特許 6606916 エクソソームの捕捉方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6606916

(24)【登録日】2019年11月1日

(45)【発行日】2019年11月20日

(54)【発明の名称】エクソソームの捕捉方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20191111BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20191111BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 501A

   G01N33/543 521

   C12Q1/04

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2015-163336(P2015-163336)

(22)【出願日】2015年8月21日

(65)【公開番号】特開2017-40595(P2017-40595A)

(43)【公開日】2017年2月23日

【審査請求日】2018年3月30日

(73)【特許権者】

【識別番号】308036402

【氏名又は名称】株式会社ＪＶＣケンウッド

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100101247

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 俊一

(72)【発明者】

【氏名】糸長 誠

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 祐一

(72)【発明者】

【氏名】辻田 公二

(72)【発明者】

【氏名】小野 雅之

(72)【発明者】

【氏名】岩間 茂彦

(72)【発明者】

【氏名】五十嵐 誠

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５０８５７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１６８０２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０３７７７７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２０３０６１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 CLAYTON, A et al.，Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry，J Immunol Methods，２００１年 １月 １日，247(1-2)，163-174

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の検出対象物質と第２の検出対象物質と第３の検出対象物質とが同時に存在するエクソソームを捕捉するエクソソームの捕捉方法であって、
前記第１の検出対象物質、前記第２の検出対象物質、及び前記第３の検出対象物質が同時に存在するエクソソームを含む第１の試料液と、前記第１の検出対象物質と結合する第１の結合物質を有する第１の微粒子を含む第１の緩衝液とを混合して、前記第１の検出対象物質と前記第１の結合物質とを結合させ、前記エクソソームと前記第１の微粒子との第１の結合体を形成し、
前記第１の試料液と前記第１の緩衝液との混合液から前記第１の結合体を分離し、
前記混合液を第２の緩衝液で置換することにより前記第１の検出対象物質が存在していないエクソソームを除去し、
前記第２の検出対象物質と結合する第２の結合物質を基板上に固定させ、
前記基板上に設けられたウェルに前記第１の結合体を含む第２の試料液を注入し、前記第１の結合体の前記第２の検出対象物質と前記基板上に固定された前記第２の結合物質とを結合させることにより、前記基板上に前記第１の結合体を固定させ、
前記ウェルより前記第２の試料液を排出して第３の緩衝液で洗浄することにより、前記第２の検出対象物質が存在していないエクソソームを除去し、
前記第３の検出対象物質と結合する第３の結合物質を有する第２の微粒子を含む第４の緩衝液を、前記基板上に固定されている前記第１の結合体と反応させ、前記第３の検出対象物質と前記第３の結合物質とを結合させて、前記エクソソームに前記第１の微粒子及び前記第２の微粒子がそれぞれ結合している第２の結合体を前記基板上に固定させる
エクソソームの捕捉方法。

【請求項2】

前記基板上に固定されている前記第２の結合体における前記第２の微粒子を検出することで、前記第２の結合体における前記エクソソームを間接的に検出する請求項１に記載のエクソソームの捕捉方法。

【請求項3】

前記第１の微粒子の粒子径は、前記第２の微粒子の粒子径よりも小さい請求項１または２に記載のエクソソームの捕捉方法。

【請求項4】

前記基板は、凸部と凹部とが交互に配置されたトラック領域を有し、前記第１の結合体及び前記第２の結合体を、前記凹部に捕捉させる請求項１〜３のいずれか１項に記載のエクソソームの捕捉方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、各種の細胞が分泌するエクソソームの捕捉方法に関する。

【背景技術】

【0002】

疾病と関連付けられている特定の抗原（または抗体）をバイオマーカとして検出して分析することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析することが広く行われている。近年、エクソソーム（exosome）と称されている微小な膜小胞が新たなバイオマーカとして期待されている。

【0003】

エクソソームは、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等に含まれている。エクソソームは液体中では概略球形であり、直径１００ｎｍ程度を中心として分布している。エクソソームは、脂質二重膜で覆われている。脂質二重膜には、様々な物質、例えばたんぱく質が存在している。また脂質二重膜の内部には、様々なたんぱく質やmiRNA等の核酸が内包されている。なお、エクソソームは、マイクロベシクル、細胞外小胞と称されることもあり、複数の呼称が存在する。

【0004】

特許文献１には、酵素免疫吸着測定法（ELISA（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay））による免疫学的測定法を用いて、エクソソームを捕捉して分析する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００９／０９２３８６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

