特許 6598425 疲労の評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6598425

(24)【登録日】2019年10月11日

(45)【発行日】2019年10月30日

(54)【発明の名称】疲労の評価方法

(51)【国際特許分類】

   A61B 5/16 20060101AFI20191021BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20191021BHJP

【ＦＩ】

   A61B5/16 200

   A61B5/16ZDM

   G01N33/483 F

【請求項の数】2

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-36554(P2014-36554)

(22)【出願日】2014年2月27日

(65)【公開番号】特開2015-159942(P2015-159942A)

(43)【公開日】2015年9月7日

【審査請求日】2017年2月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】高妻 和哉

(72)【発明者】

【氏名】三井 友毅

(72)【発明者】

【氏名】落合 龍史

(72)【発明者】

【氏名】片岡 洋祐

【審査官】 北島 拓馬

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０３０２１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１８３６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０１６１０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 久米 慧嗣，"水浸疲労負荷モデル動物におけるＴＣＡ回路および尿素回路内代謝物レベルの変化"，日本疲労学会誌，日本，日本疲労学会，２０１３年 ６月 ７日，第９巻，第１号，ｐ．８６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｂ ５／００− ５／０１

Ａ６１Ｂ ５／０６− ５／２２

Ｇ０１Ｎ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験者から採取された生体試料中のアザライン酸の濃度を測定し、当該生体試料中のアザライン酸の濃度と０．７８〜０．９６μｍｏｌ／Ｌである第１の閾値を比較し、アザライン酸の濃度が該閾値より高いと疲労度が高いと判定され、アザライン酸の濃度が該閾値未満であると疲労度が低いと判定される工程、
（ｂ）被験者から採取された生体試料中のピメリン酸の濃度を測定し、当該生体試料中のピメリン酸の濃度と１．１４〜１．２２μｍｏｌ／Ｌである第２の閾値を比較し、ピメリン酸の濃度が該閾値未満であると疲労度が高いと判定され、ピメリン酸の濃度が該閾値より高いと疲労度が低いと判定される工程、
（ｃ）被験者から採取された生体試料中の２−アミノ酪酸の濃度を測定し、当該生体試料中の２−アミノ酪酸の濃度と２２．５〜２７．３μｍｏｌ／Ｌである第３の閾値を比較し、２−アミノ酪酸の濃度が該閾値より高いと疲労度が高いと判定され、２−アミノ酪酸の濃度が該閾値未満であると疲労度が低いと判定される工程、
（ｄ）被験者から採取された生体試料中のシトルリンの濃度を測定し、当該生体試料中のシトルリンの濃度と３７．５μｍｏｌ／Ｌである第４の閾値を比較し、シトルリンの濃度が該閾値より高いと疲労度が高いと判定され、シトルリンの濃度が該閾値未満であると疲労度が低いと判定される工程、
から選択される１又は２以上の工程を含む、疲労の評価方法。

【請求項2】

生体試料が血液である請求項１記載の疲労の評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、疲労の評価方法及び疲労評価マーカーに関する。

【背景技術】

【0002】

疲労は、現代の社会に生きる人が日常向き合っている現象である。我が国で疲労感を自覚しているヒトの割合は、就労人口の約６０％以上とも云われている。
このような状況の中、疲労の指標化が望まれ、疲労のバイオマーカーの探索研究等が精力的になされてきた。

【0003】

例えば、特許文献１には、健常者と慢性疲労症候群の患者の間にグルコース、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、乳酸の量的差異が見られ、被験者の生体サンプル中のこれらの健常者の測定値に対する比率を算出し、疲労を評価する方法が報告されている。
また、特許文献２には、生体個体から分離した血液中の総アミノ酸、分岐鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸の濃度が所定の値より低い場合を精神疲労の疲労度が高いと評価し、グリシン、プロリン、アラニン、アスパラギン、リジン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の濃度が所定の値より低い場合を肉体疲労の疲労度が高いと評価し、トリプトファンの濃度が所定の値より低い場合を複合的疲労の疲労度として評価する方法が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１２−２４５５５号公報

