特許 6603208 複数の細胞内シグナル伝達経路活性を用いた治療反応の医学的予後及び予測

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6603208

(24)【登録日】2019年10月18日

(45)【発行日】2019年11月6日

(54)【発明の名称】複数の細胞内シグナル伝達経路活性を用いた治療反応の医学的予後及び予測

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20191028BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20191028BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68

   C12N15/12

【請求項の数】9

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2016-509460(P2016-509460)

(86)(22)【出願日】2014年4月24日

(65)【公表番号】特表2016-519926(P2016-519926A)

(43)【公表日】2016年7月11日

(86)【国際出願番号】EP2014058326

(87)【国際公開番号】WO2014174003

(87)【国際公開日】20141030

【審査請求日】2017年4月21日

(31)【優先権主張番号】13165471.7

(32)【優先日】2013年4月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】590000248

【氏名又は名称】コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＮＩＮＫＬＩＪＫＥ ＰＨＩＬＩＰＳ Ｎ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100122769

【弁理士】

【氏名又は名称】笛田 秀仙

(74)【代理人】

【識別番号】100145654

【弁理士】

【氏名又は名称】矢ヶ部 喜行

(72)【発明者】

【氏名】フェルハーフ ウィルヘルムス フランシスクス ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ファン オーイェン ヘンドリク ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ファン デ ストルプ アンヤ

(72)【発明者】

【氏名】アルベス デ インダ マルシア

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０１１４７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１０４７６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 PAIK, S. et al.，THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE，２００４年１２月３０日，Vol.351, No.27，pp.2817-2826

【文献】 SU, J. et al.，PLOS ONE，２００９年１２月 ７日，Vol.4, No.12，e8161(pp.1-10)，DOI:10/1371/journal.pone.0008161

【文献】 LEE, E. et al.，PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY，２００８年１１月 ７日，Vol.4, No.11，e1000217(pp.1-9)，DOI:10.1371/journal.pcbi.1000217

【文献】 WEI, Z. et al.，BIOSTATISTICS，２００７年，Vol.8, No.2，pp.265-284，DOI:10.1093/biostatistics/kx1007

【文献】 OCHS, M.F. et al.，CANCER RES.，２００９年１２月 １日，Vol.69, No.23，pp.9125-9132，DOI:10.1158/008-5472.CAN-09-1709

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における三つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性スコアを、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定される前記細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、推定するステップと、
臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するステップとを有する方法であって、前記リスクスコアは前記推定された活性スコアの組み合わせに基づき、
前記細胞内シグナル伝達経路が、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路及びＨＨ経路を有し、
前記臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクが、増加するＰ_ＥＲとともに減少し、増加するｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）とともに増加するように前記リスクスコアが定義され、
Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨがそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の前記推定された活性スコアをあらわし、
前記臨床イベントが乳癌の再発であり、
前記推定するステップが、
ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＷｎｔ経路の活性スコアを推定するステップ、
ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、及びＡＰ１Ｂ１から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＥＲ経路の活性スコアを推定するステップ、並びに
ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＨＨ経路の活性スコアを推定するステップ、
を有し、
前記推定された活性スコアの組み合わせが式
−α・Ｐ_ＥＲ＋β・ｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）
を有し、
α及びβは非負定数スケーリングファクタであり、前記臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクは当該式の増加する値とともに単調増加する、方法。

【請求項2】

前記推定するステップがさらに、
ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２から成る群から選択される前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベル、及び／又は、
ＲＡＲＡ、ＭＹＣ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＳＤ、ＫＲＴ１９、ＨＳＰＢ１、ＴＲＩＭ２５、ＰＴＭＡ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＤＨ２６、ＮＤＵＦＶ３、ＰＲＤＭ１５、ＡＴＰ５Ｊ、及びＥＳＲ１から成る群から選択される前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベル、及び／又は、
ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１から成る群から選択される前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベル、
に基づく、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記臨床イベントが所定期間内に発生する、異なる示されたリスクと関連する複数のリスクグループの少なくとも一つに前記被検体を割り当てるステップ、
をさらに有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液におけるＷｎｔ経路の活性スコアを推定するステップ、及び／又は、
前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液におけるＥＲ経路の活性スコアを推定するステップ、及び／又は、
前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／体液におけるＨＨ経路の活性スコアを推定するステップ、
を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子のセットが、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６，及びＦＺＤ７から成る群から選択される少なくとも９の標的遺伝子を含み、及び／又は、
前記ＥＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２，及びＡＰ１Ｂ１から成る群から選択される少なくとも９の標的遺伝子を含み、及び／又は、
前記ＨＨ経路の標的遺伝子のセットが、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ，及びＣＴＳＬ１から成る群から選択される少なくとも９の標的遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｗｎｔ経路の標的遺伝子のセットが、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含み、及び／又は、
前記ＥＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＲＡＲＡ、ＭＹＣ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＳＤ、ＫＲＴ１９、ＨＳＰＢ１、ＴＲＩＭ２５、ＰＴＭＡ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＤＨ２６、ＮＤＵＦＶ３、ＰＲＤＭ１５、ＡＴＰ５Ｊ、及びＥＳＲ１から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含み、及び／又は、
前記ＨＨ経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１，及びＴＯＭ１から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含む、
請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記リスクスコア及び／又は前記推定される活性スコアの少なくとも一つを、一つ以上の追加予後検査から得られる一つ以上の追加リスクスコアと組み合わせて複合リスクスコアを得るステップをさらに有し、当該複合リスクスコアは前記臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示す、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における三つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性スコアを、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定される前記細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、推定する推定ユニットと、
臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定する決定ユニットと、
を有する装置であって、前記リスクスコアは前記推定された活性スコアの組み合わせに基づき、
前記細胞内シグナル伝達経路が、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路及びＨＨ経路を有し、
前記臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクが、増加するＰ_ＥＲとともに減少し、増加するｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）とともに増加するように前記リスクスコアが定義され、
Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨがそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の前記推定された活性スコアをあらわし、
前記臨床イベントが乳癌の再発であり、
前記推定ユニットが、
ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＷｎｔ経路の活性スコアを推定し、
ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、及びＡＰ１Ｂ１から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＥＲ経路の活性スコアを推定し、並びに
ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１から成る群から選択される、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて、前記被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＨＨ経路の活性スコアを推定し、
前記推定された活性スコアの組み合わせが式
−α・Ｐ_ＥＲ＋β・ｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）
を有し、
α及びβは非負定数スケーリングファクタであり、前記臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクは当該式の増加する値とともに単調増加する、装置。

【請求項9】

コンピュータにより実行されて、当該コンピュータに請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法を実行させる、コンピュータプログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に記載の主題は主にバイオインフォマティクス、ゲノムプロセシング技術、プロテオームプロセシング技術、及び関連技術に関する。

【背景技術】

【0002】

ゲノム解析及びプロテオーム解析は、様々な癌が、癌の成長と進化、例えば細胞増殖及び転移に関与する、ゲノム突然変異／変異／異常メチル化パターン及び／又は特定遺伝子の高若しくは低発現レベルの特異的組み合せと関連することが知られている、オンコロジーなどの医療分野における臨床応用にとって、実質的な実現された潜在的将来性を持つ。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路は細胞増殖の調節（レギュレーション）に影響し、高度に調節される。調節の欠失に起因する高Ｗｎｔ経路活性は、癌、その中でも悪性結腸腫瘍を伴う癌と関連付けられている。いかなる特定の動作理論にも限定されないが、悪性結腸細胞におけるＷｎｔ経路の脱調節（ディレギュレーション）は高Ｗｎｔ経路活性につながり、これはひいては悪性結腸細胞の細胞増殖を、すなわち結腸癌の転移を引き起こす。他方で、例えば骨粗しょう症の場合、異常に低い経路活性も関心が高い。健康状態及び疾患における細胞分裂、機能及び／又は分化において同様の役割を果たす他の経路は、細胞内シグナル伝達経路である（例えばＥＲ、ＰＲ、ＡＲ、ＰＰＡＲ、ＧＲ、ＶｉｔＤ、ＴＧＦｂｅｔａ、Ｎｏｔｃｈ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＦＧＦ、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＶＥＧＦ、及びＰＤＧＦ）。

【0003】

ゲノム及びプロテオームデータを取得するための技術は臨床背景で容易に利用可能になっている。例えば、マイクロアレイによる測定は遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、メチル化などを評価するために日常的に利用される。自動遺伝子シークエンシングはＤＮＡ及びｍＲＮＡにおける遺伝子変異／突然変異／異常メチル化パターンのコスト効率のよい同定を可能にする。遺伝子シークエンシング中のｍＲＮＡレベルの定量的評価は遺伝子発現レベルを評価するための臨床的手段として有望である。

【0004】

治療専門家、例えば腫瘍専門医にとっての主要な課題の一つは、患者の予後について知識に基づいて推測することであり、なぜならこの情報は治療選択に影響を及ぼすからである。個々の患者のがん組織標本ベースのゲノミクス、トランスクリプトミクス、及びプロテオミクス（及び他の"オーミクス"）解析は患者の予後評価に寄与する可能性がある情報を提供する。しかしながら関連する臨床情報を引き出すためのこれらの複雑なデータの解釈は、まだ大部分未解決の課題であることが証明されている。患者の予後は例えば"再発までの期間"、又は"転移までの期間"、又は"生存期間"、又は"疾患若しくは治療に起因する死亡リスク"など、いくつかの方法で定量的に示され得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は本明細書に開示の通り新規の改良された方法と装置を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の主要態様によれば、上記問題は臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するための具体的方法によって解決され、すなわち方法は、
被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性を、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定される細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップと、
臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するステップとを有し、リスクスコアは推定される活性の組み合わせに少なくとも一部基づき、
細胞内シグナル伝達経路はＷｎｔ経路、ＥＲ（エストロゲン受容体）経路、ＨＨ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路、及び／又はＡＲ（アンドロゲン受容体）経路を有し、
細胞内シグナル伝達経路はＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路を有し、リスクスコアは臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクが、増加するＰ_ＥＲとともに減少し、増加するｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）とともに増加するように定義され、
Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨはそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の推定される活性をあらわす。

【0007】

被検体は人若しくは動物、特に医学的被検体であり得る。さらに、"標的遺伝子"は"直接標的遺伝子"及び／又は"間接標的遺伝子"であり得る（本明細書に記載の通り）。

【0008】

Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＨＨ経路、及びＡＲ経路は好適には経路と関連する転写因子（ＴＦ）複合体の転写活性に最終的につながる細胞内シグナル伝達経路と定義される。好適には、これらは少なくともβ‐カテニン／ＴＣＦ４、ＥＲαダイマー、ＧＬＩファミリーメンバー、及びＡＲからそれぞれ構成される。

【0009】

被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における細胞内シグナル伝達経路の活性の推定は、例えばとりわけ、（ｉ）被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液において（例えば組織スライド若しくは細胞上での染色）又は被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定される細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルを少なくとも含む入力のセットについて細胞内シグナル伝達経路をあらわす、確率モデルの少なくとも一部、好適にはベイジアンネットワークを評価すること、（ｉｉ）少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）要素の被検体の組織中のレベルを推測すること、当該少なくとも一つのＴＦ要素は細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の転写を制御し、推定は被検体の抽出サンプルにおいて測定される細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルと少なくとも一つのＴＦ要素を関連付ける条件付き確率に少なくとも一部基づく、並びに（ｉｉｉ）転写因子の組織サンプル及び／又は細胞サンプル及び／又は体液サンプルにおける推定レベルに基づいて細胞内シグナル伝達経路の活性を推定することによって、実行され得る。これは公開欧州特許出願ＥＰ２５４９３９９Ａ１（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ"）に、及び特に公開国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"）に詳細に記載され、その内容はその全体が本明細書に引用される。

【0010】

代替例において、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の活性の推定は、とりわけ（ｉ）被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて転写因子（ＴＦ）要素のレベルを決定すること、当該ＴＦ要素は細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の転写を制御し、当該決定は細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルをＴＦ要素のレベルに関連付ける数学モデルを評価することに少なくとも一部基づき、当該モデルは一つ以上の標的遺伝子の発現レベルの一つ以上の線形結合に少なくとも一部基づく、並びに（ｉｉ）被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおけるＴＦ要素の決定されたレベルに基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における細胞内シグナル伝達経路の活性を推定することによって、実行され得る。これは未公開米国仮特許出願ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張する未公開国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ"）に詳細に記載される。