一般的に、エクソソームは、種類の異なる複数のたんぱく質を含んでいる。その中で、認識対象となるたんぱく質は、脂質二重膜の表面に存在するたんぱく質であり、例えば、膜貫通型たんぱく質、接着分子、膜輸送たんぱく質、膜融合たんぱく質、糖たんぱく質等である。以下、これらを単にたんぱく質と総称する。１つのエクソソームに対して複数の種類のたんぱく質を識別することができれば、エクソソームの選択的な検出が可能になる。そのため、検出の疾患特異性を高めることができ、診断の精度や確度を向上させることが期待される。

【0007】

しかしながら、特許文献１に記載されているような従来のエクソソーム捕捉方法では、１つのエクソソームに対して、２種類のたんぱく質を識別することはできるものの、３種類のたんぱく質を識別することは難しい。

【0008】

そのため、異なる抗体を用いてエクソソームの捕捉と分析を複数回行う必要があり、工程が煩雑になる。また、この場合においても、１つのエクソソームに３種類のたんぱく質が同時に存在しているか否かを識別することは難しい。

【0009】

本発明はこのような問題点に鑑み、従来よりも疾患特異性を高め、診断の精度や確度を向上させることが可能になる、エクソソームの捕捉方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、第１の検出対象物質と第２の検出対象物質と第３の検出対象物質とが同時に存在するエクソソームを捕捉するエクソソームの捕捉方法であって、前記第１の検出対象物質、前記第２の検出対象物質、及び前記第３の検出対象物質が同時に存在するエクソソームを含む第１の試料液と、前記第１の検出対象物質と結合する第１の結合物質を有する第１の微粒子を含む第１の緩衝液とを混合して、前記第１の検出対象物質と前記第１の結合物質とを結合させ、前記エクソソームと前記第１の微粒子との第１の結合体を形成し、前記第１の試料液と前記第１の緩衝液との混合液から前記第１の結合体を分離し、前記混合液を第２の緩衝液で置換することにより前記第１の検出対象物質が存在していないエクソソームを除去し、前記第２の検出対象物質と結合する第２の結合物質を基板上に固定させ、前記基板上に設けられたウェルに前記第１の結合体を含む第２の試料液を注入し、前記第１の結合体の前記第２の検出対象物質と前記基板上に固定された前記第２の結合物質とを結合させることにより、前記基板上に前記第１の結合体を固定させ、前記ウェルより前記第２の試料液を排出して第３の緩衝液で洗浄することにより、前記第２の検出対象物質が存在していないエクソソームを除去し、前記第３の検出対象物質と結合する第３の結合物質を有する第２の微粒子を含む第４の緩衝液を、前記基板上に固定されている前記第１の結合体と反応させ、前記第３の検出対象物質と前記第３の結合物質とを結合させて、前記エクソソームに前記第１の微粒子及び前記第２の微粒子がそれぞれ結合している第２の結合体を前記基板上に固定させるエクソソームの捕捉方法を提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明のエクソソームの捕捉方法によれば、従来よりも疾患特異性を高め、診断の精度や確度を向上させることが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】エクソソームと第１の微粒子との結合体の形成方法を説明するためのフローチャートである。

【図2】エクソソームを含む試料液とエクソソームの模式的な断面図である。

【図3】磁気微粒子を含む緩衝液と磁気微粒子の模式図である。

【図4】エクソソームを含む試料液と磁気微粒子を含む緩衝液との混合液の模式的な断面図である。

【図5】結合体が磁気捕集されている状態を模式的に示す断面図である。

【図6】結合体が分散した試料液の模式的な断面図である。

【図7】エクソソーム捕捉ユニットの模式図である。

【図8】図７（ａ）のＢ−Ｂで切断した部分のウェルの拡大斜視図である。

【図9】エクソソームの捕捉方法を説明するためのフローチャートである。

【図10】ウェルに注入された溶液の模式的な断面図である。

【図11】ウェルに注入された微粒子を含む緩衝液、及び、微粒子の模式図である。

【図12】抗体及びブロック層がトラック領域に固定されている状態を模式的に示す断面図である。

【図13】エクソソーム及び結合体がトラック領域の凹部に固定されている状態を模式的に示す断面図である。

【図14】トラック領域の凸部及び凹部の寸法的形状を示す拡大断面図である。

【図15】結合体がトラック領域の凹部に固定されている状態を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