【特許文献2】特許第３９２３５０７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、従来の技術は、半年以上続く慢性的な疲労を抱える者、すなわち慢性疲労症候群の病的な疲労や、一時的な肉体負荷・精神負荷を与えたときの急性の変化による疲労を評価対象としたもので、健常なヒトの、日々の生活や労働により生じる疲労を評価するものではなかった。
したがって、本発明は、健常者の日常の生活や労働で生じる疲労を客観的に評価するために有用なマーカーを特定し、当該マーカーを用いた疲労を評価するための方法を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題に鑑み、健常な労働者について、１週間分の疲労が蓄積していると認められた金曜日の血中成分と、疲労が回復していると認められた休養日後の月曜日の血中成分を比較したところ、これまで知られていなかった化合物の量的な変化が見られることを見出した。そして、当該特定の化合物が、健常者の日常の生活や労働で生じる疲労を客観的に評価するために有用なマーカーとなり得ることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、次の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験者から採取された生体試料中のアザライン酸の濃度を測定する工程、
（ｂ）被験者から採取された生体試料中のピメリン酸の濃度を測定する工程、
（ｃ）被験者から採取された生体試料中の２−アミノ酪酸の濃度を測定する工程、
（ｄ）被験者から採取された生体試料中のシトルリンの濃度を測定する工程、
より選ばれる１又は２以上の工程を含む、疲労の評価方法を提供するものである。
また、本発明は、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンより選ばれる１種又は２種以上からなる疲労評価マーカーを提供するものである。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、健常者の日常の生活や労働で生じる疲労を客観的に評価することができる。これにより、疲労度を的確に捉え、適切な人材を選択することや、状態に応じたアドバイスを与えることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の疲労の評価方法の概略フローチャートである。

【図2】疲労評価マーカーの代謝マップである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の疲労の評価方法の概略フローチャートであり、当該疲労の評価方法では、被験者から採取された生体試料の分析を行う。詳細には、次の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験者から採取された生体試料中のアザライン酸の濃度を測定する工程、
（ｂ）被験者から採取された生体試料中のピメリン酸の濃度を測定する工程、
（ｃ）被験者から採取された生体試料中の２−アミノ酪酸の濃度を測定する工程、
（ｄ）被験者から採取された生体試料中のシトルリンの濃度を測定する工程、
より選ばれる１又は２以上の工程を行う。
本発明において、疲労とは、肉体的及び精神的活動、又は疾病によって生じた独特の不快感と休養の願望を伴う身体の活動能力の減退状態を云い、疲労度とは該疲労の度合いをいう。
疲労は、前記のとおり、病的な疲労とそれ以外の生理的な疲労に分類されるが、本発明における疲労は病的な疲労ではなく、生理的な、肉体的及び精神的な疲労を含む複合疲労であることが好ましい。
すなわち、本発明の方法が適用される被験者は、健常者、更に健常労働者、更に健常なディスクワーカーであることが好ましい。

【0011】

本発明において、生体試料としては、例えば、血液（全血、血漿、血清等）、髄液、汗、尿、涙液、唾液等が挙げられる。なかでも、血液が好ましい。

【0012】

生体試料中のアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度を測定する方法は、従来公知の方法でよいが、後述する実施例に記載の方法に準ずる方法が好ましい。

【0013】

本発明では、被験者から採取された生体試料中のアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンから選ばれる少なくとも１種の濃度に基づいて疲労が評価される。好ましくは、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸、シトルリンの濃度の上昇或いは低下により被験者の疲労を評価することができる。この際、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンに関して予め所定の閾値を設定し、被験者の生体試料中の濃度と該所定の閾値を比較する工程を含むのが好ましい。

