特許 6603305 混合液混合種培養によるバイオ燃料生産技術

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6603305

(24)【登録日】2019年10月18日

(45)【発行日】2019年11月6日

(54)【発明の名称】混合液混合種培養によるバイオ燃料生産技術

(51)【国際特許分類】

   C12P 5/02 20060101AFI20191028BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20191028BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20191028BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20191028BHJP

【ＦＩ】

   C12P5/02ZNA

   C12N1/12 A

   C12N1/12 C

   C12N1/20 A

   C12R1:01

【請求項の数】9

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2017-503746(P2017-503746)

(86)(22)【出願日】2016年3月4日

(86)【国際出願番号】JP2016057691

(87)【国際公開番号】WO2016140374

(87)【国際公開日】20160909

【審査請求日】2018年12月20日

(31)【優先権主張番号】特願2015-43817(P2015-43817)

(32)【優先日】2015年3月5日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業個人型研究（さきがけ）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-01981

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-01982

(73)【特許権者】

【識別番号】504203572

【氏名又は名称】国立大学法人茨城大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】朝山 宗彦

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１３０４３７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０１３−１９８４７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１４２８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ORTIZ-MARQUEZ J.C. et al.，Association with an ammonium-excreting bacterium allows diazotrophic culture of oil-rich eukaryotic，Appl. Environ. Microbiol.，78(7)(2012)，p.2345-2352，ISSN: 0099-2240

【文献】 YAMANE K. et al.，Anaerobic coculture of microalgae with Thermosipho globiformans and Methanocaldococcus jannaschii at，Appl. Environ. Microbiol.，79(3)(2013)，p.924-930，ISSN: 0099-2240

【文献】 遠山 忠 他，Sinorhizobium sp.SP4によるウキクサの光合成能力、バイオマス生産性と水質浄化機能の向上，日本生物工学会大会講演要旨集，Vol.65th(2013)，p.67,1P-200

【文献】 大久保 亨 他，乾燥培養におよる気生微細藻類Coccomyxa sp.を用いたオイル生産の検討，第17回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集，Vol.17(2015.5.30)，P-B-30, 特に、【結果および考察】

【文献】 LIANGQI Z. et al.，Synthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate) by a Sinorhizobium fredii strain.，Lett. Appl. Microbiol.，42(2006)，p.344-349，ISSN: 0266-8254

【文献】 TIBBLES B.J. et al.，Characterization of nitrogen-fixing bacteria from a temperate saltmarsh lagoon, including isolates t，Microb. Ecol.，27(1994)，p.65-80，ISSN: 0095-3628

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ５／０２

Ｃ１２Ｎ １／１２

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｒ １／０１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号NITE BP-01982で特定されるハロミクロネマ・エスピー(Halomicronema sp.)SZ2菌株又は糖生産能を有するその変異株と受託番号NITE BP-01981で特定されるシノリゾビウム・エスピー(Sinorhizobium sp.)ST1菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株とを含む混合微生物を、窒素源欠乏培地において共培養することを含む、ヘプタデカンの製造方法。

【請求項2】

培地が無機物培地と有機物培地とをさらに含有する、請求項１記載の方法。

【請求項3】

培地が炭素源をさらに含有する、請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

炭素源が酢酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。

【請求項5】

培地が糖源をさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

糖源がグルコースである、請求項５記載の方法。

【請求項7】

共培養において所定の暗黒期間を設ける、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

受託番号NITE BP-01981で特定されるシノリゾビウム・エスピーST1菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株。

【請求項9】

受託番号NITE BP-01982で特定されるハロミクロネマ・エスピーSZ2菌株又は糖生産能を有するその変異株と受託番号NITE BP-01981で特定されるシノリゾビウム・エスピーST1菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株とを含む混合微生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば光合成微生物と非光合成微生物との共培養により、バイオ燃料を生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

エネルギーを化石燃料（天然ガス・石油・石炭等）に依存する日本の現状を鑑みると、将来、自国の技術により燃料を自力で生産できることが重要である。そこで、水と二酸化炭素を光合成により固定し、ブドウ糖等の有機物を生産することのできる光合成生物を利用してバイオ燃料を生産する試みが日本内外で大変注目されている。
シアノバクテリア（原核光合成微生物）を含む光合成微生物は、広義の意味で微細藻類に属するが、光合成能は植物のそれと比較して数十倍から百倍とも言われている。加えて、バイオ燃料生産に微細藻類を使用する場合、植物と比べて土や根茎等といった栽培後に不要となる廃棄物も出ない事から、次世代バイオ燃料生産に使用される生物として有望視されている。
ところで、バイオ燃料は、バイオディーゼルの原料となる中性脂肪（トリアシルグリセロール，ＴＡＧ）や脂肪酸、炭化水素等に大別される。前者２つは化学構造に酸素（Ｏ）分子を有しているが、炭化水素は炭素（Ｃ）と水素（Ｈ）のみで構成されており、エンジン等に優しい燃料として石油産業界で好まれている。炭化水素燃料は炭素数とそれらを繋ぐ二重結合の数と位置により、燃料としての性質が規定される。このうち二重結合を含まない鎖式飽和炭化水素は、アルカン（Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋２）と呼ばれ、炭素数が１〜２０までの短鎖アルカンは、私達の身の回りで様々な燃料として役立っている。とりわけ炭素数が１１〜１７又は１２〜１７のアルカンは、標準（常温常圧）状態で液体であり、ジェット燃料や軽油相当の燃料として位置づけられる。
これまで微細藻類のうち、シアノバクテリア天然藻の一部の種で、炭素数１５（ペンタデカン，Ｃ_１５Ｈ_３２）や１７（ヘプタデカン，Ｃ_１７Ｈ_３６）のアルカンを生産する株が知られている（非特許文献１）。本発明者グループは、これまでシアノバクテリア天然藻を遺伝子操作により改変し、細胞乾燥重量当たり約５０〜６０％に及ぶ変異株を取得することに成功している（特許文献１）。これに限らず微細藻類の天然藻や遺伝子組換藻を用いたバイオ燃料生産が試みられている。
それら従来の技術では、単離純化された藻細胞を滅菌した培地中で無菌的あるいは無菌状態に近づけながら培養することによって、藻細胞内外へバイオ燃料を生産してきた。また、バイオエタノール生産等に見られるように、植物から生産されるブドウ糖を回収した後、酵母の発酵により目的物を得る２段階生産技術と比較して、光合成微生物を利用することのメリットは、前述したようにブドウ糖から目的有機物質（バイオ燃料等）を１段階（一つのバイオリアクター内で同時に培養しながら）生産できる点にある。
一方、共培養による有用物質生産の従来法の例としては、アクチノタレア・ファーメンタス細菌と酵母を共培養することによりハロゲン化メチルを生産する系（特許文献２）、緑藻ボトリオコッカス培養液にアスティカカリウス・エキセントリカス菌株を添加し共培養することにより緑藻の増殖を促進させる系（特許文献３）、加水分解されたバイオマス原料からエタノール燃料を生産する系においてクロストリジウム・フィトフェルメンタンス細胞あるいは更に他の微細物を含む共培養による方法（特許文献４）等が挙げられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１３−１９８４７３号公報

