特許 6607481 ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6607481

(24)【登録日】2019年11月1日

(45)【発行日】2019年11月20日

(54)【発明の名称】ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20191111BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20191111BHJP

   C12N 15/66 20060101ALI20191111BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20191111BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 Z

   C12N15/63 ZZNA

   C12N15/66

   C12N15/87 Z

【請求項の数】4

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2015-7674(P2015-7674)

(22)【出願日】2015年1月19日

(65)【公開番号】特開2016-131516(P2016-131516A)

(43)【公開日】2016年7月25日

【審査請求日】2017年10月23日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 研究成果最適展開支援プログラム 本格研究開発ステージ 起業挑戦タイプ（若手起業育成）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100188352

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100177714

【弁理士】

【氏名又は名称】藤本 昌平

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100198074

【弁理士】

【氏名又は名称】山村 昭裕

(72)【発明者】

【氏名】中村 美紀子

(72)【発明者】

【氏名】星田 尚司

(72)【発明者】

【氏名】赤田 倫治

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０４４９５２８０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１１２０８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 "Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested pLEAD Expression Kit", Woko Bio Window, 2007 Dec., vol. 86, p. 6, [online], retrieved 2018/08/08, <URL ; https://labchem.wako-chem.co.jp/journal/docs/bio86.pdf>

【文献】 "GenScript LIC Kit", フナコシ, 掲載日2008-02-18, [online], retrieved 2018/08/23, <URL:https://www.funakoshi.co.jp/contents/2632>

【文献】 Sykes KF et al，Nat Biotechnol，１９９９年 ４月，Vol. 17，pp. 355-359

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ターミネータ配列の３’末端側に、哺乳動物細胞でＲＮＡの発現を制御することができるプロモータ配列が動作可能に連結された線状二本鎖ＤＮＡであって、ターミネータ配列の３’末端の塩基とプロモータ配列の５’末端との間の塩基数が０〜３０００であり、プラスミドの複製開始点を含まないことを特徴とする線状二本鎖ＤＮＡ。

【請求項2】

ターミネータ配列が、ＳＶ４０ターミネータ又はラビットβ−グロビンターミネータ由来の配列であることを特徴とする請求項１記載の線状二本鎖ＤＮＡ。

【請求項3】

プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列であることを特徴とする請求項１又は２記載の線状二本鎖ＤＮＡ。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか記載の線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡをインビトロで哺乳動物細胞内に導入することを特徴とする前記ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ由来のＲＮＡを発現させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡや、かかる線状二本鎖ＤＮＡを用いてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

形質転換細胞を作製して該細胞内で目的遺伝子を発現させるには、プロモータ配列と目的遺伝子とターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡを作製し、かかるＤＮＡコンストラクトを、ベクターを介して細胞に導入する方法が一般的である。この方法を用いる場合には、プロモータ配列と目的遺伝子とターミネータ配列とを順次備えるようにＤＮＡを連結する必要がある。上記のようにＤＮＡを連結するために最も一般的に用いられている手法は、ＤＮＡリガーゼを用いて、平滑末端を有するＤＮＡ分子同士又は相補的な突出末端を有するＤＮＡ分子同士を結合させるものである。しかしながら、かかる方法は、制限酵素処理とＤＮＡリガーゼによるインサートＤＮＡとベクターの切断並びに連結という複雑なｉｎ ｖｉｔｒｏ操作を必要としていた。

【0003】

近年、本発明者らは、ベクターを介さずに形質転換細胞を作製する方法として、特定のターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマーを用いて作製した、プロモータ配列と目的ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と特定ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを動物細胞に導入する方法を提案した（特許文献１参照）。かかる方法では、制限酵素サイトやアニーリング配列を導入することなく、また煩雑な環状化操作を行うこともなく、ＰＣＲのみによってターミネータ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流に連結でき、得られた線状二本鎖ＤＮＡを動物細胞に導入することでＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることが可能となる。しかしながら、ＰＣＲを行う際は、プロモータ配列と目的ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたテンプレートを予め用意する必要があった。

【0004】

また、本発明者らは、ターミネータ配列とプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡやＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（特許文献２参照）を提案した。かかるＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いれば、線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞内に導入し、細胞内で容易にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることができるが、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列にターミネータ配列又はプロモータ配列を予め連結する必要があった。

【0005】

さらに、本発明者らは、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる形質転換細胞の製造方法を提案した（特許文献３参照）。かかる方法では、予めＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを調製する必要があり、様々なＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の発現を解析する場合には煩雑な作業と時間が必要であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット

