特許 6605179 ラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6605179

(24)【登録日】2019年10月25日

(45)【発行日】2019年11月13日

(54)【発明の名称】ラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/04 20060101AFI20191031BHJP

   C12P 33/20 20060101ALI20191031BHJP

   C12P 17/06 20060101ALI20191031BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/04

   C12P33/20

   C12P17/06

【請求項の数】7

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2019-512027(P2019-512027)

(86)(22)【出願日】2017年3月1日

(65)【公表番号】特表2019-514440(P2019-514440A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(86)【国際出願番号】CN2017075348

(87)【国際公開番号】WO2018157335

(87)【国際公開日】20180907

【審査請求日】2018年11月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】518403311

【氏名又は名称】桂林莱菌生物科技股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＧＵＩＬＩＮ ＬＡＹＮ ＮＡＴＵＲＡＬ ＩＮＧＲＥＤＩＥＮＴＳ ＣＯＲＰ．

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】宋 云飛

(72)【発明者】

【氏名】楊 文国

(72)【発明者】

【氏名】李 元元

(72)【発明者】

【氏名】郭 美錦

(72)【発明者】

【氏名】李 佳瑞

(72)【発明者】

【氏名】王 沢建

(72)【発明者】

【氏名】庄 英萍

【審査官】 清野 千秋

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−１５８５１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／０８８７００（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０４

Ｃ１２Ｐ １７／０６

Ｃ１２Ｐ ３３／２０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを加える、
ことを特徴とするラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【請求項2】

前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から５〜７日目に酵母誘導物質１０〜５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル５０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、９〜１１日目に酵母誘導物質１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１２０〜２６０μｍｏｌ／Ｌを添加し、１７〜２５日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する、
ことを特徴とする請求項１に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【請求項3】

前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加えて、１９日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する、
ことを特徴とする請求項１に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【請求項4】

ラカンカの成熟胚を分離し、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、３〜５回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶステップ（１）と、
ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得るステップ（２）により、前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系を獲得する、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【請求項5】

前記ステップ（１）の継代回数は４回である、
ことを特徴とする請求項４に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【請求項6】

請求項１乃至３および請求項５のいずれか１項に記載の方法で製造した成熟ラカンカ懸濁細胞からさらにモグロシドＶを分離・抽出する、
ことを特徴とするモグロシドＶの製造方法。

【請求項7】

請求項４に記載の方法で製造した成熟ラカンカ懸濁細胞からさらにモグロシドＶを分離・抽出する、
ことを特徴とするモグロシドＶの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生物技術分野に関し、特にラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法に関する。

【背景技術】

【0002】

モグロシドＶは、モグロシドともいい、ウリ科ラカンカ属ラカンカ（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ）の主な甘味成分で、その甘さは蔗糖の３５０倍に上り、すでに７種の単量体が分離されており、そのうちモグロシドＶとシアメノサイドＩの甘さが最も強い。モグロシドＶは熱を下げて肺を潤わせ、喉や便通に効くなどの薬用効果があり、また、モグロシドＶは斬新な味わいと純粋な味を有するため、人々に深く好かれており、肥満症、高血圧、糖尿病患者等の最も適切な甘味料と健康食品で、広範な応用価値がある。現在、モグロシドＶを得る方法は主に天然ラカンカを原料として、加熱などの方法を通じて抽出している。しかしながら、天然ラカンカに含まれているモグロシドＶの量がきわめて低く、既存の技術ではラカンカの利用率およびモグロシドＶの抽出率がそれほど高くなく、原料を大きく浪費しているだけでなく、日増しに増大する市場ニ−ズを満足させることができない。