【特許文献2】特表２０１１−５０５１４８号公報

【特許文献3】特開２０１０−２５２７００号公報

【特許文献4】特表２００９−５２４４３２号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ａ．，Ｍａｔｈｅｗ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｐｏｐｏｖａ，Ｅ．，ａｎｄ Ｃａｒｄａｙｒｅ Ｓ．Ｂ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｎｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０年，３２９（５９９１），ｐｐ．５５９−５６２

【発明の概要】

【0005】

上述の実情に鑑み、本発明は、バイオ燃料を生産する新規の技術を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、光合成微生物と非光合成微生物とを同時に存在させ、混合種同士を同一空間で窒素源欠乏培地において培養（共培養）することにより、バイオ燃料を生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）光合成微生物と非光合成微生物とを含む混合微生物を、窒素源欠乏培地において共培養することを含む、バイオ燃料の製造方法。
（２）光合成微生物がハロミクロネマ（Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ）属に属する微生物である、（１）記載の方法。
（３）ハロミクロネマ属に属する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８２で特定されるハロミクロネマ・エスピー（Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ ｓｐ．）ＳＺ２菌株又は糖生産能を有するその変異株である、（２）記載の方法。
（４）非光合成微生物がシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物である、（１）〜（３）のいずれか１記載の方法。
（５）シノリゾビウム属に属する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８１で特定されるシノリゾビウム・エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＳＴ１菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株である、（４）記載の方法。
（６）培地が無機物培地と有機物培地とをさらに含有する、（１）〜（５）のいずれか１記載の方法。
（７）培地が炭素源をさらに含有する、（１）〜（６）のいずれか１記載の方法。
（８）炭素源が酢酸ナトリウムである、（７）記載の方法。
（９）培地が糖源をさらに含有する、（１）〜（８）のいずれか１記載の方法。
（１０）糖源がグルコースである、（９）記載の方法。
（１１）共培養において所定の暗黒期間を設ける、（１）〜（１０）のいずれか１記載の方法。
（１２）共培養後、共培養物を乾燥ストレス下で更に培養することを含む、（１）〜（１１）のいずれか１記載の方法。
（１３）バイオ燃料が短鎖アルカンである、（１）〜（１２）のいずれか１記載の方法。
（１４）短鎖アルカンがヘプタデカンである、（１３）記載の方法。
（１５）受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８２で特定されるハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株又は糖生産能を有するその変異株。
（１６）受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８１で特定されるシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株。
（１７）（１５）記載のハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株又は糖生産能を有するその変異株と（１６）記載のシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株とを含む混合微生物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−０４３８１７号の開示内容を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ＭＣＭＳ培養の概要を示す模式図である。

【図2】ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株の顕微鏡写真である。

【図3】ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株の糖生産を示す写真である。

【図4】ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株とシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株共存下でのシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株による炭化水素生産を示す写真である。

【図5】炭化水素生産におけるハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株とシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株の相性を示す図である。

【図6】炭化水素生産におけるシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株の培養のための培地組成条件の検討結果を示す図である。

【図7】ＭＣＭＳ培養による５Ｌ規模のバイオ燃料生産におけるＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。

