特許 6608934 有機化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6608934

(24)【登録日】2019年11月1日

(45)【発行日】2019年11月20日

(54)【発明の名称】有機化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 487/04 20060101AFI20191111BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/30 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20191111BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20191111BHJP

【ＦＩ】

   C07D487/04 142

   C07D487/04CSP

   A61K31/519

   A61P43/00 111

   A61P25/00

   A61P25/06

   A61P25/08

   A61P25/28

   A61P25/16

   A61P9/10 101

   A61P21/02

   A61P25/14

   A61P25/24

   A61P25/20

   A61P25/18

   A61P25/22

   A61P25/30

   A61P9/12

   A61P25/04

【請求項の数】9

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-530036(P2017-530036)

(86)(22)【出願日】2015年12月7日

(65)【公表番号】特表2017-536410(P2017-536410A)

(43)【公表日】2017年12月7日

(86)【国際出願番号】US2015064324

(87)【国際公開番号】WO2016090380

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2018年12月6日

(31)【優先権主張番号】62/088,541

(32)【優先日】2014年12月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507401225

【氏名又は名称】イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＲＡ−ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】ポン・リ

(72)【発明者】

【氏名】ハイリン・ジェン

(72)【発明者】

【氏名】グレッチェン・スナイダー

(72)【発明者】

【氏名】ローレンス・ピー・ウェノグル

(72)【発明者】

【氏名】ジョゼフ・ヘンドリック

【審査官】 ▲吉▼澤 英一

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５１６０７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５０６５８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２４２２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０８３０６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Gomez et.al.，PDE2 inhibition:Potential for the treatment of cognitive disorders，Bioorganic & medicinal chemistry letters，２０１３年，23，6522-6527

【文献】 Hecht et.al.，Competitive Inhibition of Beef Heart Cyclic AMP Phosphodiesterase by Cytokinins and Related Compounds，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，１９７４年，vol.71,No.12，4670-4674

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遊離形態または塩形態の、式Ｉ：

【化1】

［式中、
（ｉ）Ｒ₁およびＲ₂は窒素原子と一緒になってヘテロＣ_3-7シクロアルキルを形成し；
（ｉｉ）Ｒ₃は、ＨまたはＣ_1-4アルキルであり；
（ｉｉｉ）Ｒ₄は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_3-7シクロアルキル、Ｃ_1-4アルコキシおよびハロＣ_1-4アルキルから選択される１個以上の基で置換されていてもよい、ヘテロアリールまたはアリールであり；
（ｉｖ）Ｒ₆は、ＨまたはＣ_1-4アルキルである］
の化合物。

【請求項2】

Ｒ₄が、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_3-7シクロアルキル、Ｃ_1-4アルコキシおよびハロＣ_1-4アルキルから選択される１個以上の基で置換されていてもよいアリールである、遊離形態または塩形態の請求項１記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ₆がＣ_1-4アルキルである、遊離形態または塩形態の請求項１または２記載の化合物。

【請求項4】

化合物が、
７−(アゼチジン−１−イル)−３−メチル−１−(１−メチル−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−メトキシ−２−メチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−シクロプロピルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−エチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン
からなる群から選択される、遊離形態または塩形態の請求項１、２または３記載の化合物。

【請求項5】

遊離形態または塩形態の請求項１〜４いずれか１項記載の化合物を薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と組み合わせてまたは薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と一緒に含む医薬組成物。

【請求項6】

遊離形態または塩形態の請求項１〜４いずれか１項記載の化合物を含む医薬。

【請求項7】

ＰＤＥ２媒介障害の処置のための、請求項５記載の医薬組成物または請求項６記載の医薬。

【請求項8】

該障害が、神経障害；パーキンソン病およびうつ病に付随した認知機能障害；精神遅滞；睡眠障害；精神障害；作為症；衝動制御障害；気分障害；精神運動障害；精神病性障害；薬物依存；摂食障害；小児精神障害；向精神物質の使用に起因する精神的および行動的障害；心血管障害；および疼痛からなる群から選択される、請求項７記載の医薬組成物または医薬。

【請求項9】

該障害が、不安、うつ病、自閉症スペクトラム症、統合失調症、自閉症および／または統合失調症患者における不安および／またはうつ病、および統合失調症または認知症に関連する認知障害から選択される、請求項７記載の医薬組成物または医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、下記式ＩのＰＤＥ２阻害化合物、それらの医薬としての使用およびそれらを含む医薬組成物に関する。これらの化合物は、例えば不安、うつ病、自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）、統合失調症および認知障害のようなＰＤＥ２媒介障害の処置において、有用である。