［エクソソームと第１の微粒子との結合体の形成］
まず、図１〜図６を用いて、エクソソームと第１の微粒子との結合体の形成方法について説明する。

【0014】

図１は、エクソソーム１０と磁気微粒子２０との結合体の形成方法を説明するためのフローチャートである。図２（ａ）は、エクソソーム１０を含む試料液１の模式的な断面図である。図２（ｂ）は、エクソソーム１０の模式的な断面図である。なお、エクソソーム１０の粒子径は種々存在するが、図２（ａ）等においてはエクソソーム１０の粒子径を全て同一で図示している。

【0015】

図１において、オペレータは、ステップＳ１にて、図２（ａ）に示すように、検出対象のエクソソーム１０を含む試料液１（第１の試料液）を準備する。

【0016】

図２（ｂ）に示すように、エクソソーム１０は、脂質二重膜１１で覆われている。脂質二重膜１１には、複数の種類の膜貫通型たんぱく質等のたんぱく質が存在する。たんぱく質の個数や脂質二重膜１１における位置は、エクソソームの種類によって異なり、個体によっても異なる。これらの表面分子を抗原として抗原抗体反応を用いて認識を行う。抗原である表面分子として、ＣＤ６３，ＣＤ９，Ｒａｂ−５ｂ等の他様々なたんぱく質等の分子の存在が多くの論文で報告されている。なお、図２（ｂ）では、エクソソームを識別するための抗原である３種類のたんぱく質（検出対象物質）に対して符号１２，１３，１４を付している。

【0017】

エクソソーム１０の平均粒子径Ｒａは、例えば１００ｎｍである。

【0018】

エクソソーム１０の平均粒子径Ｒａとは、エクソソーム１０の粒子径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えば、ナノ粒子トラッキング法を用いた、エクソソーム１０が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエクソソーム１０の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法等がある。

【0019】

後者の測定方法では、エクソソーム１０の形態を保ったまま乾式で観測可能とするために、エクソソーム１０を含む試料に対して細胞を観測する手法に準じた処理を施す。

【0020】

具体的には、試料を基体上に固定し、低濃度のエタノールから純度１００％のエタノールまで、ステップごとにエタノールの濃度を高くして数ステップをかけてエタノールの含浸を繰り返す。これによって、試料中の水分がエタノールへと置換されて脱水される。

【0021】

次に、試料を、エタノールに可溶な合成樹脂を含む溶液で含浸することによって、エタノールを合成樹脂に置換する。そして、合成樹脂に置換された試料を薄片化して観測する。

【0022】

また、エクソソーム１０を含む試料を急速冷凍することにより、エクソソーム１０の形態を保ったまま脱水して観測可能とすることもできる。

【0023】

図３（ａ）は、磁気微粒子２０を含む緩衝液２の模式図である。図３（ｂ）は、磁気微粒子２０の模式図である。

【0024】

オペレータは、ステップＳ２にて、図３（ａ）に示すように、磁気微粒子２０（第１の微粒子）を含む緩衝液２（第１の緩衝液）を調製する。

【0025】

図３（ｂ）に示すように、磁気微粒子２０は、略球形に形成されたポリスチレン等の合成樹脂で形成されている。磁気微粒子２０は酸化鉄等の磁性体２１を内包している。磁気微粒子２０の表面には、エクソソーム１０の抗原１２（第１の検出対象物質）と特異的に結合する抗体２２（第１の結合物質）が固定されている。なお、磁気微粒子２０の粒子径Ｒｂについては後述する。

【0026】

図４は、エクソソーム１０を含む試料液１と磁気微粒子２０を含む緩衝液２との混合液４の模式的な断面図である。

【0027】

オペレータは、ステップＳ３にて、図４に示すように、試料液１と緩衝液２とをマイクロチューブやカラム等の容器３に注入し、混合させる。適切な時間、抗原抗体反応を進行させるインキュベート処理を行う。

【0028】

インキュベート処理により、混合液４中に、抗原１２と抗体２２とが特異的に結合された、エクソソーム１０と磁気微粒子２０との結合体５（第１の結合体）が形成される。なお、試料液によっては抗原１２を有さないエクソソームが含まれている場合がある。抗原１２を有さないエクソソームは、磁気微粒子２０と結合しない状態で混合液４中に分散している。

【0029】

図５は、結合体５が磁気捕集されている状態を模式的に示す断面図である。

【0030】

オペレータは、ステップＳ４にて、図５に示すように、磁石６等を用いて、結合体５を磁気捕集する。例えば、磁石６を容器３の側面３ａに接近させることで、結合体５を磁石６近傍の側面３ａに磁気捕集することができる。従って、ステップＳ４により、混合液４から結合体５を分離させることができる。

