特許 6611610 レーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6611610

(24)【登録日】2019年11月8日

(45)【発行日】2019年11月27日

(54)【発明の名称】レーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/04 20060101AFI20191118BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20191118BHJP

   G01N 27/62 20060101ALI20191118BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20191118BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20191118BHJP

   G02B 21/26 20060101ALI20191118BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/04 X

   G01N1/28 G

   G01N1/28 J

   G01N27/62 F

   G01N33/48 S

   G02B21/00

   G02B21/26

【請求項の数】13

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-541497(P2015-541497)

(86)(22)【出願日】2014年9月11日

(86)【国際出願番号】JP2014074064

(87)【国際公開番号】WO2015053039

(87)【国際公開日】20150416

【審査請求日】2017年8月24日

【審判番号】不服2018-17280(P2018-17280/J1)

【審判請求日】2018年12月26日

(31)【優先権主張番号】特願2013-210366(P2013-210366)

(32)【優先日】2013年10月7日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３〜２５年度ＪＳＴ研究成果展開事業（先端計測分析技術・機器開発プログラム）、産業技術力強化法１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】澤田 誠

【合議体】

【審判長】 三崎 仁

【審判官】 福島 浩司

【審判官】 渡戸 正義

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０６６７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／２６９６３７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／２７８４００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第１９９８／０３６２６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／１０７９４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｂ．Ｊ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＭＡＬＤＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｊ．Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，米国，２００２年 ９月２５日，Ｖｏｌ．１３，Ｐ．１２９２−１２９７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC G01N 1/04,1/28,G01N27/62,H01J49/04

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料を載置することができ、該試料を水平方向に移動することができる試料移動手段、
熱可塑性フィルムを装着した支持体、スライドガラス又は基材を取り付けることができ、前記支持体、スライドガラス又は基材に装着した熱可塑性フィルムを水平方向及び垂直方向に移動することができる熱可塑性フィルム移動手段、
試料にダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱可塑性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部、
ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段、及び
前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱可塑性フィルムの位置座標に基づき、前記試料移動手段及び前記熱可塑性フィルム移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部、
を含み、
前記熱可塑性フィルムには少なくとも２以上の採取試料を接着することができ、
前記採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標は、接着する任意の採取試料と該採取試料に隣接する他の採取試料との中心間距離が採取する前の試料の間隔より大きく、且つ接着する任意の採取試料と該採取試料に隣接する他の採取試料との中心間距離を任意の間隔に設定したものである、
ことを特徴とするレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項2】

前記ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標を任意に設定するためのポインティングデバイスを含むことを特徴とする請求項１に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項3】

前記任意の採取試料と該採取試料に隣接する採取試料との中心間距離が、（イオン化レーザー光の直径＋採取試料の直径）／２より大きいことを特徴とする請求項２に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項4】

前記試料移動手段が垂直方向にも移動することができることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項5】

前記スライドガラス及び基材が、導電処理されていることを特徴とする請求項３に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項6】

請求項１〜５の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。

【請求項7】

前記分析装置が、質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、マイクロチップ分析装置から選ばれる１種であることを特徴とする請求項６に記載の分析装置。

【請求項8】

請求項５に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む質量分析装置。

【請求項9】

前記分析装置が、試料の画像と分析装置による分析結果を併せて表示することができる表示部を含むことを特徴とする請求項６〜８の何れか一項に記載の分析装置。

【請求項10】

請求項１〜５の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を用いた、熱可塑性フィルムに試料が接着したマイクロチップの製造方法。

【請求項11】

ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標を設定し、採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を設定し、前記試料の位置座標及び前記熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する工程、
前記関連付けて記憶された試料の位置座標及び熱可塑性フィルムの位置座標に基づき、試料及び熱可塑性フィルムをダイセクションレーザー光が照射される位置に移動する工程、
ダイセクションレーザー光を照射することで、採取した試料を熱可塑性フィルムに接着する工程、
を含み、
前記試料の位置座標及び前記熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する工程では、少なくとも２以上の前記試料の位置座標及び前記熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶し、
前記採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標は、接着する任意の採取試料と該採取試料に隣接する他の採取試料との中心間距離が採取する前の試料の間隔より大きく、且つ接着する任意の採取試料と該採取試料に隣接する他の採取試料との中心間距離を任意の間隔に設定したものである、
ことを特徴とするレーザーマイクロダイセクションによる試料の採取方法。

