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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6604098
(24)【登録日】2019年10月25日
(45)【発行日】2019年11月13日
(54)【発明の名称】評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/00 20060101AFI20191031BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20191031BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20191031BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20191031BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20191031BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/00
C12Q1/68
A01K67/027
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
【請求項の数】6
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2015-175724(P2015-175724)
(22)【出願日】2015年9月7日
(65)【公開番号】特開2017-51102(P2017-51102A)
(43)【公開日】2017年3月16日
【審査請求日】2018年7月31日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２７年７月２５日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｓ．ｏｒｇ／Ａｂｓｔｒａｃｔｓ／Ｐｕｂｌｉｓｈ／２４１／００００３１．ｐｄｆ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｓ．ｏｒｇ／２０１５にて公開。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２７年８月１２日、ｈｔｔｐ：／／ｋ−ｃａｖ．ｃｏｍ／ｎｂｓ２２／ｐｒｏｇｒａｍ／ｓｏｃｉｅｔｙ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｋ−ｃａｖ．ｃｏｍ／ｎｂｓ２２／、第２２回日本排尿機能学会、プログラム・抄録集、第１３７頁、日本排尿機能学会誌 第２６巻第１号２０１５にて公開。
(73)【特許権者】
【識別番号】304023994
【氏名又は名称】国立大学法人山梨大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】井原 達矢
(72)【発明者】
【氏名】武田 正之
(72)【発明者】
【氏名】中尾 篤人
(72)【発明者】
【氏名】中村 勇規
【審査官】
鈴木 優志
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１４−０８４２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Vitaterna et al.，Science，１９９４年，VOl.264，p.719-725
【文献】
King et al.，Cell，１９９７年，Vol.89，p.641-653
【文献】
根来宏光ら，日本臨床，２０１３年，Vol.71, No.12，p.2182-2186
【文献】
Sawada et al.，European Urology，２０１３年，Vol.64，p.664-671
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ６７／０２〜６７／０２７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＤＷＰＩ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損したマウスからなる睡眠期頻尿乃至多尿モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、
（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、
（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、
（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、
（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、
（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに
（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、
の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤が睡眠期頻尿乃至多尿の治療薬として有用であると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、
（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、
（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、
（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、
（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、
（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに
（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、
の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤が睡眠期頻尿乃至多尿の治療薬として有用であると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【請求項2】
Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物からなる睡眠期頻尿乃至多尿モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、
（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、
（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、
（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、
（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、
（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに
（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、
の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤が睡眠期頻尿乃至多尿の治療薬として有用であると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、
（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、
（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、
（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、
（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、
（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに
（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、
の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤が睡眠期頻尿乃至多尿の治療薬として有用であると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【請求項3】
評価対象薬剤が、排尿障害治療薬である請求項１から２のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【請求項4】
評価対象薬剤が、経口投与される請求項１から３のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【請求項5】
膀胱の伸展性が、前記膀胱のオルガンバスにおける等尺性張力により測定される請求項１から４のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【請求項6】
膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、前記膀胱上皮細胞の伸展刺激による細胞内カルシウムの濃度変化により測定される請求項１から５のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、睡眠期頻尿乃至多尿モデル、及び評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
夜間頻尿とは、「夜間、排尿のために１回以上起きなければならない」という訴えであり、夜間多尿とは、２４時間の尿量のうち、夜間尿量の割合が多い状態とされ、前記割合（夜間多尿指数）として、高齢者では０．３３以上、若年者では０．２０以上が提唱されている（非特許文献１参照）。