【0031】

なお、結合体５の分離方法は磁気捕集に限定されるものではない。例えば、磁気微粒子２０に替えて電荷を有する粒子を使用することも可能である。電荷を有する粒子が固定されているエクソソームと、固定されていないエクソソームとでは、電荷の量が異なるため電界の中での動きが異なることを利用して、両者を分離する。例えば、フローサイトメトリーを原理としたセルソーターを用いることで、混合液４中から結合体５を分離させることが可能となる。

【0032】

磁気微粒子２０が非常に小さい場合、外部磁界によって誘起される磁化が小さい。そのため、一般的な永久磁石では結合体５を効率よく磁気捕集することが難しい場合がある。その場合は、高勾配磁気分離法による磁気捕集が好適である。

【0033】

オペレータは、ステップＳ５にて、容器３内の混合液４を緩衝液で置換する。容器３内を複数回、緩衝液で置換することが好ましい。なお、混合液４中に分散している抗原１２を有さないエクソソームは、緩衝液で置換されることにより除去される。

【0034】

オペレータは、ステップＳ６にて、磁石６を容器３から離隔させ、磁気捕集により分離された結合体５を緩衝液中に再分散させる。その際、容器３に超音波を印加する等の分散処理を行うとより良好な分散状態を実現できる。

【0035】

図６は、結合体５が分散した試料液７の模式的な断面図である。

【0036】

ステップＳ６の分散処理により、図６に示すように、緩衝液中に結合体５が分散した再懸濁液を試料液７（第２の試料液）とする。

【0037】

次に、図７〜図１３を用いて、エクソソームの捕捉方法について説明する。

【0038】

［エクソソーム捕捉ユニット］
まず、図７及び図８を用いて、エクソソームを捕捉するためのエクソソーム捕捉ユニットの構成を説明する。

【0039】

図７（ａ）はエクソソーム捕捉ユニット３０の模式的な上面図である。図７（ｂ）は図７（ａ）のＡ−Ａにおける模式的な断面図である。図７（ｃ）はカートリッジ３２が基板３１に対して着脱可能であることを説明するための模式的な断面図である。図８は、図７（ａ）のＢ−Ｂで切断した部分拡大斜視図である。

【0040】

図７（ａ）に示すように、エクソソーム捕捉ユニット３０は、基板３１とカートリッジ３２とを有して構成されている。

【0041】

基板３１は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。基板３１は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂やシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。

【0042】

図８に示すように、基板３１の表面には、凸部３３と凹部３４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域３５が形成されている。凸部３３及び凹部３４は、内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部３３は光ディスクのランドに相当する。凹部３４は光ディスクのグルーブに相当する。

【0043】

図７（ａ）に示すように、カートリッジ３２はリング形状を有する。カートリッジ３２には、周方向に複数の円筒状の貫通孔３６が形成されている。

【0044】

図７（ｂ）及び図８に示すように、エクソソーム捕捉ユニット３０は、カートリッジ３２の貫通孔３６と基板３１のトラック領域３５とによって形成される複数のウェル３７を有している。即ち、貫通孔３６の内周面はウェル３７の内周面を構成し、基板３１のトラック領域３５はウェル３７の底面を構成する。ウェル３７は試料液７等を溜めるための容器である。また、貫通孔３６と基板３１の間に、シリコンゴム等の弾性変形する素材で作成したパッキンを入れると、溶液の漏れる可能性を低減することができ好都合である。

【0045】

図７（ｃ）に示すように、カートリッジ３２は基板３１に対して着脱可能である。エクソソーム捕捉後のエクソソームの検出は、カートリッジ３２を基板３１から取り外し、基板３１単体で行われる。

【0046】

［エクソソームの捕捉］
次に、図９〜図１５を用いて、エクソソーム捕捉ユニット３０を用いてエクソソーム１０を捕捉する捕捉方法を説明する。

【0047】

図９はエクソソーム１０の捕捉方法を説明するためのフローチャートである。

【0048】

図１０（ａ）はウェル３７に注入された抗体４３を含む緩衝液４０の模式的な断面図である。図１０（ｂ）はウェル３７に注入された結合体５を含む試料液７の模式的な断面図である。なお、図１０（ａ）及び図１０（ｂ）では、基板３１とカートリッジ３２とを簡略化させて一体化させた構造として示している。