【背景技術】

【0002】

ＰＤＥ２は、脳（海馬、線条体および前頭前野を包含する）、心臓、血小板、内皮細胞、副腎球状層細胞およびマクロファージを包含する多種多様な組織および細胞型において発現する１０５−ＫＤａのホモ二量体である。ｃＧＭＰは、この酵素に対する好ましい基質およびエフェクター分子であるが、ＰＤＥ２は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）のどちらをも加水分解し、多くの生理的プロセスに関与すると考えられている。特に、ｃＧＭＰシグナル伝達を減少させる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の阻害が抗不安化合物であるベンゾジアゼピンクロルジアゼポキシドの行動的影響を弱めることを示している。また、Ｂａｙ６０−７５５０のような市販のＰＤＥ２ツール阻害剤は、脳内の環状ヌクレオチド濃度を増加させ、正常な齧歯類およびストレス状態にある齧歯類において重要な抗不安効果および抗うつ効果を発揮することが示されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。Ｂａｙ６０−７５５０によるＰＤＥ２の阻害は、また、刺激を受けた１次ニューロン培養物中にて用量反応的にｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ濃度を上昇させること；海馬のスライス標本中にて電気刺激に応答してＬＴＰを亢進すること；新規対象認識動物モデル（novel object recognition animal model）における学習およびラットにおける社会的認識課題（social recognition task）を増強すること；加齢老化（age impaired）ラットにおける新規対象記憶（novel object memory）の獲得期および固定期を改善すること；訓練後に投与された場合の対象位置および認識課題の遂行を改善することが示されている。非特許文献５。Ｂａｙ６０−７５５０は、また、ラットにおいて脳におけるｎＮＯＳ活性を増強することによって認知および記憶機能を改善することが示されている。(非特許文献６）。したがって、ＰＤＥ２は、有効な行動および認知機能において重要な役割を果たす。

【0003】

有効な行動および認知機能に加えて、内皮細胞内でのＰＤＥ２Ａ ｍＲＮＡおよび活性がインビトロでの腫瘍壊死因子−α刺激に応答して非常に誘発されることが観察されている。９−(６−フェニル−２−オキソヘキサ−３−イル)−２−(３,４−ジメトキシベンジル)−プリン−６−オン（ＰＤＰ）によるＰＤＥ２活性の選択的阻害は、内皮細胞のバリア機能を非常に変化させ、これは、ＰＤＥ２が病的状況下の循環器系の体液およびタンパク質完全性の調節において重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。したがって、ＰＤＥ２は、敗血症に関し、またはより局在化した炎症応答において、優れた薬理学的ターゲットであり得る。

【0004】

最近の研究では、ＰＤＥ２阻害は、また、肺拡張を誘発すること、肺血管リモデリングを予防すること、および肺高血圧の右心室肥大特徴を軽減することを示しており、これは、肺高血圧におけるＰＤＥ２阻害の治療可能性を示唆している。非特許文献７。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Xu et al., Eur. J. Pharmacol. (2005) 518:40-46

【非特許文献2】Masood et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2008) 326:369-379

【非特許文献3】Masood et al., JPET (2009) 331:690-699

【非特許文献4】Xu et al., Intl. J. Neuropsychopharmacol. (2013) 16:835-847

【非特許文献5】Gomez et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2013) 23:6522-6527

【非特許文献6】Domek-Lopacinska et al. (2008) Brain Res. 1216:68-77

【非特許文献7】Bubb et al., “Inhibition of Phosphodiesterase 2 Augments cGMP and cAMP Signaling to Ameliorate Pulmonary Hypertension”, Circulation, August 5, 2014, p. 496-507, DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.114.009751

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

有望な前臨床データおよびＰＤＥ２の有望な創薬ターゲットとしての確認試験にもかかわらず、現存するＰＤＥ２化合物の代謝安定性および脳浸透性の低さを一因として、現在臨床的検討下にあることが知られているＰＤＥ２阻害剤はない。かくして、ＰＤＥ２活性を選択的に阻害し、一方で優れた生物物理学的特性を示す、化合物が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、経口利用能および脳アクセスが向上した、強力な選択的ＰＤＥ２阻害特性を有する新規化合物を提供する。したがって、第１の態様において、本発明は、遊離形態または塩形態の、式Ｉ：

【化1】

［式中、
（ｉ）Ｒ₁およびＲ₂は窒素原子と一緒になってヘテロＣ_3-7シクロアルキルを形成し（例えば、アゼチジン−１−イルを形成し）；
（ｉｉ）Ｒ₃は、ＨまたはＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）であり；
（ｉｉｉ）Ｒ₄は、Ｃ_1-4アルキル（例えば、エチル）、Ｃ_3-7シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）、Ｃ_1-4アルコキシ（例えば、メトキシ）およびハロＣ_1-4アルキル（例えば、トリフルオロメチル）から選択される１個以上の基で置換されていてもよい、ヘテロアリールまたはアリール（例えば、フェニル）であり；
（ｉｖ）Ｒ₆は、ＨまたはＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）である］
の化合物を提供する。

【0008】

本発明は、また、遊離形態または塩形態の、以下のとおりの式Ｉの化合物を提供する：
１.１ Ｒ₁およびＲ₂が窒素原子と一緒になってヘテロＣ_3-7シクロアルキル（例えば、アゼチジン−１−イル）を形成する、式Ｉ；
１.２ Ｒ₁およびＲ₂が窒素原子と一緒なってアゼチジン−１−イルを形成する、式１.１；
１.３ Ｒ₃がＨまたはＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）である、式Ｉまたは１.１〜１.２のいずれか；
１.４ Ｒ₃がＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）である、式Ｉまたは１.１〜１.２のいずれか；
１.５ Ｒ₄が、Ｃ_1-4アルキル（例えば、エチル）、Ｃ_3-7シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）、Ｃ_1-4アルコキシ（例えば、メトキシ）およびハロＣ_1-4アルキル（例えば、トリフルオロメチル）から選択される１個以上の基で置換されていてもよい、ヘテロアリールまたはアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；
１.６ Ｒ₄が、Ｃ_1-4アルキル（例えば、エチル）、Ｃ_3-7シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）、Ｃ_1-4アルコキシ（例えば、メトキシ）およびハロＣ_1-4アルキル（例えば、トリフルオロメチル）から選択される１個以上の基によって置換されているアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；
１.７ Ｒ₄が、Ｃ_1-4アルキル（例えば、エチル）で置換されているアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；
１.８ Ｒ₄が、Ｃ_3-7シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）で置換されているアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；
１.９ Ｒ₄が、Ｃ_1-4アルコキシ（例えば、メトキシ）で置換されているアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；
１.１０ Ｒ₄が、ハロＣ_1-4アルキル（例えば、トリフルオロメチル）で置換されているアリール（例えば、フェニル）である、式Ｉまたは１.１〜１.４のいずれか；