【0003】
本邦において、夜間頻尿や夜間多尿を有する患者は加齢とともに増加し、頻度の高い下部尿路症状の一つである。日本人男性において、夜間頻尿の罹患率は、５０歳以上で６０％以上、７０歳になると実に９０％以上と極めて高い。ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）への影響も大きく、睡眠の質の低下や昼間の倦怠感の出現、社会生活への影響が生じ、高齢者においては、夜間頻尿が転倒発生の要因となり、大腿骨頚部骨折のリスクを増加させる。
【0004】
夜間頻尿乃至夜間多尿の原因としては、年齢や高血圧、糖尿病、脳血管障害、薬剤性、腎泌尿器疾患、睡眠障害など多岐にわたり、依然として未解明な部分も多い。対症療法的な治療が行われているが、治療効果はそこまで高くなく、夜間頻尿乃至夜間多尿の病態解明、新規治療薬の開発が望まれている。しかし、夜間頻尿乃至夜間多尿の有用なモデルとなる睡眠期頻尿乃至多尿モデルについては、これまでに報告されていない。
【0005】
哺乳類の覚醒睡眠リズム、血圧変動、その他の昼夜の行動パターンや種々の代謝酵素活性などには１日を１周とした概日リズムがみられる。排尿についても、排尿量、排尿回数、機能的膀胱容量などに概日リズムがみられる（非特許文献２参照）。
【0006】
概日リズムは、Ｐｅｒ、Ｃｒｙ、Ｂｍａｌ、Ｃｌｏｃｋなどの時計遺伝子による転写制御機構により作り出される。時計遺伝子の翻訳産物であるＣＬＯＣＫ−ＢＭＡＬ複合体は、Ｐｅｒ、Ｃｒｙなどの時計遺伝子や時計被制御遺伝子の転写を促進する。一方で、Ｐｅｒ及びＣｒｙの翻訳産物であるＰＥＲ及びＣＲＹは、ＣＬＯＣＫ−ＢＭＡＬ複合体に負のフィードバックを与えることにより転写を抑制させる。これにより、ＰｅｒやＣｒｙなどの時計遺伝子や時計被制御遺伝子の転写に日内変動が生じ、様々な生理機能、代謝活性の概日リズムを生み出す。時計遺伝子は、これら以外にも数十種類存在し、形成される複雑なフィードバックループが２４時間を１周とした正確な概日リズムを作り出している（非特許文献３参照）。
【0007】
時計遺伝子は、生体内の全ての組織に発現し、時計遺伝子の転写制御を受ける時計被制御遺伝子は、全遺伝子の１０％〜１５％といわれている。時計遺伝子の異常により生じる概日リズム障害は、様々な疾患の原因となっている可能性がある。しかし、個々の時計遺伝子の機能については未解明な部分も多く、排尿機能の制御と時計遺伝子との関連についても未だ明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】本間之夫ら、下部尿路機能に関する用語基準：国際尿禁制学会標準化部会報告．日排尿機能会誌２００３；１４：２７８−２８９
【非特許文献2】Ｎｅｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１２；３：８０９
【非特許文献3】Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１０；６２：８７６−８８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、夜間頻尿乃至夜間多尿の有用なモデルである睡眠期頻尿乃至多尿モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、前記目的を達成するために、鋭意検討した結果、Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物について、１）生理条件下では野生型と同じ昼夜の行動リズムを持つこと、２）野生型では、睡眠時の１回排尿量が覚醒時の１回排尿量より多いが、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物ではそのような昼夜の１回排尿量変化は消失していること、３）排尿回数も昼夜の変化はなくなり夜間多尿パターンを示すこと、及び４）夜間多尿指数（ｎｏｃｔｕｒｎａｌ Ｐｏｌｙｕｒｉａ Ｉｎｄｅｘ（ＮＰＩ））に相当する質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、ヒト若年者では２０質量％以上、高齢者では３３質量％以上が夜間多尿と定義されているが、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物では３３質量％以上と睡眠期多尿を示すこと、並びにこれらの属性により前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物が、自然発症型の睡眠期頻尿乃至多尿モデルとしての新たな用途への使用に適することを見出し、本発明の完成に至った。
【0011】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、＜１＞ Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物からなることを特徴とする睡眠期頻尿乃至多尿モデルである。
＜２＞ 非ヒト哺乳動物が、マウスである前記＜１＞に記載の睡眠期頻尿乃至多尿モデルである。
＜３＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載された睡眠期頻尿乃至多尿モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、
（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、
（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、
（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、
（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、
（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに
（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、
の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤が睡眠期頻尿乃至多尿の治療薬として有用であると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法である。
＜４＞ 評価対象薬剤が、排尿障害治療薬である前記＜３＞に記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法である。
＜５＞ 評価対象薬剤が、経口投与される前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法である。
＜６＞ 膀胱の伸展性が、前記膀胱のオルガンバスにおける等尺性張力により測定される前記＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法である。
＜７＞ 膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、前記膀胱上皮細胞の伸展刺激による細胞内カルシウムの濃度変化により測定される前記＜３＞から＜６＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法である。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、夜間頻尿乃至夜間多尿の有用なモデルである睡眠期頻尿乃至多尿モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
（睡眠期頻尿乃至多尿モデル）本発明の睡眠期頻尿乃至多尿モデルは、Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物からなることを特徴とする。
本発明は、Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物が、睡眠期において頻尿乃至多尿を示すという未知の属性を見出し、この属性により、当該Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物が、自然発症型の睡眠期頻尿乃至多尿モデルとしての新たな用途への使用に適することを見いだしたことに基づく発明である。
【0015】
−Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物−前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物としては、Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物は、個体レベルにおいて野生型と同様の、行動の概日リズム、飲水パターン及び総排尿量を示すものの、機能的膀胱容量の低下、睡眠期頻尿及び睡眠期多尿の表現型を示す。
【0016】
前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物としては、個体そのものであってもよく、器官、組織及び細胞のいずれかの試料であってもよい。前記試料としては、前記個体に由来する試料であってもよく、試料レベルでＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を阻害した（例えば、ｓｉＲＮＡ等により機能阻害した）細胞などの試料であってもよい。
前記試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記器官としては、膀胱、腎臓、尿管、前立腺、尿道が好ましく、前記組織としては、糸球体、腎尿細管、腎集合管；膀胱、尿管、前立腺、尿道等の器官における上皮組織、平滑筋組織、粘膜下組織が好ましく、前記細胞としては、糸球体構成細胞、尿細管細胞、腎集合管細胞；尿管、膀胱、前立腺、尿道等の器官における上皮細胞、平滑筋細胞、粘膜下組織等の構成細胞が好ましい。
【0017】