【図8】ＭＣＭＳ培養による燃料蓄積の経時変化を示すグラフである。

【図9】ＭＣＭＳ培養による油（ヘプタデカン）生産量を示すグラフである。

【図10】乾燥ストレスによるＳＺ２藻の油生産を示す図である。

【図11】乾燥ストレス藻ＳＺ２細胞内の脂肪酸と炭化水素Ｃ_１７Ｈ_３６の蓄積を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明に係るバイオ燃料の製造方法（以下、「本方法」と称する）は、光合成微生物と非光合成微生物とを含む混合微生物を、窒素源欠乏培地において共培養する（同一空間で培養する）ことで、光合成微生物が糖を生産する一方、当該生産された糖を炭素源として利用し、非光合成微生物が油（炭化水素）等のバイオ燃料を生産する方法である。生産されるバイオ燃料としては、例えばヘプタデカン等の炭素数１〜２０個の短鎖アルカンが挙げられる。
図１に、混合液混合種培養（ＭＣＭＳ：Ｍｉｘｅｄ−Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｘｅｄ−Ｓｐｅｃｉｅｓ）の概要を示す。従来の細胞の培養方法は、目的とする細胞を純化し一種類の細胞を単純組成の培地で培養する（ＵＣＵＳ：Ｕｎｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓ）ことを特徴としている。この場合、細胞株の純化が困難であったり、目的とする出口産物やそれを生産する培養条件が限定される場合がある。一方、本方法は、混合液混合種培養（ＭＣＭＳ：Ｍｉｘｅｄ−Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｘｅｄ−Ｓｐｅｃｉｅｓ）を特徴とする。混合液とは、無機物と有機物を成分とする培地であり、混合種とは、光合成微生物を含む２種類以上の細胞が共存することを意味する。特に、混合種培養は「共培養」と位置づけられる。共培養では、単一種純粋培養よりも培養条件や目的生産物の種類に多様性が与えられ、さらには昼夜を問わず油等のバイオ燃料の生産が可能であるので、バイオ燃料の生産量を向上させ、また経費を削減することができる。
本方法において、光合成微生物としては、水と二酸化炭素とを光合成により固定し、ブドウ糖等の有機物を生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばシアノバクテリア（原核光合成微生物）が挙げられる。シアノバクテリアとしては、例えばハロミクロネマ属、マイクロキスティス属、リムノスリックス属、シュードアナベナ属等の属に属する微生物が挙げられる。また、ハロミクロネマ属に属する微生物としては、例えば、ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株（以下、「ＳＺ２菌株」等と称する場合がある）又は糖生産能を有するその変異株（例えば自然突然変異株、突然変異誘発処理株）等が挙げられる。
ＳＺ２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２６年（２０１４年）１２月１２日付で寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ Ｐ−０１９８２である。さらに、ＳＺ２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２８年（２０１６年）２月１２日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８２として国際寄託へ移管されている。ＳＺ２菌株は、下記の実施例に示す菌学的性質及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性分析等により、菌体表面に糖を生産する糸状性シアノバクテリアの一種ハロミクロネマ属に属する新菌株であると同定した。
一方、非光合成微生物としては、光合成微生物以外の糖等の炭素源を利用してバイオ燃料を生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばシノリゾビウム属、シノリゾビウム属と近属のリゾビウム属、アゾリゾビウム属、メソリゾビウム属、アグロバクテリム属等に属する微生物が挙げられる。シノリゾビウム属に属する微生物としては、例えば、シノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株（以下、「ＳＴ１菌株」等と称する場合がある）又はヘプタデカン等の短鎖アルカン生産能を有するその変異株（例えば自然突然変異株、突然変異誘発処理株）等が挙げられる。
ＳＴ１菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２６年（２０１４年）１２月１２日付で寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ Ｐ−０１９８１である。さらに、ＳＴ１菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２８年（２０１６年）２月１２日付けで受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８１として国際寄託へ移管されている。ＳＴ１菌株は、下記の実施例に示す菌学的性質及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性分析等により、根粒菌シノリゾビウムに属する新菌株であると同定した。
本方法においては、好ましくはＳＺ２菌株又は糖生産能を有するその変異株とＳＴ１菌株又は短鎖アルカン生産能を有するその変異株とを含む混合微生物を使用する。
先ず、本方法においては、光合成微生物と非光合成微生物とを準備する。
光合成微生物は、無機物培地で培養（前培養）し、調製することができる。ここで、無機物培地とは、例えばＢＧ１１培地のように栄養源として糖類を含まない培地を意味する。ＳＺ２菌株の場合には、例えば無機物培地としてＢＧ１１液体培地［培地組成：０．００３ｍＭ Ｎａ_２−Ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２９ｍＭ クエン酸、０．１８ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．３０ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３（無水）、０．０３ｍＭ クエン酸鉄アンモニウム、１ｍｌ／Ｌ 微量栄養素（微量栄養素の組成：２．８６ｇ／Ｌ ホウ酸、１．８１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、０．２２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３９ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０８ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０４９ｇ／Ｌ Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ）、１．５ｇ／Ｌ ＮａＮＯ_３］を使用し、例えば２０〜４０℃（好ましくは２７〜３３℃）の温度下で７〜９０日間（好ましくは１０〜６０日間）振盪（１〜２００ｒｐｍ、好ましくは４０〜１１０ｒｐｍ）又は静置培養することで、ＳＺ２菌株培養物を準備することができる。
一方、非光合成微生物は、有機物培地で培養（前培養）し、調製することができる。ここで、有機物培地とは、栄養源としてグルコースなどの糖類（あるいは一酸化炭素や二酸化炭素などを除いた炭素を含む化合物の中で炭素と酸素から成るもの）を含有する培地を意味する。ＳＴ１菌株の場合には、例えば有機物培地としてＬＢ液体（寒天）培地（培地組成：ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、粉末酵母エキス５ｇ／Ｌ、寒天培地にする場合は以上にＢａｃｔｏ Ａｇａｒを１５ｇ／Ｌの割合で添加し、これをオートクレーブ後、シャーレに注ぎ固化させる）を使用し、２８〜３０℃の温度下で１〜数日間（寒天培地の場合は数日〜６０日間）振盪（０〜２００ｒｐｍ、好ましくは９０〜１２０ｒｐｍ）培養することで、ＳＴ１菌株培養物を準備することができる。
次いで、本方法では、光合成微生物と非光合成微生物とを組み合わせて混合微生物とし、当該混合微生物を例えば窒素源欠乏培地において共培養する。なお、ＳＺ２菌株には、自然界において共存菌としてＳＴ１菌株が共存しており、当該共存下の混合微生物を使用してもよい。
また、光合成微生物と非光合成微生物は、それぞれ単離したものであってよく、あるいは上述の前培養物自体を各微生物として使用することができる。前培養物を使用する場合には、共培養における窒素源欠乏培地に前培養に使用した無機物培地及び／又は有機物培地とが含有されることとなる。窒素源欠乏培地に対する前培養に使用した無機物培地及び／又は有機物培地の割合としては、例えば０〜１００容量％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．４〜２０容量％（ｖ／ｖ）が挙げられる。
混合微生物における光合成微生物と非光合成微生物との混合比としては、例えばＳＺ２菌株とＳＴ１菌株との場合において、２ヶ月間前培養した培養液５０ｍＬから集菌したＳＺ２菌株と前培養した培養液（ＯＤ_６６０＝２）５ｍＬから集菌したＳＴ１菌株とを１：１とすると、ＳＺ２菌株：ＳＴ１菌株＝１：０．０４〜１：２、好ましくは１：１程度が挙げられる。
共培養に使用される窒素源欠乏培地としては、窒素源を含まないか、又は通常の培地（例えば、ＢＧ１１液体培地）中の窒素源に対して窒素源が乏しい（例えば、０〜５０％、好ましくは０〜１０％の窒素源を含む）培地である。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム等が挙げられる。例えばＳＺ２菌株とＳＴ１菌株との混合微生物の共培養においては、窒素源欠乏培地としてＢＧ１１_０液体培地（培地組成：前記のＢＧ１１培地組成よりＮａＮＯ_３を全部抜いたもの）或いはＮａＮＯ_３を部分的（１割〜９割程度）に抜いたＢＧ１１培地を使用することができる。なお、窒素源欠乏培地は、非滅菌の蒸留水等を使用して調製したものであってもよい。非滅菌の蒸留水を使用することで、培養コストを削減することができる。
さらに、窒素源欠乏培地には、炭素源及び／又は糖源を添加することが好ましい。炭素源を添加することで、更に炭素源を補強することができる。添加する炭素源としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。窒素源欠乏培地への炭素源の添加量は、例えば窒素源欠乏培地における最終濃度１〜数１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ程度となる量である。一方、糖源を添加することで、光合成微生物が生産する糖に加えて、添加した糖源を利用し、非光合成微生物がバイオ燃料を生産することができ、バイオ燃料生産量を向上させることができる。糖源としては、例えば単糖類であるグルコース、キシロース、アラビノース、キシロース、リボース、デオキシリボース、フルクトース、ガラクトース、マンノース等、二糖類であるラクトース、マルトース、トレハロース等、三糖類であるマルトトリース、ラフィノース等、オリゴ糖である、フラクトオリゴ（ＦＯＳ）糖、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ（ＭＯＳ）糖等、多糖類であるグリコーゲン、デンプン、セルロース、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン質等、その他産業廃棄物（廃糖蜜、発酵液、糞尿液、下水等）に含まれる廃棄糖等が挙げられる。窒素源欠乏培地への糖源の添加量は、例えば窒素源欠乏培地における最終濃度０．０１〜数百ｍＭ、好ましくは０．１〜２０ｍＭ（本方法では０．５ｍＭ程度）となる量である。
共培養は、例えば２０〜３０℃（好ましくは２５〜３０℃）の温度条件、０〜５００μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓ^１（好ましくは１０〜１００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓ^１）の光強度条件（例えば、白色光照射下）、０．０４〜１２％（好ましくは０．５〜３％）の二酸化炭素ガス供給（０．０１〜５０Ｌ／ｍｉｎ、好ましくは０．１〜２０Ｌ／ｍｉｎ）下等の条件下で数日〜３０日間（好ましくは５日間程度〜２０日間程度）静置又は振盪（１０〜２００ｒｐｍ、好ましくは３０〜５０ｒｐｍ）培養により行われる。
また、共培養において、所定の暗黒期間を設けることで、培養コストを削減することができる。例えば、照明１２時間間隔（すなわち、明／暗（１２時間／１２時間）サイクル）条件下で共培養を行うことができる。
さらに、共培養後、共培養物を乾燥ストレス（例えば、培地液体の自然乾燥）下で更に培養することで、光合成微生物自身でもバイオ燃料の生産が可能となる。当該培養は、上述の共培養条件に準じた条件下で数日〜数十日間（好ましくは２週間程度〜２ヶ月間程度）静置培養により行われる。
以上に説明した本方法によれば、炭化水素（アルカン）等のバイオ燃料を高収量で生産することができる。例えば、共培養物を酢酸エチル等の溶媒抽出に供することで、バイオ燃料を回収することができる。また、ＭＣＭＳ系で連続的にヘプタデカン等を液体燃料として回収し、その後、培養の最後は共培養物を乾燥させると、乾燥菌体を固形燃料として使用でき、経済的にコスト安な燃料製造法となる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0008】

ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株の分離・単離及び当該菌株の分類学的性質
１−１．ＳＺ２菌株の分離
日本国静岡県修善寺市の道端石垣より数グラム（一塊）の試料を採取し、これをＢＧ１１液体培地と混ぜて１ヶ月程度静置培養して藻細胞の生育を促した。この藻細胞液からＳＺ２株細胞を混釈重層法（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら２０１０年，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７巻１８２７−１８３５頁）により分離し、ＢＧ１１寒天培地へ塗抹し、３０℃（白色蛍光灯下）で培養した。寒天培地上に生育したＳＺ２株細胞塊をかき取り、新しいＢＧ１１液体培地に移して継代培養した。以上により得られた分離株（ＳＴ１細胞含む）をＳＺ２と命名した。
１−２．ＳＺ２菌株の生理学的性質
ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株をＢＧ１１液体培地で３０℃（白色蛍光灯下）で静置培養（一日一回程度の撹拌を行う）すると、１細胞当たりの長辺が約３〜５μｍの細胞が連なった糸状性細胞形態を示す。ＳＺ２株は、さらに上記培養条件下で約２週間以上培養すると、ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｓｔａｉｎ）染色で観察される中性多糖を菌体外に生産する。この多糖の生産が数ヶ月続くとＳＺ２株細胞塊の回りは、バイオフィルムで覆われ肉眼でも顕著な特徴として観察される。
１−３．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）配列によるＳＺ２菌株の分類特定
ＳＺ２株を優先種とする培養液より菌体を回収し、細胞全ＤＮＡを抽出して１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１：８６２塩基対）を解読した。この配列をＱｕｅｒｙとして遺伝子ＤＮＡデータベースと総当たり検索をしたところ、２０１５年３月時点でシアノバクテリアＨａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ属株数種の有する１６Ｓ ｒＤＮＡと９２％以上の相同性を有していた。またコンピューター解析ソフトＭＥＧＡ４（Ｔａｍｕｒａら２００７年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２４巻１５９６−１５９９頁）により分子系統樹を作成すると、ＳＺ２株が糸状性シアノバクテリアの一種Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ属クラスターに位置付けされる新種藻であることが明らかとなった。

【実施例2】

【0009】

シノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株の単離及び当該菌株の分類学的性質
２−１．ＳＴ１菌株の単離
実施例１において前述した混釈重層法により得られたＳＺ２分離株（ＳＴ１株細胞を含む）のＢＧ１１培養液から約１０マイクロリットルを採取し、これをＬＢ寒天培地にクロスストリークしながら塗り広げた。この寒天培地を３０℃で数日間培養し、生育したＳＴ１のコロニーを単離した。以上により得られた単離（純化）株をＳＴ１と命名した。
２−２．ＳＴ１菌株の生理学的性質
ＬＢ培地あるいはＬＢ寒天培地で生育させる温度は、通常３０℃前後である（３７℃培養で生育は認められない）。１細胞当たりの長辺は、約０．７〜２μｍの単細胞性である。
２−３．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列によるＳＴ１菌株の分類特定
ＳＴ１単離（純化）株より細胞全ＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号２：１，４７５塩基対）を解読した。この配列をＱｕｅｒｙとして遺伝子ＤＮＡデータベースと総当たり検索をしたところ、２０１５年３月時点でＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属株数種の有する１６Ｓ ｒＤＮＡと９９％以上の相同性を有していた。またコンピューター解析ソフトＭＥＧＡ４（前述）により分子系統樹を作成すると、ＳＴ１株がシノリゾビウムやリゾビウム属クラスターに位置付けされる新種株であることが明らかとなった。