【0014】

後述するように、被験者の疲労度が高いと血中のアザライン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度は高くなり、一方、ピメリン酸の濃度は低くなることが見出された。したがって、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度は、被験者の疲労を反映する指標となり得る。
すなわち、アザライン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンについては、被験者から採取された生体試料中の濃度が高い場合、被験者の疲労度が高いと判定され、濃度が低い場合、被験者の疲労度が低いと判定される。
好ましくは、生体試料中のアザライン酸、２−アミノ酪酸又はシトルリンの濃度が、これらに関して予め設定した第１、第３又は第４の所定の閾値より高いと被験者の疲労度が高いと判定され、濃度が該第１、第３又は第４の所定の閾値未満であると被験者の疲労度が低いと判定される。
他方、ピメリン酸については、被験者から採取された生体試料中の濃度が低い場合、被験者の疲労度が高いと判定され、濃度が高い場合、被験者の疲労度が低いと判定される。
好ましくは、生体試料中のピメリン酸の濃度が、これに関して予め設定した第２の所定の閾値未満であると被験者の疲労度が高いと判定され、濃度が該第２の所定の閾値より高いと被験者の疲労度が低いと判定される。
閾値は、この値を超えると或いは満たないと疲労度が高い、疲労が蓄積していると判断される基準となる値である。

【0015】

閾値は、例えば、後述するＶＡＳ評価で「疲労あり」の被験者、「疲労なし」の被験者毎に、生体試料中の各成分についてＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）を作成し、該ＲＯＣ曲線を用いて設定することができる。

【0016】

この際、診査の信頼性を図る尺度である感度・特異度・有効度をそれぞれ任意に設定し、その割合に応じた閾値を設定することができる。
感度は、疲労感がある被験者が陽性となる割合（真陽性率）を意味し、特異度は疲労感のない被験者が陰性となる割合（真陰性率）を意味する。特異度が高くなるように閾値を設定すると偽陰性が多くなり、感度が低くなる。一方、感度が高くなるように設定すると偽陽性が多くなり、特異度は低くなる。そこで、閾値は、目的に応じて決定されるのが好ましい。

【0017】

閾値は、予想される疲労度に応じて変えるのが好ましい。
例えば、アザライン酸の閾値は好ましくは０．７８μｍｏｌ／Ｌ以上１．１μｍｏｌ／Ｌ以下に、更に好ましくは０．９６μｍｏｌ／Ｌに、ピメリン酸の閾値は好ましくは１．１４μｍｏｌ／Ｌ以上１．７２μｍｏｌ／Ｌ以下に、更に好ましくは１．２２μｍｏｌ／Ｌに、２−アミノ酪酸の閾値は、好ましくは２２．５μｍｏｌ／Ｌ以上２７．３μｍｏｌ／Ｌ以下に、更に好ましくは２４．９μｍｏｌ／Ｌ、シトルリンの閾値は３７．５μｍｏｌ／Ｌに設定することが好ましい。
疲労度が低いことが明らかな被験者の場合は、２−アミノ酪酸の閾値を２６．８μｍｏｌ／Ｌ、シトルリンの閾値を４３．４μｍｏｌ／Ｌに設定することがより好ましい。
また、疲労度が高いことが明らかな被験者の場合は、シトルリンの閾値を３２．７μｍｏｌ／Ｌに設定する。
例えば、後述する実施例では、アザライン酸の閾値を０．９６μｍｏｌ／Ｌとすると、感度、特異度共に１００％となり、有効度が１００％と極めて信頼性の高い評価法となる。また、ピメリン酸の閾値を１．２２μｍｏｌ／Ｌとすると、感度、特異度共に１００％となり、有効度が１００％と極めて信頼性の高い評価法となる。

