特許 6598161 ｐＨ応答性ポリマーのライブラリー及びそのナノプローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6598161

(24)【登録日】2019年10月11日

(45)【発行日】2019年10月30日

(54)【発明の名称】ｐＨ応答性ポリマーのライブラリー及びそのナノプローブ

(51)【国際特許分類】

   C08F 293/00 20060101AFI20191021BHJP

   G01N 21/80 20060101ALI20191021BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20191021BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20191021BHJP

   A61B 10/00 20060101ALI20191021BHJP

   A61K 51/06 20060101ALI20191021BHJP

   A61K 51/12 20060101ALI20191021BHJP

   A61K 50/00 20060101ALI20191021BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20191021BHJP

   C08F 220/34 20060101ALI20191021BHJP

   C08F 8/30 20060101ALI20191021BHJP

   C07C 69/54 20060101ALI20191021BHJP

   C09K 11/06 20060101ALI20191021BHJP

【ＦＩ】

   C08F293/00

   G01N21/80

   G01N21/78 C

   G01N21/64 C

   G01N21/64 F

   A61B10/00 E

   A61K51/06 200

   A61K51/12 200

   A61K50/00 200

   C12Q1/02

   C08F220/34

   C08F8/30

   C07C69/54 ZCSP

   C09K11/06 680

【請求項の数】21

【全頁数】137

(21)【出願番号】特願2016-571093(P2016-571093)

(86)(22)【出願日】2015年6月5日

(65)【公表番号】特表2017-526753(P2017-526753A)

(43)【公表日】2017年9月14日

(86)【国際出願番号】US2015034575

(87)【国際公開番号】WO2015188157

(87)【国際公開日】20151210

【審査請求日】2018年6月1日

(31)【優先権主張番号】62/009,019

(32)【優先日】2014年6月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508152917

【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，ジンミン

(72)【発明者】

【氏名】フアン，ガン

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，ティアン

(72)【発明者】

【氏名】マ，シンペン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，イグアン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】シュメール，バラン，ディー．

【審査官】 横山 法緒

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０３３０２７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５４３４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３９７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０８３８４５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｆ ２９３／００

Ｃ０８Ｆ ６／００−２４６／００

Ａ６１Ｂ １０／００

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２

Ｃ０７Ｃ ６９／５４

Ｃ０９Ｋ １１／０６

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｇ０１Ｎ ２１／００−２１／９５８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

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（Ｖ）
のポリマーであって、
式（Ｖ）において、
Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、または

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

或いは金属キレート基であり；
ｎは１〜５００の整数であり；
Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；
Ｒ_３は、式：

【化3】

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（ＩＩ）
の基であり、
式（ＩＩ）において、
ｎ_ｘは１〜１０であり；
Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；
Ｘ_４はペンチル、ｎ−プロピル、またはエチルであり；
Ｘ_５はペンチルまたはｎ−プロピルであり；
ｘは１〜１００の整数であり；
Ｒ_４は、式：

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＶ）
の基であり、
式（ＩＶ）において、
ｎ_ｚは１〜１０であり、
Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；
Ｙ_４は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤であり；そして
ｙは１〜６の整数であり；そして
Ｒ_５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}である、ポリマー。

【請求項2】

Ｙ_４が蛍光色素である請求項１に記載のポリマー。

【請求項3】

前記蛍光色素が、インドシアニングリーンである請求項２に記載のポリマー。

【請求項4】

Ｒ_１はアルキル_{（Ｃ≦１２）}である請求項１に記載のポリマー。

【請求項5】

Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれアルキル_{（Ｃ≦１２）}である請求項１に記載のポリマー。

【請求項6】

Ｒ_３は

【化5】

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である請求項１に記載のポリマー。

【請求項7】

Ｘ_４及びＸ_５は、それぞれペンチルである請求項６に記載のポリマー。

【請求項8】

Ｘ_４及びＸ_５は、それぞれｎ−プロピルである請求項６に記載のポリマー。

【請求項9】

Ｘ_４はエチルであり、Ｘ_５はｎ−プロピルである請求項６に記載のポリマー。

【請求項10】

前記ポリマーが、以下である請求項１に記載のポリマー。

【化6】

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【請求項11】

前記ポリマーが、以下である請求項１に記載のポリマー。

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項12】

式：

【化8】

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のポリマーであって、
上式において、
ｘが３０〜１５０の整数であり、ｙが１または２の整数であり；ｘ及びｙが当該ポリマー全域にランダムに分布し；そしてＩＣＧが蛍光色素インドシアニングリーンである、ポリマー。

【請求項13】

式：

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

のポリマーであって、
上式において、
ｘが４０〜１２０の整数であり、ｙが１、２または３の整数であり；Ｙ_４が蛍光色素インドシアニングリーンである、ポリマー。

【請求項14】

前記ポリマーが、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_４０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_６０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_８０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_１００−ｒ−ＩＣＧ_３）、またはＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_１２０−ｒ−ＩＣＧ_３）である請求項１３に記載のポリマー。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の１種以上のブロックコポリマーを含むミセル。

【請求項16】

請求項１５に記載のミセルを含むｐＨ応答性組成物であって、Ｙ_４が色素であり、ミセルがｐＨ転移点及び発光スペクトルを有する、ｐＨ応答性組成物。

【請求項17】

（ａ）請求項１６のｐＨ応答性組成物を細胞内または細胞外の環境と接触させる工程、
（ｂ）細胞内または細胞外の環境からの１つ以上の光シグナルを検知する工程であって、その光シグナルの検知が、ミセルがそのｐＨ転移点に到達し、解離したことを示す、工程、を含む細胞内または細胞外の環境のｐＨをイメージングする方法における使用のための、請求項１６に記載のｐＨ応答性組成物。

【請求項18】

細胞内の環境は細胞の一部である請求項１７に記載のｐＨ応答性組成物。

【請求項19】

細胞外の環境が腫瘍または血管細胞である請求項１７に記載のｐＨ応答性組成物。

【請求項20】

（ａ）請求項１６に記載のｐＨ応答性組成物を有効量で患者に投与する工程；
（ｂ）患者の１つ以上の光シグナルを検知する工程であって、その光シグナルは腫瘍の存在を示す、工程；及び
（ｃ）腫瘍を手術により切除する工程、を含む患者の腫瘍を切除する方法における使用のための、請求項１６に記載のｐＨ応答性組成物。

【請求項21】

前記腫瘍が、がんによるものであり、前記がんが、乳がん、頭頸部がん、または結腸直腸の腹膜転移である請求項１６に記載のｐＨ応答性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／００９，０１９号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。

【0002】

本発明は、国立衛生研究所に授与された認可番号Ｒ０１ＥＢ０１３１４９の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【0003】

本開示は、分子及び細胞生物学、がんイメージング、ナノテクノロジー、並びに蛍光センサーの分野に関する。より詳細には、本開示は、ｐＨ変化の検出のためのナノプラットフォームに関する。

【背景技術】

【0004】

蛍光イメージングは、マイクロスコピック、メゾスコピック及びマクロスコピックレベルで時空間情報を提供することができる能力のために、生細胞中の生体分子、経路及びプロセスの研究において重要なツールとなっている（例えば、Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３，４，ＳＳ１６；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００８，４５２，５８０；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００８，９，９２９参照）。最近、イオン及びレドックス電位、酵素発現、並びにｐＨ等の生理的刺激に応答性のある、活性化可能イメージングプローブが、細胞生理的プロセスを調査するためにかなり注目を集めている（例えば、ｄｅ Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，１５１５；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２，３，９０６；Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，４２５０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１０，４４，８３；Ｌｏｖｅｌｌ，Ｊ．Ｆ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２８３９；Ｕｅｎｏ，Ｔ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１，８，６４２参照）。これらの刺激の中でも、ｐＨは、細胞内（ｐＨ_ｉ）環境及び細胞外（ｐＨ_ｅ）環境の両方で重大な役割を担う重要な生理的パラメータとして際立っている。（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ；第５版．；Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００８）。

【0005】

様々なｐＨ感受性蛍光プローブが報告されているが（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２６２０；Ｈａｎ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２７０９）、それらのｐＨ感受性は、フルオロフォアへのｐＨ依存性光誘起電子移動（ＰｅＴ）特性を有するイオン化可能な残基に主として起因している。これらの蛍光剤についての一つの潜在的な欠点は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式によって規定されるそれらのブロードなｐＨ応答（ΔｐＨ約２）である（Ａｔｋｉｎｓ，Ｐ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００９）。このような鋭いｐＨ応答の欠如は、酸性細胞内オルガネラ間の僅かなｐＨ差（例えば、初期エンドソームとリソソームとの間の＜１ｐＨ差）（Ｍａｘｆｉｅｌｄ， Ｆ． Ｒ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００４， ５， １２１； Ｃａｓｅｙ， Ｊ． Ｒ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１０， １１， ５０）又は正常組織環境（７．４）に対する固形腫瘍中のｐＨｅ（６．５〜６．９）（Ｗｅｂｂ，Ｂ．Ａ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２０１１，１１，６７１；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．， Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１０，５１，１１６７．）を検出することが困難である。さらに、ｐＨ転移点及び発光波長（特に、近ＩＲ範囲内）の同時制御は、小分子色素にとっては困難である。ｐＨ感受性蛍光ナノ粒子開発の最近の試みは、小分子ｐＨ感受性色素と結合したポリマー（Ｓｒｉｋｕｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１１，２，１１５６；Ｂｅｎｊａｍｉｎｓｅｎ，Ｒ．Ｖ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１１，５，５８６４；Ａｌｂｅｒｔａｚｚｉ，Ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１８１５８；Ｕｒａｎｏ，Ｙ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９，１５，１０４）またはｐＨ非感受性色素を結合するためのｐＨ感受性リンカーの使用（Ｌｉ，Ｃ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１０，２０，２２２２；Ａｌｍｕｔａｉｒｉ，Ａ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１３０，４４４）を主に利用する。これらのナノプローブ設計もブロードなｐＨ応答をもたらし、ｐＨ転移点を微調整する能力を欠けている。

【0006】

最近、ｐＨ応答性システムを作製するためのポリマーの使用がＷＯ２０１３／１５２０５９に記載されており、このポリマーの使用は、使用される特定のモノマーに基づく比較的狭い範囲のｐＨ転移点を生み出すが、具体的には、ｐＨ転移点を微調整するための柔軟性が欠けている。

【0007】

さらに、腫瘍細胞のイメージングは、腫瘍の境界を描き、使用を切除する手術の有効性を高める向上した方法を提供することができる。腫瘍の境界を描くのを助ける様々な方法が提案されている。Ｂｒａｉｎｌａｂ（商標）等の画像ナビゲータを用いる、ＣＴ、ＭＲＩまたは超音波等の従来のイメージングモダリティでは、まず術前画像を使用し、続いて頭蓋底及び洞がん、並びに脳腫瘍の切除をガイドするための手術基準マーカーが術中使用される。主な欠点は、堅固な骨の境界標識に対して動かない腫瘍のみが、正確に画像化され、術前画像はリアルタイムのフィードバックを提供するために術中操作を埋めるためのアップデートをすることができない。術中ＭＲＩは、脳腫瘍の画像化のために少数のセンターで使用されつつあるが、リアルタイムイメージングのために手術スーツに高価な磁石装着の必要があり、最近の検討では、これは従来の手術ナビゲーションに対して大して重要でない利点となっているかもしれないと示唆されている（Ｋｕｂｂｅｎら，２０１１）。超音波は口腔ＨＮＳＣＣの腫瘍の深さを評価するために使用されてきているが、頭と首の近づき難い原発部位への使用は困難である（Ｌｏｄｄｅｒら，２０１１）。

【0008】

これらの解剖学を基礎とする画像診断法は重要な解決手段ではあるが、疾患の具体的な情報をほとんど提供しない。光イメージング戦略は、細胞イメージング、自然自己蛍光及びラマン散乱に基づいて手術中に組織を画像化するために急速に使用されてきている（Ｖａｈｒｍｅｉｊｅｒら，２０１３；Ｎｇｕｙｅｎ ＆ Ｔｓｉｅｎ，２０１３；Ｄａｃｏｓｔａら，２００６；Ｄｒａｇａら，２０１０；Ｈａｋａら，２００６； Ｓｃｈｗａｒｚら，２００９及びＭｏら，２００９）。残念ながら、腫瘍の境界検出のための組織の自動発光の使用は、がんと正常組織との間の強固な分光差が欠如していることよる高い擬陽性及び偽陰性の結果により制限されている（Ｌｉｕら，２０１０；Ｋａｎｔｅｒら，２００９；Ｒａｍａｎｕｊａｍら，１９９６及びＳｃｈｏｍａｃｋｅｒら，１９９２）。

【0009】

様々な外因性フルオロフォア（蛍光色素分子）は、術中の境界評価のために開発されている。最も普通の戦略は、葉酸受容体−α（ＦＲ−α）（ｖａｎ Ｄａｍら，２０１１）、クロロトキシン（Ｖｅｉｓｅｈら，２００７）、表皮成長因子受容体（ＥＦＧＲ）（Ｋｅら，２００３、及びＵｒａｎｏら，２００９）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｋｏｙａｍａら，２００７）、腫瘍関連抗体（例、前立腺特異的膜抗原、ＰＳＭＡ） （Ｔｒａｎ Ｃａｏら，２０１２，ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９−９（ＣＡ１９−９） （Ｔｒａｎ Ｃａｏら，２０１２； Ｍｃｅｌｒｏｙら，２００８）等の細胞表面受容体に焦点が当てられている。これらの中で、葉酸−ＦＩＴＣ及びクロロトキシン−Ｃｙ５．５複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）はすでに、それぞれ、卵巣及び皮膚がんの手術におけるフェーズＩの臨床実験に進んでいる。これらの成功にもかかわらず、主要な制約の原因の１つは、がん患者における広い腫瘍適応性の欠如である。腫瘍可視化の細胞表面受容体戦略にとって、均一マーカーの欠如は、多様な発がん遺伝子型（ｏｎｃｏｇｅｎｏｔｙｐｅ）及び解剖学的部位を有する腫瘍を可視化するためにユニバーサルプラットフォームを作製することを困難にする。加えて、比較的低い（ｆｍｏｌ−ｎｍｏｌ）且つ非常に変わり易い発現レベル（１００〜３００倍）は、従来のシグナル増幅の無い化学量論戦略（例、リガンド：レセプターが１：１）にとっては困難で挑戦的である。これは、常時接続プローブ型のため血液環境を高めるヒト化ｍＡｂの長い循環時間が原因で、特に、ｍＡｂ−色素複合体（例、エルビタックス−ＩＣＧ）には困難で挑戦的である。

【0010】

このように、腫瘍をイメージングするためのｐＨ応答性システムを発生させることができる新規なポリマーは、診断及びイメージング・プロトコルの開発にとって有益である。

【発明の概要】

【0011】

要旨
いくつかの態様において、本開示は、
式：

【0012】

【化1】

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（Ｉ）
［式（Ｉ）において、Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、または

【0013】

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

或いは金属キレート基であり；ｎは１〜５００の整数であり；Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0014】

【化3】

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（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、ｎ_ｘは１〜１０であり；Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｘは１〜１５０の整数であり；、Ｒ_４は、式：

【0015】

【化4】

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（ＩＩＩ）
（式（ＩＩＩ）において、ｎ_ｙは１〜１０であり；Ｘ_１’、Ｘ_２’、及びＸ_３’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４’及びＸ_５’は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４’及びＸ_５’は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｙは１〜１５０の整数であり；Ｒ_５は、式：

【0016】

【化5】

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（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、ｎ_ｚは１〜１０であり；Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり；ｚは０〜６であり；そしてＲ_６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}であり；且つＲ_３及びＲ_４が同一の基ではないとの条件で、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は当該ポリマー内においてどのような順序で現れても良い。］で表されるポリマー、を提供する。いくつかの実施形態において、前記化合物は、前記式で表され、さらに、Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または

【0017】

【化6】

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或いは金属キレート基であり；ｎは１０〜５００の整数であり、Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0018】

【化7】

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（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦８）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦８）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｘは１〜１００の整数であり、Ｒ_４は、式：

【0019】

【化8】

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（ＩＩＩ）
（式（ＩＩＩ）において、Ｘ_１’、Ｘ_２’、及びＸ_３’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４’及びＸ_５’は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４’及びＸ_５’は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦８）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦８）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｙは１〜１００の整数であり、Ｒ_５は、式：

【0020】

【化9】

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（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり、ｚは０〜６であり；そしてＲ_６は、水素、ハロゲン、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}であり；且つＲ_３及びＲ_４が同一の基ではないとの条件で、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は当該ポリマー内においてどのような順序で現れても良い。いくつかの実施形態において、前記化合物は、前記式で表され、さらに、Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、置換アルキル_{（Ｃ≦８）}、または

【0021】

【化10】

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或いは金属キレート基であり；ｎは１０〜２００の整数であり、Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0022】

【化11】

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（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}である。）で表される基であり；ｘは１〜１００の整数であり；Ｒ_４は、式：

【0023】

【化12】

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（ＩＩＩ）
（式（ＩＩＩ）において、Ｘ_１’、Ｘ_２’、及びＸ_３’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＸ_４’及びＸ_５’は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４’及びＸ_５’は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}であり；ｙは１〜１００の整数であり；Ｒ_５は、式：

【0024】

【化13】

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（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり；ｚは０〜６であり；そしてＲ_６は、水素、ハロゲン、アルキル_{（Ｃ≦６）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦６）}であり；且つＲ_３及びＲ_４が同一の基ではないとの条件で、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は当該ポリマー内においてどのような順序で現れても良い。いくつかの実施形態では、Ｒ_１は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ_１はアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｒ_１はメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１は

【0025】

【化14】

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である。いくつかの実施形態では、Ｒ_１は、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、Ｄｉａｍｓａｒ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＡＣＮ−ＴＭ、ＤＴＰＡ、ＴＲＡＰ、ＮＯＰＯ、ＡＡＺＴＡ、ＤＡＴＡ、ＨＢＥＤ、ＳＨＢＥＤ、ＢＰＣＡ、ＣＰ２５６、ＤＦＯ、ＰＣＴＡ、ＨＥＨＡ、ＰＥＰＡ、またはこれらの誘導体から選択される金属キレート基等の金属キレート基である。いくつかの実施形態では、金属キレート基が窒素含有大員環である。いくつかの実施形態では、窒素含有大員環が下記式：

【0026】

【化15】

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［上式において、
Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_７’、Ｒ_８’、Ｒ_９’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、−アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}−アシル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され；或いはリンカーであり、該リンカーはアルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり；或いは
Ｒ_７は、Ｒ_８、Ｒ_９、またはＲ_１０の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_８は、Ｒ_７、Ｒ_９、またはＲ_１０の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_９は、Ｒ_７、Ｒ_８、またはＲ_１０の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_１０は、Ｒ_７、Ｒ_８、またはＲ_９の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_７’は、Ｒ_８’またはＲ_９’の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_８’は、Ｒ_７’またはＲ_９’の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；或いは
Ｒ_９’は、Ｒ_７’またはＲ_８’の１つと一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦６）}であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ａ’、ｂ’、及びｃ’はそれぞれ独立して１、２、３または４から選択される。］
で表される化合物である。

【0027】

いくつかの実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ａ’、ｂ’、及びｃ’はそれぞれ独立して２または３である。いくつかの実施形態で、金属キレート基が：

【0028】

【化16】

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である。

【0029】

いくつかの実施形態では、金属キレート錯体が金属イオンと結合している。いくつかの実施形態で、金属イオンが放射線核種または放射線金属である。いくつかの実施形態で、金属イオンがＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージングに適している。いくつかの実施形態で、金属キレート錯体が遷移金属イオンと結合している。いくつかの実施形態で、金属イオンが、銅イオン、ガリウムイオン、スカンジウムイオン、インジウムイオン、ルテチウムイオン、イッテルビウムイオン、ジルコニウムイオン、ビスマスイオン、鉛イオン、アクチニウムイオン、またはテクニチウムイオンである。いくつかの実施形態では、金属イオンが、^９９ｍＴｃ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^２２５Ａｃ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^１１１Ｉｎ、^１１４ｍＩｎ、^１１４Ｉｎ、^１８６Ｒｅ、または^１８８Ｒｅから選択される同位体である。いくつかの実施形態では、遷移金属が銅（ＩＩ）イオンである。いくつかの実施形態では、銅（ＩＩ）イオンが^６４Ｃｕ^２＋イオンである。いくつかの実施形態では、金属キレート錯体が：

【0030】

【化17】

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である。

【0031】

いくつかの実施形態では、Ｒ_２がアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｒ_２がメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_２’がアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｒ_２’がメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３が、さらに、式：

【0032】

【化18】

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（Ｖ）
（式（Ｖ）において、Ｘ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}である。）によって定義される。いくつかの実施形態では、Ｘ_１がアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｘ_１がメチルである。いくつかの実施形態では、Ｘ_４がアルキル_{（Ｃ≦８）}である。いくつかの実施形態では、Ｘ_４がメチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチルである。いくつかの実施形態では、Ｘ_５がアルキル_{（Ｃ≦８）}である。いくつかの実施形態では、前記Ｘ_５がメチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチルである。

【0033】

いくつかの実施形態では、Ｒ_４が、さらに、式：

【0034】

【化19】

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（ＶＩ）
（式（ＶＩ）において、Ｘ_１’は、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＸ_４’及びＸ_５’は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４’及びＸ_５’は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦８）}である。）によって定義される。いくつかの実施形態では、Ｘ_１’がアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｘ_１がメチルである。いくつかの実施形態では、Ｘ_４’がアルキル_{（Ｃ≦８）}である。いくつかの実施形態では、Ｘ_４’がメチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチルである。いくつかの実施形態では、Ｘ_５’がアルキル_{（Ｃ≦８）}である。いくつかの実施形態では、Ｘ_５’がメチル、エチル、プロピル、ブチル、またはペンチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_５が、さらに、式：

【0035】

【化20】

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（ＶＩＩ）
（式（ＶＩＩ）において、Ｙ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦８）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦８）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、色素または蛍光消光剤である。）よって定義される。いくつかの実施形態では、Ｙ_１がアルキル_{（Ｃ≦６）}である。いくつかの実施形態では、Ｙ_１がメチルである。いくつかの実施形態では、Ｙ_４が水素である。いくつかの実施形態では、Ｙ_４が色素である。いくつかの実施形態では、Ｙ_４が蛍光色素である。いくつかの実施形態では、蛍光色素が、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、キサンテン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、またはシアニン色素である。いくつかの実施形態では、蛍光色素が、インドシアニングリーン、ＡＭＣＡ−ｘ、マリンブルー、ＰｙＭＰＯ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）、テトラメチルローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ボディピー４９３（Ｂｏｄｉｐｙ４９３）、ボディピーＴＭＲ−ｘ、ボディピー６３０、シアニン５、シアニン５．５、及びシアニン７．５である。いくつかの実施形態では、蛍光色素が、インドシアニングリーンである。いくつかの実施形態では、Ｙ_４が蛍光消光剤である。いくつかの実施形態では、蛍光消光剤が、ＱＳＹ７、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＴＱ１、ＴＱ２、ＴＱ３、ＴＱ４、ＴＱ５、ＴＱ６及びＴＱ７である。いくつかの実施形態では、ｎが７５〜１５０である。いくつかの実施形態では、ｎが１００〜１２５である。いくつかの実施形態では、ｘが１〜９９である。いくつかの実施形態では、ｘが１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜９９またはこれらから導かれ得る範囲である。いくつかの実施形態では、ｙが１〜９９である。いくつかの実施形態では、ｙが１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜９９またはこれらから導かれ得る範囲である。いくつかの実施形態では、ｚが０〜６である。いくつかの実施形態では、ｚが１〜６である。いくつかの実施形態では、ｚが０〜２、２〜４、４〜６、またはこれらから導かれ得る範囲である。いくつかの実施形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は、ポリマー内においてどのような順序でも現れ得る。いくつかの実施形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は、式（Ｉ）に記載された順序で現れる。いくつかの実施形態では、ポリマーがさらに標的部分を含む。いくつかの実施形態では、標的部分が、小分子、抗体、抗体断片、またはシグナル伝達ペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４が

【0036】

【化21】

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から選択される。いくつかの実施形態では、ポリマーが、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_２０−Ｄ５Ａ_６０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_６０−Ｄ５Ａ_２０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_６０−ＤＢＡ_２０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_４０−ＤＢＡ_４０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_２０−ＤＢＡ_６０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_７６−ＤＰＡ_２４）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_５８−ＤＰＡ_４２）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_３９−ＤＰＡ_６１）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_２１−ＤＰＡ_７９）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_３０−ＤＢＡ_５０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＢＡ_２８−Ｄ５Ａ_５２）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＢＡ_５６−Ｄ５Ａ_２４）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_２０−Ｄ５Ａ_６０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_６０−Ｄ５Ａ_２０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_６０−ＤＢＡ_２０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_４０−ＤＢＡ_４０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_２０−ＤＢＡ_６０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_７６−ＤＰＡ_２４−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_５８−ＤＰＡ_４２−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_３９−ＤＰＡ_６１−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_２１−ＤＰＡ_７９−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_３０−ＤＢＡ_５０−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＢＡ_２８−Ｄ５Ａ_５２−ＡＭＡ_３）、またはＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＢＡ_５６−Ｄ５Ａ_２４−ＡＭＡ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_１１−ＥＰＡ_８９）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＥＡ_２２−ＥＰＡ_７８）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＥＰＡ_９０−ＤＰＡ_１０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＥＰＡ_７９−ＤＰＡ_２１）である。

【0037】

別の態様において、本開示は、式：

【0038】

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

（Ｖ）
［式（Ｖ）において、Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、または

【0039】

【化23】

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或いは金属キレート基であり；ｎは１〜５００の整数であり；Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0040】

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、ｎ_ｘは１〜１０であり；Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４はペンチル、ｎ−プロピル、またはエチルであり；そしてＸ_５はペンチルまたはｎ−プロピルである。）で表される基であり；ｘは１〜１００の整数であり；、Ｒ_４は、式：

【0041】

【化25】

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（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり；ｙは１〜６の整数であり；そしてＲ_５は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}である。］で表されるポリマーを提供する。いくつかの実施形態において、Ｙ_４が蛍光色素である。いくつかの実施形態において、蛍光色素がインドシアニングリーンである。いくつかの実施形態において、ポリマーが、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｄ５Ａ_８０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｄ５Ａ_１００）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_８０）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＤＰＡ_１００）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＥＰＡ_８０）及びＰＥＯ_１１４−Ｐ（ＥＰＡ_１００）である。

【0042】

さらに別の態様において、本開示は、式：

【0043】

【化26】

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で表される化合物を提供する。

【0044】

別の態様において、本開示は、本開示のポリマーのミセルを提供する。

【0045】

さらに別の態様において、本開示は、本開示の第１ポリマーのミセルを含むｐＨ応答性システムであって、ｚが０でなく、Ｙ_４が色素であり、そしてミセルがｐＨ転移点及び発光スペクトルを有するｐＨ応答性システムを提供する。いくつかの実施形態において、ミセルがさらに本開示の第２ポリマーを含み、且つｚが０でなく、Ｙ_４が蛍光消光剤である。いくつかの実施形態において、第２ポリマーは、Ｙ_４が蛍光消光剤である以外は第１のポリマーと同一の式を有する。いくつかの実施形態において、ｐＨ転移点が３〜９の間にある。いくつかの実施形態において、ｐＨ転移点が４〜８の間にある。いくつかの実施形態において、ｐＨ転移点が４〜６の間にある。いくつかの実施形態において、ｐＨ転移点が６〜７．５の間にある。いくつかの実施形態において、ｐＨ転移点が４．３８、４．６７、４．９６、５．２７、５．６３、５．９１、６．２１、６．４５、６．７６、７．０８、または７．４４である。いくつかの実施形態において、発光スペクトルが４００〜８５０の間にある。いくつかの実施形態において、システムが１ｐＨ単位より小さいｐＨ応答（ΔｐＨ_{１０−９０％}）を有する。いくつかの実施形態において、ｐＨ応答が０．２５ｐＨ単位より小さい。いくつかの実施形態において、ｐＨ応答が０．１５ｐＨ単位より小さい。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルが２５より大きい蛍光活性化比を有する。いくつかの実施形態において、蛍光活性化比が５０より大きい。

【0046】

さらに別の態様において、細胞内または細胞外の環境のｐＨをイメージング（画像化）する方法であって、
（ａ）本開示のミセルを環境と接触させ、
（ｂ）環境からの１つ以上の光シグナルを検知し、且つその光シグナルの検知が、ミセルがそのｐＨ転移点に到達して、解離することを示すことを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、光シグナルが蛍光シグナルである。いくつかの実施形態において、細胞内環境を画像化する際、細胞は、ｐＨ応答性システムの取り込みを起こすのに好適な条件下でｐＨ応答性システムと接触する。いくつかの実施形態において、細胞内環境は細胞の一部である。いくつかの実施形態において、細胞の一部が、リソソームまたはエンドソームである。いくつかの実施形態において、細胞外環境が腫瘍または血管細胞である。いくつかの実施形態において、細胞外環境が血管内または血管外である。いくつかの実施形態において、腫瘍環境のｐＨのイメージングがセンチネルリンパ節または複数のセンチネルリンパ節の画像化を含む。いくつかの実施形態において、センチネルリンパ節または複数のセンチネルリンパ節のイメージングが、腫瘍の外科的切除及び腫瘍転移の診断を可能にする。いくつかの実施形態において、腫瘍環境のｐＨのイメージングが腫瘍のサイズ及び境界の決定を可能にする。いくつかの実施形態において、腫瘍環境のｐＨの画像化が、手術中の腫瘍のより正確な除去を可能にする。いくつかの実施形態において、センチネルリンパ節または複数のセンチネルリンパ節のｐＨのイメージングが、手術中のセンチネルリンパ節または複数のセンチネルリンパ節のより正確な除去を可能にする。いくつかの実施形態において、方法は、さらに：
（ａ）細胞を対象の化合物と接触させ；
（ｂ）その環境で１つ以上の光シグナルを検知し；及び
（ｃ）細胞と対象の化合物との接触後に、光シグナルの変化が起こったか否かを決定することを含む。いくつかの実施形態において、対象の化合物が、薬、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子である。

【0047】

さらに別の態様において、本開示は、標的細胞に対象の化合物を送達する方法であって、
（ａ）対象の化合物を、請求項１〜５５のポリマーのミセルと接触させ；及び
（ｂ）標的細胞のｐＨがｐＨ応答性システムの解離及び化合物の放出をトリガーする条件下で、標的細胞をｐＨ応答性システムと接触させ、これにより対象の化合物を送達することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の化合物を細胞内に送達する。いくつかの実施形態において、対象の化合物を細胞に送達する。いくつかの実施形態において、対象の化合物が、薬、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、または小分子である。いくつかの実施形態において、ミセルを患者に投与する。

【0048】

さらに別の態様において、患者の腫瘍を切除する方法であって、
（ａ）本開示のｐＨ応答性システムを有効量で患者に投与し；
（ｂ）患者の１つ以上の光シグナルを検知し；且つその光シグナルは腫瘍の存在を示し；そして
（ｃ）腫瘍を手術により切除することを含む前記方法を提供する。

【0049】

いくつかの実施形態において、光シグナルが腫瘍の領域境界を示す。いくつかの実施形態において、腫瘍を９０％切除するか、または９５％切除するか、または９９％切除する。いくつかの実施形態において、固体腫瘍等の腫瘍が、がん由来のものである。いくつかの実施形態において、がんが、乳がんまたは頭頸部扁平上皮がん等の頭頸部がんである。ｐＨ応答性システムが、式：

【0050】

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

［上式において、ｘが３０〜１５０の整数であり、ｙが１または２の整数であり；ｘ及びｙは当該ポリマー全域にランダムに分布し；そしてＩＣＧが蛍光色素インドシアニングリーンである。］で表されるポリマーからなる。

【0051】

さらに別の態様において、本開示は、患者におけるエンドソーム／リソソームｐＨ停止を起こし易いがんを治療する方法であって、本開示のｐＨ応答性システムを、それが必要な患者に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、がんが非小細胞肺がん等の肺がんである。いくつかの実施形態において、がんが、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異またはＬＫＢ１伝子の突然変異を含む。他の実施形態において、がんが、ＫＲＡＳ及びＬＫＢＩの両方の遺伝子の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、方法が、アポトーシスを誘導するのに十分である。

【0052】

さらに別の態様において、本開示は、細胞の遺伝子突然変異の存在を同定する方法であって：
（ａ）２つ以上のミセルを含むｐＨ応答性システムを、細胞または細胞環境と接触させ、
（ｂ）環境からの２つ以上の光シグナルを検出し、且つ光シグナルの検出が、ミセルの１つがそのｐＨ転移点に到達し、解離したことを示し；及び
（ｃ）細胞中の遺伝子突然変異の存在を判定するために、２つ以上の光シグナルをに関連づけること含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子突然変異が、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異である。いくつかの実施形態において、２つ以上のミセルが、６．９、６．２、または５．３のｐＨ転移点を有する３つのミセルを含む。いくつかの実施形態において、３つのミセルのそれぞれがＰＤＰＡ−ＴＭＲ、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５から選択されるポリマーから作製される。いくつかの実施形態において、方法が、インビボで行われ、１つ以上のミセルを患者に投与することにより細胞と接触する。

【0053】

さらに別の態様において、本開示は、腫瘍アシドーシスの経路を同定する方法であって：
（ａ）本開示の１つ以上のミセルを含むｐＨ応答性システムを、細胞または細胞環境と接触させ、
（ｂ）細胞を、ｐＨ調節経路の阻害剤と接触させ；
（ｃ）細胞または細胞環境からの２つ以上の光シグナルを検出し、且つ光シグナルの検出が、ミセルの１つがそのｐＨ転移点に到達し、解離したことを示し；及び
（ｄ）２つ以上の光シグナルを腫瘍アシドーシスの経路の変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関連づけることを含む前記方法を提供する。

【0054】

いくつかの実施形態において、ｐＨ調節経路の阻害剤が、モノカルボキシレート輸送体、炭酸脱水酵素、アニオン交換器、Ｎａ^＋−重炭酸塩交換器、Ｎａ^＋／Ｈ^＋−交換器、またはＶ−ＡＴＰａｓｅの阻害剤である。いくつかの実施形態において、１つ以上のミセルが、ポリマー骨格に結合した２つ以上のフルオロフォアを有するポリマーを含む。いくつかの実施形態において、方法が１つのミセルを含み、ミセルが、異なるフルオロフォアまたは異なるＲ_３基を有する２種以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセルが、異なるフルオロフォア及び異なるＲ_３基を有する２種以上のポリマーを含む。

【0055】

腫瘍の存在を決定するために患者をイメージングする方法であって：
（ａ）本開示の１つ以上のミセルを含むｐＨ応答性システムを、腫瘍と接触させ、このミセルはさらにＲ_１に金属キレート基を含んでおり；
（ｂ）１つ以上のＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像スキャンを集め；及び
（ｃ）１つ以上の光画像スキャンを集め、且つ光シグナルの検出が、ミセルの１つがそのｐＨ転移点に到達し、解離したことを示すことを含み、且つ
１つ以上のＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像スキャン及び１つ以上の光画像スキャンが、腫瘍の同定をもたらす前記方法を提供する。

【0056】

いくつかの実施形態において、光画像スキャンが、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像スキャンの前に集められる。他の実施形態において、光画像スキャンが、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像スキャンの後に集められる。いくつかの実施形態において、光画像スキャンが、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像スキャンと同時に集められる。いくつかの実施形態において、画像スキャンが、ＰＥＴ画像スキャンである。他の実施形態において、画像スキャンが、ＳＰＥＣＴ画像スキャンである。いくつかの実施形態において、金属キレート基が^６４Ｃｕイオンと結合している。いくつかの実施形態において、金属キレートが、窒素含有大員環である。いくつかの実施形態において、窒素含有大員環が：

【0057】

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

［上式において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_７’、Ｒ_８’、Ｒ_９’、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ａ’、ｂ’、及びｃ’は上記と同義である。］である。いくつかの実施形態において、窒素含有大員環が：

【0058】

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0059】

さらに別の態様において、本開示は、式：

【0060】

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＸ）
［式（ＩＸ）において、Ｒ_１は、金属キレート基であり；ｎは１〜５００の整数であり；Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0061】

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、ｎ_ｘは１〜１０であり；Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｘは１〜１５０の整数であり；Ｒ_４は、式：

【0062】

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、ｎ_ｚは１〜１０であり；Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり；ｙは０〜６の整数であり；そしてＲ_４は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}であり；且つＲ_３及びＲ_４が同一の基ではないとの条件で、Ｒ_３及びＲ_４は当該ポリマー内においてどのような順序で現れても良い。］で表されるポリマーを提供する。いくつかの実施形態において、Ｒ_３が

【0063】

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

［上式において、Ｘ_１、Ｘ_４、及びＸ_５は上記と同義である。］
である。

【0064】

いくつかの実施形態において、Ｘ_１がメチル等のアルキル_{（Ｃ≦１２）}である。いくつかの実施形態において、Ｘ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}または置換アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}である。いくつかの実施形態において、Ｘ_４及びＸ_５は、一緒になって、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−である。いくつかの実施形態において、Ｒ_４が

【0065】

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

［上式において、Ｙ_１及びＹ_４は上記と同義である。］である。いくつかの実施形態において、Ｙ_４が色素である。いくつかの実施形態において、Ｙ_４が蛍光色素である。いくつかの実施形態において、Ｙ_１がメチル等のアルキル_{（Ｃ≦１２）}である。いくつかの実施形態において、ｘが４０、６０、８０、１００、または１２０である。いくつかの実施形態において、ｙが１、２、または３であり、ｙが３である場合もある。いくつかの実施形態において、ポリマーが、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_４０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_６０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_８０−ｒ−ＩＣＧ_３）、ＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_１００−ｒ−ＩＣＧ_３）、またはＰＥＯ_１１４−Ｐ（Ｃ７Ａ_１２０−ｒ−ＩＣＧ_３）であり、且つＰＥＯ基は金属キレート基でキャップされている。

【0066】

本明細書で使用されているように、「ｐＨ応答性システム」、「ミセル」、「ｐＨ応答性ミセル」、「ｐＨ感受性ミセル」、「ｐＨ活性化ミセル」、及び「ｐＨ応答性ミセル（ｐＨＡＭ）ナノ粒子」は、本明細書では区別すること無く使用され、１種以上のコポリマーを含むミセルを意味し、これはｐＨ（例えば、あるｐＨ超過または未満）に依存して解離する。非限定的例として、あるｐＨにおいて、ブロックコポリマーは実質的にミセル形態にある。ｐＨ変化（例えば、減少）として、ミセルは解離し始め、そして、さらなるｐＨ変化（例、さらなる減少）として、ブロックコポリマーは解離した（非−ミセルの）形態で実質的に存在する。

【0067】

本明細書で使用されているように、「ｐＨ転移範囲」は、それを超えるとミセルが解離するｐＨ範囲を意味する。

【0068】

本明細書で使用されているように、「ｐＨ転移値」（ｐＨ_ｔ）は、ミセルの半分が解離するｐＨを意味する。

【0069】

本明細書に記載された方法及び組成物のいずれも、他のどの方法及び組成物に関して実施することができると考えられる。

【0070】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の含むの任意の形態）、「有する（ｈａｖｅ）」（及び「有する（ｈａｓ）」及び「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」等の有するの任意の形態）、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」（及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の含有するの任意の形態）、並びに「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）（及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の包含するの任意の形態）は、オープンエンドの連結動詞である。結果として、１つ以上の記載された工程または要素を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムは、それらの記載の工程または要素を有するが、それらの工程または要素のみを有することに限定されず；それは、記載されていない要素または工程を有してもよい（即ち、カバーしてもよい）。同様に、１つ以上の記載の特徴を「含む」、「有する」、「含有する」、または「包含する」方法、組成物、キット、またはシステムの要素は、それらの特徴を有するが、それらの特徴のみを有することに限定されず；それは、記載されていない特徴を有してもよい。

【0071】

本発明の方法、組成物、キット、及びシステムのいずれかの態様が、記載された工程及び／または特徴を含む／包含する／含有する／有するのではなく、記載された工程及び／または特徴からなるまたはそれらから本質的になっても良い。従って、請求項のいずれかにおいて、用語「からなる」または「から本質的になる」を、そうでなければオープンエンドの連結動詞を使用していたものから所定の請求項の範囲を変更するために、上記に記載のオープンエンドの連結動詞のいずれかに置換してもよい。

【0072】

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すようにまたは選択肢が相互に排他的であることが明確に示されない限り、「及び／または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみ並びに「及び／または」を指す定義をサポートしている。本出願全体に亘って、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられる装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。長年の特許法に従って、単語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、特許請求の範囲または明細書において単語「含む」と共に使用される場合、特段の記載が無い限り、１つまたは複数を意味する。