【0003】

植物細胞培養技術を通じて目的とする二次代謝産物を生産することは、天然植物中の目標成分含量を高める有効な手段の一つである。細胞懸濁培養は増殖スピ−ドが速く、培養規模が大きくかつ均一な植物細胞培養産物を大量に提供することができるため、植物細胞培養技術を通じてモグロシドＶを生産すれば、モグロシドＶの含有量を効果的に高め、生産コストを下げることができ、モグロシドＶの市場化に適している。特許文献１に開示された「ラカンカカルス細胞懸濁系の培養方法」において、培養で得られたラカンカ総配糖体、モグロシドＶの含有量はそれぞれ細胞総重量の８．１１％と５．７７％であった。しかしながらこの方法の培養周期は２１日間と長く、操作維持の難しさとコストが増大し、かつ得られたモグロシドＶの含有量は市場の需要を満たせるものではなかった。

【0004】

植物次生代謝の過程において、誘導物質は特殊な生物化学分子として迅速、専一かつ選択的にある特定遺伝子の表現を誘導して、代謝経路の関連酵素の活性を高めることができるため、当該酵素が制御している次生産物の生成量を促進または抑制することができる。真菌誘導物質は微生物分子に由来した一種の確定した化学信号で、植物細胞を刺激して、迅速に防御応答反応を発生させることによって、高度専一かつ選択的に植物の特定遺伝子の表現を刺激して、特定の次生代謝の経路を活性化させ、次生代謝産物の合成を促進することができる。非特許文献１に、糖の濃度を３００ｍｇ／Ｌに調整したコウジカビ粗抽出物の成分（蛋白質＋多糖類）はモグロシドＶの総量を対照群より２４６．７２％向上させることができ、また５００ｍｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加すると細胞によるモグロシドＶの合成を著しく促進することができ、モグロシドＶの総量が対照群より２６０．３８％向上したと記載されている。この方法はモグロシドＶの含有量を高めることができるが、苦味成分の分泌合成も同時に増えるので、後続プロセスにおけるモグロシドＶの分離と純化の難度およびコストを増している。

【0005】

酵母（Ｙｅａｓｔ）は植物細胞の培養によく使われている誘導物質で、二次代謝産物の形成を促進することができる。研究によると、Ｔｉ−形質転換された丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）細胞の培養において、酵母誘導物質の添加によってクリプトタンシノン（Ｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）が２倍増加した。また酵母は紫雪花（Ｐｌｕｍｂａｇｏ ｒｏｓｅａｌ）の培養において、プルンバギン（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎ）の含有量を３倍増やした。ただ違う培養系ではその誘導効果が異なる。ジャスミン酸メチルエステル（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎａｔｅ、ＭｅＪＡ）は次生代謝物の蓄積を刺激する非生物類の誘導因子で、異なる植物懸濁培養系にジャスミン酸メチルエステルを加えると細胞の次生代謝物の蓄積を誘導することができる。２００μｍｏｌ／Ｌのジャスミン酸メチルエステルでエンジュ（Ｍａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ．ｅｔＭａｘｉｍ）の懸濁培養細胞を処理した９日後、イソフラボンの含有量が対照の４１７．１８％に増えた。１００μｍｏｌ／Ｌのジャスミン酸メチルエステルで南方イチイ（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の懸濁細胞を処理した場合、タキソールの含有量が１０倍増加した。しかしながら、ジャスミン酸メチルエステルをいくつかの植物懸濁培養系に添加した場合、懸濁細胞のアレルギー反応を誘発したり、またはフェノ−ル化合物の放出を促進したりすることによって、懸濁細胞の褐変を招くことがある。１．０ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルエステルで野生葛の懸濁細胞を処理した場合、細胞培養物中のプエラリンの含有量の増大がみられたが、細胞が著しく褐変した。現在のところ、酵母あるいはジャスミン酸メチルエステルのラカンカ懸濁培養系への応用がない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】中国特許第１０２１７４４６３号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】ラカンカ細胞培養系の創立とモグロシドＶ形成の制御、陳蘭桂、広西師範大学、２０１０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従来技術の不足を克服するために、本発明の目的はラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶの含有量を高める方法を提供することである。前記方法はラカンカ懸濁細胞の培養周期を短縮することができるだけでなく、生産過程の操作維持コストを下げ、ラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高めると同時に、苦味成分の合成分泌を抑えることもできる。