【0009】

１.１１ Ｒ₆がＨまたはＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）である、式Ｉまたは１.１〜１.１０のいずれか；
１.１２ Ｒ₆がＣ_1-4アルキル（例えば、メチル）である、式Ｉまたは１.１〜１.１０のいずれか；
１.１３ 化合物が、
７−(アゼチジン−１−イル)−３−メチル−１−(１−メチル−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−メトキシ−２−メチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−シクロプロピルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン；
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−エチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン
からなる群から選択される、上記式のいずれか；
１.１４ 化合物が、例えば、実施例５に記載されるような固定金属親和性粒子試薬ＰＤＥアッセイにおいて、１μＭ未満、より好ましくは２５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下のＩＣ₅₀をもって、ｃＧＭＰのホスホジエステラーゼ媒介（例えば、ＰＤＥ２媒介）加水分解を阻害する、上記式のいずれか。

【0010】

第２の態様において、本発明は、本発明の化合物、すなわち、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物を薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と組み合わせてまたは薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と一緒に含む、医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明は、また、ＰＤＥ２媒介障害、例えば下記のような障害の処置（特に、不安、うつ病、自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）、統合失調症、認知障害の処置）のための本発明の化合物を使用する方法。このリストは、完全に網羅しているわけではなく、下記のような他の疾患および障害を包含し得る。

【0012】

したがって、第３の態様において、本発明は、ＰＤＥ２媒介障害の処置方法であって、該処置を必要とする対象体に、治療上有効量の、本明細書に記載の本発明の化合物、すなわち、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0013】

第３の態様のさらなる実施態様において、本発明は、対象体、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトにおける以下の障害の処置方法であって、該対象体に、治療上有効量の、本明細書に記載の本発明の化合物、すなわち、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する：
神経障害（たとえば、片頭痛；てんかん；アルツハイマー病；パーキンソン病；脳損傷；脳卒中；脳血管疾患（脳動脈硬化症、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血および低酸素性虚血性脳症を包含する）；脊髄性筋萎縮症；側索硬化症；多発性硬化症；
認知障害（健忘症、老年認知症、ＨＩＶ関連認知症、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン関連認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症、薬物関連認知症、せん妄および軽度認知障害を包含する）；パーキンソン病およびうつ病に付随した認知機能障害；
精神遅滞（ダウン症候群および脆弱Ｘ症候群を包含する）；
睡眠障害（過眠、睡眠リズム障害、不眠症、睡眠時随伴症および睡眠遮断を包含する）；
精神障害（例えば、不安（急性ストレス反応、全般不安症、社交不安障害、パニック障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、強迫性障害、特定恐怖症、社会恐怖症、慢性不安症および強迫性障害を包含する）；
作為症（急性幻覚性躁病を包含する）；
衝動制御障害（病的賭博、病的放火、病的窃盗および間欠性爆発性障害を包含する）；
気分障害（双極性Ｉ型障害、双極性ＩＩ型障害、躁病、混合型情動状態、大うつ病、慢性うつ病、季節性うつ病、精神病性うつ病および産後うつ病を包含する）；
精神運動障害（錐体外路性運動障害、例えば、パーキンソニズム、レビー小体病、振戦、薬物誘発性振戦、薬物誘発性遅発性ジスキネジア、Ｌドパ誘発性ジスキネジアおよび下肢静止不能症候群）；
精神病性障害（統合失調症（例えば、連続性または突発性、妄想性、破瓜型、緊張型、未分化型および残遺型の統合失調症を包含する）、統合失調感情障害、統合失調症様および妄想性障害）；
薬物依存（麻薬依存、アルコール依存症、アンフェタミン依存症、コカイン中毒、ニコチン依存症および薬物禁断症候群を包含する）；
摂食障害（食欲不振、過食症（bulimia）、過食性障害、過食症（hyperphagia）および氷食症を包含する）；
小児精神障害（注意欠陥障害、注意欠陥多動障害、素行障害（例えば、チック障害、例えば、一過性、慢性、運動性または音声性チック障害）、自閉症および自閉症スペクトラム症（ＡＳＤ）を包含する）；
向精神物質の使用に起因する精神的および行動的障害；
心血管障害（例えば、肺高血圧および肺動脈性肺高血圧症）；および
疼痛（例えば、骨関節痛（変形性関節症）、反復運動痛（repetitive motion pain）、歯痛、癌性疼痛、筋筋膜痛（筋肉損傷、線維筋痛症）、手術期疼痛（一般外科、婦人科）、慢性疼痛および神経障害性疼痛）。

【0014】

一の実施態様において、該疾患または障害は、不安、うつ病、自閉症スペクトラム症および統合失調症からな群から選択され、例えば自閉症および／または統合失調症患者における不安および／またはうつ病である。別の実施態様において、該疾患または障害は、統合失調症または認知症に関連する認知障害である。

【0015】

第４の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＰＤＥ２媒介障害の処置のための（医薬の製造に使用するための）、本明細書に記載の本発明の化合物、すなわち、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物を提供する。