【0073】

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本発明の具体的な態様を示しているが、例示のためのみに記載されていると理解されるべきである、なぜなら、本発明の主旨及び範囲内における様々な変更及び改質はこの詳細な説明から当業者に明らかになるためである。

【0074】

本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を有する本特許または本出願のコピーは、要求により或いは必要な費用の支払いに応じて事務所より提供されるであろう。

【0075】

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれている。本開示は、本明細書に示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1】色素−または蛍光消光剤（ＦＱ）−結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｒ_１−γ−Ｒ_２）コポリマーの合成を示す。ＰＲ断片の疎水性は、２種のモノマー（Ｒ_１またはＲ_２：Ｅｔ，エチル；Ｐｒ，プロピル；Ｂｕ，ブチル；Ｐｅ，ペンチル）のモル分率を変化させることにより連続的に制御され得る。

【図2】ランダムコポリマーの異なるモノマー（ＤＥＡ及びＤ５Ａ）比でのＰＥＯ−Ｐ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）（ｘ＋ｙ＝８０）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。０．９ｐｐｍ及び１．１ｐｐｍのピークが、疎水性ＰＲブロックのモノマー組成を推定するために使用された。

【図3】ランダムコポリマーの異なるモノマー（ＤＰＡ及びＤＢＡ）比でのＰＥＯ−Ｐ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）（ｘ＋ｙ＝８０）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。１．３ｐｐｍ及び１．４ｐｐｍのピークが、疎水性ＰＲブロックのモノマー組成を推定するために使用された。

【図4】疎水性ＰＲブロックのモノマー（ＤＥＡ及びＤＰＡ）比を調節することにより７．８、７．４、７．１、６．８、６．５及び６．２のｐＨ_ｔ値を有するナノプローブ組成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。０．９ｐｐｍ及び１．０〜１．１ｐｐｍのピークが、疎水性ＰＲブロックのモノマー組成を推定するために使用された。

【図5】疎水性ＰＲブロックのモノマー（ＤＰＡ及びＤＢＡ）比を調節することにより６．２、５．９、５．６及び５．３のｐＨ_ｔ値を有するナノプローブ組成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。１．３ｐｐｍ及び１．４ｐｐｍのピークが、疎水性ＰＲブロックのモノマー組成を推定するために使用された。

【図6】疎水性ＰＲブロックのモノマー（ＤＢＡ及びＤ５Ａ）比を調節することにより５．３、５．０、４．７及び４．４のｐＨ_ｔ値を有するナノプローブ組成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。１．３ｐｐｍ及び１．４ｐｐｍのピークが、疎水性ＰＲブロックのモノマー組成を推定するために使用された。

【図7】（図７Ａ）ｐＨ_ｔの制御に対するＰＤＥＡ／ＰＤ５Ａ分子混合対Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）コポリマーの戦略の比較。（図７Ｂ）ｐＨの関数としての２種のモノマーの異なる比を有するＰ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）ナノプローブの正規化蛍光強度。（図７Ｃ）ナノプローブｐＨ_ｔは、ＰＲ断片のＤＥＡ−ＭＡモノマーのモル分率と直線的に相関している。ポリマー濃度はこれらの検討では０．１ｍｇ／ｍＬであった。

【図8】ＰＤＥＡ／ＰＤ５Ａミセルブレンド対Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）コポリマーナノプローブのｐＨ−依存性蛍光スペクトルを示す。Ｃｙ５色素（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４６／６６２ｎｍ）を対応するコポリマーのＰＲブロックに結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）。正規化蛍光強度対ｐＨの関係は図７Ａに示した。

【図9】粗調整されたＰ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）ナノプローブのｐＨ−依存性蛍光スペクトルを示す。Ｃｙ５色素（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４６／６６２ｎｍ）をコポリマーのＰＲブロックに結合した。正規化蛍光強度対ｐＨの関係は図７Ｂに示した。

【図10】（図１０Ａ）Ｃｙ５−結合Ｐ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）ナノプローブについてのｐＨ関数としての正規化蛍光強度。（図１０Ｂ）Ｐ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）対Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）ナノプローブについてのｐＨ関数としての誘導蛍光プロット（ｄ_Ｆ／ｄ_ｐＨ、４ａからのデータ）。近い疎水性を有するメタクリレートモノマーの使用（即ち、ＤＰＡ／ＤＢＡ対ＤＥＡ／Ｄ５Ａ）は極めて鋭いｐＨ転移をもたらした。（図１０Ｃ）異なるコポリマー組成物の疎水性の小さいモノマーのモル分率の関数としての、ナノプローブｐＨ_ｔの直線関係。これらの関係は、オペレータ−予め決められたｐＨ_ｔを達成するために最適のコポリマーを選択するための標準曲線として機能する。（図１０Ｄ）ｐＨ（４〜７．４）の全生理的範囲をカバーする０．３ｐＨ増加分を有するＵＰＳナノプローブの代表的なライブラリー。全てのナノプローブはＣｙ５色素と結合した。ポリマー濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであった。

【図11】微調整されたＰ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）ナノプローブのｐＨ依存蛍光スペクトルを示す。Ｃｙ５色素（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４６／６６２ｎｍ）をコポリマーのＰＲブロックに結合した。正規化蛍光強度対ｐＨの関係は図１０Ａに示した。

【図12】ＵＰＳライブラリーナノプローブのｐＨ依存蛍光スペクトルを示す。ＵＰＳナノプローブの組成は表３に示す。Ｃｙ５色素（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４６／６６２ｎｍ）をコポリマーのＰＲブロックに結合した。正規化蛍光強度対ｐＨの関係は図１０Ｄに示した。

【図13】０．３ｐＨ増加分を有する１０個のナノプローブからなるＵＰＳライブラリーの蛍光イメージングを示す。各ＵＰＳナノプローブの組成は表３に示す。Ｃｙ５色素（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４６／６６２ｎｍ）をコポリマーのＰＲブロックに結合した。ナノプローブの画像はＭａｅｓｔｒｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍで撮影された。

【図14】（図１４Ａ）ＰＥＯ−ＰＯＰＡ−Ｄｙｅ／ＦＱコポリマーの構造、（図１４Ｂ）大きいストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）を有する選択されたフルオロフォアの構造、（図１４Ｃ）選択されたローダミン色素の構造、（図１４Ｄ）選択されたＢｏｄｉｐｙ色素の構造、（図１４Ｅ）選択されたシアニン色素の構造、を示す。全てのフルオロフォアの励起光／蛍光波長を図１４Ｂ−Ｅに、それぞれ示した。（図１４Ｆ）選択された蛍光消光剤の構造を示す。各消光剤の活性消光範囲は丸括弧に示した。

【図15】超ｐＨ感受性（ＵＰＳ）ミセルナノプローブの模式図を示す。（図１５Ａ）ユニマー状態（ｐＨ＜ｐＨ_ｔ）において、ポリマー解離がフルオロフォア消光剤の分離及び強い蛍光発光をもたらした。ミセル状態（ｐＨ＞ｐＨ_ｔ）において、蛍光消光剤が、フルオロフォアの発光強度を劇的に抑制した。（図１５Ｂ）コポリマー戦略は、ＰＲ断片の疎水性を連続的に微調整する能力によってナノプローブｐＨ_ｔのオペレータが予め決めた制御を達成するために用いられた。

【図16】ＰＤＰＡ−色素／ＰＤＰＡ−ＦＱの異なる比におけるｐＨ５．０（オン）及びｐＨ７．４（オフ）での混合ナノ粒子の蛍光強度比を示す。（図１６Ａ）より大きなストークスシフト（ＡＭＣＡ、ＭＢ及びＰＰＯ）を有するフルオロフォアの結果。（図１６Ｂ）ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーのフルオロフォアの結果。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図17】（図１７Ａ〜Ｆ）蛍光消光剤無し（左欄）または蛍光消光剤有り（右欄）のナノプローブのｐＨ依存性蛍光スペクトルを示す。大きなストークスシフトを有するフルオロフォアはこの検討で示した。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図18】（図１８Ａ〜Ｆ）異なるＰＤＰＡ−色素ナノプローブの蛍光強度比を顕著に増加させたＦＱ−結合ＰＤＰＡコポリマーを示す。ｐＨ７．４に対する異なるｐＨでの蛍光強度（Ｆ_ｐＨ／Ｆ_７．４）がコポリマーついてのみプロットされ（図１８Ａ、１８Ｃ及び１８Ｅ）、そして加えてＦＱ−結合コポリマーもプロットされた（図１８Ｂ、１８Ｄ及び１８Ｆ）。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図19】（図１９Ａ〜Ｆ）蛍光消光剤無し（左欄）または蛍光消光剤有り（右欄）のナノプローブのｐＨ依存性蛍光スペクトルを示す。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーのフルオロフォアがこの検討で示された。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図20】（図２０Ａ〜Ｆ）蛍光消光剤無し（左欄）または蛍光消光剤有り（右欄）のナノプローブのｐＨ依存性蛍光スペクトルを示す。ローダミンファミリーのフルオロフォアがこの検討で示された。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図21】（図２１Ａ〜Ｅ）蛍光消光剤無し（左欄）または蛍光消光剤有り（右欄）のナノプローブのｐＨ依存性蛍光スペクトルを示す。シアニンファミリーのフルオロフォアがこの検討で示された。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図22】ローダミンファミリー及びシアニンファミリーの色素について、ｐＨ７．４に対する異なるｐＨでの蛍光強度（Ｆ_ｐＨ／Ｆ_７．４）がコポリマーのみについてプロットされ（図２２Ａ及び２２Ｃ）、そして加えてＦＱ−結合コポリマーもプロットされた（図２２Ｂ及び２２Ｄ）ことを示す。フルオロフォア及びＦＱの構造は図１４Ａ〜Ｆに示した。

【図23】（図２３Ａ＆Ｂ）腫瘍における好気的解糖及び酸性細胞外ｐＨ（ｐＨ_ｅ）を示す。（図２３Ａ）がん細胞は酸素が存在するか否かにかかわらずグルコースをラクテート（乳酸塩）に変換する（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。この図は、Ｈｅｉｄｅｎ，ら，２００９が出典である。（図２３Ｂ）３０の異なるヒトがん細胞株からの２６９の腫瘍に、酸性ｐＨ_ｅが測定された。６．７１〜７．０１の変化範囲での平均ｐＨ_ｅ＝６．８４は血液ｐＨ（７．４）より低い。表はＶｏｌｋ，ら．，１９９３の出典である。

【図24】広いｐＨ範囲（４〜７．４）及び大きい蛍光発光（４００〜８２０ｎｍ）に亘る１０ナノプローブからなるＵＰＳライブラリーの例を示す。各ナノプローブはそれの転移ｐＨ及びフルオロフォアによりコードされる。４．４−ＡＭＣＡ及び４．７−ＭＢの画像は３６５ｎｍの励起光によりカメラで撮影された。ナノプローブ溶液の残りの画像はＭａｅｓｔｒｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍで撮影された。

【図25】２つの独立メカニズムによるイオン化可能ポリマーミセルの自己組織化を示す。左のパネルは、ｐＨ増加によるミセル化誘導を示し、ここではＰＲ断片は中和され、疎水性になり、ミセル形成を推進する。驚くべきことに、低ｐＨでのカオトロピックイオン（ＣｌＯ_４⁻等のＣＡ）の添加がアンモニウムＰＲ断片とのミセル化をもたらす（右のパネル）。異なる疎水性側鎖を有する一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマー（１〜５）の構造を差し込み図で示される。

【図26】（図２６Ａ）カオトロピックアニオンが、プロトン化ＰＲ断片を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマーからミセル自己組織化を誘導するが、これはタンパク質を溶解させる（塩溶）その能力と反対の「塩析」効果による。（図２６Ｂ）ＣＡ−誘導自己組織化ミセルを開発するためのＦＲＥＴ設計の図。ＣＡの添加がミセル形成及び供与体（ＴＭＲ）から受容体（Ｃｙ５）色素への効率の良いエネルギー移動をもたらす。（図２６Ｃ）カオトロピックアニオンが抗−ホフマイスター・トレンドを示すミセル自己組織化を誘導した。

【図27】カオトロッピックアニオンの異なる濃度におけるＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＴＭＲ）／ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−Ｃｙ５）のＦＲＥＴポリマーペアーの蛍光スペクトルを示す。サンプルは、λ_ｅｘ＝５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルは５６０〜７５０ｎｍから収集された。全ての実験はＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨ（ｐＨ_ｔ＝６．１）より低いｐＨ＝４で行った。

【図28】コスモトロッピック及び境界アニオンの異なる濃度におけるＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＴＭＲ）／ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−Ｃｙ５）のＦＲＥＴポリマーペアーの蛍光スペクトルを示す。サンプルは、λ_ｅｘ＝５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルが５６０〜７５０ｎｍから収集された。全ての実験はＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨ（ｐＨ_ｔ＝６．１）より低いｐＨ＝４で行った。

【図29】Ｃｌ⁻の存在下（図２９Ａ）及びＣｌＯ_４⁻の存在下（図２９Ｂ）におけるコポリマー３のミセル転移のＴＥＭ及びＤＬＳ分析を示す。両方のアニオンの濃度は５０ｍＭ（ｐＨ＝５．０）に制御した。スケールバーはＴＥＭ画像において１００ｎｍである。

【図30】ｐＨ７．４でＣｌ⁻（５０ｍＭ）の存在下にコポリマー３ミセルのミセル形態及び流体力学直径についてのＴＥＭ分析（図３０Ａ）及びＤＬＳ分析（図３０Ｂ）を示す。スケールバーはＴＥＭ画像において１００ｎｍである。

【図31】ｐＨ７．４でＣｌＯ_４⁻（５０ｍＭ）の存在下にコポリマー３ミセルのミセル形態及び流体力学直径についてのＴＥＭ分析（図３１Ａ）及びＤＬＳ分析（図３１Ｂ）を示す。スケールバーはＴＥＭ画像において１００ｎｍである。

【図32】ｐＨ７．４及び５．０でＣｌＯ_４⁻（５０ｍＭ）の存在下にＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡコポリマーのミセル形態及び流体力学直径についてのＴＥＭ分析（図３２Ａ）及びＤＬＳ分析（図３２Ｂ）を示す。スケールバーはＴＥＭ画像において１００ｎｍである。

【図33】Ｃｌ⁻（０〜２，０００ｍＭ）の異なる初期濃度でのＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＴＭＲ）／ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−Ｃｙ５）のＦＲＥＴポリマーペアーの蛍光スペクトルを示す。異なる濃度のＣｌＯ_４⁻（Ｍで）アニオンがミセル形成の誘導のため添加された。サンプルはλ_ｅｘ＝５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルが５６０〜７５０ｎｍから収集された。全ての実験はＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨ（ｐＨ_ｔ＝６．１）より低いｐＨ＝４で行った。

【図34】異なる競合するＣｌ⁻濃度（０〜２，０００ｍＭ）にて、ＣｌＯ_４⁻濃度の関数としてのＦＲＥＴ転移効率を示す。

【図35】ＳＯ_４^２−（０〜５００ｍＭ）の異なる初期濃度でのＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＴＭＲ）／ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−Ｃｙ５）のＦＲＥＴポリマーペアーの蛍光スペクトルを示す。異なる濃度のＣｌＯ_４⁻（Ｍで）がミセル形成の誘導のため添加された。サンプルはλ_ｅｘ＝５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルが５６０〜７５０ｎｍから収集された。全ての実験はＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨ（ｐＨ_ｔ＝６．１）より低いｐＨ＝４で行った。

【図36】異なる競合するＳＯ_４^２−濃度（０〜５００ｍＭ）における、ＣｌＯ_４⁻濃度の関数としてのＦＲＥＴ転移効率を示す。

【図37】（図３７Ａ）ＳＯ_４^２−アニオンの異なる濃度の存在下におけるコポリマー３のＣｌＯ_４⁻誘導された自己組織化を示す。（図３７Ｂ）競合Ｃｌ⁻及びＳＯ_４^２−アニオンのイオン強度の関数としての、ＣｌＯ_４⁻誘導された自己組織化からのＦＲＥＴ効率（ＦＣ_５０）。溶液ｐＨはこれらの検討では４に制御された。

【図38】（図３８Ａ）ＰＲ断片の疎水性強度はミセル誘導のＣｌＯ_４⁻の能力に影響を与えることを示す。より疎水性のＰＲ断片（例えば、５のペンチル基）は、ＣｌＯ_４⁻感受性を増加させミセル形成を誘導する。（図３８Ｂ）経験的モデルは、イオン性ポリマーミセルの自己組織化に２つの重要な寄与因子（疎水性アルキル鎖及びカオトロピックアニオン）を描いている。

【図39】異なる疎水性強度のＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｒ−ｒ−ＴＭＲ）／ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｒ−ｒ−Ｃｙ５）のＦＲＥＴポリマーペアーの蛍光スペクトルを示す（ＰＲ断片はメチルからペンチル側鎖に変化した）。異なる濃度のＣｌＯ_４⁻（Ｍで）がミセル形成の誘導のため添加された。サンプルはλ_ｅｘ＝５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルが５６０〜７５０ｎｍから収集された。全ての実験はＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨ（ｐＨ_ｔ＝６．１）より低いｐＨ＝４で行った。

【図40】６．９に極めて鋭いｐＨ転移を有するＵＰＳ_６．９ナノプローブを示す。（図４０Ａ）イオン化可能なブロックコポリマーの構造及びそのｐＨ−依存性蛍光発光性。高いｐＨ（即ち、７．４または７．２）で、ＵＰＳは静かに存在する。６．９より低いｐＨで、ＵＰＳはミセル形成の結果として、活性化される。ｐＨ応答は、仮定の小分子ｐＨセンサー（青い破線）よりはるかに鋭い。（図４０Ｂ）異なるｐＨ緩衝液中のＵＰＳ_６．９溶液の蛍光画像。（図４０Ｃ）それぞれｐＨ７．４及び６．７における、ミセル及びユニマー状態のＵＰＳ_６．９の透過型電子顕微鏡写真（ポリマー濃度＝１ ｍｇ／ｍＬ、スケールバー＝１００ｎｍ）。

【図41】（図４１Ａ及びＢ）匹敵するサイズを有するがｐＨ転移が異なる（ｐＨ_ｔ＝６．３及び６．９）２つのＵＰＳのＰＫ／ＢＤを示す。

【図42】（図４２Ａ）初期ＨＮＳＣＣ腫瘍の除去後、首側の代表的なセンチネルリンパ節のＮＩＲ画像を示す。（図４２Ｂ）組織構造（Ｈ＆Ｅ）が節構造であることを確認することができた。選択された節は、節の皮質領域におけるＨＮ５細胞（黒矢印）の存在を示した。

【図43】ＰＩＮＳナノプローブの合成及び最適化を示す。（図４３Ａ）ＩＣＧ結合ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＰＡ_ｘ−ｒ―ＩＣＧ_ｙ）ブロックコポリマーの合成スキーム。（図４３Ｂ〜Ｄ）ＰＥＰＡ断片長のｐＨ−依存性蛍光特性への影響の調査：（図４３Ｂ）蛍光強度、（図４３Ｃ）７．４を超える対象のｐＨでの蛍光活性化、及び（図４３Ｄ）正規化蛍光強度。ＰＥＰＡ断片長を変化させ（ｘ＝４０、６０、８０、１００、１２０）、ポリマー鎖当たりＩＣＧ数が１に達した。（図４３Ｅ〜Ｇ）ＩＣＧ結合数のｐＨ−依存性蛍光特性への影響の調査：（図４３Ｅ）蛍光強度、（図４３Ｆ）７．４を超える対象のｐＨでの蛍光活性化、及び（図４３Ｇ）正規化蛍光強度。ポリマー鎖当たりＩＣＧ数を変化させ（ｙ＝０．５、１．２）、ＰＥＰＡ断片長を１００に制御した。（図４３Ｈ及びＩ）（図４３Ｈ）ｐＨ７．４のヒト血清及び（図４３Ｉ）ｐＨ６．０のヒト血清において、ＰＥＰＡ_１００−ＩＣＧ_ｙ（ｎ＝０．５、１、２）のモノマーピーク強度（λ＝８０８ｎｍ）へ正規化したＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペルトル。これらのデータをもとに、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＰＡ_１００−ｒ―ＩＣＧ_１）を動物イメージング研究のための最適な組成として選択した。

【図44】ＰＩＮＳの特性評価を示す。（図４４Ａ）ＰＩＮＳ濃度及びｐＨの関数としての蛍光強度の３Ｄプロット。（図４４Ｂ）ｐＨ−感受性オフ／オン活性化を示すＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）手術カメラによるＰＩＮＳ溶液の近ＩＲ画像。（図４４Ｃ）それぞれ、ｐＨ＝７．４及び６．５でのミセル及びユニマー状態における、ＰＩＮＳの透過型電子顕微鏡写真。ポリマー濃度＝１ｍｇ／ｍＬ；スケールバー＝１００ｎｍ。貯蔵時の（図４４Ｄ）ＰＢＳ中または（図４４Ｅ）５０％ヒト血清中におけるｐＨ６．５（黒バー）及びｐＨ７．４（白バー）でのＰＩＮＳ蛍光強度。（図４４Ｆ）貯蔵時のＰＩＮＳナノプローブの数加重流体力学半径。（図４４Ｄ〜図４４Ｆ）：−２０℃での１０％ｗ／ｖスクロース溶液の貯蔵条件。これらの結果は、ＰＩＮＳが１０％ｗ／ｖスクロース溶液において−２０℃で６カ月にわたる貯蔵において安定であることを示した。

【図45】ヒトＨＮ５同所腫瘍を有するマウスにおけるＰＩＮＳの用量−反応を示す。尾静脈を介して異なる用量のＰＩＮＳ（１．０、２．５及び５．０ｍｇ／ｋｇ）が注射されたマウスの白色光（図４５Ａ）及び近ＩＲ（図４５Ｂ）の画像。ＨＮ５腫瘍強度は、ＰＩＮＳ用量の増加と共に増加した。２５ｍｇ／ｋｇＰＩＮＳに対する等価の色素用量での遊離ＩＣＧ対照は、観察可能な腫瘍の差異は示さなかった。（図４５Ｃ）：選択された時点での異なる用量のＰＩＮＳが注射された代表的なマウスのＮＩＲ画像。静脈注射（ｎ＝３）後の時間の関数としての、腫瘍蛍光強度の定量化（図４５Ｄ）及びノイズに対する腫瘍コントラストの比（図４５Ｅ）。５．０ｍｇ／ｋｇのより高いＰＩＮＳ用量は、筋肉腫瘍のより高いバックグランドシグナルのため、ＣＮＲ値の減少をもたらした。図４５Ｅの結果に基づき、２．５ｍｇ／ｋｇは、腫瘍アシドーシスイメージングのための最適ＰＩＮＳ用量として選択された。

【図46】ＰＩＮＳによる腫瘍アシドーシスイメージングを示す。（図４６Ａ）ＦＤＧを用いるＰＥＴ、またはＰＩＮＳを用いるＮＩＲ蛍光イメージングによる、腫瘍代謝イメージングの略図。（図４６Ｂ）大きいまたは小さいＨＮ５同所腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおけるＦＤＧ−ＰＥＴとＰＩＮＳイメージングとの比較。ＰＩＮＳイメージングは、ＦＤＧ−ＰＥＴに比べて腫瘍検出の感度及び選択性において劇的に改良された。追加の比較は、図４７Ａ〜Ｅにおいて入手できる（各動物グループについてｎ＝３）。

【図47】ＨＮ５同所腫瘍を有するマウスにおけるＰＩＮＳイメージングにおけるＦＤＧ−ＰＥＴとＰＩＮＳイメージングの比較を示す。大きい腫瘍（２００ｍｍ^３、図４７Ａ）または小さい腫瘍（１５ｍｍ^３、図４７Ｂ）を有する同じグループのマウスの、白色光、ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ及びＮＩＲ画像。ＰＩＮＳイメージングで、大、小全ての腫瘍に明白な腫瘍境界描写が認められた。大きな腫瘍について、ＦＤＧ−ＰＥＴは、腫瘍の周辺で、ＰＩＮＳ活性化と両立するより高いシグナルを示した。大きい（図４７Ｃ）及び小さい（図４７Ｄ）腫瘍を有する同じグループのマウスの矢状図。（図４７Ｅ）図４６Ａ及び４６Ｂに示された大きい及び小さい腫瘍のステッチＨ＆Ｅ画像。スケールバー：大きい腫瘍画像で２ｍｍ及び小さい腫瘍画像で５００μｍ。

【図48】ＰＩＮＳイメージングは広い腫瘍特異性を達成したことを示す。ＰＩＮＳナノプローブ（ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）医療用カメラによるイメージ前の２．５ｍｇ／ｋｇの２４時間静脈注射）は、異なる腫瘍モデル（頭頸部、胸（乳房）、腹膜転移、腎臓、脳）及び器官部位において広い腫瘍イメージング有効性を示す。

【図49】ＰＩＮＳナノプローブと異なる医療用カメラとの適合性を示す。（図４９Ａ）医療に用いたＩＣＧイメージングシステム：Ｎｏｖａｄａｑ ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）、Ｈａｍａｍａｓｔｕ ＰＤＥ及びＬｅｉｃａ ＦＬ−８００モデル。（図４９Ｂ）異なる医療用ＩＣＧイメージングシステム下で同じ腫瘍を有するマウスの白色光及びＮＩＲ画像。

【図50】ＰＩＮＳ注射後のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）器官及び腫瘍蛍光イメージを示す。（図５０Ａ）ＨＮ５、（図５０Ｂ）ＦａＤｕ及び（図５０Ｃ）ＨＣＣ４０３４頭頸部腫瘍、（図５０Ｄ）ＮＢＡ−ＭＤ−２３１及び（図５０Ｅ）乳房腫瘍、及び（図５０Ｆ）Ｕ８７グリオーマを有するマウスに、ナノプローブ注射後２４時間の蛍光の主な器官のＮＩＲ画像及び器官の定量化の筋肉に対する比。データは平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）として示される。肝臓は信号飽和のため計算され得なかった。

【図51】同所頭頸部腫瘍を有するマウスの腫瘍アシドーシスガイド手術（ＴＡＧＳ）を示す。（図５１Ａ）初期ＨＮ５腫瘍の切除及びＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）カメラによる残った腫瘍の検出の成功。目による腫瘍床の視診では、周囲の筋肉組織から残った腫瘍を見分けることができなかった（左頂部）。腫瘍組織（Ｔ）及び正常組織（Ｎ）は組織構造により確認された。スケールバー＝１ｍｍ（低倍率）、または１００μｍ（高倍率）。（図５１Ｂ）予想されたように、減量手術は、未処理対照に対して生存利益をもたらさなかった。ＴＡＧＳは、白色光及び他の対照グループに対して顕著に改善された長期の生存を示す（^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。対照及び減量グループはｎ＝７；白色光グループはｎ＝１５；ＴＡＧＳグループはｎ＝１８。

【図52】初期腫瘍、腫瘍境界及び陰性床の組織構造的検証を示す。非生存手術中に集められた試料の各種の５つの代表的Ｈ＆Ｅ組織構造画像。矢印の頭は腫瘍境界試料中におけるがん細胞の存在を示す。スケールバー＝１ｍｍ（頂部矢印、低倍率）、または１００μｍ（底部矢印、高倍率）。

【図53】小さい隠れた乳房腫瘍結節を有するマウスの腫瘍アシドーシスガイド手術を示す。腫瘍病巣（＜１００万細胞）ＳＰＹカメラで見られたが（図５３Ｂ）、目視検出はされなかった（図５３Ａ）。図５３Ｃ：ＴＡＧＳの間に切除された小さい乳房腫瘍結節の代表的な組織構造セクション；スケールバー＝２００μｍ。図５３Ｄ：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、白色光及び未処理対照グループに対してＴＡＧＳにより顕著に改良された長期生存を示した。対照グループはｎ＝７；白色光及びＴＡＧＳグループはｎ＝１０；^＊Ｐ＜０．０５。

【図54】ＰＩＮＳにより異なる腫瘍アシドーシス経路を狙う小分子阻害剤の評価を示す。図５４Ａ：選択された小分子阻害剤の化学構造及び丸括弧内のそれらの対応する標的：アセタゾールアミド（ＣＡＩＸ）、α−シアノ−４−ヒドロキシシナメート、またはＣＨＣ（ＭＣＴ）、カリポリド（ＮＨＥ１）、及びパントプラゾール（プロトンポンプ）。図５４Ｂ：ＰＢＳまたは他の腫瘍アシドーシス阻害剤の注射後免疫応答性ＢａｌＢ／Ｃマウスにおいてトリプルネガティブ４Ｔ１乳房腫瘍を有するマウスの代表的画像。図５４Ｃ：図５４Ｂで示されたＮＩＲ蛍光画像の定量化。蛍光強度はＰＢＳ制御に正規化された。アセタゾールアミドによるＣＡＩＸ阻害剤は腫瘍アシドーシスの最も効率の良い抑制をもたらした。

【図55】図５５Ａ〜図５５Ｅは健康なＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて静脈内投与されたＰＩＮＳの安全性評価を示す。図５５Ａ：ＰＢＳ制御と比較された、２００または２５０ｍｇ／ｋｇＰＩＮＳのボーラス注射後のＣ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスの体重の正規化変化。図５５Ｂ〜５５Ｅ：異なる用量でＰＩＮＳのボーラス注射後及び選択された時点後に犠牲になったＣ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスの、肝臓（図５５Ｂ及び５５Ｃ）及び腎臓（図５５Ｄ及び５５Ｅ）の機能についての血清試験。全グループはｎ＝５。略語：ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＯＴ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ；ＢＵＮ、血中尿素窒素；ＣＲＥ、クレアチニン；点線は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの典型的な野生型平均値を示す。

【図56】ＰＩＮＳの安全性評価のための主要な器官の組織構造分析を示す。ＰＩＮＳのボーラス注射（２５０ｍｇ／ｋｇ）または注射の繰り返し（２５ｍｇ／ｋｇ、５回注射）後及び選択された時点（各グループｎ＝５）後に犠牲になったＣ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスからの主な器官の代表的なＨ＆Ｅ断面。２５０ｍｇ／ｋｇで、微小脂肪変性が早い時点で（１日目及び７日目）観察されたが、２８日目に回復した。脾臓、腎臓及び心臓は異常を示さなかった。繰り返し注射については、主な器官なのいずれにも異常は観察されなかった。

【図57】広い生理学的ｐＨ範囲に亘って定義された鋭い緩衝能を有するＵＰＳナノ粒子ライブラリーを示す。（図５７Ａ）ＵＰＳナノ粒子の緩衝効果、及び微調整された疎水性及びｐＫ_ａを有するＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２）コポリマーの化学構造の略図。各コポリマーの組成は表１１に示されている。（図５７Ｂ）０．４ＭＨＣｌを用いるＵＰＳ_６．２、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_４．４含有溶液のｐＨ滴定。最大緩衝液ｐＨは各コポリマーの見かけのｐＫ_ａに対応する。クロロキン（ＣＱ、ｐＫ_ａ＝８．３及び１０．４）、小分子塩基及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を比較のために含んだ。（図５７Ｃ）ＵＰＳライブラリーの各成分の緩衝能（β）を、４．０〜７．４のｐＨ範囲でｐＨ関数としてプロットした。異なるｐＨ値で、ＵＰＳナノ粒子は緩衝強度でＣＱに対して３０〜３００倍高かった。Ｌ．Ｅ．及びＥ．Ｅ．は、それぞれ、後期エンドソーム及び早期エンドソームの略語である。

【図58】色素−結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ジブロックコポリマーの合成を示す。ＰＲ断片は、疎水性とｐＨ転移を微調整するために異なるモル分率の２種のモノマーからのランダムブロックからなる（表１０参照）。Ｃｙ５色素の構造も示されている。

【図59】ＵＰＳナノプローブライブラリーのＴＥＭ画像を示す。ナノプローブはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解され、ＴＥＭ分析の前にカーボングリッド上で乾燥された。リンタングステン酸は逆染色法に使用された。全ての画像のスケールバー＝１００ｎｍ。

【図60】ＵＰＳナノプローブライブラリーの各成分のｐＨ滴定を示す。ＨＣｌ（０．４Ｍ）を、１０個全てのＵＰＳナノプローブのミセル溶液（２ｍｇ／ｍＬポリマー濃度またはアミノ基量に基づく８ｍＭ）、クロロキン溶液（２ｍｇ／ｍＬまたはアミノ基量に基づく１２．５ｍＭ）及びＰＥＩ（分岐、ＭＷ１０，０００Ｄａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．）溶液（０．３ｍｇ／ｍＬまたはアミノ基量に基づく７．３ｍＭ）を滴定するために徐々に添加した。ｐＨ／導電率計（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）を、滴下中のｐＨの変化をモニターするために使用した。

【図61】常時オン／オフ−オンのＵＰＳナノ粒子合成及び特性評価を示す。（図６１Ａ）及び（図６１Ｂ）デュアル−レポーターナノ粒子の略図。ミセル状態で、常時オン色素はオン／オフのフルオロフォアの消光剤として機能する。ミセルが解離した時、常時オン及びオン／オフのフルオロフォアは独立して蛍光発光することができる。ＢＯＤＩＰＹ（図６１Ａ）及びＣｙ３．５（図６１Ｂ）のオン／オフ比は、これらの２種の色素と結合したポリマーの比が変化した時に、変化する。６０％のＢＯＤＩＰＹ結合コポリマーと４０％のＣｙ３．５結合コポリマーとの重量分率が最後の組み合わせとして選択された。（図６１Ｃ）ｐＨ関数としてのＵＰＳ_６．２ナノプローブの蛍光シグナル増幅。画像は、グリーン及びイエローフィルタを用いてＭａｅｓｔｒｏインビボイメージングシステム（ＣＲＩ）で捉えられた。

【図62】ＨｅＬａ細胞におけるエンドサイトーシスオルガネラのｐＨ感受性イメージング及び緩衝化を示す。（図６２Ａ）ＵＰＳ_６．２の低用量（１００μｇ／ｍＬ）及び高用量（１，０００μｇ／ｍＬ）への５分間暴露の後の、指示された時点でのＨｅＬａの代表的共焦点画像。核はＨｏｅｃｈｓｔで青に染色した。スケールバー＝１０μｍ。（図６２Ｂ）常時オン／オフ−オンＵＰＳ_６．２の活性化動力学の定量分析。ＢＯＤＩＰＹチャンネル（オフ−オン）における斑点の蛍光強度はＣｙ３．５（常時オン）のものに正規化された。（図６２Ｃ）ＵＰＳ_６．２の指示用量で処理されたＨｅＬａ細胞におけるエンド（ｅｎｄｏ）／リソソームのリアルタイム測定。Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ レシオメトリックイメージングプローブをインビボｐＨ測定に使用した。エラーバーは各時点で５０器官からの標準偏差を表す。

【図63】ＨｅＬａ細胞のＵＰＳ_５．３ナノプローブによるバッファリングエンドサイトーシスオルガネラを示す。（図６３Ａ）低用量（１００μｇ／ｍＬ）及び高用量（１，０００μｇ／ｍＬ）の常時オン（Ｃｙ_３．５）／オフ−オン（ＢＯＤＩＰＹ）ＵＰＳ_５．３への５分間暴露の後の、指示された時点でのＨｅＬａの共焦点画像。核はＨｏｅｃｈｓｔでブルーに染色した。スケールバー＝１０μｍ。（図６３Ｂ）ＵＰＳ_５．３のオフ−オンの活性化プロセスの定量分析。ＢＯＤＩＰＹチャンネル細胞における斑点の蛍光強度はＴＭＲチャンネルの同じ斑点の蛍光強度に正規化された。（図６３Ｃ）指示用量の常時オン（Ｃｙ３．５）／オフ−オン（ＢＯＤＩＰＹ）ＵＰＳ_５．３へで処理されたＨｅＬａ細胞におけるエンド（ｅｎｄｏ）／リソソームのリアルタイム測定。Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ ＤＮＤ１６０ レシオメトリックイメージングプローブをインビボｐＨ測定に使用した。エラーバーは各時点で５０器官からの標準偏差を表す。

【図64】エンドサイトーシスオルガネラのｐＨの緩衝化がそれらの膜タンパク質の動力学に影響を与えることを示す。ＨｅＬａ細胞は、細胞接種のために１，０００μｇ／ｍＬ ＵＰＳ_６．２−Ｃｙ５またはＵＰＳ_４．４−Ｃｙ５で５分間処理した。その後これらは、固定前に１５分間（図６４Ａ）、１時間（図６４Ｂ）及び２時間（図６４Ｃ）培養された。免疫蛍光（ＩＦ）画像は、初期のエンドソーム（Ｒａｂ５）またはリソソーム（ＬＡＭＰ２）におけるＵＰＳナノプローブの局在化を示す。スケールバー＝１０μｍ及び５μｍ（差し込み図）。Ｉｍａｒｉｓソフトウェアをｚ−積層共焦点画像の共局在化を分析するために使用した。Ｒａｂ５（図６４Ｄ）及びＬＡＭ２（図６４Ｅ）で共局在化されたＵＰＳの画分、及びＬＡＭ２で共局在化されたＲａｂ５の画分（図６４Ｆ）を、マンダーの係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）、ｎ＝１０、α＝０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、から計算した。２方向ＡＮＯＶＡ及びＳｉｄａｋの多重比較試験を、統計的有意性を評価するために行った。

【図65】ＵＰＳによるエンド（ｅｎｄｏ）／リソソームのクランピング内腔ｐＨが、アミノ酸−依存性ｍＴＯＲＣ１活性化を選択的に阻害していることを示している。ＨｅＬａ細胞はＥＢＳＳ中で２時間飢えさせ、その後（図６５Ａ）ＵＰＳ_６．２／ＵＰＳ_５．３／ＵＰＳ_５．０及び（図６５Ｂ）ＵＰＳ_４．７／ＵＰＳ_４．４の存在下に指示された時間間隔の間必須アミノ酸（ＥＡＡ）で刺激した。水と５０μＭクロロキン（ＣＱ）を対照として使用した。指示されたリンタンパク質を細胞溶解物全体の免疫ブロット法により評価した。（図６５Ｃ）指示された処理後のＧＦＰ−ＴＦＥＢの細胞核／細胞質分布の定量分析。エラーバーは標準偏差、ｎ＝１０を表す。（図６５Ｄ）図６５Ｃの代表的画像。スケールバー＝１０μｍ。（図６５Ｅ）ｍＴＯＲＣ１シグナル経路における遊離アミノ酸に必要なｐＨ転移対アルブミン誘導アミノ酸依存活性化のワーキングモデル。

【図66】ＵＰＳ暴露時のｍＴＯＲＣシグナル定量及びカテプシンＢ活性を示す。（図６６Ａ及び６６Ｂ）図６４Ａ及び６４Ｂにおける総タンパク質レベルにより正規化されたリン酸化Ｓ６タンパク質の定量分析。各時点の対照（水）とＵＰＳ処理グループとの間の統計学的差異は、２方向ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔのマルチプル比較試験により検出した、α＝０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１即ち有意ではない（ｎ．ｓ．）。対照とＵＰＳ処理グループとの間の統計学的差異は、図６６Ｂにおけるいずれの時点でも有意ではなかった。エラーバーは標準偏差、ｎ＝３を示す。（図６６Ｃ）カテプシンＢ活性は、指示された処理（ｎ＝２）に応じて測定された。「Ｆｅｄ」と他の全てのグループとの間の統計学的差異は１方向ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔのマルチプル比較試験により検出した、α＝０．０５、^＊＊ｐ＜０．０５、即ち有意ではない（ｎ．ｓ．）。

【図67】アルブミン依存性ｍＴＯＲＣ１経路活性化はＵＰＳ_４．４により阻害される。（図６７Ａ）ＨｅＬａ細胞は２時間栄養物を奪われ、次いで指示されたＵＰＳナノプローブ（１，０００μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下にＢＳＡの摂取（２％）がなされた。指示されたリンタンパク質の蓄積を全細胞溶解物の免疫ブロット法によりモニターした。（図６７Ｂ）ＧＦＰ−タグ付きＴＦＥＢの核／細胞質分布を指示された条件に応じてモニターした。（図６７Ｃ）（図６７Ａ）においてその合計タンパク質レベルにより正規化されたリン酸化Ｓ６タンパク質の定量分析。エラーバーは標準偏差、ｎ＝３を示す。各時点での対照とＵＰＳ処理グループは、２方向ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔのマルチプル比較試験により検出した、α＝０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１即ち有意ではない（ｎ．ｓ．）。（図６７Ｄ）（図６７Ｂ）で示された結果におけるＴＦＥＢの位置の定量分析（サイトゾル（細胞質ゾル）＝０において、核＝１において）。エラーバーは標準偏差を表す。スケールバー＝１０μｍ。

