメンシスの純粋培養物。
【請求項4】
生産のプロセスが
ａ．受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシスを、振盪インキュベーター内、３０℃で６０時間、ｐＨ６．８のＴ３培地中で増殖させること、
ｂ．抗菌および／または抗真菌活性を有する抽出物を回収すること
を含む、請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物。
ａ．受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシスを、振盪インキュベーター内、３０℃で６０時間、ｐＨ６．８のＴ３培地中で増殖させること、
ｂ．抗菌および／または抗真菌活性を有する抽出物を回収すること
を含む、請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物。
【請求項5】
前記枯草菌亜種シリラメンシスが好気条件下で増殖される、請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物。
【請求項6】
任意選択により前記培養濾液由来の抽出物を従来の方法を用いて濃縮することを含む、請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物。
【請求項7】
組成物が５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ〜５×１０７ｃｆｕ／ｍｌの細菌濃度で抗菌および／または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を有する、請求項１に記載の枯草菌亜種シリラメンシスを含む組成物。
【請求項8】
組成物が４μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌの抽出物濃度で抗菌および／または抗真菌活性を有する、請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物を含む組成物。
【請求項9】
組成物が抗菌および／または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を有する、請求項１に記載の枯草菌亜種シリラメンシスおよび請求項２に記載の培養濾液由来の抽出物を含む組成物。
【請求項10】
任意選択により１種類以上の抗菌および／または抗真菌ならびに植物生長促進剤を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
任意選択により農業上許容される担体を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、病原性真菌および／または細菌を５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ〜５×１０７ｃｆｕ／ｍｌの有効量の、請求項１に記載の枯草菌亜種シリラメンシスまたは請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項13】
病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌ならびに植物生長促進組成物の調製にいずれの場合にも使用される、請求項１もしくは２に記載の枯草菌亜種シリラメンシスもしくは培養濾液由来の抽出物または請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗菌および／または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を示す、枯草菌亜種シリラメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｓｐ． ｓｈｒｉｒａｍｅｎｓｉｓ）と呼称されるバチルス科に属す新規細菌、抗菌および／または抗真菌活性、タンパク質分解活性、デンプン分解活性を示す新規細菌の単離およびその抽出物の同定、前記新規細菌および／または抽出物を含む組成物、病原性細菌および／または真菌を有効量の新規細菌ならびに／または抗菌性および／もしくは抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物および／または薬剤と接触させることによって病原性細菌および／または真菌の増殖を阻害する方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
地球の大気は、高い光強度、極端な温度変動、低濃度の有機物および水の不足が環境を微生物の増殖に不適とするとしても、空中浮遊微生物と調和していることが知られている。生物材料は、遠隔大陸環境、居住大陸環境および遠隔海洋環境のそれぞれで体積にして全空中浮遊粒子物質の約２０％、２２％および１０％を占め得る。それらのほとんどは土壌、湖沼、動物およびヒトなどの天然源に起源する。さらに、農業慣行、医療部門および産業運用、例えば、下水処理、動物の飼育、発酵プロセス、および食品加工場も環境中に生きた微生物を放出している。
【0003】
細菌は単細胞の原核微生物の大きな範囲を成している。一般に、数ミクロンの長さの細菌は、球菌から桿菌およびらせん菌までにわたる広範な形状を持つ。細菌は地球上に遍在し、土壌、酸性の温泉、放射性廃棄物、水、および地殻の深部、ならびに有機物および動植物の生体で増殖している。バチルスは、桿状、グラム陽性、胞子形成型、好気性または条件的嫌気性の細菌である。ほとんどのバチルスは腐生菌である。各細菌は、熱、低温、放射線、乾燥、および殺菌剤に耐性のある胞子を１つだけ形成する。バチルスは、砂漠の砂、温泉、および北極土壌などの多くの極限生息地を含む広範な生息地で生存を可能とする一連の生理学的能力を示す。バチルス種は好熱性、好冷性、好酸性、好アルカリ性、耐塩性、または好塩性であり得、様々なｐＨ値、温度、および塩濃度で増殖することができる。
【0004】
抗菌因子の生産は、ほとんどの細菌に対して一般的な現象であると思われる。これらの細菌は、広域の古典的抗生物質、有機酸などの代謝副生成物、およびリゾチームなどの細胞溶解物質を含む、見事な一連の細菌防護システムを作り出している。加えて、数種のタンパク質外毒素、および殺菌作用様式を有する生物学的に活性なペプチド部分であるバクテリオシンも生産される。この細菌由来の生物兵器庫は、その多様性および自然界での存在量において注目すべきものである。
【0005】
新規抗菌剤に関する研究は最も重要な分野である。抗菌剤に対する耐性の発達は驚くべき速度で増えている。現解決策は、抗生物質使用に対するより合理的なアプローチの開発および新規抗菌剤の発見を含む。
【0006】
関連性の高い特許１．新規細菌株および真菌病原体を防除する方法（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２０００／０１５７６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
発明の目的本発明の目的は、抗菌および／または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を示す新規細菌を提供することである。
【0009】
本発明の目的は、新規細菌の抽出物を単離および同定することであり、前記抽出物は抗菌および／または抗真菌植物生長促進活性を示す。
【0010】
本発明の目的はまた、抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物または薬剤を提供することであり、前記組成物または薬剤は、新規細菌および／または新規細菌の抽出物を含む。
【0011】
本発明の別の目的は、病原性細菌および／または真菌を有効量の新規細菌および／または抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物および／または薬剤と接触させることにより病原性細菌および／または真菌の増殖を阻害する方法を提供することであり、前記組成物または薬剤は、新規細菌および／または新規細菌の抽出物および／または新規細菌とその抽出物の混合物を含む。
【0012】
本発明の他の目的は、病原性細菌および／または真菌の増殖を阻害するための新規細菌、抗菌性および／または抗真菌性組成物または薬剤の使用を提供することであり、前記組成物または薬剤は、新規細菌および／または新規細菌の抽出物および／または新規細菌とその抽出物の混合物を含む。
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の概要本発明の態様は、抗菌性および／または抗真性の代謝産物または薬剤の生産に有用な単離された新規細菌を提供することである。
【0014】
本発明の一態様は、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｓｐ． ｓｈｒｉｒａｍｅｎｓｉｓ）と呼称されるバチルス種に属す細菌の新規な形態を提供することである。特に、本発明に開示される新規細菌は、明瞭な抗菌および／または抗真菌特性ならびに植物生長促進特性を示し得る。
【0015】
本発明の別の態様は、抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物または薬剤の生産のためのプロセスを提供することであり、前記組成物または薬剤は、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／または枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む。
【0016】
枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含む組成物が提供される。前記組成物は、薬学上許容される賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含み得る。
【0017】
枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含有する組成物が提供される。また、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の水性抽出物を含む組成物も提供される。前記組成物は、薬学上許容される賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含み得る。
【0018】
病原性細菌および／または真菌を有効量の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）または枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物と接触させることによって病原性細菌および／または真菌の増殖を阻害するための方法が提供される。前記枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／または枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物は、任意選択により１以上の付加的抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の薬剤を含有し得る。
【0019】
本発明では、病原性細菌および／または真菌の増殖を阻害するための抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物または薬剤の調剤における、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／または枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物の使用が提供される。
【0020】
発明の詳細な説明本発明は、枯草菌亜種シリラメンシスと呼称され、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有するバチルス科に属す新規細菌ならびに抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物または薬剤を生産する方法を提供し、前記組成物または薬剤は、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／または枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む。
【0021】
本発明はまた、細菌および／または真菌を有効量の新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／または前記新規細菌もしくはその抽出物を含む組成物と接触させることによって病原性細菌および／または真菌を阻害する方法を提供する。
【0022】