【0011】

好適には、細胞内シグナル伝達経路は癌に関与する少なくとも一つの細胞内シグナル伝達経路を有する。

【0012】

細胞内シグナル伝達経路がＷｎｔ経路及び／又はＨＨ経路を有し、リスクスコアが、臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクがＷｎｔ経路の増加する推定活性及び／又はＨＨ経路の増加する推定活性を伴って単調増加するように定義される方法が特に好適である。

【0013】

また、細胞内シグナル伝達経路がＥＲ経路を有し、リスクスコアが、臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクがＥＲ経路の増加する推定活性を伴って単調減少するように定義される方法も特に好適である。

【0014】

推定活性の組み合わせが式
−α・Ｐ_ＥＲ＋β・ｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ）
を有し、Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨがそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の推定活性をあらわし、α及びβは非負定数スケーリングファクタであり、臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクは増加する発現の値とともに単調増加する方法がさらに好適である。

【0015】

推定するステップが、
ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６及びＦＺＤ７から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の一つ以上の、好適には少なくとも三つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＷｎｔ経路の活性を推定すること、並びに／或いは、
ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２及びＡＰ１Ｂ１から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の一つ以上の、好適には少なくとも三つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＥＲ経路の活性を推定すること、並びに／或いは、
ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ及びＣＴＳＬ１から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の一つ以上の、好適には少なくとも三つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＨＨ経路の活性を推定すること、並びに／或いは
ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＡＲ経路の一つ以上の、好適には少なくとも三つの標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＡＲ経路の活性を推定すること
を有する方法が特に好適である。

【0016】

推定するステップがさらに、
ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ及びＬＥＣＴ２から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベルに、並びに／或いは
ＲＡＲＡ、ＭＹＣ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＳＤ、ＫＲＴ１９、ＨＳＰＢ１、ＴＲＩＭ２５、ＰＴＭＡ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＤＨ２６、ＮＤＵＦＶ３、ＰＲＤＭ１５、ＡＴＰ５Ｊ、及びＥＳＲ１から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベルに、並びに／或いは
ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベルに、並びに／或いは
ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２から成る群から選択される被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＡＲ経路の少なくとも一つの標的遺伝子の発現レベルに
基づく方法がさらに好適である。

【0017】

本発明の別の態様は、
臨床イベントが所定期間内に発生する異なる示されたリスクと関連する複数のリスクグループの少なくとも一つに被検体を割り当てるステップ、及び／又は
臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクに少なくとも一部基づいて被検体にとって推奨される治療を決定するステップ
をさらに有する（本明細書に記載の）方法に関する。

【0018】

本発明はまた、
被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＷｎｔ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＷｎｔ経路の活性を推定するステップ、並びに／或いは
被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＥＲ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＥＲ経路の活性を推定するステップ、並びに／或いは
被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＨＨ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＨＨ経路の活性を推定するステップ、並びに／或いは
被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定されるＡＲ経路の標的遺伝子のセットの二つ、三つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液におけるＡＲ経路の活性を推定するステップ
を有する（本明細書に記載の）方法にも関する。

【0019】

好適には、
Ｗｎｔ経路の標的遺伝子のセットは、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、及びＦＺＤ７から成る群から選択される少なくとも９の、好適には全標的遺伝子を含む、並びに／或いは、
ＥＲ経路の標的遺伝子のセットは、ＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、及びＡＰ１Ｂ１から成る群から選択される少なくとも９の、好適には全標的遺伝子を含む、並びに／或いは、
ＨＨ経路の標的遺伝子のセットは、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、及びＣＴＳＬ１から成る群から選択される少なくとも９の、好適には全標的遺伝子を含む、並びに／或いは、
ＡＲ経路の標的遺伝子のセットは、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ、及びＥＡＦ２から成る群から選択される少なくとも９の、好適には全標的遺伝子を含む。

【0020】

Ｗｎｔ経路の標的遺伝子のセットが、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、及びＬＥＣＴ２から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含む、並びに／或いは、
ＥＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＲＡＲＡ、ＭＹＣ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＳＤ、ＫＲＴ１９、ＨＳＰＢ１、ＴＲＩＭ２５、ＰＴＭＡ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＤＨ２６、ＮＤＵＦＶ３、ＰＲＤＭ１５、ＡＴＰ５Ｊ、及びＥＳＲ１から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含む、並びに／或いは、
ＨＨ経路の標的遺伝子のセットが、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、及びＴＯＭ１から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含む、並びに／或いは、
ＡＲ経路の標的遺伝子のセットが、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１、及びＴＡＣＣ２から成る群から選択される少なくとも一つの標的遺伝子をさらに含む、
方法が特に好適である。

【0021】

本発明に従って使用される（複数の）サンプルは、例えば癌病変から、又は癌の疑いのある病変から、又は転移性腫瘍から、又は癌細胞で汚染された流体が存在する体腔（例えば胸腔若しくは腹腔若しくは膀胱腔）から、又は癌細胞を含む他の体液などから、好適には生検法若しくは他の標本採取法によって得られるサンプルであり得る。サンプルが抽出される細胞は血液悪性腫瘍（白血病若しくはリンパ腫など）からの腫瘍性細胞でもあり得る。場合によっては、細胞サンプルは循環腫瘍細胞、つまり血流に入り、適切な分離技術、例えばアフェレーシス若しくは従来の静脈血採血を用いて抽出され得る腫瘍細胞でもあり得る。血液は別として、サンプルが抽出される体液は尿、胃腸内容物、若しくは溢出物であり得る。本明細書で使用される"抽出サンプル"という語は、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液が被検体から採取されている、並びに例えば顕微鏡スライド上に置かれている場合、並びに請求される方法を実行するためにこのサンプルの一部が例えばレーザキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を用いて、若しくはスライドから関心細胞をスクレイプオフすることによって、若しくは蛍光活性化セルソーティング法によって抽出される場合も包含する。

【0022】

リスクスコア及び／又は推定活性の少なくとも一つを、一つ以上の追加予後検査から得られる一つ以上の追加リスクスコアと組み合わせて複合リスクスコアを得るステップをさらに有し、複合リスクスコアは臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示す方法がさらに好適である。一つ以上の追加予後検査は、特に、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）乳癌検査、Ｍａｍｍｏｓｔｒａｔ（登録商標）乳癌検査、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）乳癌検査、ＢｌｕｅＰｒｉｎｔ（商標）乳癌検査、ＣｏｍｐａｎＤｘ（登録商標）乳癌検査、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｄｅｘ（サービスマーク）（ＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ）、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）結腸癌検査、及び／又は遺伝子／タンパク質Ｋｉ６７の発現を測定することによって実行される増殖検査を有し得る。

【0023】

優先的に、臨床イベントは癌、特に乳癌である。そして臨床イベントが所定期間内に発生するリスクは優先的には再発のリスク、すなわち治療後の癌の再発のリスクである。これは局所再発（すなわち原発腫瘍側）若しくは異所再発（すなわち原発腫瘍側を超える転移）のいずれかであり得る。代替的に、リスクは疾患の進行若しくは死亡のリスクであり得る。

【0024】

別の開示の態様によれば、装置は本明細書に記載の発明にかかる方法を実行するように構成されるデジタルプロセッサを有する。

【0025】

別の開示の態様によれば、非一時的記憶媒体は本明細書に記載の発明にかかる方法を実行するためにデジタル処理装置によって実行可能な命令を記憶する。非一時的記憶媒体はハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光学ディスク若しくは他の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは他の電子記憶媒体、ネットワークサーバなどといったコンピュータ可読記憶媒体であり得る。デジタル処理装置は携帯端末（例えばパーソナルデータアシスタント若しくはスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、リモートネットワークサーバなどであり得る。

【0026】

別の開示の態様によれば、コンピュータプログラムはデジタル処理装置に本明細書に記載の発明にかかる方法を実行させるためのプログラムコード手段を有する。デジタル処理装置は携帯端末（例えばパーソナルデータアシスタント若しくはスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、リモートネットワークサーバなどであり得る。

【0027】

別の開示の態様によれば、信号は臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアをあらわし、リスクスコアは本明細書に記載の発明にかかる方法を実行することから得られる。信号はアナログ信号であり得るか若しくはデジタル信号であり得る。

【0028】

一つの利点は、例えばＷｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路及び／又はＨＨ経路の確率モデル若しくは別の数学モデルを用いて、二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の分析に基づいて、特に細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づくリスクスコアによって示される、臨床イベント、例えば癌、特に乳癌が所定期間内に発生するリスクに基づいて、例えば被検体のための治療を決定することによって、臨床的勧告を提供するように構成される臨床決定支援（ＣＤＳ）システムにある。

【0029】

別の利点は、一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づくリスクスコアによって示される、臨床イベント、例えば癌、特に乳癌が所定期間内に発生する異なるリスクと関連する複数のリスクグループの少なくとも一つに被検体を割り当てるように構成されるＣＤＳシステムにある。

【0030】

別の利点は、臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示す、一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づくリスクスコアを、一つ以上の追加予後検査から得られる一つ以上の追加リスクスコアと組み合わせることにある。

【0031】

本明細書に記載の本発明は、例えば
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づく予後予測、
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づく例えば化学療法及び／又はホルモン療法の薬効の予測、
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づく薬効のモニタリング、
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づく薬剤開発、
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づくアッセイ開発、並びに／或いは
一つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに一部基づく癌のステージング
と関連して有利に使用されることもできる。

【0032】

さらなる利点は添付の図面、以下の記載及び特に本明細書で以下に提供される詳細な実施例を読んで理解することで当業者に明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ２１６５３、及びＥ‐ＭＴＡＢ‐３６５由来の、様々な乳癌患者のセット（ｎ＝１２９４）についてα＝１及びβ＝１で式（７）を用いて計算されるＭＰＳのヒストグラムを示す。

【図2】ＧＳＥ６５３２及びＧＳＥ９１９５において報告されている外科手術及びアジュバントホルモン療法で治療されるＥＲ陽性患者における無再発生存のＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロットを示す。患者群はＭＰＳ、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）再発スコア（ＲＳ）に基づく高リスク層別化、及び両スコア（ＭＰＳ＆ＲＳ）についての高リスク層別化に基づいて分類された。

【図3】Ｅ‐ＭＴＡＢ‐３６５において報告されている原発性乳癌患者における無再発生存のＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロットを示す。患者群は本明細書に記載の多経路スコアに基づくリスク層別化アルゴリズムに基づいて分類された。ログランク検定を用いて低リスク患者群と高リスク患者群の間でｐ値が計算された。

【図4】ＧＳＥ２０６８５において報告されている様々な乳癌患者群における無再発生存のＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロットを示す。患者群は本明細書で提供される多経路スコアに基づくリスク層別化アルゴリズムに基づいて分類された。報告されたｐ値はログランク検定を用いて低リスク患者群と高リスク患者群の間で計算された。

【図5】ＧＳＥ２１６５３において報告されている早期乳癌患者群における無再発生存のＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロットを示す。患者群は本明細書で提供される多経路スコアに基づくリスク層別化アルゴリズムに基づいて分類された。報告されたｐ値はログランク検定を用いて低リスク患者群と高リスク患者群の間で計算された。

【図6】本明細書に開示の、臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するように構成される臨床決定支援（ＣＤＳ）システムを図示する。

【図7】二つの異なって決定されたリスクスコアを比較する実験からの結果を図示するプロットを示す。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下の実施例は特に好適な方法及びそれと関連する選択された態様を例示するに過ぎない。そこで提供される教示は複数の試験及び／又はキットを構成するために使用され得る。以下の実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されないものとする。

【実施例1】

【0035】

実施例１：二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性の推定
公開欧州特許出願ＥＰ２５４９３９９Ａ１（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ"）及び、特に公開国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"）に詳細に記載の通り、確率モデル（例えばベイジアンモデル）を構築し、複数の異なる標的遺伝子の発現レベルと細胞内シグナル伝達経路の活性との間の従来の確率的関係を組み込むことによって、かかるモデルは高精度で細胞内シグナル伝達経路の活性を決定するために使用されることができる。さらに、条件付き確率を調節すること及び／又は追加情報源をあらわす新たなノードをモデルに追加することによって、確率モデルは後の臨床研究によって得られる追加知識を組み込むように容易に更新されることができる。このように、確率モデルは最新の医学的知識を具体化するように必要に応じて更新されることができる。