【図68】リソソームｐＨの選択バッファリングが細胞の代謝産物の貯蔵を調節することを示す。（図６８Ａ）系統樹は、合計でタンパク質含有量に正規化された、いっぱいの（供給された）栄養物または奪われた（欠乏した）培地において指示された代謝産物の相対存在量を示す。細胞は、指示された用量にてＵＰＳ_４．４で処理された。（図６８Ｂ）十分な栄養物及び奪われた栄養物の条件下で選択されたアミノ酸の正規化存在量。エラーバーは標準偏差、ｎ＝６を表す。（図６８Ｃ）細胞代謝産物の貯蔵のバランスに基づき、環境及びリソソームｐＨの結果を示す略図。

【図69】ＵＰＳナノ粒子がリソソームのストレスに感受性のあるＮＳＣＬＣ細胞を選択的に殺すことを示す。（図６９Ａ）使用される細胞モデル及びそれらのリソソームの成熟に対する対応する脆弱性の略図。（図６９Ｂ）有効量のＵＰＳ（ＵＰＳ_６．２及びＵＰＳ_５．３＝４００μｇ／ｍｌ、ＵＰＳ_４．４＝１，０００μｇ／ｍｌ）に暴露するまたはしないＨＢＥＣ３０ＫＴ及びＨＣＣ４０１７細胞の相対生存能力を示すＤＩＣ画像。スケールバー＝１００μｍ。（図６９Ｃ〜６９Ｅ）ＨＢＥＣ３０ＫＴ、ＨＢＥＣ３０ＫＴ ＫＰ、ＨＢＥＣ３０ＫＴ ＫＰＬ及びＨＣＣ４０１７細胞におけるカスパーゼ３／７活性が、指示用量のＵＰＳに暴露された後７２時間で測定された。２方向ＡＮＯＶＡ及びＳｉｄａｋの多重比較試験が、ＨＢＥＣ３０ＫＴとＨＣＣ４０１７とＨＢＥＣ３０ＫＴ ＫとＨＢＥＣ３０ＫＴ ＫＰＬとの間の観察される差異の統計的有意性を評価するために、行われた、α＝０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（図６９Ｆ及び６９Ｇ）ＨＣＣ４０１７（図６９Ｆ）及びＨＢＥＣ３０ ＫＴ ＫＰＬ（図６９Ｇ）を１０００μｇ／ｍＬのＵＰＳ_６．２に、指示濃度のピルビン酸メチル（ＭＰ）、ジメチル−２−オキソグルタレート（ＭＯＧ）、または水（破線）と共に、７２時間暴露後細胞ＡＴＰのレベルが測定された。値は、処理無しの（ＵＰＳ無し）対照に正規化された。エラーバーは標準偏差を示し、ｎ＝４。

【図70】Ｉ−ＵＰＳ_６．９ナノプローブを示す。（図７０Ａ）ＩＣＧ−結合ブロックコポリマー、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｃ７Ａ−ｒ―ＩＣＧ）。（図７０Ｂ）ｐＨ−感受性オフ／オン活性化を示すＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）手術用カメラによるＩ−ＵＰＳ_６．９の近ＩＲ画像。（図７０Ｃ）ｐＨの関数としての正規化蛍光強度が、より少し低いｐＨ転移及びより鋭い応答をもたらすより長いＰＣ７Ａセグメントを示す。（図７０Ｄ）プローブ濃度及びｐＨの関数としての蛍光強度の３Ｄプロット。図７０Ｂ〜７０Ｄのデータは、２０％血清含有溶液において得られた。

【図71】キレート剤結合ポリマー、ＣＢ−ＴＥ２Ａ−ＰＥＧ−ＰＣ７Ａ_Ｘ、の提案された合成ルートを示す。

【図72】ＦＤＧ−ＰＥＴ及びＩ−ＵＰＳにより画像化された同所性ＮＨ５腫瘍を有するマウスを示す。マウスは矢印位置で画像化され、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像において褐色脂肪または首の筋肉（矢印）から擬陽性を示した。

【図73】異なる腫瘍モデル（頭頸部、乳房、結腸直腸の腹膜転移、腎臓、脳）の広いがん特異性を有するＩ−ＵＰＳによる腫瘍アシドーシスイメージングを示す。黄色矢じりは腫瘍の位置を指示する。Ｉ−ＵＰＳ_６．９（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、ＳＰＹカメラによるイメージングの２４時間前に、ｉ．ｖ．（静脈）に注射した

【図74】（図７４Ａ）同所性４Ｔ１乳房腫瘍のＩ−ＵＰＳ_６．９−ガイド切除を示す。腫瘍巣（＜百万細胞）はＳＰＹカメラで見えるが（右パネル）、視覚的検出では見えない（右パネル右）。（図７４Ｂ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、白色光（Ｐ＜０．０５）及び未処理対照グループ（Ｐ＜０．０１）に対して、Ｉ−ＵＰＳ_６．９−ガイド切除が改善された長期間生存を有することを示している。

【図75】常時−オン／オフ−オン・デュアルレポーターシグナルを有するＵＰＳナノプローブを示す。ＵＰＳ_６．９はサンプルとして使用し、ＢＯＤＩＰＹ／ＣＹ３．５をＦＲＥＴ供与体／受容体として使用する。

【図76】微調整ｐＨ転移を有するＵＰＳナノプローブを示す。（図７６Ａ）ＰＲブロックにＤＰＡ−ＭＡ及びＤＥＡ−ＭＡサブユニットのモル分率を変化させたＰＥＧ−ｂ−ＰＲコポリマーの合成スキームを示す。（図７６Ｂ）異なるＰＲ組成に対するＵＰＳナノプローブのｐＨ応答。Ｃｙ５．５をモデル色素として使用した。（図７６Ｃ）ＤＰＡのモル％の関数としての転移ｐＨは、予め定められたｐＨ転移を有するＵＰＳの合理的デザインのための標準カーブを確立する。

【図77】がん細胞のｐＨ調節機構を示す。プロトンポンピングは、微環境における腫瘍アシドーシスをもたらし、並びに細胞内ｐＨを細胞の増殖及び移動が促進するように向上させる（Ｎｅｒｉ ＆ Ｓｕｐｕｒａｎ，２０１１）。

【図78】ＵＰＳ_６．９ナノプローブはＡ５４９肺腫瘍における腫瘍ｐＨ_ｅを具体的に画像化することができることを示している。（図７８Ａ）好気的解糖はがん細胞中のグルコースをラクテート（乳酸塩）に変換する。２−ＤＧ及びＣＨＣは、それぞれ、グルコース摂取及び乳酸分泌のための代謝阻害剤である。（図７８Ｂ）Ａ５４９細胞において乳酸分泌の速度に対する２−ＤＧまたはＣＨＣの効果。（図７８Ｃ）６時間培養後の、２−ＤＧ及びＣＨＣの存在下のＡ５４９細胞培地の酸性化。ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）グループに比較して、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（図７８Ｄ）ＵＰＳ_６．９（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射後２４時間でのＡ５４９腫瘍を有するマウスの重ね撮り蛍光画像。対照グループにおいて、２−ＤＧ（２５０ｍｇ／ｋｇ）またはＣＨＣ（２５０ｍｇ／ｋｇ）をＵＰＳ_６．９の投与の１２時間前に注射した。Ｃｙ５．５（光点）及び自己蛍光（背景光）を複合画像に示す。（図７８Ｅ）ＵＰＳ_６．９の注射後の時間の関数としての腫瘍と正常組織との間のＮＩＲ蛍光強度比（Ｔ／Ｎ比）。データは、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。

【図79】同所性４Ｔ１乳房腫瘍のＩ−ＵＰＳイメージングを示す。腫瘍巣（＜百万細胞）をＳＰＹカメラ下で見ることができるが（ヒートモード、図７９Ｂ）、視覚的検出では見えない（図７９Ａ）。腫瘍の存在は、組織構造により確認された（図７９Ｃ）。スケールバーは図７９Ｃにおいて２００μｍである。

【図80】ＦＤＧ−ＰＥＴ及びＩ−ＵＰＳにより画像化された同所性ＨＮ５腫瘍を有するマウスを示す。マウスは、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像における首（３マウスからの２マウス）の褐色脂肪組織の擬陽性を示すため、矢状位置で画像化された。

【図81】８０のヒト非小細胞肺がん細胞のパネルからグルコース消費及びラクテート分泌の速度を示す。これらの肺がん細胞は、Ｌａｃ_ｏｕｔ／Ｇｌｕ_ｉｎの比により表されるような異なる解糖速度を示す。

【図82】ＢＯＤＩＰＹ及びＣｙ３．５シグナルを定量化し、組織構造により描かれた真の腫瘍境界と相関する概略図を示す。腫瘍標的点に垂直の線に沿った蛍光強度が測定される。平均強度対距離は、腫瘍境界に沿った多数の接点から決定される。

【図83】匹敵するサイズを有するがｐＨ転移が異なる２つのＵＰＳナノプローブのＰＫ／ＢＤの比較を示す。

【図84】マルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブの略図及び動作原理を示す。図８４Ａ：マルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブは、それぞれ異なる蛍光色素でコードされた３種のＰＥＧ−ｂ−ＰＲブロックコポリマーにより操作される。ハイブリッドＵＰＳナノプローブは、中性ｐＨで「オフ」に留まる。ｐＨが低い場合、ＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−色素）成分は分解し、微妙なｐＨ変化に合うと異なる色を連続的に示す蛍光を発する。図８４Ｂ：ＰＥＧ−ｂ−ＰＲブロックコポリマー及び蛍光色素結合ポリマーの化学構造。図８４Ｃ：受容体を介したエンドサイトーシス（例えば、内皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））を介しての生細胞内のマルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブの内在化及び活性化。内在化後、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３はクラスリン被覆小胞によりオンに変えられ（ＣＣＶ、ｐＨ約６．８）、その後ＰＥＰＡ−ＴＭＲは初期エンドソームにより活性化され（ｐＨ約６．０）、最後にＰＤＢＡ−Ｃｙ５は後期エンドソーム／リソソームによりオンに変えられる（ｐＨ約５．０〜５．５）。

【図85】（図８５Ａ）ｐＨ−依存性蛍光発光スペクトル及び（図８５Ｂ）０．１ＭのＰＢＳ溶液のｐＨの関数としてのＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３の蛍光強度比。サンプルは４８８ｎｍで励起され、発光スペクトルは５００〜６５０ｎｍで集められる。ポリマー濃度は０．１ｍｇ／ｍＬに制御される。

【図86】（図８６Ａ）ｐＨ−依存性蛍光発光スペクトル及び（図８６Ｂ）０．１ＭＰＢＳ溶液の関数としてのＰＤＰＡ−ＴＭＲの蛍光強度比を示す。サンプルは５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルは５６０〜７５０ｎｍで集められる。ポリマー濃度は０．１ｍｇ／ｍＬに制御される。

【図87】（図８７Ａ）ｐＨ−依存性蛍光発光スペクトル及び（図８７Ｂ）０．１ＭＰＢＳ溶液の関数としてのＰＤＢＡ−Ｃｙ５の蛍光強度比を示す。サンプルは６４０ｎｍで励起され、発光スペクトルは６５０〜７５０ｎｍで集められる。ポリマー濃度は０．１ｍｇ／ｍＬに制御される。

【図88】ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５ミセルのｐＨの関数としての正規化蛍光強度を示す。ポリマー濃度は１００μｇ／ｍＬであった。

【図89】分子的に混合されたミセル及びミセル混合物の蛍光特性評価を示す。（図８９Ａ）ｐＨ７．４で１：１９のモル比を有するＰＤＢＡ−Ｃｙ５及びＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ_３）の分子的に混合されたミセルの蛍光強度。（図８９Ｂ）ｐＨ７．４で１：１９のモル比を有するＰＤＢＡ−Ｃｙ５ミセル及びＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ_３）ミセルのミセル混合物の蛍光強度。

【図90】蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）実験が、マルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブの形成を実証していることを示す。ＰＥＧ−ｂ−ＰＲブロックコポリマーは異なる色素でコードされる。ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５を含む、３つの例のＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−色素）ブロックコポリマーは、色素／ポリマー比（１：１）で合成され、ホモＦＲＥＴ効果を最小化する。図９０Ａ：ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３／ＰＤＰＡ−ＴＭＲ（１：１）ミセル、及びＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３とＰＤＰＡ−ＴＭＲとのミセル混合物は、４８５ｎｍで励起され、その後発光スペクトルは４９０〜７２０ｎｍで集められた。ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３からＰＤＰＡ−ＴＭＲへの強いＦＲＥＴ効果が観察され、ＰＥＰＡ／ＰＤＰＡハイブリッドナノ粒子の形成を示す。図９０Ｂ：ＰＤＰＡ−ＴＭＲからＰＤＢＡ−Ｃｙ５への強いＦＲＥＴ効果が観察され、ＰＤＰＡ／ＰＤＢＡハイブリッドナノ粒子の形成を示す。図９０Ｃ：ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３からＰＤＢＡ−Ｃｙ５への強いＦＲＥＴ効果が観察され、ＰＥＰＡ／ＰＤＢＡハイブリッドナノ粒子の形成を示す。図９０Ｄ：ＢＤＹ４９３からＴＭＲへ、最終的Ｃｙ５への強いＦＲＥＴ効果が観察され、ＰＥＰＡ／ＰＤＰＡ／ＰＤＢＡハイブリッドナノ粒子の形成を示す。

【図91】ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３（１）、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ（２）、ＰＤＢＡ−Ｃｙ５（３）及びスリーインワン・ハイブリッドナノプローブ（４）を含む色素−結合ポリマーミセルの代表例を示す。

【図92】ハイブリッドナノプローブのインビボ特性評価を示す。（図９２Ａ〜９２Ｄ）異なるｐＨ緩衝液におけるハイブリッドナノプローブの蛍光スペクトル。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５のシグナルは、それぞれ４８５、５４５、及び６４０ｎｍで励起される。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５の発光スペクトルは、それぞれ４９０−７５０ｎｍ、５６０−７５０ｎｍ、及び６５０−７５０ｎｍで集められる。（図９２Ｅ）ハイブリッドナノプローブの計数率及び正規化蛍光強度は時間の関数としてプロットされる。異なるｐＨでの計数率は、ダイナミック光散乱分析により決定される。マルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブのマルチ−ステージ活性化は、異なるｐＨ範囲で、グリーン、レッド、及びブルーの色のＳ字形曲線によって示される。（図９２Ｆ）異なるｐＨ範囲でのマルチ−スペクトルＵＰＳナノプローブの代表的蛍光画像が捉えられる。イエローは、グリーンとレッドのシグナルの合併色である。ホワイトはブルー、グリーン及びレッドのシグナルの合併色である。

【図93】図９３Ａ−９３Ｆは、ハイブリッドナノプローブのｐＨ−依存性蛍光発光スペクトルを示す。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５シグナルは、それぞれ４８５ｎｍ、５４５ｎｍ、及び６４０ｎｍで励起された。対応する発光スペクトルは、それぞれ４９０−７５０ｎｍ、５６０−７５０ｎｍ、及び６５０−７５０ｎｍで集められた。

【図94】ｐＨの関数としての、ハイブリッドＵＰＳナノプローブのＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５成分の正規化蛍光強度を示す。

【図95】異なるｐＨ溶液における、ハイブリッドナノプローブのモルホロジー（形態）及び粒径の（図９５Ａ）ＴＥＭ及び（図９５Ｂ）ＤＬＳ分析を示す。スケールバーはＴＥＭ画像において１００ｎｍである。

【図96】Ａ５４９細胞におけるエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）−結合ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブの特定の蛍光活性化を示す。細胞をエルビタックス−結合ＰＤＰＡ−ＴＭＲミセル（上側）またはＰＤＰＡ−ＴＭＲミセル（下側）で、それぞれ１時間処理した。スケールバーは４０μｍである。

【図97】Ａ５４９ヒト肺がん細胞の単一エンドサイトーシスオルガネラにおけるエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）−コードしたＵＰＳナノプローブの同期摂取を示す。腫瘍細胞をナノプローブで３時間処理し、次いで共焦点イメージングを行った。スケールバーは４０μｍである。

【図98】肺がんＡ５４９細胞において、多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重化イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図99】頭頸部がんＨＮ５細胞において、多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重化イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図100】ＫＲＡＳ遺伝子突然変異を有するヒト肺がんＨ４６０細胞株における、多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重化イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図101】ＫＲＡＳ遺伝子突然変異を有するヒト肺がんＡ５４９細胞株における、多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重化イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図102】Ｐ５３遺伝子突然変異を有するヒト肺がんＨ２８８２細胞株における、多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重化イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図103】肺がん細胞株のパネルにおいてオルガネラ成熟を示す。初期エンドソーム（図１０３Ａ）及び後期エンドソーム／リソソーム（図１０３Ｂ）の成熟速度の定量化は、Ｋｒａｓ突然変異が表現型差異に起因することを特定する。３０分での初期エンドソーム（ＥＥ）のＰＤＰＡ−ＴＭＲ（Ｉ_６．２）の蛍光強度はＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化される。７５分での後期エンドソーム／リソソーム（ＬＥ／Ｌｙｓ）におけるＰＤＢＡ−Ｃｙ５（Ｉ_５．３）の蛍光強度はＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化される。ＫＲＡＳ変異細胞株とＫｒａｓ野生型細胞株との顕著な差異は、Ｋｒａｓ突然変異が後期エンドソーム／リソソーム成熟に起因することを示している。^＊＊Ｐ＜０．０１、対の、両側の、ｔ−試験；ｎ＝１０。

【図104】肺がん細胞株のパネルにおけるオルガネラ成熟を示す。初期エンドソーム（図１０４Ａ）及び後期エンドソーム／リソソーム（図１０４Ｂ）の成熟速度の定量化は、Ｋｒａｓ突然変異が表現型差異に起因することを特定する。図１０４Ｃ：３０分での初期エンドソーム（ＥＥ）のＰＤＰＡ−ＴＭＲ（Ｉ_６．２）の蛍光強度はＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化される。図１０４Ｄ：７５分での後期エンドソーム／リソソーム（ＬＥ／Ｌｙｓ）におけるＰＤＢＡ−Ｃｙ５（Ｉ_５．３）の蛍光強度はＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化される。Ｋ−ｒａｓ変異細胞株とＫ−ｒａｓ野生型細胞株との顕著な差異は、ＫＲＡＳ突然変異が後期エンドソーム／リソソーム成熟に起因することを示している。^＊＊Ｐ＜０．０１、対の、両側の、ｔ−試験；ｎ＝１０。

【図105】生体細胞におけるマルチ−スペクトルハイブリッドＵＰＳナノプローブを用いるエンドサイトーシスの間のオルガネラ成熟のマルチステージｐＨイメージングを示す。ＨＢＥＣ３０上皮細胞（図１０５Ａ）及び遺伝子同質のＨＣＣ４０１７肺がん細胞（図１０５Ｂ）は、１００μｇ／ｍＬのエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）−結合ハイブリッドＵＰＳナノプローブで４℃、３０分間培養され、洗浄され、そして共焦点顕微鏡を用いて３７℃でリアルタイムで画像化される。ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５シグナルは、それぞれ４８８、５４３、及び６３７ｎｍで励起される。ＦＩＴＣ（５１５／３０ＢＰ）、ＴＲＩＴＣ（５９０／７５ＢＰ）、及びＣｙ５（６５０ＬＰ）フィルタは、それぞれ、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５画像キャプチャーに使用される。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５は、それぞれ、グリーン、レッド及びブルーの色である。スケールバーは２０μｍである。

【図106】ＨＢＥＣ３０ＫＴヒト上皮細胞の多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図107】ヒト遺伝子同質のＨＣＣ４０１７ヒト肺がん細胞の多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図108】ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３細胞の多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図109】ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ細胞の多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図110】ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ／ｓｈＬＫＢ１細胞の多色ハイブリッドナノプローブによるエンドソーム成熟の多重イメージングを示す。スケールバーは２０μｍである。

【図111】同質遺伝子進行シリーズ（ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）のＨＢＥＣ３０細胞の経時的オルガネラ成熟を示す。初期エンドソーム（図１１１Ａ）及び後期エンドソーム／リソソーム（図１１１Ｂ）の成熟速度の定量化は、Ｋｒａｓ突然変異が表現型差異に起因することを特定する。図１１１Ｃ：３０分での初期エンドソーム（ＥＥ）のＰＤＰＡ−ＴＭＲ（Ｉ_６．２）の蛍光強度は、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化された。ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３及びＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ細胞との顕著な差異は、Ｋｒａｓ突然変異が早期エンドソーム成熟に起因することを示している。^＊＊Ｐ＜０．０１、対の、両側の、ｔ−試験；ｎ＝１０。図１１１Ｄ：１５０分での後期エンドソーム／リソソーム（ＬＥ／Ｌｙｓ）におけるＰＤＢＡ−Ｃｙ５（Ｉ_５．３）の蛍光強度は、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナル（Ｉ_６．９）により正規化された。ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３とＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖとの顕著な差異は、Ｋｒａｓ突然変異が後期エンドソーム／リソソーム成熟に起因することを示している。^＊＊Ｐ＜０．０１、対の、両側の、ｔ−試験；ｎ＝１０。

【図112】常時オン／オフ−オンＵＰＳナノ粒子の合成と特性評価を示す。（図１１２Ａ）及び（図１１２Ｂ）デュアル−レポーターナノ粒子の略図。ミセル状態で、常時オン色素は、オン／オフ・フルオロフォアの消光剤として機能する。ミセルが解離すると、常時−オン及びオン／オフ・フルオロフォアが独立して蛍光を発する。ＢＯＤＩＰＹ（図１１２Ａ）及びＣｙ３．５（図１１２Ｂ）のオン／オフ比は、これらの２種の色素と結合したポリマーの比が変化した時に、変化する。６０％のＢＯＤＩＰＹ−結合コポリマーと４０％のＣｙ３．５結合コポリマーとの重量分率が最終的な組み合わせとして選択された。（図１１２Ｃ）ｐＨ関数としてのＵＰＳ_６．２ナノプローブの蛍光シグナル増幅。画像は、グリーン及びイエローフィルタを用いてＭａｅｓｔｒｏインビボイメージングシステム（ＣＲＩ）で捉えられた。

【図113】トリブロックコポイマーＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ−ｂ−Ｄ５Ａ）、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｄ５Ａ_４０−ｂ−ＤＥＡ_４０）及びランダムブロックコポリマーＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ−ｒ−Ｄ５Ａ）の化学構造を示す（図１１３Ａ）。第３級アミノ基のモル分率の関数としての、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｄ５Ａ_４０−ｂ−ＤＥＡ_４０）、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ_４０−ｂ−Ｄ５Ａ_４０）及びＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｄ５Ａ_４０−ｒ−ＤＥＡ_４０）コポリマーのｐＨ滴定曲線（図１１３Ｂ）。

【図114】分子的に混合されたミセル及びミセル混合物の蛍光特性評価を示す。（図１１４Ａ）ｐＨ７．４で１：１９のモル比を有するＰＥＰＡ−Ｃｙ５及びＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ_３）の分子的に混合されたミセルの蛍光強度。（図１１４Ｂ）ｐＨ７．４で１：１９のモル比を有するＰＥＰＡ−Ｃｙ５ミセル及びＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ_３）ミセルのミセル混合物の蛍光強度。

【発明を実施するための形態】

【0077】

いくつかの態様において、本開示は、特定のｐＨ転移より上に装うｐＨ応答性ナノ粒子を形成することができるポリマーを提供する。いくつかの実施形態では、これらのポリマーは、０．２５ｐＨ単位より小さい所望のｐＨ転移点（ΔＰＨ_{１０−９０％}）に特別に合わせるようにすることができ、並びに約ｐＨ４〜約ｐＨ８のｐＨ転移点の範囲のｐＨプローブに発展させることができる、異なったモノマーの混合物を含む。ｐＨ転移点が広い範囲であることは、広範囲な応用・利用を可能にし、その応用・利用として、小胞輸送、腫瘍のｐＨ_ｅのイメージング、特定の組織への医薬化合物の送達、腫瘍を可視化して腫瘍組織を切除する外科医の能力の向上、或いはエンドソーム／リソソームの成熟または成長の検討が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様では、本開示は、前述のように、これらのポリマーをｐＨ応答性システムにさらなる方法を提供する。本開示のポリマー及び得られるｐＨ応答性システムを使用する付加的方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５２０５９に記載されている。

【0078】

Ａ．化学的定義
化学基に関連して使用する際：「水素」は−Ｈを意味し；「ヒドロキシ」は−ＯＨを意味し；「カルボキシ」は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（−ＣＯＯＨまたはＣＯ_２Ｈとも記載）；「ハロゲン」は、独立して−Ｆ、−Ｃｌ、−ＢｒまたはＩを意味し；「アミノ」は−ＮＨ_２を意味し；「ニトロ」は−ＮＯ_２を意味し；「シアノ」は−ＣＮを意味し；１価に関連する「ホスフェート」は−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）_２またはその脱プロトン化体を意味し；２価に関連する 「ホスフェート」は−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−またはその脱プロトン化体を意味し；「メルカプト」は−ＳＨを意味し：「チオ」は＝Ｓを意味し：「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ）_２−を意味し：「スルフィニル」は−Ｓ（Ｏ）−を意味する。

【0079】

化学式に関連して、記号「−」は単結合を表し；「＝」は２重結合を表し；「≡」は３重結合を表す。記号

【0080】

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

は、任意の結合で、存在する場合は単結合または２重結合である。記号

【0081】

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

は単結合または２重結合である。従って、。式

【0082】

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

は、

【0083】

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

を包含する。そして、このような環の原子は一つも２重結合を超える部分を形成しないと理解される。さらに、共有結合の記号「−」は、１または２個の立体的原子に結合した場合、好ましい立体化学を示すものではない。むしろ、それは全ての立体異性体及びその混合物を含むものである。記号

【0084】

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

は、結合にわたって垂直にひかれた場合（例えば、メチル等の

【0085】

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

その基に結合する点を示すものである。結合点を一義的に特定できるように読者を助けるために、この結合点は一般により大きな基に対してのみこのように特定されることが知られている。記号

【0086】

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

は、くさび状の厚い端部に結合した基が「頁から外側に」ある場合の単結合を意味する。記号

【0087】

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

は、くさび状の厚い端部に結合した基が「頁の中側に」ある場合の単結合を意味する。記号

【0088】

【化43】

[この文献は図面を表示できません]

は、２重結合の周囲の形状（例、ＥまたはＺ）が定義されていない場合の単結合を意味する。このため、両方の選択肢、並びにその組み合わせが意図されている。この出願で示される構造の原子への定義されていない原子価はいずれもその原子に結合した水素原子を暗に表す。炭素原子上の太い点は、その炭素に結合した水素は紙の平面から傾斜していることを示している。

【0089】

基「Ｒ」は環系の「浮遊基」として、例えば

【0090】

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

で表現される場合、安定な構造が形成される限りにおいて、Ｒは環原子のいずれかと結合した水素原子と置き換わっても良く、描かれた、暗示された、または明確に定義された水素を包含する。基「Ｒ」は、縮合環系の「浮遊基」として、例えば

【0091】

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

として表現される場合、特に断らない限り、Ｒは縮合環のどちらかの環原子のいずれかと結合した水素原子と置き換わっても良い。置き換わることができる水素としては、描かれた水素（例、上式の窒素と結合した水素）、暗示された水素（例、示されていないが存在すると理解される上式の水素）、明確に定義された水素、及び、安定な構造が形成される限りにおいて、その存在が環原子との同一性に依存している任意の水素（例、基Ｘが−ＣＨ−の場合、Ｘに結合した水素）が挙げられる。描かれた例において、Ｒは、縮合環系の５員環または６員環のいずれかに存在しても良い。上式において、括弧内に包含される基「Ｒ」直後の下付き文字「ｙ」は、可変数値を表す。特に規定が無い限り、この可変数値は０、１、２、または２より大きい全ての整数であることができるが、環または環システムの置換可能な水素原子の最大数にのみ限定される。

【0092】

以下の基及びクラスについて、以下の括弧内下付き文字は以下のように基／クラスを定義する：「Ｃｎ」は、基／クラスの炭素原子の正確な数（ｎ）を定義する。「Ｃ≦ｎ」は基／クラスで存在し得る炭素原子の最大数（ｎ）を定義し、且つその最小数は問題の基について可能な限り小さいものであり、例えば、基「アルケニル_{（Ｃ≦８）}」またはクラス「アルケエン_{（Ｃ≦８）}」の炭素原子の最小数は２である。例えば、「アルコキシ_{（Ｃ≦１０）}」は、１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシ基を指定する。「Ｃｎ−ｎ’」は、その基において、最小（ｎ）及び最大（ｎ’）の炭素原子の両方を定義する。同様に、「アルキル_{（Ｃ２−１０）}」は２〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を指定する。

【0093】

本明細書で使用される用語「飽和した」は、そのように修飾された化合物または基は、炭素−炭素２重結合を持たず、また炭素−炭素３重結合を持たないが、以下のものは除く。飽和基の置換形態において、１個以上の炭素酸素２重結合または１個以上の炭素窒素２重結合は存在しても良い。そして、このような結合が存在する場合、ケト−エノール互変異性またはイミン／エナミン互変異性の一部として現れても良い炭素酸素２重結合は除外されない。

【0094】

「置換（された）」の修飾語句無しに使用された場合の用語「脂肪族」は、そのように修飾された化合物または基は、非環状または環状であるが、非芳香族炭化水素化合物または基であることを意味する。脂肪族化合物／基では、炭素原子は、直鎖、分岐鎖また非芳香族環（脂環式）で一緒に結合することができる。脂肪族化合物／基は飽和されていても良く、即ち単結合（アルカン／アルキル）で結合していても良く、或いは、１個以上の２重結合（アルケン／アルケニル）で、または１個以上の３重結合（アルキン／アルキニル）で不飽和化されていても良い。

【0095】

「置換（された）」の修飾語句無しに使用された場合の用語「アルキル」は、結合点として炭素原子を有し、直鎖または分岐の非環式構造を有し、そして炭素及び水素以外の原子を持たない１価の飽和の脂肪族基を指す。基−ＣＨ_３（Ｍｅ）、−ＣＨ_２ＣＨ_３（Ｅｔ）、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３（ｎ−Ｐｒまたはプロピル）、−ＣＨ（ＣＨ_３）_２（ｉ−Ｐｒ、^ｉＰｒまたはイソプロピル）、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３（ｎ−Ｂｕ）、−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３（ｓｅｃ−ブチル）、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２（イソブチル）、−Ｃ（ＣＨ_３）_３（ｔｅｒｔ−ブチル、ｔ−ブチル、ｔ−Ｂｕまたは^ｔＢｕ）、及び−ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３（ｎｅｏ−ペンチル）が、アルキル基の非限定的例である。「置換（された）」の修飾語句無しに使用された場合の用語「アルカンジイル」は、結合点として１個または２個の飽和炭素原子を有し、直鎖または分岐の非環式構造を有し、炭素炭素２重結合または３重結合を持たず、そして炭素及び水素以外の原子を持たない２価の飽和の脂肪族基を指す。基、−ＣＨ_２−（メチレン）、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２−及び−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−が、アルンジイル基の非限定的例である。「置換された」の修飾語句無しに使用された場合の用語「アルカンジエン」は、２価の基＝ＣＲＲ’（但し、Ｒ及びＲ’は独立して水素またはアルキルを表す）を指す。アルカンジエンの非限定的例としては、＝ＣＨ_２、＝ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）、及び＝Ｃ（ＣＨ_３）_２を挙げることができる。「アルカン」は、化合物Ｈ−Ｒ（Ｒは上記定義されたアルキルである）を指す。これらの用語のいずれかが「置換（された）」の修飾語と共に使用された場合、１個以上の水素原子は独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。下記の基が置換アルキル基の非限定的例である：−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２Ｃｌ、−ＣＦ_３、−ＣＨ_２ＣＮ、−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_３、−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＯＣＨ_３、−ＣＨ_２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＮＨ_２、−ＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、及び−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ。用語「ハロアルキル」は、置換アルキルの一部であり、１個以上の水素がハロゲン基で置換されており、炭素、水素及びハロゲンを除いて他の原子は存在しない。基−ＣＨ_２Ｃｌはハロアルキルの非限定的例である。用語「フルオロアルキル」は、置換アルキルの一部であり、１個以上の水素がフルオロ基で置換されており、炭素、水素及びフッ素を除いて他の原子は存在しない。基は、−ＣＨ_２Ｆ、−ＣＦ_３、及び−ＣＨ_２ＣＦ_３はフルオロアルキル基の非限定的例である。

【0096】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「シクロアルキル」は、結合点としての炭素原子を有し、直鎖または分岐のシクロまたは環状の構造を有し、炭素炭素２重結合または３重結合は無く、そして炭素及び水素以外の原子は持たない１価の飽和脂肪族基を指す。本明細書で使用されているように、シクロアルキル基は、結合点が環系である限り、環系に結合する１個以上の分岐アルキル基（炭素数制限が許すなら）を含んでも良い。シクロアルキルの非限定的例として：−ＣＨ（ＣＨ_２）_２（シクロプロピル）、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルが挙げられる。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「シクロアルカンジイル」は、結合点としての１個または２個の炭素原子を有し、直鎖または分岐のシクロまたは環状の構造を有し、炭素炭素２重結合または３重結合は無く、そして炭素及び水素以外の原子は持たない２価の飽和脂肪族基を指す。

【0097】

【化46】

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は、アルカンジイルの非限定的例である。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「シクロアルキリデン」は、２価の基＝ＣＲＲ’（但し、Ｒ及びＲ’は一緒になって少なくとも２個の炭素を有するシクロアルカンジイル基を形成する）を指す。アルキリデン基の非限定的例としては：＝Ｃ（ＣＨ_２）_２及び＝Ｃ（ＣＨ_２）_５が挙げられる。「シクロアルカン」は化合物Ｈ−Ｒ（但し、Ｒは、シクロアルキルであり、この用語は上記で定義されている）を指す。これらの用語のいずれかが「置換（された）」の修飾語と共に使用された場合、１個以上の水素原子は独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。下記の基が置換シクロアルキル基の非限定的例：−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ_２）_２、

【0098】

【化47】

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である。

【0099】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アリール」は、結合点としての芳香族炭素原子を有し、この炭素原子は１個以上の６員芳香族環構造の一部を形成し、且つその環の原子は全て炭素であり、且つ当該基は炭素及び水素以外の原子は持たない、１価の不飽和芳香族基を指す。１個を超える環が存在する場合、環は縮合していても、縮合していなくても良い。本明細書で使用されるように、この用語は、第１の芳香環または存在する付加的な芳香環に結合する１個以上のアルキルまたはアラルキル基（炭素数制限が許すなら）の存在を除外しない。アリール基の非限定的例として、フェニル（Ｐｈ）、メチルフェニル、（ジメチル）フェニル、−Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_２ＣＨ_３（エチルフェニル）、ナフチル、及びビフェニルから誘導される１価の基が挙げられる。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アレーンジイル」は、結合点としての２個の芳香族炭素原子を有し、この炭素原子は１個以上の６員芳香族環構造の一部を形成し、且つその環の原子は全て炭素であり、且つこの１価の基は炭素及び水素以外の原子は持たない、２価の不飽和芳香族基を指す。本明細書で使用されているように、用語は、第１の芳香環または存在する付加的な芳香環に結合する１個以上のアルキル、アリール、またはアラルキル基（炭素数制限が許すなら）の存在を排除しない。１個を超える環が存在する場合、環は縮合していても、縮合していなくても良い。非縮合環は、１個以上の下記のもの：共有結合、アルカンジイル、またはアルケンジイル基（炭素数制限が許すなら）を介して結合されていても良い。アレーンジイル基の非限定的例として：

【0100】

【化48】

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が挙げられる。「アレーン」は、化合物Ｈ−Ｒ（但し、Ｒは、この基として上記で定義されたアリールである）を指す。ベンゼン及びトルエンはアレーンの非限定的例である。これらの用語のいずれかが「置換（された）」の修飾語と共に使用された場合、１個以上の水素原子は独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、またはＳ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。

【0101】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「ヘテロアリール」は、結合点としての芳香族炭素原子または窒素原子を有し、この炭素原子または窒素原子は１個以上の芳香族環構造の一部を形成し、且つその環の原子の少なくとも１つは窒素、酸素またはイオウであり、且つ当該ヘテロアリール基は炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素及び芳香族イオウ以外の原子からならない、１価の芳香族基を指す。１個を超える環が存在する場合、環は縮合していても、縮合していなくても良い。本明細書で使用されているように、用語は、芳香環または芳香環系に結合する１個以上のアルキル、アリール、及び／またはアラルキル基（炭素数制限が許すなら）の存在を排除しない。ヘテロアリール基の非限定的例としては、フラニル、イミダゾリル、イドリル、インダゾリル（Ｉｍ）、イソオキサゾリル、メチルピリジニル、オキサゾリル、フェニルピリジニル、ピリジニル、ピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリル、キナゾリル、キノキサリニル、トリアジニル、テトラゾリル、チアゾリル、チエニル、及びトリアゾリルが挙げられる。用語「Ｎ−ヘテロアリール」は、結合点として窒素を有するヘテロアリール基を指す。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「ヘテロアレーンジイル」は、２個の結合点としての、２個の芳香族炭素原子、２個の芳香族窒素、または１個の芳香族炭素原子及び１個の芳香族窒素原子を有し、この原子は１個以上の芳香族環構造の一部を形成し、且つその環の原子の少なくとも１つは窒素、酸素またはイオウであり、且つ当該２価の基は炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素及び芳香族イオウ以外の原子からならない、２価の芳香族基を指す。１個を超える環が存在する場合、環は縮合していても、縮合していなくても良い。非縮合環は、１個以上の下記のもの：共有結合、アルカンジイル、またはアルケンジイル基（炭素数制限が許すなら）を介して結合されていても良い。本明細書で使用されているように、用語は、芳香環または芳香環系に結合する１個以上のアルキル、アリール、及び／またはアラルキル基（炭素数制限が許すなら）の存在を排除しない。ヘテロアレーンジイル基の非限定的例として：

【0102】

【化49】

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が挙げられる。「ヘテロアレーン」は、化合物Ｈ−Ｒ（但し、Ｒはヘテロアリールである）を指す。ピリジンとキノリンはヘテロアレーンの非限定的例である。「置換された」の修飾語と共に使用される場合のこれらの用語「ヘテロアレーンジイル」は、１個以上の水素原子は独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、またはＳ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。

【0103】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒ（但し、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキルまたはヘテロアリールであり、これらは上記で定義されている。）を指す。基、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３（アセチル、Ａｃ）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_２）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５、−Ｃ（Ｏ）（イミダゾリル）は、アシル基の非限定的例である。「チオアシル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒの酸素原子が−Ｃ（Ｓ）Ｒのイオウ原子に代わった以外、同様に定義される。用語「アルデヒド」は、上記で定義されたアルカンに対応し、アルカンにおいて、少なくとも１個の水素原子が−ＣＨＯ基と置換されている。これらの用語のいずれかが「置換（された）」の修飾語と共に使用される場合、１個以上の水素原子（もしあれば、カルボニルまたはチオカルボニル基に直接結合した水素を含む）は、独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、またはＳ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。基、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＦ_３、−ＣＯ_２Ｈ（カルボキシル）、−ＣＯ_２ＣＨ_３（メチルカルボキシル）、−ＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２（カルバモイル）、及び−ＣＯＮ（ＣＨ_３）_２は、置換アシル基の非限定的例である。

【0104】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アルコキシ」は、基−ＯＲ（但し、Ｒは、アルキルであり、この用語は上記で定義されている）を指す。アルコキシ基の非限定的例として：−ＯＣＨ_３（メトキシ）、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３（エトキシ）、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ（ＣＨ_３）_２（イソプロポキシ）及び−ＯＣ（ＣＨ_３）_３（ｔｅｒｔ−ブトキシ）が挙げられる。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「シクロアルコキシ」、「アルケニルオキシ」、「シクロアルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ」、「アリールオキシ」、「アラルコキシ」、「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロシクロアルコキシ」、及び「アシルオキシ」は、−ＯＲ（但し、Ｒが、それぞれ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル及びアシルである）で定義される基を指す。用語「アルコキシジイル」は、−Ｏ−アルカンジイル−、−Ｏ−アルカンジイル−Ｏ−、またはアルカンジイル−Ｏ−アルカンジイル−の２価の基を指す。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アルキルチオ」、「シクロアルキルチオ」、及び「アシルチオ」は、基−ＳＲ（但し、Ｒは、それぞれ、アルキル、シクロアルキル、及びアシルである）を指す。用語「アルコール」は上で定義されたアルカンに対応し、その際、水素原子の少なくとも１個がヒドロキシ基と置換されている。用語「エーテル」は上記で定義されたアルカンに対応し、その際、水素原子の少なくとも１個がアルコキシまたはシクロアルコキシ基と置換されている。これらの用語のいずれかを「置換（された）」の修飾語と共に使用された場合、１個以上の水素原子は、独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、またはＳ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。