本発明はまた、病原性細菌および／または真菌を阻害するための、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）、ならびに／または新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）および／もしくは枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む抗菌性および／もしくは抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物もしくは薬剤の使用を提供する。
【0023】
新規枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）は、好適な増殖培地中、有利な条件下で枯草菌亜種シリラメンシスを培養することによる、抗菌性および／または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物／調製物／薬剤の大量生産のために利用され得る。
【0024】
深く、慎重な研究により、本発明者らは驚くことに、新規薬剤を生産し得る単離および培養された新規細菌を見出した。詳細な実験的研究により、本発明者らはまた、前記新規微生物から前記新規薬剤を生産する方法も発明した。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図１−枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の単離および精製を示すプレート（Ａ）菌糸を伴う細菌増殖を示す母培養プレート；（Ｂ）（Ａ）の細菌コロニーからの枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の精製。矢印は推定細菌コロニーを示す。
【図11】図１１−（Ａ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）コロニーおよび（Ｂ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液により示される抗菌および／または抗真菌活性を示す培養プレート。フザリウム・オキシスポルム培養物を試験真菌として使用した。
【図12】図１２−試験管希釈法による抗菌および／または抗真菌化合物のＭＩＣアッセイの結果を示す写真。１〜Ｃ−２：種々の濃度の抗菌および／または抗真菌剤を含有するＰＤＢ中でインキュベートした後のフザリウム・オキシスポルム胞子の写真（光学顕微鏡下で観察）。１〜２８（１：１〜１：１００希釈）、Ｃ−１−抗菌および／または抗真菌剤（未精製）中の胞子；Ｃ−２−対照（抗菌および／または抗真菌剤不含のＰＤＢ培養液中の胞子）。
【図13】図１３−寒天拡散法による抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣアッセイの結果を示す写真。１〜Ｃ−２：試験プレート上で増殖しているフザリウム・オキシスポルム菌糸の写真、１〜２８ 抗菌および／または抗真菌剤の１：１〜１：１００（ｖ／ｖ）希釈液、Ｃ１−抗菌および／または抗真菌剤（未精製）を含有するウェル；Ｃ２−ＰＤＢを含有する対照ウェル；Ｃ３−７０％飽和硫酸アンモニウムを含有する対照ウェル。
【図14】図１４−アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の胞子に対する抗菌および／または抗真菌剤の効果を示す写真。（Ａ、ＢおよびＣ）ＤＢ培地で正常な発芽を示すアスペルギルス・ニガーの胞子；（Ｄ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抽出物を含有するＰＤＢ培地で発芽できなかったアスペルギルス・ニガーの胞子。
【図15】図１５−フザリウム・オキシスポルムに対する細胞溶解液の抗菌および／または抗真菌活性を示すプレート；（１）リゾチームのみを含有するウェル（真菌フザリウム・オキシスポルムに対するリゾチームの効果を確認するため）および（２）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の細胞溶解液を含有するウェル。
【図16】図１６−多様な種類の植物病原性真菌および細菌種に対する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体／抽出物の抗菌および／または抗真菌活性のアッセイを示すプレート。Ａ．フザリウム・オキシスポルム、Ｂ．サロクラジウム・オリゼ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ Ｃ．トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄａｅ）、Ｄ．コレトトリクム・カプシシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉｉ）、Ｅ．エクセロヒルム・ツルシクム（Ｅｘｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、Ｆ．リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉｉ）、Ｇ．マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、Ｈ．キサントモナス・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）。
【図17】図１７−フザリウム・オキシスポルムの存在下でのイネ種子の発芽に対する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抽出物の抗菌および／または抗真菌活性の結果を示すプレート。（Ａ）真菌フザリウム・オキシスポルム胞子で処理したイネ種子；（ＢおよびＣ）真菌フザリウム・オキシスポルムおよび枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抽出物で処理したイネ種子。
【図18】図１８−様々な植物種に対して枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）に病原性がないことを示すための実験の結果を示すプレート。（Ａ）イネ、（Ｂ）ワタ、（Ｃ）タバコ、（Ｄ）トウモロコシ、および（Ｅ）トマト。
【図19】図１９−生物防除剤としての枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の作用を示すための実験の結果を示す写真。（Ａ）リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）（ＮＦＣＣＩ−３１９４）真菌を感染させたトマト植物。（Ｂ）リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）および枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を伴うトマト植物、ならびに（Ｃ）対照トマト植物（リゾクトニア・ソラニ真菌および枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を伴わない。
【図20】図２０−（１）ペニシリウム・オクサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）（ＮＦＣＣＩ−１９９７）真菌コロニー、および（２）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）純粋コロニーを示すプレート。
【図21】図２１−抗菌／抗真菌剤としての枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の様々な配合剤でコーティングしたトウモロコシ種実を示すプレート。１．（対照−１）真菌病原体および生物防除剤を含まない配合剤で処理した種実；２．（対照−２）生物防除剤を含まない配合剤で処理した種実；３．（対照−３）市販の殺真菌剤「カルベンダジムＷＰ５０」を含む配合剤で処理した種実；４ａ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０４ｃｆｕ）を含む配合剤で処理した種実；４ｂ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０５ｃｆｕ）を含む配合剤で処理した種実；４ｃ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０６ｃｆｕ）を含む配合剤で処理した種実；４ｄ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）を含む配合剤で処理した種実、および５．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）のみを含む配合剤で処理した種実。
【図22】図２２−２週間のインキュベーション後の生物防除活性の結果を示すプレート。１．（対照−１）真菌病原体および抗真菌剤を含まない配合剤−１で処理した種実；２．（対照−２）生物防除剤を含まない配合剤−２で処理した種実；３．（対照−３）市販の殺真菌剤「カルベンダジムＷＰ５０」を含む配合剤−３で処理した種実；４ａ．枯草菌亜種シリラメンシス（５×１０４ｃｆｕ）を含む配合剤−４ａで処理した種実；４ｂ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０５ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｂで処理した種実；４ｃ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０６ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｃで処理した種実；４ｄ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｄで処理した種実、および５．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）のみを含む配合剤−５で処理した種実。
【図23】図２３−４週間のインキュベーション後の生物防除活性の結果を示すプレート。１．（対照−１）真菌病原体および抗真菌剤を含まない配合剤−１で処理した種実；２．（対照−２）生物防除剤を含まない配合剤−２で処理した種実；３．（対照−３）市販の殺真菌剤「カルベンダジムＷＰ５０」を含む配合剤−３で処理した種実；４ａ．枯草菌亜種シリラメンシス（５×１０４ｃｆｕ）を含む配合剤−４ａで処理した種実；４ｂ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０５ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｂで処理した種実；４ｃ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０６ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｃで処理した種実；４ｄ．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）を含む配合剤−４ｄで処理した種実、および５．枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）のみを含む配合剤−５で処理した種実。
【図24】図２４−様々なヒト病原性真菌種に対する抗真菌および／または抗菌活性のアッセイ。Ａ、ＢおよびＣ−ペニシリウム種に対する抗真菌および／または抗菌活性のアッセイ。（Ａ）ペニシリウム種真菌コロニー、（Ｂ）菌糸、および（Ｃ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液の効果。Ｄ、ＥおよびＦ−アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）に対する抗真菌および／または抗菌活性のアッセイ。（Ｄ）真菌コロニー、（Ｅ）菌糸、および（Ｆ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液の効果。Ｇ、ＨおよびＩ−アスペルギルス・ニガーに対する抗真菌および／または抗菌活性のアッセイ。（Ｇ）真菌コロニー、（Ｈ）菌糸、および（Ｉ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液の効果。Ｊ、ＫおよびＬ−皮膚感染を引き起こす未知の真菌に対する抗真菌および／または抗菌活性のアッセイ。（Ｊ）真菌コロニー、（Ｋ）分生子、および（Ｌ）枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液の効果。
【発明を実施するための形態】
【0026】
新規細菌の単離および同定本発明者らは、空中菌叢に関する試験を行いながら、ハイデラバードおよびパタンチャール（テランガーナ州、インド）の１８の異なる場所から大気サンプルを採取した。培地（Ｔ３培地、Ｔｒａｖｅｒｓら， １９８７）を含むディスポーザブルペトリプレートを研究室で作製し、様々な場所で大気に曝した。曝したプレートを密閉し、ラボインキュベーターにて３０℃でインキュベートした。パタンチャール地方で大気に曝したプレートの１つで、菌糸に取り囲まれた細菌コロニーが見られた（図１Ａ）。インキュベーションを続けてもクリアランスゾーンは維持され、菌糸の増殖はクリアランスゾーン周辺に限定されたままであった。このコロニー由来の微生物に対して、生物学の標準法を用いることにより精製を行った（図１Ｂ）。個々のコロニーを一般的な真菌フザリウム・オキシスポルムに対して試験した（図２）。