【特許文献2】特願２０１３−２１３４５９号

【特許文献3】特願２０１３−２５８２６５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、プロモータ配列又はターミネータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを予め連結することなく、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることが可能な線状二本鎖ＤＮＡや、かかる線状二本鎖ＤＮＡを用いたＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を行った中で、プロモータ配列やターミネータ配列を含む様々な線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子を作製して、それぞれの配列を予め連結せずにそのまま哺乳動物細胞に導入したところ、意外にも、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入した場合において、細胞内で目的とするタンパク質が発現していることを見いだし、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は以下に示すとおりのものである。
（１）ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡであって、ターミネータ配列の３’末端の塩基とプロモータ配列の５’末端との間の塩基数が０〜３０００であることを特徴とする線状二本鎖ＤＮＡ。
（２）プラスミドの複製開始点を含まないことを特徴とする上記（１）記載の線状二本鎖ＤＮＡ。
（３）ターミネータ配列が、ＳＶ４０ターミネータ又はラビットβ−グロビンターミネータ由来の配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の線状二本鎖ＤＮＡ。
（４）プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の線状二本鎖ＤＮＡ。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を細胞内に導入することを特徴とする前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法。
（６）細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする上記（５）記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明によると、細胞内で遺伝子などを発現させる場合に、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列をコードする配列とを連結する工程や、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列をコードする配列とターミネータ配列とを連結する工程や、プラスミドを作製する工程が不要となる。特に、様々なＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の発現解析を行う場合に、本発明を利用することで短時間且つ低コストで解析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製する方法の例を示す図である。（ａ）はプロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとする場合、（ｂ）はターミネータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとする場合である。

【図2】作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を示す図である。（１）レーンがＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ、（２）レーンがＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ、（３）レーンがβＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ、（４）レーンがβＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰである。

【図3】プラスミドｐＣＭＶ−ｈＧｌｕｃ−ＳＶｔｅｒのマップを示す図である。

【図4】作製した線状二本鎖ＤＮＡ ｈＧｌｕｃのアガロース電気泳動の結果を示す図である。

【図5】実施例１においてヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を用いた場合におけるルシフェラーゼの発現量を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸がルシフェラーゼの相対蛍光強度（ＲＬＵ（ｃｏｕｎｔｓ／μｌ／ｓｅｃ））を示す。

【図6】実施例１においてヒト子宮頸部類上皮腫細胞（ＨｅＬａ細胞）を用いた場合におけるルシフェラーゼの発現量を示す図である。横軸、縦軸は図５と同様である。

【図7】作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を示す図である。（１）レーンがＥＧＦＰ、（２）レーンがＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒである。

【図8】実施例２において、ＨＥＫ２９３細胞に（ａ）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入した場合、（ｂ）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。また、（ａ）、（ｂ）において左図は蛍光顕微鏡像、右図は微分干渉顕微鏡像である（図９〜１３においても同様）。

【図9】実施例２において、ＨＥＫ２９３細胞に（ａ）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰを導入した場合、（ｂ）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【図10】実施例２において、ＨＥＫ２９３細胞に（ａ）ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒを導入した場合、（ｂ）ＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【図11】実施例２において、ＨｅＬａ細胞に（ａ）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入した場合、（ｂ）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【図12】実施例２において、ＨｅＬａ細胞に（ａ）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰを導入した場合、（ｂ）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【図13】実施例２において、ＨｅＬａ細胞に（ａ）ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒを導入した場合、（ｂ）ＥＧＦＰを導入した場合の蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の線状二本鎖ＤＮＡとしては、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡであって、ターミネータ配列の３’末端の塩基とプロモータ配列の５’末端との間の塩基数が０〜３０００であることを特徴とする線状二本鎖ＤＮＡであれば特に制限されず、プラスミドの複製開始点を含まないことが好ましい。

【0013】

また、本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法としては、上記本発明の線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を細胞内に導入する方法であれば特に制限されず、かかる方法により、プロモータ配列又はターミネータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを予め連結することなく、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることが可能となる。

【0014】

本発明において、ターミネータ配列としては、遺伝子の転写の終了を制御し、また転写されたＲＮＡを安定化する配列であればよく、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡ発現を行う細胞の種類、プロモータの種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類などによって適宜選択することができ、天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよい。なお、ターミネータとしての機能を有する限り、天然に存在するターミネータ配列の部分配列や、天然に存在するターミネータ配列に塩基の置換、欠損、又は挿入を含む配列も便宜上、人工的に合成したターミネータ配列に含まれる。