【0105】

「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アルキルアミノ」は、基−ＮＨＲ（但し、Ｒはアルキルであり、この用語は上記で定義されている）を指す。アルキルアミノ基の非限定的例として：−ＮＨＣＨ_３及び−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３が挙げられる。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「ジアルキルアミノ」は、基−ＮＲＲ’（但し、Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、同一または異なるアルキル基であり、或いはＲ及びＲ’は、一緒になってアルカンジイルを表すことができる）を指す。ジアルキルアミノ基の非限定的例として：−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）、及びＮ−ピロリジニルが挙げられる。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アルコキシアミノ」、「シクロアルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「シクロアルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」、「アリールアミノ」、「アラルキルアミノ」、「ヘテロアリールアミノ」、「ヘテロシクロアルキルアミノ」、及び「アルキルスロホニルアミノ」は、−ＮＨＲ（但し、Ｒは、それぞれ、アルコキシ、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル及びアルキルスルホニルである）として定義される基を指す。アリールアミノ基の非限定的例は−ＮＨＣ_６Ｈ_５である。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アミド（アシルアミノ）」は、−ＮＨＲ（但し、Ｒは、アシルであり、その用語は上記で定義されている）を指す。アミド基の非限定的例は−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_３である。「置換（された）」の修飾語が無く使用される場合の用語「アルキルイミノ」は２価の基＝ＮＲ（但し、Ｒはアルキルであり、この用語は上記で定義されている）を指す。用語「アルキルアミノジイル」は、−ＮＨ−アルカンジイル−、−ＮＨ−アルカンジイル−ＮＨ−、またはアルカンジイル−ＮＨ−アルカンジイル−を指す。これらの用語のいずれかを「置換（された）」の修飾語と共に使用された場合、１個以上の水素原子は、独立して、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２ＣＨ_３、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ_３、またはＳ（Ｏ）_２ＮＨ_２によって置換されている。基−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＣＨ_３及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ_３は置換アミド基の非限定的例である。

【0106】

Ｂ．細胞外ｐＨ_Ｅ
本開示はまた、細胞または細胞群の細胞外ｐＨ（ｐＨ_ｅ）のイメージングに関する。特に、細胞外環境は腫瘍細胞であり得る。がん細胞がグルコースを優先的に取り込み、それを乳酸に変換する好気的解糖（別名、Ｗａｒｂｕｒｇ効果、図２３Ａ）が、腫瘍組織の存在を決定する方法として、腫瘍細胞のイメージングへの強い関心を再燃させた（Ｈｅｉｄｅｎら，２００９）。Ｗａｒｂｕｒｇ効果の臨床的関連性は、腫瘍診断のための及び治療反応をモニターするための、２−^１８Ｆ−デオキシグルコース（ＦＤＧ）の広い臨床用途により明らかになっている。腫瘍の微環境において、乳酸は、がん細胞膜で上昇するモノカルボキシレート輸送体により、優先的に細胞外空間で蓄積される（Ｈａｌｅｓｔｒａｐ ＆ Ｐｒｉｎｃｅ １９９９）。結果として得られた腫瘍内の細胞外ｐＨ（ｐＨ_ｅ）の酸性化は、腫瘍の浸潤及び転移の増大のための細胞外マトリックスの再構成を促進する。最近、Ｂａｒｂｅｒと共同研究者が、別の「がんの顕著な特徴」として腫瘍内の無調節ｐＨを記述した（Ｗｅｂｂら，２０１１）。

【0107】

多くの以前の研究は、腫瘍の微環境におけるｐＨ_ｅを定量化するために行われてきた（Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９９４；Ｇｉｌｌｉｅｓら，２００４；ｖａｎ Ｓｌｕｉｓら，１９９９及びＶｏｌｋら，１９９３）。図２３Ｂは、３０の異なるヒトがん細胞株から得た２６８の腫瘍における代表的なｐＨ_ｅ研究である（Ｖｏｌｋら，１９９３）。血液のｐＨ（７．４）に比べて、全ての腫瘍のｐＨ_ｅは、６．７１〜７．０１の範囲で、平均６．８４の酸性である。腫瘍ｐＨ_ｅの酸性は持続的であるが、腫瘍特異的イメージングのためにそれを有効に使うことは、比較的小さなｐＨ差（即ち、＜１ｐＨ単位）のため、困難で挑戦的なことであるが、このような小さなｐＨ差が、本出願の特別な興味である極めて狭いｐＨ転移を有するプローブを創製させた。

【0108】

いくつかの実施形態において、本開示は、画像化することができ、そして生理学的及び／または病理学的に処理することができ、細胞内もしくは細胞外ｐＨに影響を与えられるか、または影響を与える、ｐＨ応答性システムにおいて使用することができるポリマー及びミセルを提供する。このような細胞内または細胞外ｐＨとしては、感染症、瘻、潰瘍、糖尿病または他の疾患からのケトアシドーシス、低酸素症、代謝性アシドーシス、呼吸性アシドーシス、毒素の摂取、中毒、骨代謝回転、変性疾患、傷、及び放射線または他の原因の火傷による組織損傷が挙げられるが、これらに限定されない。

【0109】

Ｃ．腫瘍境界の手術用イメージング
外科的切除における端部でのがんの存在により定義される陽性腫瘍境界は、術後のＨＮＳＣＣ患者の腫瘍の再発及び生存に関して最も重要な指標である（Ｗｏｏｌｇａｒ ＆ Ｔｒｉａｎｔａｆｙｌｌｏｕ ２００５；ＭｃＭａｈｏｎら，２００３；Ｒａｖａｓｚら， Ａｔｋｉｎｓら，２０１２及びＩｃｚｋｏｗｓｋｉ ＆ Ｌｕｃｉａ ２０１１）。いくつかの実施形態において、正常な生理ｐＨの環境とは異なる細胞外ｐＨの環境を示すがん細胞はどれでも本明細書に開示されたｐＨ応答性システムを用いて画像化することができる。さらに、ｐＨ応答性色素で使用される色素を修飾することにより、様々な異なる市販の手術イメージングシステムを用いて腫瘍の境界を測定することができる。これらのシステムとしては、観血的手術システム（例、ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標））、マイクロ手術（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｌｅｉｃａ）、腹腔鏡手術 （Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｚ）及びロボット外科手術（ｄａ Ｖｉｎｃｉ（登録商標））等のシステムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの臨床システムの多くは、手術中のリアルタイムイメージングを可能にする早い取得時間を有する。さらに、本明細書に開示された混合ポリマー及び混合ポリマーを作製するために使用される個々のモノマーのホモポリマーが、手術中のイメージングのためのｐＨ応答性システムに使用することができる。

【0110】

Ｄ．ブロックコポリマー及び蛍光色素
本明細書に開示されたｐＨ応答性ミセル及びナノ粒子は、ブロックコポリマー及び蛍光色素を含む。ブロックコポリマーは、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントを含む。疎水性ポリマーセグメントはｐＨ感受性である。例えば、疎水性ポリマーセグメントは、ｐＨ感受性の状態にするイオン化可能アミン基を含むことができる。ブロックコポリマーは、これらのイオン化可能ブロックコポリマーの超分子自己組織化に基づくｐＨ活性化ミセル（ｐＨＡＭ）ナノ粒子を形成する。より高いｐＨでは、ブロックコポリマーはミセルに集合し、一方より低いｐＨで、疎水性ポリマーセグメントのアミン基のイオン化がミセルの解離をもたらす。イオン化基は、異なるｐＨで微調整可能な親水性／疎水性ブロックとして機能することができ、ミセルの動的自己組織化に直接影響を与えることができる。

【0111】

診断またはｐＨモニターの用途のために、標識部分をブロックコポリマーに結合する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ことができる。いくつかの実施形態において、標識（例えば、蛍光標識）は、ｐＨがミセル形成に有利に働く時、ミセルの内側に隔離される。ミセルの隔離は標識シグナル（例えば、蛍光の消光により）の減少をもたらす。特定のｐＨ条件は、ミセルの急速なプロトン化と解離に導いてユニマーとし、これにより標識を露出させて、標識シグナルを増加させることができる（例えば、蛍光発光の増加）。本開示のミセルは、診断利用において１つ以上の優位性をもたらすことができる、例えば：（１）以前のミセル組成物では数時間または数日であったのに反して、特定のｐＨ環境（例えば、酸性環境）下に短時間内（例えば、数分内）にミセルの解離（及び標識シグナルの急速増加）；（２）イメージング・ペイロードの増加；（３）標識の所望の部位（例えば、腫瘍または特定のエンドサイトーシス区域）への選択的ターゲティング；（４）長時間の血液循環；（５）特定の狭いｐＨ範囲内での反応性（例、特定オルガネラへのターゲティングのため）；（６）高いコントラスト感度及び特異性。例えば、ミセルが、正常な生理的条件（例えば、血液循環、細胞培地の条件）下では最小の背景シグナル内で静かに留まっている（または、オフ状態にある）が、ミセルが目的の分子標的に到達した場合イメージングシグナルが大きく増幅することができる（例えば、細胞外腫瘍環境または細胞オルガネラ）。

【0112】

多数の蛍光色素（染料）は当該技術分野で知られている。本開示のある態様において、蛍光色素はｐＨ感受性色素である。いくつかの実施形態において、蛍光色素は蛍光消光剤とペアとなって活性化時の大きなシグナル変化を得る。蛍光色素は、直接またはリンカー部分を介してコポリマーに結合される。当該技術分野で公知の方法が蛍光色素を、例えば、疎水性ポリマーに結合するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、蛍光色素はアミド結合を介して疎水性ポリマーのアミンに結合することができる。

【0113】

ブロックコポリマー及び蛍光色素に結合するブロックコポリマーの例として：

【0114】

【化50】

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（Ｉ）
［式（Ｉ）において、Ｒ_１は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、または

【0115】

【化51】

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或いは金属キレート基であり；ｎは１〜２５０の整数であり；Ｒ_２及びＲ_２’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；Ｒ_３は、式：

【0116】

【化52】

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（ＩＩ）
（式（ＩＩ）において、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４及びＸ_５は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４及びＸ_５は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；
ｘは１〜１００の整数であり；Ｒ_４は、式：

【0117】

【化53】

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（ＩＩＩ）
（式（ＩＩＩ）において、Ｘ_１’、Ｘ_２’、及びＸ_３’は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＸ_４’及びＸ_５’は、それぞれ独立して、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、アリール_{（Ｃ≦１２）}、ヘテロアリール_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものから選択され、或いはＸ_４’及びＸ_５’は、一緒になって、アルカンジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルコキシジイル_{（Ｃ≦１２）}、アルキルアミノジイル_{（Ｃ≦１２）}、またはこれらの基のいずれかの置換されたものである。）で表される基であり；ｙは１〜１００の整数であり；Ｒ_５は、式：

【0118】

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

（ＩＶ）
（式（ＩＶ）において、Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３は、それぞれ独立して、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換シクロアルキル_{（Ｃ≦１２）}から選択され；そしてＹ_４は、水素、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、アシル_{（Ｃ≦１２）}、置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}、置換アシル_{（Ｃ≦１２）}、色素、または蛍光消光剤から選択される。）で表される基であり；ｚは０〜６の整数であり；そしてＲ_６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル_{（Ｃ≦１２）}、または置換アルキル_{（Ｃ≦１２）}であり；且つＲ_３及びＲ_４が同一の基ではないとの条件で、Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５は当該ポリマー内においてどのような順序で現れても良い。］を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ポリマーの特定の組成物（Ｒ_３、Ｒ_４、及びＲ_５のモノマーのモル分率）はそのポリマーを用いて製造されるナノ粒子の特定のｐＨ転移点に関係する。

【0119】

Ｅ．ミセルシステム及び組成物
本明細書に開示されたシステム及び組成物は、異なるｐＨレベルに調整された単一ミセルまたは一連のミセルを利用する。さらに、ミセルは狭いｐＨ転移範囲を有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約１ｐＨ単位より小さいｐＨ転移範囲を有する。様々な実施形態において、ミセルは約０．９ｐＨ単位より小さい、約０．８ｐＨ単位より小さい、約０．７ｐＨ単位より小さい、約０．６ｐＨ単位より小さい、約０．５ｐＨ単位より小さい、約０．４ｐＨ単位より小さい、約０．３ｐＨ単位より小さい、約０．２５ｐＨ単位より小さい、約０．２ｐＨ単位より小さい、約０．１ｐＨ単位より小さいｐＨ転移範囲を有する。狭いｐＨ転移範囲は、ｐＨの微妙な変化を有するフルオロフォアの完全なターン−オンをもたらし得るより鋭いｐＨ応答性を有利に提供する。

【0120】

従って、ｐＨ誘導ミセル化をさせ及びミセル核でのフルオロフォアを消光化させる単一または一連のｐＨ調節可能な多色蛍光ナノ粒子は、ｐＨ転移（ポリマーを介して）、蛍光発光、または蛍光消光剤使用の独立制御メカニズムを提供する。蛍光波長は、例えば、紫色から近ＩＲ発光範囲（４００〜８２０ｎｍ）まで微調整することができる。これらの蛍光オン／オフ活性化は、小分子ｐＨセンサーと比較してはるかにより狭い０．２５ｐＨ単位未満で達成することができる。いくつかの実施形態において、蛍光オン／オフ活性化の狭い範囲は、０．２ｐＨ単位以下で達成することができる。いくつかの実施形態において、その範囲は、０．１５ｐＨ単位以下である。さらに、蛍光消光剤の使用は、会合及び非会合ナノ粒子間の差が会合ナノ粒子の５０倍より大きくなるように、蛍光活性化を増加させることもできる。いくつかの実施形態において、蛍光活性は会合ナノ粒子の７５倍より大きい。この多色ｐＨ調節可能かつ活性化可能蛍光ナノプラットフォームは、がん、リソソーム蓄積症、及び神経障害に関連する、エンドサイトーシス・オルガネラ、受容体サイクリング、及びエンドサイトーシス輸送中のｐＨ調節等の基本的な細胞生理的プロセスを調査するための価値あるツールを提供する。

【0121】

ミセルのサイズは、典型的にはナノメートルスケール（即ち、直径約１ｎｍ〜１μｍ）である。いくつかの実施形態において、ミセルは約１０〜約２００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約２０〜約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ミセルは約３０〜約５０ｎｍのサイズを有する。

【0122】

Ｆ．標的指向部分
ミセル及びナノ粒子は標的指向部分をさらに含むことができる。標的指向部分は、ナノ粒子またはミセルを、例えば、特定の細胞表面受容体、細胞表面マーカー、またはオルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソーム）へ標的指向させるために使用することができる。このような標的指向部分は、受容体リサイクリング、マーカーリサイクリング、細胞内ｐＨ調節、エンドサイトーシス輸送の研究において有利である。

【0123】

標的指向部分は、例えば、抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ’断片）、タンパク質、ペプチド（例えば、シグナルペプチド）、アプタマー、または小分子（例えば、葉酸）でもよい。当該技術分野において公知の方法を用いて、標的指向部分を、ブロックコポリマーに結合することができる（例えば、親水性ポリマーセグメントに結合する）。標的指向部分の選択は個々の標的に依存する。例えば、抗体、抗体断片、小分子、または結合パートナーが、細胞表面受容体及び細胞表面マーカーを標的とするためにより適切であり得るが、一方ペプチド、特にシグナルペプチドも、オルガネラを標的とするためにより適切であり得る。

【0124】

Ｇ．蛍光検出
本発明の様々な態様は、蛍光シグナルの増加を検出することによるミセル解離の直接的または間接的な検出に関する。蛍光色素からの蛍光シグナルを検出するための技術は当業者に公知である。例えば、下記の実施例に記載される蛍光共焦点顕微鏡法はこのような技術の一つである。

【0125】

例えば、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、蛍光シグナルを検出するために使用することができる別の技術である。フローサイトメトリーは、液体試料中の細胞または他の粒子、例えばマイクロスフェア、の分離を伴う。フローサイトメトリーの基本的工程は、液体流がセンシング領域を通過するように、装置により流体試料の方向を規定することを含む。粒子は、センサーのそばを１つずつ通過し、サイズ、屈折、光散乱、不透明性、粗さ、形状、蛍光等に基づいて分類されるはずである。

【0126】

本明細書に記載された測定は、１つ以上の細胞画像を分析し、複数の検出波長での及び／または複数の時点での蛍光発光の大きさを示す数値等の１つ以上の細胞の特性を決定するための、画像処理を含むことができる。

【0127】

Ｈ．キット
本開示はまたキットを提供する。本明細書に開示された成分のいずれかをキット中に組み込むことができる。ある実施形態において、キットは、前述のｐＨ応答性システムまたは組成物を含む。

【0128】

キットは、成分を入れることができる、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器を概して含む。キット中に２種以上の成分が存在する場合、キットはまた、追加の成分が別に入れられ得る、第２、第３または他の追加の容器を概して含有する。しかしながら、成分の様々な組み合わせが１つの容器中に含まれてもいてもよい。いくつかの実施形態において、シリーズ中のミセル集団の全てが単一の容器中で組み合わされる。他の実施形態において、シリーズ中のミセル集団の一部または全てが別々の容器中に提供される。

【0129】

本開示のキットはまた、概して、商品販売のため厳重に密封した様々な容器を含有する包装を含む。このような包装は、所望の容器が保持される、ボール紙または射出若しくはブロー成形プラスチック包装を含み得る。キットはまた、キット成分を使用するための説明書を含んでもよい。説明書は、実施することができるバリエーションを含んでもよい。

【0130】

Ｉ．ＳＰＥＣＴ及びＰＥＴ
放射線核種イメージング法（様式）（陽電子発光断層撮影法、（ＰＥＴ）；単光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））は、放射線核種標識化放射線トレーサーの位置及び濃度の地図を描く診断断面イメージング技術である。ＣＴ及びＭＲＩは、腫瘍の位置と程度についてかなり解剖学的情報をもたらすが、これらのイメージング法は、浮腫、放射線壊死、悪性度分類（ｇｒａｄｉｎｇ）、またはグリオーシスから侵襲性病変を的確に見分けることができない。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは、代謝活性を測定することにより腫瘍を位置づけ及び特性づけに使用することができる。

【0131】

ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは、細胞生存率等の細胞レベルでの情報に関する情報を提供する。ＰＥＴでは、陽電子を発する少し放射能のある物質が患者に摂取または注入され、物質が体を通過するのをモニターすることができる。１つの通常の利用では、例えば、患者が、結合した陽電子エミッターを有するグルコースが与えられ、彼らの脳が様々な働きを行うので、モニターされる。脳は働くとともにグルコースを使用するので、ＰＥＴ画像は、どこの脳の活性が高いかを示す。

【0132】

単光子放出コンピューター断層撮影、即ちＳＰＥＣＴは、ＰＥＴに密接に関係している。これら２つの主要な相違は陽子発生物質の代わりにＳＰＥＣＴは低エネルギー光子を発する放射能のあるトレーサーを使用する。ＳＰＥＣＴは、冠動脈疾患を診断するために有用であり、既におよそ２５０万のＳＰＥＣＴによる心臓研究が、毎年米国で行われている。

【0133】

イメージングするためのＰＥＴ放射線医薬品は、通常、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^８２Ｒｂ、^６２Ｃｕ、及び^６８Ｇａ等の陽電子放射体で標識化される。ＳＰＥＣＴ放射線医薬品は、通常^９９ｍＴｃ、^２０１Ｔｌ及び^６７Ｇａ等の陽電子放射体で標識化される。脳イメージングに関して、ＰＥＴとＳＰＥＣＴ放射線医薬品は、血液脳関門透過性（ＢＢＢ）、脳かん流及び代謝受容体結合、並びに抗原抗体結合に従って分類される（Ｓａｈａら，１９９４）。血液脳関門ＳＰＥＣＴ製剤、例えば、^９９ｍＴｃＯ４−ＤＴＰＡ、^２０１Ｔｌ、及び［^６７Ｇａ］クエン酸塩、は正常脳細胞により除去されが、変更されたＢＢＢのため腫瘍細胞に入る。ＳＰＥＣＴ血流製剤、例えば［^１２３Ｉ］ＩＭＰ、［^９９ｍＴｃ］ＨＭＰＡＯ、［^９９ｍＴｃ］ＥＣＤは親油性薬物であり、それ故正常脳に拡散する。重要な受容体結合ＳＰＥＣＴ放射性医薬品としては、［^１２３Ｉ］ＱＮＥ、［^１２３Ｉ］ＩＢＺＭ、及び［^１２３Ｉ］イオマゼニルが挙げられる。これらのトレーサーは特定の受容体に結合し、受容体関連疾患の評価において重要なものである。

【実施例】

【0134】

Ｊ．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証するために含む。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者によっ見出された技術を示し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると考えられ得ることを、当業者は認めるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らし、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な態様において多くの変更を行い、同様または類似の結果をさらに得ることができることを理解するべきである。

【0135】

実施例１：ｐＨ応答性ナノプローブのライブラリーを製造するための方法及び材料
１．材料
異なるフルオロフォア及び蛍光消光剤のＮ−ヒドロキシスクシンイミダル（ＮＨＳ）エステルを下記のようにして得た：ＲｈｏＧ−ＮＨＳ、ＴＭＲ−ＮＨＳ、ＲＯＸ−ＮＨＳ、ＢＤＹ−ＮＨＳ、ＢＤＹ−ＴＭＲ−ＮＨＳ、ＢＤＹ６３０−ＮＨＳ、ＡＭＣＡ−ｘ−ＮＨＳ、ＭＢ−ＮＨＳ、ＰＰＯ−ＮＨＳ、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７及びＱＳＹ２１エステルを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した；Ｃｙ５−ＮＨＳ、Ｃｙ５．５−ＮＨＳ、Ｃｙ７．５−ＮＨＳエステルをＬｕｍｉｐｒｏｂｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した；ＢＨＱ−１−ＮＨＳエステルをＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＰＥＯマクロ開始剤、ＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−Ｂｒ、を２−ブロモ−２−メチルプロパノイルブロミド及びＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−ＯＨからＢｒｏｎｓｔｅｉｎ，ら（参照により本明細書に取り込まれている）の手順に従い作製した。ブロモプロパン、ブロモブタン、ブロモペンタン、エタノールアミン、メタクリル酸クロリド、及びナトリウム塩をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。モノマー、例えば２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡ−ＭＡ）、２−（ジエチルアミノ）メタクリレート（ＤＥＡ−ＭＡ）及び２−アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ）をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ＡＭＡは、イソプロパノール及び酢酸エチル（３：７）で２回再結晶した。モノマー、２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＢＡ−ＭＡ）は、既に公表された手順^２に従い合成した。モノマー、２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）及び２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート（Ｄ５Ａ−ＭＡ）は、本明細書で報告している。ＡＭＡモノマーは、使用前にイソプロパノール及び酢酸エチル（３：７）で２回再結晶した。他の溶剤及び薬剤はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から得て使用した。

【0136】

２．新規のメタクリレートモノマーの合成
新規のメタクリレートモノマーは、刊行物記載の方法に従い合成した。２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）の^［２］合成は、実施例としてここに記載される。まず、エタノールアミン（１２．２ｇ、０．２ｍｏｌ）及びブロモプロパン（４９．２ｇ、０．４ｍｏｌ）を４００ｍＬのアセトニトリルに溶解し、この溶液にＮａ_２ＣＯ_３（５３．０ｇ、０．５ｍｏｌ）を添加した。一晩反応させた後、溶液をろ過して析出したＮａＢｒ塩及び過剰のＮａ_２ＣＯ_３を除去した。ＣＨ_３ＣＮ溶剤をロータリーエバポレータ（ｒｏｔｏｖａｐ）により除去した。得られた残渣を真空下で蒸留し（４０〜４５℃、０．０５ｍｍＨｇ）、無色液体として２−（ジプロピルアミノ）エタノールを得た。その後２−（ジプロピルアミノ）エタノール（２１．３ｇ、０．１ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０．１ｇ、０．１ｍｏｌ）及び阻害剤のヒドロキノン（０．１１ｇ、０．００１ｍｏｌ）を１００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、塩化メタクリロイル（１０．４ｇ、０．１ｍｏｌ）を三口フラスコに滴下した。溶液を一晩環流した。反応後、溶液をろ過し析出したトリエチルアミン−ＨＣｌ塩を除去し、そしてＣＨ_２Ｃｌ_２溶剤をロータリーエバポレータにより除去した。得られた残渣を真空下で蒸留し（４７〜５３℃、０．０５ｍｍＨｇ）、無色液体を得た。合成後、モノマーを^１Ｈ−ＮＭＲにより特性評価した。全てのＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ_３中、内部基準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いＶａｒｉａｎ ５００ＭＨｚスペクトロメーターで得た。２つの新しいモノマーの特性は以下の通り：

【0137】

【化55】

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２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）
^１Ｈ ＮＭＲ （ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：６．１０（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），５．５４（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），４．０７（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），３．０１（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．６８（ｔ，４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）_２，１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−），１．４４（ｍ、４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），１．０１（ｔ，６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）

【0138】

【化56】

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２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート（Ｄ５Ａ−ＭＡ）
^１Ｈ ＮＭＲ （ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：６．１０（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），５．５５（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），４．２０（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．７４（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．４５（ｔ，４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）_２，１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−），１．４３（ｍ、４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），１．３０（ｍ、４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），１．２４（ｍ、４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），０．８８（ｔ，６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），

【0139】

【化57】

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２−（エチルプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＥＰＡ−ＭＡ）
^１Ｈ ＮＭＲ （ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：６．１０（ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），５．５４（ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），４．２０（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．７５（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．５８（ｑ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），２．４４（ｍ、２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−），１．４５（ｍ、２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．０２（ｔ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），０．８７（ｔ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３））

【0140】

【化58】

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２−（ブチル（イソプロピル）アミノ）エチルメタクリレート（^ｎｉＤ３．５Ａ−ＭＡ）
^１Ｈ ＮＭＲ （ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：６．０９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），５．５３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），４．１１（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．９２（ｍ、１Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２），２．６４（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．４２（ｔ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−），１．３８（ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２），１．２９（ｍ、２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２），０．９７（ｄ，６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２），０．８８（ｔ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ（ＣＨ_３）_２）。

【0141】

３．ＰＥＯ−ｂ−ＰＲブロックコポリマーの合成
ＰＥＯ−ｂ−ＰＲブロックコポリマーは、Ｚｈｏｕ，ら，２０１１（参照により本明細書に取り込まれている）に記載されているように原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）により合成した。色素無しコポリマーはポリマーの特性評価に使用した。表１〜３に各ポリマーの特性をまとめる。ＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡを、手順を説明する例として使用する。まず、ＤＰＡ−ＭＡ（１．７０ｇ、８ｍｍｏｌ）、ＰＭＤＥＴＡ（２１μＬ、０．１ｍｍｏｌ）及びＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−Ｂｒ（０．５ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を重合管に充填した。その後、２−プロパノール（２ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）の混合物を添加し、モノマーと開始剤を溶解した。酸素を除去するため凍結脱気（ｆｒｅｅｚｅ−ｐｕｍｐ−ｔｈａｗ）を３サイクルした後、ＣｕＢｒ（１４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に重合管に加え、重合管を真空で密封した。重合は４０℃で８時間行われた。重合後、反応混合物は１０ｍＬのＴＨＦで希釈され、中性Ａｌ_２Ｏ_３カラムを通過させて触媒を除去した。ＴＨＦ溶剤をロータリーエバポレータにより除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥して白色粉末を得た。

【0142】

【表1】

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【0143】

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【0144】

【表3】

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【0145】

４．ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−色素／ＦＱ）ブロックコポリマーの合成
ＡＭＡを色素または蛍光消光剤の結合のために使用した。ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）コポリマーの合成は前記の手順に従った。３つの第１級アミノ基を、開始剤に対するＡＭＡモノマーの供給比（比＝３）を制御することにより各ポリマー鎖に導入した。合成後、ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）（１０ｍｇ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解した。その後ＮＨＳ−エステル（色素−ＮＨＳまたはＦＱ−ＮＨＳに対して１．５当量）を添加した。一晩反応後、コポリマーをゲルパーミエ−ションクロマトグラフィ（ＰＬｇｅｌ Ｐｒｅｐ １０ｍ １０Ｅ３Å ３００×２５０カラム、Ｖａｒｉａｎ製、溶離液としてＴＨＦ ５ｍＬ／ｍｉｎ）により精製し、遊離の色素分子を除去した。製造されたＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−色素／ＦＱ）コポリマーを凍結乾燥し、貯蔵のため−２０℃に保持した。

【0146】

５．ミセルナノ粒子の作製
ミセルは、Ｚｈｏｕ，ら，２０１１（参照により本明細書に取り込まれている）に前述されているように、作製した。典型的な手順において、５ｍｇのＰＤＰＡ−Ｃｙ５を０．５ｍＬのＴＨＦに溶解した。その後、溶液を、４ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水に超音波処理下にゆっくり添加した。混合物を、マイクロ限外ろ過システム（ＭＷＣＯ＝１００ＫＤ）を用いて４回ろ過してＴＨＦを除去した。その後、脱イオン水を添加して、ポリマー濃度を貯蔵液としての５ｍｇ／ｍＬに調節した。混合ミセルのために、異なる重量比のＰＲ−色素とＰＲ−ＦＱコポリマーを０．５ｍＬのＴＨＦに溶解し、そして同様の手順を用いた。

【0147】

６．蛍光特性
蛍光発光スペクトルを、日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）により得た。各ポリマーについて、最初に、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水にて２ｍｇ／ｍＬの濃度で作製した。その後貯蔵溶液を、異なるｐＨ値を有する０．２Ｍクエン酸−リン酸塩緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有）で希釈した。最終的なポリマー溶液は１００〜２００μｇ／ｍＬに制御された。

【0148】

異なるｐＨ値を有する４．４−７．１−Ｃｙ５ｓ、５．０−ＢＤＹ、５．３−ＲｈｏＧ、５．６−ＴＭＲ、５．９−ＲＯＸ、６．２−ＢＤＹ６３０、６．５−Ｃｙ５、６．８−Ｃｙ５．５及び７．１−Ｃｙ７．５溶液（各溶液について１００μｇ／ｍＬ）の蛍光画像のために、Ｍａｅｓｔｒｏイメージングシステム（ＣＲＩ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を、装置マニュアルに従い適正バンドパス励起フィルタ及び適正ロングパス発光フィルタを選択することにより用いた。４．４−ＡＭＣＡ及び４．７−ＭＢのために、画像は携帯型ＵＶ光（３６５ｎｍ）の照射下にカメラにより撮られた。全ての測定は室温で行われた。

【0149】

実施例２：ｐＨ応答性ポリマーミセルのライブラリーの合成及び特性評価
１．ＡＴＲＰ法によりコポリマーの合成
触媒としてＣｕＢｒ及びコポリマー合成用のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）リガンドを用いた原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法（Ｔｓａｒｅｖｓｋｙ及びＭａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，２００７；Ｍａ，ら，２００３）（図１）を、検討のためのコポリマーを作製するために使用した。ホモポリマーＰＲブロックを有するＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマーを、前述の単一メタクリレートモノマーを用いて合成した（Ｚｈｏｕ，ら，２０１１；Ｚｈｏｕ，ら，２０１２）。ＰＲセグメントの疎水性を連続的に微調整するために、異なる疎水性を有する２種のメタクリレートモノマーを用いる共重合戦略（図１）を使用した。２種のモノマーのモル分率は重合の前に正確に制御され、ランダム共重合されたＰ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２）ブロックを得ることができる。異なるジアルキル鎖長（例えば、エチル、プロピル、ブチル及びペンチル）を有する一連のメタクリレートモノマーを、この今の検討に用いた。蛍光及び蛍光消光剤を導入するために、アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ−ＭＡ）（ポリマー鎖当たり３個の繰り返し単位）も導入され、遊離アミノ基が色素またはＦＱに活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを介して導入された。

【0150】

合成後、コポリマーは^１Ｈ ＮＭＲで特性評価され、化学組成が確認され、ゲルパーミエーションクロマトグラフィにより数平均及び重量平均分子量及び多分散性が測定された（表１〜３、図２〜６）。

【0151】

２．ｐＨ_ｔ制御に関して共重合と分子混合の戦略の比較
初めに、ＵＰＳナノプローブのｐＨ_ｔ値を制御するためその能力についての２つの異なる戦略を比較した。第１の戦略は、異なるｐＨ転移を有する２種のＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマー分子混合に関わる。この実施例では、Ｃｙ５−結合ＰＥＯ−ｂ−ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＥＡ、全てのコポリマーは、以下で特に断りの無い限り、ＰＲセグメントにおいてＣｙ５色素と結合された）及びＰＥＯ−ｂ−ポリ［２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤ５Ａ）を使用した。ＰＤＥＡ及びＰＤ５Ａナノプローブは、それぞれｐＨ転移を４．４と７．８に有していた。溶剤蒸発手順は、各ミセルで同じモル％（即ち５０％）を有する両方のコポリマーからなるミセルナノプローブを生成させるために使用された（これはヘテロＦＲＥＴ実験により確認された）。第２の戦略では、Ｃｙ５−結合ＰＥＯ−ｂ−ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート−ｒ−２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート］コポリマー（Ｐ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０））を合成し、これはＰＲセグメントが２種のモノマーのランダムコポリマーからなるものであった（各モノマーについて４０の繰り返し単位、表１）。流体力学直径は、ＰＤＥＡ／ＰＤ５Ａ（分子混合）及びＰ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）（コポリマー）について、それぞれ６５ｎｍ及び２２ｎｍであった。

【0152】

２種のミセル設計は蛍光発光対ｐＨ関係において大きく異なるパターンを示した。ＰＤＥＡ／ＰＤ５Ａナノプローブについて、ｐＨ転移の際立った挙動が、個々のコポリマーに対応して観察され、蛍光オン／オフ転移が４．４及び７．８であった（図７Ａ、図８）。この結果は、ミセル内でのＰＤＥＡとＰＤ５Ａの間の鎖の絡み合いは、個々のポリマーの会合挙動を取り除くには十分でないことを示している。対照的にＰ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）ナノプローブは、６．０の単一のｐＨ転移、ＰＤＥＡとＰＤ５Ａの間のほぼ中間を示した。

【0153】

転移ｐＨの制御を探るために、モル分率を変化させた２種のモノマーの一連のＰ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）コポリマーを合成した。得られたコポリマーは異なるｐＨ転移を示した（図７Ｂ、図９）。ＤＥＡモノマーのモル分率の関数としてのナノプローブのｐＨ_ｔのプロットは直線関係を示した（図７Ｃ）。疎水性のより少ないモノマー（例えば、ＤＥＡ−ＭＡ）をより高い％で導入することにより、より高いｐＨ転移が得られた。ＵＰＳナノプローブの転移ｐＨは、ＰＲセグメントの疎水性を変化させることにより主として制御することができる。この観察は、電子吸引または共与基が微調整に必要である低分子ｐＨセンサーに反している（Ｕｒａｎｏ，ら，２００９）。

【0154】

３．モノマー相溶性のｐＨ転移の鋭さへの影響
異なるモノマー％を有するＰ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）ナノプローブは、転移ｐＨの制御を可能にするが（図７Ｂ〜Ｃ）、ｐＨ転移の鋭さは、ホモポリマーＰＲセグメントを有する対応するナノプローブより顕著に広範囲となっている。より具体的には、ｐＨ_{１０−９０％}値（蛍光強度が１０％〜９０％増加するｐＨ範囲）が、２５、５０及び７５％のＤＥＡ−ＭＡ組成を有するＰ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）コポリマーについて、それぞれ０．６５、０．６４及び０．４７で、これに比較してＰＤＥＡ及びＰＤ５Ａについてはそれぞれ０．１４及び０．１９であった。Ｐ（ＤＥＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）コポリマーから得られた広いｐＨ応答は、大きい疎水性差を有するモノマーから得られる不均一な鎖の性質を示唆している。

【0155】

ｐＨ転移の鋭さを改善するために、密接に適合した疎水性を有するモノマーを使用することにより調査研究した。例として、２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）及び２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＢＡ−ＭＡ）を選択して一連のＰ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）ナノプローブを製造した。この２種のモノマーは、窒素置換基の１つの炭素が異なっている（即ち、プロピルとブチル）。２種のモノマーの共重合は、鋭いｐＨ転移を有する、より精密に調整可能な一連のナノプローブをもたらした（図１０Ａ、図１１）。ｐＨ_{１０−９０％}値は、２５、５０及び７５％のＤＰＡ−ＭＡ組成を有するＰ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）コポリマーについて、それぞれ０．１９、０．２０及び０．１８であった。各コポリマープローブは鋭いｐＨ転移（＜０．２５ｐＨ単位）を維持した。図１０Ｂは、ｐＨの関数としての蛍光誘導体プロットを示し、さらに一連のＰ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）ナノプローブが、単一のＰ（ＤＥＡ_４０−Ｄ５Ａ_４０）ナノプローブに比較して、同じｐＨ範囲で大きく向上した鋭さを有することを示している。

【0156】

ＤＰＡ−ＭＡモノマーのモル分率の関数としてのＰ（ＤＰＡ_ｘ−ＤＢＡ_ｙ）ナノプローブのｐＨ_ｔ値のプロットは直線関係を与えた（図１０Ｃ）。同様に、一連のＰ（ＤＢＡ_ｘ−Ｄ５Ａ_ｙ）及びＰ（ＤＥＡ_ｘ−ＤＰＡ_ｙ）の標準曲線も、ｐＨ_ｔとモノマーのモル分率との間の直線関係を示すものであることが確立された。これらの標準曲線は、正しいＰＲ組成を有するコポリマーを選択することにより予め定められたｐＨ転移（４．４〜７．８の間）のいずれかを有するＵＰＳナノプローブの合理的設計を可能にする（つまり、モノマー対および特定のモル分率の選択）。概念実証を行ったところ、ｐＨの全生理的範囲（４．４〜７．４）をカバーする０．３ｐＨの増分を有する１０のナノプローブからなるＵＰＳライブラリーを作製し、各ナノプローブが鋭いｐＨ転移を維持した（オン及びオフ状態の間で＜０．２５ｐＨ単位、図１０Ｄ、図１２〜１３）。

【0157】

４．フルオロフォア選択を拡大するための蛍光消光剤の使用
以前、ホモ−ＦＲＥＴ誘発蛍光減衰は、ＵＰＳナノプローブのオン／オフ活性化設計を達成するための主なメカニズムであると報告された（Ｚｈｏｕ，ら，２０１２）。このメカニズムは、小さいストークシフト（＜４０ｎｍ）を有するフルオロフォア（例えば、ローダミン及びシアニン色素）にのみ適用される。大きなストークシフトを有する色素（例えば、マリーナブルーまたはＰＰＯ、λ≧１００ｎｍ）について、蛍光活性化比（Ｒ_Ｆ＝Ｆ_ｏｎ／Ｆ_ｏｆｆ、このＦ_ｏｎ及びＦ_ｏｆｆはそれぞれオン、オフ状態の蛍光強度である）は５未満であった。さらに、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素について、ｐＨ転移は、光子誘発電子移動（ＰｅＴ）メカニズムの結果により、比較的低いＲ_Ｆ（＜１５）を有して広範（＞０．５ｐＨ単位）であった（Ｐｅｔｓａｌａｋｉｓ，ら，２００８；Ｔａｌ，ら，２００６；Ｄａｌｅ及びＲｅｂｅｋ，２００６）。

【0158】

これらの制約を克服するため、フルオロフォア選択を拡大するための蛍光消光剤の使用が検討された。蛍光消光剤は活性化可能イメージングプローブの設計に多くのグループによって広く使用されてきている（Ｂｌｕｍ，ら，２００５；Ｌｅｅ，ら，２００９；Ｌｅｖｉ，ら，２０１０；Ｍａｘｗｅｌｌ，ら，２００９）。メカニズムは、所望のフルオロフォアからＦＱへの蛍光共鳴エネルギー移動に基づいており、その移動後放射エネルギーを熱に消散させる。この設計において、異なる発光波長に感受性を有する一連のＦＱが作製され、コポリマーに結合される（図１４）。ＵＰＳナノプローブは、同一ミセル核内で、ＦＱ−結合ポリマーを色素−結合ポリマーと混合することにより製造される。ミセル状態で、ＦＱは予想されているように、その化合物が、蛍光シグナルを効果的に抑制し、ミセル解離時にＦＱとフルオロフォアとの分離が蛍光発光の顕著な増加をもたらすと思われる（図１５Ａ）。