【0018】

また、後述するように、被験者の疲労度が上昇すると血中のアザライン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度は高くなり、一方、ピメリン酸の濃度は低くなることが見出された。したがって、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度は、被験者の疲労の増減を判断する指標となり得る。すなわち、被験者から２回以上生体試料を採取し、これらの濃度の変化を検出することにより、被験者の疲労の上昇又は低下を判定することができる。
より詳しく述べると、被験者の生体試料をあらかじめ採取してアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンから選ばれる少なくとも１種の濃度を測定しておく。そして、疲労の増減を判断したいときに被験者から再び生体試料を採取する。ｎ回目（ｎは２以上の正の整数）に採取された生体試料中のアザライン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンについては、被験者から採取された生体試料中の濃度が対照とする基準時（１回目〜（ｎ−１）回目）より上昇した場合、被験者の疲労が上昇したと判定され、濃度が低下した場合、被験者の疲労が低下したと判定される。
他方、ピメリン酸については、被験者からｎ回目に採取された生体試料中の濃度が対照とする基準時より低下した場合、被験者の疲労が上昇したと判定され、濃度が上昇した場合、被験者の疲労が低下したと判定される。

【0019】

更に、本発明の疲労評価マーカー、すなわちアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンを指標とすれば、抗疲労物質がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ある物質によりアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンから選ばれる少なくとも１種の濃度が変動すれば、その物質は抗疲労物質となり得る。

【0020】

また、本発明の疲労評価マーカーを利用した疲労のメカニズムの解明等が期待できる。
疲労は画一の症状ではなく、疲労の原因や影響も多岐にわたることが知られている。一方、アザライン酸は、β酸化を受けてマロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡになりＴＣＡサイクルに入ることが知られている。ピメリン酸もβ酸化に関連する。また２−アミノ酪酸も、ＴＣＡサイクルに関連する。シトルリンは、尿素サイクルで生成されるアミノ酸である。これらのことから、疲労、ことに健常者の日常の生活や労働で生じる疲労はβ酸化やＴＣＡサイクル、尿素サイクルに影響すると想像できる。
したがって、本発明の疲労評価マーカー、すなわちアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンを指標とすれば、疲労が影響している代謝系を明らかにできる。すなわち、アザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンから選ばれる少なくとも１種の濃度が変動すれば、疲労が影響する代謝系を解明できる。疲労が影響する代謝系を明らかにすることにより、その疲労のメカニズムの解明等が期待でき、更に、疲労が影響した代謝系が明らかになれば、その疲労改善に有用な代謝系、更には生成系が予測でき、疲労の種類に応じた効果的な疲労改善が期待できる。

【実施例】

【0021】

最初に、閾値の設定に用いた計測、および本発明での計測における化合物の分析方法を示す。
シトルリン、２−アミノ酪酸等の血中（血漿）アミノ酸の分析は以下のアミノ酸分析方法に従った。
［試料の調製（前処理）］
生体試料（血漿）１０μＬを正確に測り、ＭａｓｓＴｒａｋ ＡＡＡ試薬１（ホウ酸バッファ）を７０μＬ添加し、攪拌後、ＭａｓｓＴｒａｋ ＡＡＡ試薬２を２０μＬ添加後に攪拌し、ヒートブロック（５５℃）で１０分加温しアミノ酸分析用試料とした。

【0022】

［アミノ酸分析条件］
システム： Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣR システム
カラム： ＭａｓｓＴｒａｋ^TM Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓカラム 内径２．１×長さ１５０ｍｍ
移動相Ａ： ＭａｓｓＴｒａｋ溶離液Ａ
移動相Ｂ： ＭａｓｓＴｒａｋ溶離液Ｂ
流量： ０．４ｍＬ／分
カラム温度： ４３℃
サンプル温度： ２０℃
サンプル注入量： １μＬ
検出： ＵＶ２６０ｎｍ

【0023】

アザライン酸、ピメリン酸等のアミノ酸以外の化合物の分析は以下のメタボローム解析方法に従った。
［試料の調製（前処理）］
生体試料（血漿）４０μＬを正確に測り、これに内部標準溶液４００μＬ（メチオニンスルホン、カンファースルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸をそれぞれ２０μｍｏｌ／Ｌ含む）を加える。混合後、クロロホルム４００μＬと超純水１２０μＬを加えて激しく混和後、遠心分離し水層を分取する。分取した水層を限外濾過（分画分子量 ５，０００）で除タンパク後、乾固する。乾固した試料を４０μＬの３−アミノピロリジン，トリメサート水溶液（各２００μＭ／Ｌ）に溶解し、メタボローム解析用の試料とした。