【0015】

天然に存在するターミネータ配列を用いる場合、ターミネータ配列としては、ウィルスのターミネータ配列であっても、大腸菌、枯草菌などの原核生物のターミネータ配列であっても、酵母、マウス、ヒトなどの真核生物のターミネータ配列であってもよく、具体的には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のＺｅｉｎ遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、ＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列などを例示することができ、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくはＳＶ４０ターミネータ配列又はラビットβ−グロビンターミネータ配列を例示することができる。

【0016】

人工的に合成したターミネータ配列としては、ＳＶ４０ターミネータ又はラビットβ−グロビンターミネータ由来の配列であることが好ましく、例えば、特願２０１３−２１３４５９号に記載された人工的に合成したターミネータ配列、好ましくはＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列（配列番号１）やラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列（配列番号２）などを例示することができる。

【0017】

本発明において、プロモータ配列とは、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流に配置した際に、ＲＮＡポリメラーゼが結合することにより、下流に配置されたＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡの発現を制御することができる塩基配列であればよく、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡを発現させる哺乳動物などの細胞の種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類、ターミネータ配列の種類などにより適宜選択することができ、天然に存在するプロモータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したプロモータ配列であってもよい。なお、プロモータとしての機能を有する限り、天然に存在するプロモータ配列の部分配列や、天然に存在するプロモータ配列に塩基の置換、欠損、又は挿入を含む配列も、便宜上人工的に合成したプロモータ配列に含まれる。

【0018】

天然に存在するプロモータ配列を用いる場合、プロモータ配列としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ配列、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列、アデノウイルス後期（Adenovirus Major Late、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモータ配列、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの融合プロモータであるＳＲαプロモータ配列、ヒトユビキチンＣプロモータ配列、α−アクチンプロモータ配列、β−アクチンプロモータ配列、Ｕ６プロモータ配列、Ｈ１プロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモータ配列、亜鉛などの金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモータ配列、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモータ配列を例示することができ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列を好適に例示することができる。

【0019】

人工的に合成したプロモータ配列としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ又はシミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ由来の配列であることが好ましく、例えば、特願２０１４−１２３２１４号や特願２０１４−１３６９２９号に記載されたプロモータ活性を有する配列などを例示することができる。

【0020】

本発明のターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡとしては、ターミネータ配列の下流（３’末端側）にプロモータ配列が動作可能に連結された線状二本鎖ＤＮＡであって、ターミネータ配列の３’末端の塩基とプロモータ配列の５’末端との間の塩基数が０〜３０００、好ましくは０〜１０００、より好ましくは０〜５００、さらに好ましくは０〜１００、特に好ましくは０〜５０、最も好ましくは０を例示することができる。

【0021】

ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製する方法としては特に制限されないが、例えば、プロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ法で作製する方法や、ターミネータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、プロモータ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ法で作製する方法や、ターミネータ配列を含む線状二本鎖ＤＮＡとプロモータ配列を含む線状二本鎖ＤＮＡとをフュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０号公報）やＤＮＡリガーゼを用いる方法などの公知の方法で連結して作製する方法を例示することができる。

【0022】

プロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ法で作製する方法としては、図１（ａ）に示すようにプロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列とプロモータ配列の５’末端領域の配列とを順次含む配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域の相補配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。かかるフォワードプライマーにおけるターミネータ配列としては、上述の特願２０１３−２１３４５９号に記載された人工的に合成したターミネータ配列、好ましくはＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列（配列番号１）やラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列（配列番号２）などを用いることが、ＲＮＡの発現量を高めることやプライマーを低コストで作製できる観点で好ましい。

【0023】

ターミネータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、プロモータ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ法で作製する方法としては、図１（ｂ）に示すようにターミネータ配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域の配列からなるフォワードプライマーと、ターミネータ配列の３’末端領域の配列とプロモータ配列とを順次含む配列の相補配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。かかるリバースプライマーにおけるプロモータ配列としては、上述の特願２０１４−１２３２１４号や、特願２０１４−１３６９２９号に記載されたプロモータ活性を有する配列などの人工的に合成したプロモータ活性を有する配列を用いることが、ＲＮＡの発現量を高めることやプライマーを低コストで作製できる観点で好ましい。

【0024】

本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法において、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ配列であればよく、タンパク質をコードする遺伝子の他、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）発現配列、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列などの機能性核酸を発現するＤＮＡ配列を例示することができる。