【0049】

図１１（ａ）はウェル３７に注入された微粒子５０を含む緩衝液８の模式図である。図１１（ｂ）は微粒子５０の模式図である。

【0050】

図１２（ａ）は抗体４３がトラック領域３５に固定されている状態を模式的に示す断面図である。図１２（ｂ）はブロック層４１がトラック領域３５に形成されている状態を模式的に示す断面図である。

【0051】

なお、図１２（ａ）及び図１２（ｂ）では抗体４３が基板３１に対してほぼ垂直の方位で固定されるように示されている。しかしながら、実際には、抗体４３が固定される方位は固定方法により異なる。例えば疎水結合を用いて抗体４３が固定された場合は、抗体４３は様々な方位を有して基板に固定される。

【0052】

図１３（ａ）は結合体５がトラック領域３５の凹部３４に捕捉されている状態を模式的に示す断面図である。図１３（ｂ）はエクソソーム１０に磁気微粒子２０及び微粒子５０がそれぞれ結合された結合体９がトラック領域３５の凹部３４に捕捉されている状態を模式的に示す断面図である。

【0053】

なお、説明をわかりやすくするために、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示すエクソソーム１０は、図２（ｂ）に示すエクソソーム１０を簡略化して模式的に示している。

【0054】

図９において、オペレータは、ステップＳ１１にて、図１０（ａ）に示すように、エクソソーム１０の抗原１３（第２の検出対象物質）と特異的に結合する抗体４３（第２の結合物質）を含む緩衝液４０を、エクソソーム捕捉ユニット３０のウェル３７に注入する。

【0055】

オペレータは、エクソソーム捕捉ユニット３０を、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。例えば、一般的な免疫学的測定で用いられる、４℃で一晩ほど静置してインキュベートさせる。これにより、抗体４３は基板３１上のトラック領域３５に固定される。

【0056】

オペレータは、ステップＳ１２にて、ウェル３７から緩衝液４０を排出し、ウェル３７を緩衝液で洗浄する。なお、トラック領域３５に固定されなかった抗体４３はこの洗浄によって除去される。

【0057】

なお、ステップＳ１１及びステップＳ１２は、オペレータが抗体４３を固定させる場合に必要な工程である。工場等で事前に抗体４３が固定されているエクソソーム捕捉ユニット３０または基板３１を使用する場合は、ステップＳ１１及びステップＳ１２を省略することができる。

【0058】

図１２（ａ）に示すように、抗体４３はトラック領域３５を構成する凸部３３及び凹部３４に疎水結合によって固定される。抗体４３の固定方法は疎水結合に限定されない。トラック領域３５に適切な化学的処理を行い、共有結合等を用いて抗体４３をトラック領域３５に固定させてもよい。トラック領域３５に抗体４３を固定させる方法は、免疫学測定法で一般的に使われている方法を用いることができる。

【0059】

オペレータは、ステップＳ１３にて、抗体４３の抗原識別部以外に抗原が非特異的に吸着することを防ぐため、ウェル３７の内部をブロッキング処理する。具体的には、オペレータは、緩衝液で希釈されたスキムミルクをウェル３７に注入し、ステップＳ１１と同様に、エクソソーム捕捉ユニット３０を適切な時間、振盪させる。

【0060】

スキムミルクはエクソソーム１０に付着しないたんぱく質を含むので、ブロッキング処理に好適である。なお、ブロッキング処理に用いる物質は、同様の効果を奏するものであればスキムミルクに限定されない。

【0061】

オペレータは、ステップＳ１４にて、ウェル３７からスキムミルクを含む緩衝液を排出し、ウェル３７を緩衝液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝液としては、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略することも可能である。

【0062】

図１２（ｂ）に示すように、ブロック層４１がトラック領域３５に形成される。

【0063】

オペレータは、ステップＳ１５にて、図１０（ｂ）に示すように、結合体５を含む試料液７をウェル３７に注入し、ステップＳ１１と同様に、エクソソーム捕捉ユニット３０を、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。インキュベート時に振盪させてもよい。ステップＳ１５では、例えば２時間程度、３７℃でエクソソーム捕捉ユニット３０を振盪させる。

【0064】

これにより、エクソソーム１０の抗原１３とトラック領域３５に固定されている抗体４３とは、抗原抗体反応によって特異的に結合する。図１３（ａ）に示すように、結合体５は、トラック領域３５の凹部３４に捕捉される。なお、試料液によっては抗原１３を有さないエクソソームが含まれている場合がある。抗原１３を有さないエクソソームは、トラック領域３５の抗体４３と結合しない状態で試料液７中に結合体５として分散している。