【0036】

各経路の標的遺伝子は好適にはＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２のセクション"Ｅｘａｍｐｌｅ ３：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ"及び"Ｅｘａｍｐｌｅ ４：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ ｌｉｓｔ ａｎｄ ｂｒｏａｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｌｉｓｔ"に記載の方法に従って選択され、確率モデルは好適にはＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２の"Ｅｘａｍｐｌｅ ５：Ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ"に記載の方法に従って訓練され得る。例示的なＷｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路及び／又はＨＨ経路の活性を決定するために使用される標的遺伝子の適切な選択は添付の請求項に定義される。

【0037】

未公開米国仮特許出願ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張する未公開国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ"）に詳細に記載される別の理解及び解釈が容易なアプローチにおいて、特定の細胞内シグナル伝達経路の活性は、細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベルと転写因子（ＴＦ）要素のレベルの関係を組み込む数学モデル（例えば線形若しくは（擬似）線形モデル）を構築することによって決定され、ＴＦ要素は細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の転写を制御し、モデルは一つ以上の標的遺伝子の発現レベルの一つ以上の線形結合に少なくとも一部基づく。

【0038】

この後者のアプローチに関して、一つ以上の標的遺伝子の発現レベルは好適にはｍＲＮＡのレベルの測定であり得、これは例えば標的遺伝子ｍＲＮＡシーケンスと関連するプローブを用いる（ＲＴ）‐ＰＣＲ及びマイクロアレイ法の、並びにＲＮＡシークエンシングの結果であり得る。別の実施形態において一つ以上の標的遺伝子の発現レベルはタンパク質レベル、例えば標的遺伝子によってコードされるタンパク質の濃度によって測定され得る。

【0039】

上述の発現レベルはオプションとして、アプリケーションにより適しているかどうかわからない多くの方法で変換され得る。例えば、発現レベル、例えばマイクロアレイベースのｍＲＮＡレベルの四つの異なる変換は以下の通りであり得る。
‐"連続データ"、すなわちＭＡＳ５．０及びｆＲＭＡなどの周知のアルゴリズムを用いてマイクロアレイの前処理後に得られる発現レベル、
‐"ｚ‐スコア"、すなわち全サンプル平均が０であり標準偏差が１になるようにスケールされる連続発現レベル、
‐"離散"、すなわち所定閾値を超える全発現レベルは１に、それを下回る全発現レベルは０に設定される（例えば、プローブセットに対する閾値はある数の陽性臨床サンプルと同数の陰性臨床サンプルのセットにおけるその値の中央値として選ばれ得る）、
‐"ファジー"、すなわち連続発現レベルは以下のフォーマットのシグモイド関数を用いて０と１の間の値に変換される：１／（１＋ｅｘｐ（（ｔｈｒ−ｅｘｐｒ）／ｓｅ））、ｅｘｐｒは連続発現レベル、ｔｈｒは前述の閾値、ｓｅは０と１の間の差に影響する軟化パラメータである。

【0040】

構築され得る最も単純なモデルの一つは、第一層において転写因子（ＴＦ）要素をあらわすノードと、第二層において例えばマイクロアレイ若しくは（ｑ）ＰＣＲ実験における例えば特定標的遺伝子と特に高度に相関する一つのプローブセットによる、標的遺伝子発現強度レベルの直接測定をあらわす重み付きノードを持つモデルである。重みは訓練データセットからの計算に基づくか若しくは専門知識に基づき得る。標的遺伝子あたり複数の発現レベルが測定される可能性がある場合（例えば一つの標的遺伝子が複数のプローブセットで測定され得るマイクロアレイ実験の場合）、標的遺伝子あたり一つの発現レベルのみを使用するこのアプローチは特に単純である。特定標的遺伝子について使用される一つの発現レベルを選択する具体的方法は、訓練データセットの活性サンプルと不活性サンプルを最もよく分離することができるプローブセットからの発現レベルを使用することである。このプローブセットを決定する一つの方法は統計的検定、例えばｔ検定を実行し、最低ｐ値を持つプローブセットを選択することである。最低ｐ値を持つプローブの訓練データセットの発現レベルは定義により（既知の）活性サンプルと不活性サンプルの発現レベルが重なる最も起こりにくい確率を持つプローブである。別の選択法はオッズ比に基づく。かかるモデルでは、一つ以上の発現レベルが一つ以上の標的遺伝子の各々について与えられ、一つ以上の線形結合は一つ以上の標的遺伝子の各々について重み付き項を含む線形結合を有し、各重み付き項は各標的遺伝子について与えられる一つ以上の発現レベルのただ一つの発現レベルに基づく。上記の通り標的遺伝子あたりただ一つの発現レベルが選ばれる場合、モデルは"最尤判別プローブセット"モデルとよばれ得る。

【0041】

"最尤判別プローブセット"モデルの代替案において、標的遺伝子あたり複数の発現レベルが測定される可能性がある場合、標的遺伝子あたり与えられる全発現レベルを利用することが可能である。かかるモデルでは、一つ以上の発現レベルが一つ以上の標的遺伝子の各々について与えられ、一つ以上の線形結合は一つ以上の標的遺伝子について与えられる一つ以上の発現レベルの全発現レベルの線形結合を有する。言い換えれば、一つ以上の標的遺伝子の各々について、各標的遺伝子について与えられる一つ以上の発現レベルの各々はその独自の（個々の）重みによって線形結合において重み付けされ得る。この変形例は"全プローブセット"モデルとよばれ得る。これは与えられる発現レベル全てを利用しながら比較的単純であるという利点を持つ。

【0042】

上記両モデルは、ＴＦ要素のレベルが発現レベルの線形結合に基づいて計算される"単層"モデルとみなされ得るものであるという共通点を持つ。

【0043】

各モデルを評価することによってＴＦ要素のレベルが決定された後、決定されたＴＦ要素レベルは細胞内シグナル伝達経路の活性を推定するために閾値化され得る。かかる適切な閾値を計算する方法は不活性経路を持つとわかっている訓練サンプルと活性経路を持つ訓練サンプルの決定されたＴＦ要素レベルｗｌｃを比較することによる。そのようにし、またこれらの群における分散も考慮する方法は次の閾値を用いることによって与えられる。

【数1】

σとμは訓練サンプルの標準偏差と算術平均（ｍｅａｎ）である。活性及び／又は不活性訓練サンプルにおいて少数のサンプルのみが利用可能である場合、二つの群の分散の平均（ａｖｅｒａｇｅ）に基づいて計算された分散に擬似カウントが加算され得る。

【数2】

νは群の分散でありχは正の擬似カウントである。標準偏差σは次に分散νの平方根をとることによって得られる。

【0044】

閾値は解釈を簡単にするためにＴＦ要素の決定されたレベルｗｌｃから減算され、負の値が不活性細胞内シグナル伝達経路に対応し、正の値が活性細胞内シグナル伝達経路に対応するように細胞内シグナル伝達経路の活性スコアをもたらす。

【0045】

上記"単層"モデルの代替案として、経路の活性シグナル伝達の実験的決定をあらわす"二層"モデルが使用され得る。全標的遺伝子についてその関連プローブセットの測定強度に基づく線形結合を用いてサマリレベルが計算される（"第一（底）層"）。計算されたサマリ値はその後追加線形結合を用いて経路の他の標的遺伝子のサマリ値と組み合わされる（"第二（上）層"）。重みは訓練データセットから学習されるか若しくは専門知識に基づくか若しくはその組み合わせであり得る。言い換えれば、"二層"モデルにおいて、一つ以上の発現レベルが一つ以上の標的遺伝子の各々について与えられ、一つ以上の線形結合は一つ以上の標的遺伝子の各々について、各標的遺伝子について与えられる一つ以上の発現レベルの全発現レベルの第一の線形結合を有する（"第一（底）層"）。モデルはさらに一つ以上の標的遺伝子の各々について重み付き項を含む追加線形結合に少なくとも一部基づき、各重み付き項は各標的遺伝子に対する第一の線形結合に基づく（"第二（上）層"）。

【0046】

サマリ値の計算は、"二層"モデルの好適なバージョンにおいて、訓練データを用いて各標的遺伝子について閾値を定義することと、計算された線形結合から閾値を減算し、遺伝子サマリをもたらすことを含み得る。ここで閾値は、負の遺伝子サマリレベルがダウンレギュレーションされた標的遺伝子に対応し、正の遺伝子サマリレベルがアップレギュレーションされた標的遺伝子に対応するように選ばれ得る。また、遺伝子サマリ値は"第二（上）層"に結合される前に例えば上述の変換（ファジー、離散など）の一つを用いて変換される。

【0047】

"二層"モデルを評価することによってＴＦ要素のレベルが決定された後、決定されたＴＦ要素レベルは上記の通り細胞内シグナル伝達経路の活性を推定するために閾値化され得る。

【0048】

以下、ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６を参照する上記モデルは"（擬似）線形モデル"と総称される。

【0049】

各経路の標的遺伝子は好適にはＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６のセクション"Ｅｘａｍｐｌｅ ２：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ"及び"Ｅｘａｍｐｌｅ ３：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ ｌｉｓｔ ａｎｄ ｂｒｏａｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｌｉｓｔ"に記載の方法に従って選択され、数学モデルは好適にはＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の"Ｅｘａｍｐｌｅ ４：Ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ"に記載の方法に従って訓練され得る。添付の請求項に定義される標的遺伝子の選択は例示的なＷｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、及び／又はＨＨ経路の活性をこの後のアプローチで決定するためにも有用である。

【0050】

以下、ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６のセクション"Ｅｘａｍｐｌｅ ２：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ"及び"Ｅｘａｍｐｌｅ ３：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ ｌｉｓｔ ａｎｄ ｂｒｏａｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｌｉｓｔ"に記載の方法に従った各経路の標的遺伝子の選択、並びにＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の"Ｅｘａｍｐｌｅ ４：Ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ"に記載の方法に従った数学モデルの訓練が簡潔に要約される。

【0051】

ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の実施例２に記載の標的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）は特異的ＤＮＡシーケンスに結合することによって標的遺伝子からの転写を調節し、それによってＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝子情報の転写を制御することができるタンパク質複合体（つまり、特異的構造に結合されるタンパク質の結合体）若しくはタンパク質である。この転写複合体の作用によって直接生成されるｍＲＮＡは本明細書において"直接標的遺伝子"とよばれる。経路活性化は"間接標的遺伝子"とよばれるそれ以上の二次遺伝子転写ももたらし得る。以下、経路活性とｍＲＮＡレベルの間の直接リンクとして、直接標的遺伝子を有する若しくは直接標的遺伝子から成る（擬似）線形モデルが好適であるが、直接標的遺伝子と間接標的遺伝子の区別は常に明白であるとは限らない。ここで利用可能な文献データに基づくスコアリング関数を用いて直接標的遺伝子を選択する方法が提示される。とはいえ、限られた情報と生物学的変異及び不確実性のために、間接標的遺伝子の偶発的選択を除外することはできない。

【0052】

特異的経路のｍＲＮＡ標的遺伝子は、特異的標的遺伝子についての科学的証拠が、証拠が蓄積された科学実験のタイプに応じて格付けを与えられているランキングシステムを用いることによって、科学文献から選択された。一部の実験的証拠は、例えばＨＨ経路が活性であるとわかっている胚のマイクロアレイ上で増加するｍＲＮＡのような標的遺伝子である遺伝子を示唆するに過ぎないが、他の証拠は、同定された経路転写因子結合部位の組み合わせ、及び細胞中の特異的経路の刺激後のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおけるこの部位の回収、及び細胞株における経路の特異的刺激後のｍＲＮＡの増加のような、非常に強力なものであり得る。

【0053】

下記のような（ただし限定されない）特異的経路標的遺伝子を発見する複数のタイプの実験が科学文献において同定され得る。
１．ゲノム上のその結合部位への経路‐転写因子の直接結合が示されるＣｈＩＰ実験。実施例：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）法を用いることによって、その後活性Ｗｎｔ経路を伴う若しくは伴わない結腸細胞株のＤＮＡにおける推定機能的ＴＣＦ４転写因子結合部位が、純粋にヌクレオチドシーケンスに基づいて認識される結合部位のサブセットとして同定された。推定機能は転写因子がＤＮＡ結合部位に結合することがわかったＣｈＩＰ由来の証拠として同定された。
２．結合シーケンスを含むＤＮＡのフラグメントへの転写因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を示す電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。ＣｈＩＰベースの証拠と比較してＥＭＳＡベースの証拠は、ｉｎ ｖｉｖｏ状況に変換されることができないのであまり強力でない。
３．経路の刺激及びマイクロアレイでのｍＲＮＡプロファイルの測定又はＲＮＡシークエンシングの使用、経路誘導性細胞株の使用及びタンパク質への翻訳を抑制するシクロヘキシミドの存在下で誘導後の複数時点で測定されるｍＲＮＡプロファイルの測定、従って誘導ｍＲＮＡは直接標的遺伝子であるとみなされる。
４．３と同様、ただしｍＲＮＡの量を測定するために定量的ＰＣＲを使用。
５．バイオインフォマティクスアプローチを用いるゲノム中の転写因子結合部位の同定。Ｗｎｔ経路の実施例：既知のＴＣＦ４‐ベータカテニン転写因子ＤＮＡ結合シーケンスを用いて、ヒトゲノムシーケンス上でソフトウェアプログラムが実行され、遺伝子プロモータ領域及び他の遺伝子領域の両方において可能性のある結合部位が同定された。
６．３と同様、ただしシクロヘキシミドなし。
７．４と同用、ただしシクロヘキシミドなし。
８．経路が活性であることがわかっている特異的組織若しくは細胞サンプルのｍＲＮＡ発現プロファイリング、ただし適切な陰性対照条件なし。