【請求項12】

前記ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標が、ポインティングデバイスにより任意に設定されたものであることを特徴とする請求項１１に記載のレーザーマイクロダイセクションによる試料の採取方法。

【請求項13】

請求項１１又は１２に記載のレーザーマイクロダイセクションによる試料の採取方法により採取した、熱可塑性フィルムに接着した採取試料に、質量分析装置のイオン化レーザー光を照射する工程、
を含むことを特徴とする質量分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法であって、特に、レーザー光を照射する際の試料の位置座標と採取試料が熱可塑性フィルムに接着する位置座標を関連付けて記憶しておくことで、分析装置の空間分解能を向上することができ、更に、試料の画像と分析装置による分析結果を併せて表示することができる分析装置に関するものである。

【背景技術】

【0002】

近年、生命科学の研究では、ある分子が生体試料のどの場所に存在しているのか、又、生体試料中の興味のある場所にどのような分子が存在しているのかを精度よく分析することが求められている。

【0003】

また、生体試料を分析する際には、試料を取り出して単に分析するのではなく、顕微鏡により観察している試料にどの様な分子が含まれているのかを併せて表示する質量分析イメージングが要望されている。当該要望を実現する装置としては、顕微鏡で生体試料を観察し、そして、生体試料を質量分析することができる質量顕微鏡が市販されている。

【0004】

通常の質量分析方法は、試料にレーザー光を照射し、照射された部分の試料をイオン化して質量分析している（以下、質量分析装置の試料をイオン化するためのレーザー光を「イオン化レーザー光」と記載することがある。）。したがって、試料を連続的に分析するためには、イオン化レーザー光を試料に照射した後、当該試料をイオン化レーザー光の直径に相当する長さ移動し再度イオン化レーザー光を照射することで、試料を連続的に分析することが可能である。しかしながら、質量分析においては、イオン化レーザー光を照射した部分のみがイオン化するのではなく、イオン化レーザー光の直径に相当する長さを移動した後にイオン化レーザー光を照射しても、移動前の試料も同時にイオン化してしまうという問題がある。そのため、イオン化レーザー光を照射する箇所を連続的に移動することは難しく、使用するイオン化レーザー光の直径にもよるものの空間分解能は約２００μｍ程度であることから、試料を連続的に精密分析することが難しいという問題がある（非特許文献１参照）。また、イオン化レーザー光を照射した部分の生体試料を完全にイオン化することはできず、分析結果の定量性にも問題がある。更に、従来の質量顕微鏡は、単に顕微鏡と質量分析装置を組み合わせたもので、装置が大型化するという問題もある。

【0005】

上記問題点を解決するため、大気圧イオン化法を用いた質量顕微鏡が知られている（特許文献１参照）。大気圧イオン化法を用いた質量顕微鏡では、イオン化レーザー光を直径１μｍ程度まで絞ることで空間分解能を約５μｍ程度にすることができ、また、真空にする必要が無いことから、装置が小型化され手軽に試料を分析することができるというメリットがある。しかしながら、大気圧イオン化法を用いた質量顕微鏡は、試料をイオン化する際に真空にしていないことから、分析できる試料は大気圧下でイオン化レーザー光を照射してイオン化できるものに限られ、分析能の限界は分子量が２０００程度で、多様な試料の分析をすることができないという問題がある。また、イオン化レーザー光の直径を細径化するためにはイオン化レーザー光源を高性能化する必要があるため、コストが大幅に増加するという問題がある。

【0006】

更に、大気圧イオン化法を用いての分析は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を用いた飛行時間質量分析計（以下、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と記載することがある。）に限られており、液体クロマトグラフ質量分析（以下、「ＬＣ−ＭＳ」と記載することがある。）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（以下、「ＥＳＩ−ＭＳ」と記載することがある。）、等の他の質量分析方法には対応していないという問題がある。

【0007】

上記のイオン化レーザー光を直接試料に照射して質量分析する方法以外にも、例えば、試料から所望の位置の試料をレーザーマイクロダイセクションで採取し、ＬＣ−ＭＳ分析を行う方法も知られている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２に記載されている方法は、採取したサンプルに含まれているタンパク質を検出しているのみで、検出解析したデータを質量顕微鏡のように生体試料に重ね合わせて表示することはできないという問題がある。