【0065】

オペレータは、ステップＳ１６にて、ウェル３７から試料液７を排出し、ウェル３７を緩衝液で洗浄する。なお、試料液７中に分散している結合体５、及び、抗原抗体反応ではない非特異吸着によってトラック領域３５に付着している結合体５は、この洗浄によって除去される。即ち、試料液７中に分散している抗原１３を有さないエクソソームは、緩衝液で洗浄されることにより除去される。また、試料液７中に磁気微粒子２０が含まれている場合においても、磁気微粒子２０は、この洗浄によって除去される。

【0066】

オペレータは、ステップＳ１７にて、図１１（ａ）に示すように、微粒子（第２の微粒子）５０を含む緩衝液８（第２の緩衝液）をウェル３７に注入し、ステップＳ１１と同様に、エクソソーム捕捉ユニット３０を、適切な時間、振盪させる。

【0067】

図１１（ｂ）に示すように、微粒子５０は、略球形に形成されたポリスチレン、グリシジルメタクリレート等の合成樹脂で形成されている。微粒子５０の表面には、エクソソーム１０の抗原１４（第３の検出対象物質）と特異的に結合する抗体５４（第３の結合物質）が固定されている。なお、微粒子５０の粒子径Ｒｃについては後述する。

【0068】

これにより、エクソソーム１０の抗原１４と微粒子５０の抗体５４とは、抗原抗体反応によって特異的に結合する。図１３（ｂ）に示すように、エクソソーム１０に磁気微粒子２０及び微粒子５０がそれぞれ結合された結合体９は、トラック領域３５の凹部３４に捕捉される。なお、抗原１４を有さないエクソソームは、微粒子５０の抗体５４と結合しない状態でトラック領域３５の凹部３４に捕捉されている。

【0069】

従って、トラック領域３５の凹部３４には、エクソソーム１０を識別するための３種類の検出対象物質（たんぱく質）１２，１３，１４の全てを有するエクソソーム１０が結合された結合体９、及び、２種類の検出対象物質（たんぱく質）１２，１３を有するエクソソームが結合された結合体５が捕捉されている。

【0070】

微粒子５０は、磁気微粒子２０と同様に磁性体２１を内包していてもよい。ステップＳ１７においてエクソソーム捕捉ユニット３０の裏面側に磁石を配置することで、磁性体２１を内包する微粒子５０をトラック領域３５に迅速に移動させることができる。これにより、ステップＳ１７を時間短縮することができる。

【0071】

オペレータは、ステップＳ１８にて、ウェル３７から緩衝液８を排出し、ウェル３７を緩衝液で洗浄する。なお、緩衝液８中に分散している微粒子５０は、この洗浄によって除去される。

【0072】

例えば、外部に配置された光ピックアップから、結合体９及び結合体５が捕捉されているトラック領域３５、詳しくは凹部３４に向けてレーザ光を照射する。トラック領域３５からの反射光を解析することで、微粒子５０が結合されている結合体９のみを検出することができる。従って、エクソソーム１０を識別するための３種類の検出対象物質１２，１３，１４の全てを有するエクソソーム１０のみを検出することができる。

【0073】

具体的には、光ピックアップは、トラック領域３５にレーザ光を集光させるための対物レンズを備えている。基板３１を一般的な光ディスクと同様に回転させ、光ピックアップを基板３１の半径方向に移動させることにより、対物レンズによって集光されたレーザ光をトラック（具体的には凹部３４）に沿って走査する。

【0074】

トラック領域３５からの反射光により得られた検出信号から、凹部３４に捕獲されている結合体９における微粒子５０を検出することができる。従って、トラック領域３５からの反射光により得られた検出信号から、微粒子５０が結合されている結合体９からの信号のみを選別することにより、結合体９を構成するエクソソーム１０のみを検出することができる。

【0075】

即ち、微粒子５０を検出することで結合体９のみを検出することができ、間接的に結合体９におけるエクソソーム１０を検出することができる。また、微粒子５０の数を計測することで間接的にエクソソーム１０の数を計測することができる。

【0076】

ここで、磁気微粒子２０の粒子径を、磁気分離を行うには十分な磁化を有し、かつ、検出信号へ与える変化が十分に小さい範囲に設定する。なお、磁気微粒子２０の粒子径については後述する。その結果、検出信号の変化は、結合体９のみに現れ、結合体５では生じない。すなわち、複雑な信号処理を行わなくても、結合体９のみの検出が可能となる。