【0054】

最も単純な形で、標的ｍＲＮＡが同定されたこれらの実験的アプローチの各々について１ポイントを全ての潜在的標的ｍＲＮＡに与えることができる。

【0055】

代替的に、ポイントは漸増的に与えられることができ、１技術１ポイント、第二の技術が第二のポイントを加算することなどを意味する。この相対的ランクキング手法を用いて、最も信頼できる標的遺伝子のリストを作ることができる。

【0056】

代替的に、別の方法でのランキングが、ｉｎ ｖｉｖｏ直接標的遺伝子について最も多くの証拠を与える技術により多数のポイントを与えることによって、直接標的遺伝子である可能性が最も高い標的遺伝子を同定するために使用されることができ、上記リストにおいてこれは実験的アプローチ１）について８ポイント、２）に７ポイント、そして実験的アプローチ８について１ポイントへと減少することを意味する。かかるリストは"一般標的遺伝子リスト"とよばれ得る。

【0057】

生物学的変異及び不確実性にもかかわらず、本発明者らは、直接標的遺伝子は組織独立的に帰納される可能性が最も高いと仮定した。これらの標的遺伝子のリストは"エビデンスキュレーション（ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｃｕｒａｔｅｄ）標的遺伝子リスト"とよばれ得る。これらのキュレーション標的リストは、異なる組織及び／又は細胞源由来のサンプルに適用可能な計算モデルを構築するために使用されている。

【0058】

"一般標的遺伝子リスト"は、おそらくより組織特異的な遺伝子を含み、乳癌サンプルのような特異的組織からのサンプルでの適用のためにモデルの感度及び特異性を最適化し増加するために潜在的に使用されることができる。

【0059】

以下はエビデンスキュレーション標的遺伝子リストの選択が具体的にどのようにＥＲ経路について構築されたかを例示する。

【0060】

本明細書に記載の（擬似）線形モデルのための入力として使用されるＥＲ標的遺伝子を選択する目的で、以下の三つの基準が使用された。
１．遺伝子プロモータ／エンハンサ領域がエストロゲン応答配列（ＥＲＥ）モチーフを含む：
ａ．ＥＲＥモチーフは、例えば特異的ＥＲＥモチーフがレポータ遺伝子にリンクされる一過性導入アッセイを用いて、エストロゲンに応答することを証明されなければならない。
ｂ．ＥＲＥモチーフの存在は、例えば遺伝子プロモータ／エンハンサ領域の豊富なモチーフの解析によって確認されなければならない。
２．ＥＲは問題となっている遺伝子のプロモータ／エンハンサ領域にｉｎ ｖｉｖｏで（特異的に）結合し、例えばＣｈＩＰ／ＣＨＩＰ実験若しくはクロマチン免疫沈降アッセイによって実証される：
ａ．ＥＲ経路が活性であるとき、ＥＲは遺伝子のプロモータ／エンハンサ領域に結合すると証明される。
ｂ．ＥＲ経路が活性でない場合、（好適には）遺伝子の遺伝子プロモータ／エンハンサ領域に結合しない（若しくは弱く結合する）。
３．ＥＲ経路が活性であるとき、遺伝子は特異的に転写され、例えば、以下によって実証される：
ａ．リアルタイムＰＣＲ若しくはマイクロアレイ実験を通じた問題となっている遺伝子のｍＲＮＡのｆｏｌｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、又は
ｂ．免疫沈降アッセイを通じたＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩが遺伝子のプロモータ領域に結合するという実証。

【0061】

上述の三つの基準全てが満たされたことを証明する、十分に立証された実験的証拠が集められた遺伝子をＥＲ標的遺伝子として定義することによって、選択がなされた。ＥＲ特異的結合の証拠を収集するための適切な実験は、例えば、エストロゲンに暴露されるとき若しくは暴露されないときのエストロゲンに応答する癌細胞株（例えばＭＣＦ‐７細胞株）におけるＣｈＩＰ／ＣＨＩＰ実験の結果を比較することである。ｍＲＮＡ転写の証拠の収集についても同様である。

【0062】

以下は、一般的アプローチ、及び上述のアプローチを用いて発見された証拠に基づいて複数の標的遺伝子を選択するために利用された標的遺伝子選択手順のより具体的な実施例について論じる。例示的な経路、すなわちＷｎｔ、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路について（擬似）線形モデルにおいて使用される標的遺伝子のリストが、表１、表２、表３及び表４にそれぞれ示される。

【0063】

本明細書に記載のＥＲ経路の（擬似）線形モデルに使用されるＥＲ経路の標的遺伝子（表２に図示）は、その文献証拠スコアに基づく標的遺伝子の選択を含み、最高証拠スコアを持つ標的遺伝子（本発明による好適な標的遺伝子）のみがこのショートリストに追加された。低証拠スコアを持つ遺伝子も含むＥＲ標的遺伝子の完全リストは表５に示される。

【0064】

表１、表２、表３及び表４に示すＷｎｔ、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の標的遺伝子のさらなるサブセレクション若しくはランキングが、プローブセットノードを対応する標的遺伝子ノードにリンクする訓練データセットを用いて計算されるオッズ比と文献証拠スコアの組み合せに基づいて実行された。オッズ比は、カットオフ値、例えば同数の活性及び不活性訓練サンプルが使用される場合は全訓練サンプルの中央値を用いて計算され、カットオフを超える全ての値は高いと、カットオフを下回る全ての値は低いと宣言される。これは経路が活性若しくは不活性であるとわかっている訓練サンプルについてなされる。その後特異的標的遺伝子若しくはプローブセットについてオッズ比が以下の通り計算され得る：
式（３）
ｆ（活性，低）＝ｎ（活性，低）／（ｎ（活性，低）＋ｎ（活性，高））
ｆ（不活性，低）＝ｎ（不活性，低）／（ｎ（不活性，低）＋ｎ（不活性，高））
オッズ比＝ｆ（不活性，低）／（１−ｆ（不活性，低））^＊（１−ｆ（活性，低））／ｆ（活性，低）

【0065】

ｎ（活性，低）はカットオフ未満の発現レベルを持つことがわかった活性経路を持つと知られている訓練サンプルの数、ｎ（不活性，低）はカットオフ未満の発現レベルを持つことがわかった不活性経路を持つと知られている訓練サンプルの数などであり、ｆ（活性，低）とｆ（不活性，低）はそれぞれ活性若しくは不活性経路を持つと知られている、並びにカットオフ未満の発現レベルを持つことがわかったサンプルの割合である。

【0066】

代替的に、未定義のオッズ比（ゼロ除算）を回避するために、割合計算に例えば疑似カウントを追加することができる、例えば：
式（４）
ｆ（活性，低）_擬似＝（ｎ（活性，低）＋１）／（ｎ（活性，低）＋ｎ（活性，高）＋２）
ｆ（不活性，低）_擬似＝（ｎ（不活性，低）＋１）／（ｎ（不活性，低）＋ｎ（不活性，高）＋２）

【0067】

代替的に、測定設定における何らかの不確実性（ノイズ）を仮定することによって証拠となる活性を示すサンプルの絶対数を置換し、例えば正規分布を仮定して"低"若しくは"高"のいずれかである確率を各訓練サンプルについて計算することもできる（"ソフトエビデンス"とよばれる）。その後、割合計算が上述の計算に従って計算され得る。
式（５）
ｆ（活性，低）_ソフト＝（Σｐ（活性，低）＋１）／（Σｐ（活性，低）＋Σｐ（活性，高）＋２）
ｆ（不活性，低）_ソフト＝（Σｐ（不活性，低）＋１）／（Σｐ（不活性，低）＋Σｐ（不活性，高）＋２）

【0068】

ｐ（活性，低）及びｐ（不活性，低）は、各訓練サンプルの測定発現レベルに等しい算術平均を持つ標準偏差と、発現レベル測定に関連する不確実性の推定に等しい標準偏差、例えばｌｏｇ２スケールで０．２５を仮定して、各サンプルについて観察結果がカットオフを下回る確率である。これらの確率は全訓練サンプルにわたって合計され、次に疑似カウントが追加される。

【0069】

オッズ比は経路の活性を推定するにあたっての標的遺伝子の重要性の評価である。一般に、低オッズ比を持つ標的遺伝子と比較して、高オッズ比を持つ標的遺伝子の発現レベルの方が経路の総活性について情報を与える可能性が高いと期待される。しかしながら、細胞内シグナル伝達経路の複雑さのために、標的遺伝子と経路活性との間により複雑な相関関係が存在し得ることが理解され、例えば、高オッズ比を持つ標的遺伝子を分離して考慮するより、低オッズ比を持つ標的遺伝子の様々な組み合せの発現レベルを考慮する方が証拠となり得る。本明細書で報告されるＷｎｔ、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲモデリングにおいて、表６、表７、表８及び表９に示される標的遺伝子は、Ｗｎｔ、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路活性の予測にとって、低ランクの標的遺伝子と比較してより高い証明性があることがわかった（従って、本発明によれば表６乃至９に示される標的遺伝子が特に好適である）。とはいえ、マイクロアレイなどの収集法が大きな遺伝子セットについて発現レベルを収集し得る相対的容易性を考えると、記載の（擬似）線形モデルにおいて、表６、表７、表８及び表９の標的遺伝子の一部若しくは全部を利用し、オプションとして付加的に、表１、表２、表３及び表４に示されるランクの追加標的遺伝子の一つ、二つ、一部若しくは全部を利用することが考えられる。

【0070】

表１．標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用される関連するプローブセット及び（擬似）線形モデルにおいて使用されるＷｎｔ経路の標的遺伝子のエビデンスキュレーションリスト。

【表1】

【0071】

表２．標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用される関連するプローブセット及び（擬似）線形モデルにおいて使用されるＥＲ経路の標的遺伝子のエビデンスキュレーションリスト。"最弁別的プローブセット"は下線によってマークされる。

【表2】

【0072】

表３．標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用される関連するプローブセット及び（擬似）線形モデルにおいて使用されるＨＨ経路の標的遺伝子のエビデンスキュレーションリスト。

【表3】

【0073】

表４．標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用される関連するプローブセット及び（擬似）線形モデルにおいて使用されるＡＲ経路の標的遺伝子のエビデンスキュレーションリスト。

【表4】

【0074】

表５．有意な文献証拠を持つことがわかったＥＲ標的遺伝子の遺伝子シンボル（＝ＥＲ標的遺伝子ロングリスト）。

【表5】

【0075】

表６．文献証拠スコアとオッズ比に基づくＷｎｔ標的遺伝子のショートリスト。

【表6】

【0076】

表７．文献証拠スコアとオッズ比に基づくＥＲ標的遺伝子のショートリスト。

【表7】

【0077】

表８．文献証拠スコアとオッズ比に基づくＨＨ標的遺伝子のショートリスト。

【表8】

【0078】

表９．文献証拠スコアとオッズ比に基づくＡＲ標的遺伝子のショートリスト。

【表9】

【0079】

ＵＳ６１／７４５８２９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の実施例３にかかる、エビデンスキュレーションリストと広域文献リストとの比較
本明細書に記載の手順に従って文献証拠に基づいて構築されるＷｎｔ標的遺伝子のリスト（表１）が、上述の手順に従わない別の標的遺伝子のリストと比較される。代替リストは、分子生物学及びＷｎｔ経路の領域におけるその専門知識で知られる、名高い研究室によって三つの公的ソースにおいて公開された、様々な実験的アプローチからの様々なデータによってＷｎｔ標的遺伝子であることが示された遺伝子を編集したものである。代替リストは、Ｈａｔｚｉｓら（Ｈａｔｚｉｓ Ｐ，２００８）からの表Ｓ３、ｄｅ Ｓｏｕｓａ ｅ Ｍｅｌｏ（ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｅ Ｍｅｌｏ Ｆ，２０１１）からのテキスト及び表Ｓ１Ａ、並びに、Ｗｎｔシグナル伝達の分野における先駆者であるＲｏｅｌ Ｎｕｓｓｅによって収集され維持される標的遺伝子のリスト（Ｎｕｓｓｅ，２０１２）に記載の遺伝子の組み合わせである。これら三つのソースの組み合わせは１２４の遺伝子のリストをもたらした（＝広域文献リスト、表１０を参照）。ここで、この代替リストから得られるアルゴリズムによって臨床サンプルにおけるＷｎｔ活性を予測する性能が、既存の遺伝子リスト（＝エビデンスキュレーションリスト、表１）に基づいて構築されたモデルと比較して同様の若しくはより良い性能を示すかどうかという問題が論じられる。