【0009】

本発明の発明者は、初代ラカンカ懸濁細胞の培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、適量の酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを添加することによって、ラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量およびその合成速度を効果的に向上させることができると同時に、モグロシドＩＩの合成分泌を低減させることができることを発見した。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の目的は以下の技術的手法を通じて実現することができる。
本発明はラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法を提供し、当該方法は、初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを加えることにあることを特徴とする。

【0011】

好ましくは、前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から５〜７日目に酵母誘導物質１０〜５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル５０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、９〜１１日目に酵母誘導物質１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１２０〜２６０μｍｏｌ／Ｌを添加し、１７〜２５日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する。

【0012】

好ましくは、前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミンの酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加えて、１９日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する。

【0013】

好ましくは、初代ラカンカ懸濁細胞培養系は、
ラカンカの成熟胚を分離し、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、３〜５回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、状態が安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶステップ（１）と、
ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得るステップ（２）により獲得される。

【0014】

好ましくは、ステップ（１）の継代回数は４回である。

【0015】

本発明は以下技術的難題を克服した。すなわちジャスミン酸メチルエステル単独で対数生長期のラカンカ懸濁細胞を処理した場合、処理後単位時間内のモグロシドＶの合成量がある程度増加したが、細胞の褐変が顕著で、総含有量は通常の培養群よりも低下した。酵母誘導物質を単独添加した場合、モグロシドＶの総含有量に対する明らかな影響が見られなかったが、モグロシドＶの合成速度は緩やかになった。

【0016】

一連の技術的最適化を通じて、初代ラカンカ懸濁細胞培養系において、培養開始から５〜７日目に酵母誘導物質１０〜５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル５０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、９〜１１日目に酵母誘導物質１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１２０〜２６０μｍｏｌ／Ｌを加えて、１７〜２５日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得することが好都合で、モグロシドＶの合成速度と総含有量が著しく向上し、苦味成分の分泌合成が著しく低下し、かつ細胞培養周期を著しく短縮させることができることが明らかになった。特に培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加えて、１９日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を収穫した場合、モグロシドＶの合成速度がもっとも速く、総含有量が最も高く、苦味成分であるモグロシドＩＩの合成分泌が最も少なかった。

【0017】

本発明はまたモグロシドＶの製造方法を提供し、その特徴は、上述の方法で製造した成熟ラカンカ懸濁細胞からさらにモグロシドＶを分離・抽出することにある。

【発明の効果】

【0018】

従来技術に比べると、本発明は以下のメリットがある。
１．本発明はラカンカの胚を培養原料とし、分化継代能力がさらに強くて安定し、成長が旺盛で、状態安定かつ均一なラカンカカルスを培養するのに適している。
２．本発明の培養方法で得たラカンカ細胞懸濁系は、モグロシドＶの生成量が著しく高く、かつ合成分泌した苦味などの不純物の含有量がさらに少なくなくなっている。
３．本発明の培養方法で得たラカンカ細胞懸濁系は、細胞の成長が速く、分散性が良く、培養周期が短く、操作維持の難度が減り、更なる市場化生産の要求を満たすことができる。
４．本発明の方法でモグロシドＶを獲得するプロセスは、大量の土地資源を節約し、生態環境の保護に役立ち、我が国の持続的発展可能な経済戦略に合致しているだけでなく、モグロシドＶを得るための効果的なプロセスを提供している。
５．本発明は人工方式でラカンカ細胞とモグロシドＶの製造過程を調節することができ、製品の品質を管理・制御するのに役立つ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下の実施例は本発明の説明に用いるが、本発明の範囲を制限するものではない。

【0020】

（実施例１）
（１）ラカンカの成熟胚を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、４回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0021】