【実施例3】

【0010】

ハロミクロネマ・エスピーＳＺ２菌株とシノリゾビウム・エスピーＳＴ１菌株との共培養（ＭＣＭＳ培養）によるバイオ燃料生産
３−１．ＳＺ２菌株
図２は、ＳＺ２菌株の顕微鏡写真（ｘ １，０００：（Ａ）光学顕微鏡観察、（Ｂ）蛍光顕微鏡観察）である。図２において、棒は１０μｍである。ＳＺ２菌株を、ＢＧ１１液体培地５０ｍＬを含有する１００ｍＬ容三角フラスコで３週間振盪（１００ｒｐｍ）培養した。以上の条件下では、優先種はＳＺ２藻細胞であり、ＳＴ１細胞（矢印）等の共存菌は僅かに観察される程度であった。１細胞当たりの長辺は、ＳＺ２菌株では約３〜５μｍであり、ＳＴ１菌株では約０．７〜２μｍであった。蛍光顕微鏡（励起４６０−４９５ｎｍ／放射５１０ｎｍ，オリンパスＢＸ５３／ＤＰ７２）観察では、光合成微生物特有の自家蛍光が認められた。ＳＺ２細胞の凝集体では、糸状性細胞の周りに多糖と思われる物質の蓄積が認められた。
３−２．ＳＺ２菌株の糖生産
図３は、ＳＺ２菌株の糖生産を示す写真である。
ＰＡＳ染色（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｓｔａｉｎ）は、中性多糖類（グリコーゲン、キチン、ヘパリン、粘液タンパク質、糖タンパク質、糖脂質等）の検出法である。過ヨウ素酸はグルコース残基を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色を呈す。
図３（Ａ）：ＳＺ２菌株をＢＧ１１液体培地で４週間静置培養した後、培養液１ｍＬを回収して遠心し、藻菌体を集菌した。蒸留水で藻を洗浄後、再び遠心して蒸留水を捨てた。集菌細胞に０．５％（ｗ／ｖ）過ヨウ素酸（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ，和光純薬製）水溶液を３００μＬ加え懸濁後、３分放置した。その後、過ヨウ素酸水溶液を遠心して捨てた。これに蒸留水を加え洗浄し、遠心して蒸留水を捨てた。シッフ試薬（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ，和光純薬製）を加え、藻を懸濁した。１３分放置後、シッフ試薬を遠心して捨てた。これを３回繰り返した後、蒸留水を加え洗浄し遠心して、顕微鏡観察の試料とした。これを光学顕微鏡（オリンパスＢＸ５３／ＤＰ７２）観察した。細胞内、細胞外表面に多糖の蓄積が観察された（図３（Ａ）において、棒は１０μｍである）。
図３（Ｂ）：図３（Ａ）に示す試料を更に２ヶ月間静置培養した後、多糖を生産した細胞を塊ごとシャーレに移した時の様子を示す。ＳＺ２細胞塊の周りの白いフィルム様部分が蓄積した多糖である。（図３（Ｂ）において、棒は１ｃｍである）。
３−３．ＳＺ２菌株とＳＴ１菌株共存下でのＳＴ１菌株による炭化水素生産
図４は、ＳＺ２菌株とＳＴ１菌株共存下でのＳＴ１菌株による炭化水素生産を示す写真である。
ＳＴ１菌株が共存しているＳＺ２藻細胞をＢＧ１１培地で３週間培養後（図２）、培養液５０ｍＬを回収し遠心して、細胞塊を新たな窒素欠乏ＢＧ１１_０液体培地５０ｍＬ（１００ｍＬ用三角フラスコ内）へ移植した。ＢＧ１１_０液体培地には炭素源の補強として、予め最終濃度１０ｍＭになるように酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を添加しておいた。以上の培地を通常大気中で白色蛍光灯照射下（３０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓ^１）で１０日間静置培養した後、液体培地１ｍＬを回収した。炭化水素の蓄積を確認するため、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（和光純薬）を最終濃度１０μＭになるよう培地に添加し細胞を染色し、これを光学顕微鏡（図４（Ａ））並びに蛍光顕微鏡（励起４６０−４９５ｎｍ／放射５１０ｎｍ，図４（Ｂ））で観察した。
光学顕微鏡観察の結果、窒素欠乏条件下で培養すると糸状性ＳＺ２藻細胞を取り囲むようにしてＳＴ１細胞の増殖が認められた。これによりＳＺ２細胞とＳＴ１細胞の比率は、ＢＧ１１培地での培養では圧倒的にＳＺ２細胞が優先種で占められているのに対し、ＢＧ１１_０培地では相対的にＳＴ１細胞が増加していることが明らかとなった。一方、蛍光顕微鏡観察の結果、ＳＴ１細胞内に顕著な炭化水素の蓄積が認められた（図４（Ａ）及び（Ｂ）において、棒は１０μｍである）。
３−４．炭化水素生産におけるＳＺ２菌株とＳＴ１菌株の相性
ＳＺ２株培養液より単離純化したＳＴ１株細胞の培養液を３種類のシアノバクテリア藻培養液に添加混合し、ＳＴ１株の相手となる藻細胞と「共培養」することにより、ＳＴ１株による炭化水素生産における相手藻細胞の相性を検証した。
結果を図５に示す。使用したシアノバクテリア３種のうち、ＳＺ２株以外の２種はそれぞれ純化株を用いた。３週間ＢＧ１１培地で前培養した各種藻細胞液５０ｍＬに相当する菌体を遠心回収し、第３−３節で説明したＢＧ１１_０液体培地（酢酸ナトリウム＝酢酸Ｎａ添加）へ懸濁した。これに予め一晩ＬＢ液体培地で培養（３０℃、１１０ｒｐｍ振盪培養）したＳＴ１細胞培養液１ｍＬ（ＯＤ_６６０＝２）を遠心分離して集菌した量に相当する湿潤菌体を直接とって、上記５０ｍＬ ＢＧ１１_０液体培地へ移植した。これを第３−３節で記述したように大気中（０．０４％ＣＯ_２ガス含む）で５日間静置培養した。その後、細胞をＮｉｌｅ Ｒｅｄ染色して蛍光顕微鏡観察を行った。
その結果、ＢＧ１１液体培地を使用してＳＴ１株と各種藻を共培養した場合は、いずれの共培養下でも炭化水素生産は殆ど認められなかった。一方、ＢＧ１１_０（窒素源欠乏）培地で共培養した場合、ＳＴ１株による炭化水素生産量は、ＳＺ２株＞ＰＣＣ６８０３株＞ＡＢＲＧ５−３株との共培養の順に高かった。この結果から、ＳＴ１株による炭化水素生産時に共存させる相手藻に関しては特異性が認められ、元々自然界から分離された時のＳＴ１株と共存するＳＺ２藻との相性が一番良い事が明らかとなった。