【0024】

［メタボローム解析（キャピラリー電気泳動／質量分析装置、ＣＥ／ＭＳ）条件］
システム： Ａｇｉｌｅｎｔ ＣＥ−ＴＯＦＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ
陽イオン性代謝物質測定モード
高性能キャピラリー電気泳動（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＨＰＣＥ）条件
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ： Ｆｕｓｅｄ−Ｓｉｌｉｃａ， 内径５０μｍ×長さ１００ｃｍ
Ｂｕｆｆｅｒ： １Ｍ Ｆｏｒｍａｔｅ
Ｖｏｌｔａｇｅ： Ｐｏｓｉｔｉｖｅ， ３０ｋＶ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ２０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ： Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ５０ｍｂａｒ， ５ｓｅｃ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５ｎＬ）
Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ： ４ｍｉｎ ａｔ ｒｕｎ ｂｕｆｆｅｒ

【0025】

飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ， ＴＯＦ−ＭＳ）条件
Ｐｏｌａｒｉｔｙ： Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ： ４，０００Ｖ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ： ７５Ｖ
Ｓｋｉｍｍｅｒ： ５０Ｖ
ＯＣＴ ＲＦＶ： ５００Ｖ
Ｄｒｙｉｎｇ ｇａｓ：Ｎ₂， １０Ｌ／ｍｉｎ
Ｄｒｙｉｎｇ ｇａｓ ｔｅｍｐ．：３００℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ ｇａｓ ｐｒｅｓｓ．： ７ｐｓｉｇ
Ｓｈｅａｔｈ ｌｉｑｕｉｄ： ５０％ＭｅＯＨ ／ Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０１Ｍ Ｈｅｘａｋｉｓ（２，２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｏｘｙ） ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ： １０Ｌ／ｍｉｎ
Ｌｏｃｋ ｍａｓｓ： ２ＭｅＯＨ¹³Ｃｉｓｏｔｏｐｅ ｍ／ｚ６６．０６３０６１，
Ｈｅｘａｋｉｓ（２，２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ ｍ／ｚ ６２２．０２８９６３

【0026】

陰イオン性代謝物質測定モード
高性能キャピラリー電気泳動（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＨＰＣＥ）条件
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ： ＣＯＳＭＯ（＋），内径５０μｍ×長さ１０５ｃｍ
Ｂｕｆｆｅｒ： ５０ｍＭ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ｐＨ８．５
Ｖｏｌｔａｇｅ： Ｎｅｇａｔｉｖｅ，３０ｋＶ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： ２０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ： Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ５０ｍｂａｒ， ３０ｓｅｃ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ３０ｎＬ）
Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ： ２ｍｉｎ ａｔ ５０ｍＭ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ｐＨ３．４ ａｎｄ ５ｍｉｎ ａｔ ｒｕｎ ｂｕｆｆｅｒ

【0027】

飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ， ＴＯＦ−ＭＳ）条件
Ｐｏｌａｒｉｔｙ： Ｎｅｇａｔｉｖｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ： ３，５００Ｖ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ： １００Ｖ
Ｓｋｉｍｍｅｒ ： ５０Ｖ
ＯＣＴ ＲＦＶ： ２００Ｖ
Ｄｒｙｉｎｇ ｇａｓ：Ｎ₂， １０Ｌ／ｍｉｎ
Ｄｒｙｉｎｇ ｇａｓ ｔｅｍｐ．： ３００℃
Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ ｇａｓ ｐｒｅｓｓ．： ７ｐｓｉｇ
Ｓｈｅａｔｈ ｌｉｑｕｉｄ：５ｍＭ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ ５０ ％ ＭｅＯＨ／Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１Ｍ Ｈｅｘａｋｉｓ（２，２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｏｘｙ） ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ： １０Ｌ／ｍｉｎ
Ｌｏｃｋ ｍａｓｓ：２ＣＨ₃ＣＯＯＨ¹³Ｃｉｓｏｔｏｐｅ ｍ／ｚ １２０．０３８３３９，
Ｈｅｘａｋｉｓ（２，２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ＋ＣＨ₃ＣＯＯＨ ｍ／ｚ ６８０．０３５５４１