前記非ヒト哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類動物；ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマなどの、ヒトを除く哺乳類動物が挙げられる。これらの中でも、マウス、ラット、モルモットが好ましく、マウスがより好ましい。
【0018】
ここで、「Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した」とは、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損し、結果として前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の翻訳産物であるＣＬＯＣＫタンパク質の機能が欠損することを意味し、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子が無効化されていてもよく、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の一部機能が欠損していてもよい。前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させる方法としては、例えば、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子に変異を導入する方法、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の転写段階での機能阻害を行う方法（例えば、ｓｉＲＮＡ等による機能阻害）などが挙げられる。
前記ＣＬＯＣＫタンパク質の機能の欠損としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、転写活性化領域の欠損、ＤＮＡ結合領域の欠損、他のタンパク質（転写活性化因子、クロマチンリモデリング因子等）との結合領域の欠損等による転写活性化機能の欠損；前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の無効化による前記ＣＬＯＣＫタンパク質の欠損などが挙げられる。これらの中でも、転写活性化機能の欠損が好ましく、マウスＣｌｏｃｋ遺伝子のエクソン１９に相当する領域の欠損がより好ましい。
【0019】
前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子においてＣＬＯＣＫタンパク質の転写活性化ドメインをコードする領域が欠損した非ヒト哺乳動物としては、例えば、Ｃｌｏｃｋのエクソン１９が欠損したマウスであるＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスなどが好適に挙げられる。前記ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスは、Ｖｉｔａｔｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６４：７１９−７２５、及びＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８９：６４１−６５３において報告された変異型マウスであり、Ｃｌｏｃｋ遺伝子をコードする遺伝子のうち、イントロン１９の５’側３塩基目のＡがＴに点変異しており、結果として得られる転写産物においてエクソン１９が全て消失し、翻訳産物であるＣＬＯＣＫタンパク質の転写活性化機能を欠損しているマウスである。前記ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスは、ジャクソン研究所（米国）から入手することができる。
【0020】
−−Ｃｌｏｃｋ遺伝子−−前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子は、概日リズム（体内時計）を司る時計遺伝子の１つである。前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の翻訳物であるＣＬＯＣＫタンパク質は、Ｐｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙ等の他の時計遺伝子や時計被制御遺伝子の転写を促進する転写因子であり、様々な生理機能、代謝活性を生み出す。マウスのＣｌｏｃｋ遺伝子は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００７７１５に登録されている。
【0021】
（評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法）本発明の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法は、本発明の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルを用いた評価方法であり、薬剤投与工程と、評価工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法は、ｉｎ ｖｉｖｏの評価方法であってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価方法であってもよい。
【0022】
＜薬剤投与工程＞前記薬剤投与工程は、本発明の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程である。
【0023】
−評価対象薬剤−前記評価対象薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の治療薬、被検薬、及び医薬品候補となる試験化合物のいずれであってもよく、天然化合物及び合成化合物のいずれであってもよい。
また、前記治療薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、排尿障害治療薬、利尿薬、非ステロイド系抗炎症薬、抗男性ホルモン剤、漢方、抗利尿ホルモン剤、抗うつ薬、生物毒乃至植物製剤などが挙げられる。
【0024】
−排尿障害治療薬−前記排尿障害治療薬としては、例えば、抗コリン薬、α１受容体遮断薬、β３受容体刺激薬、ＰＤＥ５阻害薬、５α還元酵素阻害剤などが挙げられる。
【0025】
前記抗コリン薬としては、例えば、プロピベリン、オキシブチニン、トルテロジン、ソリフェナシン、イミダフェナシンなどが挙げられる。前記α１受容体遮断薬としては、例えば、タムスロシン、ナフトピジル、シロドシン、プラゾシン、テラゾシン、ウラピジル、アルフゾシンなどが挙げられる。
前記β３受容体刺激薬としては、例えば、ミラベグロンなどが挙げられる。
前記ＰＤＥ５阻害薬としては、例えば、タダラフィルなどが挙げられる。
前記５α還元酵素阻害剤としては、例えば、フィタステリド、デュタステリドなどが挙げられる。
【0026】
前記利尿薬としては、例えば、アゾセミド、フロセミドなどが挙げられる。前記非ステロイド系抗炎症薬としては、例えば、ロキソプロフェンなどが挙げられる。
前記抗男性ホルモン剤としては、例えば、クロルマジノン、アリルエストレノールなどが挙げられる。
前記漢方としては、例えば、牛車腎気丸、柴苓湯、ブシ沫などが挙げられる。
前記抗利尿ホルモン剤としては、例えば、バソプレシン、デスモプレシンなどが挙げられる。
前記抗うつ薬としては、例えば、イミプラミンなどが挙げられる。
前記生物毒乃至植物製剤としては、例えば、レスベラトロール、フラボキサート、カプサイシン、レジニフェラトキシン、セルニチンポーレンエキス、ボツリヌストキシン、ＧｓＭＴｘ４などが挙げられる。
【0027】
前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルに対し、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、静脈内投与などが挙げられる。これらの中でも、経口投与が好ましい。
【0028】
前記投与条件としては、例えば、前記ＧｓＭＴｘ４を評価する場合は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５ｍｇ／ｋｇ）を生理食塩水１０μＬ〜５００μＬ（例えば、１００μＬ）に溶解した溶液を腹腔内投与することが好ましい。
【0029】
或いは、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、評価しようとする投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。これにより、各々の薬剤について、適した投与条件を評価し選定することが可能となる。
【0030】
本発明が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記試料に前記評価対象薬剤を投与すればよい。前記試料としては、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物の個体に由来する、器官、組織及び細胞の少なくともいずれかの試料、又は試料レベルで前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させた試料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記器官としては、膀胱、腎臓、尿管、前立腺、尿道が好ましく、前記組織としては、糸球体、腎尿細管、腎集合管；膀胱、尿管、前立腺、尿道等の器官における上皮組織、平滑筋組織、粘膜下組織が好ましく、前記細胞としては、糸球体構成細胞、尿細管細胞、腎集合管細胞；尿管、膀胱、前立腺、尿道等の器官における上皮細胞、平滑筋細胞、粘膜下組織等の構成細胞が好ましい。
本発明が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の各種条件を選択することができ、例えば、前記評価対象薬剤を含む培地を前記試料に投与すればよい。
【0031】