図５において略語は以下を示す：ＳＺ２，Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ ｓｐ．ＳＺ２；ＰＣＣ６８０３，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３（パスツール研究所（仏国，パリ）保存株；かずさＤＮＡ研究所（千葉県木更津市かずさ鎌足２−６−７）より分譲）；ＡＢＲＧ５−３，Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ／Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．ＡＢＲＧ５−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２２１７２；特開２０１３−１９８４７３号公報）。また、図５において、棒は１０μｍである。さらに、図５において、ＳＴ１株による炭化水素（油）生産の有無： 有，＋；無，−。
３−５．炭化水素生産における培地組成条件
ＳＺ２株とＳＴ１株の菌体組み合わせ、培地中の窒素源の有無並びに酢酸ナトリウム（酢酸Ｎａ，最終濃度１０ｍＭ）添加の有無について、第３−４節に示す培養条件により飼育した菌体をＮｉｌｅ Ｒｅｄにより染色し、ＳＴ１株の炭化水素生産における培地組成条件について検証した。
結果を図６に示す。先ず、ＳＴ１細胞が炭化水素を一番効率良く生産する条件としては、ＳＺ２藻細胞との共培養（ＭＳ：Ｍｉｘｅｄ−Ｓｐｅｃｉｅｓ）で窒素欠乏（ＢＧ１１_０培地使用）条件下且つ培地に炭素源の補強剤として酢酸ナトリウムを添加した場合であった（図６上段左）。この組み合わせより培地を窒素欠乏にしなければ（ＢＧ１１培地使用）、ＳＴ１細胞の炭化水素の顕著な蓄積は認められなかった（図６上段右）。このことは、ＳＴ１細胞の効率的な炭化水素生産にはＳＺ２藻細胞との共培養が有効であり、且つ窒素源欠乏培地で培養することが必須ということが明らかとなった。
次に、単離純化されたＳＴ１株のみを用いて同様の実験を行ったところ、窒素源欠乏培地で酢酸ナトリウムを添加した場合は、ＳＴ１株単独培養（ＵＣＵＳ：Ｕｎｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓ）でも炭化水素を生産していた（図６中段左）。しかしながら、その生産能は、ＳＺ２株と共培養した場合に比べて低かった。また酢酸ナトリウムを添加していても、培地が窒素欠乏になっていなければＳＴ１株の炭化水素生産は認められなかった（図６中段右）。
以上により、ＳＴ１株の炭化水素生産は、炭素源を供給し、且つ窒素源を欠乏した場合に限り可能なことが示唆された。従って、ＳＺ２藻細胞との共培養では、ＳＺ２藻細胞表面に生産された多糖をＳＴ１株が炭素源として利用し、炭化水素生産の効率を高めている（図６上段左）のではないかと推察された。ＳＴ１細胞の炭化水素生産に炭素源が必要な事は、単離純化したＳＴ１細胞のみを培養した場合、窒素欠乏の有無にかかわらず、培地へ炭素源となる酢酸ナトリウムを添加しなければ、生産が認められない事と矛盾しない（図６下段左右）。
なお、図６において、棒は１０μｍである。また、図６において、ＳＴ１株による炭化水素（油）生産の有無： 有，＋；無，−。
３−６．ＭＣＭＳ培養による５Ｌ規模のバイオ燃料生産
ＳＺ２株とＳＴ１株との共培養によるバイオ燃料生産の実用化に向けた基盤技術を確立するため更に、（１）５リットル（５Ｌ）規模でのＭＣＭＳ培養技術、（２）ＭＣＭＳ培養により生産される油の成分について検証した。（１）に関しては、特に経費軽減のため、ＢＧ１１_０培地作製には滅菌水の代わりに蒸留水を使用し、照明も１２時間（１２ｈ）間隔の暗黒を設けることとした。以下に、培養と燃料成分分析について記述する。
藻株には本来ＳＴ１株が共存しているが、予め培養したＳＺ２株培養液に単離したＳＴ１株培養液を所定の濃度で添加することにより、炭化水素を蓄積生産することが可能であることは図５で示されている。ＭＣＭＳ培養に関しては、一ヶ月間ＢＧ１１液体培地（無機物培地）で培養したＳＺ２藻株培養液１Ｌに対し、単離純化したＳＴ１株をＬＢ液体培地（有機物培地）に接種し一晩３０℃で振盪培養（１１０ｒｐｍ）したＳＴ１細胞（ＯＤ_６６０≒２）０．２Ｌを混合し、この１．２Ｌ混合種液を新しいＢＧ１１_０液体培地３．８Ｌ（滅菌処理はしていない蒸留水をベースに作製）へ移した（培地総量５ＬのＭＣＭＳ培地に対し、１０ｍＭとなるよう酢酸ナトリウムを添加）。培養装置は、厚さ２ｍｍの箱型プラスチック容器（縦２０ｃｍｘ横１２ｃｍｘ高さ１６ｃｍ）であった。これに０．５％二酸化炭素ガス（１５Ｌ／ｍｉｎ）をシリコンチューブで供給した。この培地を、白色蛍光灯（３０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／秒／ｍ^２）下、明暗（１２ｈ／１２ｈ）サイクル条件で１９日間培養した。
培養後、培養液５０ｍＬを回収し、遠心により菌体を集めた。以後、酢酸エチルを用いて回収菌体から炭化水素を回収し（特開２０１３−１９８４７３号公報参照）、そのうち一部の試料をとってＧＣ−ＭＳ分析に供した（特開２０１３−１９８４７３号公報参照）。