【0016】

第５の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＰＤＥ２媒介障害の処置に使用するための、明細書に記載の本発明の化合物、すなわち、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物を薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と組み合わせてまたは薬剤的に許容される希釈剤もしくは担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

（本文に記載なし）

【発明を実施するための形態】

【0018】

発明の詳細な説明
他に特記されないかまたは文脈から明かではない場合、本明細書における以下の用語は、以下の意味を有する：
（ａ）本明細書で用いられる「アルキル」は、例えばハロゲン（例えば、クロロまたはフルオロ）、ヒドロキシまたはカルボキシで、モノ置換、ジ置換またはトリ置換されていてもよい、好ましくは炭素原子を１〜６個有し、好ましくは炭素原子を１〜４個有し、直鎖であっても分枝鎖であってもよい、飽和または不飽和の、好ましくは飽和の炭化水素基である。
（ｂ）本明細書で用いられる「アリール」は、例えばアルキル（例えば、メチル）、ハロゲン（例えば、クロロまたはフルオロ）、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）またはヒドロキシで、置換されていてもよい、単環式または二環式芳香族炭化水素、好ましくはフェニルである。
（ｃ）本明細書で用いられる「ヘテロアリール」は、例えばアルキル、ハロゲン、ハロアルキルまたはヒドロキシで、置換されていてもよい、芳香環を構成する原子の１個以上が炭素ではなくて硫黄または窒素である芳香族の基、例えば、ピリジルまたはチアジアゾリルである。

【0019】

本発明の化合物、例えば、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物は、遊離形態または塩形態で、例えば酸付加塩として、存在してよい。他に特記しない限り、本明細書において、「本発明の化合物」のような語は、いずれもの形態、例えば遊離形態もしくは酸付加塩形態、または該化合物が酸性置換基を含有する場合には塩基付加塩の形態の該化合物を包含すると解すべきである。本発明の化合物は、医薬としての使用を目的とし、したがって、薬剤的に許容される塩が好ましい。薬剤的使用に適していない塩は、例えば、本発明の化合物またはそれらの薬剤的に許容される塩の単離または精製に有用であり得、したがって、包含される。
本発明の化合物は、プロドラッグの形態で存在する場合もある。プロドラッグの形態は、体内で本発明の化合物に変換される化合物である。例えば、、本発明の化合物がヒドロキシ置換基またはカルボキシ置換基を含有する場合、これらの置換基は、生理学的に加水分解性でかつ許容されるエステルを形成し得る。本明細書で使用する場合、「生理学的に加水分解性でかつ許容されるエステル」とは、生理学的条件下で加水分解できて、投与されるべき用量で自体が生理学的に許容できるものである酸（ヒドロキシ置換基を有する本発明の化合物の場合）またはアルコール（カルボキシ置換基を有する本発明の化合物の場合）を生じる本発明の化合物を意味する。したがって、本発明の化合物がヒドロキシ基を含有する場合、例えば、化合物−ＯＨである場合、該化合物のアシルエステルプロドラッグ、すなわち、化合物−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｃ_1-4アルキルは、体内で加水分解して、一方では生理学的に加水分解性であるアルコール（化合物−ＯＨ）を形成することができ、他方では酸（例えば、ＨＯＣ(Ｏ)−Ｃ_1-4アルキル）を形成することができる。別法として、本発明の化合物がカルボン酸を含有する場合、例えば、化合物−Ｃ(Ｏ)ＯＨである場合、該化合物の酸エステルプロドラッグである化合物−Ｃ(Ｏ)Ｏ−Ｃ_1-4アルキルは、化合物−Ｃ(Ｏ)ＯＨおよびＨＯ−Ｃ_1-4アルキルを形成することができる。当然のことであるが、かくして、該用語は、慣用の薬剤的プロドラッグ形態を包含する。

【0020】

本明細書における本発明の化合物は、それらのエナンチオマー、ジアステレ異性体およびラセミ体、ならびにそれらの多形体、水和物、溶媒和物および複合体を包含する。本発明の範囲内の化合物には二重結合を含有するものがある。本発明における二重結合の表示は、二重結合のＥ異性体およびＺ異性体のどちらも含むことを意味する。加えて、本発明の範囲内の化合物には１個以上の不斉中心を含有するものがある。本発明は、光学的に純粋な立体異性体のいずれか、およびいずれもの立体異性体の組合せの使用を包含する。

【0021】

本発明の化合物がそれらの安定な同位体および不安定な同位体を包含することも意図される。安定な同位体は、同一の種（すなわち、元素）の豊富な核種と比べて１個のさらなる中性子を含有する非放射活性同位体である。該同位体を含む化合物の活性は保持され、該化合物は非同位体アナログの薬物動態を測定するための有用性を有すると考えられる。例えば、本発明の化合物の特定位置の水素原子を重水素（非放射性である安定な同位体）と置換できる。公知の安定な同位体の例としては、重水素、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏが挙げられるが、これらに限定されない。別法として、同一の種（すなわち、元素）の豊富な核種と比べてさらなるニュートロンを含有する放射活性同位体である不安定な同位体、例えば¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹¹Ｃ、¹⁸Ｆは、Ｉ、ＣおよびＦの対応する豊富な核種と置換できる。本発明の化合物の有用な同位体の別の例は¹¹Ｃ同位体である。これらの放射性同位体は、本発明の化合物の放射性イメージングおよび／または薬物動態学的研究に有用である。式Ｉの同位体標識化合物は、一般に、非放射性標識試薬の代わりに放射性標識試薬を用いることによって調製され得る。