【0080】

表１０．Ｗｎｔ標的遺伝子の代替リスト（＝広域文献リスト）。

【表10】

【0081】

次のステップは、遺伝子と対応するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイのプローブセットを見つけることから構成された。このプロセスは、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプラグイン、及び本明細書に記載の（擬似）線形モデルと同様の、ＵＣＳＣゲノムブラウザに基づくプローブセット関連性のマニュアルキュレーションを使用し、それによって、例えば逆ストランド上若しくは遺伝子エクソン領域外のプローブセットを除去して実行された。１２４の遺伝子のうち二つについて、このマイクロアレイチップ上で利用可能なプローブセットがなく、従って、（擬似）線形モデルに挿入することができなかった。これらはＬＯＣ２８３８５９及びＷＮＴ３Ａである。全部で２８７のプローブセットが残る１２２の遺伝子に対応することがわかった（表１１）。

【0082】

表１１．広域文献遺伝子リストにおけるＷｎｔ標的遺伝子と関連するプローブセット。

【表11】

【0083】

その後、本明細書において説明される通り重みパラメータを計算するために"白黒"法を用いて上記"全プローブセット"モデルと同様に（擬似）線形モデルが構築された。エビデンスキュレーションリストに基づくＷｎｔ（擬似）線形モデルの記載と同様に、プローブセットとその各遺伝子間のエッジと関連する重み、エビデンスキュレーションリストと広域文献リストの両方が、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてアクセス可能。最終アクセス２０１１年７月１３日）からのデータセットＧＳＥ８６７１由来の３２の正常結腸サンプル及び３２の腺腫サンプルの連続ｆＲＭＡ処理データを使用して訓練された。

【0084】

そして訓練した（擬似）線形モデルは、Ｗｎｔ経路の活性スコアを推定するために様々なデータセットついてテストされた。

【0085】

テストから、広域文献モデルは一般に、Ｗｎｔシグナル伝達がオン（活性レベル陽性）若しくはオフであるかのより極端な活性スコアを予測することが推論され得る。加えて、代替モデルは結腸癌データセット（ＧＳＥ２０９１６、ＧＳＥ４１８３、ＧＳＥ１５９６０）について同様の結果を予測するが、予想を超えるサンプルが、乳癌（ＧＳＥ１２７７７）及び髄芽腫サンプル（ＧＳＥ１０３２７）データセットにおいて活性Ｗｎｔシグナル伝達経路が予測された。

【0086】

結論として、広域文献標的遺伝子リストは、一方で結腸癌におけるＷｎｔ活性の予測をほぼ等しく良好にもたらすが、他方で他の癌タイプにおいては不良な予測（偽陽性が多い）をもたらす。これは標的遺伝子の代替リストが結腸細胞に特異的に偏り過ぎている、従って組織特異的過ぎる結果であり得る。ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｅ Ｍｅｌｏら及びＨａｔｚｉｓら両方の主な関心は結腸直腸癌であったが、非結腸特異的Ｗｎｔ標的遺伝子が含まれる可能性がある。加えて、これらのリストに含まれる可能性がある非Ｗｎｔ特異的標的遺伝子は、他の癌タイプにおけるＷｎｔ活性の予測悪化の原因になり得る。代替リストはより間接的に調節される標的遺伝子を含む可能性が高いので、おそらくより組織特異的になる。元のリストは全組織においてＷｎｔ感受性である遺伝子をあらわす可能性が最も高い直接標的遺伝子を含む方向に調整されるので、組織特異性を減らす。

【0087】

ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の実施例４にかかる数学モデルの訓練及び使用
テストサンプルにおける経路活性を推定するために本明細書に例示する（擬似）線形モデルが使用され得る前に、ノードが"不在"若しくは"存在"するかどうかをコールする閾値とノードの相関性の符号と大きさを示す重みが決定される必要がある。重みと閾値を演繹的に入力するために専門知識を使用することができるが、典型的には、好適にはｇｒｏｕｎｄ ｔｒｕｔｈがわかっている訓練サンプルの代表セットを用いてモデルが訓練される。例えば既知の存在する転写因子複合体（＝活性経路）を持つ、又は転写因子複合体のない（＝不活性経路）サンプル中のプローブセットの発現データ。しかしながら、多くの異なる種類の癌から、モデル化される経路の活性状態がどのようなものかわかっている訓練サンプルを得ることは実用的でない。結果として、利用可能な訓練セットは、典型的には１タイプの癌のみからの、限られた数のサンプルから成る。本明細書では、テストサンプルを活性若しくは不活性経路を持つと分類するために必要なパラメータを決定する方法が記載される。

【0088】

モデルトポロジーを考慮し、モデル出力、ここでは重み付き線形スコアが最適化されるようにモデルパラメータ、ここでは重みと閾値を変更する、多数の訓練アルゴリズム（例えば回帰）が当技術分野で周知である。本明細書では最適化アルゴリズムの必要なく発現レベルから直接重みを計算するために使用されることができる二つの方法例を示す。

【0089】

好適には、Ｗｎｔ、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の（擬似）線形モデルの訓練はＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてアクセス可能、上記参照）で利用可能な公開データを用いてなされる。

【0090】

本明細書において"白黒"法と定義される第一の方法は、重み因子が｛−１，０，１｝の要素である三進法に要約する。これを生物学的文脈におく場合、−１と１はそれぞれ経路活性の場合ダウンレギュレーション及びアップレギュレーションされる遺伝子若しくはプローブに対応する。プローブ若しくは遺伝子がアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーションされることを統計的に立証できない場合、これは０の重みを受け取る。ここでは、使用される訓練データを仮定してプローブ若しくは遺伝子がアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーションされるかどうかを決定するために、活性経路サンプルの発現レベル対不活性経路サンプルの発現レベルの左片側及び右片側二標本ｔ検定を使用した。不活性サンプルよりも活性サンプルの平均が統計的に大きい場合、すなわちｐ値が所定閾値、例えば０．３を下回る場合、プローブセット若しくは標的遺伝子はアップレギュレーションされると決定される。逆に、不活性サンプルよりも活性サンプルの平均が統計的に低い場合、このプローブセット若しくは標的遺伝子は経路の活性についてダウンレギュレーションされると決定される。最低ｐ値（左若しくは右片側）が上述の閾値を超える場合、このプローブ若しくは遺伝子の重みは０であると定義する。

【0091】

別の好適な実施形態において、重みと閾値に至る代替法が使用される。この代替法はオッズ比の対数（例えばｅを底とする）に基づき、従って"対数オッズ"重みとよばれる。各プローブ若しくは遺伝子についてのオッズ比は、プローブ／遺伝子レベルが対応する閾値、例えば全訓練サンプルの中央値を超える及び下回る、陽性及び陰性の訓練サンプルの数に基づいて計算される（式３）。ゼロ除算を回避するために疑似カウントが追加され得る（式４）。さらなる精緻化は、プローブ／遺伝子レベルが例えばある特定標準偏差（例えば２対数スケールで０．２５）でその実測値を中心に正規分布すると仮定し、閾値を超える及び下回る確率質量をカウントすることによって、いくらかより確率論的に閾値を超える／下回るサンプルをカウントすることである（式５）。

【0092】

代替的に、本明細書に記載の（擬似）線形モデルの重みと閾値を決定するために回帰などの当技術分野で周知の最適化アルゴリズムを利用することができる。

【0093】

うまく一般化するために（擬似）線形モデルについてパラメータが決定される方法に特に注意しなければならない。代替的に、訓練手順中に特別措置をとることによって極めてうまく一般化することができるよう、当技術分野で周知のベイジアンネットワークなどの他の機械学習法を使用することができる。

【0094】

好適には、Ｗｎｔ、ＥＲ、ＨＨ、ＡＲ経路の（擬似）線形モデルの訓練はＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてアクセス可能）で利用可能な公開データを用いてなされる。モデルはかかる公開データを用いて例示的に訓練された。

【0095】

ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２及びＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６に関して、添付の請求項に定義されるＥＲ標的遺伝子の順位は、新たな文献証拠が追加されたためわずかに変更されることに留意されたい。ＥＲ標的遺伝子はＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張するＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６の実施例３に記載の同様の方法で選択されランク付けされた。遺伝子はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘモデル内で活性経路と不活性経路を区別するために各遺伝子の個々の能力と文献証拠スコアとを組み合わせることによってランク付けされた。このランキングは、エストロゲンを欠乏させその後欠乏させたままであるか、又は１ｎＭエストロゲンに２４時間暴露したＭＣＦ７細胞株サンプルの訓練セット（ＧＳＥ３５４２８）でモデルを訓練するとき、並びにＭＣＦ７細胞からエストロゲンを欠乏させ、その後欠乏させたままであるか、又は１０ｎＭ若しくは２５ｎＭエストロゲンに暴露した二つの他の訓練セット（それぞれＧＳＥ１１３５２及びＧＳＥ８５９７）と訓練セットでモデルをテストするときに、各遺伝子について得られる重み付き偽陽性率と偽陰性率の線形結合に基づいた。

【0096】

（様々なセットにおいて使用される異なる実験条件を考慮するために（オッズ比の代わりに）重み付き偽陽性及び偽陰性の組み合わせが使用されたことが留意される。異なる重みは、偽陽性（陰性）が、サンプルがさらされている異なる実験条件ではなくモデルの結果であったという発明者の確信に従って設定された。例えば、全実験においてＭＣＦ７細胞株サンプルは、最初にエストロゲンに暴露される前にある期間エストロゲンを欠乏させるか、又はもう２４時間さらに欠乏させた。短い欠乏時間はエストロゲン欠乏にもかかわらず経路を依然として活性にし、この場合偽陽性はテストサンプルと訓練サンプルの両方を同じ時間欠乏させたときよりも低い重みをもち得る。）

【実施例2】

【0097】

実施例２：リスクスコア決定
一般に、臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示し、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づくリスクスコアを決定するために、多くの異なる式が考案され得る。すなわち：
ＭＰＳ＝Ｆ（Ｐ_１，…，Ｐ_Ｎ）＋Ｘ （式６）
ＭＰＳはリスクスコアであり（リスクスコアが二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性によって影響を受けることをあらわすために"多経路スコア"の略語として"ＭＰＳ"という語が本明細書で使用される）、Ｐ_ｉは細胞内シグナル伝達経路ｉの活性スコアであり、Ｎは検討中の細胞内シグナル伝達経路の総数であり、Ｘは式に入り得る可能な追加因子若しくはパラメータ用のプレースホルダーである。かかる式はより具体的には所与の変数若しくは変数の線形結合におけるある程度の多項式であり得る。かかる多項式における重み付け係数及びパワーは専門知識に基づいて設定され得るが、典型的には既知のｇｒｏｕｎｄ ｔｒｕｔｈ、例えば生存データを持つ訓練データセットが、式（６）の重み付け係数及びパワーの推定を得るために使用される。推定活性は式（６）を用いて結合され、その後ＭＰＳを生成する。次に、スコアリング関数の重み付け係数及びパワーは、高ＭＰＳが臨床イベントの発生までのより長い期間と相関し、逆もまた同様であるように最適化される。発生データとのスコアリング関数の相関を最適化することは、多数の解析法、例えばコックス比例ハザード検定（本明細書で例示的に使用される）、ログランク検定、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ推定量を勾配降下若しくは手動適応などの標準最適化法と併用してなされ得る。

【0098】

この実施例において、臨床イベントは癌、特に乳癌であり、公開国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"）若しくは未公開米国仮特許出願ＵＳ６１／７４５８３９の優先権を主張する未公開国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６１０６６（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ） ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ"）に詳述の通り、Ｗｎｔ経路、ＥＲ（エストロゲン受容体）経路、ＨＨ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路、及びＡＲ（アンドロゲン受容体）経路の推定活性が考慮される。