（実施例２）
（１）ラカンカの成熟胚を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で３回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、状態が安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌ（新鮮重量）の接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から５日目に酵母誘導物質１０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル５０μｍｏｌ／Ｌ、９日目に酵母誘導物質１００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１２０μｍｏｌ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩ含有量を測定した。

【0022】

（実施例３）
（１）ラカンカの成熟胚を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、５回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌ（新鮮重量）の接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目に酵母誘導物質２５ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル７５μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質２００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２６０μｍｏｌ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0023】

（実施例４）
（１）ラカンカ茎のカルスを接種・誘導し、ショ糖２．５％、６−ベンジルアデニン０．２ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．０４ｍｇ／Ｌ、寒天４．０ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．８のＭＳ培地で継代培養し、３回、４回あるいは５回連続継代培養した新鮮で柔らかくて砕けやすい黄白色のカルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得たカルスを３００ｇ／Ｌの接種量でショ糖４．０％、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．０２ｍｇ／Ｌを含むＭＳ液体培地が入っている無菌三角フラスコに移し、初期培地のｐＨは５．５〜６．０で、１２０ｒ／ｍｉｎの振盪培養器に入れて２５℃の暗黒条件下で２４時間懸濁培養した後静置し、上層部の培地と共に単細胞と小細胞塊を空の無菌三角形フラスコに移し、引き続き振盪培養する。
（３）３日後に同様の方法でもう一回移して、７日後に懸濁細胞を４０μｍのろ過網でろ過した後に新鮮な培地に接種して引き続き振盪培養し、一定の体積に達した後に大きな三角形フラスコに移して、同様の方法で培地を添加して振盪培養を継続し、一定量の均一で安定的な細胞懸濁培養液を得るまで続けて、細胞懸濁培養温度は２５±２℃で、光の強さは２０００ｌｕｘで、日照時間は１２ｈ／ｄで、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（４）ステップ（３）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加える。
（５）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0024】

（対照例１）
本対照例は、コウジカビ誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを添加する技術的手法と本発明の技術的手法の技術効果の相違を評価するために用いるもので、具体的なステップは次の通りである。
（１）ラカンカの成熟胚を分離し、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、４回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目に黒色アスペルギルス誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に黒色アスペルギルス誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩ含有量を測定した。

【0025】

（対照例２）
本対照例は、フェニルアラニンと酵母誘導物質を添加する技術的手法と本発明の技術的手法の技術効果の相違を評価するために用いるもので、具体的なステップは次の通りである。
（１）ラカンカの成熟胚を分離し、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、４回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目にフェニルアラニン５０ｍｇ／Ｌ、酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、１１日目にフェニルアラニン１８０ｍｇ／Ｌ、酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0026】

（対照例３）
本対照例は、酵母誘導物質を単独で添加する技術的手法と本発明の技術的手法の技術効果の相違を評価するために用いるもので、具体的なステップは次の通りである。
（１）ラカンカの成熟胚を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、４回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌを加える。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0027】

（対照例４）
本対照例は、ジャスミン酸メチルエステルを単独で添加する技術的手法と本発明の技術的手法の技術効果の相違を評価するために用いるもので、具体的なステップは次の通りである。
（１）ラカンカの成熟胚を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、４回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（３）ステップ（２）で得た初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養し、培養開始から７日目にジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目にジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを添加する。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0028】