＜評価工程＞前記評価工程は、前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、（１）２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が、低下した場合、（２）睡眠期における排尿回数が、減少した場合、（３）睡眠期における１回排尿量が、増加した場合、（４）睡眠期における膀胱の伸展性が、上昇した場合、（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が、上昇した場合、並びに（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が、上昇した場合、の少なくともいずれかの場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価する工程である。
【0032】
ここで、「低下した場合」、「減少した場合」又は「上昇した場合」とは、前記対照と比較して、低下、減少、上昇などの変化が有意に観察されること、すなわち、統計的解析により有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。前記統計的解析としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（二元配置分散分析）などが挙げられる。
また、「睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果がある」とは、睡眠期頻尿及び睡眠期多尿の少なくともいずれかの治療効果があること、乃至治療薬の候補薬剤として有用であることを意味する。
【0033】
前記対照とは、前記評価対象薬剤に代えて、前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒のみを投与するか、何も投与しないこと以外は、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルと同様に処理した対照マウスを意味する。前記溶媒としては、前記評価対象薬剤を溶解することができ、医薬的に許容されるものであれば、特に制限はなく、使用する前記評価対象薬剤に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩水、蒸留水、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
【0034】
−（１）質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）の低下−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、２４時間尿量（質量）における睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）が低下した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0035】
前記睡眠期とは、ヒトなどの昼行性の動物では暗期を意味し、マウスなどの夜行性の動物では明期を意味する。また、活動期とは、ヒトなどの昼行性の動物では明期を意味し、マウスなどの夜行性の動物では暗期を意味する。前記明期及び暗期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２４時間周期の明暗周期であることが好ましい。
前記明暗周期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、明期１２時間及び暗期１２時間の明暗周期、明期１０時間及び暗期１４時間の明暗周期、明期１４時間及び暗期１０時間の明暗周期などが挙げられる。
【0036】
前記２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）の測定方法としては、例えば、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、排尿代謝ケージ（小動物用排尿機能測定装置ＭＣＭ／ＴＯＡ−ＵＦ００１、株式会社シンファクトリー製）を用いて明期１２時間及び暗期１２時間の明暗周期下で飼育しながら排尿量を経時的に測定し、１日当たりの排尿量の合計質量（２４時間尿量）に対する睡眠期１２時間における排尿量の合計質量（睡眠期尿量）の割合を算出する方法などが挙げられる。ただし、前記測定方法において、睡眠期に８時間以上の無排尿期がみられた場合、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルは睡眠しているものと定義し、その後の活動期の初尿の排尿量を睡眠期の排尿量としてカウントする。
【0037】
−（２）睡眠期における排尿回数の減少−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、睡眠期における排尿回数が減少した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0038】
前記睡眠期における排尿回数としては、例えば、排尿代謝ケージ（小動物用排尿機能測定装置ＭＣＭ／ＴＯＡ−ＵＦ００１、株式会社シンファクトリー製）を用いて測定することができる。
【0039】
−（３）睡眠期における１回排尿量の増加−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、睡眠期における１回排尿量が増加した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0040】
前記睡眠期における１回排尿量としては、例えば、排尿代謝ケージ（小動物用排尿機能測定装置ＭＣＭ／ＴＯＡ−ＵＦ００１、株式会社シンファクトリー製）を用いて測定することができる。
【0041】
−（４）睡眠期における膀胱の伸展性の上昇−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、睡眠期における膀胱の伸展性が上昇した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0042】
前記膀胱の伸展性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルとして前記個体に由来する前記膀胱を用い、前記膀胱のオルガンバスにおける等尺性張力により測定する方法などが挙げられる。前記膀胱のオルガンバスにおける等尺性張力により測定する方法としては、例えば、市販のオルガンバスシステム（Ｄａｎｉｓｈ Ｍｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた方法、Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ．２０１３；６４（４）：６６４−７１等の文献に記載された方法などが挙げられる。
【0043】
−（５）活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性の上昇−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、活動期における膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性が上昇した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0044】
前記膀胱上皮細胞の伸展刺激感受性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、前記膀胱上皮細胞の伸展刺激による細胞内カルシウムの濃度変化により測定する方法、伸展刺激により放出されるＡＴＰ濃度をルシフェリン等の生物発光を利用して測定する方法などが挙げられる。前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プローブを用いて蛍光輝度変化により測定する方法などが挙げられる。
【0045】
前記プローブとしては、例えば、カルシウムイオン指示薬、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｅｎｃｏｄｅｄ Ｃａ２＋ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＧＥＣＩ）などが挙げられる。前記カルシウムイオン指示薬としては、Ｃａ２＋蛍光プローブ（Ｆｕｒａ２ＡＭ等）、生物発光Ｃａ２＋指示薬（エクオリン等）、Ｃａ２＋感受性指示薬（アルセナゾＩＩＩ等）などが挙げられる。
前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の、振幅の大きさ、起こる頻度、起こる細胞数等により評価する方法などが挙げられる。
【0046】
−（６）膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量の上昇−前記評価対象薬剤を投与した後の前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルについて、前記評価対象薬剤に代えて前記評価対象薬剤を溶解可能な溶媒を投与した対照又は何も投与しない対照と比較して、膀胱上皮細胞におけるＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択されるマーカーの発現量が上昇した場合に、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができる。
【0047】
前記マーカーとは、Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴから選択される少なくともいずれかのｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかを意味する。前記Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、及びＣｒｙ１は、概日リズム（体内時計）を司る時計遺伝子である。マウスのＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１、及びＣｒｙ１は、それぞれジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６６、ＮＭ＿００７４８９、及びＮＭ＿００７７７１に登録されている。
前記Ｐｉｅｚｏ１は、侵害性機械刺激を感知する受容体をコードする遺伝子であり、マウスのＰｉｅｚｏ１は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７２９８．１に登録されている。