【0025】

本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法において、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を導入した細胞内でタンパク質を発現させる場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質をコードする遺伝子を選択でき、タンパク質をコードする遺伝子としては、用途に合わせて全長の遺伝子でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製された人工的な遺伝子でもよい。

【0026】

本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法において、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を導入した細胞内のタンパク質の発現をノックダウンする場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制できるｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、ｓｉＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現用ＤＮＡ配列を選択することができ、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を導入した細胞内のタンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制できる核酸アプタマー発現用ＤＮＡ配列や、リボザイム発現用ＤＮＡ配列を選択することができ、上記配列は、それぞれ標的ＲＮＡの配列や、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて常法により設計することができる。

【0027】

本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる方法において、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を導入する細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などを例示することができ、中でも哺乳動物細胞を好適に例示することができる。かかる哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌなどの哺乳動物由来の細胞であればよく、具体的にはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＣＯＳ−７）細胞、ＮＩＨ由来のマウス胎仔由来繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）、ヒト骨肉腫細胞（ＨＯＳ細胞）、培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１細胞）、ヒト白血球Ｔ細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒト乳癌培養樹立細胞（ＭＣＦ−７細胞）、ヒト肝臓ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト結腸癌由来細胞（ＣａＣＯ−２細胞）、ヒト骨芽細胞（ＳａＯＳ細胞）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）、サル腎由来細胞（ＣＶ−１細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１細胞）、マウス由来線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）、マウス奇形腫細胞（Ｆ９細胞）、マウス骨芽様細胞（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）、ラット副腎髄質褐色腫（ＰＣ−１２細胞）、ラット骨芽細胞様細胞（ＲＯＳ１７／２．８細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１細胞）などを例示することができ、中でもＨＥＫ２９３細胞又はＨｅＬａ細胞が好ましい。また、上記哺乳動物細胞には、ＥＢ３細胞などの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、組織から採取した初代培養細胞も含まれる。

【0028】

プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ＤＮＡを哺乳動物などの細胞内に導入する一般的な方法であればよく、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などを例示することができ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Tｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などの市販のトランスフェクション試薬並びに当技術分野で広く用いられている手法を用いることができる。

【0029】

また、細胞内に導入するターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列は、同時に細胞に導入してもよく、いずれか一方を先に細胞に導入し、その後、他方を前記細胞に導入してもよいが、同時に細胞内に導入することが好ましい。ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の濃度は、形質転換細胞においてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のＲＮＡを発現しうる限り特に制限されないが、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の濃度に対してターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの濃度が０．２〜５倍、好ましくは０．５〜２倍であることを例示することができる。

【実施例1】

【0030】

［ルシフェラーゼの発現］
（ＳＶ４０ターミネータ配列とＣＭＶプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１に示されるフォワードプライマー（SV40pA(130-208)-eCMV-600）と配列番号３に示されるリバースプライマー（CMVpc）を用いて、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列とＣＭＶプロモータの全長の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲは、ＧＸＬポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート１０ｐｇ（１００ｐｇ／μｌを１μｌ）、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調整し、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２（２）レーンに示す。

【0031】

（ラビットβ−グロビンターミネータ配列とＣＭＶプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック製）をテンプレートとして、配列番号２に示されるフォワードプライマー（βGlopA(121-190)-eCMV-600）と配列番号３に示されるリバースプライマー（CMVpc）を用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列とＣＭＶプロモータの全長の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも前記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２（３）レーンに示す。

【0032】

（ルシフェラーゼ（ｈＧｌｕｃ）遺伝子をコードする配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用い、特願２０１３−２１３４５９号に記載の方法に従って、ＣＭＶプロモータの全長の配列と、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする配列と、ＳＶ４０ターミネータの塩基番号１２１番目〜２２０番目の配列とを順次備えたプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｈＧｌｕｃ−ＳＶｔｅｒ：図３）を作製した。かかるｐＣＭＶ−ｈＧｌｕｃ−ＳＶｔｅｒをテンプレートとして、配列番号４に示されるフォワードプライマー（hGluc+1）と配列番号５に示されるリバースプライマー（hGluc+558taaC）を用いて、ｈＧｌｕｃ遺伝子をコードする配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ｈＧｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも上述と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図４に示す。