【0027】
これらのコロニーのうちの１つは真菌増殖の阻害を示し、クリアランスゾーンが見られた（図２）。コロニー由来の細菌の顕微鏡観察により、桿状の運動性細菌が明らかになった（図５）。培養培地中で６日のインキュベーション後に、細菌は胞子を生産した。この細菌コロニーは、粘液状、隆起型、円形、平滑、かつ、クリーム色〜灰白色であり（図４）、菌体は不定グラム染色を示した（図５）。
【0028】
炭水化物発酵、カタラーゼ活性、酸化発酵試験、デンプン加水分解、硫化水素生産試験、オキシダーゼ活性試験、デオキシコール酸寒天試験を含む一定の範囲の生化学的試験を行った。これらの試験の結果から、前記細菌がカタラーゼ陽性であり、アミラーゼ活性を有し、強い好気性で、硫化水素を生産せず、オキシダーゼ陽性であり、かつ、グラム不定であることが確認された。
【0029】
細菌の同定のために、１６Ｓ ＤＮＡシーケンシングおよびＦＡＭＥ分析を行った。両試験の結果は、これらの細菌は、枯草菌亜種サブティリスと１６Ｓ ＤＮＡ配列に０．３７％の差異および０．８２７のＦＡＭＥ類似度指数；バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）と１６Ｓ ＤＮＡ配列に０．８４％の差異および０．７４９のＦＡＭＥ類似度指数を示していることを示した。よって、これらの結果は、この細菌が枯草菌およびバチルス・アトロファエウスと近縁であるが、ＡＴＣＣコレクションのカタログの細菌種のいずれとも同一でないことを示唆する。
【0030】
１６Ｓ ＤＮＡ配列比較の結果
【0031】
【表1】
【0032】
ＦＡＭＥ分析比較の結果
【0033】
【表2】
【0034】
単離された細菌は、バチルス属の亜種の新規メンバーである。細菌命名法の慣例に従い、新規細菌種は、枯草菌亜種シリラメンシスと命名した。この細菌はＩＭＴＥＣＨ、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＭＴＣＣ）に寄託されている。この新規な種の寄託番号は（ＭＴＣＣ−５６７４）である。
【0035】
本発明により提供される受託／寄託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌の特徴本細菌は、２．４５×０．８８μｍの寸法の桿状、運動性、胞子形成、グラム不定であり；コロニーは、初期段階では平滑、粘液状、灰白色〜クリームがかっているが、長期インキュベーションではしわ型に変わる。細菌は、培地中の栄養が欠乏すると胞子となり、通常、この胞子形成の過程は、３０℃および２００ｒｐｍでの振盪下、２５×１５０ｍｍ培養管にて、１００μｌの５×１０８菌体接種物を含有する１０ｍｌ培地中、４日のインキュベーションを要する。
【0036】
受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスは、抗菌および／または抗真菌活性を示す。受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物は、抗菌および／または抗真菌活性を示す。この細菌の潜在的適用および使用の範囲は広い。
【0037】
本発明は、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスから抗菌および／または抗真菌抽出物を生産する方法を提供する。
【0038】
抗菌および／または抗真菌剤の生産および単離受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシスの増殖のための培養培地の組成は次の通りである
１．トリプトン ：０．３２％（ｗ／ｖ）
２．トリプトース ：０．２４％（ｗ／ｖ）
３．酵母抽出物 ：０．１８％（ｗ／ｖ）
４．ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ：０．０４４Ｍ
５．Ｎａ２ＨＰＯ４ ：０．０６２Ｍ
６．ＭｎＣｌ２ ：０．０００５％（ｗ／ｖ）
ｐＨ＝６．８
【0039】
１．培地は付属書類−Ｉ（Ｉ）に示される方法に従って調製し、１００ｍｌアリコートを５００ｍｌの三角フラスコに移した。培地は１２１℃で１５分間オートクレーブにかけることにより滅菌した。２．各フラスコに枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の単一の純粋コロニーを接種し、３０℃、２００ｒｐｍで６０時間インキュベートした。
【0040】
培養培地からの抗菌および／または抗真菌剤の単離Ｔ３培養液で６０時間、細菌を増殖させた後、その培養物を４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、０．２２μｍディスクフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濾過した。この濾液を、抗菌および／または抗真菌活性を試験するための詳細な実験のために適当な保存条件下で保存した。
【0041】
本発明は特に、新規微生物、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシス、ならびに前記新規細菌および／もしくはその抽出物または新規細菌および／もしくはその抽出物の混合物から抗菌および／または抗真菌組成物を生産するための方法を提供する。
【0042】
本発明の一実施形態は、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する、抗菌および／または抗真菌活性を示す枯草菌亜種シリラメンシスに属す単離された新規細菌を提供する。
【0043】
本発明の一実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する枯草菌亜種シリラメンシスと呼ばれる新規細菌が提供される。
【0044】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの純粋培養物が提供される。
【0045】
本発明の一実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物が提供され、前記抽出物は抗菌および／または抗真菌活性を示す。
【0046】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物が提供され、抗菌および／または抗真菌活性を示す抽出物は水性抽出物である。本発明のさらに別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物の生産のためのプロセスが提供され、前記プロセスは、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを栄養培地で増殖させること、および従来の方法を用いて抗真菌性を有する抽出物を回収することを含む。
【0047】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物の生産のためのプロセスが提供され、前記プロセスは、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを好気条件下で増殖させることを含む。
【0048】
本発明のさらに別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物の生産のためのプロセスが提供され、前記プロセスは、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを栄養培地で増殖させること、抗菌および／または抗真菌活性を有する抽出物を回収すること、および任意選択により、前記抽出物を従来の方法を用いて濃縮すること含む。
【0049】
本発明の一実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを含む組成物が提供され、前記組成物は抗菌および／または抗真菌活性を有する。
【0050】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物を含む組成物が提供され、前記組成物は抗菌および／または抗真菌活性を有する。
【0051】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスおよび受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物を含む組成物が提供され、前記組成物は抗菌および／または抗真菌活性を有する。
【0052】
本発明の一実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスおよび／もしくは前記新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物、または任意選択により１種類以上の抗菌および／または抗真菌剤を含むそれらの組合せを含む組成物が提供される。
【0053】
本発明の別の実施形態では、任意選択により１種類以上の抗菌および／または抗真菌剤を含む受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物を含む組成物が提供される。
【0054】
本発明のさらに別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスと任意選択により１種類以上の抗菌および／または抗真菌剤を含むその抽出物との組合せを含む組成物が提供される。
【0055】
本発明の一実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスまたは受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物またはそれらの組合せを含み、任意選択により農業上または薬学上許容される担体を含む組成物が提供される。
【0056】
本発明の別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを含み、任意選択により農業上または薬学上許容される担体を含む組成物が提供される。
【0057】
本発明のさらに別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物を含有し、任意選択により農業上または薬学上許容される担体を含む組成物が提供される。
【0058】
本発明のさらに別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスと前記新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物との組合せを含み、任意選択により農業上許容される担体を含む（付属書類ＩＩＩを参照）組成物が提供される。
【0059】
本発明の一実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、前記病原性真菌および／または細菌を有効量の受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスまたは前記新規細を含む組成物またはその抽出物またはそれらの組合せと接触させることを含む方法が提供される。
【0060】
本発明の一実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、前記病原性真菌および／または細菌を有効量の受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスと接触させることを含む方法が提供される。
【0061】
本発明の別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、前記病原性真菌および／または細菌を有効量の、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを含む組成物と接触させることを含む方法が提供される。
【0062】
本発明のさらに別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、前記病原性真菌および／または細菌を有効量の、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む組成物と接触させることを含み、前記抽出物は抗菌および／または抗真菌活性を有する、方法が提供される。
【0063】
本発明のさらに別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための方法であって、前記病原性真菌および／または細菌を有効量の、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含む組成物とおよび前記新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物接触させることを含み、前記抽出物が抗菌および／または抗真菌活性を有する、方法が提供される。