前記ＴＲＰＶ４は、浸透圧刺激、圧刺激、温度刺激、及び機械刺激の少なくともいずれかを感知する受容体をコードする遺伝子であり、マウスのＴＲＰＶ４は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０２２０１７．１に登録されている。
前記Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６は、細胞間結合タンパク質をコードする遺伝子であり、マウスのＣｏｎｎｅｘｉｎ２６は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００８１２５に登録されている。
前記ＶＮＵＴは、ＡＴＰなどのヌクレオチドを輸送するタンパク質をコードする遺伝子であり、マウスのＶＮＵＴは、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿１８３１６１に登録されている。
【0048】
本発明者らは、膀胱上皮培養細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本について、野生型では前記マーカーのｍＲＮＡ発現に概日リズムが観察されるのに対し、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルではその概日リズムが消失し、ｍＲＮＡの発現量が下方制御されていることを見出した。また、細胞レベルでＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させた膀胱上皮培養細胞においても、前記マーカーのｍＲＮＡ発現の概日リズムが消失し、ｍＲＮＡの発現量が下方制御されていることを見出した。したがって、前記マーカーについては、野生型に比べて前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルにおいてｍＲＮＡの発現の概日リズムが消失し、ｍＲＮＡの発現量が下方制御されていることから、睡眠期頻尿乃至多尿からの機能回復のためには、これらのマーカーの発現量が上昇すること（特に、ｐｅａｋを示す時間帯におけるマーカーの発現量が上昇すること）を指標として、前記評価対象薬剤に睡眠期頻尿乃至多尿の治療効果があると評価することができることが分かった。
【0049】
前記膀胱上皮細胞における前記マーカーの発現量を測定する方法としては、例えば、前記個体から採取した膀胱上皮細胞、野生型由来の膀胱上皮細胞を試料レベルでＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させた試料などを用いた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルでの検出；例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ウエスタンブロッティング（タンパク質レベルでの検出）等；前記個体から採取した膀胱上皮組織の試料を用いた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡレベルでの検出）、免疫組織染色（タンパク質レベルでの検出）等；により測定する方法などが挙げられる。
【実施例】
【0050】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。なお、実施例中の単位「Ｍ」は、「ｍｏｌ／Ｌ」である。
【0051】
（実施例１：Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損したマウスの排尿行動及び行動リズムの解析）＜ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウス＞
Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損したマウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６系統の遺伝的背景を有する、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウス（ジャクソン研究所（米国）より入手したものを自家繁殖した）を用いた。
【0052】
＜排尿行動の測定＞雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８−１２週齢、Ｎ＝１０）と雄性同遺伝的背景ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（８週齢、Ｎ＝８）のそれぞれの排尿行動を、排尿代謝ケージ（小動物用排尿機能測定装置ＭＣＭ／ＴＯＡ−ＵＦ００１、株式会社シンファクトリー製）を用いて測定した（図１Ａ〜図１Ｃ）。マウスは底面が金網の円筒に入れられ、食餌及び飲水は自由である（図１Ａ及び図１Ｃ）。全ての糞は、撥水性の特殊なメッシュでトラップされ（図１Ｄ、矢印）、尿のみがメッシュを通り抜けメッシュ下部に設置された精密天秤（ＧＸ−８０００、株式会社エー・アンド・デイ製）によって経時的に定量される（図１Ａ）。
【0053】
得られるデータは、排尿回数、排尿量、１回排尿量、及び飲水量であり、いずれも平均値（±標準誤差）で図中に示した。データ収集は、ＰｏｗｅｒＬａｂＲｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍで自動的に行われ、得られたデータは、ＬａｂＣｈａｒｔＲｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で解析した。測定は、一定環境（２５℃、照度：３００ｌｕｘ、明期０６：００−１８：００、暗期１８：００−翌０６：００の明暗周期下、明期開始時刻である６時をＺｅｉｔｇｅｂｅｒ Ｔｉｍｅ（ＺＴ）０とした）の条件において、２日間の馴化期間をおいて行った（図２）。なお、マウスは夜行性であるため、明期が睡眠期に相当し、暗期が活動期に相当する。
【0054】
ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウス及び野生型マウスについて、排尿量及び飲水量を経時的に測定した結果をそれぞれ図３Ａ及び図３Ｂに示す。夜間排尿は、以下の通り定義した。明期の排尿を睡眠期の排尿としてカウントし（図３Ａ、矢印）、それ以外を暗期（活動期）の排尿としてカウントした。ただし、明期に８時間以上の無排尿期がみられた場合、マウスは睡眠しているものと定義し（図３Ｂ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｓｔａｇｅ）、その後の暗期の初尿の排尿量を明期の排尿量としてカウントした（図３Ｂ、矢印）。
【0055】
＜＜排尿回数の比較＞＞野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスの排尿回数を図４に示す。その結果、暗期の排尿回数は、両群間で同じであったが、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の明期の排尿回数は、野生型よりも多かった。すなわち、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９は野生型と比較し、睡眠期頻尿を示していることが分かった。
【0056】
＜＜１回排尿量の比較＞＞野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスの１回排尿量を図５に示す。なお、１回排尿量は、１回の排尿あたりの排尿量（排尿量／排尿）であり、明期及び暗期における平均値（±標準誤差）を図５に示した。その結果、野生型マウスの１回排尿量は、ヒトの昼夜のパターンと同じように、暗期より明期の方が多いことが分かった。ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の１回排尿量は暗期、明期で同じであった。また、野生型マウスに比較し、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の１回排尿量は少なく、機能的膀胱容量が減少していることが分かった。
【0057】
＜＜明期又は暗期の総排尿量の比較＞＞野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスの明期又は暗期の総排尿量を図６に示す。その結果、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の明期の総排尿量は野生型より有意に多いことが分かった。
また、両群間で２４時間尿量（質量）に対する睡眠期尿量（質量）の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）を比較した結果を表１に示す。その結果、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の質量％（睡眠期尿量／２４時間尿量）は野生型マウスより有意（ｐ＜０．０１）に高いことが分かった。
【0058】
【表1】
【0059】
＜＜総排尿量の比較＞＞総排尿量（２４時間尿量）は、野生型では２，０８４．８３±１２９．８５（μＬ）、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９では２，３１９．１６±９４．７９（μＬ）で、両群間で同等であり、有意差が見られなかった。多飲により多尿を示す場合もあるが、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９は、そのような傾向のない睡眠期頻尿乃至多尿モデルであることを示している。
【0060】
＜＜飲水量の比較＞＞実施例１における野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスの４時間毎の飲水量を図７に示す。その結果、明期及び暗期における飲水パターンは、両群において暗期に高いという同様のパターンを示し、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡの結果、両群のプロファイル間に有意差は見られなかった。
【0061】