【0033】

（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して２３時間培養後、（I）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ、（II）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ、（III）ｈＧｌｕｃ、（IV）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びｈＧｌｕｃ（ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ＋ｈＧｌｕｃ）、（V）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びｈＧｌｕｃ（βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ＋ｈＧｌｕｃ）の各線状二本鎖ＤＮＡ２０ｎｇと、５％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ３３５０と、１．２５μｇのｔＲＮＡと、０．２μｌのＦｕＧＥＮＥ（商標登録）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ試薬と、蒸留水とを含む溶液２０μｌを調製し、かかる溶液を用いてＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞に（I）〜（V）の線状二本鎖ＤＮＡを導入した。次に、２５時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼの発現量を最終濃度１０μＭのＣＴＺ基質とＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（ベルトールドテクノロジー社製）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合におけるルシフェラーゼの発現量を図５に、ＨｅＬａ細胞を用いた場合におけるルシフェラーゼの発現量をそれぞれ図６に示す。

【0034】

（結果）
図５、６に示すように、ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ、又はｈＧｌｕｃをそれぞれ単独で導入しても細胞内でルシフェラーゼは発現していないが、ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びｈＧｌｕｃ、又は、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びｈＧｌｕｃを導入すると細胞内でルシフェラーゼが発現していることが明らかとなった。

【0035】

［ＥＧＦＰの発現］
（ＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマー（pEGFP+1）と配列番号７に示されるリバースプライマー:（pEGFP+720c）を用いて、ＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＧＦＰ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（１）レーンに示す。

【0036】

（ＳＶ４０ターミネータ配列とＣＭＶプロモータ配列とＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック製）をテンプレートとして、配列番号１に示されるフォワードプライマー（SV40pA(130-208)-eCMV-600）と配列番号７に示されるリバースプライマー（pEGPF+720c）を用いて、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列とＣＭＶプロモータの全長の配列とＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２（１）レーンに示す。

【0037】

（β−グロビンターミネータ配列とＣＭＶプロモータ配列とＥＧＦＰ遺伝子とをコードする配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック製）をテンプレートとして、配列番号２に示されるフォワードプライマー（βGlopA(121-190)-eCMV-600）と配列番号７に示されるリバースプライマー（pEGPF+720c）を用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列とＣＭＶプロモータの全長の配列とＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２（４）レーンに示す。

【0038】

（ＣＭＶプロモータ配列とＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック製）をテンプレートとして、配列番号８に示されるフォワードプライマー（pEGFP-600）と配列番号９に示されるリバースプライマー（pEGPF+1018c）を用いて、ＣＭＶプロモータの全長の配列とＥＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１分のサイクルを４０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（２）レーンに示す。

【0039】

（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して２３時間培養後、（I）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰ（ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ＋ＥＧＦＰ）、（II）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰ（βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ＋ＥＧＦＰ）、（III）ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ、（IV）βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ、（V）ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒ、（VI）ＥＧＦＰの各線状二本鎖ＤＮＡ２０ｎｇを、実施例１と同様にＦｕＧＥＮＥ（商標登録）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ試薬を含む溶液を用いてＨＥＫ２９３細胞及びＨｅＬａ細胞に導入し、２６時間後に蛍光顕微鏡で観察した。ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合における観察結果を図８〜１０に、ＨｅＬａ細胞を用いた場合における観察結果を図１１〜１３に示す。

【0040】

（結果）
図８〜１０に示すように、ＨＥＫ２９３細胞を用いた場合において、ＥＧＦＰを単独で導入しても細胞内でＥＧＦＰの発現はみられないが、ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰ、又は、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入すると、細胞内でＥＧＦＰが発現していることが明らかとなった。同様に、図１１〜１３に示すように、ＨｅＬａ細胞を用いた場合において、ＥＧＦＰを単独で導入しても細胞内でＥＧＦＰの発現はみられないが、ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰ、又は、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入すると、細胞内でＥＧＦＰが発現していることが明らかとなった。予めＥＧＦＰがプロモータ配列及び／又はターミネータ配列と結合したＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ、ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−ＳＶｔｅｒを導入した場合に比べれば発現量が劣るものの、ＳＶｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰ、又は、βＧｌｏｐＡｔｅｒ−ＣＭＶｐ及びＥＧＦＰを導入すると、蛍光観察による解析が十分可能なレベルでＥＧＦＰ発現が発現しており、本発明の線状二本鎖ＤＮＡを用いることで、煩雑な作業や時間を要することなく、細胞へ導入した遺伝子の発現解析が可能となることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0041】

本発明によると、細胞内で遺伝子などを発現させる場合に、プロモータ配列と遺伝子などをコードする配列とを連結する工程や、遺伝子などをコードする配列とターミネータ配列とを連結する工程や、プラスミドを作製する工程が不要となる。そのため、遺伝子、プロモータ、ターミネータなどの解析で利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]