【0064】
本発明の一実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌組成物の調製のための、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスまたは前記新規細菌もしくはその抽出物もしくはそれらの組合せを含む組成物の使用が提供される。
【0065】
本発明の別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌組成物の調製のための、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの使用が提供される。
【0066】
本発明の別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌組成物の調製のための、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含む組成物の使用が提供される。
【0067】
本発明の別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌組成物の調製のための、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【0068】
本発明の別の実施形態では、病原性真菌および／または細菌の増殖を阻害するための抗菌および／または抗真菌組成物の調製のための、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物前記新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスの抽出物を含む組成物の使用が提供される。
【0069】
別の実施形態では、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスを含む薬学上および農業上有効な組成物が提供される。
【0070】
別の実施形態では、新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抽出物を含む、薬学上および農業上有効な組成物が提供される。
【0071】
本発明のさらに別の実施形態では、前記有効組成物を、受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規細菌である枯草菌亜種シリラメンシスから生産するための方法が提供される。
【0072】
本発明のさらに別の実施形態では、前記組成物／抽出物の生産に必要な工程および時間は、最短期間かつ前記化合物の最大回収率で維持される。
【0073】
本発明の他の利点または利益細菌の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）はまた、抗菌および／または抗真菌剤とともに、高温、すなわち１２１℃に１５分間曝した後でも活性がある強力な好熱性プロテアーゼおよびアミラーゼも生産する。
【0074】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。以下の実施例は、開示の研究を例示することを意図し、本発明の範囲に限定的に何らかの制限を適用するものではない。当業者は、本明細書に記載の特定の物質に対する等価な置換、または対応する改良は本発明の範囲内であると見なされることを理解するであろう。
【0075】
詳細な方法を以下の実施例で説明する：本研究で使用した方法は微生物学において周知であり、個々のパラメーターは異なり、本試験に関して最適化されている。
【0076】
実施例１１．１ 大気サンプルの採取および予備スクリーニング
大気サンプルの採取は、ハイデラバードおよびパタンチャール（テランガーナ州、インド）の種々の場所で行った。Ｔ３培地を含むディスポーザブルペトリプレートを研究室で作製し、種々の場所で大気に曝した。曝したプレートを密閉し、ラボインキュベーターにて３０℃でインキュベートした。パタンチャール地方で大気に曝したプレートの１つで、菌糸に取り囲まれた細菌コロニーが見られた。
【0077】
１．２ 抗菌および／または抗真菌活性に関する大気サンプルの予備スクリーニングインキュベーションを続けてもクリアランスゾーンは維持され、菌糸の増殖はクリアランスゾーン周辺に限定されたままであった。このコロニー由来の微生物に対して、生物学の標準法を用いることにより精製を行った（図１Ｂ）。個々のコロニーを一般的な真菌フザリウム・オキシスポルムに対して試験した（図２）。コロニーの１つが真菌増殖およびクリアランスゾーンの阻害を示した（図２）。
【0080】
実施例２２．１ 新規微生物の特性評価および同定
２．１．１ 受託番号（ＭＴＣＣ−５６７４）を有する新規単離株枯草菌亜種シリラメンシスの特性評価
炭水化物発酵、カタラーゼ試験、酸化−発酵試験、デンプン加水分解、硫化水素生産試験、オキシダーゼ活性試験を含む一定の範囲の生化学的試験を行った。これらの試験の結果から、前記細菌がカタラーゼ陽性、アミラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、かつ、強い好気性であることが確認された。
【0081】
２．１．１．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）−コロニー形態枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）のコロニーは、粘液状、隆起型、円形、平滑、かつ、クリーム色〜灰白色である（図４）。
【0082】
２．１．１．２ 培養の特徴枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）は、３０℃（１５℃から５５℃まで増殖可能）で最適増殖を示す。それは好気性細菌であるので、その増殖に十分な酸素を必要とし、培養液中での培養に連続的振盪を要する。
【0084】
２．１．１．３．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）と枯草菌お９よびバチルス・アトロファエウスとのコロニー増殖および形態の比較
【0085】
【表3】
【0086】
２．１．１．４ カタラーゼ試験材料
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の培養試験管
・過酸化水素
【0087】
方法・ＬＢ培地を含む３本の試験管に「試験」、「陽性対照」および「陰性対照」と表示し、これらの試験管に白金耳１杯の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）をそれぞれ接種した。３０℃で２４時間のインキュベーション後に、全ての試験管に数滴の過酸化水素を加え、泡の生成を観察した。
【0089】
２．１．１．５ デンプン加水分解材料
・草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液
・デンプン寒天プレート
・ヨウ素
・インキュベーター
【0090】
方法デンプン寒天培地は付属書類−Ｉ（ＶＩ）に示す方法に従って調製した。デンプン寒天培地を含むプレート内に等距離で２つのウェルを作り、「試験」および「陰性対照」と表示した。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液および無菌蒸留水の各５００μｌアリコートを「試験」および「陰性対照」と表示したウェルに分注した。このプレートを５０℃で４時間インキュベートした。
【0091】
結果４時間のインキュベーション後に試験ウェルを取り囲む青色が消え、このことは枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液がデンプン分解活性を有することを示す。対照ウェルを取り囲む領域では青色の変化は見られなかった（図７）。
【0092】
２．１．１．６ Ｏ／Ｆ（酸化−発酵）試験材料
・Ｈｕｇｓｈ ＬｅｉｆｓｏｎのＯＦ基本培地
・試験管
・大腸菌培養物
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
・インキュベーター
【0093】
方法Ｈｕｇｓｈ ＬｅｉｆｓｏｎのＯＦ基本培地（ＯＦＢＭ）（付属書類−Ｉ（ＶＩＩ））を含む３本の試験管を「陰性対照」、「陽性対照」および「試験」と表示し、これらの試験管に白金耳１杯のアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌および枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）をそれぞれ接種した。これらの試験管を３０℃で４８時間インキュベートし、変色を観察した。
【0094】
結果これらの観察から、試験生物（枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）は、培地内の深部では炭水化物を発酵しなかったので、偏性好気性であると結論付けられた。培地の表面では酸素が利用可能であるためにいくらかの変色が見られた。一方、大腸菌は培地内の深部で極めてよく増殖し、炭水化物を発酵し（気体の生成と培地の変色の両方）、このことは大腸菌が条件的嫌気性菌であることを示す（図８）。陰性対照では、気体の発生も変色も見られなかった。
【0095】
２．１．１．７ 硫化水素生産試験材料
・ＳＩＭ（Ｓｕｌｆｉｄｅ Ｉｎｄｏｌｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）培地
・培養試験管
・大腸菌培養物
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
・インキュベーター
【0096】
方法ＳＩＭ［ｄｏｌｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ、｛付属書類−Ｉ（ＶＩＩ）｝］培地を含む試験管を「陰性対照」および「試験」と表示し、これらの試験管に白金耳１杯の大腸菌および枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）をそれぞれ接種し、３０℃で２４時間インキュベートし、変色を観察した。
【0098】
２．１．１．８ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の増殖に及ぼすｐＨの影響３．４〜１１．０（酸性〜塩基性）の範囲の種々のｐＨ値に調整した標準培養培地（ＬＢ）を含む培養試験管を、標準条件下での枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の増殖のために使用した。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の増殖は６．４〜７．２のｐＨ範囲で見られ、最適ｐＨは７．０であることが判明した。
【0099】
２．１．１．９ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の抗生物質感受性試験２４時間経過した枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養物をＴ３寒天の表面に拡げた。各抗生物質の表示をしたこれらＴ３寒天プレートの表面に種々の抗生物質ディスクを置いた。これらのプレートを３０℃で２４時間インキュベートした。
【0100】
表−１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）ＲＥＳ−耐性、ＩＮＴ−中間、ＳＥＮ−感受性の抗生物質感受性の観察
【0101】
【表4】
【0102】
結果これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）は、抗生物質−アンピシリン、カルベニシリン、カナマイシン、エンロフロキサシン、リンコマイシン、アモキシシリン、クリンダマイシン、ネオマイシン、アジスロマイシンに耐性であると結論付けられた。試験細菌は、ゲンタマイシン、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｉｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｉｃｉｎ）、ノボビオシン、スルフイソキサゾール、セファロチン、クロラムフェニコール、セフトリアキソンおよびバシトラシンに感受性であり、オキサシリン、アミカシン、ストレプトマイシンおよびエリスロマイシンには中間の耐性を示した。
【0103】
２．１．２ 新規単離株である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の同定細菌の同定のため、１６Ｓ ＤＮＡシーケンシングおよびＦＡＭ分析を行った。両試験の結果は、この細菌が枯草菌亜種サブティリスと１６Ｓ ＤＮＡ配列に０．３７％の差異および０．８２７のＦＡＭＥ類似度指数；バチルス・アトロファエウスと１６Ｓ ＤＮＡ配列に０．８４％の差異および０．７４９のＦＡＭＥ類似度指数を示していることを示した。よって、これらの結果は、この細菌が枯草菌およびバチルス・アトロファエウスと近縁であるが、ＡＴＣＣコレクションのカタログの細菌種のいずれとも同一でないことを示唆する。