＜行動の概日リズムの測定＞雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、１２週齢、Ｎ＝８）と雄性同遺伝的背景ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（１２週齢、Ｎ＝８）のそれぞれの明暗周期下における活動量を、活動量記録装置（装置名：マウス行動解析用クリーンフード Ｔ−ＣＨ−Ｍ−ＬＥ ４×４型、トキワ科学器械株式会社製）及び活動量解析ソフト（製品名：ｃｌｏｃｋ ＬＡＢ、株式会社ニューロサイエンス製）を用いて測定した。活動量記録装置の天井に取り付けられた行動解析センサー（赤外線センサー）で活動量を検出し、１２日間に亘る行動パターンを測定した。
食餌及び飲水は自由であり、排尿行動の測定と同様の明暗周期下の一定環境の条件において飼育しながら測定した。
【0062】
＜＜行動の概日リズムの比較＞＞野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスについて、活動量を経時的に測定した結果をそれぞれ図８Ａ及び図８Ｂに示す。なお、活動量として、活動量記録装置の赤外線センサーを遮った回数を検出し、図８Ａ及び図８Ｂ中、１０分間当たりの活動量を黒色バーで示した。また、２日間分の測定データを横に並べて示した（ダブルプロット）。
その結果、明期１２時間、暗期１２時間の明暗周期が維持された生理条件下では、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスは、野生型と同様な１日周期の行動リズムを示すことが分かった。
【0063】
以上の結果から、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスでは、野生型に比べて顕著に睡眠期の排尿回数及び排尿量が多く、睡眠時における頻尿乃至多尿の症状を呈することが分かった。しかしＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスは野生型と比較して飲水パターンや行動の概日リズムに異常を認めない。したがって、Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損したＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスは、睡眠時における頻尿乃至多尿の自然発症モデルとして用いることができ、この動物を使用することで睡眠時における頻尿乃至多尿や排尿障害治療薬の評価に適用できることが示された。
【0064】
（実施例２：公知の排尿障害治療薬を用いた評価方法）睡眠期頻尿乃至多尿モデルとして、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスを用い、公知の排尿障害治療薬であるＧｓＭＴｘ４の評価を行った。
なお、ＧｓＭＴｘ４は、Ｐｉｅｚｏ１受容体拮抗薬であり、そのアミノ酸配列は、「ＧＣＬＥＦＷＷＫＣＮＰＮＤＤＫＣＣＲＰＫＬＫＣＳＫＬＦＫＬＣＮＦＳＦ」（３４残基）である。
【0065】
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０−１２週齢）、及び雄性ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウス（８週齢）に対し、ＧｓＭＴｘ４（株式会社ペプチド研究所製）０．７５ｍｇ／ｋｇを生理食塩水１００μＬに溶解し、活動期のＺＴ１２（１８：００）又は睡眠期のＺＴ０（０６：００）に腹腔内投与を行った（図９Ａ〜図９Ｄ、黒矢印）。飼育は、マウス排尿代謝ゲージを用いて、自由食餌及び自由飲水で一定環境（２５℃、照度：３００ｌｕｘ、明期０６：００−１８：００、暗期１８：００−翌０６：００の明暗周期下、明期開始時刻である６時をＺｅｉｔｇｅｂｅｒ Ｔｉｍｅ（ＺＴ）０とした）の条件にて行い、投与前日、投与日及び投与１日後の計３日間の測定を行った。
実験に用いた個体数（Ｎ）は、それぞれ野生型ＺＴ１２投与群（Ｎ＝１０）、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９ＺＴ１２投与群（Ｎ＝９）、野生型ＺＴ０投与群（Ｎ＝１２）、及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９ＺＴ０投与群（Ｎ＝９）であった。
【0066】
ＧｓＭＴｘ４を活動期（ＺＴ１２）に投与したマウスの排尿回数及び１回排尿量を、それぞれ図９Ａ及び図９Ｂに示す。また、ＧｓＭＴｘ４を睡眠期（ＺＴ０）に投与したマウスの排尿回数及び１回排尿量を、それぞれ図９Ｃ及び図９Ｄに示す。その結果、ＺＴ１２投与により投与日の活動期での排尿回数は、両群で低下するが、その後の睡眠期の排尿回数に対する影響は乏しく、投与１日後をみてみるとＧｓＭＴｘ４の効果はなくなっていることが分かった（図９Ａ）。しかし、１回排尿量は、両群においてＺＴ１２投与後でも上昇が持続しており、１回排尿量の上昇は投与日の野生型群で顕著であることが分かった（図９Ｂ）。
【0067】
一方、ＺＴ０投与においては、活動期の排尿回数に対する影響は両群でそれほど大きくないが、睡眠期の排尿回数はＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９群で著明に低下することが分かった（図９Ｃ）。野生型群は、もともと睡眠期の排尿回数が少ないため、睡眠期の排尿回数抑制効果は乏しいと考えられる。ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９群の排尿回数抑制効果は、投与後でも持続していることが分かった（図９Ｃ）。１回排尿量に対する影響は、ＺＴ１２投与群とほぼ同じであることが分かった（図９Ｄ）。
【0068】
このように、Ｐｉｅｚｏ１受容体拮抗薬の投与による、排尿回数抑制及び１回排尿量増加が両群で確認できたが、睡眠期の排尿への影響は、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９群がより顕著であった。また、薬剤投与直後から投与後の変化は、薬剤の血中濃度が直に排尿抑制に作用するものと考えられるが、新たに、投与時間により薬効の持続時間が変化することが明らかとなった。
【0069】
（実施例３：マウス膀胱上皮細胞ｅｘ ｖｉｖｏ標本での時計遺伝子、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化）＜マウス膀胱上皮細胞ｅｘ ｖｉｖｏ標本由来のＲＮＡの調製＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８−１２週齢）、及び雄性ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウス（８週齢）を、自由食餌及び自由飲水で一定環境（２５℃、照度：３００ｌｕｘ、明期０６：００−１８：００、暗期１８：００−翌０６：００の明暗周期下、明期開始時刻である６時をＺｅｉｔｇｅｂｅｒ Ｔｉｍｅ（ＺＴ）０とした）の条件において、１０日間以上馴化させ、ＺＴ０より４時間毎に膀胱を摘出した。なお、全てのタイムポイントにおいて、野生型（Ｎ＝４）及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（Ｎ＝３）から採取した試料を用いて独立に解析を行った。
膀胱上皮をメスにて鋭的に剥離し、ＲＮｅａｓｙＴＭ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡ抽出し、ｅｘ ｖｉｖｏ標本に由来するＲＮＡを調製した。
【0070】
＜ｍＲＮＡ発現経時的変化の測定＞Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、ＶＮＵＴ、代表的な時計遺伝子のｍＲＮＡをスマートサイクラー（Ｃｅｐｈｉｅｄ社製）及びＳＹＢＲＴＭ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
内部補正遺伝子としては、時間変動の少ない２個の遺伝子の比（Ｅｉｆ２ａ／Ｔｂｃｃ）を用いた。
なお、Ｅｉｆ２ａ遺伝子は、真核生物翻訳開始因子２（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）ａサブユニットをコードする遺伝子（ジェンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００１００５５０９）であり、Ｔｂｃｃ遺伝子は、ｔｕｂｕｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ Ｃをコードする遺伝子（ジェンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿１７８３８５．３）である。
各群における４時間毎の継時的変化の統計学的解析には、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた。また、両群間での経時的変化の解析には、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた。
【0071】
マウス膀胱上皮細胞ｅｘ ｖｉｖｏ標本での時計遺伝子Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、及びＣｌｏｃｋ、並びにＰｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化を測定した結果を、それぞれ図１０Ａ〜図１０Ｈに示す。
【0072】
その結果、膀胱上皮のみにおいても、時計遺伝子の発現を確認した（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。野生型において、Ｐｅｒ２は明期の終わりにＰｅａｋを認め、暗期の終わりにｎａｄｉｒがくる概日変動を認めた（ｐ＜０．０１）。一方で、Ｂｍａｌ１は、Ｐｅｒ２とほぼ逆の位相で概日リズムを呈していた（ｐ＜０．０５）。Ｃｒｙ１も発現周期に概日リズムを認めた（ｐ＜０．０１）。ＣｌｏｃｋのｍＲＮＡに時間変動は見られないとされており、膀胱上皮においても同様の結果であった（有意差なし、統計解析：ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ、Ｃｌｏｃｋ以外の時計遺伝子（Ｃｒｙ２、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４、ＲＯＲα、及びＲｅｖ−ｅｒｂα）に関しても、その他の組織において報告されている通りの概日リズムを伴うｍＲＮＡ発現を認めた（データ未掲載）。