【0159】

ＦＱ戦略の有効性を評価するために、ＰＥＯ−ｂ−ポリ［２−（プロピルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＰＡ）をモデルシステムとして使用し、異なるＦＱとフルオロフォアをコポリマーに結合した。ＰＤＰＡナノプローブはｐＨ転移を６．２に有していた。まず、大きいストークシフトを有するフルオロフォア（例えば、ＡＭＣＡ：３５３／４４２；マリーナブルーまたはＭＢ：３６２／４６２；ＰｙＭＰＯまたはＰＰＯ：４１５／５７０。２つの数字はそれぞれ活性化波長及び発光波長を指す。）のＦＱ戦略を調査研究した。ＦＱ−結合ポリマーの導入無しでは、ＰＤＰＡ−ＡＭＣＡ及びＰＤＰＡ−ＭＢナノプローブは、それぞれｐＨ５．０及び７．４においてオンとオフの間で僅か３倍の蛍光活性化しか示さなかった（図１８Ａ）。ＰＤＰＡ−ＱＳＹ３５のＰＤＰＡ−ＡＭＣＡまたはＰＤＰＡ−ＭＢへの導入は蛍光活性化のかなりの増加をもたらし、ＰＤＰＡ−ＱＳＹ３５のモル分率が６７％になった時停滞期に達した（図１６Ａ）。この組成で、Ｒ_Ｆ値は約９０倍に達し、これはＦＱ無しのものより３０倍高い（図１８Ｂ）。同様に、ＰＤＰＡ−ＱＳＹ７（５０ｍｏｌ％）のＰＤＰＡ−ＰＰＯナノプローブへの導入は、それぞれＲ_Ｆ値を６から＞１３０倍に増加させた（図１８Ｂ）。

【0160】

ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素について、ＰＤＰＡ−ＢＤＹ４９３及びＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブはほんの約１５倍の蛍光活性化を与え（図１８Ｃ）、生理的利用には十分ではない（例えば、細胞イメージング中では、＞３０のＲ_Ｆ値が背景シグナルを抑制するには必要である）。ＰＤＰＡ−ＢＨＱ１（５０ｍｏｌ％）及びＰＤＰＡ−ＱＳＹ７（５０ｍｏｌ％）のＰＤＰＡ−ＢＤＹ４９３及びＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブへの導入は、Ｒ_Ｆ値の劇的な増加をもたらす（共に＞１００倍、図１８Ｄ、図１９）。興味深いことに、ＰＤＰＡ−ＢＤＹ６３０のみが４０倍のＲ_Ｆ値を達成することができた。ＰＤＰＡ−ＱＳＹ２１の追加がさらにＲ_Ｆ値を２５０倍超過に増加させた（図１８Ｄ）．

【0161】

以前の研究は、小さいストークシフト（＜４０ｎｍ）を有するローダミン及びシアニン色素は、ホモＦＲＥＴ誘発蛍光減衰メカニズムにより大きなＲ_Ｆ値を有するＵＰＳナノプローブを生成させることができた（Ｚｈｏｕ，ら，２０１２）。この研究の結果は、以前のレポート、即ちＰＤＰＡ色素コポリマーのみが、ローダミン及びシアニン色素に対してそれぞれ＞５０倍及び＞１００倍に達することが確認された。ＦＱ結合コポリマーはさらにこれらのナノプローブのＲＦ値を増加させた（図１８Ｆ、図２０〜２２）。

【0162】

図１８Ｅ〜Ｆは、蛍光消光剤の導入有り及び無しのＰＤＰＡナノプローブで使用される全てのフルオロフォアについての蛍光活性化比（Ｒ_Ｆ＝Ｆ_５．０／Ｆ_７．４）をまとめた。データは、ＦＱ結合ポリマーの追加で、全てのフルオロフォア（全部で１２）は、ストークシフトまたはＰｅＴメカニズムに関係なく、例外なく高い活性化比（＞５０倍）を示すことを提示した。加えて、ＦＱ結合ポリマーの導入はｐＨ転移の鋭さへの影響は与えなかった（全ての複合体ナノプローブはオン及びオフ状態の間で＜０．２５ｐＨ単位有していた、図１８Ｂ及び１８Ｄ並びに図２２Ｂ〜２２Ｄ）

【0163】

５．大きいｐＨ転移及び蛍光発光に広がるＵＰＳライブラリー
上記結果に基づき、それぞれ異なる蛍光でコードされた１０個のナノプローブからなるＵＰＳライブラリーを製造した。各ナノプローブの組成は、図１０Ｄ（詳細は表３参照）に従い、得られた収集されたものは４〜７．４のｐＨスパンで０．３ｐＨ増加分を有するものであった。各ナノプローブについて、同じポリマー濃度（即ち０．１ｍｇ／ｍＬ）であるが異なるｐＨ値の一連の水溶液を調製した。４．４−ＡＭＣＡ、４．７−ＭＢ、５．０−ＢＤＹ及び６．２−ＢＤＹ６３０ナノプローブについて、対応のコポリマーを、同等量のＦＱ結合適合ポリマーと混合し、高いオン／オフコントラストを獲得した。図２４は、各フルオロフォアに対応する活性化／発光波長でのＵＰＳナノプローブライブラリーの発光画像を示す。

【0164】

図２４の結果は、４〜７．４の全生理的ｐＨにわたる外部環境に対するＵＰＳナノプローブの鋭敏なｐＨ感受性を示している。最低ｐＨ範囲で、４．４−ＡＭＣＡナノプローブはｐＨ４．５５でオフとなるがｐＨ４．２５でオンに変わった。このナノプローブは、ヒドロラーゼが酵素活性のためにより低いｐＨを必要とする際の機能性リソソームのｐＨの検出に有用であると言える。ナノプローブのオン／オフ特性により、それらは、リソソーム機能に影響を与える分子経路または小分子摂動体の同定を可能にするスクリーニング用途に特により一層有用となる。より高いｐＨ範囲（例えば、６．５〜７．１）をカバーするナノプローブについて、ナノプローブは、腫瘍の酸性ｐＨ_ｅのイメージングに有用であり、そしてナノプローブ活性化をがん細胞の解糖速度に関連付けることができる（Ｗａｎｇ，ら，２０１４；Ｋｏ，ら ２０１０）。中間範囲（例えば、５．０〜６．５）におけるナノプローブはエンドソーム／リソソームの成熟の研究に有用であり、細胞内イメージングまたは薬品送達用途のためのオルガネラ特定組成物を確立することができる。

【0165】

実施例３：アニオン駆動ミセル形成方法
１．ＰＥＯ−ｂ−ＰＲブロックコポリマーの合成
ＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマー（スキーム１）は、Ｚｈｏｕ，ら，２０１１（参照により本明細書に取り込まれている）に報告された原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）により合成された。色素非含有コポリマーはポリマー特性評価で使用された。ＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡ（３）は、手順を説明するための例として使用される。まず、ＤＰＡ−ＭＡ（１．７０ｇ、８ｍｍｏｌ）、ＰＭＤＥＴＡ（２１μＬ、０．１ｍｍｏｌ）及びＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−Ｂｒ（０．５ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を重合管に充填した。その後２−プロパノール（２ｍＬ）とＤＭＦ（２ｍＬ）の混合物を加えてモノマー及び開始剤を溶解した。酸素除去のため凍結脱気を３回繰り返した後、ＣｕＢｒ（１４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下重合管に加え、重合管を真空下に密封した。重合を４０℃で８時間行った。重合後、反応混合物を１０ｍＬのＴＨＦで希釈し、中性Ａｌ_２Ｏ_３カラムを通過させてＣｕ触媒を除去した。ＴＨＦ溶剤をロータリーエバポレータで除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥し白色粉末を得た。表４に各コポリマーの特性をまとめる。

【0166】

【化59】

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【0167】

【表4】

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【0168】

２．ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＴＭＲ／Ｃｙ５）ブロックコポリマーの合成
ＡＭＡモノマーを色素結合用コポリマーに取り込んだ（スキームＳ１ｂ）。ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）の合成は前述の手順に従った。３つの第１級アミノ基を、開始剤に対するＡＭＡモノマーの供給比（比＝３）を制御することにより、各ポリマーに導入された。代表的手順では、ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）（５０ｍｇ）を２ｍＬのＤＭＦに溶解した。その後ＮＨＳ−エステル（ＴＭＲ−ＮＨＳに対して２．０当量及びＣｙ５−ＮＨＳに対して１．０当量）を加えた。一晩反応後、コポリマーを調製ゲルパーミエ−ションクロマトグラフィ（ＰＬｇｅｌ Ｐｒｅｐ １０ｍ １０Ｅ３Å ３００×２５０ カラム、Ｖａｒｉａｎ、溶離液としてＴＨＦ（５ｍＬ／ｍｉｎで））により精製し、遊離色素分子を除去した。製造されたＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−色素）コポリマーを凍結乾燥し、貯蔵中は−２０℃に保持した。ブロックコポリマーが自己組織化してミセルを形成した際、色素はＨｅｔｅｒｏ ＦＲＥＴ及び自己消光の両方を受けることに注目することが重要である。このため各ポリマー鎖の色素結合数がＦＲＥＴ実験には重要である。実験において、ＴＭＲとＣｙ５の結合数は、それぞれ、ポリマー鎖当たり２及び１に制御された。

【0169】

３．ミセルナノ粒子の調製
各コポリマーについて、ミセルの貯蔵液は、Ｎａｓｏｎｇｋｌａ，ら（２００６）（参照により本明細書に取り込まれている）に記載の溶剤蒸発法の後、調製した。ＰＥＯ−ｂ−（ＰＤＰＡ−ｒ−ＴＭＲ）ミセル溶液の例では、２０ｍｇのコポリマーをまず１．０ｍＬのＴＨＦに溶解し、その後超音波処理下に８ｍＬの脱イオン水に滴下した。ＴＨＦを、（１００ＫＤ）膜を用いて限外ろ過を５回行って除去した。その後、脱イオン水を加えて、ポリマー濃度を５ｍｇ／ｍＬを調整し、貯蔵液とした。ＰＥＯ−ｂ−ＰＤＭＡ貯蔵液は、コポリマーを脱イオン水に直接溶解することにより作製することができた。

【0170】

ＦＲＥＴ実験用ミセル溶液サンプルを類似の方法で調製した。ＰＥＯ−ｂ−（ＰＤＰＡ−ＴＭＲ／Ｃｙ５）サンプルの作製を代表的手順として記載した。まず、０．１ｍＬのＰＤＰＡ−ＴＭＲ及び０．１ｍＬのＰＤＰＡ−Ｃｙ５貯蔵溶液を１．８ｍＬ脱イオン水に加えた。その後１．８μＬの１．０Ｍ ＨＣｌを加えて水不溶性ブロックコポリマーを溶解させ、溶液のｐＨを４に調整した。出発サンプルのＨＣｌからのＣｌ⁻は＜２ｍＭで、実験結果によれば、ミセル化をかく乱するその能力としては無視され得るものであった。

【0171】

４．ＦＲＥＴ実験
蛍光発光スペクトルは日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）で得られた。サンプルは５４５ｎｍで励起され、発光スペクトルは５６０〜７５０ｎｍで収集された。異なるアニオンが導入されたＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの自己組織化作用についてのＦＲＥＴ実験は、類似の手順に従った。ＣｌＯ_４⁻は、以下の実施例として使用された：０．２μＬの１０Ｍ ＮａＣｌＯ_４溶液を、２．０ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬの色素結合ＰＤＰＡ（ＰＤＰＡ−ＴＭＲ／ＰＤＰＡ−Ｃｙ５＝１：１）溶液にｐＨ＝４で添加し、ＣｌＯ_４⁻濃度を１ｍＭに調節した。その後、小容量の１０Ｍ ＮａＣｌＯ_４溶液を徐々に加えてＣｌＯ_４⁻濃度を３．２、５．６、１０ｍＭに増加させた。１０ｍＭ後、固体ＮａＣｌＯ_４をその溶液に添加してＣｌＯ_４⁻濃度を増加させサンプルの希釈を回避した。添加されたＮａＣｌＯ_４の合計量は２μＬ未満であり、合計２ｍＬに比べて無視することができる。蛍光発光スペクトルは、ＮａＣｌＯ_４のそれぞれの添加後に、４分間渦混合してから収集された。

【0172】

５．ＴＥＭ及びＤＬＳ特性評価
ＴＥＭ及びＤＬＳ分析用サンプルを、前述の手順に従い調製した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＤＰＡの転移ｐＨは６．１であった。まず、０．１ｍＬのＰＤＰＡ−ＴＭＲ及び０．１ｍＬのＰＤＰＡ−Ｃｙ５貯蔵溶液を、１．６ｍＬの脱イオン水に加えた。その後、固体ＮａＣｌＯ_４及びＮａＣｌをその溶液に加え、渦混合後溶解した。ＨＣｌ及びＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を用いて溶液のｐＨを５．０及び７．４に調節した。脱イオン水を加えて合計容量を２ｍＬに調節した。ナノ粒子のモルホロジー及びサイズを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＲＯＬ １２００ＥＸ ｍｏｄｅｌ）により特性評価した。流体力学直径（Ｄ_ｈ）は動的光散乱（ＤＬＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ ＭｉｃｒｏＶ Ｍｏｄｅｌ，Ｈｅ−Ｎｅ Ｌａｓｅｒ，λ＝６３２ｎｍ）により測定された。

【0173】

６．アニオン競合実験
ミセルサンプルの作製はＦＲＥＴ実験に記載と同様の手順に従った。固体ＮａＣｌ及びＮａ_２ＳＯ_４粉末を水溶液に溶解し初期アニオン濃度を達成した。Ｃｌ⁻の初期濃度は０、５０、１００、２００、５００，１０００及び２０００ｍＭであった。ＳＯ_４^２−の初期濃度は０、２５、５０、１００、２００及び５００ｍＭであった。蛍光発光スペクトルは、ＮａＣｌＯ_４の添加後、渦混合後４分収集された。得られた結果はＳ字形曲線と一致した。パーコレートの、最大の半分のＦＲＥＴ効率濃度はＦＣ_５０として定義され、Ｃｌ⁻及びＳＯ_４^２−の競合能力を定量する。

【0174】

７．ＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマーのＣｌＯ_４⁻誘発ミセル自己組織化
異なるアルキル側鎖を有する一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＲ_{コポリマー}（図２５の１〜５）が本研究に使用された。ミセルサンプルの調製はＦＲＥＴ実験セクションの記載に従った。この一連の実験で、溶液のイオン強度は１００ｍＭのＮａＣｌ濃度を用いて緩衝化された。これはＮａＣｌＯ_４からのイオン強度寄与を最小にするために使用される。なぜなら、疎水性ＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマー（例えば、５）が多いほどミセル自己組織化を誘発する濃度を小さくする必要があるからである。実験後、ＦＲＥＴ効率は、ＦＲＥＴセクションで前述されたように計算された。

【0175】

実施例４：アニオン駆動ミセル形成の結果と考察
ｐＨ_ｔ未満のｐＨでプロトン化ＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマーの驚くべきカオトロピックアニオン誘発ミセル化の発見（図２５）を記載する。驚くべきことに、抗ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ）傾向が観察され、そこではカオトロピックアニオンがミセル化をもたらすが、それらのタンパク質凝集の効果に反して、コスモトロピックアニオンとはならない（Ｚｈａｎｇ及びＣｒｅｍｅｒ， ２００６；Ｐａｒｓｏｎｓ，ら，２０１１；Ｋｕｎｚ，ら，２００４）（図２６Ａ）。

【0176】

まず、ミセル自己組織化プロセスを調査するための蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）が確立された。ＦＲＥＴはポリマー／タンパク質の立体配座及び相転移の検出に高い感度を有する。なぜなら、これは、エネルギー移動効率が供与体−受容体距離の６乗に反比例するためである（Ｊａｒｅｓ−Ｅｒｉｊｍａｎ及びＪｏｖｉｎ，２００３；Ｓａｐｓｆｏｒｄ，ら，２００６）。この方法では、ブロックコポリマーは供与体または受容体色素と結合する（図２５の１〜５、表４） （Ｔｓａｒｅｖｓｋｙ及びＭａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，２００７；Ｍａ，ら，２００３）。ＰＥＯ−ｂ−ポリ（ジプロピルアミノエチルメタクリレート）（３，ｐＨ_ｔ＝６．１）がモデルコポリマーとして選択され、供与体／受容体として、それぞれテトラメチルローダミン（ＴＭＲ，λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝５４５／５８０ｎｍ）／Ｃｙ５（λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝６４７／６６６ｎｍ）が選択された（Ｈａ，ら，１９９９；Ｇｒｕｎｗｅｌｌ，ら，２００１）。

【0177】

ｐＨ４で、３の第３級アミン（ｐＨ_ｔ＝６．１）がプロトン化され、得られたコポリマーは分散カチオン性ユニマーとして水に溶解した。溶液中のユニマー（それ故ＴＭＲとＣｙ５）との間の大きな距離のために、ＦＲＥＴ効果は観察されなかった。カトロピックアニオン（例えば、ＣｌＯ_４⁻、ＳＣＮ⁻またはＩ⁻）の添加は、ポリマーミセルの形成を示す、ＴＭＲの蛍光強度の低下及びＣｙ５の発光強度の増加をもたらした（図２７）。ミセル形成がＴＭＲとＣｙ５をミセル核内に極めて近接させ、これによりＦＲＥＴ効率を増加させるとの仮定を立てた（図２６Ｂ）。反対に、コスモトロピックアニオン（例えば、ＳＯ_４^２−、Ｈ_２ＰＯ_４⁻）は、たとえ濃度をそれらの溶解限界に近付けても、いかなるＦＲＥＴも引き起こさなかった（図２８）（表５）。

【0178】

【表5】

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【0179】

ミセル化を起こす能力において異なるアニオンを比較するために、ＦＲＥＴ効果を定量化した（図２６Ｃ）。ＦＲＥＴ効率は（ＦＡ／ＦＤ）／（ＦＡ／ＦＤ）_ｍａｘとして正規化され、ここでＦＡ及びＦＤは、それぞれ異なるアニオン濃度でのＴＭＲ及びＣｙ５の蛍光強度であり；（ＦＡ／ＦＤ）_ｍａｘは、高いＣｌＯ_４⁻濃度でのＦＡ／ＦＤの最大値（３．３）であった。ＦＲＥＴ効率は、異なるアニオンについての濃度の関数としてプロットされた。結果は、カオトロピックアニオンがユニマー会合（即ちミセル化）を起こすことができたが、コスモトロピックアニオンはできなかった（図２６Ｃ）との抗ホフマイスター傾向を示した。この観察は、タンパク質可溶化における古典的ホフマイスター効果に反しており、この効果ではコスモトロピックイオンは水でのタンパク質凝集を引き起こすことが知られているが、カオトロピックでは知られていない（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，１８８８；Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ，１９８５）。

【0180】

コポリマー３はカオトロピックアニオンに対して異なる検出感度を示した。データはＦＲＥＴ感度がＣｌＯ^４−＞ＳＣＮ⁻＞Ｉ⁻＞ＮＯ_３⁻の順に従ったことを示している。ＦＣ_５０はＦＲＥＴ効率が５０％のときのアニオン濃度として定義される。ＦＣ_５０の値は、ＣｌＯ^４−、ＳＣＮ⁻及びＩ⁻について、それぞれ１１、６８及び３０４ｍＭであった。ＮＯ_３⁻については、その飽和濃度（約３Ｍ）でほんの弱いＦＲＥＴ効果が得られたのみであった。より詳細な調査では、ＦＲＥＴ効率を１０％から９０％に増加させるために、３倍のＣｌＯ_４⁻濃度変化が必要であるのみであった（即ち、６から１８ｍＭへ、図２６Ｃ）。この狭い濃度依存性は、以前報告された超ｐＨ応答（Ｚｈｏｕ，ら，２０１１；Ｚｈｏｕ，ら，２０１２；Ｈｕａｎｇ，ら，２０１３；Ｗａｎｇ，ら，２０１３）に類似する高い共同応答を示唆している

【0181】

さらにカオトロピックアニオン誘発ミセル化を確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて、それぞれ、ミセル転移中のモルホロジーの変化及び流体力学直径を調査した。クロリドイオン（Ｃｌ⁻）は陰性対照に用いた。５０ｍＭのＣｌ⁻の存在で、コポリマー３はｐＨ５．０でユニマーとして留まっていた（６．１のｐＨ_ｔを下回る、図２９Ａ）。対照的に、コポリマー３はＣｌ⁻がＣｌＯ_４⁻と置き換わった時球状のミセルに自己組織化した（図２９Ｂ）。ＤＬＳ分析は、アニオンがＣｌ⁻からＣｌＯ_４⁻に変化した時、流体力学直径は、それぞれ、７±２から２６±３ｎｍに増加することを示した（図２９）。ユニマー状態からミセル状態へのコポリマー３の転移を反映するこのサイズの増加は、ＦＲＥＴとＴＥＭのデータと一致している。ｐＨ７．４で、コポリマー３は、Ｃｌ⁻及びＣｌＯ_４⁻アニオンの存在下、それぞれ２７±２及び２８±３ｎｍの流体力学直径を有する球状ミセルとして存在していた（図３０〜３１）。ＰＥＯ−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ）等の非イオンの両親媒性ブロックコポリマーに関しては、ｐＨ変化もＣｌＯ_４⁻の添加のいずれもミセル状態への影響はなかった（図３２）。

【0182】

カオトロピックアニオン誘発自己組織化は、その後、競合コスモトロピックまたは境界型アニオンの存在で研究を行った。コポリマー３を、異なる初期濃度の競合ＳＯ_４^２−またはＣｌ⁻と共にｐＨ４で溶解させた。その後カオトロピックアニオンＣｌＯ_４⁻を添加してミセル化を誘発させた（図３３〜３６）。図３７Ａは、ＣｌＯ_４⁻濃度の関数としてのＦＲＥＴ効率の代表例を示す。ＳＯ_４^２−アニオンの添加により、ミセル誘発におけるＣｌＯ_４⁻の感受性を減少させることができた。ＦＣ_５０値は競合アニオンの効果を評価するために定量化された（図３７Ｂ）。競合アニオンのイオン強度の関数としての釣鐘曲線が観察された。低いイオン強度（＜０．１Ｍ）において、競合アニオンの添加は、ミセル形成を誘発するためのＣｌＯ_４⁻の能力を低下させ、ＰＲセグメントのアンモニウム基とこれらの競合と一致した。しかしながら、ＳＯ_４^２−またはＣｌ⁻の高いイオン強度（＞０．５Ｍ）では、ＣｌＯ_４⁻誘発自己組織化の増加が観察された。この効果は、高いコスモトロピックイオン濃度でのより規則的なバルク水構造に貢献することができ、ミセル自己組織化中の疎水性集合をより有利にする。

【0183】

最後に、ＰＲセグメントの疎水性強度のカオトロピックアニオン誘発ミセル化への影響（図３８Ａ）を調査した。第３級アミノ基のメチルからペンチル基までの異なるアルキル鎖長を有する一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマー（図２５の１〜５）を合成した。結果は、ＰＲセグメントの疎水性へのＣｌＯ_４⁻誘発自己組織化の明らかな依存性を示した（図３９）。最も小さい疎水性の側鎖（即ち、１のメチル）では、ミセル化はＣｌＯ_４⁻の最高の濃度でさえ観察されなかった（１Ｍ）。反対に、最も疎水性の側鎖（５のペンチル）がＣｌＯ_４⁻により誘発された最高の感度のミセル化をもたらした。ＦＣ_５０値は、側鎖がペンチル、ブチル、プロピル、及びエチル基の時、それぞれ２、４、３５、１３４ｍＭであった（図３８Ａ）。

【0184】

上記研究からの結果は、カオトロピックアニオンにより誘発された第３級アンモニウム基を有するブロックコポリマーによる高度に並はずれたミセル自己組織化プロセスを示している。現在のナノシステムにおいていくつかの類の無い特徴がある：第１に、カオトロピックアニオンが、疎水性ミセル核環境において正に電荷されたアンモニウム基を有する安定なイオン対を形成することができた。アンモニウム基の優位性がイオン化状態にあると仮定すれば、これは１４ｎｍと推測される核サイズを有するミセル当たり約６０，０００イオン対と理解される（ミセル当たり８００ポリマー鎖を基に計算、（Ｗａｎｇ，ら，２０１３）ポリマー鎖当たりアミノ基含有モノマーの７０〜８０繰り返し単位、及び６ｎｍのＰＥＯ殻サイズ（Ｌｅｏｎｔｉｄｉｓ，２００２））。第２に、カオトロピックアニオンのみがミセル形成を誘発し、コスモトロピック（ＳＯ_４^２−）及び境界型アニオン（Ｃｌ⁻）はこの能力を持たない。この傾向は古典的タンパク質安定化の研究と反対と思われる。第３に、ミセル化を誘発するカオトロピックアニオンの能力が、超ｐＨ感度応答に類似した正の共同性を示していると思われる。以前の研究では、蛍光活性化（１０％〜９０％の応答）は０．２５ｐＨ単位（＜［Ｈ^＋］の２倍）で起こるとされていた。この研究では、ＦＲＥＴ移動は３倍の［ＣｌＯ_４⁻］変化の範囲で起こることが示されている。最後に、コスモトロピックと境界型アニオンを用いた競合実験では釣鐘曲線挙動が示され、これは現在のシステムにおけるミセル自己組織化プロセスの複雑で微妙な性質を示唆している。

【0185】

実験的モデル（図３８Ｂ）が、ミセル自己組織化プロセスに寄与する因子を表現するために構築された。理論に束縛されないが、アルキル鎖長の増加による疎水性の相互作用がミセル形成の主要な推進力を与えると仮定される。これは、第３級アミンの側鎖がメチル基の場合（図３８Ｂの左腕の破線により示されている）にはミセルの形成の無いことにより支持される。同様に、中和コポリマー１はｐＨ_ｔより上のｐＨではミセルを形成しなかった（Ｚｈｏｕ，ら，２０１１）。一方、アニオンも、ミセル化において決定的な役割を演ずる。強い水和殻と弱い極性特性を有するとして知れらているコスモトロピックアニオンは、イオン対の形成及び疎水性核内のイオン対の安定にエネルギー的にほとんど有利とはいえない（Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９７；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ及びＡｎａｃｋｅｒ，１９８７）。強力な極性を有し、そして水和鞘を除去する際のエネルギーコストが低いカオトロピックアニオンは、疎水性ミセル核において安定したイオン対の形成を可能にする（Ｚｈａｎｇ及びＣｒｅｍｅｒ，２００９）。

【0186】

実施例５：センチネルリンパ節の検出
１．ＵＰＳ６．９による危険性のあるセンチネルリンパ節の同定
ＵＰＳ_６．９ナノプローブはまた危険性のあるセンチネルリンパ節を同定する能力も示した。図４２Ａは、ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）カメラによる腫瘍部位近くの首側にある代表的センチネルリンパ節の同定を示す。初期頭頸部がんを有する４つの異なる動物（動物当たり２つ）において、８つのリンパ節を同定した。これらの節は、マウス内の初期頭頸部がんに流入し、且つ解剖学的にはマウス内に典型的に見られる頸部節に対応する頸部流域にあった。８つの節の全ての構造はＵＰＳ_６．９のみにより同定された；それらは白色光で見るには余りにも小さく、ミリメートル以下であり、頸部脂肪及び唾液腺と密接に関わっているが、ＳＰＹカメラで可視化された時には輝いた。臨床病理医によるＨ＆Ｅ分析で、同定された構造はリンパ節と確認された。８つの節の１つは、図４２Ｂの底部パネルの黒矢印に指示されるように、ＨＮ５がん細胞の存在を示した。いくつかの場合においては、腫瘍の節再発は初期腫瘍を完全に切除したマウスに観察された。大きい腫瘍が、初期腫瘍の部位に代わって頸部側面に現れた。これらのデータは、腫瘍の完全切除を達成するために危険なリンパ節の同定の重要性を示唆している。腫瘍に流入する単一の節は同定され、多くはがん細胞を含まなかったとの事実は、これらの節は初期腫瘍部位からリンパ管に流入する活性化ポリマープローブを収集するＳＬＮを表していることを示唆している。

【0187】

実施例６：ｐＨ活性化インドシアニングリーン・コード・ナノセンサー（ＰＩＮＳ）の開発
１．ＰＩＮＳの調製及びナノセンサー特性
ポリ（エチルグリコール）−ｂ−ポリ（エチルプロピルアミノエチルメタクリレート）コポリマー（ＰＥＧ−ｂ−（ＰＥＰＡ_ｘ−ｒ―ＩＣＧ_ｙ）（但し、ｘ及びｙは、それぞれ、ＥＰＡモノマーとＩＣＧ色素のランダム繰り返し単位の数を表す；図４３Ａ〜４３Ｉ））のミセルを含むｐＨ活性化可能インドシアニングリーン・コード・ナノセンサー（ＰＩＮＳ）を合成した。疎水性ミセル化及びホモＦＲＥＴ誘発蛍光消光（Ｚｈｏｕら，２０１１及びＺｈｏｕら，２０１２）がｐＨ応答を劇的に鋭くした。ＰＥＰＡセグメント長及びＩＣＧ結合数の系統的最適化（図４４Ａ〜４４Ｆ）により、６．９の鋭いｐＨ転移、高い蛍光活性化比、最適な粒径（２５ｎｍ）及びシグナル増幅のためのナノプローブ当たり８００ＩＣＧの平均を有する最適なＰＩＮＳ組成が得られた。報告されているｐＨ感受性プローブ（例えば、小分子色素（Ｕｒａｎｏら，２００９）、ペプチド（Ｗｅｅｒａｋｋｏｄｙら，２０１３）または２ｐＨにわたり１０倍のシグナル変化を有するＰｅＴナノプローブ（Ｄｉａｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，２００６））に比較して、ＰＩＮＳ設計は、６．９で０．１５のｐＨ範囲で＞１００倍のシグナル増加を達成した。ＩＣＧに結合した追加のポリマーを製造し、特性評価して表６に示す。

【0188】

【表6】

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【0189】

ナノセンサーを用いた初期の用量−応答研究を、本明細書に記載の他のｐＨ応答性システムを用いるはずのものに類似のヒト頭頸部ＨＮ５同所性腫瘍異種移植片を有するマウスにおいて実施した。ＰＩＮＳを、尾静脈を介して静脈内注射を行い、医療用ＳＰＹ Ｅｌｉｔ（登録商標）カメラを、動物を画像化するために用いた（図４５Ａ〜４５Ｅ）。２．５ｍｇ／ｋｇの量を、持続時間ウ_インドウ（１２〜２４時間）にわたってノイズ比に対して大きな腫瘍コントラス（ＣＮＲ＝２７）を得るために、イメージング用量として使用するのに選択した。安定な時間ウ_インドウは、速い腎クリアランスが原因で、一時的ウ_インドウ（２〜３時間）（Ｃｈｏｉら，２０１３）を用いる小分子トレーサーに対する腫瘍外科手術に有利である。２．５ｍｇ／ｋｇＰＩＮＳの場合のような当量の色素用量での遊離ＩＣＧの注射は、観察し得る腫瘍コントラストは見られなかった（図４５Ｂ）。

【0190】

ＰＩＮＳによる腫瘍アシドーシスイメージングは、脳及び褐色脂肪組織を擬陽性の類似臨床観察に導くＦＤＧ−ＰＥＴに比べて、腫瘍検出の感度及び選択性が改良された（図４６Ｂ及び図４７Ａ〜４７Ｅ）（Ｃｏｏｋら，２００４及びＦｕｋｕｉら，２００５）。ＦＤＧ−ＰＥＴは大きなＨＮ５腫瘍（約２００ｍｍ^３）を検出するけれども、ＰＥＴ法は小さ腫瘍結節（約１５ｍｍ^３、表７）の検出には成功しなかった。多数の異なる腫瘍サイズを、ＰＩＮＳを用いて正常組織に対する腫瘍の高いコントラス（ＣＮＲ＞２０）で検出することができた。さらに、ＰＩＮＳはミリメートル未満の空間分解能で腫瘍境界を描くことができた（図４６Ｂ及び図４７Ａ〜４７Ｅ）。

【0191】

【表7】

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【0192】

幅広い腫瘍検出を評価するため、３つの同所性頭頸部腫瘍（ＨＮ５、ＦａＤｕ及びＨＣＣ４０３４、Ｂ．Ｄ．Ｓ患者からの腫瘍異種移植片）、皮下乳房腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、乳房内同所性乳房腫瘍（３種陰性４Ｔ１）、ＨＣＴ１１６結腸直腸がん細胞からの腹膜転移モデル、患者由来の腎臓がんの異種移植片、及びＵ８７神経膠腫細胞からの同所性脳腫瘍が画像化された。全ての腫瘍は、免疫応答性ＢａｌＢ／Ｃマウスの４Ｔｌ腫瘍無しのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスで確立された。輝く蛍光照明が全ての腫瘍のタイプについて観察された（図４８）。エクスビボ・イメージングは高いがん選択性で筋肉に対して腫瘍の高いコントラスト比（２０〜５０倍）を明らかにした（図４９Ａ及び４９Ｂ）。ＨＮ５腫瘍モデルを用いて、ＰＩＮＳイメージングと多眼医療用カメラとの適合性が実証された（図５０Ａ〜５０Ｆ）。

【0193】

ＳＰＹカメラを用いて、ＨＮ５頭頸部がんまたは４Ｔ１乳がんを有するマウスにおいてリアルタイム腫瘍アシドーシス誘導手術（ＴＡＧＳ）を行った。ＰＩＮＳ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を、手術の１２〜２４時間前に静脈内注射した。初期腫瘍切除後の、ＨＮ５腫瘍を有するマウスの代表的手術で、残存腫瘍をＳＰＹカメラにより明確に視認でき（図５１Ａの左中断パネル）、白色光ではできなかった（左頂部パネル）。境界抽出の正確性を調査するため、ＨＮ５頭頸部腫瘍を有する９匹のマウスにおける非生存手術を、二重盲検プロトコルを用いて分析した。外科医は、ＰＩＮＳ照明下で腫瘍を切除し、組織試料（２〜３ｍｍサイズ）を、蛍光に基づき初期腫瘍、腫瘍境界または陰性筋肉組織としてマークした。試料はその後冷凍され、分割され、Ｈ＆Ｅで着色された。組織学的評価は臨床病理医により独立して行われた（図５２）。究極の判断基準として組織構造を用いて、ＰＩＮＳ蛍光評価は、８９．５％と１００％との間の、９５％の検出精度信頼性を持つものであった（ｎ＝２７）。長期間生存の手術成果は、白色光手術（ＷＬＳ）、減量手術及び未処理対照に対してＴＡＧＳを用いることにより局所領域制御及び全生存が改良された（図５１Ｂ）。肉眼的に断端陽性を有する減量手術は一般に頭頸部がんの生存利益は無く、ＷＬＳの妥当性について調整するために機能する。ＷＬＳは、良好で公平な技術を示唆する同等の生存を示した減量及び未処理対照（Ｐ＜０．０００１）より優れていた。ＴＡＧＳは、最高の成果、即ち１８の内１３の動物（７２％）が術後１５０日での治癒、を示した（Ｐ＜０．０００１対ＷＬＳ、図５１Ｂ）。

【0194】

肉眼で発見できないがん性小結節を同定することが、腫瘍境界より優先されるかもしれない臨床シナリオを模倣するために、小さい同所性乳房腫瘍が、免疫応答性雌Ｂａ１Ｂ／Ｃマウスにおいて確立された。５×１０^４の３種陰性４Ｔ１乳がん細胞が鼠径の乳腺体に注射された。２４時間の推定倍増時間で、結節サイズは、４日目の増殖巣で＜１００万４Ｔ１細胞を示す。ＳＰＹカメラ下のＰＩＮＳは４Ｔ１増殖巣を同定することが可能であり、組織構造により確認された（図５３Ａ〜５３Ｃ）。腫瘍は、目視検査または触診で検出することはできなかった。白色光制御について、腫瘍は約２５ｍｍ^３まで増殖させて可視化させ、注意深く初期腫瘍と周囲の境界を切除した。ＴＡＧＳは、より優れた可視化をもたらし、未処理対照及びＷＬＳに対して切除後の生存を改善させ（Ｐ＜０．０５、図５３Ｄ）、ＰＩＮＳによる素晴らしいイメージング感度を実証した。

【0195】

異なる腫瘍アシドーシス経路を標的とする小分子阻害剤に応答する腫瘍を、ＰＩＮＳにより評価した（図５４Ａ〜５４Ｃ）。４種の阻害剤を選択した：炭酸脱水酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ），Ｖ）（Ｎｅｒｉ ＆ Ｓｕｐｕｒａｎ，２０１１）、モノカルボキシレートトランスポート（ＭＣＴ）のためのα−シアノ−４−ヒドロキシシンナメート（ＣＨＣ）（Ｓｏｎｖｅａｕｘら，２００８）、ナトリウムプロトン交換体１型のためのカリポリド（ｃａｒｉｐｏｒｉｄｅ）（ＮＨＥ１）（Ｃａｒｄｏｎｅら，２００５）、及びプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）としてのパントプラゾール（Ｖｉｓｈｖａｋａｒｍａ ＆ Ｓｉｎｇｈ，２０１１）。ＰＩＮＳは、４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌＢ／Ｃマウスに静脈内注射され、次いで阻害剤が投与された。ＰＩＮＳ注射２４時間後のＮＩＲイメージンは、ＰＢＳ対照に対してＣＡＩＸ阻害剤アセタゾールアミドにより劇的な阻害（７４．２％）を示した。ＭＣＴ阻害剤ＣＨＣによる穏やかな阻害（２９．３％）も観察した。カリポリドまたはパントプラゾールでは顕著な阻害は見られなかった。ＰＩＮＳ応答は、４Ｔ１腫瘍内のＣＡＩＸ阻害剤の以前報告された抗腫瘍有効性と一致する（Ｌｏｕら，２０１１及びＰａｃｃｈｉａｎｏら，２０１１）。^１Ｈ／^３１Ｐ^１９または過分極^１３Ｃ ＭＲＩ法（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら，２００８）に比較して、ＰＩＮＳイメージングは、腫瘍アシドーシスの機構調査及び固体がんの無調節ｐＨを標的とする薬の開発のための簡単で便利なレポーターアッセイを提供する（Ｎｅｒｉ ＆ Ｓｕｐｕｒａｎ，２０１１及びＰａｒｋｓら，２０１３）。

【0196】

免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＩＮＳの安全性評価は、高い用量で一時的な体重減少を示した（図５５Ａ及び表８＆９）。最大耐性用量は２５０ｍｇ／ｋｇで、イメージング用量より１００倍高い。マウスは、２００及び２５０ｍｇ／ｋｇにおいて１、７及び２８日目に犠牲になった。肝臓及び腎臓機能が測定された（図５５Ｂ〜５５Ｄ）。肝臓の酵素レベルは（ＡＬＴ及びＧＯＴ）はＰＩＮＳ注射１日後増加し、７日後に正常に戻った。組織構造分析（図５６）は、２５０ｍｇ／ｋｇグループの肝臓に１日目で微小脂肪変性が起こり、２８日目までに正常に戻ったことを示した。他の主要な臓器（例えば、腎臓、心臓、脾臓、脳）は正常である。

【0197】

【表8】

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【0198】

【表9】

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【0199】

２．材料及び方法
ＰＩＮＳのモノマー及びポリマーの特性評価。２−（エチルプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＥＰＡ−ＭＡ）及びポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（エチルプロピルアミノエチルメタクリレート）コポリマー（ＰＥＧ−ｂ−（ＰＥＰＡ））合成は、前の方法セクションで記載した。以下に、モノマー及びポリマーの化学特性を示す。

【0200】

２−（エチルプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＥＰＡ−ＭＡ）：^１Ｈ ＮＭＲ（ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）６．１０（ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），５．５４ （ｓ，１Ｈ，ＣＨＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−），４．２０（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．７５（ｔ，２Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ−），２．５８（ｑ，２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），２．４４（ｍ、２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−），１．４５（ｍ、２Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．０２（ｔ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），０．８７（ｔ，３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３））。^１３ＣＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：１６７．４２，１３６．３６，１２５．３５，６３．２０，５６．３１，５１．５１，４８．３２，２０．５４，１８．３３，１２．０９，１１．８２。［Ｍ＋Ｈ］^＋：２００．２（計算値２００．３）。

【0201】

ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（エチルプロピルアミノエチルメタクリレート）（ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＥＰＡ）_１００）：^１Ｈ ＮＭＲ（ＴＭＳ，ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：３．９９ （ｂ，２０４Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−），３．８３−３．４５（ｍ、４５０Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３Ｏ−），２．６８（ｂ，２０４Ｈ−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ），２．５５（ｂ，２０４Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），２．４１（ｂ，２０４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．７８−１．９０（ｍ、２７０Ｈ，ＣＣＨ_３Ｃ ＆ Ｃ（ＣＨ_３）_２），１．４５（ｍ、２０４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），１．０２（ｂ，３０６，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）），０．８８（ｂ，３０６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３））。^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，ｐｐｍ）：１７７．７３，１７７．３３，１７６．６１，７０．５８，６３．２６，６３．１３，５６．２１，５１．０９，４５．０５，４４．７０，３８．６９，３１．９２，３０．３３，２９．６９，２９．３６，２８．９０，２３．７２，２２．９８，２２．６９，２０．６２，１６．５３，１４．１３，１２．１８，１１．９１。