【0028】

計測１（閾値設定）
〔対象者〕
週５日（月曜日〜金曜日勤務、週休２日（土曜日と日曜日））の日勤労働者（標準労働時間８：３０〜１７：００、１時間の昼休み含む）のうち、月曜日から金曜日の５日間の労働により疲労感があり、週末の休息で疲労感がなくなっていた４名の日勤労働者（以下「疲労あり」、４３〜５４歳、平均年齢４８．５±４．９歳）と月曜日から金曜日の５日間の労働により疲労感がない５名の労働者（以下「疲労なし」、２５〜４９歳、平均年齢３６．４±１０．５歳）を対象とした。

【0029】

〔疲労評価〕
１．ＶＡＳ評価
対象者の主観的な疲労の評価は、日本疲労学会の抗疲労臨床評価ガイドライン第５版（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｒｏｕｇａｋｋａｉ．ｃｏｍ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ｐｄｆ）の疲労感ＶＡＳ（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｃａｌｅ）検査方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｒｏｕｇａｋｋａｉ．ｃｏｍ／ＶＡＳ．ｐｄｆ）を利用した。
疲労感ＶＡＳ検査は、１００ｍｍの直線の左端（０ｍｍ）を「疲れを全く感じない」、右端（１００ｍｍ）を「何もできないほど疲れきっている」感覚として、今、感じている疲労感を、直線の左右両端に示した感覚を参考に１００ｍｍの直線上に示してもらう方法である。
ＶＡＳ検査は、試験初日の金曜日就寝時から、連続１０日間、毎日就寝時に実施し、２回実施した金曜日、土曜日、日曜日の結果は平均値で示した。
その結果、表１に示すように、「疲労あり」では、金曜日就寝時の数値が高く、金曜日に疲労が蓄積している状態と判断した。「疲労なし」では、数値の大きな上昇は認められず疲労が蓄積していない状態と判断した。

【0030】

【表1】

【0031】

２．血中濃度の測定
月曜日と金曜日の早朝の空腹時に採血した。「疲労あり」の金曜日の血液を「疲労」、「疲労あり」の月曜日の血液と「疲労なし」の金曜日の血液を「非疲労」とし、対象者から採取した血液中の表２に示す成分の濃度を測定した。血中（血漿）アミノ酸は、上述のアミノ酸自動分析により測定し、血中（血漿）有機酸は、上述のキャピラリー電気泳動／質量分析装置（ＣＥ／ＭＳ）により測定した。

【0032】

【表2】

【0033】

その結果、表２に示すように、「疲労」の血液中では、アザライン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンの濃度が増加し、反対にピメリン酸の濃度が減少していることが見出された。
また、「疲労」の血液中では、分岐鎖アミノ酸、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、芳香族アミノ酸、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、アルギニン、アスパラギン、メチオニン、リジンの濃度と２−アミノ酪酸／ロイシン比が増加し、他方、ピルピン酸、乳酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、総アミノ酸、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸の濃度が減少していることが見出された。
すなわち、これらの化合物は疲労の評価マーカーとして使える可能性がある。なかでもアザライン酸、ピメリン酸、２−アミノ酪酸及びシトルリンは、増加や減少の幅に比べて、測定されている疲労時あるいは非疲労時の数値の範囲が小さいので、適切な閾値を定めれば後述するようにその値をそのまま疲労の有無の判定に使うことができる。