【0022】

「本発明の化合物」または「本発明のＰＤＥ２阻害剤」という語句は、本明細書に記載された化合物、例えば、上記の、遊離形態または塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物のいずれかまたは全てを包含する。

【0023】

「処置」および「処置すること」という語は、該疾患の症状の処置または寛解、および該疾患の原因の処置を包含すると解されるべきである。一の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の疾患または障害の処置のための方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の疾患または障害の予防のための方法を提供する。

【0024】

処置のための方法について、「有効量」という語は、特定の疾患または障害を処置するための治療上有効量を包含するよう意図されている。

【0025】

「肺高血圧」という用語は、肺動脈性肺高血圧症を包含するよう意図されている。

【0026】

「対象体」という用語は、ヒトまたは非ヒト（すなわち、動物）を包含する。特定の実施態様において、本発明は、ヒトおよび非ヒトのどちらも包含する。別の実施態様において、本発明は、非ヒトを包含する。他の実施態様において、該用語は、ヒトを包含する。

【0027】

本明細書で使用される場合、「を含む」という用語は、オープンエンドであるよう意図されており、未記載のさらなる要素または方法の工程を排除しない。

【0028】

「認知障害（cognitive disorders）」という用語は、認知不全（cognitive deficiency）症状（すなわち、同年代の集団（the same general age population）内で、一個体の記憶、知力、学習、論理、注意力または実行機能（作業記憶）のような１つ以上の認知的局面における機能が他の個体と比べて亜正常または最適以下）を含む障害を表す。したがって、認知障害としては、健忘症、老年認知症、ＨＩＶ関連認知症、アルツハイマー関連認知症、ハンチントン関連認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症、薬物関連認知症、せん妄および軽度認知障害が挙げられるが、これらに限定されない。認知障害は、また、精神病（統合失調症）、気分障害、双極性障害、脳卒中、前頭側頭葉型認知症、進行性核上性麻痺、脳外傷および薬物乱用、アスペルガー症候群および加齢による記憶障害と主に関連があるが独占的に関連があるわけではない障害でもあり得る。

【0029】

本発明の化合物、例えば、本明細書に記載の、遊離形態または薬剤的に許容される塩形態の、式Ｉまたは式１.１〜１.１４のいずれかの化合物は、単独の治療剤として使用することができるが、他の活性薬剤と組み合わせてまたは他の活性薬剤との共投与のために使用することもできる。

【0030】

本発明を実施する際に用いられる投与量は、もちろん、例えば、処置されるべき特定の疾患または状態、使用される特定の本発明の化合物、投与方法および所望の治療に依存して変化する。本発明の化合物は、経口、非経口、経皮または吸入を包含する好適な経路によって投与できるが、経口投与されるのが好ましい。一般に、満足できる結果は、例えば上記した疾患の処置については、約０.０１〜２.０ｍｇ／ｋｇ程度の投与量の経口投与により得られるよう意図されている。大型哺乳動物、例えばヒトにおいて、経口投与について指摘された日用量は、したがって、約０.７５〜１５０ｍｇの範囲で、好都合には１日１回、もしくは１日２〜４回の分割用量で投与されるか、または持続放出剤形で投与される。かくして、例えば、経口投与要の単位用量は、本発明の化合物約０.２〜７５または１５０ｍｇ、例えば、約０.２または２.０〜５０、７５または１００ｍｇを薬剤的に許容される希釈剤または担体と一緒に含み得る。

【0031】

本発明の化合物を含む医薬組成物は、慣用の希釈剤または賦形剤、およびガレヌス分野（galenic art）において公知の技術を用いて調製され得る。該薬剤的に許容される担体は、慣用の医薬的担体または賦形剤を含み得る。好適な医薬担体としては、不活性希釈剤または充填剤、水および種々の有機溶媒（例えば水和物および溶媒和物）が挙げられる。該医薬組成物は、必要に応じて、矯味矯臭剤、結合剤、賦形剤などのようなさらなる成分を含有することができる。かくして、経口投与について、クエン酸のような種々の賦形剤を含有する錠剤は、デンプン、アルギン酸およびある種の複合ケイ酸塩のような種々の崩壊剤、ならびにシュークロース、ゼラチンおよびアカシアのような結合剤と一緒に用いることができる。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤は、しばしば、打錠目的に有用である。同類のタイプの固体組成物は、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤内で用いることもできる。したがって、材料の非限定的な例としては、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁剤またはエリキシル剤が経口投与のために望ましい場合、その中の該活性化合物は、希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンまたはそれらの組合せと一緒に、種々の甘味剤または矯味矯臭剤、着色物質または色素、および、所望により、乳化剤または懸濁化剤と合わせることができる。該医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、徐放性製剤、液剤もしくは懸濁剤として経口投与に適した剤形、滅菌溶液、懸濁液もしくはエマルションとして非経口注射に適した剤形、軟膏剤もしくはクリーム剤として局所投与に適した剤形、または坐剤として直腸投与に適した剤形であり得る。

【0032】

本明細書における本発明の化合物およびそれらの薬剤的に許容される塩は、本明細書に記載された方法および例示された方法を用いて、また、それに類似の方法および化学の分野において公知の方法によって製造され得る。このような方法としては下記のものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法の出発物質は、市販されていない場合には、公知化合物の合成と同様または類似の技術を用いて化学分野から選択される手順によって製造され得る。本明細書で引用される全ての文献は出典明示によりその全体として本明細書の一部を構成する。