【0073】
一方で、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９では、時計遺伝子のｍＲＮＡ発現における概日リズムは、すべて消失していた（有意差なし）。ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９のこれら以外の時計遺伝子ｍＲＮＡ発現変化は統計学的な有意差を持つものも存在したが、概日リズムではない変動であった（データ未掲載）。
【0074】
膀胱上皮の伸展刺激受容体であるＰｉｅｚｏ１及びＴＲＰＶ４、ＡＴＰ放出に関与するＶＮＵＴ、並びにギャップジャンクションタンパク質Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６について、これらのタンパク質をコードする膀胱上皮の機能制御に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現は、野生型では暗期の始まり（ＺＴ１２）にｐｅａｋを認め、明期の半ば（ＺＴ４）にｎａｄｉｒを呈する形での概日リズムを認めた（それぞれ、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。一方で、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９では、その発現リズムは全て消失していた（有意差なし）。
これらの遺伝子の発現リズムは、時計遺伝子の発現リズムと相関するように変化しており、尿意の伝達に概日リズムが存在することを示唆する。
【0075】
（実施例４：マウス膀胱上皮培養細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本での時計遺伝子、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化）＜マウス膀胱上皮由来の培養細胞の調製＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８−１２週齢）と雄性同遺伝的背景ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（８週齢）から、以下の方法により膀胱上皮培養細胞を作製した。
各マウスより膀胱を摘出し膀胱を反転した。反転した膀胱内に膀胱頚部からＰＢＳ（和光純薬工業株式会社製）を１００μＬ注入し、膀胱を拡張した後、膀胱頚部を結紮した（ｅｖｅｒｔｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ ｂａｌｌの調製）。次いで、膀胱を９．２Ｕ／ｍＬのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）溶液中で３７℃、２５分間インキュベートし、その後、ＤＭＥＭ（和光純薬工業株式会社製）中に移し替え、膀胱上皮細胞を鈍的に剥離した。細胞を１、０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、ＤＭＥＭに再懸濁した後、０．０５ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン（和光純薬工業株式会社製）でコーティングした３．５ｃｍディッシュ（Ｔｈｅｒｏｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製；或いは、実験に応じて同社製の６ウェルプレート、又は２４ウェルプレートを適時使用した）上に播種し、播種３時間後で１０体積％ＦＢＳ（和光純薬工業株式会社製）を含むＤＭＥＭを添加した。
実験系により、１個体の膀胱から得られた膀胱上皮細胞を３分割〜６分割して播種した。なお、全てのタイムポイントにおいて、野生型（Ｎ＝５）及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（Ｎ＝５）から採取した試料を用いて独立に解析を行った。
【0076】
＜マウス膀胱上皮培養細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本由来のＲＮＡの調製、及びｍＲＮＡ発現経時的変化の測定＞４８時間後に１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを入れ替え、サンプル回収は播種から７２時間後から４時間毎で行った。回収の１２時間前より５０体積％馬血清（商品名：ＨＩ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ社製）による同期刺激を２時間与え、同期刺激より１２時間後をｃｉｒｃａｄｉａｎ ｔｉｍｅ（ＣＴ）０とし、細胞を回収した。ｅｘ ｖｉｖｏサンプルと同様の方法でｍＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現リズムを測定した。各群における４時間毎の経時的変化の統計学的解析には、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた。
【0077】
マウス膀胱上皮培養細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本での時計遺伝子Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、及びＣｌｏｃｋ、並びにＰｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化を測定した結果を、それぞれ図１１Ａ〜図１１Ｈに示す。その結果、膀胱上皮由来の培養細胞において、時計遺伝子の発現リズムを確認した。野生型におけるＰｅｒ２のｍＲＮＡ発現は、ＣＴ０をｎａｄｉｒ、ＣＴ１２をｐｅａｋとする概日リズムを呈していた（ｐ＜０．０５）。一方で、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９でのＰｅｒ２のｍＲＮＡ発現は、そのリズムが消失していた（有意差なし）。ｅｘ ｖｉｖｏでの結果を参考にし、ＣＴ０−ＣＴ１２を相対的な明期、ＣＴ１２−ＣＴ０を相対的な暗期と設定した。
野生型におけるＢｍａｌ１のｍＲＮＡも同様に概日リズムを認めた（ｐ＜０．０１）。ｐｅａｋ値はＣＴ１６とＰｅｒ２よりわずかにずれていた。ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９において、Ｂｍａｌ１のｍＲＮＡ発現には、有意な経時的変化を認めたが（ｐ＜０．０５）、野生型のような概日リズムではない変動であった。
【0078】
Ｃｒｙ１におけるｍＲＮＡ発現の経時的変化もＰｅｒ２と同じであり、野生型においては、ＣＴ０をｎａｄｉｒ、ＣＴ１２をｐｅａｋとする概日リズムを呈していた（ｐ＜０．０１）。一方で、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（ｐ＜０．０５）では、そのリズムが消失していた。ＣｌｏｃｋのｍＲＮＡ発現については、ｅｘ ｖｉｖｏ標本では概日リズムを伴わなかったが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、概日リズムを認めた（ｐ＜０．０１）。
その他の時計遺伝子（Ｃｒｙ２、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４、ＲＯＲα、及びＲｅｖ−ｅｒｂα）にもＰｅｒ２、Ｃｒｙ１と同じようなｍＲＮＡ発現の概日リズムを認めた（データ未掲載）。
【0079】
野生型において、伸展刺激受容体のＰｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、ＡＴＰトランスポーターのＶＮＵＴ、ＡＴＰチャネルのＣｏｎｎｅｘｉｎ２６で、それらのｍＲＮＡの発現に概日リズムを認めた（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。一方、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９においては、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、ＶＮＵＴで概日リズムの消失を認めた（有意差なし）。Ｐｉｅｚｏ１では経時的変化に有意差を認めたが（ｐ＜０．０５）、野生型のような概日リズムではない変動であった。
【0080】
また、Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのマーカーのいずれについても、野生型に比べてＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９においてｍＲＮＡの発現量が下方制御されていることが分かった。
【0081】
以上の結果から、培養細胞においても、ｅｘ ｖｉｖｏと同様の遺伝子の発現パターンが認められることが分かった。これにより、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９由来の膀胱上皮細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ系においても、これを睡眠期頻尿乃至多尿モデルとして、評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法に使用できることが分かった。また、前記マーカーについては、野生型に比べてＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９においてｍＲＮＡの発現の概日リズムが消失し、ｍＲＮＡの発現量が下方制御されていることから、睡眠期頻尿乃至多尿からの機能回復のためには、これらのマーカーの発現量を上昇させること（特に、ｐｅａｋを示す時間帯におけるマーカーの発現量を上昇させること）が重要であることが推測された。
【0082】