【0034】

３．閾値の設定
「疲労」と「非疲労」の、それぞれの血中成分のＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）を作成し、表４に示す閾値を設定した。
この際、前述したように診査の信頼性を図る尺度である感度・特異度・有効度をそれぞれ設定し、それに応じた閾値を表４に示すように設定した。
具体的には疲労感がある被験者を確実に疲労有りとして検出するためには感度が１００％であることが好ましいので、感度１００％となる閾値を表４に示すように設定した。また、疲労感がない被験者を確実に疲労なしと判定するためには特異度が１００％であることが好ましいので特異度１００％となる閾値を２−アミノ酪酸及びシトルリンについて設定した。また、誤検出を少なくする閾値として、シトルリンについて３７．５μｍｏｌ／Ｌを設定した。
なお、感度・特異度・有効度の算出方法は表３のとおりである。

【0035】

【表3】

【0036】

【表4】

【0037】

表４に示すように、本発明によれば、的確に疲労を評価できることが確認された。例えば、アザライン酸の閾値を０．９６μｍｏｌ／Ｌとすると、感度、特異度共に１００％となり、疲労度が高いヒト、或いは疲労度が低いヒトを確実に抽出できた。
図２に、表２に示した各疲労評価マーカーの代謝マップを示す。疲労評価マーカーは、解糖系、ＴＣＡサイクル、尿素サイクル、β酸化等のエネルギー代謝系と神経伝達物質のカテコールアミン生成系等に関与していた。図２中、「↑」は濃度が増加したことを示し、「↓」は濃度が減少したことを示す。

【0038】

実施例１
〔対象者〕
週５日（月曜日〜金曜日勤務、週休２日（土曜日と日曜日））の日勤労働者（標準労働時間８：３０〜１７：００、１時間の昼休み含む）のうち、月曜日から金曜日の５日間の労働により疲労感があり、週末の休息で疲労感がなくなっていた４名の日勤労働者（以下、「疲労あり」、４３〜５４歳、平均年齢４８．５±４．９歳）を対象とした。

【0039】

〔疲労評価〕
１．ＶＡＳ評価
対象者の主観的な疲労の評価は、計測１と同様にＶＡＳ評価により行った。
その結果、表５に示すように、「疲労あり」の金曜日就寝時の数値が高く、金曜日に疲労が蓄積している状態と判断した。

【0040】

【表5】

【0041】

２．血中濃度の測定
計測１と同様にして、金曜日の早朝の空腹時に対象者から血液を採取し、計測１で定めた閾値に基づく、疲労評価の感度、特異度、有効度を求め、表６に示した。なお、本発明で用いない化合物についても、表中に、適宜閾値を設定して求めた感度、特異度、有効度を示す。

【0042】

【表6】

【0043】

その結果、良好な感度、特異度、有効度が示され、本発明の頑健性、汎用性が確認された。

【0044】

実施例２
〔対象者〕
週５日勤務（月〜金）、週休２日（土日休日）の日勤労働者（標準労働時間８：３０〜１７：００、１時間の昼休み含む）のうち、月曜日から金曜日の労働により疲労感がある４名の労働者（以下「疲労あり」、４３〜５４歳、平均年齢４８．５±４．９歳）と、疲労感がない５名の労働者（以下「疲労なし」、２５〜４９際、平均年齢３６．４±１０．５歳）を対象とした。

【0045】

〔疲労評価〕
１．ＶＡＳ評価
対象者の主観的な疲労の評価は、計測１と同様にＶＡＳ評価により行った。
その結果、表７に示すように、「疲労あり」の金曜日就寝時の数値が高く、金曜日に疲労が蓄積している状態と判断した。

【0046】

【表7】

【0047】

２．血中濃度の測定
計測１と同様にして、金曜日の早朝の空腹時に対象者から血液を採取し、計測１で定めた閾値に基づく、疲労評価の感度、特異度、有効度を求め、表８に示した。なお、本発明で用いない化合物についても、表中に、適宜閾値を設定して求めた感度、特異度、有効度を示す。

【0048】

【表8】

【0049】

その結果、良好な感度、特異度、有効度が示され、本発明の頑健性、汎用性が確認された。

【図1】

【図2】