【0104】
２．１．２．１ １６Ｓ ＤＮＡ配列比較の結果
【0105】
【表5】
【0106】
２．１．２．２ ＦＡＭＥ分析比較の結果
【0107】
【表6】
【0108】
単離された細菌は、バチルス属の新規メンバーである。細菌命名法の慣例に従い、新規細菌種は、枯草菌亜種シリラメンシスと命名した。この細菌はＩＭＴＥＣＨ、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＴＣＣ）に寄託されている。この新規な種の寄託番号は（ＭＴＣＣ−５６７４）である。
【0109】
実施例３３．１ 抗菌および／または抗真菌剤の生産およびスクリーニング
３．１．１ 抗菌および／または抗真菌剤生産
材料
・Ｔ３培養液−１Ｌ
・三角フラスコ−２Ｌ容
・カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）接種物
・振盪インキュベーター（温度３０℃および振盪２００ｒｐｍに設定）
【0110】
方法Ｔ３培養液は付属書類−Ｉ（１）に記載の方法に従って調製した。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の培養物１ｍｌを無菌Ｔ３培養液に接種し、振盪インキュベーターにて２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で６０時間インキュベートした。Ｔ３培養液中、６０時間、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を増殖させた後、培養培地を１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過して残りの菌体から分離した。濾液を４℃で維持した。
【0111】
３．１．２ 上記工程３．１．１で回収した培養濾液の抗菌および／または抗真菌活性のスクリーニング材料
・抗菌および／または抗真菌剤を含有する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の培養濾液
・ＰＤＡプレート
・試験真菌フザリウム・オキシスポルム
・インキュベーター
【0112】
方法濾液中の抗菌および／または抗真菌剤の活性を試験するために、ＰＤＡ寒天プレートの一方のコーナーにウェルを作り、５００μｌの濾液をそのウェルに入れた。同じＰＤＡ寒天プレートの他方のコーナーに白金耳１杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で５日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する濾液の阻害活性を、ウェル周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
【0113】
結果ウェルの周囲には１４ｍｍの透明な阻害ゾーンが見られ、これは抗菌および／または抗真菌剤の生産に用いた方法が最適であることを示唆する。
【0114】
３．２ 抗菌および／または抗真菌剤の特性評価抗菌および／または抗真菌活性を生じる薬剤の性質を確認するために、枯草菌亜種シリラメンシスに関連する抗菌および／または抗真菌活性を検討した。
【0115】
材料・Ｔ３培養液−１Ｌ
・三角フラスコ−２Ｌ容
・カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）接種物
・振盪インキュベーター
【0116】
方法Ｔ３培養液は付属書類−Ｉ（１）に記載の方法に従って調製した。２４時間経過した枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の１ｍｌアリコートを無菌Ｔ３培養液に接種し、振盪インキュベーターにて２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で６０時間インキュベートした。Ｔ３培養液中、６０時間、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を増殖させた後、培養培地を１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過して残りの菌体から分離した。
【0117】
３．２．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を用いた抗菌および／または抗真菌アッセイこれらの菌体による抗菌および／または抗真菌剤の活性を試験するために、Ｔ３寒天プレートの一方のコーナーに白金耳１杯の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を接種し、同じＴ３寒天プレートの他方のコーナーに白金耳１杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で５日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する菌体の阻害活性を、菌体コロニー周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
【0118】
結果菌体コロニーの周囲には１４ｍｍの透明な阻害ゾーンが見られ（図１１Ａ）、これは抗菌および／または抗真菌剤の生産に用いた方法が最適であることを示唆する。菌体により分泌された活性化合物が培養培地に拡散するようになり、その結果、菌体コロニーから離れてクリアランスゾーンが生じることを示唆する。
【0119】
３．２．２ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液を用いた抗菌および／または抗真菌アッセイ濾液中の抗菌および／または抗真菌剤の性質を試験するために、５００μｌの濾液をそのウェルに入れた。同じＰＤＡ寒天プレートの対角の端に白金耳１杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で５日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する濾液の阻害活性を、ウェル周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
【0120】
結果ウェルの周囲には１４ｍｍの透明な阻害ゾーン（図１１Ｂ）が見られ、これは濾液が抗菌および／または抗真菌活性を保持し、従って、活性化合物が菌体外の培養培地中に分泌されることを示すということを示唆する。
【0121】
３．３ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣの決定３．３．１ 抗菌および／または抗真菌剤の凍結乾燥
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の培養濾液
・硫酸アンモニウム
・凍結乾燥機
【0122】
方法抗菌および／または抗真菌剤を３．１．１で説明した方法により生産および精製した。培養濾液の８００ｍｌアリコートを３８２．１８ｇの硫酸アンモニウムと７０％（ｗ／ｖ）飽和で混合し（Ｊｉｎｇら，２００９の改変プロトコール）、溶液を４℃で一晩撹拌することにより穏やかに混合した。この懸濁液を４℃にて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。このようにしてえられたペレットを凍結乾燥機で２４時間凍結乾燥させ、乾燥したペレットを室温で保存した。
【0123】
３．３．２ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣ方法
３．３．２．１ 試験管希釈法
３．３．２．２ 寒天拡散法
凍結乾燥抗菌および／または抗真菌剤の保存溶液の調製
保存溶液は、抗菌および／または抗真菌剤の１ｇの凍結乾燥粉末を５０ｍｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かすことにより調製した。保存溶液の終濃度は２０μｇ／μｌに調整した。この保存溶液を、ＰＤＢ培地を用い、表−１に示されるような種々の比率で希釈液を作製するために使用した。
【0124】
３．３．２．１ 試験管希釈法材料
・１．５ｍｌ試験管
・ＰＤＢ培地
・抗菌および／または抗真菌剤保存液
・フザリウム・オキシスポルム胞子懸濁液
【0125】
方法抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣアッセイは、１．５ｍｌ試験管で行った。１０μｇ／μｌ（１：１）〜１９８ｎｇ／μｌ（１：１００）の範囲の抗菌および／または抗真菌剤の種々の希釈液をＰＤＢ培地（表−２）中で調製した。ＭＩＣアッセイは、フザリウム・オキシスポルムに対して、３０μｌ（５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）の胞子懸濁液を全ての試験管に加えることにより行い、１８０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で２日間インキュベートした。
【0126】
３つの対照を用い、１つ目は非希釈抗菌および／または抗真菌剤保存液を用い、２つ目はＰＤＢ中７０％硫酸アンモニウムを用い、３つ目はＰＤＢのみを用いた。これら３本の試験管の培地に３０μｌ（５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）のフザリウム・オキシスポルム胞子懸濁液を接種し、１８０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で２日間インキュベートした。
【0127】
３．３．２．２ 寒天拡散法材料
・ＰＤＡ（バレイショデキストロース寒天）プレート
・ＰＤＢ（バレイショデキストロース培養液）培地
・抗菌および／または抗真菌剤保存液
・フザリウム・オキシスポルム
【0128】
方法凍結乾燥枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣアッセイはまた寒天拡散法によっても行った。ＰＤＡプレートに等距離で各９ｍｍ径の４つのウェルを作った。１０μｇ（１：１）〜１９８ｎｇ（１：１００）の範囲の抗菌および／または抗真菌剤の種々の希釈液をＰＤＢ（表−３）中で調製した。各希釈溶液の２００μｌアリコートを、各希釈率を表示したウェルに入れた。試験真菌フザリウム・オキシスポルムをこのＰＤＡ培地の中心に接種し、これらのプレートを２８℃で４日間インキュベートした。
【0129】
１つ目は非希釈抗菌および／または抗真菌剤保存液を含有するもの、２つ目はＰＤＢ培養液のみを含有するもの、３つ目はＰＤＢを７０％硫酸アンモニウムとともに含有するものの、３つの対照を含むプレートを対照として使用した。この活性はウェルを取り囲む阻害ゾーンのミリメートルとして測定した。
【0130】
結果試験管希釈法（図１２）
これらのサンプルを４８時間のインキュベーション後に光学顕微鏡下で胞子発芽に関して観察した。胞子は、抗菌および／または抗真菌剤を１：１、１：２、１：３および１：４の比率で含有する試験管では発芽しなかった。抗菌および／または抗真菌剤を１：５、１：６、１：７、１：８および１：９希釈の比率で含有する試験管では、中等度の胞子発芽が見られ、抗菌および／または抗真菌剤を１：１０〜１：１００の比率で含有する残りの試験管では正常な胞子発芽および菌糸の形成が見られた（表−２）。
【0131】
表−２ 試験管希釈法による抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣ
【0132】
【表7】
【0133】
寒天拡散法（図１３）抗菌および／または抗真菌剤を１：１、１：２、１：３および１：４の比率で含有するウェルの周囲では菌糸増殖の阻害が見られた（表−３）。抗菌および／または抗真菌剤を１：５、１：６および１：７希釈の比率で含有するウェルの周囲では、中等度の阻害が見られ、残りの希釈率（１：８〜１：１００）では、阻害は見られなかった（表−３）。
【0134】
結論上記実験から、粗抽出物の粉末中の抗菌および／または抗真菌剤は胞子発芽ならびに菌糸増殖を１：４（ｖ／ｖ）の希釈率まで濃度依存的に阻害していることが結論付けられる。
【0135】
表−３ 寒天拡散法による抗菌および／または抗真菌剤のＭＩＣ
【0136】
【表8】
【0137】
３．４ 新規な単離株である枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の菌体溶解液の抗菌および／または抗真菌活性の試験材料
・ＰＤＡ寒天プレート
・ＬＢ培養液
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体
・リゾチーム
・インキュベーター
【0138】
方法３．４．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体溶解