（対照例５）
本対照例は、文献１が開示した技術的手法と本発明技術的手法の技術効果の相違を評価するために用いるもので、具体的なステップは次の通りである。
（１）ラカンカ茎のカルスを接種・誘導し、蔗糖２．５％、６−ベンジルアデニン０．２ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．０４ｍｇ／Ｌ、寒天４．０ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．８のＭＳ培地で継代培養し、３回、４回あるいは５回連続継代培養した新鮮で、柔らかくて砕きやすい黄白色のカルスを選ぶ。
（２）ステップ（１）で得たカルスを３００ｇ／Ｌの接種量でショ糖４．０％、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．０２ｍｇ／Ｌを含むＭＳ液体培地が入っている無菌三角形フラスコに入れて、初期培地ｐＨは５．５〜６．０で、１２０ｒ／ｍｉｎの振盪培養器に入れて、２５℃の暗黒条件下で２４ｈ懸濁培養した後静置し、上層部の培地と共に単細胞と小細胞塊を空の無菌三角形フラスコに移して引き続き振盪培養し、
（３）３日後に同様の方法でもう一回移し、７日後に懸濁細胞を４０μｍのろ過網でろ過した後新鮮な培地に接種して引き続き振盪培養し、一定の体積に達した後に大きな三角形フラスコに移して、同様の方法で培地を添加して、一定量の均一で安定的な細胞懸濁培養液に達するまで引き続き振盪培養し、細胞懸濁培養温度は２５±２℃で、光強さは２０００ｌｕｘで、日照時間は１２ｈ／ｄで、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得る。
（４）培養開始から１〜３１日の間に、一日おきにラカンカ懸濁細胞を抽出し、モグロシドＶとモグロシドＩＩの含有量を測定した。

【0029】

モグロシドＶ含有量の比較
１．実験方法
乾燥重量１．５ｇのラカンカ細胞を秤量し、１５：１の浴比で６０％のエタノールを添加して超音波で４０分間抽出した後、９０℃の微沸騰状態下でさらに２時間抽出し、このように繰り返して３回抽出した後抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで５ｍＬになるまで濃縮し、濃縮液を０．２２μｍ濾過膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーで定性と定量分析を行った。
クロマトグラフィー条件：カラム：逆相Ｃ１８カラム、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、移動相：水−アセトニトリル＝７８：２２、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２０３ｎｍ。
２．結果
異なる処理条件が単位時間内のモグロシドＶの生成量に及ぼす影響を表１に示す。

【0030】

【表1】

【0031】

異なる処理条件がモグロシドＶ生成量のピ−ク値（最大値）に及ぼす影響を調べた結果を表２に示す。

【0032】

【表2】

【0033】

モグロシドＩＩ含有量の比較
１．実験方法
乾燥重量１．５ｇのラカンカ細胞を秤量し、１５：１の浴比で６０％のエタノールを添加して超音波で４０分間抽出した後、９０℃の微沸騰状態下でさらに２時間抽出し、このように繰り返して３回抽出した後抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで５ｍＬになるまで濃縮し、濃縮液を０．２２μｍの濾過膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーで定性と定量分析を行った。
クロマトグラフィー条件：カラム：ＺＯＲＢＡＸＳＢＣＣ１８カラム、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、移動相：水−アセトニトリルグラジエント溶出（０〜２５ｍｉｎ、１３．５％〜３５％アセトニトリル）、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２０３ｎｍ。
２．結果
異なる処理条件がモグロシドＶピ−ク値の時のモグロシドＩＩの含有量に及ぼす影響を調べた結果を表３に示す。

【0034】

【表3】

【0035】

結論
モグロシドＶの含有量を比較した結果（表１、表２）から、対照例１〜５に比べると、実施例１〜４のモグロシドＶ含有量が著しく向上し、ピ−ク時の値はそれぞれ８５．２、８４．９±１．８、８６．７±２．２、８５．１±３．０ｇ／Ｌであり、ラカンカ懸濁培養系に酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを添加することによって、モグロシドＶの生成量を効果的に高めることができ、技術的効果が従来技術より著しく優れていることが明らかになった。また、対照例１〜５に比べると、実施例１においてモグロシドＶの合成速度が著しく向上し、培養開始から１５日目にモグロシドＶの含有量は７０ｇ／Ｌを上回り、１９日目にモグロシドＶの含有量はピ−ク値に達した。ラカンカ懸濁細胞培養系に酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを添加することによって、ラカンカ懸濁細胞によるモグロシドＶの合成速度を著しく向上させることができ、技術的効果が従来技術より著しく優れていることが明らかになった。