【0099】

本明細書で例示的に使用される式はＷｎｔ経路、ＥＲ経路、ＨＨ経路の活性を考慮する。これは癌生物学研究、並びに公開データセットにおいて発見される生存とＷｎｔ、ＥＲ、ＨＨ経路活性との相関関係から得られる発明者らの見解に基づく。Ｗｎｔ及びＨｅｄｇｅｈｏｇのような初期発生経路は、癌幹細胞とよばれるより幹細胞様の表現型に戻っている癌細胞によって生じる転移に関与すると考えられる。実際、発明者らはＷｎｔ経路などの初期発生経路が癌転移に関与し、転移性癌細胞が別の臓器若しくは組織中の播種位置において分裂を開始することを可能にするという十分な指標が利用可能であると考える。転移は予後不良と関連し、癌再発の一形態をあらわすので、癌細胞におけるＷｎｔ及びＨＨ経路などの初期発生経路の活性は予後不良を予測すると発明者らによって期待され、一方ＥＲ経路の不活性は乳癌患者における不良転帰と相関すると思われる。癌進行及び転移におけるＷｎｔ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路の推定される役割は前臨床研究に基づき、それらの活性を測定するための方法が利用可能でないので、主題に示されていない。

【0100】

生物学研究からのこうした発明者らの所見と、Ｗｎｔ及びＨＨ活性が癌再発に関与し、ＥＲ活性が良好な臨床転帰に関連するように思われるという臨床相関は、本明細書において例示的な次式に組み合わされる。
ＭＰＳ＝−α・Ｐ_ＥＲ＋β・ｍａｘ（Ｐ_Ｗｎｔ，Ｐ_ＨＨ） （７）
Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨはそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の推定活性をあらわし（例えば０から１の範囲）、αとβは非負の、好適には正の、定数スケーリングファクタである。この実施例では、公開国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（"Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ"）に詳細に記載される方法によって推論される通り、αとβは例示的に１に等しくなるように選ばれ、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、及びＨＨ経路がその活性状態にある確率が使用されている。本明細書において使用されるＥＲ、Ｗｎｔ、及びＨＨ経路のベイジアンネットワークモデルは、Ａ）関心転写因子レベルのトップレベルノード、Ｂ）関心標的遺伝子の存在をあらわすノードのレベル（それぞれＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２の表２、表１及び表３）、並びにＣ）関心標的遺伝子と関連するプローブセットをあらわすノードのレベル（それぞれＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２の表２、表１及び表３）を有する。ＴＦ要素の存在若しくは不在の事前確率は０．５に設定された。レベルＡとＢの間の条件付き確率は以下の通りＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２に記載の通り注記深く厳選された。（ｉ）ＴＦ無／標的遺伝子ダウン：０．９５、（ｉｉ）ＴＦ無／標的遺伝子アップ：０．０５、（ｉｉｉ）ＴＦ有／標的遺伝子ダウン：０．３０、（ｉｖ）ＴＦ有／標的遺伝子アップ：０．７０。一方レベルＢとＣの間の条件付き確率はそれぞれＧＳＥ８５９７、ＧＳＥ８６７１及びＧＳＥ７５５３からのデータ上で訓練された。

【0101】

訓練データとして、ＧＳＥ８５９７がＥＲ経路に使用され、ＧＳＥ８６７１がＷｎｔ経路に使用され、ＧＳＥ７５５３がＨＨ経路に使用されている。推定に組み込まれている標的遺伝子は、ＥＲ経路についてＧＲＥＢ１、ＰＧＲ、ＸＢＰ１、ＣＡ１２、ＳＯＤ１、ＣＴＳＤ、ＩＧＦＢＰ４、ＴＦＦ１、ＳＧＫ３、ＮＲＩＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＡＰ１Ｂ１、ＲＡＲＡ、ＭＹＣ、ＤＳＣＡＭ、ＥＢＡＧ９、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＲＢＢ２、ＰＩＳＤ、ＫＲＴ１９、ＨＳＰＢ１、ＴＲＩＭ２５、ＰＴＭＡ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＤＨ２６、ＮＤＵＦＶ３、ＰＲＤＭ１５、ＡＴＰ５Ｊ、ＥＳＲ１、Ｗｎｔ経路についてＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６、ＦＺＤ７、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ、ＬＥＣＴ２、ＨＨ経路についてＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ、ＣＴＳＬ１、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１、ＴＯＭ１であった。

【0102】

得られるＭＰＳは所定期間内の臨床イベント、ここでは局所若しくは遠隔の癌、特に乳癌の低再発リスクをあらわす−１から、高再発リスク患者の＋１に及ぶ。

【0103】

以下、式（７）に従って計算されるＭＰＳが使用されるが、Ｗｎｔ、ＥＲ及びＨＨ経路の推定活性に基づいてリスクスコア（ＭＰＳ）を計算する別の適切な方法が例示的な次式によって提供されることに留意されたい：
ＭＰＳ＝−α・Ｐ_ＥＲ＋β・Ｐ_Ｗｎｔ＋γ・Ｐ_ＨＨ （８）
Ｐ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、及びＰ_ＨＨはそれぞれＥＲ経路、Ｗｎｔ経路、及びＨＨ経路の推定活性をあらわし（例えば０から１の範囲）、α、β、γは非負定数スケーリングファクタである。

【0104】

本明細書において例示的に使用されるかかる予後値を量子化する二つの方法はログランク検定と併用されるコックス比例ハザード回帰モデルとＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒプロットである。

【0105】

第一の方法は一つ以上の共変量を持つ生存データにハザードモデルをフィッティングする。手短に言えば、かかるハザードモデルは共変量の（数）値に基づく母集団内の生存（臨床イベント）の変動を説明する。フィッティングの結果として、含まれる共変量の各々は共変量の値に基づく臨床イベントの関連リスクを定量化するハザード比（ＨＲ）を割り当てられ、例えば２のＨＲは共変量の値が１増加する患者について関心臨床イベントのリスクが２倍高いことに対応する。詳細に、１のＨＲの値はこの共変量が生存に影響を与えないことを意味するが、ＨＲ＜１の場合、共変量数の増加は低リスクをあらわし、共変量数の減少は高リスクをあらわし、ＨＲ＞１の場合、共変量値の増加は高リスクをあらわし、共変量数の減少は低リスクをあらわす。ハザード比とともに、９５％信頼区間及びｐ値が報告される（すなわちハザード比が１より有意に小さい若しくは大きい片側確率）。ハザード比の直接比較を容易にするために全共変量は０と１の間でスケールされる。

【0106】

後者の方法は時間の関数として臨床イベントの生存確率をあらわすＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ曲線をプロットすることを含む。例えば、例示的な予後検査に基づいて母集団における異なるリスク群についてＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ曲線をプロットすることによって、例示的な臨床イベントのリスクの分離の質を視覚化することができる。この質は二つの生存関数が等しい確率（ｐ値）を計算するログランク検定を用いてさらに量子化され得る。

【0107】

リスクに従って患者を層別化するために、以下のアルゴリズムが例示的に使用される：−０．１未満のＭＰＳを持つ患者は高ＥＲ経路活性確率と相関するので、低再発リスクを持つと指定され、一方＋０．１より大きいＭＰＳは高リスクＷｎｔ及び／又はＨＨ経路の高活性と関連するので、高再発リスクと相関する。−０．１と＋０．１の間のＭＰＳを持つ患者は、この群はＥＲ経路などの活性低リスク経路並びにＷｎｔ若しくはＨＨなどの高リスクシグナル伝達経路の活性を伴う患者、又は経路のいずれも腫瘍成長を促進すると推定されなかった患者を含むので、中度の再発リスクを持つと分類される。閾値−０．１及び＋０．１は、図１にみられる通り、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ(ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、ＧＳＥ２０６８５、ＧＳＥ２０６８５、及びＧＳＥ２１６５３、http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてアクセス可能、最終アクセス２０１３年２月１３日)及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（Ｅ‐ＭＴＡＢ‐３６５、http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/、最終アクセス２０１３年２月１３日)において報告される１２９４の多様な乳癌患者を含む複数のデータセットにおいて得られるＭＰＳスコアの分布の解析に基づく。

【0108】

ベンチマークとして、再発のよい予測因子であり乳癌の他の遺伝子発現ベースの予測因子と調和することが示された、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈからの別の経路活性及び乳癌ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）テストが使用された。ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）テストは遺伝子のパネルについて測定される発現レベルの組み合わせに基づいて計算される０から１００のリスク若しくは再発スコア（ＲＳ）を返す。ＲＳはＥＲ陽性、ＨＥＲ２陰性（タンパク質染色若しくはＦＩＳＨ）、ノード陰性乳癌患者における１０年生存について最適化される（Ｐａｉｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．："Ａ ｍｕｌｔｉ‐ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ‐ｔｒｅａｔｅｄ， ｎｏｄｅ‐ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，"Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５１（２７），（２００４），ｐａｇｅｓ ２８１７‐２８２６；Ｆａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．："Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ‐ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ‐ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒs ＦＯＲ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，"Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３５５（６），（２００６),ｐａｇｅｓ ５６０‐５６９参照）。ＲＳはＦａｎらによって報告されている手順（Ｆａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）参照）に従って上述のデータベースにおいて報告されているマイクロアレイ発現データを用いて計算され、患者はその後ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）リスク層別化アルゴリズムに従って低リスク、中度リスク、高リスク患者にわけられた。

【0109】

結果
（ｉ）Ｅｒａｓｍｕｓデータ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/にてアクセス可能、最終アクセス２０１３年２月１３日)からのＧＳＥ１２２７６において全２０４患者が再発した（再発までの期間の中央値：２１か月、範囲：０‐１１５か月）。これは晩期症例から早期再発症例を分離することができるかどうか見るために、経路活性スコアの予後値及び再発リスクに関してその得られるＭＰＳを調査するためによいデータセットとなる。

【0110】

一変量コックス比例ハザード再帰モデルがＷｎｔ経路、ＥＲ経路、ＨＨ経路、ＡＲ経路並びにＲＳとＭＰＳに対する正規化値（すなわち０から１の値）を用いてフィッティングされた（下記表１２参照）。一変量解析はＲＳとＭＰＳが両方とも１より有意に大きいハザード比を持つが、Ｐ_ＥＲは１より有意に小さいハザード比を持つことを示す。Ｐ_ＥＲ若しくはＭＰＳのいずれかとＲＳの組み合わせを含む多変量解析は、二つの有意な予測因子（ｐ＜０．０５）をもたらした。一方ＭＰＳとＰ_ＥＲの組み合わせは予測因子の一つについて有意性の喪失をもたらし（ＭＰＳ：ｐ＞０．０５）、これはＰ_ＥＲが多経路スコアの要素でもあるという事実によって説明される。結果としてＲＳ、ＭＰＳ、及びＰ_ＥＲを用いる多変量解析も論理的に失敗した。

【0111】

表１２．ＧＳＥ１２２７６における全患者のコックス比例ハザード比。

【表12】

【0112】

結論として、一変量解析はＧｅｎｏｍｉｃ ＨｅａｌｔｈからのＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）再発スコア（ＲＳ）が経路ベースの予測因子Ｐ_Ｗｎｔ、Ｐ_ＨＨ及びＰ_ＡＲよりも再発に関して強力な予測力を持つことを示したが、これはＲＳが再発を予測するために特異的に最適化されるが、一方Ｐ_Ｗｎｔ、Ｐ_ＨＨ及びＰ_ＡＲは経路活性を予測しようとするので、予想外のことではない。とはいえ、Ｐ_ＥＲと、Ｐ_Ｗｎｔ及びＰ_ＨＨと組み合わせて得られるそのＭＰＳも再発にとって強力で有意な予測因子である。加えて、Ｐ_ＥＲ若しくはＭＰＳのいずれかとＲＳを組み合わせることは改良されたリスク層別化をもたらし、別の予測因子より優れている（有意ではない、ｐ〜０．１４）。加えて、これはＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）再発スコア（ＲＳ）と多経路スコア（ＭＰＳ）が再発の相補的予測因子であり、両者は腫瘍成長の根底にある異なる機序を考慮することも示唆する。

【0113】

同じデータセットからＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）乳癌テストの対象となる７１患者のみを考慮すると（すなわちＨＥＲ２状態が未知でＥＲ陽性かつリンパ節陰性の患者）、ＲＳとＰ_ＥＲは依然再発の強力な予測因子である（ｐ＜０．０５）ことが観察される（下記表１３参照）。他方で、ＭＰＳはもはや有意な予測因子ではないことが観察され、これはおそらくより同質の患者群の結果である（わずかなＷｎｔ及びＨＨ活性腫瘍のみ）。際立って、ＥＲ陽性（タンパク質染色）及びリンパ節陰性患者における再発予後の最も強力な予測因子はＰ_ＥＲでありＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）再発スコア（ＲＳ）ではない。