ＬＢ培養液は、付属書類−Ｉ（３）に記載の方法に従って調製した。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の単一コロニーを無菌ＬＢ培養液に接種し、３０℃で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、栄養菌体を４℃、６５００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、これらの菌体を無菌蒸留水で３回洗浄し、リゾチーム中、３７℃で２時間のインキュベーションにより菌体溶解を行った。溶解後、この懸濁液を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体残渣を除去した。上清を回収し、０．２２μｍフィルターに通し、４℃で保存した。
【0139】
３．４．２ 菌体溶解液の抗菌および／または抗真菌アッセイペトリプレートのＰＤＡ寒天の対角の２端に２つのウェルを作り、一方を「試験」、他方を「対照」と表示した。溶解液の５００μｌアリコートを試験ウェルに加え、５００μｌのリゾチームのみを対照ウェルに加えた。試験真菌フザリウム・オキシスポルムをＰＤＡ寒天の中心に接種し、室温で５日間インキュベートした。
【0141】
実施例４４．１ 他の病原性真菌に対する抗菌および／または抗真菌活性の試験
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
・植物病原性真菌
１．リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）（ナス科のメンバーの紋枯病を引き起こす）
２．サロクラジウム・オリゼ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ）（イネに葉鞘腐敗病を引き起こす）
３．コレトトリクム・カプシシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉｉ）（トウガラシに炭疽病を引き起こす）
４．エクセロフィルム・ツルシクム（Ｅｘｅｒｏｈｉｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）（ツルシクム紋枯病を引き起こす）
５．マクロフォミア・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）（炭腐病を引き起こす）
・Ｔ３培養液
・Ｔ３寒天プレート
・ＰＤＡ寒天プレート
・インキュベーター
【0142】
方法４．１．１ 様々な植物病原性真菌に対する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を用いた抗菌および／または抗真菌活性の試験
白金耳１杯の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体および白金耳１杯の試験真菌を、各真菌の表示をしたＴ３プレートの対角上の反対側に接種し、菌体コロニーの近傍に菌糸の増殖が見られるまで２８℃でインキュベートした。
【0143】
４．１．２ 様々な植物病原性真菌に対する濾液を用いた抗菌および／または抗真菌活性の試験抗菌および／または抗真菌剤を含有する培養濾液の５００μｌアリコートを、ＰＤＡ寒天に作ったウェルに加え、各真菌の表示をした各プレートの他方のコーナーに白金耳１杯の試験真菌を接種し、培養濾液を含有するウェルの近傍に菌糸の増殖が見られるまで２８℃でインキュベートした。
【0144】
ウェルの周囲に阻害ゾーンが形成した際に、標的真菌に対する濾液の阻害活性をミリメートルで記録した。
【0145】
結果植物に病害を引き起こす一定範囲の真菌種を抗菌および／または抗真菌アッセイで試験したところ、それらは全て、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体およびまたその培養濾液の存在下で完全な増殖阻害を示した。
【0146】
４．２ 真菌攻撃からのイネ種子の保護における抗菌および／または抗真菌剤の有効性イネ種子をフザリウム・オキシスポルム胞子および枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液で処理し、無添加寒天を含むペトリプレートに置き、発芽中の種子に対する真菌攻撃の阻害における枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抗菌および／または抗真菌剤の有効性を確認した。
【0147】
対照種子は、フザリウム・オキシスポルム真菌胞子のみで処理した。
【0148】
結果枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）抗菌および／または抗真菌剤の存在下では、真菌は種子に感染できず、イネ種子は正常に発芽した。しかしながら、真菌のみで処理した種子は重度の感染を示し、発芽できなかった（図１７）。
【0149】
４．３ 植物の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の病原特性の試験材料
・噴霧可能なフォームの１％ＣＭＣ中の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
・イネ、ワタ、タバコ、トウモロコシおよびトマト植物
・噴霧器
【0150】
方法枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養物を、一定範囲の植物種に対して、存在する場合に病原性挙動に関して包括的に試験した。
【0151】
枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を２Ｌ三角フラスコ中の１Ｌ無菌ＬＢ培養液に接種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした。細菌の増殖後、４℃、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって菌体を採取した。ペレットをリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で２回洗浄し、リン酸バッファー（ｐＨ７．０）中１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）でスラリーとした。この懸濁液をイネ、タバコ、トウモロコシ、トマトおよびワタなどの作物に噴霧するために使用した。
【0152】
結果これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を噴霧した全ての植物種（イネ、タバコ、トウモロコシ、トマトおよびワタ）がいずれの種類の病害症状も示さなかったことが結論付けられ、それらの生育は対照植物と等しく、このことは枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）が植物種に対して非病原性であることを示す（図１８）。
【0153】
実施例５生物防除剤としての枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含有する抗菌および／または抗真菌組成物の配合剤
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
・ＬＢ培養液
・ＰＤＢ（バレイショデキストロース培養液）
・リン酸バッファー（ｐＨ７．０）
・ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）
【0154】
方法５．１．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体懸濁液の調製
枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を２Ｌ三角フラスコ中の１Ｌ無菌ＬＢ培養液に接種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の増殖後、培養物を４℃、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットをリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、リン酸バッファー（ｐＨ７．０）中１％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）と混合して６×１０７ｃｆｕ／ｍｌを含むスラリーを調製した。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含むスラリーを、植物に噴霧し、浸漬により植物の実生の根を処理するために使用した。
【0155】
５．１．２ トマト植物の根におけるリゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）感染を阻害するための抗菌および／または抗真菌剤を含有する配合剤の有効性の試験材料
・枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含むスラリー
・リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）真菌（ナス科のメンバーの紋枯病を引き起こす）
・ソイルライト
・トマト実生
【0156】
５．１．３ リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）の調製リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）は、バレイショデキストロース培養液（付属書類−Ｉ（Ｖ）培地に示される方法に従って調製）中で６日間増殖させた。リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）の増殖後、それをソイルライトと十分に混合し、室温で１５日間インキュベートした。真菌を含むソイルライトを土壌と１：１比で混合した。
【0157】
・トマト実生本試験には草丈１０ｃｍのトマト実生を使用した。
【0158】
方法本試験は下記のように行った。
Ａ．トマト実生をリゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）を含むが枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）で処理していな土壌に植え付けた。
Ｂ．トマト実生の根を、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）を含むスラリーで処理し、リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）を含む土壌に植え付けた。
Ｃ．無処理のトマト実生。
【0159】
Ａ．枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体および真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）による実生の処理トマト実生の根を枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体配合剤に３０分間浸漬した。処理した実生を、真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）と混合した土壌を含むポットに植え付けた。
【0160】
対照実生実生に病害を引き起こすために、トマト実生（無処理）を、真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）と混合した土壌を含むポットに植え付けた。
【0161】
陰性対照として、トマト実生（無処理）を、真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）と混合しない土壌を含むポットに植え付けた。
【0162】
トマト実生を含む全てのポットを温室に移し、着果期まで維持した。
【0163】
結果これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）と真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）の組合せで処理した実生は対照植物と同等に極めて良好に生長したが、真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）を含むポットに植え付けた実生（無処理）は、対照に比べて生長の遅れ、不十分な開花および果実形成を示したことが結論付けられた。ゆえに、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）は、トマト実生の根圏で真菌リゾクトニア・ソラニ（ＮＦＣＣＩ−３１９４）の増殖を阻害し、病害を引き起こす真菌から実生を保護したと結論付けることができる（図１９）。
【0164】
実施例６６．１ 土壌および種実伝染性の真菌病原体ペニシリウム・オクサリクム）（ＮＦＣＣＩ−１９９７）による発芽中のトウモロコシ種実の感染を防除することができる枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体の最小数のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