【0036】

モグロシドＩＩの含有量を比較した結果（表３）から、対照例１〜５に比べると、実施例１〜５のモグロシドＩＩ含有量が著しく低下し、ラカンカ懸濁細胞培養系に酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを添加することによって、苦味成分であるモグロシドＩＩの含有量を著しく低下させることができ、技術的効果が従来技術より著しく優れていることが明らかになった。

【0037】

以上、一般的説明、具体的な実施形態および実験を通じて、本発明について詳しく説明してきた。しかしながら、本発明に基づくいくらかの修正又は改良は、当該領域の技術者にとって成し得ることが自明である。そのため、本発明の趣旨を逸脱しない範囲での修正又は改良は本発明の請求範囲に属するものと見なすべきである。

【0038】

（付記）
（付記１）
初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、酵母誘導物質とジャスミン酸メチルエステルを加える、
ことを特徴とするラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【0039】

（付記２）
前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から５〜７日目に酵母誘導物質１０〜５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル５０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、９〜１１日目に酵母誘導物質１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１２０〜２６０μｍｏｌ／Ｌを添加し、１７〜２５日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する、
ことを特徴とする付記１に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【0040】

（付記３）
前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系で成熟ラカンカ懸濁細胞を培養する過程において、培養開始から７日目に酵母誘導物質５０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル１００μｍｏｌ／Ｌ、１１日目に酵母誘導物質１８０ｍｇ／Ｌ、ジャスミン酸メチルエステル２２０μｍｏｌ／Ｌを加えて、１９日目に成熟したラカンカ懸濁細胞を取得する、
ことを特徴とする付記１に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【0041】

（付記４）
ラカンカの成熟胚を分離し、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌ、寒天４．６ｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．０のＭＳ半固形培地で継代培養し、３〜５回連続継代培養した成長旺盛で、柔らかく、安定的かつ均一な新鮮胚カルスを選ぶステップ（１）と、
ステップ（１）で得た新鮮胚カルスを１００ｇ／Ｌの接種量でショ糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン１．０ｍｇ／Ｌ、ナフチ−ル酢酸０．５ｍｇ／Ｌ、イノシトール１００ｍｇ／Ｌを含むｐＨ５．５〜６．５のＭＳ液体培地に移し、そして回転速度１５０ｒ／ｍｉｎ、温度２５±２℃、光強度４０００ｌｕｘ、日照時間１２ｈ／ｄの振盪培養器のなかで培養し、初代ラカンカ懸濁細胞培養系を得るステップ（２）により、前記初代ラカンカ懸濁細胞培養系を獲得する、
ことを特徴とする付記１乃至３のいずれか１つに記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【0042】

（付記５）
前記ステップ（１）の継代回数は４回である、
ことを特徴とする付記４に記載のラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法。

【0043】

（付記６）
付記１乃至３および付記５のいずれか１つに記載の方法で製造した成熟ラカンカ懸濁細胞からさらにモグロシドＶを分離・抽出する、
ことを特徴とするモグロシドＶの製造方法。

【0044】

（付記７）
付記４に記載の方法で製造した成熟ラカンカ懸濁細胞からさらにモグロシドＶを分離・抽出する、
ことを特徴とするモグロシドＶの製造方法。

【産業上の利用可能性】

【0045】

本発明はラカンカ懸濁細胞中のモグロシドＶ含有量を高める方法に関する。前記方法はラカンカ懸濁細胞培養周期の５〜１１日目に、１０〜２００ｍｇ／Ｌの酵母誘導物質と５０〜２６０ｍｇ／Ｌのジャスミン酸メチルエステルをそれぞれ添加することによって、モグロシドＶの合成速度と生成量を向上させると同時に、モグロシドＩＩの分泌量を低減させる。前記方法はモグロシドＶの市場化における大量生産と品質の制御管理に役立ち、比較的良い経済価値と広い応用見通しを持つ。