【0202】

ＰＩＮＳの蛍光活性化。異なるｐＨ緩衝液におけるＰＩＮＳの蛍光強度は日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）で測定された。各ＰＩＮＳ組成については、２．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＭｉｌｌｉＱ水の貯蔵溶液を調製した。その後、貯蔵溶液を、異なるｐＨを有する８０ｍＭホスフェート緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、或いは異なるｐＨを有する８０ｍＭＰＢＳ緩衝液中の５０％ヒト血清のいずれかで希釈した。最終ミセル濃度は、ＰＢＳ中０．０５ｍｇ／ｍＬ、または５０％ヒト血清中０．０２５ｍｇ／ｍＬに調整された。ナノプローブ溶液は７８０ｎｍで励起され、そして発光スペクトルは８００ｎｍ〜９００ｎｍで集められた。ＰＢＳの８１５ｎｍでの及び５０％ヒト血清の８３０ｎｍでの発光強度が、ナノプローブのｐＨ応答性の定量化のために使用された。異なるｐＨ値での、試験管内のＰＩＮＳ溶液（０．０５ｍｇ／ｍＬ）の蛍光画像は、ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）イメージングシステムにより撮影された。

【0203】

貯蔵期間の研究。新しく調製されたナノプローブ水溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を、同量の２０％スクロース水溶液と混合し、１０％スクロース中の２．５ｍｇ／ｍＬ貯蔵溶液を得た。貯蔵溶液は分割され、数個の試験管内に密封し、−２０℃の冷凍機で冷凍した。サンプルを指定された時点で解凍し、前述のＰＢＳまたは５０％ヒト血清中で蛍光活性化の試験を行った。

【0204】

細胞培養。インビボで腫瘍モデルに使用されるがん細胞株としては、ＨＮ５、ＦａＤｕ、ＨＣＣ４０３４ヒト頭頸部がん、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び４Ｔ１乳がん、Ｕ８７神経膠腫、並びにＨＣＴ１１６大腸がん細胞が挙げられる。ＨＮ５及びＦａＤｕ細胞株はＭｉｃｈａｅｌ Ｓｔｏｒｙ’ｓ ｌａｂから得られ；ＨＣＣ４０３４は、Ｄｒ．Ｂａｒａｎ Ｓｕｍｅｒの頭頸部患者の切除腫瘍からＪｏｈｎ Ｍｉｎｎａ’ｓ ｌａｂにより確立され；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１及びＨＣＴ１１６はＤａｖｉｄ Ｂｏｏｔｈｍａｎ ｌａｂから得られ；Ｕ８７はＤａｗｅｎ Ｚｈａｏ ｌａｂより得られた。全ての細胞株は、使用前にマイコプラズマ汚染の試験を受けた。汚染の否定された状態が、ＢｉｏｔｏｏｌからのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで確認された。細胞は１０％のウシ胎仔血清及び抗生物質と共にＤＭＥＭで培養された。

【0205】

動物モデル。この研究に関連する動物プロトコルは、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により再調査され、承認された。雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（６〜８週間）は、テキサス大学南西医療センター繁殖コア（ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｒｅ）から購入した。同所性頭頸部腫瘍について、ＨＮ５、ＦａＤｕまたはＨＣＣ４０３４細胞（マウス当たり２×１０^６）が顎下の三角エリアに注射された。接種１週間後、１００〜２００ｍｍ^３のサイズの腫瘍を有する動物が研究をイメージングするために使用された。皮下の乳房腫瘍は、右脇腹にＭＤＡ−ＭＢ−２３１（マウス当たり２×１０^６）を注射することにより確立された。腹膜転移は、ＨＣＴ−１１６（マウス当たり２×１０^６）を腹腔内注射し、その後腹部を優しくマッサージすることにより確立された。同所性Ｕ８７神経膠腫を有するマウスは、Ｕ８７の頭蓋内注射により確立された。ＸＰ２９６患者由来の腎臓異種移植片を有するマウスはＪａｍｅｓ Ｂｒｕｇａｒｏｌａｓ ｌａｂより提供された。雌ＢａｌＢ／Ｃマウス（６〜８週間）は、テキサス大学南西医療センター繁殖コア（ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｒｅ）から購入した。同所性乳房腫瘍は、４Ｔ１（マウス当たり５×１０^４）細胞の胸部乳腺への注射によりＢａｌＢ／Ｃマウスに確立された。

【0206】

用量−応答の研究。ＨＮ５腫瘍を有するマウス（各グループ３）に１．０、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇのＰＩＮＳ等張溶液を注射した。対照グループに０．０８ｍｇ／ｋｇ遊離ＩＣＧ色素（２．５ｍｇ／ｋｇＰＩＮＳ中の色素含有量に相当）を注射した。指定された時点で、マウスを２．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）で画像化した。蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｊで測定した。コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は以下の式で計算された：

【0207】

【数1】

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ＦＩ（Ｔｕｍｏｒｓ） 及び ＦＩ（Ｎｏｒｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ）は、それぞれ腫瘍及び正常組織の蛍光強度である。背景ノイズは正常組織蛍光の標準偏差として測定された。

【0208】

インビボ及びエクスビボ蛍光イメージング。ナノプローブ（Ｕ８７及びＸＰ２９６に対して３．０ｍｇ／ｋｇとした以外は、全ての腫瘍モデルに対しては２．５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍を有するマウスの尾静脈を介して静脈内投与した。２４時間後、動物はＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）医療用カメラにより画像化された。エクスビボ・イメージングについては、腫瘍及び主要な器官が摘出され、画像化された。腫瘍及び器官の蛍光強度は、匹敵するサイズの筋肉組織に正規化された。

【0209】

実施例７：エンドサイトーシスオルガネラを評価するためのミセルの使用並びにシグナル伝達及び増殖におけるそれらの使用
１．ｐＨ応答性システムの調製
オルガネラの生理的役割を評価するために、一連の両親媒性ブロックコポリマーＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２）［但し、ＰＥＯはポリ（エチレンオキシド）であり、Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２）はイオン化可能ランダムコポリマーブロックである］を合成した（図５７Ａ及び図５８）。各コポリマーの分子組成を表１０に示す。高いｐＨ（例えば、ホスフェート緩衝化生理食塩水において７．４）において、これらのコポリマーは核−殻（コア−シェル）ミセル構造にに自己組織化する（直径３０〜６０ｎｍ、表面静電電位−２〜０ｍＶ、表１０及び図５９）。各コポリマーの見かけのｐＫ_ａより低いｐＨで、ミセルは、第３級アミンのプロトン化のために、ユニマーに解離する。以前の研究では、鋭いｐＨ依存性ミセル転移を、一連の、微調整、超ｐＨ感受性の蛍光センサーの開発のために利用した（Ｍａ，ら，２０１４）。

【0210】

【表10】

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【0211】

本明細書には、広い範囲のｐＨ（４．０〜７．４）における狭いｐＨ間隔で非常に優れたｐＨ調節緩衝能力を有するＵＰＳナノプローブが記載されている。図５７Ｂは、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下における、３つの例、ＵＰＳ_４．４、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_６．２ナノプローブ（各下付き文字は、対応コポリマーのｐＫａを指示する、表１０）のｐＨ滴定曲線を示す。ＵＰＳ_４．４、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_６．２（２ｍｇ／ｍＬ）は、ＨＣｌ（０．４Ｍ）がポリマー溶液に添加された時、それぞれ、そのｐＨを４．４、５．３及び６．２の見かけのｐＫ_ａに緩衝化され得る。対照的に、クロロキン（ＣＱ）、生物学的研究において広く使用されている小分子ベースは、ｐＨ６〜９（ｐＫ_ａ＝８．３）の範囲の広いｐＨ応答を示し、同様にポリエチレンイミンも広いｐＨ緩衝を示した（Ｓｕｈら，１９９４）。ｐＨ滴定曲線（図５７Ｃ及び図６０）からの緩衝能力の決定により、ｐＨ４．０〜７．４の範囲で特定のｐＨで非常に優れた緩衝強度を示した。より具体的には、ＵＰＳ_４．４、ＵＰＳ_５．６及びＵＰＳ_７．１ナノプローブの最大値は、ナノプローブ４０ｍｇ当たり１．４、１．５及び１．６ｍｍｏｌ ＨＣｌであり、これはそれぞれ、ｐＨ４．４、５．６及び７．１において３３９倍、７５倍及び３０倍ＣＱより高かった（図５７Ｃ）。ＵＰＳナノプローブのこの収集は、初期エンドソーム（Ｅ．Ｅ．，６．０−６．５）（Ｗｅｉｓｚ，２００３）から後期エンドソーム（Ｌ．Ｅ．，５．０−５．５）（Ｗｅｉｓｚ，２００３）へ、リソソーム（４．０−４．５） （Ｃａｓｅｙ，２０１０）へのオルガネラｐＨの機能的範囲に、独特な一連のｐＨ特異的「プロトン・スポンジ」を提供する。

【0212】

２．ｐＨ緩衝能力及びプロトンポンプ速度
イメージング及び緩衝の同時研究のために、デュアル蛍光レポータを有する新しいナノ粒子設計が確立された：ｐＨ環境に拘わりなく細胞内ナノ粒子分布をたどる「常時オン」レポータ、及びｐＨ活性化可能レポータ（細胞外媒体ｐＨ７．４でオフ及びエンドサイトーシス後の特定のオルガネラｐＨでオン）。ＰＥＯの末端に色素（例えば、Ｃｙ３．５）を結合させる際の初期の試みでは常時オンシグナルで成功するが、得られたナノ粒子は、色素が血清タンパク質に結合する結果として不安定であった。この制約を除去するために、ミセルの核に導入された１対のフルオロフォアを用いたヘテロＦＲＥＴ設計が使用された。例えば、ＦＲＥＴペア（例えば、ＢＯＤＩＰＹ及びＣｙ３．５、それぞれ供与体及び受容体である）をＵＰＳ_６．２コポリマーのＰＲセグメントに結合した。同じミセル核内で２種の色素結合コポリマー（供与体／受容体の最適なモル比＝２：１）を混合することにより、ミセル状態（ｐＨ＞ｐＫ_ａ）で共与体色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ）のヘテロＦＲＥＴ誘発蛍光の消光を可能にするが、ミセル分解後のユニマー状態での蛍光回復はより低いｐＨで可能である（図６１Ａ上側パネル）。「常時オン」シグナルを発生させるために、ミセル中のＣｙ３．５結合コポリマーの重量分率を低く維持して（例えば、４０％）、ミセル状態での受容体色素のホモＦＲＥＴ誘発蛍光の消光を回避した（Ｚｈｏｕ，ら，２０１２）（図６１Ｂ）。得られたＵＰＳナノ粒子は、広いｐＨ範囲にわたりＣｙ３．５チャンネルにおいて一定の蛍光強度を示し、ＢＯＤＩＰＹシグナルについては特定のｐＨで超ｐＨ感受性活性化を達成した（図６１Ｃ）。両方のフルオロフォアがミセル核内に埋め込まれたので、得られるＵＰＳナノ粒子は安定で、プロテイン結合はしない。

【0213】

ＵＰＳ_６．２及びＵＰＳ_５．３は、それらの見かけのｐＫ_ａが、それぞれ早期エンドソームから後期エンドソームへ、及びリソソームへの転移に対応するので（Ｗｅｉｓｚ，２００３）、イメージング及び緩衝化の研究のために選択された。ＨｅＬａ細胞を、増大する用量（１００、４００及び１，０００μｇ／ｍＬ）のＵＰＳ_６．２またはＵＰＳ_５．３で３７℃において５分間培養させ、エンドサイトーシスにより粒子を摂取させ（Ｃｏｎｎｅｒ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ，２００３）、その後新鮮な媒体（ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ）で洗浄した。１００μｇ／ｍＬで、最大の半分のＵＰＳ_６．２活性化（ＢＯＤＩＰＹチャンネル）が３０分まで観察され、最大の半分のＵＰＳ_５．３活性化（ＢＯＤＩＰＹチャンネル）が６０分まで観察された（ＵＰＳ_６．２に関する図６２Ａ及び６２Ｂ；ＵＰＳ_５．３に関する図６３Ａ及び６３Ｂ）。対照的に、１，０００μｇ／ｍＬで、ＢＯＤＩＰＹシグナルの活性化が、Ｃｙ３．５シグナルによるＨｅＬａ細胞内の粒子摂取の明確な指示にも拘わらず、少なくとも６０分まで遅れた（図６２Ａ及び６２Ｂ並びに図６３Ａ及び６３Ｂ）。インサイチューで、リソセンサーによるエンドソームのｐＨの定量は、細胞を４００及び１，０００μｇ／ｍＬのＵＰＳ_６．２（図６２Ｃ）及びＵＰＳ_５．３（図６３Ｃ）に曝した時に、それぞれｐＨ６．２及び５．３において用量依存性の持続的なｐＨ停滞期（ｐｌａｔｅａｕｓ）を示した。いずれのナノ粒子についても、１００μｇ／ｍｌ用量ではオルガネラの酸性化を遅らせるには不十分であった。

【0214】

さらに酸性化速度を定量化するため、ＨｅＬａ細胞当たりのミセルナノ粒子の数を、細胞数で割られた取り込まれたＵＰＳの蛍光強度に基づいて測定した（下記方法を参照）。データは、より高い摂取用量でのナノ粒子が増加することを示している（表１１）。ミセル（６４，０００）当たりのアミノ基の数、及び細胞当たりの２００エンドソーム／リソソームの平均（Ｈｏｌｔｚｍａｎ，１９８９）に基づいて、酸性化速度は各オルガネラについて１秒当たり約１５０〜２１０プロトンと計算された。この結果は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ当たり加水分解されたＡＴＰ当たり２プロトン（Ｄｅａｍｅｒら，１９９９）、１回転当たり消費される３ＡＴＰ分子（Ｃｒｏｓｓ ＆ Ｍｕｌｌｅｒ，２００４）、１秒当たり２．４回転（Ｉｍａｍｕｒａら，２００３）、及びオルガネラ当たり２０Ｖ−ＡＴＰａｓｅの平均（Ｉｍａｍｕｒａら，２００３）に基づく計算と一致している。

【0215】

【表11】

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【0216】

３．ｍＴＯＲＣ１活性化の２つの異なるモデルに関するｐＨ閾値
エンドソームタンパク質被覆成熟及びエンド／リソソーム−依存性シグナルの形質導入に対する内腔（管腔）ｐＨのＵＰＳ緩衝化の影響を調査した。この目的のため、別々に報告され且つｐＨ６．２、５．３、５．０、４．７及び４．４で緩衝作用を示すＵＰＳナノ粒子が選択された。この範囲は、早期エンドソーム、後期エンドソーム、及びリソソームにおける確立された内腔ｐＨ値をカバーする。早期エンドソーム生合成の際立った特徴は、Ｒａｂ５ ＧＴＰａｓｅの漸増（Ｈｕｏｔａｒｉ，＆ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，２０１１）であり、それは６．０〜６．５の内腔ｐＨ範囲に対応する（Ｗｅｉｓｚ，２００３）。完全成熟リソソームは、４．０〜４．５の内腔ｐＨ範囲を有するＬＡＭＰ２陽性である（Ｃａｓｅｙら，２０１０）。エンドソーム成熟マーカーを有するＵＰＳ陽性エンドソームの共局在化の定量を可能にするために、Ｃｙ５をコードしたＵＰＳ_６．２及びＵＰＳ_４．４を、ミセル状態で蛍光を検出可能にする低い色素／ポリマー比で開発した（Ｗａｎｇら，２０１４）（図６４Ａ）。１，０００μｍ／ｍＬの濃度で１５分以内に、６０％を超えるＵＰＳ_６．２及びＵＰＳ_４．４陽性エンドソームもまたＲａｂ５陽性であった（図６４Ａ及び６４Ｄ）。ＵＰＳ_４．４陽性エンドソームはさらに６０分以内にＲａｂ５陰性／ＬＡＭＰ２陽性の成熟状態に転移した（図６４Ｂ及び６４Ｅ〜６４Ｆ）。特に、この転移に通常伴う内腔の酸性化の阻害にもかかわらず、ＵＰＳ_６．２陽性エンドソームも類似の時間枠でＬＡＭＰ２陽性になった（図６４Ｂ及び６４Ｄ）。しかしながら、ＵＰＳ_６．２はＲａｂ５の放出を遅らせ、６０分で異常なＲａｂ５／ＬＡＭＰ２陽性エンドソームの過渡的な蓄積をもたらした（図６４Ｂ及び６４Ｆ）。これらの観察されたものは、内腔ｐＨ及び内腔ｐＨ感受性Ｒａｂ５放出メカニズムの存在に依存しない新生エンドソームにＬＡＭＰ２を補強する調整メカニズムの存在を示唆している。

【0217】

内腔ｐＨがエンド／リソソーム生態に固定された影響を調査するために、リソソーム生合成−、即ちラパマイシン錯体１（ｍＴＯＲＣ１）の哺乳類標的を介して細胞増殖の栄養依存活性化に繋がると最近報告された重要な調整システムが評価された。哺乳類細胞では、ｍＴＯＲＣ１は、取り込まれた遊離アミノ酸に呼応してエンド／リソソーム膜に局在する（Ｓａｎｃａｋら，２０１０）。さらに、エンド／リソソーム膜上のＶ−ＡＴＰａｓｅ及びＲａｇ ＧＴＰａｓｅｓの間の物理的相互作用が、栄養の利用に呼応してｍＴＯＲＣ１活性化のために必要である（Ｚｏｎｃｕら，２０１１）。アミノ酸誘発ｍＴＯＲＣ１活性化を評価するために、ｍＴＯＲＣ１経路活性化の２つの定量レポータが使用された：ｍＴＯＲＣ１基質ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のリン酸化反応／活性化及びｍＴＯＲＣ１基質ＴＦＥＢの核／細胞質分布。

【0218】

栄養分を含まない平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）においてＨｅＬａ細胞の２時間の培養は、ｐ７０Ｓ６Ｋ及びそれの基質Ｓ６の両方における活性化部位リン酸化反応の蓄積が減少したことにより誘発されるｍＴＯＲＣ１活性を阻害するために十分であった。必須アミノ酸の添加は、５分以内に経路活性化を誘発するために十分であった（図６５Ａ、及び図６６Ａ及び６６Ｂ）。１，０００μｇ／ｍｌのＵＰＳ_４．７またはＵＰＳ_４．４での処理は、遊離アミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１応答への影響はほとんどまたは全く無かった。対照的に、１，０００μｇ／ｍｌのＵＰＳ_６．２、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_５．０による前処理は遊離アミノ酸に対するｍＴＯＲＣ１応答を遅らせ且つ顕著に抑制した（図６５Ａ及び６５Ｂ、並びに図６６Ａ及び６６Ｂ）。ｍＴＯＲＣ１経路応答の選択的ＵＰＳ阻害は、ＴＦＥＢ核／細胞質分布とよく似ている。ｍＴＯＲＣ１によるこの転写因子のリン酸化反応は核排除をもたらし、これにより栄養が十分な状態でのＴＦＥＢ転写プログラムを阻害する（Ｐｅｎａ−Ｌｌｏｐｉｓら，２０１１，Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅら，２０１２及びＲｏｃｚｎｉａｋ−Ｆｅｒｇｕｓｏｎら，２０１２）。Ｈｅｌａ細胞において、ＧＦＰ−標識づけされたＴＦＥＢの安定した発現を用いた場合、ＵＰＳ_６．２、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_５．０は、遊離アミノ酸添加時のＴＦＥＢの細胞質への再分配を阻害した。対照的に、ＵＰＳ_４．７及びＵＰＳ_４．４で前処理された細胞においては、ＴＨＥＢ再分配は正常に進行した（図６５Ｃ及び６５Ｄ）。

【0219】

上記データは、ｐＨ５の閾値を下回るエンドソームの酸性化には、ｍＴＯＲＣ１の遊離アミノ酸誘発活性化が必要であることを示唆している。類似の実験が、遊離アミノ酸よりむしろ高分子の栄養源として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて行われた。遊離アミノ酸のように、ＢＳＡ暴露が、ｍＴＯＲＣ１の再活性化と、それに続く栄養飢餓に十分であった（図６７Ａ〜６７Ｄ）。しかしながら、遊離アミノ酸と対照的に、ＵＰＳ_４．４はＢＳＡに呼応してｍＴＯＲＣ１の活性化を遅らせた（図６７Ａ＆６７Ｄ）。ＵＰＳ_４．４で処理された細胞が遊離アミノ酸に正常に応答したことを考慮すると、遅れた応答は、ＢＳＡと推量され、即ちリソソーム内の酸性加水分解酵素によるＢＳＡのタンパク質分解阻害の結果と推量された。これに合致して、ＵＰＳ_４．４の存在でカテプシンＢ活性の顕著な阻害が見られた（図６６Ｃ）。同時に、これらの観察は、明らかなリソソームｐＨ閾値は酸性加水分解酵素活性対遊離アミノ酸検知（ｓｅｎｓｉｎｇ）に必要であることを示唆している（図６５Ｅ）。

【0220】

４．緩衝化リソソームｐＨによる細胞代謝産物プールの調節
代謝中間体を製造するためのリソソーム再循環細胞内高分子及び破片は、エネルギー製造、または細胞環境の栄養状態に呼応した新しい細胞成分の構築のために配置された（Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅら，２０１３）。リソソーム中の脂質及び糖タンパク質などの大きな分子の異常な蓄積は、代謝障害と関連する。リソソームの酸性化の高度に選択的な摂動と関連する変化について広く評価するために、細胞内の小さな代謝産物の蓄積は、栄養飢餓対栄養十分な成長条件下でＵＰＳ_４．４を投与することにより定量化された。０、２００及び４００μｇ／ｍｌのＵＰＳ_４．４に１２時間曝した後、ＨｅＬａ細胞を溶解し、細胞な代謝産物を液体クロマトグラフィ−三連四重極質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて定量化した。６８の代謝産物が３×１０^６ＨｅＬａから定量可能であり、リソソーム内の４．４でのｐＨ停止における用量依存性及び栄養依存性の多数の結果を明らかにした（図６８Ａ）。栄養十分な状態で、ＵＰＳ_４．４用量の増加と共に、比較的大量のほとんどの代謝産物も、細胞タンパク質含有量を正規化すると、増加した。これはほとんどのアミノ酸を包含し（図６８Ｂ上側パネル）、これらのアミノ酸は、アミノ酸のリソソーム排出におけるタンパク質合成及び／または欠陥のためにそれらを使用する必要がある同化シグナルの阻害と一致している。栄養不足の条件で、ＵＰＳ_４．４は、比較的多量のヌクレオチド及びそれらの前駆体（例えば、図６８Ａの底部一群）を増進させ、そして第２のメッセンジャーｃＡＭＰを大幅に抑制した。リシン、バリン、メチオニン、及びアルギニン等の多くの必須アミノ酸の損失も観察され、アルブミンのような高分子の飢餓誘発異化作用の阻害と一致した（図６８Ｂ下側パネル）。これらの結果は、オルガネラ酸性化と代謝産物プールとの間の機構的関連を示唆しており、また、妥当なリソソームの酸性度は、栄養が存在しても存在しなくても、多くの代謝経路の恒常性に必要であることを示唆している（図６８Ｃ）。

【0221】

５．ＮＳＣＬＣ細胞のエンド／リソソームのｐＨ停止への影響
本発明者等は、最近、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）における選択的代謝脆弱性を記述したが、これによれば、ＫＲＡＳがん遺伝子及びＬＫＢ１腫瘍抑制遺伝子における共発生突然変異が、ミトコンドリアの健康維持のためのリソソーム異化の細胞依存性をもたらす（Ｋｉｍら，２０１３）。Ｖ−ＡＴＰａｓｅ活性度の遺伝性または化学的阻害は、この発がん性の背景においてプログラム細胞死を選択的に誘発させるのに十分であった。これが、ＡＴＰ産生のためのＴＣＡサイクル基質のリソソームに依存する供給を阻害する直接的な影響であると提案された。ＵＰＳライブラリーは、がん細胞において、細胞質ｐＨ及びｍＴＯＲＣ１／ＡＭＰＫタンパク質錯体に対するＶ−ＡＴＰａｓｅｓの多面的寄与に関連する交絡因子の非存在下にこの仮説を直接試験する機会を提供した（Ｚｏｎｃｕら，２０１１ Ｚｈａｎｇら，２０１４）。モデルシステムとして、同一の患者から得られた正常（ＨＢＥＣ３０ＫＴ）及び腫瘍由来（ＨＣＣ４０１７）の細胞株を、ＫＲＡＳ及びＬＫＢ１の病変が、背景の正常細胞に人工的に導入された一連の同質遺伝子進行細胞と一緒に使用した（図６９Ａ）（Ｒａｍｉｒｅｚら，２００４）。高い用量のＵＰＳ_６．２、ＵＰＳ_５．３及びＵＰＳ_４．４で処理されたＨＣＣ４０１７とＨＢＥＣ３０ＫＴとの間の細胞数及びモルホロジーの比較が、これらのＵＰＳナノ粒子のＨＣＣ４０１７に対する高度に選択的な毒性を明らかにした（図６９Ｂ）。ＬＫＢ１の阻害と一緒に発がん性ＫＲＡＳの発現が、ＵＰＳ誘発プログラム細胞死に対して気管支上皮細胞の選択性を誘発するのに十分であった（図６９Ｃ〜６９Ｅ）。重要なことは、この表現型が、腫瘍由来細胞（図６９Ｇ）及び遺伝的に操作された細胞（図６９Ｇ）の両方において、ＴＣＡサイクル基質（ピルビン酸メチル及びα−ケトグルタレート）の細胞透過性相似器官の添加時に、救出されたことである。従って、リソソーム機能に対するＫＲＡＳ／ＬＫＢ１共成熟ＮＳＣＬＣ細胞の選択的脆弱性は、細胞外高分子の異化作用への依存に由来している。さらにＵＰＳ_４．４に対するＵＰＳ_６．２のより高い細胞毒性は、ｍＴＯＲＣ１阻害がさらにこれらの細胞の致死率に寄与したことを示している。

【0222】

６．考察
内腔酸性化は、異なるステージでの受容体リサイクリング、オルガネラ輸送及びタンパク質／脂質異化作用などの際立った細胞機能を与える哺乳類の細胞におけるエンドサイト―シスオルガネラの成熟の特徴である（Ｍａｘｆｉｅｌｄ ＆ ＭｃＧｒａｗ，２００４及びＹｅｕｎｇら，２００６）。現存する手段または試薬（例えば、クロロキン、ＮＨ_４Ｃｌ、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１）は、細胞透過性であり、広い範囲のｐＨ活性度をブロックする。結果として、これらの試薬を用いたエンドソーム／リソソームの機能についての生物学的質問として、調合された非特異的ｐＨ効果、並びに他の酸性オルガネラ（例えばゴルジ（Ｇｏｌｇｉ））からの寄与されるものを受けるかもしれない。対照的に、現在のＵＰＳナノ粒子は専らエンドサイトーシスを経由して細胞に入る；さらにそれらは、エンドサイトーシス経路に沿ってオペレータが予め定めた閾値にて内腔ｐＨの強固で微細な緩衝化（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ）を可能にする。素晴らしいｐＨ特異緩衝効果は、以前報告された超ｐＨ感受性蛍光応答（Ｚｈｏｕら，２０１１及びＺｈｏｕら，２０１２）と共に、自己組織化システムにおいて独特のナノスケール特性であり、そこでは疎水性ミセル化（相転移）が、第３級アミンの共同プロトン化に導くｐＨ転移を劇的に鋭くする。結果として、ＵＰＳナノ粒子は０．３ｐＨ単位以内で高い解像度の緩衝効果をもたらした。ＵＰＳプラットフォームの緩衝化ｐＨ範囲（ほぼ見かけのｐＫ_ａの中心）は、電子吸引／供与性の置換基によりほとんど制御される小分子ｐＨ緩衝液／センサーとは異なるＰＲセグメントの疎水性により微調整することができる（Ｕｒａｎｏ，ら，２００８）。独特のｐＨ特異性の、調整可能な「プロトン・スポンジ」効果は、他の低分解能ポリ塩基緩衝液（例えば、ポリエチレンイミン、図５７Ｃ）とは異なる。さらに、イメージング及び緩衝化能力を同時に達成するために、常時オン／オフ−オン組成を、ヘテロＦＲＥＴ戦略を用いて構築した。このナノ粒子の設計は、ＨｅＬａ細胞内でのエンドサイトーシス・オルガネラの酸性化速度（１秒当たり１５０〜２１０プロトン）の最初の測定を可能にし、それは文献データに基づく推定（２４０〜３１０）の大きさと同じオーダー（ｏｒｄｅｒ）にある。

【0223】

ＵＰＳライブラリーの詳細な評価では、エンドサイトーシスオルガネラの内腔ｐＨの摂動がいかに多細胞生理的プロセスに影響を与えたかについて説明した。そして、これはエンドソームの生態及びバイオナノ相互作用を理解する上で貢献している。より具体的には、ライブラリーの「摂動を与える、及び報告する（ｐｅｒｔｕｒｂ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔ）」との特徴は、エンドソームの成熟の時間分解された定量を可能にし、エンドソームのコートタンパク質の交換での内腔ｐＨの以前正しく評価されていなかった重大な結果を明らかにした。とりわけ、「成熟」リソソームマーカー、ＬＡＭＰ２、の増強が、内腔酸性化と関係なく起こることが分かった。一方、初期エンドソームマーカーＲａｂ５の放出は、内腔アルカリ化により遅れるようにされ、Ｒａｂ５／ＬＡＭＰ２陽性エンドソームのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）蓄積をもたらす。このことは、現在は述べられていないが探求可能な、エンドソーム／リソソーム生合成を統括するｐＨ感受性及びｐＨ非感受性のメカニズムの存在を示唆している。ＵＰＳ緩衝容量を微調整する能力はまた、ｍＴＯＲＣ１経路の遊離アミノ酸対アルブミンに依存する活性化に必要な確かなｐＨ閾値の識別を可能にする。いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、ｐＨ５．０以下の酸性化が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅタンパク質錯体との「内側から外側の」やりとりのための、またはアミノ酸センシング中のＶ−ＡＴＰａｓｅにおける立体構造変化の誘導のための、遊離アミノ酸を放出するのに必要である（Ｚｏｎｃｕら，２０１１）。同様に、ｐＨ４．４以下の酸性化が、ｍＴＯＲＣ１経路のアルブミン依存活性化に使用され、多分、加水分解酵素の活性化、それに続くタンパク質異化作用に必要である。ＵＰＳ合成の拡張性は、細胞外高分子のリソソーム消費の阻害時における細胞代謝環境を広範囲に定量化することを可能にした。エンドサイトーシスオルガネラ内のＵＰＳの排他的摂取は、増殖調節の信号伝達の経路及び細胞代謝においてエンドソーム／リソソームのｐＨの参加を具体的に評価する機会を提供した。

【0224】

７．方法
１．化学品
Ｃｙ５―ＮＨＳ、ＢＯＤＩＰＹ―ＮＨＳ及びＣｙ３．５―ＮＨＳエステルはＬｕｍｉｐｒｏｂｅ Ｃｏｒｐより購入した（ＦＬ，ＵＳＡ）。モノマーの、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡ−ＭＡ）及び２−アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙより購入した。モノマーの、２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＢＡ−ＭＡ）（Ｚｈｏｕら，２０１１）、２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）及び２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート（Ｄ５Ａ−ＭＡ）（Ｌｉら，２０１４）は発明者の以前の著作物に記載された方法に従い調製し、同様にＰＥＯマクロ開始剤（ＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−Ｂｒ）^１も調製した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。Ａｍｉｃｏｎウルトラ−１５遠心ろ過管（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅｓ）（ＭＷＣＯ＝１００Ｋ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＭＡ）より購入した。他の試薬及び有機溶剤はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製の分析グレードであった。

【0225】

２．細胞、培地、及び生物試薬
ＮＳＣＬＣ細胞株ＨＣＣ４０１７及びそれに合った正常気管支上皮細胞株ＨＢＥＣ３０ＫＴは、同一の患者から培養した。これらの細胞株の発生及び対応するのＨＢＥＣ３０ＫＴ発がん進行シリーズの発生は以前に報告された（Ｒａｍｉｒｅｚ，ら，２００４）。ＨＣＣ４０１７及び全てのＨＢＥＣ３０由来細胞株をＡＣＬ４（０．０２ｍｇ／ｍｌインスリン、０．０１ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、５０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．０１ｍＭエタノールアミン、０．０１ｍＭ Ｏ−ホスホリルエタノールアミン、０．１ｎＭトリヨードチロニン、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウムが添加されたＲＰＭＩ １６４０）で、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１％抗生物質（ＧＩＢＣＯ）と共に培養した。ＨｅＬａ及びＧＦＰ−ＴＦＥＢ ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に培養した。Ｅａｒｌｅ‘ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＥＢＳＳ，１０×，Ｓｉｇｍａ）を、２．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）が添加されたＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１ｘに希釈した。抗生物質は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｓ６Ｋ−ｐＴ３８９，Ｓ６Ｋ，Ｓ６−Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐＳ２３５／２３６，Ｓ６ Ｒｉｂｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ５及びＲａｂ７）及びＡｂｃａｍ（ＬＡＭＰ２）から得た。他の生物試薬は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ ＤＮＤ １６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｍａｇｉｃ Ｒｅｄ（商標）Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１（Ｓｉｇｍａ）、Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）及びＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）等であった。

【0226】

３．色素結合ＰＥＯ−ｂ−（Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２））ブロックコポリマーの合成
アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ）を色素との結合に使用した。３つの第１級アミノ基を、ＡＭＡモノマー対開始剤の供給比（モル比＝３）を制御することにより各ポリマー鎖に導入した。合成後、ＰＥＯ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）を２ｍＬ ＤＭＦに溶解した。その後、色素−ＮＨＳエステル（色素−ＮＨＳとして１．５当量）を加えた。１晩反応後、コポリマーを、予備ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＰＬｇｅｌ Ｐｒｅｐ １０μｍ １０^３Å， ３００×２５ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ ｂｙ ｖａｒｉａｎ，溶離液としてＴＨＦを５ｍＬ／分で）により精製し、遊離の色素分子を除去した。得られたコポリマーを凍結乾燥し、貯蔵のため−２０℃に保持した。常時−オン／オフ−オンＵＰＳナノ粒子のためのコポリマー合成の唯一の相違は、３つのＡＭＡ基がＢＯＤＩＰＹ結合のためのポリマー鎖に導入され、他方１つのＡＭＡ基がＣｙ３．５結合にのために導入される点である。

【0227】

４．ＵＰＳナノ粒子ミセルの作製及び特性
典型的手順において、１０ｍｇ ＵＰＳポリマーを５００μＬのＴＨＦ（色素結合無し）またはメタノール（色素結合有り）に溶解した。常時−オン／オフ−オンＵＰＳナノ粒子として、ＢＯＤＩＰＹ−結合ポリマーとＣｙ３．５結合ポリマーを、指示した重量比（図１１２）で混合し、ＢＯＤＩＰＹチャンネルでの高いオン／オフ比とＣｙ３．５チャンネルでの安定した常時オンシグナルを与える最良の組み合わせを決定した。溶液を１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に滴下した。有機溶剤を除去するために、ミクロ限外ろ過システム（＜１００ｋＤａ，Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による４〜５回ろ過を用いた。ＵＰＳナノ粒子の水溶液を、０．２２μｍフィルタユニット（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて殺菌した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ １２００ ＥＸ ｍｏｄｅｌ，東京，日本）をミセルサイズ及びモルホロジーを調査するために使用した。動的光散乱（ＤＬＳ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ−ＺＳ ｍｏｄｅｌ，Ｈｅ−Ｎｅレーザ，＝６３３ｎｍ）を用いて、１００μｇ／ｍＬミセルＰＢＳ溶液の流体力学直径（Ｄ_ｈ）を測定した。示されたデータは５つの独立した測定値の平均であった。ゼータ電位は、ひだ状のキャピラリセル（ｆｏｌｄｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いて測定した（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。示されたデータは３つの独立した測定値の平均であった。

【0228】

５．ＵＰＳナノプローブの細胞摂取の定量
ＨｅＬａ細胞（ウェル当たり１×１０^６）を、６ウェルの組織培養皿に播種した。１２〜１６時間後、細胞を、血清非含有ＤＭＥＭ中で、ＵＰＳ_６．２−ＴＭＲ及び／またはＵＰＳ_５．３−ＴＭＲに５分間曝し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。さらに２時間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養後、ＵＰＳナノプローブを細胞からメタノールで抽出した。ＵＰＳナノプローブミセルはメタノール中でユニマーに解離した。日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）を、ＵＰＳ−ＴＭＲユニマー溶液のＲＦＵを５７０ｎｍで測定するために使用した。取り込まれたＵＰＳナノプローブの用量はＲＦＵ及びＵＰＳ−ＴＭＲ溶液の標準曲線から計算された。

【0229】

６．エンド／リソソームｐＨの測定
ＨｅＬａ細胞を、４−または８−ウェルＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩＣｈａｍｂｅｒｅｄ Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に固定し、４８時間培養させた。その後、細胞を、血清非含有媒体中の２５μＭのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６０及び１，０００μｇ／ｍＬのＵＰＳナノプローブに３７℃で５分間浸した。細胞は２回洗浄され、即座に画像化（イメージング）された。イメージングは、ディジタルモノクロＣｏｏｌｓｎａｐ ＨＱ２カメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を装備した落射蛍光顕微鏡（Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を用いて実施した。蛍光画像は、ＳｏｆｔＷｏＲｘ ｖ３．４．５（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて収集された。データは、３６０／４６０ｎｍ及び３６０／５２０ｎｍの励起／発光波長で記録された。ＤＡＰＩ（３６０ｎｍ）のための単一帯域通過励起フィルタは４０ｎｍであり、ＤＡＰＩ（４６０ｎｍ）及びＦＩＴＣ（５２０ｎｍ）のための発光フィルタの帯域通過はそれぞれ５０ｎｍ及び３８ｎｍである。細胞蛍光比は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて保存された単一波長画像の画像分析により決定した。各細胞について、対象範囲は、ＵＰＳナノプローブ及びＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒの両方からの蛍光シグナルを発光したサイトゾルの斑点（ｐｕｎｃｔａｅ）として定義される。蛍光強度比は、各細胞内斑点についてＲ＝（Ｆ_１−Ｂ_１）／（Ｆ_２−Ｂ_２）（但し、Ｆ_１及びＦ_２はそれぞれ３６０／５２０及び３６０／４６０での蛍光強度であり、Ｂ_１及びＢ_２は、サイトゾルの斑点の近くにある同じ画像上の領域から決定される対応する背景値である）として計算された。ＲとｐＨ間の関係を標準化するために、我々はＤｉｗｕら（１９９９）により確立された改良プロトコルを用いた。細胞はＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒで一杯にされ、その後１０μＭのモネンシン及び１０μＭのニゲリシンで透過処理した。これらの細胞を、３０分間、５ｍＭのＮａＣｌ、１１５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４及び２５ｍＭのＭＥＳ（ＭＥＳバッファー）からなる、ｐＨ４．０と７．４との間で変化する平衡緩衝液で処理した。細胞はイメージングまで緩衝液中に保持された。

【0230】

７．共局在化分析
免疫蛍光検査法からの画像を、回転盤共焦点顕微鏡（Ａｎｄｏｒ）を用いて撮影された。Ｚ−スタック（Ｚ−ｓｔａｃｋ）画像は、共局在化分析におけるデコンボリューションの後に用いた。データはＩｍａｒｉｓ７．７（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）のＣｏｌｏｃモジュールを用いて分析した。閾値Ｍａｎｄｅｒ’ｓ係数は、全シグナルにわたって共局在化シグナルの割合の指標として用いた（Ｍａｎｄｅｒｓら，１９９３及びＢｏｌｔｅ ＆ Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ，２００６）。

【0231】

８．メタボロミクス解析
ＨｅＬａ細胞を１００ｍｍ皿で８０％融合まで培養させ、栄養豊富グループと栄養枯渇グループに分けた。栄養枯渇グループ細胞の培地を、生理食塩水で２回洗浄する前に、ＥＢＳＳに変えた。その後、２００または４００μｇ／ｍＬのＵＰＳ_４．４（最終濃度）または同じ容量の水（対照として、各条件は６つの複製を含む）を、両方のグルームに添加し、１晩置いた。この後に、細胞は氷冷生理食塩水で２回洗浄し、５００μＬの冷却メタノール／水（５０／５０、ｖ／ｖ）で覆った。細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、３回の凍結融解サイクルに付した。激しいボルテックスの後、破片（ｄｅｂｒｉｓ）を、１６，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによりペレット化した。ペレットはタンパク質定量化に使用した（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ）。上澄みを新しい管に移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を用いて蒸発させて乾燥させた。代謝産物を、１００μＬの０．０３％ギ酸の分析グレード水でもどし、ボルテックス混合し、そして遠心分離して破片を除去した。その後、メタボロミクス研究のために、上澄みをＨＰＬＣバイアルに移した。