（実施例５：Ｃｌｏｃｋ ｓｉＲＮＡによりＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を阻害したマウス膀胱上皮培養細胞における時計遺伝子、Ｐｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化）＜Ｃｌｏｃｋ ｓｉＲＮＡによる機能阻害＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８−１２週齢）と雄性同遺伝的背景ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（８週齢）から、実施例４と同様の方法により、膀胱上皮培養細胞をフィブロネクチンコーティングのディッシュ上に播種した。
細胞播種より３時間後、ｃｌｏｃｋ ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉＴＭ，ＣｌｏｃｋＭＳＳ２０３０３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０μＭと、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に溶解し、膀胱上皮培養細胞にトランスフェクトした。
【0083】
培地を４８時間後に１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換した。細胞回収１２時間前より、実施例４と同様に馬血清刺激を２時間加え、ＣＴ０より４時間毎に細胞回収を開始した。回収した細胞から、実施例４と同様の方法でｍＲＮＡを抽出して定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ発現の経時的変化を測定した。各群における４時間毎の経時的変化の統計学的解析には、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた。
【0084】
Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能を阻害したマウス膀胱上皮培養細胞での時計遺伝子Ｐｅｒ２、Ｂｍａｌ１、及びＣｒｙ１、並びにＰｉｅｚｏ１、ＴＲＰＶ４、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ２６、及びＶＮＵＴのｍＲＮＡ発現経時的変化を測定した結果を、それぞれ図１２Ａ〜図１２Ｇに示す。その結果、野生型の膀胱上皮培養細胞にＣｌｏｃｋ ｓｉＲＮＡを導入してＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を阻害したことにより、時計遺伝子や伸展刺激受容体などのｍＲＮＡ発現リズムが消失することが分かった（いずれも有意差なし）。このｍＲＮＡ発現パターンは、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９の膀胱上皮培養細胞におけるパターンとほぼ同じ傾向であった。
【0085】
以上の結果から、細胞レベルで野生型の膀胱上皮培養細胞のＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させた場合においても、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９に由来する膀胱上皮培養細胞と同様のｍＲＮＡ発現リズムを再現できることが分かった。このことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価対象薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法については、ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９などのＣｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した個体に由来する試料（細胞など）に加えて、細胞レベルでＣｌｏｃｋ遺伝子の機能を欠損させた場合も、使用できることが分かった。
【0086】
（実施例６：マウス膀胱上皮培養細胞への伸展刺激による細胞内カルシウムの濃度変化の経時的変化測定）＜マウス膀胱上皮由来の培養細胞の調製＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型、８−１２週齢）と雄性同遺伝的背景ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（８週齢）から、以下の方法により膀胱上皮培養細胞を作製した。
各マウスより膀胱を摘出し膀胱を反転した。反転した膀胱内に膀胱頚部からＰＢＳ（和光純薬工業株式会社製）を１００μＬ注入し、膀胱を拡張した後、膀胱頚部を結紮した（ｅｖｅｒｔｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ ｂａｌｌの調製）。次いで、膀胱を９．２Ｕ／ｍＬのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）溶液中で３７℃、２５分間インキュベートし、その後、ＤＭＥＭ（和光純薬工業株式会社製）中に移し替え膀胱上皮細胞を鈍的に剥離した。細胞を１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、ＤＭＥＭに再懸濁した後、伸展刺激を加えるため、細胞をフィブロネクチンでコーティングしたｅｌａｓｔｉｃ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＳＴＢ−ＣＨ−０４、ストレックス株式会社製）に１個体の膀胱から得られた膀胱上皮細胞を６分割して播種した。
なお、各タイムポイントＣＴ０、ＣＴ４、ＣＴ８、ＣＴ１２、ＣＴ１６及びＣＴ２０において野生型（Ｎ＝８３、５２、９２、４１、５３及び５７）及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９（Ｎ＝４６、１００、７５、４７、７６及び５８）から採取した試料を用いて独立に解析を行った。
【0087】
＜伸展刺激＞伸展刺激を加える１２時間前に馬血清（商品名：ＨＩ Ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ社製）を５０体積％含むＤＭＥＭにより２時間の同期刺激を加え、同期刺激より１２時間後をｃｉｒｃａｄｉａｎ ｔｉｍｅ（ＣＴ）０とし、ＣＴ０からＣＴ２０の４時間毎に細胞に伸展刺激を加えた。伸展刺激装置（ＳＴＢ１５０、ストレックス株式会社製）に置かれたｓｉｌｉｃｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒｓに対し、１００μｍ、１００μ／ｓｅｃで伸展刺激を加えた。
【0088】
＜細胞内Ｃａ２＋流入量の測定＞５μＭのＣａ２＋蛍光プローブＦｕｒａ２ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と０．０２体積％の界面活性剤ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とをローディングバッファー（ＢＳＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭ グルコース、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）に懸濁し、培養細胞に加え、室温で１時間静置することによりＦｕｒａ２ＡＭをローディングした。
【0089】
次いで、伸展刺激装置に培養細胞をセットし、ＢＳＳで洗浄後、更に３０分間静置した。伸展刺激前５分間、伸展刺激後５分間で、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの励起光によって得られる蛍光（それぞれ、Ｆ３４０及びＦ３８０と称する）の蛍光強度変化を蛍光顕微鏡（ＴＥ−２０００−Ｕ、株式会社ニコン製）と高感度ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−Ｒ２、浜松ホトニクス株式会社製）を用い測定した。蛍光強度変化比率（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を、画像処理システム（Ａｑｕａｃｏｓｍｏｓ Ｖｅｒ２．６、浜松ホトニクス株式会社製）で数値化した。変化率は、伸展刺激後のＣａ２＋の増加ｐｅａｋ値から伸展刺激前の値を引くことにより算出した。
【0090】
野生型マウス及びＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９マウスに由来する膀胱上皮培養細胞への伸展刺激による細胞内カルシウムの濃度変化の経時的変化を測定した結果をそれぞれ図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。その結果、野生型において、膀胱上皮培養細胞へ伸展刺激を加えた際の細胞内Ｃａ濃度は概日リズムを認めた（図１３Ａ）。これは伸展刺激受容体Ｐｉｅｚｏ１やＴＲＰＶ４のｍＲＮＡ発現と同じリズムである。同じ伸展刺激に対して、これらの受容体発現量がの少ない睡眠期はＣａ２＋流入が少なく尿意を感じにくい状況といえる。一方で、受容体の発現量が多い活動期においてはＣａ２＋流入量が多く尿意を感じ易くなっている状況といえる。
ＣｌｏｃｋΔ１９／Δ１９においても有意変動はあるが、野生型で観察された概日リズムとは異なる変動パターンを示し、野生型に比べてＣａ２＋流入量が下方制御されることが分かった（図１３Ｂ）。昼夜による尿意の調節がない状態であり、常にある一定の尿量で排尿をしている状況のため、睡眠期頻尿を引き起こしていると考えられる。
【0091】
以上の結果から、前記Ｃｌｏｃｋ遺伝子の機能が欠損した非ヒト哺乳動物が、自然発症型の睡眠期頻尿乃至多尿を示すことが明らかとなった。これらの表現型は、ヒト高齢者の夜間頻尿乃至夜間多尿とほぼ同じであることから、睡眠期頻尿乃至多尿モデルとして有用であることが分かった。また、前記睡眠期頻尿乃至多尿モデルを用いた評価対照薬剤の睡眠期頻尿乃至多尿治療効果の評価方法に適用できることが分かった。本発明の評価方法は、現行の治療薬及びその投与条件を評価し、再考して治療効果を高めるために利用できることに加え、新規治療薬の評価や、睡眠期頻尿乃至多尿の病態解明に役立つものと考えられる。