６．１．１ 細菌および真菌懸濁培養物の調製
材料
ａ．枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）
ｂ．ペニシリウム・オクサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）−植物病原性真菌
ｃ．カルベンダジムＷＰ５０（市販の殺真菌剤）
ｄ．Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培養液（ＬＢ）
【0165】
方法６．１．１．１ 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の懸濁培養物の調製
枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の純粋コロニー（図２０−１）を１０ｍｌのＬＢ培養液に接種し、３０℃で２４時間、１８０ｒｐｍでインキュベートした。生物防除配合剤の調製については、１ｍｌの新鮮培養物を１００ｍｌのＬＢ培養液に接種し、３０℃で２４時間、１８０ｒｐｍでインキュベートした。培養物の増殖は６２５ｎｍでの培養物の吸光度を周期的に測定することにより経過観察した。菌体を遠心分離により回収し、４℃、５５００ｒｐｍで１０分の遠心分離により無菌リン酸バッファーで洗浄した。最終的に菌体を５ｍｌの無菌リン酸バッファーに懸濁させた。この濃縮懸濁液を生物防除配合剤の調製に使用した。
【0166】
６．１．１．２ ペニシリウム・オクサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）（真菌病原体）の懸濁培養物の調製ペニシリウム・オクサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）の純粋コロニー（図２０−２）をＰＤＡプレートに接種し、胞子形成まで２８℃でインキュベートした。白金耳１杯の真菌胞子を１００ｍｌのＰＤＢに接種し、２８℃で７日間、１８０ｒｐｍでインキュベートした。真菌胞子を含む培養物の水性部分を５０ｍｌポリプロピレン試験管に採取した。これらの胞子を４℃、８０００ｒｐｍで１０分の遠心分離により無菌リン酸バッファーで洗浄した。胞子を必要な容量の無菌リン酸バッファーに、ｃｆｕが６×１０４ｍｌ−１となるように懸濁させた。
【0167】
６．１．２ Ｐ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）（真菌病原体）による土壌汚染土壌媒体に十分な真菌胞子量を維持するために、５０ｍｌ真菌胞子懸濁液（６×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）をオートクレーブにかけた１ｋｇのソイルライトと混合し、２８℃で１０日間インキュベートした。真菌が定着したソイルライトを土壌と１：１比で均一に混合し、９６カップトレイに充填した。
【0168】
６．１．３ 土壌伝染性植物病害の生物防除のための枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）の配合剤の調製材料
ａ．ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）
ｂ．スクロース
ｃ．レッドポリマー（殺真菌剤不含）
ｄ．枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体懸濁液（生物防除剤）
ｅ．カルベンダジム（市販の殺真菌剤）
【0169】
発芽中のトウモロコシ種実に対してＰ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）の増殖および病原性を抑制することができる枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体の有効濃度を評価するために、４つの異なる配合剤を設計した（詳細は下表に示す）。生物防除剤のみ、市販の殺真菌剤のみを含む配合剤、および生物防除剤も殺真菌剤も含まない配合剤を対照として用いた。全ての配合剤が結合剤−ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、炭素源（スクロース）およびレッドポリマー（殺真菌剤不含）を含む。
【0170】
１． 対照−１（真菌病原体および生物防除剤を含まない配合剤）この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、およびレッドポリマーから構成される。この配合剤は生物防除剤、病害誘導因子および殺真菌剤を含まない。この配合剤で処理した種実を対照種実として用いた。
【0171】
組成物
【0172】
【表9】
【0173】
２． 対照−２（真菌病原体を含むが生物防除剤を含まない配合剤）この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、およびレッドポリマーから構成される。この配合剤は生物防除剤／市販の殺真菌剤を含まないが、この配合剤で処理した種実をＰ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）真菌を接種した土壌に播種した。種実周囲には生物学的保護も化学的保護もないので、真菌は旺盛に増殖し、種実に感染し、実生に病害が発生する。この配合剤で処理した種実を病害対照として用いた。
【0174】
組成物
【0175】
【表10】
【0176】
３． 対照−３（市販の殺真菌剤「カルベンダジムＷＰ５０」を含む配合剤）この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび市販の殺真菌剤カルベンダジムＷＰ５０（商標バビスチン）から構成され、５００μｇ／ｍｌの濃度で使用した（Ｍｏｈｉｄｄｉｎら，２０１３）。この配合剤は、発芽中の種実の近傍の真菌増殖の抑制における生物防除剤および市販の殺真菌剤の両方の効果を比較するために用いた。
【0177】
組成物
【0178】
【表11】
【0179】
４ａ． 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）（５×１０４ｃｆｕ）を含む配合剤この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体から構成される。この配合剤は最小数の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含む。
【0180】
組成物
【0181】
【表12】
【0182】
４ｂ． 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体（５×１０５ｃｆｕ）を含む配合剤この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体から構成される。
【0183】
組成物
【0184】
【表13】
【0185】
４ｃ． 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体（５×１０６ｃｆｕ）を含む配合剤 この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体から構成される。
【0186】
組成物
【0187】
【表14】
【0188】
４ｄ． 枯草菌亜種シリラメンシス菌体（５×１０７ｃｆｕ）を含む配合剤この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ（５０００万菌体／ｍｌ担体）濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体から構成される。この配合剤は最大数の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含む。
【0189】
組成物
【0190】
【表15】
【0191】
５． 枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体（５×１０７ｃｆｕ）のみを含む配合剤この配合剤は、１％ＣＭＣ、２％スクロース、レッドポリマーおよび５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体から構成される。この配合剤は、最大数の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含み、種子発芽および植物生長に対する生物防除剤の効果を検討するために用いた。
【0192】
組成物
【0193】
【表16】
【0194】
表−４ 表形式で示す試験植物
【0195】
【表17】
【0196】
種実のコーティング上記に示す組成に従う生物防除配合剤をトウモロコシ種実にコーティングした（図２１）。各処理に対して３反復で２０粒のトウモロコシ種実（合計６０粒）を０．１％ＨｇＣｌ２で１０分間表面殺菌し、各１０分間、９５％エタノールですすぎ、無菌水で洗浄した。乾燥した種実を１７１μｌ／６０粒の種々の配合剤でコーティングし、２時間風乾した。
【0197】
播種処理した全ての種実を９６カップトレイに、各処理３反復で播種した。全てのトレイを温室で保持し、管理された条件下で維持した。種実発芽以降から５週間まで、これらのトレイを経過観察した。
【0198】
データの記録発芽パーセンテージ
全ての種実処理の発芽パーセンテージを播種１週間後に記録した。
【0199】
病害発生率病害発生率は、播種４週間のパーセンテージとして記録した。病害発生率の記録のために使用した式（Ｈｏｆｆｍａｎら，２００２）は次の通りである：
【0200】
【数1】
【0201】
結果種実発芽および実生生存率
配合剤−３（対照−３）、４ｃ、１（対照−１）、４ｂ、４ｄおよび５で処理した種実でそれぞれ、最適な種実発芽、すなわち、９３．３３％、９６．６６％、１００．００％、１００．００％、１００．００％および１００．００％、次いで、配合剤−４ａおよび２（対照−２）で処理した種実で８３．３３％、３３．３３％が記録された。播種４週間後の実生生存率は、配合剤−３（市販の殺真菌剤を含む）で処理した種実以外の上記全ての配合剤で処理した種実で１００．００％と記録され、これは明らかに、市販の殺真菌剤「カルベンダジムＷＰ５０」は、真菌増殖の抑制に有効であったとしても１００．００％の効果は無いことを示す。種々の濃度（最小数の菌体を含む配合剤４ａ以外）の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含む配合剤は、土壌中に存在するＰ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）からの種実の保護に１００．００％有効であることが分かった。
【0202】
配合剤−４ａ（菌体の最小濃度５０，０００菌体／ｍｌ担体を含む配合剤）で処理した種実の発芽率の低下は、発芽中の種実に対して土壌中に存在するＰ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）からの保護を付与するためには基本量の菌体が要されることを明確に示す。よって、細菌濃度が５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ（５０万菌体／ｍｌ）である配合剤−４ｂは、Ｐ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）からの良好な保護を与え、かつ、対照種実と同様の１００％の種実発芽および実生生存を与えた。
【0203】
表−５ Ｐ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）の増殖および病原性を抑制するための枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体の有効濃度（ｃｆｕ／ｇ担体）の検出
【0204】
【表18】
【0205】
病害発生率本試験の結果は、処理間に有意差があったことを示した。配合剤１、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび５で処理した種実はいずれの病害症状も示さず、対照実生と同様の健康な生長を示し、このことは、これらの配合剤中に存在する生物防除剤枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）が真菌Ｐ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）の増殖および病原性を大幅に抑制し、従って、種実を真菌感染から保護したことを示す。配合剤−３（市販の殺真菌剤カルベンダジム５０ＷＰを含む）で処理した種子は３．５７％の病害発生率を示し、このことは、市販の殺真菌剤は真菌増殖の抑制に有効であったが、本試験で用いた生物防除剤ほど良好でなかったことを示す。
【0206】
表−６ 種々の配合剤で処理したトウモロコシ実生の病害発生のパーセンテージ
【0207】
【表19】
【0208】