【実施例】

【0033】

実施例１
７−(アゼチジン−１−イル)−３−メチル−１−(１−メチル−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン

【化2】

（ａ）５−クロロ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール
ＴＨＦ中のビス(トリメチルシリル)アミドリチウム（１.０Ｍ、６５ｍＬ、６５ｍｍｏｌ）を２５℃で１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（５.５０ｇ、４３.３ｍｍｏｌ）およびヘキサクロロエタン（１０.５４ｇ、４４.５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１２０ｍＬ）中溶液に滴下する。該反応混合物を２５℃で６０分間撹拌し、次に、水（１ｍＬ）でクエンチする。該混合物を蒸発乾固させる。残留物を水（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ₃で２回（２×３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で連続的に洗浄し、次に、真空乾燥させて、生成物６.５０ｇ（収率９３％）を得る。MS (ESI) m/z 162.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.15 (s, 1H), 3.92 (s, 3H)。

【0034】

（ｂ）５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン・塩酸塩
５−クロロ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（６.５０ｇ、４０.２ｍｍｏｌ）の１２Ｎ ＨＣｌ（１５ｍＬ）およびエタノール（１５ｍＬ）中懸濁液に塩化スズ(ＩＩ)（３５.５ｇ、１６０.９ｍｍｏｌ）を添加する。反応が完了するまで該反応混合物を９０℃で撹拌する。該反応混合物を蒸発乾固させる。残留物を１２Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）で処理し、次に、５℃で２時間冷却する。濾過後、濾過ケーキを６Ｎ ＨＣｌ（２×２５ｍＬ）で洗浄し、次に、真空乾燥させて、生成物６.０８ｇ（収率：９０％）を得る。MS (ESI) 132.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 7.66 (s, 1H), 3.89 (s, 3H)。

【0035】

（ｃ）５−クロロ−４−ヒドラジニル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール・塩酸塩
０℃で、５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン・塩酸塩（６.０８ｇ、３６.２ｍｍｏｌ）のＨＣｌ（１２Ｎ、３５ｍＬ）中撹拌溶液に水性ＮａＮＯ₂（５.５０ｇ、８０.０ｍｍｏｌ）を添加する。該反応混合物を０℃で４５分間撹拌し、次に、塩化スズ(ＩＩ)（２２.８ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を添加する。添加完了後、該反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、次に、室温で一夜撹拌する。得られた混合物を氷浴にて２時間冷却し、次に、濾過する。濾過ケーキをＨＣｌ（１２Ｎ、２０ｍＬ）で洗浄し、次に、真空乾燥させて、粗生成物７.７７ｇ（収率：９８％）を得、さらなる精製を行わずに次反応で使用する。MS (ESI) m/z 147.0 [M+H]⁺。

【0036】

（ｄ）５−ブロモ−４−クロロ−６−(１−エトキシビニル)ピリミジン
５−ブロモ−４,６−ジクロロピリミジン（５.００ｇ、２１.９ｍｍｏｌ）およびトリブチル(１−エトキシビニル)スタンナン（７.９２ｇ、２１.９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）中懸濁液をアルゴンで脱気し、次に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)（１.２７ｍｇ、１.１０ｍｍｏｌ）を添加する。該懸濁液を再度脱気し、次に、アルゴン下にて１１０℃で８時間加熱する。溶媒を減圧除去した後、残留物を、３０分間にわたってヘキサン中０〜４０％酢酸エチル勾配液で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物２.７２ｇ（収率：４７％）。MS (ESI) m/z 263.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.85 (s, 1H), 4.71 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 3.98 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.67 (s, 0H), 1.42 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。

【0037】

（ｅ）５−ブロモ−４−クロロ−６−(１−(２−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)ヒドラゾノ)エチル)ピリミジン
５−ブロモ−４−クロロ−６−(１−エトキシビニル)ピリミジン（１.６０ｇ、６.０７ｍｍｏｌ）および５−クロロ−４−ヒドラジニル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール・塩酸塩（３.１１ｇ、１２.１ｍｍｏｌ）の酢酸（３２ｍＬ）中懸濁液を６０℃で６時間撹拌する。溶媒を減圧除去した後、残留物を飽和ＮａＨＣＯ₃（４０ｍＬ）で処理し、次に、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をブライン（７０ｍＬ）で洗浄し、次に、蒸発乾固させる。残留物を真空乾燥させて、粗生成物１.０ｇ（収率：４５％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用する。MS (ESI) m/z 362.9 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.79 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.32 (s, 3H)。

【0038】

（ｆ）７−クロロ−１−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン
密閉管中の５−ブロモ−４−クロロ−６−(１−(２−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)ヒドラゾノ)エチル)ピリミジン（３３４ｍｇ、０.９２ｍｍｏｌ）、１,１０−フェナントロリン（４９７ｍｇ、２.７６ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（１２７ｍｇ、０.９２ｍｍｏｌ）のトルエン（４ｍＬ）中混合物を１００℃で１.５時間加熱する。室温に冷却した後、該反応混合物をトルエン（３ｍＬ）で希釈し、次に、濾過する。固体をトルエンで２回（２×３ｍＬ）洗浄する。合わせた濾液を飽和ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏで３回（３×４ｍＬ）洗浄し、次に、蒸発乾固させる。得られた残留物をさらに真空乾燥させて、粗生成物１４７ｍｇ（収率：５７％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用する。MS (ESI) m/z 283.0 [M+H]⁺。