【0232】

標的の代謝産物プロファイリングを、液体クロマトグラフィ−質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）アプローチを用いて行った。分離は、Ｎｅｘｅｒａ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（ＵＨＰＬＣ）ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，京都，日本）を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒ−ＲＰ ＨＰＬＣカラム（１５０×２ｍｍ、 ４μｍ、８０Å）で行った。使用した移動相は、０．０３％ギ酸水溶液（Ａ）及び０．０３％ギ酸アセトニトリル溶液（Ｂ）であった。勾配プログラムは以下の通りであった：０〜３分、１００％ Ａ；３〜１５分、１００％〜０％ Ａ；１５〜２１分、０％ Ａ；２１〜２１．１分、０％〜１００％ Ａ；２１．１〜３０分、１００％ Ａ。カラムは３５℃に維持され、サンプルは大気中で４℃に保持された。流速は０．５ｍＬ／分、注入量は１０μＬであった。質量分析器は、多重反応モニター（ＭＲＭ）モードの、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＡＢ ＱＴＲＡＰ ５５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）であった。サンプル分析は、正／負切換型で行った。デクラスタリング電位（ＤＰ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）は、サンプル分析の前に注射器ポンプを用いて参照基準を直接注入することにより、各代謝産物のために最適化された。ＭＲＭ ＭＳ／ＭＳ検出器は以下のように設定した：カーテンガス ３０ｐｓｉ；イオンスプレー電圧 ５０００Ｖ（正）及び−１５００Ｖ（負）；温度 ６５０℃；イオン源ガス１ ５０ｐｓｉ；イオン源ガス２ ５０ｐｓｉ；インターフェースヒータオン；入口電圧 １０Ｖ。合計で、６９の水溶性内因性代謝物を上記のように明確に検出した、その際ベースラインは細胞非含有サンプルにより設定された。細胞サンプルはランダムな順序で分析され、ＭＲＭデータは、Ａｎａｌｙｓｔ １．６．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて得られた。

【0233】

クロマトグラムの調査及びピーク領域の積分は、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェア バージョン２．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。細胞の数は類似しており、各サンプルは完全に同じように且つランダムに処理されたが、それぞれの検出された代謝産物のピーク領域は、機器分析によるサンプル操作からもたらされるばらつきを修正するためにそのサンプルのタンパク質含有量に対して正規化された。正規化された領域値は多変量及び単変量の統計的データ解析の変数として用いた。共通のＭＲＭ転移を有するクロマトグラフィによる共溶出代謝産物は分類されたフォーマット（即ち、ロイシン／イソロイシン）で示した。正規化データに基づくすべての多変量分析及びモデル化は、ＳＩＭＣＡ−Ｐ（ｖｅｒｓｉｏｎ １３．０．１，Ｕｍｅｔｒｉｃｓ，Ｕｍｅａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。予め処理されたデータセットは完全連結法を用いる監視なし階層的クラスタ分析により評価された。

【0234】

実施例８： ＰＥＴ及び蛍光イメージングを用いたデュアルイメージング法
１．蛍光レポータを有する超ｐＨ感受性（ＵＰＳ）ナノプローブの発生
最近、ＩＣＧ−官能化ＵＰＳナノプローブで、６．９にｐＨ転移を有するものが本発明者により開発された。ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＰＡを、ＰＥＰＡセグメントの繰り返し単位を変えながら原子移動ラジカル重合法を用いて合成した（４０〜１２０、図７０Ａ）。その後、ＩＣＧ、即ちＦＤＡ是認近赤外色素を、異なる色素濃度を有するＰＥＰＡセグメントに結合させた（ポリマー鎖当たり１、３及び６個のＩＣＧ）。正常組織の血液ｐＨ（７．４）または間質ｐＨ（７．２）において、Ｉ−ＵＰＳ_６．９ナノプローブは、ホモＦＲＥＴ誘発蛍光消光の結果として、静かにしている（図７０Ｄ）（Ｚｈｏｕら，２０１２及びＺｈｏｕら，２０１１）。これらのｐＨでは、ＵＰＳ_６．９は、動的光散乱分析による２５．３±１．５ｎｍの直径及びＴＥＭによる球状モルホロジー（データは示されない）を有する自己組織化ミセルとして存在した。転移ｐＨ、応答の鋭さ、蛍光活性化比及びナノプローブの直径に対するポリマー鎖長及びＩＣＧ濃度の影響を調査した。図７０Ｂは、ＰＥＰＡセグメント長を変化させた代表的な研究を示す。データは、ＰＥＰＡの繰り返し単位の４０から１２０への増加がより鋭いｐＨ転移（例えば、それぞれ０．３０から０．１３に縮減されたｐＨ_{オン／オフ}）及びわずかに低いｐＨ転移（それぞれ６．９６から６．９１に）をもたらすことを示している。粒径はまたＰＣ７Ａ長（１５から３０ｎｍ）と共に増加した。ポリマー鎖当たり３つのＩＣＧは、オン状態での高い蛍光活性化比及び輝く蛍光強度と共に最も典型的な色素濃度を可能にした。これらのデータをもとに、鎖当たり１００の繰り返し単位のＰＣ７Ａ及び３つのＩＣＧ色素を有するＵＰＳ組成が選択された。得られたＵＰＳナノプローブは鋭いｐＨ転移（ｐＨ_{オン／オフ}＝０．１５）、高い蛍光活性比（オンとオフ状態の間の＞１００倍）（図７０Ｃ）、及び腫瘍透過の典型的粒径（２５ｎｍ）を有する。この戦略を用いて、多様ながんタイプ及び器官部位を有する一連の広範な動物腫瘍において、腫瘍対腫瘍組織の大きい比を有する広い腫瘍特異性が実証された（Ｗａｎｇら，２０１４）。腫瘍特異イメージングは、１ｍｍ^３くらい小さい腫瘍において達成された。加えて、Ｉ−ＵＰＳ_６．９ナノプローブは血清含有（２０％ＦＢＳ）培地において４８時間わたって安定であり、鋭いｐＨ応答及び高い蛍光活性化比を維持している（図７０Ｂ〜７０Ｄ）。

【0235】

２．ＰＥＴイメージングのための放射性トレーサーとしての^６４ＣｕのＵＰＳナノプローブへの導入
他の非標準ＰＥＴ核種に比べて、^６４Ｃｕ（ｔ_１／２＝１２．７ｈ；β＋０．６５３ＭｅＶ，１７．４％）は、低い陽電子範囲、市場入手容易性、及び合理的な長い崩壊半減期のために、ナノ粒子、抗体及びペプチドに基づく多くのイメージング剤に使用されている（Ｒｏｓｓｉｎら，２００８及びＨａｕｂｎｅｒ ＆ Ｗｅｓｔｅｒ，２００４）。金属とキレート剤との間の安定性は、放射線医薬様式設計における成果に重要である。多くのキレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）及び１，４，７−トリアザシクロノナン−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）等の^６４Ｃｕ用キレートリガンドとして開発されてきた（Ｗａｄａｓら，２００７）。これらの中で、ＣＢ−ＴＥ２Ａ（図７１）がＳｕｎ及び共同研究者によって報告され、^６４Ｃｕとの最も安定な錯体の１つを形成するものであり（Ｓｕｎら，２００２）、Ｃｕ（ＩＩ）−ＣＢ−ＴＥ２Ａ錯体は、他のテトラ大環状錯体と比べて還元的金属損失耐性に優れている（Ｗｏｏｄｉｎら，２００５）。ＣＢ−ＴＥ２Ａは、^６４ＣｕをＵＰＳに誘導するためのキレート剤として使用される。ＮＨＳエステル官能化ＣＢ−ＴＥ２Ａは文献に報告された手順に従って製造される（Ｌｉｕら，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．，４８：７３４６−７３４９，２００９）。ナノプローブ側では、第１級アミノ基が、ポリマー鎖のＰＥＧ末端に導入される。ＮＨ_２−ＰＥＧ−ＰＣ７Ａは図７１に記載の経路で合成される。市販のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨはＡＴＲＰ用のマクロ開始剤の作製に使用される。ＡＴＲＰ後、ポリマーを脱保護した後、第１級アミノ基は再生することができ、ＮＨＳエステル官能化ＣＢ−ＴＥ２Ａへの結合に使用することができる。ハイブリッドミセルは、超音波処理及び溶剤蒸発法により、ＣＢ−ＴＥ２Ａ−ＰＥＧ−ＰＣ７Ａ及びＰＥＧ−ＰＣ７Ａ−ＩＣＧの混合物から形成される。ハイブリッドミセルは、^６４ＣｕＣｌ_２とミセルを緩衝化溶液で培養し、その後限外ろ過することにより^６４Ｃｕで標識化される。

【0236】

３．デュアルモダリティＵＰＳ及びＰＥＴとＦＤＧのみとのイメージング有効性の比較
同所性ＨＮ５頭頸部腫瘍を有するマウスにおける予備結果では、３匹のマウスの内２匹に肩甲骨間ＢＡＴからの強い擬陽性信号が示され、一方Ｉ−ＵＰＳ蛍光は高い特異性を有する腫瘍を描いた（図７２）。臨床的には、頭頸部がん患者のＢＡＴまたは緊張した頸筋は、上昇したグルコース消費により、ＰＥＴイメージングにおける異常なものとの誤解に導いた。^６４ＣｕのＵＰＳナノプローブへの導入により、ＰＥＴ核種の分布が腫瘍アシドーシスを標的することによりシフトされ、このためＦＤＧを有するＰＥＴから潜在的擬陽性を除去すると予想される。

【0237】

デュアルモダリティＵＰＳが、ＰＥＴスキャンによるＦＤＧに対してより確実な腫瘍検出を提供するかどうかを比較検討するために、活性化ＢＡＴが、イメージング有効性を評価するためにモデルとして用いられる。マウスに同所性頭頸部腫瘍モデルを確立した後、活性ＢＡＴへのＰＥＴイメージングの前に、腫瘍を有するマウスを冷却処理する（Ｗａｎｇら，２０１２）。特異的であるために、腫瘍を有するマウスを１２時間絶食にし、ＰＥＴイメージングの前に、４℃の冷却部屋内の予備冷却かごに４時間入れる。マウスは均等に３つのグループに分けられ、それぞれ以下の試薬を尾静脈から注射される：１）ＦＤＧ；２）デュアルモダリティＵＰＳ；３）プロプラノロールとＦＤＧ。プロプラノロールは、ＢＡＴ活性化を抑制し、負の制御として機能するβアドレナリン受容体阻害剤である。ＰＥＴ画像が得られ、３Ｄ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（３Ｄ配列分画期待値最大化）（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いて単枠に再構築される。対象領域（ＲＯＩ）は、腫瘍を含む全ての面における腫瘍／ＢＡＴを包括して、手動で取り出される。標的の活性度は、グラム当たりの注射容量％（％ＩＤ／ｇ）として計算される。標準化摂取値（ＳＵＶ）も、腫瘍、肩甲骨間のＢＡＴ、並びに潜在的擬陽性の評価のための周囲の正常組織について計算される。組織構造は、がん組織またはＢＡＴの存在の判断のための究極の判断基準として役立つ。ＦＤＧグループまたはＵＰＳグループからの頭頸領域において陽性を示す全ての組織は、パラフィン包埋及び切片法により収集される。Ｈ＆Ｅ染色は、各グループの結果と関係する組織構造検証のためにこれらのスライドから調製される。それぞれの試料は、ＦＤＧ＋／−（ＰＥＴから）、^６４Ｃｕ−ＵＰＳ＋／−（ＰＥＴから）、がん細胞＋／−（組織構造から）及びＢＡＴ＋／−（組織構造から）に割り当てられる。統計分析は、デュアルモダリティＵＰＳが検出精度を顕著に改善したか否かを判断するために使用される。

【0238】

実施例９：ＵＰＳナノプローブを用いたがん手術及び腫瘍除去プロセス
１．ＵＰＳナノプローブを用いた多重腫瘍タイプの広域がん特異的イメージング
Ｉ−ＵＰＳ設計の１つの優位性は、観血的手術（ＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標） ｂｙ Ｎｏｖａｄａｑ）、マイクロ手術（Ｌｅｉｃａ， Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、腹腔鏡検査（Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｚ， Ｏｌｙｍｐｕｓ）、及びロボット手術 （ｄａ Ｖｉｎｃｉ（登録商標））においてＩＣＧに基づくイメージングのために既に承認されている現存の手術室カメラシステムと適合しており、臨床解釈の障壁を低くしている。ＳＰＹカメラを用いて、多発性がんタイプにおける腫瘍アシドーシスを画像化するＩ−ＵＰＳ_６．９ナノプローブの実現性を調査した。多発性がんタイプとしては、頭頸部（ヒトＨＮ５、ＳＣＩＤマウスのＦａＤｕ及びＨＣＣ４０３４同所性異種移植片；ＨＣＣ４０３４）、乳房（ＳＣＩＤマウ内のヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＡＬＢ／Ｃマウス内のマウス４Ｔ１）、腎臓（ＳＣＩＤマウス内のヒト同所性ＸＰ２９６腫瘍）、脳（ヒト膠芽細胞腫Ｕ８７異種移植片）、及びＧＩトラクトからの腹膜転移（ＳＣＩＤマウス内のヒト結腸直腸ＨＣＴ−１１６腫瘍、図７３）が挙げられる。結果は、この一連の広域な腫瘍において高い腫瘍／正常組織のコントラスト（Ｔ／Ｎ比＞２０）を示している。特に、頭頸部（例えば、褐色脂肪）並びに脳実質（ＵＰＳ摂取を防ぐ血液脳関門（Ｈａｗｋｉｎｓ ＆ Ｄａｖｉｓ，２００５及びＫｒｅｕｔｅｒ，２００１）による可能性が高い）における典型的な擬陽性腫瘍を、Ｉ−ＵＰＳシグナルは欠いていた。これらの結果は、がん標的として細胞外酸性ｐＨのロバスト性、及び広範に応用できるがん特異性検出がＩ−ＵＰＳナノプローブにより可能であることを実証している。

【0239】

実施例１０：デュアル蛍光レポータＵＰＳナノプローブ
１．デュアル蛍光レポータを有するＵＰＳナノプローブ
腫瘍アシドーシスイメージングにおいてナノプローブ用量とｐＨ活性化を独立して評価するために、デュアル蛍光レポータを有するＵＰＳナノプローブが構成される：ｐＨに関係なくナノ粒子分布を追跡する「常時オン」レポータ、及びｐＨ活性化可能レポータ。ＰＥＯ（ＵＰＳナノプローブの表面など）の末端に色素（例えば、Ｃｙ５．５）を結合させる最初の試みは、常時オンシグナルに成功したが、得られたナノ粒子は色素が血清タンパク質と結合するため不安定であった。この制限を除去するため、ミセルの核に導入される一対のフルオロフォアを用いたヘテロＦＲＥＴを使用する。例えば、ＦＲＥＴ対（例えば、供与体と受容体としてそれぞれＢＯＤＩＰＹとＣｙ３．５）をＵＰＳ_６．９コポリマーのＰＲセグメントに別々に結合させた。同じミセル核内の２種の色素結合コポリマー（供与体／受容体＝２：１の最適比）は、ミセル状態（ｐＨ＞ｐＫ_ａ）で供与体色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ、λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝４９３／５０３ｎｍ）のヘテロＦＲＥＴ誘発蛍光消光を可能にしたが、ミセル解離後のユニマー状態での蛍光回復がより低いＰＨであった（図７６Ａ〜Ｃ）。「常時オン」を発生させるため、ミセル状態のＣｙ３．５結合コポリマーの重量分率を、ミセル状態で受容体色素（Ｃｙ３．５、λ_ｅｘ／λ_ｅｍ＝５９１／６０４ｎｍ）のヘテロＦＲＥＴ誘発蛍光消光を避けるため、低く保持した（例えば、４０％）（Ｚｈｏｕら，２０１１；２０１２）。得られたＵＰＳナノ粒子は、広いｐＨ範囲にわたってＣｙ３．５チャンネルにおいて一定の蛍光強度を示し、超ｐＨ感受性活性化をＢＯＤＩＰＹシグナルの６．９で達成する（図７５）。両方のフルオロフォアはミセル核内に埋め込まれるので、得られるＵＰＳナノ粒子は安定で、タンパク質汚染は無い。

【0240】

現在の研究では、ヘテロＦＲＥＴ設計及びＢＯＤＩＰＹ／Ｃｙ３．５組み合わせは、ＵＰＳナノプローブに常時−オン／オフ−オンデュアルレポータを導入するために使用される。ミセル形成後、ナノプローブは、まず動的光散乱（ＤＬＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ ｍｏｄｅｌ）で流体力学直径（Ｄ_ｈ）及びゼータ電位により特性評価される。ＵＰＳナノプローブのサイズとモルホロジーはさらに透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ １２００ ＥＸ ｍｏｄｅｌ）により分析され、ＤＬＳ結果と関連付けられる。ｐＨへの応答における蛍光活性化の研究のために、ミセルは異なるｐＨ緩衝液（ｐＨは６．０〜７．４に、０．１ｐＨ増分で制御される）で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度において作製される。ナノプローブは、日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）でフルオロフォアに対応する波長で励起される。発光強度はオン／オフ比を定量化するために使用される。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）はピレン法（Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ ＆ Ｔｈｏｍａｓ，１９７７及びＷｉｎｎｉｋ，１９９３）を用いて測定する。新しいマウス血清におけるデュアルレポータＵＰＳナノプローブの安定性も、以前記載されたように試験される（Ｗａｎｇら，２０１４）。

【0241】

２．６．５〜７．１のｐＨ転移を有するＵＰＳナノプローブ
一連の微調整可能な６．５〜７．１のＵＰＳナノプローブは、アシドーシスの種々の段階を有する腫瘍ｐＨ_ｅを標的にして合成される。オペレータ既定のｐＨ転移（４．０〜７．４）及び鋭いｐＨを有するＵＰＳライブラリーを構成するためのランダムコポリマー戦略は本明細書に報告され、（Ｍａら，２０１４）に報告されている。３つの設計基準に合わなければならない：（１）ＰＥＯ−ｂ−ＰＲコポリマーにおいて、ランダムＰＲブロック（Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２））（但し、Ｒ_１及びＲ_２は第３級アミン上で異なるアルキル鎖長を有するモノマーである）は単一のｐＨ転移を確実にするために使用されなければならない。ブロック化ＰＲセグメント（Ｐ（Ｒ_１−ｂ−Ｒ_２））は、Ｒ_１及びＲ_２ブロックの異なるイオン化挙動を反映する２つのｐＨ転移をもたらした；（２）Ｒ_１及びＲ_２における近接して良く合った疎水性を有するモノマーは鋭いｐＨ応答を達成するのに必要である。非限定的な１つの例では、近接アルキル基が使用された時（例えば、Ｒ_１／Ｒ_２＝エチル／プロピル）、ΔｐＨ_{オフ／オン}は＜０．２５であり、Ｒ_１／Ｒ_２がエチル／ペンチルの時はΔｐＨオフ／オンは＜０．５である；（３）Ｐ（Ｒ_１−ｒ−Ｒ_２）セグメントの疎水性は、Ｒ_１とＲ_２モノマーのモル分率を制御することにより微調整することができ、正確に制御された転移ｐＨが得られる。

【0242】

上記基準に基づいて、２種のモノマー、ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡ−ＭＡ）及びジイソプロピルアミノエチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）の比を変化させた一連のＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ_ｘ−ｒ−ＤＰＡ_ｙ）コポリマー（図７６Ａ）を合成する。合計繰り返し単位は１００（ｘ＋ｙ＝１００）で制御される。アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ−ＭＡ）がフルオロフォア結合のために導入される（鎖当たりｚ＝３）。図７６Ｂは、代表的色素のＣｙ５．５を用いたｐＨ依存性ＵＰＳ活性化のデータを示す。結果は、６．３〜７．８のｐＨ範囲に微調整された一連のＵＰＳナノプローブを示している。全てのナノプローブは鋭いｐＨ応答（ΔｐＨ_{オフ／オン}＜０．２５）を維持した。転移ｐＨ対ＤＰＡモル％（^１Ｈ ＮＭＲにより定量化）のプロットは、直線関係を示す（図７６Ｃ）。この関係は、６．５、６．７、６．９及び７．１のｐＨ転移を標的とするＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ_ｘ−ｒ−ＤＰＡ_ｙ）コポリマーの組成を決定するための標準曲線として使用する。各転移ｐＨのために、ＳＰＹイメージング用ＩＣＧ結合またはメカニズム研究のためのデュアル蛍光レポータを有するナノプローブを製造する。

【0243】

実施例１１：腫瘍進行におけるｐＨ調節メカニズムの分析
１．腫瘍進行の種々の段階での異なる糖分解表現型における腫瘍アシドーシスのｐＨ調節メカニズム
本明細書に記載のデュアルレポータＵＰＳナノプローブを用いて、分岐解糖傾向を有する腫瘍が、腫瘍アシドーシスを達成するのに使用される異なるｐＨ調節経路を決定するために調査される。より具体的には、より高い解糖性腫瘍はｐＨ調節のためモノカルボキシレート輸送体（例えば、ＭＣＴ１／４）を優先的に使用し、一方解糖性が損なわれた腫瘍は腫瘍アシドーシスにおいて炭酸脱水酵素ＩＸ型を利用するか否かが調査される。適格解糖性頭頸部がん細胞（例えば、ＨＮ５またはＦａＤｕ）は、陽性対照として使用され、重要な解糖酵素（例えば、ＬＤＨＡまたはＰＫＭ２）の安定的ノックダウンにより同質遺伝子の解糖性が損なわれた腫瘍を創製する。以前の研究では、ＬＤＨＡまたはＰＫＭ２のｓｈＲＮＡノックダウンが選択的に解糖を阻害し、ＯＸＰＨＯＳ経路に向かって細胞を再プログラミングすることが示されていた（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｋら，２００８；Ｆａｎｔｉｎら，２００６）。小分子阻害剤（例えば、ＭＣＴ１／４の自殺阻害剤、またはＣＡＩＸのアリールスルホンアミド）が、ＭＣＴ１／４とＣＡＩＸとの免疫組織化学の組み合わせで使用される。ＵＰＳ活性化のパターンは、腫瘍部におけるｐＨ調節タンパク質の空間発現と関係している。

【0244】

２．小分子阻害剤の摂動による腫瘍アシドーシスの機構的研究
腫瘍生体エネルギー学は、解糖機構またはミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）経路の向上と関係する。いくつかの分子レベルのメカニズムが、がん細胞におけるアルカリ性ｐＨ_ｉ及び腫瘍ミクロ環境における酸性ｐＨ_ｅを維持することに関与している（図７７）。ｐＨ調節機構は、モノカルボキシレート輸送体（ＭＣＴ１及びＭＣＴ４）（Ｅｎｅｒｓｏｎ ＆ Ｄｒｅｗｅｓ，２００３及びＨａｌｅｓｔｒａｐ ＆ Ｐｒｉｃｅ，１９９９）、炭酸脱水酵素（ＣＡＩＸ及びＣＡＸＩＩ）（Ｓｕｐｕｒａｎ，２００８及びＳｕｐｕｒａｎ，２０１０）、アニオン交換体 （ＡＥ１、２及び３）（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ら，２００２；Ｍｏｒｇａｎ，２００４）、Ｎａ^＋−重炭酸塩交換体（ＮＢＣ）（Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒら，２００６）、Ｎａ^＋／Ｈ^＋交換体（ＮＨＥ）（Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒら，２００６）及びＶ−ＡＴＰａｓｅ（Ｐｅｒｅｚ−Ｓａｙａｎｓら，２００９）等の多種タンパク質の相互作用と関係している。

【0245】

異なる解糖機構を有する腫瘍におけるアシドーシス機構を調査するために、本発明者等はまずアシドーシスプロセスにおける２つの主要な規制タンパク質の阻害剤から始める：ＭＣＴ１／４のための自殺ＣＨＣ阻害剤（図７８Ａ〜７８Ｅ）及びＣＡＩＸのためのアセタゾールアミド。本明細書に記載のデュアルレポータＵＰＳナノプローブは、腫瘍のマイクロ環境におけるｐＨ調節性に摂動を与えるために静脈内投与され、酸性化の時空応答をイメージングするためにデュアルレポータＵＰＳナノプローブを使用する。３つのグループのマウスは、以下の異なる解糖表現型を有する皮下肺腫瘍と共に使用される：１）適格解糖速度を有する同所性 ＨＮ５またはＦａＤｕ；２）ＬＤＨＡのｓｈＲＮＡにより解糖が損なわれた同所性ＨＮ５またはＦａＤｕ（Ｆａｎｔｉｎら，２００６）。腫瘍サイズは全てのグループにおいて約２００ｍｍ^３に制御される。各グループからのマウスは、その後４つのサブグループに分けられる。各サブグループのマウスは以下を受ける：１）ＰＢＳ；２）ＣＨＣ阻害剤；３）アセタゾールアミド；４）ＣＨＣ阻害剤とアセタゾールアミドの両方、それぞれ、その後デュアルレポータＵＰＳが投与される。ＵＰＳ注射の１、２、４、１２及び２４時間後に、各腫瘍からのＢＯＤＩＰＹ（オフ−オン）蛍光強度（ＦＩ）及びＣｙ３．５分布（常時オン）がＭａｅｓｔｒｏ小動物イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定され、画像Ｊにより定量化される。３つの異なるグループ間とＦＩ（サブグループ１）と比較することにより、分岐解糖速度を有するがん細胞が全て、腫瘍マイクロ環境において酸性ｐＨ_ｅを生成させるか否かが決定される。同じグループからＦＩ（サブグループ２／３／４）／ＦＩ（サブグループ１）の比を計算することにより、各経路が、異なる解糖速度を有する腫瘍の全アシドーシスに如何に貢献するかを決定する。各実験の最後に、腫瘍は集められ、凍結切片が試料から調製される。各腫瘍切片について、活性化ナノプローブのＢＯＤＩＰＹ画像及び絶対プローブ分布のＣｙ３．５画像が記録される。ＭＣＴ１／４またはＣＡＩＸの腫瘍アシドーシスへの相対的寄与は、活性化オン／オフＢＯＤＩＰＹ対常時オンＣｙ３．５蛍光強度から正規化される。凍結切片はＨ＆Ｅまたは抗体によって着色され、腫瘍のＭＣＴ１／４またはＣＡＩＸの発現プロファイルと関連付けられる。低酸素バイオマーカーＨＩＦＩαはまた、分布パターンを活性化ナノプローブと比較するために着色される。

【0246】

３．腫瘍進行の異なる段階での腫瘍アシドーシスの腫瘍内異質性の調査
生体エネルギーリモデリングの連続が腫瘍進行と共に存在することは知られている（Ｊｏｓｅら，２０１１）。小さい腫瘍は、グルコースからラクテートへの変換が低い傾向があるが、グルタミンからラクテートへの変換は比較的高い。一方、大きい腫瘍は、グルコース及び酸素の供給が低いにも拘わらず高いグルコース及び酸素利用速度を有する（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｄｔら，１９９８）。データは、Ｉ−ＵＰＳ法が、ＳＰＹカメラで輝く斑点として、極めて小さい腫瘍巣（＜１ｍｍ、またはＢａｌＢ／Ｃマウス内の１００万未満の４Ｔ１がん細胞、図７９Ａ〜７９Ｃ）を検出することができることを示している。この結果は、Ｉ−ＵＰＳは、進行の早い段階での小さい腫瘍結節を検出するのに十分な感度を有する。

【0247】

腫瘍増殖中に腫瘍アシドーシス機構の電位スイッチングをモニターするために、ＨＮ５及びＨＮ５の解糖性が損なわれたモデルを研究し、腫瘍増殖の異なる段階でのナノプローブ活性化を評価する。腫瘍が１０、１００、５００及び１０００ｍｍ^３に増殖した時、動物はまずＭＣＴ１／４またはＣＡＩＸ阻害剤の注射無しで画像化される。その後、ＣＨＣ阻害剤またはアセタゾールアミドを静脈注射し、対応するｐＨ調節経路を遮断し、動物は再び画像化され、摂動前後の蛍光強度を比較する。ＣＨＣ阻害剤またはアセタゾールアミド注射の結果としての蛍光強度％の低下が定量化され、それぞれ腫瘍切片におけるＭＣＴ１／４またはＣＡＩＸの発現レベルと関連づけられる。血管系（アンチ−ＣＤ３１）及び低酸素症（ピモニダゾール）の着色も、（Ｗａｎｇら，２０１４）に記載の腫瘍進行の異なる段階での血管新生及び低酸素症のＵＰＳ活性化についての評価をするために行われる。

【0248】

実施例１１：分岐解糖系表現型を有する腫瘍の検出におけるＵＰＳイメージング
１．分岐解糖速度を有するマウス腫瘍モデル
１つのシリーズで、同所性頭頸部腫瘍（ＨＮ５、ＦａＤｕ、またはＨＣＣ４０３４、図７３）は確立され、それらの同系の解糖性が損なわれた腫瘍が、本明細書に記載のＬＤＨＡの安定的ノックダウンにより確立される。別のシリーズでは、以前に確立した８０の細胞株のパネルから構造的に高い解糖速度対低い解糖速度を有するいくつかの非小細胞肺がん株が選択される。これらの分岐解糖系表現型を有する動物モデルを用いて、Ｉ−ＵＰＳナノプローブによるアシドーシスイメージングが、がん特異性をより高くするとの仮説が、ＦＤＧ−ＰＥＴにより、特に、解糖性が損なわれた腫瘍について試験される。加えて、正常組織における両方のイメージング法からの擬陽性シグナルも調査される。

【0249】

２．頭頸部の正常及び解糖性が損なわれた腫瘍モデルにおけるＩ−ＵＰＳとＦＤＧ−ＰＥＴイメージングの比較
適格な解糖性及び損なわれた解糖性を有するマウスにおいて一連の同所性頭頸部腫瘍モデルを確立する。具体的には、１０^６の選択された頭頸部がん細胞（ＨＮ５、ＦａＤｕまたはＨＣＣ４０３４）をＳＣＩＤマウスのおとがい下三角の領域に注射し、腫瘍を約２００ｍｍ^３まで増殖させる。マウスを２つのグループに分ける：１つのグループは、適格解糖性グループとしてスクランブル短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ_ｓｃｒ）が注射され；他のグループは、解糖性が損なわれたグループとして、ラクテート形成を遮断するためのラクテート脱水素酵素（ＬＤＨＡ）ノックダウウン短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ_ＬＤＨＡ）が注射される（Ｆａｎｔｉｎら，２００６）。マウスはＰＥＴイメージング前に１２時間絶食させる。各マウスは、生理食塩水１５０μＬ中の１５０μＣｉのＦＤＧの尾静脈注射を静脈内より受けた。ＰＥＴ画像は注射１時間後１５分間で得られる。ＰＥＴ画像は、３Ｄ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（３Ｄ配列分画期待値最大化）（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いて単枠に再構築される。対象領域（ＲＯＩ）は、腫瘍を含む全ての面における腫瘍を包括して、手動で取り出される。標的の活性度は、グラム当たりの注射容量％（％ＩＤ／ｇ）として計算される。標準化摂取値（ＳＵＶ）も、潜在的擬陽性の評価のために、腫瘍、並びに周囲の正常組織及び他の興味ある臓器（例えば、脳、腎臓、心臓、及びへんとう腺）について計算される。同所性ＨＮ５頸部腫瘍を有するマウスにおける最初のデータは、３匹のマウスの内２匹に褐色脂肪組織からの強い擬陽性シグナルを示し（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｋら，２００８；Ｆａｎｔｉｎら，２００６）、一方ＵＰＳは高い特異性を持つ腫瘍を検出した（図８０）。臨床的には、頭頸部がん患者の肩甲骨間の褐色脂肪組織または緊張した頸筋は、上昇したグルコース消費のためＰＥＴイメージングにおいては異常なものとして誤った解釈に導く（Ｍｉｒｂｏｌｏｏｋｉ，２０１１； Ｗａｎｇら，２０１２）。正常組織の構造は擬陽性シグナルの組織源を確認するために前もって作製される。

【0250】

ＰＥＴイメージング後、マウスは、放射線トレーサー（^１８Ｆ，ｔ_１／２＝１１０分）を再活性させるために１晩置かれる。Ｉ−ＵＰＳ（２．５ｍｇ／ｋｇ）は、その後、尾静脈より注射される。マウスは、注射の２４時間後、マウスはＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）医療用カメラで画像化される。全ての体のイメージングの後、マウスは主要な臓器（例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、脳、脾臓等）を除去するため解剖する。腫瘍及び正常組織のエクスビボ・イメージングはＳＰＹ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）医療用カメラで画像化される。腫瘍及び正常組織の比（Ｔ／Ｎ）は、全ての蛍光画像についてＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて定量化される。２つの分岐解糖性動物グループの間で、ＰＥＴイメージングの解糖度への影響％ＩＤ／ｇまたはＳＵＶ、及び蛍光イメージングのＴ／Ｎが比較される。蛍光イメージング後、動物の主要な臓器は凍結断片化され、Ｈ＆Ｅで着色される。床病理医は、悪性腫瘍の存在及び擬陽性シグナルの組織源の存在を確認する。

【0251】

３．非小細胞肺腫瘍モデルにおけるＩ−ＵＰＳイメージング特異性の調査
頭頸部がんモデルに加えて、分岐解糖速度を有する選択された肺がんモデルにおいてＩ−ＵＰＳ及びＦＤＧ−ＰＥＴのイメージング特異性もまた調査する。肺がんＳＰＯＲＥの一部として、細胞培地における８０を超える非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のパネルについてグルコース消費速度及びラクテート分泌速度（図８１）を予め定量した。解糖速度（ラクテート_ｏｕｔ／グルコース_ｉｎ）対細胞株のプロットは、ＮＳＣＬＣ細胞に対して細胞自律的な構造的分岐解糖表現型を描いている。このデータに基づき、高い及び低い解糖速度有する２グループの肺がん細胞を選択する。具体的には、Ｈ２１７０、ＨＣＣ５１５及びＨ２３４７は、高い解糖パネル（ラクテート_ｏｕｔ／グルコース_ｉｎが約２．０）として選択され、そしてＨ２２８、Ｈ１７５５及びＨＣＣ７８は低い解糖パネル（ラクテート_ｏｕｔ／グルコース_ｉｎが＜０．５）として選択される。これらの細胞株は、ＵＴＳＷ／ＭＤＡＣＣ肺ＳＰＯＲＥから入手でき、ＳＣＩＤマウスにおいて皮下腫瘍を作りだすことが示された。典型的な手順において、２×１０^６の肺がん細胞はまずマウスの左脇の皮下に注射され、ＳＣＩＤマウス内に細胞異種移植片を形成する。腫瘍が約２００ｍｍ^３に増殖した時、マウスはまずＰＥＴで画像化され、その後、前述の手順を用いてＩ−ＵＰＳナノプローブの注射後蛍光イメージングがなされる。Ｉ−ＵＰＳイメージングの成果は、ＦＤＧ−ＰＥＴのものと比較される。特に、Ｉ−ＵＰＳイメージングはＦＤＧ−ＰＥＴの認識された擬陽性組織（例えば、褐色脂肪、組織学的胸筋）について何も示さないか否かが、評価され、そしてまたＩ−ＵＰＳイメージングは、ＦＤＧ−ＰＥＴでは潜在的に検出されない構造的に低い解糖速度を有する肺腫瘍を明らかにすることができる。

【0252】

実施例１２：がん細胞における顕微鏡的腫瘍境界と最適ＵＰＳナノプローブ活性化との比較
１．ＵＰＳ活性化プロファイルの定量化及び顕微鏡的腫瘍境界との関連
選択された腫瘍モデルに対して、常時オン／オフ−オン・デュアルレポータを有するナノプローブが静脈内注射される。注射後１５分で始めて、１、４及び２４時間後に、腫瘍と周囲の組織を集め、凍結切片を試料から調製する。各腫瘍切片について、ＢＯＤＩＰＹ画像が活性化ナノプローブのために記録され、Ｃｙ３．５画像が絶対プローブ分布のために記録される。凍結切片はＨ＆Ｅで着色され、真の腫瘍境界が同定される（現在の医療の最高標準）。より大きい腫瘍のために、複数の画像を記録し、それらを繋ぎ合わせて総合的な比較を行う。

【0253】

定量的画像分析のために、（１）組織構造画像により同定された真の腫瘍境界点（ゼロ点）からの接線を引く（図８２）、（２）接線に垂直な別の線を引く、（３）ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて垂直線に沿ってＢＯＤＩＰＹ及びＣｙ３．５蛍光強度（例えば、ゼロ点から±５００μｍ）を同定する、（４）各腫瘍スライスの複数の境界点から工程１〜３を繰り返し、複数の線形プロファイルの平均値を求める、そして（５）平均蛍光強度対ＢＯＤＩＰＹとＣｙ３．５チャンネルの距離をプロットする。図８２は、デュアルレポータ・ナノプローブによる境界分析のスキームを示す。

【0254】

プローブが解糖性がん細胞によるｐＨ活性化を介して腫瘍を描くことができるか否かを知るために、プローブはＨ＆Ｅ画像及びＢＯＤＩＰＹ（ｐＨ活性化可能レポータ）マップを比較して決定される。対処すべきいくつかの特定の問題が挙げられる：（１）ラクテート分泌細胞の分布及び性質はどんなものであるか、並びにラクテート分泌とは、従って腫瘍のサイズ、タイプ及びステージの影響を受ける境界の正確さとは何であるか、（２）ＵＰＳナノプローブは、腫瘍の境界の内側及び／または向こう側にｐＨ異質性を識別することができるか否か、及び正常組織に浸潤する残ったがん細胞を、ＥＰＲ効果の欠如があることにより境界を越えて検出することができるか否か。ＣＦＰとＣｙ３．５（常時オンレポータ）を比較することにより、細胞内側のプローブの分布が、時間にわたって腫瘍周囲の正常組織に対して決定される。ＢＯＤＩＰＹとＣｙ３．５シグナルを比較することにより、プローブ活性化（Ｉ_{ＢＯＤＩＰＹ}／Ｉ_{Ｃｙ３．５}）は、プローブ蓄積（Ｉ_{Ｃｙ３．５}）と相対的に決定される。いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、用量蓄積対ＥＰＲ効果またはｐＨ活性化は境界描写を駆動させると考えられる。６．３〜７．１の異なるｐＨ転移を有する一連のデュアルレポータプローブのこの一連の曲線により、ｐＨ転移の調整が腫瘍境界描写の感度及び特異性を変化させるか否かが確立され、調査される。最適Ｉ−ＵＰＳは自在に調べられ、または腫瘍のタイプ及び／またはサイズに依存している。結局、ＣＦＰ標識化がん細胞は、境界を越えた正常組織に浸潤するがん細胞の検出のためのプローブの感度及び特異性をさらに試験するために使用される。

【0255】

２．抗腫瘍の有効性及び長期間生存の研究
同所性腫瘍異種移植片（頭頸部がんのＨＮ５及びＦａＤｕ、乳がんの４Ｔ１及びＭＤ−ＭＢＡ−２３１）はＩ−ＵＰＳ誘導切除の抗腫瘍有効性を評価するために使用される。各研究について、Ｉ−ＵＰＳナノプローブは手術の２４時間前に静脈注射される。動物は４グループ（各グループについてｎ＝１０または１５）に分割される：（１）手術なし；（２）腫瘍の大部分の除去による制御（見える腫瘍の部分的除去）；（３）白色光手術による腫瘍完全除去（外科医の推測できる限りで）及び（４）ＳＰＹ誘導腫瘍除去。これらの実験グループは、白色光下の通常手術と蛍光手術との間の差異の調査を可能にしている。試験的研究はＩ−ＵＰＳ_６．９プローブを用いて行われている（図７４Ａ＆７４Ｂ及び７８Ａ〜７８Ｅ）。追加の腫瘍モデル（例えば、ＦａＤｕ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における最適Ｉ−ＵＰＳプローブのための同様の実験が行われる。