【0077】

試料液によっては、３種類の検出対象物質１２，１３，１４のうち、検出対象物質１２を有さないエクソソームや、検出対象物質１３を有さないエクソソームや、検出対象物質１４を有さないエクソソームが含まれている場合がある。

【0078】

本実施形態のエクソソームの捕捉方法によれば、３種類の検出対象物質１２，１３，１４のうち、検出対象物質１２を有さないエクソソームはステップＳ５で除去される。例えば、試料液中に検出対象物質１２を有さないエクソソームのみが含まれている場合、エクソソームはステップＳ５で全て除去されるため、試料液中には検出対象物質１２を有さないエクソソームのみが含まれていることが特定できる。

【0079】

本実施形態のエクソソームの捕捉方法によれば、検出対象物質１３を有さないエクソソームはステップＳ１６で除去される。検出対象物質１４を有さないエクソソームは、微粒子５０が結合されていないため検出されない。即ち、３種類の検出対象物質１２，１３，１４を有するエクソソーム１０のみを検出することができる。

【0080】

よって、本実施形態のエクソソームの捕捉方法によれば、１つのエクソソームに存在している３種類のたんぱく質を一度に識別することが可能になる。また、試料液中に３種類全ての検出対象物質を有するエクソソームが含まれていない場合、エクソソームは検出されないため、試料液中に３種類全ての検出対象物質を有するエクソソームが含まれていないことが特定できる。これにより、従来よりも疾患特異性を高め、診断の精度や確度を向上させることが可能になる。

【0081】

図１４及び図１５を用いて、エクソソーム１０、磁気微粒子２０、微粒子５０、及び、トラック領域３５の相互の関係を説明する。

【0082】

図１４はトラック領域３５の凸部３３及び凹部３４の寸法的形状を示す拡大断面図である。凹部３４の深さ（凸部３３の高さ）をＨとし、凹部３４の幅をＷａとし、凸部３３の幅をＷｂとする。なお、幅Ｗａ，幅Ｗｂは、一点鎖線で示すＨ／２の位置での幅である。

【0083】

図１５（ａ）は結合体９がトラック領域３５の凹部３４に固定されている状態を模式的に示す上面図である。図１５（ｂ）は図１５（ａ）のＣ−Ｃにおける模式的な断面図である。図１５（ｃ）は図１５（ａ）のＤ−Ｄにおける模式的な断面図である。

【0084】

図１５（ａ）〜図１５（ｃ）に示すように、エクソソーム１０をトラック方向に沿って配列させ、１つのエクソソーム１０に１つの微粒子５０を高い確率で結合させることで、エクソソーム１０の測定精度や測定確度を向上させることができる。

【0085】

例えば、式（１）に示すように、磁気微粒子２０の粒子径Ｒｂは凹部３４に集光されるレーザ光のスポット径（ｋ×λ）／ＮＡよりも小さく、微粒子５０の粒子径Ｒｃはスポット径（ｋ×λ）／ＮＡ以上であることが好ましい。

【0086】

Ｒｂ＜（ｋ×λ）／ＮＡ≦Ｒｃ …（１）

【0087】

なお、λは光ピックアップから射出され、対物レンズによって凹部３４に集光されるレーザ光の中心波長である。ＮＡは対物レンズの開口数である。ｋは係数である。ｋは例えば１／５である。

【0088】

式（１）を満たすことで、光ピックアップは、磁気微粒子２０の影響を受けずに、微粒子５０を精度よく検出することができる。従って、微粒子５０の測定精度や測定確度を向上させることができる。λ＝４０５ｎｍ、ＮＡ＝０．８５、ｋ＝１／５の場合、（ｋ×λ）／ＮＡ＝９５ｎｍであり、磁気微粒子２０の粒子径Ｒｂは９５ｎｍ以下、好ましくは約５０ｎｍである。微粒子５０の粒子径Ｒｃは例えば２００ｎｍである。

【0089】

式（２）に示すように、凸部３３の幅Ｗｂはエクソソーム１０の平均粒子径Ｒａよりも小さいことが好ましい。

【0090】

Ｗｂ＜Ｒａ …（２）

【0091】

式（２）を満たすことで、結合体５は凸部３３上に位置しにくくなる。

【0092】

式（３）に示すように、凹部３４の幅Ｗａは、エクソソーム１０の平均粒子径Ｒａと磁気微粒子２０の粒子径Ｒｂの加算値よりも大きく、平均粒子径Ｒａの４倍値よりも小さいことが好ましい。