【0039】

（ｇ）７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン
密閉管中の７−クロロ−１−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン（１４７ｍｇ、０.５２ｍｍｏｌ）、アゼチジン・塩酸塩（６４ｍｇ、０.６８ｍｍｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（１０５ｍｇ、１.０４ｍｍｏｌ）のトルエン（１.５ｍＬ）中混合物を室温で、反応が完了するまで撹拌する。該混合物を２Ｎ ＮａＯＨ（１８ｍＬ）中に注ぎ、次に、ＣＨ₂Ｃｌ₂で３回（３×２５ｍＬ）抽出する。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、次に、蒸発乾固させる。得られた残留物をさらに真空乾燥させて粗生成物１８１ｇを得、さらなる精製を行わずに次工程で使用する。MS (ESI) 304.1 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.51 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.87 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 2.61 (s, 3H), 2.33-2.25 (m, 2H)。

【0040】

（ｈ）７−(アゼチジン−１−イル)−３−メチル−１−(１−メチル−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン（５８ｍｇ、０.１９ｍｍｏｌ）、４−(トリフルオロメチル)−フェニルボロン酸（５１ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ）およびリン酸三カリウム（９２ｍｇ、０.４３ｍｍｏｌ）のエタノール（０.７０ｍＬ）および水（０.０８０ｍＬ）中懸濁液をアルゴン下にて７０℃で１０分間加熱し、次に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)（１９ｍｇ、０.０１７ｍｍｏｌ）を添加する。該懸濁液を再度脱気し、次に、マイクロ波にて１３０℃で２時間加熱する。さらなるテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)（９ｍｇ、０.００７９ｍｍｏｌ）を添加する。該混合物をマイクロ波にて１４０℃で７時間加熱する。溶媒を除去した後、残留物を、１６分間にわたって０.１％ギ酸含有水中０〜３３％アセトニトリル勾配液を用いて半分取ＨＰＬＣで精製して、最終生成物１２ｍｇをオフホワイト色の固体として得る（ＨＰＬＣ純度：９８％；収率：１５％）。MS (ESI) m/z 414.2 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.43 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.81 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 2.59 (s, 3H), 2.32-2.21 (m, 2H)。

【0041】

実施例２
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−メトキシ−２−メチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン

【化3】

最終工程で４−(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸およびＫ₃ＰＯ₄の代わりにそれぞれ４−メトキシ−２−メチルフェニルボロン酸およびＫ₂ＣＯ₃を添加する、実施例１の合成に記載の手順に従う類似の方法で標記化合物を製造する。最終生成物をオフホワイト色の固体として得る（ＨＰＬＣ純度：９９％；収率：３２％）。MS (ESI) m/z 390.2 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.37 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 8.5, 2.6 Hz, 1H), 4.04-3.82 (m, 4H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.35-2.26 (m, 2H), 2.08 (s, 3H)。

【0042】

実施例３
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−シクロプロピルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン

【化4】

最終工程で４−(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸およびＫ₃ＰＯ₄の代わりにそれぞれシクロプロピルフェニル−ボロン酸およびＮａ₂ＣＯ₃を添加する、実施例１の合成に記載の手順に従う類似の方法で標記化合物を製造する。MS (ESI) m/z 386.2 [M+H]⁺。

【0043】

実施例４
７−(アゼチジン−１−イル)−１−(５−(４−エチルフェニル)−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル)−３−メチル−１Ｈ−ピラゾロ[４,３−ｄ]ピリミジン

【化5】

最終工程で４−(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸およびＫ₃ＰＯ₄の代わりにそれぞれ４−エチルフェニル−ボロン酸およびＣｓ₂ＣＯ₃を添加する、実施例１の合成に記載の手順に従う類似の方法で標記化合物を製造する。MS (ESI) m/z 374.2 [M+H]⁺。

【0044】

実施例５
インビトロでのＰＤＥ２阻害の測定
ｒ−ｈＰＤＥ２Ａ（Accession No. NM_002599, Homo sapiens phosphodiesterase 2A, cGMP-stimulated, transcript variant 1）： 該遺伝子の組換えｃＤＮＡコピーを有する哺乳動物発現クローニングベクターをOrigeneから購入する。ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質転換によりタンパク質を発現させる。形質転換から４８時間後に細胞を収集し、ＴＢＳバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄し、次に、冷ホモジナイゼーションバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１Ｘプロテアーゼインヒビターカクテル）中にて超音波処理によって溶解する。該ホモジネートを４℃にて１５,０００ｇで３０分間遠心分離して、可溶性細胞質画分を得る。標準としてウシ血清アルブミンを用い、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Pierce）を用いて、該細胞質ゾルのタンパク質濃度を測定する。

【0045】

アッセイ： 基質としてＦＬ−ｃＡＭＰを用いて、ＰＤＥ２Ａをアッセイする。まず、酵素滴定を行って、ＰＤＥの作業濃度を測定する。阻害剤の不在下で１００ΔｍＰの活性をもたらす酵素の濃度は、ＰＤＥの適切な作業濃度であると思われる。

【0046】

滴定曲線に従って標準反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０.１％ＢＳＡ、０.０５％ＮａＮ₃）でＰＤＥ酵素を希釈する。ＰＤＥ２アッセイについては、該反応バッファーに１μＭ ｃＧＭＰを加えて、酵素を十分に活性化する。希釈した酵素溶液９９μｌを平底９６ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに添加し、次に、１００％ＤＭＳＯに溶解した試験化合物約１μｌを添加する。該混合物を酵素と混合し、室温で１０分間、プレインキュベートする。