【0256】

手術の後、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線が、各グループ間の抗腫瘍有効性を比較するために決定される。全ての切除された動物について、最初の部位での腫瘍発生が検討され、記録される。加えて、マウスの嚥下機能への手術の影響を推定する。いかなる理論に束縛されることを望むわけではないが、腫瘍切除中に除去された正常組織の量が多いほど、動物の得られる機能、それ故嚥下機能の低下が大きくなる。マウスについて、手術の前及び後に重量を測る。手術後、毎日重量を１週間記録し、その後１週間に２回記録する。体の損失重量％は、摂取及び嚥下機能の代用として使用される。重量は、動物の成長を説明するために初期重量に正規化される。

【0257】

実施例１３：生物学的プロファイル及び薬物動態
１．薬物動態／生体内分布（ＰＫ／ＢＤ）の研究
^３Ｈ−標識化ＰＥＧ−ｂ−ＰＣ７Ａ（ＵＰＳ_６．９）及びＰＥＧ−ｂ−ＰＤＰＡ（ＵＰＳ_６．３）を用いて以前の研究は、類似の流体力学（それぞれ２５．３±１．５対２４．９±０．８ｎｍ）、ゼータ電位（−０．７±１．１対−３．５±０．６ｍＶ）、及びＰＥＧ長（共に５ｋＤ）にもかかわらず得られるＵＰＳナノプローブは顕著に異なるＰＫ／ＰＤのプロファイル（特徴）を有することを示している。α−相の半減期は、ＵＰＳ_６．９及びＵＰＳ_６．３について、それぞれ１．０±０．２及び４．３±０．７時間（Ｐ＜０．０５）、そしてβ−相の半減期は、７．５±０．３及び１９．６±２．１時間（Ｐ＜０．０１）であった。ナノ粒子注射の２４時間後における生体内分布の研究は、肝臓と脾臓は両方のナノ粒子のクリアランス（除去）のための主要な臓器であることを示した。ＵＰＳ_６．３に対してＵＰＳ_６．９のより速いクリアランスは、より高い転移ｐＨに、且つＵＰＳ活性化及びクリアランスにおいて血液からより高い影響を受け易いことに起因する。

【0258】

この研究において、ＰＫ／ＢＤの研究はまず、以前確立した^３Ｈ標識化コポリマー（各グループについてｎ＝５）を用いて本明細書に記載の最適化Ｉ−ＵＰＳ組成物について行われる。血液は、注射後、２分、０．５、１、３、６及び２４時間後に集められる。実験の最後に、動物は犠牲にされ、腫瘍組織及び腫瘍臓器（心臓、肝臓、脾臓、腎臓）が除去される。解剖された臓器は重量が測られ、均質化され、シンチレーション混合物で処理される。血液と組織サンプルの両方は液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ６０００ ＩＣ）により定量化される。異なる臓器／組織におけるＵＰＳ分布は、組織のグラム当たりの注入された用量のパーセンテージとして計算される。血液と組織サンプルに加えて、尿及び糞サンプルも、腎臓分泌及びＧＩ管によりＩ−ＵＰＳのクリアランスを分析するために集められる。これらの実験は、キャンパス内の指定動物の施設の代謝かごで行われる。

【0259】

２．先天性免疫反応の評価
Ｉ−ＵＰＳが強い先天性免疫を引き起こすか否かを判断するために、Ｉ−ＵＰＳナノプローブを、免疫反応性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各グループについてｎ＝５）に１×、１０×及び５０×のイメージング用量で静脈注射する。２、６及び２４時間にて、尾静脈からの血液サンプル（１００μＬ）を集める。血清を分離し、サイトカインプロファイルを分析する。現在のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）多重分析は、２５μＬの血清から２３のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α及びβ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、等）を検出することができる。ＰＢＳが陰性対照として使用される。サイトカインに顕著の増加が観察された場合、免疫反応に対しより詳しい分析が（例えば、好中球または他の白血球の生成、相補体活性化、脾臓及びリンパ節における炎症活性の調査）、２〜４週間等のより長い時間枠で行われる。

【0260】

実施例１４：多様な異なるポリマーを含有するＵＰＳナノ粒子
１．多様な異なるポリマーを有するミセルの使用
初めに、一連の両親媒性のブロックコポリマーＰＥＧ−ｂ−ＰＲ（但し、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、そしてＰＲはイオン化可能セグメントである）（スキーム１及び表１２）を合成した。
スキーム１：イオン化可能セグメントの合成

【0261】

【化60】

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【0262】

【表12】

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【0263】

ＰＥＧ−ｂ−ＰＲコポリマーは異なるフルオロフォアでコードされた。３つの例のＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５蛍光ポリマーを選択し、色素結合数及び効率並びに量子収率について特性評価した（図８４Ｂ及び表１３）。ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５ナノプローブは、クラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）から初期エンドソームへ（ｐＨ約６．０）、その後の後期エンドソーム／リソソームへ（ｐＨ約５．０〜５．５）のエンドサイトーシスの経路の間におけるｐＨ変化をカバーする、６．９、６．２及び５．３でｐＨ転移を有していた（Ｈｕｏｔａｒｉ ＆ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，２０１１）。これらのナノ粒子の粒径は狭い分布を持つ２３〜２５ｎｍであった。蛍光活性化比（Ｒ_Ｆ）は、鋭いｐＨ応答を有するＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５ナノプローブについて、３０、９１及び１０７倍であった（ΔｐＨ_{１０−９０％}＝０．１８〜０．２２、表１４及び図８５〜８８）。超音波処理法を用いて、３つの成分のＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５からなるハイブリッドＵＰＳナノプローブシステムを、図８４Ａ〜８４Ｃで示されるように操作した。いかなる理論に束縛されることを望まないが、３つの蛍光ポリマーは、より高いｐＨで自己組織化して、均一なハイブリッドＵＰＳナノプローブを形成する。エンドサイトーシスの後、ハイブリッドＵＰＳナノプローブは、各ポリマーの個々のｐＨ_ｔ（例えば、６．９、６．２、５．３）で連続的に解離して蛍光を発し、生存細胞において単一のオルガネラ解像度での微妙なｐＨ変化に関連するエンドソーム成熟プロセスを辿る（図８４Ｃ）。

【0264】

【表13】

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【0265】

【表14】

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【0266】

均一ハイブリッドナノ粒子の形成を実証するため、一連のホモＦＲＥＴ及びヘテロＦＲＥＴ実験は設計され、実施された。ホモＦＲＥＴ実験は蛍光ＰＥＧ−ｂ−ＰＲポリマー及び異なるｐＨ転移を有する他の標識無しＰＥＧ−ｂ−ＰＲポリマーに関連する。この実施例では、ＰＥＰＡ−Ｃｙ５が使用され、ＰＥＰＡ、ＰＤＰＡ、またはＰＤＢＡポリマーと、指標化ポリマー対指標無しポリマーのモル比が１：１９で混合される。結果として、ＰＥＰＡ−Ｃｙ５とＰＥＰＡ、ＰＤＰＡまたはＰＤＢＡとの分子混合ミセルの形成が、ホモＦＲＥＴ効果を除去してＣｙ５蛍光シグナルの回復により示される同じミセルにおいて、なされたことが示された（図１１４Ａ＆１１４Ｂ）（Ｚｈｏｕら，２０１２）。対照的に、ＰＥＰＡ−Ｃｙ５及び別の指標無しミセルのミセル混合物はＣｙ５シグナル回復を示さなかった。同じ結果がまたＰＤＢＡ−Ｃｙ５及び別の指標無しＰＥＧ−ｂ−ＰＲポリマーの分子混合ミセルにおいても観察された（図８９Ａ＆８９Ｂ）。全てのこれらの結果は、ＰＥＰＡ、ＰＤＰＡ、及びＰＤＢＡポリマーは均一なハイブリッドナノプローブを形成することができることを示した。

【0267】

ハイブリッドナノプローブの形成をさらに確認するため、蛍光移動効果は、異なるヘテロ−ＦＲＥＴ色素：ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５でコードされたコポリマーで検討された。ホモＦＲＥＴを最小化するために、各コポリマーでは疎水性ＰＲセグメントが１つの色素でコードされた。２つまたは３つのコポリマーがＴＨＦに溶解され、その後水中に滴下され、本明細書に記載の分子混合ミセルを製造した。ＰＥＰＡ−ＢＤＹとＰＤＰＡ−ＴＭＲの組み合わせ（モル比＝１：１）において、分子混合ミセルのＢＤＹ４９３発光波長（５１０ｎｍ）での蛍光強度は、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３のみのミセル溶液に比べて４倍を超えて減少した。さらに、ＴＭＲ発光（５８０ｎｍ）での蛍光強度は、ＰＤＰＡ−ＴＭＲミセル溶液に対して、混合ミセル溶液の４倍を超える増加を示した（図９０Ａ）。他の３つのヘテロ−ＦＲＥＴポリマーのセット：（ｉ）ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５、（ｉｉ）ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５；（ｉｉｉ）ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５も広く調査した（図９０Ｂ〜９０Ｄ）。ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５蛍光ポリマーのセットでは、ＢＤＹ４９３からＴＭＲへの連続ＦＲＥＴ効果が観察され、最後はＣｙ５まで観察される（図９０Ｄ）。ハイブリッドナノプローブのＢＤＹ４９３発光における蛍光強度は、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３のみのミセル溶液に比べて４倍を超えて減少し、一方、Ｃｙ５シグナルはＰＤＢＡ−Ｃｙ５に対してハイブリッドナノプロの２５倍を超えて増加した。これらの結果は、３つのＰＥＧ−ｂ−ＰＲコポリマーは、ＰＥＧ−ｂ−ＰＲコポリマーが自己組織化して均一ハイブリッドＵＰＳナノプローブを形成することができることを明確に実証した。

【0268】

ハイブリッドＵＰＳナノプローブの形成の実証後、ハイブリッドナノプローブシステムは、各ＰＲ鎖が約２．２個の色素で結合された、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５蛍光ポリマーを用いて製造された（図９１）。異なる励起波長（４８５、５４５、６４０ｎｍ）及び異なるｐＨ（７．４、６．７、５．８、及び５．０）における蛍光発光スペクトルが集められ、プロットされた（図９２Ａ〜９２Ｄ及び図９３Ａ〜９３Ｆ及び図９４）。結果として、全ての３つの蛍光ポリマー成分は中性ｐＨでは「静か」な状態を保つことが示された。ｐＨが６．７に低下した時、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ成分がまず放出され、活性化され、青信号を発生し、一方他の２成分は「オフ」のまま留まった。ｐＨが５．８に低下した時、ＰＤＰＡ−ＴＭＲシグナルは活性化されて赤信号を発生し、ＰＤＢＡ−Ｃｙ５成分はこの段階では完全に「静か」な状態であった。最後に、溶液ｐＨが５．０に低下した時、ＰＤＢＡ−Ｃｙ５成分が活性化された。この段階で、３つの蛍光ポリマーは完全に活性化した。動的光散乱分析（ＤＬＳ）により測定された、ハイブリッドＵＰＳナノプローブの粒径は７．４と５．８との間のｐＨで約３０〜４０ｎｍであり、ユニマーとしてはｐＨ５．０で８．７ｎｍに低下した同様の観察がＴＥＭ分析によってなされた（図９５Ａ＆９５Ｂ）。ハイブリッドＵＰＳナノプローブのＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５成分のｐＨ_ｔ値は、６．９、６．２、及び５．３であり、これらの対応する単位成分ナノプローブに合致した。全体として、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５の蛍光活性化比は、鋭いｐＨ応答（ΔｐＨ_{１０−９０％}＝０．２０−０．２５、補足表Ｓ４）で７４、１２３、及び３０であった。ＤＬＳ分析を用いて、ハイブリッドナノプローブ対ｐＨ値の計数率はプロットされ、図９２Ｅに示されるように、多段活性化パターンが観察された。各段階で、１つの蛍光ポリマーが放出され、蛍光を発し、最後に全てのポリマーは解離するが、これは０に到達した計数率で示される。ハイブリッドＵＰＳナノプローブの異なるｐＨでの多段階活性化も、図９２Ｆに示されるように、ＭａｅｓｔｒｏＣＲＩイメージングシステムにより画像化され、確認された。

【0269】

ハイブリッドＵＰＳナノプローブの３成分の同期細胞摂取を検査するため、ＵＰＳナノプローブを本明細書に記載のチオール−マレイミド結合を介して５％Ｅｒｂｉｔｕｘ（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＥＧＦＲ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ａｄａｍｓ ＆ Ｗｅｉｎｅｒ，２００５）で官能化した。Ｅｒｂコード化ハイブリッドナノプローブは、６．９、６．２、及び５．３のｐＨで、０．２０−０．２５のΔｐＨ_{１０−９０％}を有する３つの特有のｐＨ転移を持っていた。ハイブリッドナノプローブの蛍光オン／オフ活性化比は、ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５チャンネルの、それぞれ２００、１９１、及び３５倍であった。Ｅｒｂコード化ＵＰＳナノプローブの特異性を調査するため、Ａ５４９細胞は、Ｅｒｂコード化ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブで培養された。Ｅｒｂコード化ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブの培養の１５分後、斑点状の蛍光活性化が細胞内で観察された。１時間で、Ｅｒｂコード化ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブにおいて、ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブ制御基に対して２５０倍を超える蛍光増加が観察され、ＥＧＦＲバイオマーカーに対して高い特異性を示した（図９６）。Ｅｒｂ結合ＵＰＳナノプローブの特異性の確認後、Ｅｒｂコード化ハイブリッドＵＰＳナノプローブの同期摂取が検査された（図９７）。Ａ５４９細胞はＥｒｂコード化ハイブリッドＵＰＳナノプローブで３時間培養され、共焦点顕微鏡で画像化された。対照グループにおいては、Ａ５４９細胞は、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、Ｅｒｂ−コード化ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５の３つのナノプローブの混合物で培養された。単一のエンドサイトーシス・オルガネラにおけるＥｒｂコード化ハイブリッドナノプローブの同期摂取が観察され、一方対照グループにおいてはＥｒｂ−コード化ＰＤＰＡ−ＴＭＲナノプローブのみが取り込まれ細胞内で活性化された。重要なことは、斑点状のブルー及びレッドの蛍光ドットはグリーン蛍光ドットの一部で共局在化され、ハイブリッドナノプローブはエンドサイトーシス・オルガネラ成熟の評価に利用することができることを示唆した。

【0270】

リアルタイムでエンドソーム成熟を追跡するために、Ａ５４９細胞をＥｒｂ−コード化ハイブリッドＵＰＳナノプローブで４℃にて３０分間培養して、特異性細胞結合を起こさせ、その後培地を除去し、２回洗浄した。ハイブリッドナノプローブの３７℃での細胞内摂取及び活性化を共焦点顕微鏡で画像化した。期待通り、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３成分がまず放出され、活性化されて、１０分でグリーン蛍光ドットを形成し、その強度を上昇させ、３０分の培養後安定状態の到達した（図９８）。その後、レッドＰＤＰＡ−ＴＭＲシグナルは２０〜３０分で現れ始めた。全てのレッドドットはこの段階でグリーンドットの一部と共局在化された。最後に、ＰＤＢＡ−Ｃｙ５成分が、９０〜１８０分で疑似カラーのブルードットで活性化し、全てのブルードットはこの期間にレッドドットの一部と共局在化された。エンドサイトーシス・オルガネラは３つの集団に分割することができる：（ｉ）グリーンドット（６．２＜ｐＨ＜６．９）；（ｉｉ）イェロードット（５．３＜ｐＨ＜６．２）；（ｉｉｉ）ホワイトドット（ｐＨ＜５．３）、それぞれクラスリン被覆小胞のｐＨ約６．８、初期エンドソームのｐＨ約６．０、及び後期エンドソーム／リソソームのｐＨ約５．０〜５．５を示した。同様に、連続して起こる活性化は、ＨＮ５頭頸部がん細胞株の単一酸性オルガネラの内側に観察された（図９９）。従って、ハイブリッドＵＰＳナノプローブは、単一オルガネラ分解で特異性エンドサイトーシス経路に沿って時空ｐＨ変化を報告することに成功した。

【0271】

ハイブリッドＵＰＳナノプローブの独特の能力を実証したので、オルガネラ成熟中に酸性化速度の劇的増加に起因する独特の発がん性の痕跡を調査した。異なる遺伝子突然変異の背景を有する７つの肺がん株を選択し、評価した（表１５）。細胞を、１００μｇ／ｍＬのＥｒｂコード化ハイブリッドＵＰＳナノプローブで４℃にて３０分間培養し、３回洗浄し、その後３７℃にてリアルタイムで画像化し、オルガネラ酸性化能力を示すナノプローブ活性化速度を辿った（図１００〜１０２）。結果として、ＨＣＣ４４、Ｈ２００９、Ｈ４６０、及びＡ５４９を含むＫＲＡＳ突然変異細胞の活性化速度は、ＫＲＡＳ野生型細胞（Ｈ２８８２、Ｈ１９９１、及びＨ１８１９）より顕著に早いことを示した。異なる細胞株における摂取の差異を正規化するために、ＰＤＰＡ−ＴＭＲ（早期エンドソーム）及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５（後期エンドソーム／リソソーム）のシグナルの蛍光強度を、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３シグナルにより分割した、それは早ければ１５分で活性化した。時間関数としてのＩ_６．２／Ｉ_６．９及びＩ_５．３／Ｉ_６．９ をプロットした（図１０３Ａ＆１０３Ｂ及び図１０４Ａ〜１０４Ｄ）。３０分で、ＴＭＲチャンネルの顕著な活性化の差異（Ｉ_６．２／Ｉ_６．９）は観察されなかった。７５分で、ＫＲＡＳ突然変細胞のＩ_５．３／Ｉ_６．９比は７０％のブルー陽性オルガネラに到達し、一方ＫＲＡＳ野生型細胞はわずか４０％未満のブルー陽性オルガネラしか持てなかった。これらの結果は、ＫＲＡＳ突然変異はｐＨ調節と関係するリソソームの異化の原因となることを示唆した。

【0272】

【表15】

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【0273】

ＫＲＡＳ突然変異は、恐らく、リソソームの酸性化速度の上方調節の原因となると仮定し、ハイブリッドＵＰＳナノプローブが遺伝子突然変異に関係するオルガネラｐＨを直接捉えるために利用された。モデルシステムとして、同じ肺がん患者から得た腫瘍由来（ＨＣＣ４０１７）及び正常細気管支上皮由来（ＨＢＥＣ３０ＫＴ）の細胞株を、ＴＰ５３（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３）の段階的な安定的抑制、ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ）の安定的発現、及びＬＫＢ１（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ／ｓｈＬＫＢ１）の安定的抑制を有する同系進行の一連のＨＢＥＣ３０ＫＴと共に、選択し、画像化した（Ｒａｍｉｒｅｚら，２００４）。図１０５Ａ及び１０５Ｂは、ＨＢＥＣ３０ＫＴ上皮細胞に対する悪性のＨＣＣ４０１７細胞においてエンドサイトーシス・オルガネラのより早い成熟速度における劇的な差異を示した（図１０６及び１０７）。元の腫瘍及びＨＣＣ４０１７細胞株の遺伝子型決定が、ＴＰ５３、ＬＫＢ１及びＫＲＡＳの成熟を明らかにした。データは、ＫＲＡＳ／ＬＫＢ１成熟細胞が、増殖及び生存ためのリソソームの異化に依存しているとの以前の発見に合致している（Ｋｉｍら，２０１３）。さらに、どの発がん痕跡がオルガネラ成熟における差異の原因であるかを正確に示すために、一連の同系進行のＨＢＥＣ３０ＫＴにおけるハイブリッドナノプローブの蛍光活性化パターンを画像化した（図１０８〜１１０）。時間の関数としてのＩ_６．２／Ｉ_６．９及びＩ_５．３／Ｉ_６．９をプロットした（図１１１Ａ〜１１１Ｄ）。結果は、ＫＲＡＳ成熟が、エンドサイトーシス・オルガネラの酸性化及び成熟の劇的増加が原因であることを明らかに示唆した。

【0274】

２．方法及び材料
１．ハイブリッドナノプローブの合成及び特性
色素結合ＰＥＧ−ｂ−ＰＲ及びマレイミド−末端ＰＥＧ−ｂ−ＰＤＰＡ（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰＡ）ブロックコポリマーを原子移動ラジカル重合法により合成した。ハイブリッドナノプローブは、以前の刊行物の手順に従って調製された（Ｗａｎｇら，２０１４）。典型的な手順では、ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＥＧ−ｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＥＧ−ｂ−ＰＤＢＡ−Ｃｙ５ポリマーをそれぞれ５ｍｇ、１ｍＬのＴＨＦに溶解した。その後、混合物を１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に超音波処理下に加えた。混合物を４回ろ過し、マイクロ−超遠心分離システムを用いてＴＨＦを除去した。その後、蒸留水を加えて最終ポリマー濃度を５ｍｇ／ｍＬに調節した。Ｅｒｂｉｔｕｘ−結合ハイブリッドナノプローブを調製するため、０．６ｍｇのＭａｌ−ＰＥＧ−ＰＤＰＡ、それぞれが４ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、ＰＥＧ−ｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＥＧ−ｂ−ＰＤＢＡ−Ｃｙ５ポリマーを１ｍＬのＴＨＦに溶解し、そして上記と同様の手順を用いて５％マレイミド変性ハイブリッドナノプローブを調製した。一方、Ｅｒｂｉｔｕｘ Ｆａｂ’−ＳＨ断片（３ｍｇ，Ｍ_ｗ＝５５ｋＤａ）を刊行物の手順に従い調製した。その後、マレイミド変性ハイブリッドナノプローブとＥｒｂｉｔｕｘ Ｆａｂ’−ＳＨ溶液を混合し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）において一晩室温で反応させた。その後、混合物を６回ろ過し、遊離のＦａｂ’−ＳＨをマイクロ−超遠心分離システム（ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて除去した。その後、１００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して最終ポリマー濃度を５ｍｇ／ｍＬに調節した。透過型電子顕微鏡検査を、１％リンタングステン酸逆染色法を用い、ＪＥＯＬ １２００ＥＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ １２００ＥＸ）で可視化して行った。ナノプローブの粒径及び分布は動的光散乱（ＤＬＳ）分析により測定した。ｐＨ値の関数としてのナノ粒子の平均計数速度もまたＤＬＳ分析により測定した。

【0275】

２．ＵＰＳナノプローブの蛍光活性化
異なるｐＨ緩衝溶液においてハイブリッドＵＰＳナノプローブの蛍光発光スペクトルが、日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）により得られた。最終のポリマー濃度が、異なるｐＨ値を有する１００ｍＭのＰＢＳを用いて１００μｇ／ｍＬに調節された。ハイブリッドナノプローブは、４８５、５４５、及び６４０ｎｍでそれぞれ励起された。対応する発光スペクトルは、それぞれ４９０〜７５０、５６０〜７５０、及び６５０〜７５０ｎｍで集められた。５１０、５８０、及び７１０ｎｍでの発光ピークが、ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５チャンネルの蛍光活性化比を定量化するために使用された。異なるｐＨ値でのハイブリッドナノプローブ溶液（１００μｇ／ｍＬ）の蛍光画像が、ブルー（５１５ｎｍ ＬＰ）、グリーン（５８０ｎｍ ＬＰ）、及びオレンジ（６４５ｎｍ ＬＰ）のフィルタを用いてＭａｅｓｔｒｏイメージングシステム（ＣＲＩ）により記録された。その後、画像は個々の色素の標準蛍光スペクトルを用いてスペクトル的な混在はされずに、マルチカラー画像を得た。

【0276】

３．細胞培養
肺がん細胞株Ａ５４９及び頭頸部がん細胞株ＨＮ５は、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養された。ＨＢＥＣ３０ＫＴ進行シリーズ及びＨＣＣ４０１７細胞は、２％のウシ胎仔血清及び抗生物質で懸濁されたＡＣＬ４培地で５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃にて培養された。

【0277】

４．細胞イメージング
Ａ５４９及びＨＮ５細胞が、２ｍＬの完全なＤＭＥＭ培地内のガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ、ＭＡ）に固定された。Ｅｒｂｉｔｕｘ−結合ナノプローブの特性を試験するために、完全な培地内のＡ５４９細胞を４℃で１０分間保持した後、１００μｇ／ｍＬのＥｒｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲミセルを添加し、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合のために４℃で３０分間保持し、その後培地を除去して氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を完全培地で３７℃にて２時間培養した。共焦点画像をＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｅ共焦点顕微鏡で６０×対物レンズで記録した。

【0278】

ハイブリッドナノプローブにおける３つの成分の同期摂取を実証するため、完全培地内のＡ５４９細胞を４℃で１０分間保持し、その後１００μｇ／ｍＬのＥｒｂ−結合ハイブリッドナノプローブを添加し、ＥＧＦＲ結合のために４℃で３０分間保持した。培地は除去され、３回洗浄された。その後、細胞を完全培地で３７℃にて３時間培養した。ＴＭＲ及びＣｙ５をそれぞれ４８８、５４３、及び６３３ｎｍで活性化させた。ＦＩＴＣ（５１５±１５ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（５９０±２５ｎｍ）及びＣｙ５（６５０ｎｍ ＬＰ）のフィルタを、それぞれＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５のイメージングのために使用した。対照グループとして、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、Ｅｒｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５のミセルを作製し、混合し、Ａ５４９細胞で培養した。同様の手順が細胞イメージングのために利用された。

【0279】

エンドソーム成熟プロセスを辿るために、細胞サンプルを前述と同様の手順を用いて調製した。共焦点画像はＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｅ共焦点顕微鏡で１００×対物レンズで、３７℃で培養後０、１５、３０、６０分、２．５、及び５時間において記録された。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５の３つのチャンネルは活性化され、前述の記載と同じ設定で集められた。画像はＩｍａｇｅ−Ｊソフトウェアを用いて分析された。５つの独立の測定は、平均±標準偏差で表した。

【0280】

５．統計的分析
データは、平均±ｓ．ｄ．で表した。グループ間の差異は一対の両側スチューデントｔ−検定（ｐａｉｒｅｄ， ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて評価した。^＊Ｐ＜０．０５は有意と考えられ、^＊＊Ｐ＜０．０１はかなり有意と考えられる。

【0281】

６．材料
テトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（ＴＭＲ−ＮＨＳ）及びＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３スクシンイミジルエステル（ＢＤＹ４９３―ＮＨＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．より購入した。Ｃｙ５ＮＨＳエステル（Ｃｙ５―ＮＨＳ）はＬｕｍｉｐｒｏｂｅ Ｃｏｍｐａｎｙより購入した。２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＰＡ−ＭＡ）、及び２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＢＡ−ＭＡ）を含むモノマーは最近報告された（Ｚｈｏｕら，２０１１；Ｍａら，２０１４）。２−アミノエチルメタクリレート（ＡＭＡ）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙより購入した。ＡＭＡはイソプロパノールと酢酸エチル（３：７）で２回再結晶した。ＰＥＧマクロ開始剤、ＭｅＯ−ＰＥＧ_１１４−Ｂｒ、はα−ブロモイソブチルブロミド及びＭｅＯ−ＰＥＧ_１１４−ＯＨから刊行物（Ｚｈｏｕら，２０１１）の手順に従い調製した。他の溶剤及び試薬はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．より得て使用した。

【0282】

７．ＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−Ｄｙｅ）ブロックコポリマーの合成
ＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）コポリマー（スキーム１）をまず原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法により合成した。第１級アミノ基は、ＡＭＡモノマーの開始剤に対する供給比（比＝３）を制御することにより各ポリマー鎖に導入された。色素非含有コポリマーはポリマーの特性化に使用された（表１２）。ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＡＭＡ）を、手順を説明するための例として用いた。まず、ＤＰＡ−ＭＡ（１．７ｇ，８ｍｍｏｌ）、ＡＭＡ（５０ｍｇ，３ｍｍｏｌ）、ＰＭＤＥＴＡ（２１μＬ，０．１ｍｍｏｌ）、及びＭｅＯ−ＰＥＧ_１１４−Ｂｒ（０．５ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を重合管に充填した。その後、２−プロパノール（２ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）の混合物を加えてモノマーと開始剤を溶解した。酸素を除去するために３サイクルの凍結脱気をした後、ＣｕＢｒ（１４．４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に反応管に添加し、管を真空で密封した。４０℃で１２時間、重合を行った。重合後、反応混合物を１０ｍＬのＴＨＦで希釈し、Ａｌ_２Ｏ_３カラムを通過させて触媒を除去した。ＴＨＦ溶剤はロータリーエバポレータで除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥して白色粉末を得た。得られたＰＥＧ−ｂ−（ＰＲ−ｒ−ＡＭＡ）コポリマーを、５００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲ、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（Ｖｉｓｃｏｔｅｃｈ ＧＰＣｍａｘ，ＰＬｇｅｌ ５μｍ ＭＩＸＥＤ−Ｄカラム，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ製，溶離液としてのＴＨＦを１ｍＬ／分で使用）により特性評価した。表１２は、各ポリマーの収率、分子量（Ｍ_ｎ及びＭ_ｗ）及び多分散指数（ＰＤＩ）を示す。

【0283】

色素結合コポリマーの合成は以下に記載の代表的手順に従った。ＴＭＲ結合のため、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ｒ−ＡＭＡ）（５０ｍｇ）をまず２ｍＬのＤＭＦに溶解した。その後、ＴＭＲ―ＮＨＳエステル（第１級アミノ基のモル量に対して１．５当量）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。コポリマーを分離用ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＰＬｇｅｌ Ｐｒｅｐ １０μｍ １０Ｅ３Å ３００×２５ｍｍカラム，Ｖａｒｉａｎ製，溶離液としてのＴＨＦを５ｍＬ／ｍｉｎで使用）で生成し、遊離の色素分子を除去した。製造したＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＰＡ−ＴＭＲ）コポリマーを凍結乾燥し、さらなる調査のため−２０℃で貯蔵した。色素結合効率及び量子収率を文献記載の手順に従い測定した（Ｍａら，２０１４）。

【0284】

８．ミセルナノ粒子の作製
ミセルを以前の刊行物記載の手順に従い調製した。典型的手順において、１０ｍｇのＰＤＰＡ−ＴＭＲを０．５ｍＬのＴＨＦに溶解した。その後、混合物を４ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に超音波処理下にゆっくり加えた。混合物はマイクロ限界ろ過システムを用いて４回ろ過し、ＴＨＦを除去した。その後、蒸留水を加えてポリマー濃度を５ｍｇ／ｍＬに調節し、貯蔵溶液とした。マルチカラーハイブリッドナノ粒子のために、５ｍｇのＰＥＰＡ−ＢＤＹ、５ｍｇのＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及び５ｍｇのＰＤＢＡ−Ｃｙ５を１ｍＬのＴＨＦに溶解した。その後、同様の手順を、ハイブリッドナノ粒子を調製するために使用した。ナノ粒子は、ミセルサイズ及びモルホロジーについて透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ １２００ ＥＸ ｍｏｄｅｌ）により、流体力学直径（Ｄ_ｈ）について動的光散乱（ＤＬＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ，λ＝６３２ｎｍ）により特性評価された。

【0285】

Ｅｒｂｉｔｕｘ結合ハイブリッドナノプローブのために、４ｍｇのＰＥＰＡ−ＢＤＹ、４ｍｇのＰＤＰＡ−ＴＭＲ、４ｍｇのＰＤＢＡ−ＣＹ５、及び０．６ｍｇのＭＡＬ−ＰＥＧ−ＰＤＰＡを１ｍＬのＴＨＦに溶解した。その後、同様の手順をＭａｌ−ハイブリッドナノプローブを調製するために使用した。ミセル形成の後、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中の過剰量のＥｒｂｉｔｕｘ Ｆａｂ‘−ＳＨ断片（５５ｋＤ）を加えた。その結合物をＮ_２雰囲気下に一晩置き、その後６回限外ろ過し、遊離のＦａｂ’−ＳＨを除去した。得られたＥｒｂ結合ハイブリッドナノプローブを、細胞イメージング研究のために５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度に調節した。Ｅｒｂ結合ＰＤＰＡ−ＴＭＲミセルも同様の手順を用いて作製した。

【0286】

９．蛍光特性評価
異なるｐＨ緩衝溶液における蛍光発光スペクトルを日立蛍光光度計（Ｆ−７５００モデル）により得た。各ポリマーミセルのために、サンプル（５ｍｇ／ｍＬ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液として調製した。その後、溶液を、異なるｐＨ値を有する１００ｍＭのリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。最後のポリマー濃度は０．１ｍｇ／ｍＬに制御された。

【0287】

異なるポリマーが均一なハイブリッドミセルを形成することができるか否かを実証するため、本発明者等は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）実験を用いてハイブリッドミセルの蛍光特性を調査した。各ナノプローブのために、サンプル（５ｍｇ／ｍＬ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水溶液として調製した。溶液を、１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中の１００μｇ／ｍＬに希釈した。その後、ナノプローブを、適当な励起光（λ_ｅｘ＝４８５、５４５、及び６４０ｎｍ）で励起させ、そして発光スペクトルを集めた。

【0288】

異なるｐＨでのハイブリッドナノプローブ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光画像を、適当なバンドパス励起フィルタ及び適当なロングパス発光フィルタを用いてＭａｅｓｔｒｏインビボイメージングシステム（ＣＲＩ Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で記録した。

【0289】

１０．細胞培養
ヒト肺小細胞肺がんＡ５４９細胞及び頭頸部がんＨＮ５細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で、５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃で培養した。

【0290】

同じ肺がん患者から、腫瘍−由来（ＨＣＣ４０１７）及び正常細気管支上皮−由来（ＨＢＥＣ３０）の細胞株を得た。正常細気管支上皮細胞を、ＣＤＫ４及びｈＴＥＲＴの安定な発現により不死化し、ＨＢＥＣ３０ＫＴを製造した。ｐ５３（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３）の段階的安定な発現、ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ）の安定な発現、及びＬＫＢ１（ＨＢＥＣ３０ＫＴ−ｓｈＴＰ５３／ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｖ／ｓｈＬＫＢ１）の安定な抑制を有するＨＢＥＣ３０ＫＴ誘導体の一連の細胞株も得た。

【0291】

ＨＢＥＣ３０ＫＴ進行シリーズ及びＨＣＣ４０１７細胞は、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが追加されたＡＣＬ４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で、５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃で培養した。

【0292】

１１．生細胞におけるＥｒｂｉｔｕｘ−結合ハイブリッドナノプローブの多段活性化
Ａ５４９及びＨＮ５細胞を、２ｍＬの完全ＤＭＥＭ培地内のガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ，ＭＡ）に固定した。Ｅｒｂｉｔｕｘ−結合ハイブリッドナノプローブの特異性を試験するために、Ａ５４９細胞を、Ｅｒｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲを含む完全培地で３７℃にて１時間培養し、その後培地を除去して３回洗浄した。共焦点画像を、６０×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｅ共焦点顕微鏡で記録した。

【0293】

ハイブリッドナノプローブにおける３つの成分の同期摂取を実証するために、完全培地中のＡ５４９細胞を４℃で１０分間保持し、その後１００μｇ／ｍＬのＥｒｂ−結合ハイブリッドナノプローブを加えて、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合のために４℃で３０分間保持した。培地を除去して、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。その後細胞を完全培地で３７℃にて３時間培養した。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５を、それぞれ４８８、５４３、及び６３３ｎｍで励起させた。ＦＩＴＣ（５１５±１５ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（５９０±２５ｎｍ）及びＣｙ５（６５０ｎｍ ＬＰ）フィルタを、それぞれＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５イメージングに使用した。対照グループとして、ＰＥＰＡ−ＢＤＹ４９３、Ｅｒｂ−ＰＤＰＡ−ＴＭＲ、及びＰＤＢＡ−Ｃｙ５ミセルを作製し、混合しＡ５４９細胞で培養した。同様の手順をパルス・チェイス研究のために利用した。

【0294】

１２．Ｅｒｂｉｔｕｘ−結合ハイブリッドナノプローブを用いたエンドサイトーシス中におけるエンドソーム成熟の追跡
パルス・チェイス実験を、エンドソーム成熟プロセスを辿るために利用した。完全培地内の細胞を４℃で１０分間保持し、その後１００μｇ／ｍＬのＥｒｂ−結合ハイブリッドナノプローブを加えて、ＥＧＦＲ結合のために４℃で３０分間保持した。培地を除去し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を完全培地で３７℃にて培養した。共焦点画像を、ミセル添加後０、１５、３０、６０分、２．５及び５時間において、１００×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｅ共焦点顕微鏡で記録した。ＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５を、それぞれ４８８、５４３、及び６３３ｎｍで励起した。ＦＩＴＣ（５１５±１５ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（５９０±２５ｎｍ）及びＣｙ５（６５０ｎｍ ＬＰ）フィルタを、それぞれＢＤＹ４９３、ＴＭＲ、及びＣｙ５イメージングに使用した。画像はＩｍａｇｅ−Ｊソフトウェアで分析した。５つの独立した測定法は平均±標準偏差として表した。

【0295】

実施例１５：トリブロックコポリマーＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｒ_１−ｂ−Ｒ_２）の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｒ_１−ｂ−Ｒ_２）トリブロックを、以前報告された類似の手順の後ＡＴＲＰ法により合成した。ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｄ５Ａ−ｂ−ＤＥＡ）を、手順を説明する例として使用する。まず、Ｄ５Ａ−ＭＡ（０．５４ｇ，２ｍｍｏｌ）、ＰＭＤＥＴＡ（１２μＬ，０．０５ｍｍｏｌ）及びＭｅＯ−ＰＥＯ_１１４−Ｂｒ（０．２５ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を重合管に充填した。その後、２−プロパノール（１ｍＬ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を加えてモノマー及び開始剤を溶解した。凍結脱気を３サイクルして酸素を除去した後、ＣｕＢｒ（７ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下に重合管に添加し、管を真空で密封した。４０℃にて８時間の重合を行った後、酸素を除去したＤＥＡ−ＭＡ（０．３６８，２ｍｍｏｌ）を反応溶液に気密注射器により注入し、反応混合物を４０℃でさらに８時間撹拌した。重合化後、反応混合物は１０ｍＬのＴＨＦで希釈し、中性Ａｌ_２Ｏ_３カラムを通して触媒を除去した。ＴＨＦ溶剤はロータリーエバポレータで除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥して白色粉末を得た。ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ−ｂ−Ｄ５Ａ）はまたＤＥＡ及びＤ５Ａの供給順序を反転することにより合成した。ｐＨ滴定実験は、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（Ｄ５Ａ_４０−ｂ−ＤＥＡ_４０）またはＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＤＥＡ_４０−ｂ−Ｄ５Ａ_４０）の２つの際立ったイオン化転移を示した。対照的に、対応するランダムＰＲブロックコポリマーについては、１つのｐＨ転移のみが観察された（図１１３Ａ＆１１３Ｂ）。

【0296】

本明細書において開示され、特許請求の範囲に記載された組成物及び方法は全て、本開示を考慮することにより過度の実験なしに作製、実施することができる。本発明の組成物及び方法を特定の実施形態の観点から説明したが、本発明の概念、趣旨及び範囲を逸脱することなく、組成物及び方法に対して、並びに本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に対して、変更しても良いことは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連するある薬剤を本明細書に記載の薬剤に変更してももよく、それにより同一または同様の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなこのような同様の置換及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念の内にあると考えられる。

【0297】

参考文献
下記の参考文献は、本明細書の記載を補う手順の例または他の詳細をそれらが提供することができる程度で、参照により本明細書に具体的に取り込まれる。
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Ｚｏｎｃｕら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３４：６７８−６８３， ２０１１．

【図1】

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【図2】

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【図3】

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【図4】

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【図5】

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【図6】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12-1】

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【図12-2】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【図20】

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【図21】

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【図22】

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【図23】

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【図24】

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【図25】

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【図26】

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【図28】

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【図29】

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【図30】

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【図31】

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【図32】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【図37】

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【図38】

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【図39】

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【図40】

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【図41】

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【図42】

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【図43-1】

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【図43-2】

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【図44-1】

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【図44-2】

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【図45-1】

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【図45-2】

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【図46】

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【図47】

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【図48】

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【図49】

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【図50-1】

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【図50-2】

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【図51】

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【図52】

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【図53】

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【図54】

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【図55】

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【図56】

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【図57】

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【図58】

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【図59】

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【図60】

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【図61】

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【図62】

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【図63】

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【図64】

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【図65】

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【図66】

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【図67】

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【図68-1】

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【図68-2】

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【図69】

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【図70】

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【図71】

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【図72】

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【図73】

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【図74】

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【図75】

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【図76】

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【図77】

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【図78】

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【図78-3】

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【図79】

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【図80】

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【図81】

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【図82】

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【図83】

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【図84】

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【図85】

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【図86】

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【図87】

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【図88】

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【図89】

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【図90】

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【図91】

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【図92】

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【図93】

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【図94】

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【図95】

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【図96】

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【図97】

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【図98】

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【図99】

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【図100】

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【図101】

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【図102】

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【図103】

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【図104】

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【図105】

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【図106】

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【図107】

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【図108】

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【図109】

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【図110】

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【図111】

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【図112】

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【図113】

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【図114】

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