配合剤４ａおよび２で処理した種実ではそれぞれ８２％および１００％の病害発生率が記録された。これらの結果は、配合剤４ａに存在する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体密度は真菌増殖の抑制に有効でなく、従って、発芽中の種実は真菌に感染し、発芽２週間後に枯死したことを示す。予想されたように、生物防除剤も市販の殺真菌剤も含まない配合剤−２で処理した種実は１００％の病害発生率を示し、このことは、この真菌が発芽中の種子に感染し、発芽２週間以内にそれらの実生を枯死させたことを示す。
【0209】
結論上記の結果は、５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ濃度の枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）（配合剤−４ｂ）は真菌病原体の増殖の抑制に有効であり、トウモロコシの発芽実生に１００％の保護を与えることを明らかに示す。ゆえに、この生物防除剤は、土壌伝染性の病原性真菌Ｐ．オキサリクム（ＮＦＣＣＩ−１９９７）の有効な防除のための種実のコーティングに首尾良く使用できる。
【0210】
６．２ 植物の生長および収量の向上における枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体配合剤の有効性の試験材料および方法
材料
１．６．１．３（４ｂ）に記載の配合剤で処理したトウモロコシ、トマトおよびナスの種子。
２．トウモロコシ、トマトおよびナスの対照種子。
【0211】
方法種子のコーティング
トウモロコシ、トマトおよびナスの種子を６．１．３（４ｂ）に記載の配合剤で処理し、風乾した。
【0212】
播種トウモロコシ、トマトおよびナスの処理および無処理（対照）の種子（各３反復、各反復は２３種子を含む）を面積４平方メートルの圃場に播種した。植物間２０ｃｍおよび畝間６０ｃｍの距離の標準的な空間寸法を維持した。適当な農学慣行に従ってこれらの作物を登熟まで生育させた。
【0213】
結果圃場条件下で植物生長パラメーターおよび収量に有意な増加が見られた。枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体を含む配合剤でコーティングした種子は、トウモロコシ、ナスおよびトマトの収量をそれぞれ１７．６０、３７．１５および１．５８％増大させた（表−７）。トウモロコシ、ナスおよびトマト植物は、より高い生育率およびバイオマス蓄積率を示した（処理および無処理トウモロコシの差異の代表的な写真を図２５に示す）。植物生長促進剤に関する初期の報告には、枯草菌を含む配合剤は植物の生長を増大させ、かつ、６０種の異なるタイプの二次代謝産物を生産することにより、病害保護のための全身耐性を誘導したことも報告されている（Ｃｏｍｐａｎｔら，２００５およびＭｏｈａｎ Ｋｕｍａｒら，２０１５）。
【0214】
表−７ トウモロコシ、トマトおよびナスの収量に対する枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）菌体配合剤の効果
【0215】
【表20】
【0216】
実施例７７．１ ヒト病原性真菌の増殖を阻害する抗真菌／抗菌剤の有効性のスクリーニング
ヒトに疾患を引き起こす一定範囲の真菌種を様々な皮膚および肺感染を患う人から単離した。抗真菌および／または抗菌活性を単離されたヒト病原性真菌の全てに対して試験した。
【0217】
材料および方法材料
１．ペニシリウム亜種
２．アスペルギルス・フラブス
３．アスペルギルス・ニガー
４．アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）
５．ＰＤＡプレート
６．枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）から単離された抗真菌／抗菌剤
【0218】
方法抗菌および／または抗真菌剤を含む培養濾液の５００μｌアリコートを、ＰＤＡ寒天に作ったウェル中に加え、各真菌の表示をした各プレートの他方のコーナーに白金耳１杯の試験真菌を接種し、培養濾液を含有するウェルの近傍に菌糸の増殖が見られるまで２８℃でインキュベートした。
【0219】
標的真菌に対する濾液の阻害活性を、ウェルの周囲に形成した阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
【0220】
結果ヒトに疾患を引き起こす一定範囲の真菌種を様々な皮膚者および肺感染を患う人から単離し、抗菌および／または抗真菌アッセイで試験したところ、それらは全て、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）培養濾液の存在下で完全な増殖阻害を示した（図２４）。
【0221】
結論これらの所見から、枯草菌亜種シリラメンシス（ＭＴＣＣ−５６７４）から単離された抗真菌／抗菌剤は医薬適用にも使用可能であると結論付けられた。
【0222】
参照文献1. Compant , S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C. and Barka, E.A. (2005). Use of plants growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, Mechanisms of action, and future prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71:4951-4959. Sci. World J., Vol 2012, pp. 001-012.
2. Hoffmann, W.A. and Poorter, H. 2002. Avoiding Bias in Calculations of Relative Growth Rate. Ann. Bot., Vol.90 (1), pp. 37-42.
3. Li, J. Yang, Q. Zhao, L-H, Zhang, S.M., Wang, Y.X. Xiao-yu and Zhao, X.Y. 2009. Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29. J. Zhejiang Univ. Sci. B.,Vol.10 (4) pp. 264-272.
4. Malusa, E. Sas-Paszt, L. and Ciesielska, J. 2012. Technologies for Beneficial Microorganisms Inocula Used as Biofertilizers.
Mena-Violante, H.G. and Olalde-Portugal, V. 2007. Alteration of tomato fruit quality by root inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Bacillus subtilis BEB-13bs. Sci. Hort.,Vol.1 (113), pp. 103-106.
6. Mohan Kumar, S.P., Chowdappa, P. and Krishna, V. (2015). Development of seed coating formulation using consortium of Bacillus subtilis OTPB1 and Trichoderma harzianum OTPB3 for plant growth promotion and induction of systemic resistance in field and horticultural crops. Indian Phytopath. 68 (1):25-31.
7. Mohiddin, F. A. and Khan, M. R. 2013. Tolerance of fungal and bacterial bio-control agents to six pesticides commonly used in the control of soil borne plant pathogens. Global J. Pests, Dis. Crop Prot., Vol. 1 (1), pp. 001-004.
関連特許
1. A novel strain of Bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm. (EP981540A1).
2. Strain of Bacillus subtilis for agricultural use. (WO2009031874A1).
3. Antifungal Bacillus subtilis and a microorganism wettable powder containing the same (KR2011075132A).
【0223】
付属書類Ｉ使用した培養培地の組成
注： 培地調製の一般法を以下に示す。下記に示す培地組成は全て１００ｍｌ容量に関するものである。組成は必要量に応じて変わる。
【0224】
（Ｉ）Ｔ３培養液（ｐＨ−６．８）び調製Ｔ３培地の組成
【0225】
【表21】
【0226】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含む容器を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。
【0227】
（ＩＩ）Ｔ３寒天プレート（ｐＨ−６．８）の調製Ｔ３培地の組成
【0228】
【表22】
【0229】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌ペトリプレートに注いだ。
【0230】
（ＩＩＩ）ＬＢ培養液（ｐＨ−７．０）の調製ＬＢ培地の組成
【0231】
【表23】
【0232】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含む容器を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。
【0233】
（ＩＶ）ＬＢ寒天プレート（ｐＨ−７．０）の調製ＬＢ培地の組成
【0234】
【表24】
【0235】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌ペトリプレートに注いだ。
【0236】
（Ｖ）ＰＤＢ培養液（ｐＨ−６．０）の調製ＰＤＢ培地の組成
【0237】
【表25】
【0238】
方法５０ｍｌの蒸留水を含む２５０ｍｌガラス瓶にバレイショ粉末（２．０ｇ）を秤り取り、５分間煮沸した。煮沸したバレイショ水を、モスリン布を用いて濾過した。濾液を新しい２５０ｍｌガラス瓶に回収し、それに２．０ｇのデキストロースを加えた。総容量を１００ｍｌとした後に、培地を含む瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。
【0239】
（ＶＩ）ＰＤＡ寒天プレート（ｐＨ−６．０）の調製ＰＤＡ培地の組成
【0240】
【表26】
【0241】
方法５０ｍｌの蒸留水を含む２５０ｍｌガラス瓶にバレイショ粉末（２．０ｇ）を秤り取り、５分間煮沸した。煮沸したバレイショ水を、モスリン布を用いて濾過した。濾液を新しい２５０ｍｌガラス瓶に回収し、それに２．０ｇのデキストロースおよび２．０ｇの寒天を加えた。総容量を１００ｍｌとした後に、培地を含む瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。融解したＰＤＡを無菌ペトリプレートに注いだ。
【0242】
（ＶＩＩ）Ｈｕｇｈ ａｎｄ Ｌｅｉｆｓｏｎ ＯＦ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＯＦＢＭ）（ｐＨ−７．１）の調製ＯＦＢＭ培地の組成
【0243】
【表27】
【0244】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌培養試験管に注いだ。
【0245】
（ＶＩ）ＳＩＭ（Ｓｕｌｐｈｉｄｅ Ｉｎｄｏｌｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）培地（ｐＨ−７．３）の調製ＳＩＭ培地の組成
【0246】
【表28】
【0247】
方法全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を１２１℃で１５分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌培養試験管に注いだ。
【0248】
付属書類ＩＩリン酸バッファーの調製
【0249】
【表29】
【0250】
方法両リン酸塩をガラスビーカーに取り、塩に５０ｍｌの蒸留水を加え、マグネチックバーを用いてマグネチックスターラーで撹拌した。リン酸塩が完全に溶けたことを確認した後、その溶液を蒸留水で１００ｍｌとした。
【0251】
付属書類ＩＩＩ試験に使用した担体および他の薬剤
【0252】
【表30】
【0253】
略語
【0254】
【表31】