【0047】

基質（最終４５ｎＭ）を添加することによりＦＬ−ｃＮＭＰ転換反応を開始する。３８４ウェルマイクロタイタープレート中で酵素と阻害剤との混合物（１６μl）および基質溶液（０.２２５μＭ、４μｌ）を合わせる。該反応を暗所にて室温で１５分間インキュベートする。３８４ウェルプレートの各ウェルに結合試薬（消泡剤の１：１８００希釈液を加えた結合バッファーによるＩＭＡＰビーズの１：４００希釈液）６０μｌを添加することにより、該反応を停止させる。該プレートを室温で１時間インキュベートして、ＩＭＡＰ結合を完了させ、次に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチモードマイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Shelton, CT）内に置いて、蛍光偏光（Δｍｐ）を測定する。

【0048】

Δｍｐの低下として測定されるｃＡＭＰ濃度の低下は、ＰＤＥ活性の阻害を意味している。０.０００３７ｎＭ〜８０,０００ｎＭの範囲の８〜１６種類の濃度の化合物の存在下にて酵素活性を測定し、次に、薬物濃度対ΔｍＰをプロットすることによってＩＣ₅₀値を測定する。試験ウェル値を同一プレートで行われたコントロール反応に対して正規化する（コントロールの％に変換した値）。４パラメーター・ワンサイト用量反応モデル（ＸＬＦｉｔ；IDBS, Cambridge, MA）に適合した非線形回帰ソフトウェアを使用して、ＩＣ₅₀値を推定する。曲線の底をコントロールの０％に定める。

【0049】

品質管理： 阻害剤のＩＣ₅₀を測定するために、１００〜２００ミリ偏光単位の最適なシグナル範囲を提供する酵素濃度を選ぶ。各サンプルウェルの総蛍光強度を測定して、平均および標準偏差を算出する。いずれかのサンプルウェルの総蛍光強度が平均値±３ＳＤの範囲内にない場合には、その特定のウェルのｍｐ値を廃棄する。

【0050】

上記のＩＭＡＰ手順またはそれと同様の手順を使用して、本発明者らは、私有のＰＤＥに焦点を合わせた化合物ライブラリーをスクリーニングして、ナノモルＰＤＥ２阻害活性を有する新規化合物を同定した。例示された本発明の化合物（例えば、実施例１〜４の化合物）が試験され、例えば以下のとおり、ナノモル濃度で活性であることが示されている：実施例１：ＩＣ₅₀ ２３.１ｎＭ；実施例２：ＩＣ₅₀ ９２ｎＭ；実施例３：ＩＣ₅₀ ９.５ｎＭ；実施例４：ＩＣ₅₀ １８.５ｎＭ。これらの化合物は、ＰＤＥ２に対して、より選択的である；実施例４の化合物が試験され、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１ＡよりもＰＤＥ２に対して２０倍以上選択的であることが示されている。

【0051】

実施例６
マウスにおける薬物動態試験
マウスに試験されるべき化合物を単回経口投与し（１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）、Zhao et al., J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. (2005) 819(1):73-80およびAppels, N.M., et al., Rapid Commun. Mass Spec. 2005. 19(15):p.2187-92に記載の方法と類似の方法を用い、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳを用いて血漿および脳の利用能を測定する（０.２５〜４時間）。該実験は、図１に示されるように実施例１の化合物が優れた脳アクセスを有することを示している。

【0052】

実施例７
物体認識課題（object recognition task）におけるウィスターラットの記憶成績に対するＰＤＥ２阻害剤による処置の効果
物体認識課題である認知の動物モデルにおいて実施例１の化合物の記憶増強効果を試験する。Ennaceur, A., Delacour, J., 1988. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav. Brain Res. 31, 47-59を参照。ラットは、１時間後に試験した時に、前の試行でどの物体を探索したかを覚えている。しかしながら、２４時間の試験間隔を用いた場合、ラットは、最初の試行でどの物体が提示されたかを覚えていられない。実施例１の化合物は、最初の試行の２時間前に投与された場合、この時間誘発性物体記憶欠損を弱めるかどうかを試験する。２〜３か月齢の雄性ウィスターラットに化合物を投与する。

【0053】

０、０.３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇの用量で、学習の２時間前に実施例１の化合物を経口注入する（２ｍｌ／ｋｇ）。これらの試験用量のどれも探索行動に対して影響を及ぼさない。本研究は、実施例１の化合物が１.０ｍｇ／ｋｇの用量で時間依存性忘却を完全に予防できることを示している。０.３および３.０ｍｇ／ｋｇで中間記憶改善が見られる。

【0054】

実施例８
海馬細胞および脳におけるｃＧＭＰシグナル伝達に対する新規ＰＤＥ２阻害剤の作用
本発明者らは、ＨＴ−２２細胞（親ＨＴ−４細胞からサブクローニングされた不死化マウス海馬ニューロン前駆細胞）が海馬依存性情動変化に関係がある細胞および分子プロセスの理解に有用なモデルであることを提案する。本発明者らは、Ａｉｍ １が、細胞ベースのアッセイにおける機能的評価のための１０〜２０種類の新規ＰＤＥ２阻害剤を生じると予想する。細胞ベースのＨＴ−２２細胞アッセイにおいてｃＧＭＰ蓄積の有意な増加を誘発する化合物だけが行動評価に進む。細胞ベースのアッセイデータは、ＣＮＳ適応症に使用する可能性のあるＰＤＥ２阻害剤の最小必要要件であり、行動試験のための用量選択の指針を提供する。

【図1】