結果を図７に示す。上記試料液中に内標準物質（対照区）として最終濃度２０ｐｐｍになるよう調製して添加されたエイコサン（Ｃ_２０Ｈ_４２）のピーク（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ＝１８．１８ｍｉｎ）に対し、アルカン（ヘプタデカン、Ｃ_１７Ｈ_３６）を示すｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（１４．６０ｍｉｎ）にメジャーなピークが観察された。このピーク面積と内標準物質のピーク面積との比［ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ（％）＝（ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｃ_１７Ｈ_３６／ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｃ_２０Ｈ_４２）ｘ１００％］は１２２％であり、これより計算されたＳＺ２＋ＳＴ１細胞乾燥重量当たりに占めるヘプタデカンの生産量は約５％であった。これに別の燃料物質と思われるマイナーなピークが幾つか観察され、これらを足し合わせると細胞乾燥重量当たり〜約１０％のバイオ燃料の生産量が確認された。乾燥重量当たりのヘプタデカンを含む燃料の生産量を１０％とし、１トン規模のＭＣＭＳ液体培地からの生産量を試算すると０．１ｋｇのバイオ燃料生産量に相当する。ヘプタデカンは軽油相当であるので、１％燃料に混ぜる場合には約５〜１０Ｌの燃料としてトラック等の走行に使用可能と考えられる。
以上により、５Ｌ規模ＭＣＭＳ培養によりバイオ燃料アルカンを生産するに至った。培地の大部分を占めるＢＧ１１_０は未滅菌の蒸留水を用いたことからその分、経費軽減が達成された。また、その培養条件下では、ＳＺ２株とＳＴ１株の両者が常に培養液中で優先種であった。更に、培地には０．５％（大気中の１２．５倍）二酸化炭素ガスを培地に供給することにより、温室効果ガスの有効利用も期待された。一方、ＢＧ１１_０（無機物培地）へのＬＢ培地（有機物培地）の混合（＝ＭＣ、Ｍｉｘｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ）では、１２時間間隔の暗黒を入れながらでもＳＺ２＋ＳＴ１混合種（＝ＭＳ、Ｍｉｘｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ）培養でも燃料生産が成立する事から、これも培養経費軽減に繋がるものとして多いに期待された。
３−７．燃料蓄積の経時変化
第３−６節に示したＭＣＭＳ培養条件下でのバイオ燃料の経時的な蓄積に関して検証し、その結果を図８に示す。
図８において、グラフの横軸は培養日数を、縦軸は内標準物質であるエイコサン（最終濃度２０ｐｐｍ）に対するヘプタデカンの生産量の相対値［ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ（％）＝（ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｃ_１７Ｈ_３６／ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｃ_２０Ｈ_４２）ｘ１００％］を示す。また、白抜き丸のグラフは集菌細胞内のヘプタデカン蓄積量を示し、黒塗りの菱形のグラフはその時の細胞上澄液（培養液）に含まれるヘプタデカン量である。これにより１２日目では３７％、１７日目では１３３％、２２日目では７９％の蓄積率を示した。以上により、５Ｌ規模でのＭＣＭＳ培養では、第３−６節に示した培養装置と培養条件下では、１７日前後でバイオ燃料の蓄積が良く、その辺りの時期が回収に適していることが明らかとなった。
３−８．ＳＺ２菌株とＳＴ１菌株の混合比と燃料生産量
第３−４節に示す培地と培養条件を以下のように改変して試験した。２ヶ月間ＢＧ１１培地で前培養したＳＺ２藻細胞液５０ｍＬに相当する菌体を遠心回収し、ＢＧ１１_０液体培地（酢酸ナトリウム添加）へ懸濁した。これに予め一晩ＬＢ液体培地で培養（３０℃、１１０ｒｐｍ振盪培養）したＳＴ１細胞培養液５ｍＬ（ＯＤ_６６０＝２）を遠心分離して集菌した量に相当する湿潤菌体を直接とって上記５０ｍＬ ＢＧ１１_０液体培地へ移植した。これをＳＺ２量：ＳＴ１量＝１：１とした。例えば、ＳＺ２量：ＳＴ１量＝１：２の場合は、上記ＳＴ１細胞培養液１０ｍＬ（ＯＤ_６６０＝２）を遠心分離し集菌した。以上を２％ＣＯ_２ガス濃度に制御された培養インキュベーター内（１２ｈ−明／１２ｈ−暗）でレシプロ式振盪（４０ｒｐｍ）しながら５日間培養した。培養後は、菌体を遠心して回収し、第３−６節と第３−７節で記述した方法により試料を調製し、ＧＣ−ＭＳ分析によってヘプタデカンの生産量を測定した。なお、単離純化したＳＴ１株を培地に添加しない場合、生産されるヘプタデカンの量を値１００とした。
結果を図９（Ａ）に示す。なお、図９（Ａ）において、縦軸は、内標準物質として添加したエイコサン（２０ｐｐｍ）に対して生産されたヘプタデカンの生産量の相対値を示し、また、横軸は、ＳＺ２株（５０ｍＬに相当する菌体量）に添加したＳＴ１株量（培養液ＸｍＬを遠心して集菌し、これをＳＺ２培養液に添加）を示す。
図９（Ａ）に示すように、濃度一定（２０ｐｐｍ）で添加している内標準物質に対する相対的なヘプタデカンの合成量を調べたところ、ＳＺ２量：ＳＴ１量＝１：１の比率（５０ｍＬ ＳＺ２培養液に対し５ｍＬのＳＴ１培養液に相当）で混合した場合が、最大の生産量（収穫率）を示した。これによりバイオ燃料をＭＣＭＳ培養系で生産させる場合、ＳＺ２藻細胞培養液に添加するＳＴ１細胞量にある特定の比率が有効であることが明らかとなった。
３−９．糖添加培地／明暗条件での油生産
ＭＣＭＳ培養において培地に外部から糖（有機物）を添加し、暗黒１２時間を含む（培養時の電力の節約に繋がる）１２ｈ−明／１２ｈ−暗（１２時間ずつ明暗）培養条件下での油生産量を検証した。
図９（Ａ）に示す結果から、ＳＺ２量（５０ｍＬからの菌体量に相当）：ＳＴ１量（５ｍＬからの菌体量に相当）＝１：１、あるいはＳＴ１株のみ（５ｍＬからの菌体量に相当）に設定し、第３−８節に示す培地と条件で培養する際、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ＝Ｇｌｃ）を所定の濃度で添加した。培養後は、菌体を遠心して回収し、第３−６〜３−８節で記述した方法により試料を調製し、ＧＣ−ＭＳ分析によってヘプタデカンの生産量を測定した。なお糖無添加の場合、生産されるヘプタデカンの量を値１００とした。