【0093】

（Ｒａ＋Ｒｂ）＜Ｗａ＜４×Ｒａ …（３）

【0094】

式（３）の（Ｒａ＋Ｒｂ）＜Ｗａを満たせば、結合体５を凹部３４に捕捉することができる。

【0095】

図１３（ａ）に示すように、凹部３４に捕捉されたエクソソーム１０は、一般的に、球形から接触面積を拡げる方向に変形する。なお、磁気微粒子２０と同様に、磁性体２１を内包した微粒子５０を用いると、ステップＳ１７にてエクソソーム捕捉ユニット３０の裏面側に磁石を配置することで磁力によってエクソソーム１０の変形が促進される。

【0096】

球形のエクソソーム１０が体積を保って楕円体に変形したと仮定すると、球の直径が５０％変化する場合、回転楕円体の長軸である凹部３４との接触部位の直径は約４０％大きくなる。さらに実際には、回転楕円体形状よりも接触部位の面積が大きくなる方向に変形するので、接触部位の直径は、元の球形のときの直径の５０％以上、場合によっては１００％以上増大することもある。

【0097】

以上のことから、式（３）のＷａ＜４×Ｒａを満たすことが好ましい。

【0098】

Ｗａに関しては、さらに式（４）に示すように、凸部３３の幅Ｗｂは微粒子５０の粒子径Ｒｃよりも小さいことが好ましい。凹部３４の幅Ｗａは粒子径Ｒｃよりも大きく、粒子径Ｒｃの２倍値よりも小さいことが好ましい。

【0099】

Ｗｂ＜Ｒｃ＜Ｗａ＜２×Ｒｃ …（４）

【0100】

式（４）のＷｂ＜Ｒｃを満たすことで、微粒子５０は凸部３３上に位置しにくくなる。式（３）のＲｃ＜Ｗａを満たすことで、微粒子５０は凹部３４に入ることができる。式（４）のＷａ＜２×Ｒｃを満たすことで、微粒子５０が凹部３４の幅方向に同時に２つ入りにくくなり、エクソソーム１０と微粒子５０との数量関係を１対１に近づけることができる。

【0101】

式（５）に示すように、微粒子５０の粒子径Ｒｃはエクソソーム１０の平均粒子径Ｒａよりも大きいことが好ましい。

【0102】

Ｒａ＜Ｒｃ …（５）

【0103】

式（５）を満たすことで、凹部３４に固定されたエクソソーム１０に複数の微粒子５０が結合しにくくなり、エクソソーム１０と微粒子５０との数量関係を１対１に近づけることができる。式（５）を満たすことで、エクソソーム１０と微粒子５０とが反応的に出会う確率が高くなり、結果として反応の収率を向上させることができる。

【0104】

式（６）に示すように、凹部３４の深さＨは、エクソソーム１０の平均粒子径Ｒａと微粒子５０の粒子径Ｒｃの加算値の１／８倍値よりも大きいことが好ましい。

【0105】

（Ｒａ＋Ｒｃ）／８＜Ｈ …（６）

【0106】

式（６）を満たすことで、エクソソーム１０は凹部３４に捕捉されやすく、微粒子５０の凸部３３への非特異的な吸着が起こりにくくなり、微粒子５０は凹部３４に捕捉されているエクソソーム１０と結合しやすくなる。

【0107】

凹部３４の深さＨは、式（７）を満たすことがさらに好ましい。

【0108】

（Ｒａ＋Ｒｃ）／６＜Ｈ …（７）

【0109】

なお、上記の式（１）〜式（６）（または式（７））の全てを満たすことが好ましいが、部分的に満たすだけでもよい。

【0110】

本発明は、以上説明した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。

【符号の説明】

【0111】

１ 試料液（第１の試料液）
２ 緩衝液（第１の緩衝液）
５ 結合体（第１の結合体）
９ 結合体（第２の結合体）
１０ エクソソーム
１２ 抗原（第１の検出対象物質）
１３ 抗原（第２の検出対象物質）
１４ 抗原（第３の検出対象物質）
２０ 磁気微粒子（第１の微粒子）
２２ 抗体（第１の結合物質）
３１ 基板
４３ 抗体（第２の結合物質）
５０ 微粒子（第２の微粒子）
５４ 抗体（第３の結合物質）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】