【0114】

表１３．ＧＳＥ１２２７６におけるＥＲ陽性及びリンパ節陰性患者のコックス比例ハザード比。

【表13】

【0115】

（ｉｉ）Ｇｕｙ'ｓ病院データ
Ｅｒａｓｍｕｓ ＧＳＥ１２２７６データセットは、経過観察中に再発した患者のみを含むので、再発に偏っている。経路ベース予測の予後値を調査するために、これらはＧＳＥ６５３２及びＧＳＥ９１９５におけるＧｕｙ'ｓ病院によって報告されるより臨床的に関連する患者セットに適用された（全部で１６４患者）。これらのデータセットにおける患者はＥＲ陽性腫瘍と診断され、外科手術で治療され、５年間アジュバントホルモン療法で治療された。

【0116】

ＭＰＳとＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）再発スコア（ＲＳ）の直接比較（表１４参照）は両テストがほぼ等しく良好に再発リスクを予測することができることを示す（ＨＲ：４．４１（１．９３−１０．０９１）ｖｓ．６．４３（１．６６−２４．９０））。両テストの予測力は多変量解析に組み合わせると有意なままである。これはＥｒａｓｍｕｓ ＧＳＥ１２２７６データセットにおいて得られる結果を支持し、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）乳癌テストから得られる再発スコア（ＲＳ）とＭＰＳは再発の相補的予測因子であり、両者は腫瘍成長の根底にある異なる機序を考慮する。これら二つのテストを組み合わせることは、図２（図２Ａは時間軸上でズームインした図２Ｂのクリッピングを示すことに留意されたい）及び下記表１４にみられる通り無再発生存予測をさらに改善する。

【0117】

表１４．ＧＳＥ６５３２及びＧＳＥ９１９５における全患者のコックス比例ハザード比。

【表14】

【0118】

（ｉｉｉ）Ｃａｒｔｅｓ ｄ'Ｉｄｅｎｔｉｔｅ ｄｅｓ Ｔｕｍｅｕｒｓデータ
ＭＰＳが原発性乳癌患者、例えば基底ＨＥＲ２増幅乳癌の母集団全体にも適用可能であることを示すために、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓにより公開されているＥ‐ＭＴＡＢ‐３６５データセットからの患者サンプルの多様なセット（ｎ＝５３７、ＥＲ＋／−、ＨＥＲ＋／−、ＰＧＲ＋／−、異なるグレードなど、平均経過観察期間６５±（ＳＤ）４０か月）に適用された。これは図３（図３Ａは時間軸上でズームインした図３Ｂのクリッピングを示すことに留意されたい）にみられる通り高リスク及び中度リスク対低リスク患者における生存の良好な分離（両方ともｐ＜０．０１）並びに２．７２（１．２５−５．９２、ｐ＜０．０１）のＨＲをもたらした。

【0119】

（ｉｖ）Ｋｏｏ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｕｎ‐Ｙａｔ‐Ｓｅｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒデータ
ＭＰＳは乳癌患者の多様な群から成る別の患者コホート（ｎ＝３２７、ＧＳＥ２０６８５、ＥＲ＋／−、ＨＥＲ＋／−、ＰＧＲ＋／−、リンパ節陰性／陽性など）でテストされた。これは３．５３（１．３４−９．３０、ｐ＜０．０１）のＨＲ、及び低、中度、高リスク患者群の良好な分離をもたらした（図４参照。図４Ａは時間軸上でズームインした図４Ｂのクリッピングを示すことに留意されたい）。

【0120】

（ｖ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｏｌｉ‐Ｃａｌｍａｔｔｅｓデータ
次にＭＰＳ再発推定量はＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｏｌｉ‐Ｃａｌｍａｔｔｅｓにおいて手術を受けた２６６早期乳癌患者のセットに適用された。患者はＥＲ＋／−、ＨＥＲ＋／−、ＰＧＲ＋／−、リンパ節陰性／陽性、グレード１/２/３、ＫＩ６７＋／−、及びＰ５３＋／−の多様な乳癌のセットをカバーする。これらのサンプルのマイクロアレイはＧＳＥ２１６５３データセットにおいて公開されている。ＭＰＳのＨＲは２．８（１．２０−６．５１、ｐ＜０．０１）で有意であり、低リスクと高リスクのリスク層別化に加えて、Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ生存曲線も同様に有意であった（ｐ＝０．０１７）（図５参照。図５Ａは時間軸上でズームインした図５Ｂのクリッピングを示すことに留意されたい）。

【実施例3】

【0121】

実施例３：アッセイ開発
マイクロアレイ若しくはＲＮＡシークエンシング由来のｍＲＮＡ入力データに例えば上述のベイジアン若しくは（擬似）線形モデルを適用する代わりに、例えばＭＰＳの一部である標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定するためにｑＰＣＲを用いる統合プラットフォーム上で、サンプル測定を実行する専用アッセイを開発することが臨床アプリケーションにおいて有益であり得る。その場合開示の標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡシーケンスが、かかるプラットフォーム上でどのプライマーとプローブを選択すべきかを決定するために使用され得る。

【0122】

かかる専用ＭＰＳアッセイの検証は、マイクロアレイベースのベイジアン若しくは（擬似）線形モデルを基準モデルとして使用し、開発されたアッセイが検証サンプルのセットについて同様の結果を与えるかどうかを検証することによってなされ得る。専用アッセイの次に、これは入力測定としてｍＲＮＡシークエンシングデータを用いて同様のベイジアン若しくは（擬似）線形モデルを構築し較正するためにもなされることができる。

【実施例4】

【0123】

実施例４：ＣＤＳアプリケーション
図６（本明細書において開示される、臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するように構成される臨床決定支援（ＣＤＳ）システムを概略的に示す）を参照すると、臨床決定支援（ＣＤＳ）システム１０は適切に構成されるコンピュータ１２として実現される。コンピュータ１２は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは別の光学記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、若しくは別の電子記憶媒体、ネットワークサーバなど、非一時的記憶媒体（不図示）上に記憶される適切なソフトウェア、ファームウェア、若しくは他の命令を実行することによって、ＣＤＳシステム１０として動作するように構成され得る。例示的なＣＤＳシステム１０は例示的なコンピュータ１２によって具体化されるが、より一般的には、ＣＤＳシステムは、本明細書に記載の臨床決定支援法を実行するように構成されるデジタル処理装置又はデジタルプロセッサを有する機器によって具体化され得る。例えば、デジタル処理装置は、携帯端末（例えば、ＣＤＳアプリケーションを実行するパーソナルデータアシスタント若しくはスマートフォン）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、リモートネットワークサーバなどであり得る。コンピュータ１２又は他のデジタル処理装置は典型的に、表示装置１４を含むか若しくは表示装置１４と動作可能に接続され、それを介して臨床決定支援勧告を含む情報が医療従事者に表示される。コンピュータ１２又は他のデジタル処理装置は典型的に、例示的なキーボード１６、又はマウス、トラックボール、トラックパッド、タッチスクリーン（おそらく表示装置１４と一体化される）、若しくは別のポインタベースユーザ入力装置など、一つ以上のユーザ入力装置も含むか又はそれと動作可能に接続され、それを介して医療従事者はＣＤＳシステム１０を制御するための動作コマンド、ＣＤＳシステム１０による使用のためのデータなどの情報を入力することができる。

【0124】

ＣＤＳシステム１０は、被検体（例えば腫瘍専門医、医師、若しくは他の医療従事者によって治療されている病院患者若しくは外来患者、又は結腸癌、乳癌、若しくは肝癌など特定タイプの癌を罹患することがわかっている若しくは疑われる、癌スクリーニング若しくは何らかの他の医療診断を受けている人）に関する情報を入力として受け取る。ＣＤＳシステム１０は、表示装置１４を介して（又は音声合成装置若しくは人が知覚可能な出力を提供する他の装置を介して）医療従事者に提示される臨床決定支援勧告を生成するために様々なデータ解析アルゴリズムをこの入力情報に適用する。一部の実施形態において、これらのアルゴリズムは臨床ガイドラインを患者に適用することを含み得る。臨床ガイドラインは、典型的には医療専門家委員会の勧告に基づいて構築され、オプションとして臨床ガイドラインのナビゲーションを容易にする臨床"フローチャート"の形でフォーマットされた、標準若しくは"正準"治療勧告の記憶されたセットである。様々な実施形態においてＣＤＳ１０のデータ処理アルゴリズムは付加的に若しくは代替的に、本明細書に開示される機械学習法など、臨床決定勧告を抽出するために入力情報に対して実行される様々な診断若しくは臨床試験アルゴリズムを含み得る。

【0125】

本明細書に開示される例示的なＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０）において、ＣＤＳデータ解析アルゴリズムは、一つ以上の医療研究所１８によって収集される入力ゲノム及び／又はプロテオーム情報に対して実行される一つ以上の診断若しくは臨床試験アルゴリズムを含む。これらの研究所は"オンサイト"で、すなわち病院、又は被検体が診察及び／若しくは治療を受ける他の場所に、或いは"オフサイト"で、例えば被検体から抽出された被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液のサンプル（例えば癌病変から、若しくは癌が疑われる病変から、若しくは転移性腫瘍から、若しくは癌細胞で汚染されている流体が存在する体腔（例えば胸腔若しくは腹腔若しくは膀胱腔）から、若しくは癌細胞を含む他の体液などから、好適には生検法若しくは他の標本採取法を介して採取されるサンプル）を、（郵便若しくは別の送付サービスを介して）受け取る例えば専門及び中央研究所に、様々に位置し得る。サンプルが抽出される細胞は血液悪性腫瘍（白血病若しくはリンパ腫など）からの腫瘍細胞でもあり得る。場合によっては、細胞サンプルは循環腫瘍細胞、すなわち、血流に入った腫瘍細胞であってもよく、適切な単離技術、例えばアフェレーシス若しくは従来の静脈採血を使用して抽出され得る。血液は別として、サンプルが抽出される体液は尿、胃腸内容物、若しくは溢出物であり得る。

【0126】

抽出サンプルはゲノム若しくはプロテオーム情報を生成するために研究所によって処理される。例えば遺伝子から転写されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のレベル、又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質のレベルの形で、関心遺伝子の発現レベルなど、証拠となるゲノム若しくはプロテオーム情報を測定するために、例えば抽出サンプルはマイクロアレイ（当技術分野において遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、バイオチップなどとも様々によばれる）を使用して、又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）処理によって処理され得る。別の実施例として抽出サンプルは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対するシーケンスを生成するため、又はＲＮＡシーケンス、コピー数多型、メチル化などを生成するために遺伝子シークエンシング研究所によって処理され得る。他の検討される測定アプローチは、病理学スライド上で実行される、免疫組織化学（ＩＨＣ）、細胞学、蛍光ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙなどを含む。マイクロアレイ処理、質量分析、遺伝子シークエンシング、若しくは他の検査技術によって生成され得る他の情報はメチル化情報を含む。かかるゲノム及び／又はプロテオーム測定の様々な組み合わせも実行され得る。

【0127】

一部の実施形態において、医療研究所１８は、多量のゲノム及び／又はプロテオームデータを生成するように、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルに対して複数の標準化データ収集を実行する。例えば、標準化データ収集法は、一つ以上の染色体若しくは染色体部分に対する、或いは組織及び／又は細胞及び／又は体液のゲノム全体に対する（オプションとして整列された）ＤＮＡシーケンスを生成し得る。標準マイクロアレイを適用することによって、多数の遺伝子に対する発現レベル、様々なメチル化データなど、何千若しくは何万ものデータアイテムを生成することができる。同様に、ＰＣＲベース測定が遺伝子の選択の発現レベルを測定するために使用され得る。この大量のゲノム及び／又はプロテオームデータ若しくはその選択部分は、臨床決定支援勧告を策定するために臨床的に有用な情報を引き出すように、ＣＤＳシステム１０に入力されて処理される。