結果を図９（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。なお、図９（Ｂ）及び（Ｃ）において、縦軸は、内標準物質として添加したエイコサン（２０ｐｐｍ）に対して生産されたヘプタデカンの生産量の相対値を示し、また、横軸は、培地へのグルコース（Ｇｌｃ）添加量（最終濃度）を示す。
図９（Ｂ）に示すように、濃度一定（２０ｐｐｍ）で添加している内標準物質に対する相対的なヘプタデカンの合成量を調べたところ、ＳＺ２＋ＳＴ１混合培養系においては、糖無添加の場合と比較して、ブドウ糖を最終濃度で０．５ｍＭ添加した明暗培養条件で約１．５倍増加を示した。以上によりＭＣＭＳ培養では、ＳＺ２藻が生産する多糖に加え、培地の外から添加する糖も燃料生産量を向上させる一因となり、且つ暗黒（照明電力の軽減に繋がる）を取り入れながら従属栄養条件下でも燃料生産が可能であることが実証された。
さらに、図９（Ｃ）に示すように、上記の培養条件下で、純化したＳＴ１株のみの培地（ＳＴ１単一培養系）にグルコースを添加した場合、同様に最終濃度０．５ｍＭの時にヘプタデカン生産量が無添加の約１．６倍となった。また糖添加量と生産されるヘプタデカン生産量との関係は、ＳＺ２＋ＳＴ１混合培養系とＳＴ１単一培養系で似ていた。この結果は、ＳＺ２＋ＳＴ１混合培養系で主にヘプタデカンを生産しているのは、ＳＴ１細胞の方であるとする図４〜７の結果を強く支持するものであった。またＳＴ１株単独でも窒素源欠乏培地に炭素源（酢酸Ｎａ）が添加されれば、炭化水素（ヘプタデカン）の蓄積量が増加するという図６の結果と矛盾しない。
以上により、ＭＣＭＳ培養系においては、ＢＧ１１培地で生育した５０ｍＬ相当に対するＳＺ２株の液体培地（ＳＴ１株が潜在的に共存している）にＬＢ培地で予め培養したＳＴ１株を５ｍＬ（ＳＺ２培養液の１０分の１に相当する菌体量）を添加し、これに有機物栄養源として酢酸Ｎａを１０ｍＭ、糖源としてグルコースを０．５ｍＭ程度で同時に混ぜ、さらに窒素欠乏培地で２％炭酸ガスを供給すると、共存菌であるＳＴ１株から昼夜（明暗）を問わず、ヘプタデカン油を効率良く生産する新技術が確立された。
３−１０．乾燥ストレスによるＳＺ２藻の油生産
図９（Ｂ）の試験後、綿栓付フラスコ内のＳＺ２＋ＳＴ１菌体培養液から１週間ほど培養した菌体を回収し、顕微鏡観察を行い、炭化水素生産を確認した（図１０の上段）。一方、ＳＺ２（＋ＳＴ１）藻を含む培養液を２ヶ月程度静置し、綿栓付フラスコ内の培地液体の自然乾燥を促した。その後、ほんの少しだけ水分を含んだ乾燥菌体を同様に顕微鏡観察した（図１０の下段）。顕微鏡観察では、培養液（あるいは自然乾燥した菌体に少量のＢＧ１１_０培地を添加して混ぜた後）に蛍光染色剤Ｎｉｌｅ Ｒｅｄを最終濃度１０μＭになるように添加した。数分間放置後、菌体を遠心により集め、これを蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５３／ＤＰ７２）で観察した（図１０において、棒は１０μｍである）。図１０において、左列は光学フィルター（ＢＦ）で観察した結果であり、右列は青色蛍光フィルター（ＢＷ）で観察した結果である。図１０中株名の太字は、その条件下で油を主に蓄積している菌体を示す。
Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ染色による蛍光顕微鏡観察では、図１０の上段ではＳＴ１が、下段でＳＺ２細胞が優先して黄色に光って見え、油の蓄積が伺えた。
以上の結果、通常のＭＣＭＳ培養条件ではＳＴ１菌株が炭化水素生産を優先して行うが、乾燥ストレスはＳＺ２藻自身による油の生産を可能にすることが明らかとなった。
それ故、乾燥ストレスによりＳＺ２藻内に蓄積された油成分をＦＩＤ（Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，水素炎イオン化型検出器）により分析した。その結果を図１１に示す。
図１１（Ａ）は、図１０の下段に示したＳＺ２藻細胞内油組成をＦＩＤにより分析した結果を示す。上３段は脂肪酸並びにヘプタデカンの内標準を供した。４段目は、ＳＺ２株が優先種の試料をＦＩＤ分析した結果である。検出されたバイオ燃料を「＊」で示した。
図１１（Ｂ）は、パネルＡの結果より検出された脂肪酸並びにヘプタデカン（バイオ燃料）の蓄積量を相対値（％）で示した。
以上の結果、乾燥ストレス下のＳＺ２藻では、Ｃ１６やＣ１８の脂肪酸メチルエステル化合物及びヘプタデカン（Ｃ_１７Ｈ_３６）等バイオ燃料が検出された。
以上、本願によりＭＣＭＳ培養系でＳＴ１による効率の良い燃料の生産が可能である。更にＭＣＭＳ培養後、乾燥ストレスによりＳＺ２藻自身でもバイオ燃料の生産が可能である。実用化を考えると、ＭＣＭＳ系で連続的にヘプタデカン等を液体燃料として回収し、その後、培養の最後はＳＺ２（＋ＳＴ１）を乾燥させると、固形燃料として使用できる可能性があり、経済的にコスト安な燃料製造法となりえる。

【産業上の利用可能性】

【0011】

本発明によれば、炭化水素（アルカン）等のバイオ燃料を高収量で生産することができる。

【受託番号】

【0012】

ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８２
ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９８１
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
［配列表］

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】