【0128】

開示のＣＤＳシステム及び関連する方法は、様々な細胞内シグナル伝達経路の活性を評価し、そこから所定期間内に臨床イベント（例えば癌）が発生するリスクを示すリスクスコアを決定するためのゲノム及び／又はプロテオームデータの処理に関する。しかしながら、開示のＣＤＳシステム（例えばＣＤＳシステム１０）はオプションとして、バイタルサインモニタリングデータ、患者の病歴データ、患者の人口統計学的データ（例えば性別、年齢など）、患者の医用画像データなど、様々な患者データに基づく記憶された臨床ガイドラインに従って臨床決定支援勧告を生成するなど、多様な追加機能をさらに含み得ることが理解されるものとする。代替的に、一部の実施形態においてＣＤＳシステム１０の機能は、本明細書に開示の通りゲノム及び／又はプロテオームデータ解析を実行して細胞内シグナル伝達経路の活性を評価し、そこから所定期間内に臨床イベント（例えば癌）が発生するリスクを示すリスクスコアを決定することのみに限定され得る。

【0129】

例示的な図６を続けて参照すると、ＣＤＳシステム１０は、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における二つ以上の細胞内シグナル伝達経路、ここではＷｎｔ経路、ＥＲ経路及びＨＨ経路の活性２２を、限定されないが、被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液の抽出サンプルにおいて測定される細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベル２０に少なくとも基づいて推定する。本明細書に開示される実施例は、例示的な細胞内シグナル伝達経路としてＷｎｔ、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路に関する。これらの経路は、経路の調節の欠失が癌の増殖の原因であり得るため、オンコロジーの様々な領域において興味深い。約１０から１５の関連するシグナル伝達経路があり、各癌は少なくとも一つの主要経路が脱調節されることによって促進される。いかなる特定の動作理論にも限定されることなく、これらの経路は細胞増殖を調節し、結果として癌細胞におけるこれらの経路の調節の欠失は経路が"常にオン"であることにつながり、従って癌細胞の増殖を加速し、ひいては癌の増殖、浸潤、又は転移（広がり）として現れ得る。

【0130】

細胞内シグナル伝達経路を形成するタンパク質カスケードの一部である中間タンパク質など、細胞内シグナル伝達経路の調節タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定は、調節タンパク質発現レベルの間接測定であり、実際の調節タンパク質発現レベルと強く相関するかどうかわからない（まして細胞内シグナル伝達経路の全活性とはほとんど相関しない）。細胞内シグナル伝達経路は標的遺伝子の転写を直接調節し、従って、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現レベルはこの調節活性の直接的な結果である。従って、ＣＤＳシステム１０は、細胞内シグナル伝達経路の一つ以上の標的遺伝子の発現レベル（代替測定としてｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）に少なくとも基づき、二つ以上の細胞内シグナル伝達経路（ここではＷｎｔ経路、ＥＲ経路、及びＨＨ経路）の活性を推定する。これは、ＣＤＳシステム１０が、測定された標的遺伝子の発現レベルによって提供される直接的な情報に基づいて経路の活性を推定することを保証する。

【0131】

そして推定活性、この実施例においてＰ_Ｗｎｔ、Ｐ_ＥＲ及びＰ_ＨＨ、すなわちＷｎｔ経路、ＥＲ経路、及びＨＨ経路の推定活性は、本明細書に詳述の通り、臨床イベント、この実施例において癌、特に乳癌が所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するために使用される２４。リスクスコアは推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づく。例えば、リスクスコアは式（７）を参照して詳述した"多経路スコア"（ＭＰＳ）であり得る。

【0132】

決定されたＭＰＳに基づいて、ＣＤＳシステム１０は、この実施例において、臨床イベントが所定期間内に発生する、異なる示されたリスクと関連する複数のリスクグループの少なくとも一つに被検体を割り当てる２６、及び／又は、臨床イベントが所定期間内に発生する示されたリスクに少なくとも一部基づいて被検体に推奨される治療を決定する２８．

【0133】

本明細書に記載の通りＣＤＳシステム若しくはＭＰＳとリスク分類のスタンドアロン実施例によって特定患者のためにＭＰＳ及び／又はリスク分類を決定することは、患者の診断若しくは治療若しくはモニタリング／経過観察に関与する腫瘍専門医、医師、若しくは他の医療従事者が、特に積極的化学療法及び／又は標的療法及び／又は免疫療法及び／又は放射線療法及び／又は外科手術の望ましくない副作用を最小限にしながら患者の長期生存の可能性が最も高くなるように治療を合わせることを可能にする。従って、例えば癌再発リスクの低い患者、すなわちＭＰＳが低い及び／又は本明細書に記載のリスク層別化アルゴリズムに基づいて低リスクと分類される患者は、現在典型的にはホルモン療法のみで、或いはホルモン療法、例えば抗エストロゲン及び／又はアロマターゼ阻害剤と、低毒性化学療法剤との組み合わせで治療される。他方で、癌再発リスクが中度若しくは高い患者、すなわちＭＰＳが中度から高い、及び／又は本明細書に記載のリスク層別化アルゴリズムに基づいて中度若しくは高リスクと分類される患者は、現在典型的にはアントラサイクリン及び／又はタキサンベース治療計画など、より積極的な化学療法で治療される。加えて、ＭＰＳは、場合によりＰ_ＥＲ、Ｐ_Ｗｎｔ、Ｐ_ＨＨ、Ｐ_ＡＲ及び／又は他の予後若しくは予測（例えばコンパニオン診断）検査など、他の患者の検査結果と組み合わせて、患者の特定の癌にとって現在主流の治療プロトコルの一部でないタモキシフェン、トラスツズマブ、ベバシズマブ及び／又は他の治療薬（例えば免疫療法）などの標的薬、及び／又は放射線療法などの他の治療オプション、例えば小線源療法、及び／又は異なる治療タイミング、例えば一次治療の前及び／又は後で、患者を治療するとの決定をすることができる。

【0134】

臨床イベント（例えば癌）が所定期間内に発生するリスクの指標として決定されたリスクスコア（ＭＰＳ）を直接用いる代わりに、ＣＤＳシステム１０はリスクスコア及び／又は推定活性の少なくとも一つを、一つ以上の追加予後検査から得られる一つ以上の追加リスクスコアと組み合わせて、複合リスクスコアを得るように構成されることが可能であり、複合リスクスコアは臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すことが留意される。一つ以上の追加予後検査は、特に、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）乳癌検査、Ｍａｍｍｏｓｔｒａｔ（登録商標）乳癌検査、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）乳癌検査、ＢｌｕｅＰｒｉｎｔ（登録商標）乳癌検査、ＣｏｍｐａｎＤｘ（登録商標）乳癌検査、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｄｅｘ（サービスマーク）（ＨＯＸＢ１３／ＩＬ１７ＢＲ）、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（登録商標）結腸癌検査、及び／又は遺伝子／タンパク質Ｋｉ６７の発現を測定することによって実行される増殖検査を有し得る。

【実施例5】

【0135】

実施例５：リンクスコアを決定するキット及び解析ツール
例えばベイジアンモデル若しくは（擬似）線形モデルを用いて、マイクロアレイ／ＲＮＡシークエンシングベースの研究に基づき、特異的経路活性を最もよく示すことがわかっている標的遺伝子のセットは、組織、細胞若しくは体液サンプル上で実行される例えば多重定量ＰＣＲアッセイ若しくは専用マイクロアレイバイオチップに翻訳され得る。本明細書に記載の遺伝子シーケンスの選択は、例えばＲＴ‐ＰＣＲ用のプライマー‐プローブセット若しくはマイクロアレイ開発用のオリゴヌクレオチドを選択するために使用され得る。このような経路活性とリスクスコア決定のためのＦＤＡに認可された検査を開発するためには、標準検査キットの開発を要し、これは規制当局の承認を得るために臨床試験で臨床評価される必要がある。

【実施例6】

【0136】

実施例６：リスクスコアの比較
図７は二つの異なって決定されたリスクスコアを比較する実験からの結果を例示するプロットを示す。特に、第一のリスクスコア（ＭＰＳ）は式（８）に従って計算され、第二のリスクスコアは式（７）に従って計算された。第一のリスクスコアは乳癌サンプル（ＧＳＥ６５３２及びＧＳＥ９１９５）について決定されるハザード比の対数を割り当てることによって乳癌サンプルについて最適化され、これはα＝ｌｏｇ（１／０．３６）、β＝ｌｏｇ（３．６７）及びγ＝ｌｏｇ（２．２９）をもたらした。第二のリスクスコアのαとβについての値は１に等しくなるように例示的に選ばれた。実験はＧＳＥ２１６５３、ＧＳＥ２０６８５、及びＥ‐ＴＡＢＭ‐３６５データセットについて実行され、算入（標本採取）後１０年で再発する患者の割合を各リスクスコアの関数として決定した（リスクスコアは容易に比較され得るようにスケーリングされる）。全部で１１３０患者が登録され、そのうち１００５が完全生存データを有した。破線曲線は式（８）に従って計算された第一のリスクスコアについての結果をあらわし、実線曲線は式（７）に従って計算された第二のリスクスコアについての結果をあらわす。

【0137】

式（７）に従って計算された第二のリスクスコア（実線曲線）は単調増加するリスクをもたらすが、式（８）に従って計算された第一のリスクスコア（破線曲線）は高リスクスコアにおいて横ばいになる（少々減少するようにも見える）ことがプロットから認められる。これは式（８）に従って計算された第一のリスクスコアの上限において患者のリスクを区別することはもはや不可能であるが、一方式（７）に従って計算された第二のリスクスコアの場合、リスクはリスクスコアとともに連続的に増加することを意味する。

【0138】

加えて、式（７）に従って計算された第二のリスク（実線曲線）は式（８）に従って計算された第一のリスク（破線曲線）よりも高リスク患者をよく区別することができるが（０．８４ｖｓ．０．７８）、低リスク患者もわずかによりよく同定することができる（０．４３ｖｓ．０．４５）こともプロットから明らかである。

【0139】

一般に、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路、及び／又はＨＨ経路に関する実施例が例示的な実施例として提供されるが、本明細書に開示の細胞内シグナル伝達経路解析のためのアプローチは、これら経路に加えて他の細胞内シグナル伝達経路、例えば細胞膜内受容体を伴う細胞間シグナル伝達経路及び細胞内部の受容体を伴う細胞内シグナル伝達経路に容易に適用されることが理解されるものとする。加えて、本願は複数の好適な実施形態を記載する。先の詳細な説明を読んで理解することで修正及び変更が想到され得る。本願はかかる修正及び変更をそれらが添付の請求項若しくはその均等物の範囲内にある限り全て含むものと解釈されることが意図される。

【0140】

開示の実施形態への他の変更は、図面、開示及び添付の請求項の考察から、請求される発明を実施する当業者によって理解されもたらされることができる。

【0141】

請求項において、"有する"という語は他の要素若しくはステップを除外せず、不定冠詞"ａ"若しくは"ａｎ"は複数を除外しない。

【0142】

単一ユニット若しくはデバイスは請求項に列挙される複数の項目の機能を満たし得る。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されるという単なる事実はこれら手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。

【0143】

一つ若しくは複数のユニット若しくはデバイスによって実行されるリスクスコアの決定のような計算は任意の他の数のユニット若しくはデバイスによって実行されることができる。

【0144】

コンピュータプログラムは、他のハードウェアと一緒に若しくはその一部として供給される光学記憶媒体若しくは固体媒体などの適切な媒体上で記憶／分散され得るが、インターネット又は他の有線若しくは無線通信システムなどを介して他の形式で分散されてもよい。

【0145】

請求項における任意の参照符号は範囲を限定するものと解釈されてはならない。

【0146】

本願は主に臨床イベントが所定期間内に発生するリスクを示すリスクスコアを決定するための特異的方法に関し、リスクスコアは被検体の組織及び／又は細胞及び／又は体液における二つ以上の細胞内シグナル伝達経路の推定活性の組み合わせに少なくとも一部基づく。本願はかかる方法を実行するように構成されるデジタルプロセッサを有する装置に、かかる方法を実行するようにデジタル処理装置によって実行可能な命令を記憶する非一時的記憶媒体に、及びデジタル処理装置にかかる方法を実行させるためのプログラムコード手段を有するコンピュータプログラムにも関する。

【0147】

文献：
de Sousa E Melo F, C. S. (2011). Methylation of cancer-stem-cell-associated Wnt target genes predicts poor prognosis in colorectal cancer patients. Cell Stem Cell., 476-485
Hatzis P, v. d. (2008). Genome-wide pattern of TCF7L2/TCF4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells. Mol Cell Biol., 2732-2744
Nusse, R. (2012, May 1). Wnt target genes. Retrieved from The Wnt homepage: http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/target_genes
Soderberg O, G. M. (2006). Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods., 995-1000
van de Wetering M, S. E.-P.-F. (2002). The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell, 241-250.

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】