【0008】

上記特許文献２に記載されているレーザーマイクロダイセクション装置による試料の採取方法以外に、レーザーマイクロダイセクション装置による試料の採取方法として、コールドレーザーアブレーションまたはマルチフォトン吸収によって、サブミリメータ領域で試料から所定の構造体を切り離す方法（特許文献３参照）、熱可塑性フィルムを試料の上に置き、レーザー光（以下、試料を切り出すためのレーザー光を「ダイセクションレーザー光」と記載することがある。）を照射することで試料を熱可塑性フィルムに接着させる方法（特許文献４、５参照）等が知られている。

【0009】

しかしながら、特許文献４、５に記載されている技術は、単に、組織標本から細胞やＤＮＡを取り出すための技術に過ぎず、そもそも、熱可塑性フィルムに接着した生体試料にイオン化レーザー光を照射して質量分析を行うと、通常は、熱可塑性フィルムもイオン化レーザー光によりイオン化されてしまい、質量分析のノイズになると考えられていたため、熱可塑性フィルムに試料を接着したまま、質量分析を行うことは知られていなかった。

【0010】

更に、上記特許文献４、５に記載されているレーザーマイクロダイセクション装置は、生体試料から単に所望部分の試料を採取するものであり、特許文献４、５に記載されているレーザーマイクロダイセクション装置を通常の質量分析装置で分析するためのサンプル採取装置として使用したとしても、空間分解能を向上することは難しいという問題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開２００６−１７０６８９号公報

【特許文献2】特開２０１３−２７３８７号公報

【特許文献3】特開２００９−１０３７０１号公報

【特許文献4】特許３７８６７１１号公報

【特許文献5】特許４１５６８５１号公報

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】澤田誠、“サブセルラー分析対応高解像度質量分析イメージング試料調製技術の開発”、〔ｏｎｌｉｎｅ〕、〔平成２６年７月１７日検索〕、インターネット＜ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｅｎｔａｎ／ｈｙｏｕｋａ／ｈ２４ｃｙｕｕｋａｎ／４−０８ｓａｗａｄａ＿ｍ．ｈｔｍｌ＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）レーザーマイクロダイセクション装置のダイセクションレーザー光を試料に照射して切り出し、熱可塑性フィルムに接着した試料（以下、ダイセクションレーザー光で切り出して熱可塑性フィルムに接着した試料を「採取試料」と記載することがある。）に直接イオン化レーザー光を照射してイオン化することで質量分析を行っても、熱可塑性フィルム由来のノイズがなく採取試料を定量性よく質量分析することができること、（２）ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶手段に記憶し、前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱可塑性フィルムの位置座標に基づき、試料移動手段と熱可塑性フィルム移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部を設けることで、ダイセクションレーザー光を照射して採取する試料の間隔より、熱可塑性フィルムに接着する採取試料の間隔を大きくすることがでること、（３）熱可塑性フィルムに接着する採取試料の間隔を、イオン化レーザー光を照射した際に隣の試料がイオン化レーザー光の影響を受けない距離とすることで、レーザーマイクロダイセクション装置で連続的に採取した微小試料を、従来の質量分析装置のイオン化レーザー光源を変更することなく隣の試料の影響を排除して分析できることから、従来の質量分析装置の空間分解能を向上することができること、（４）ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶手段に記憶しておき、そして、熱可塑性フィルムに接着した試料の位置座標と当該試料の分析装置による分析結果とをリンクすることで質量イメージングを簡単に行えること、（５）熱可塑性フィルムに接着する採取試料の間隔を任意に設定することができるので、例えば、採取試料に液体を塗布して試料を溶液としてコンタミすることなく回収できる範囲に設定することで、ＬＣ−ＭＳ等の様々な分析装置の試料調製に使用することができること、を新たに見出し、本発明を完成した。

【0014】

すなわち、本発明の目的は、レーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、以下に示す、レーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法に関する。

【0016】

（１）試料を載置することができ、該試料を水平方向に移動することができる試料移動手段、
熱可塑性フィルムを載置することができ、該熱可塑性フィルムを水平方向及び垂直方向に移動することができる熱可塑性フィルム移動手段、
試料にダイセクションレーザー光を照射し、該ダイセクションレーザー光を照射した箇所の試料を切り出し、熱可塑性フィルムに採取試料として接着するためのレーザー照射部、
ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段、及び
前記記憶手段に記憶された試料の位置座標及び熱可塑性フィルムの位置座標に基づき、前記試料移動手段及び前記熱可塑性フィルム移動手段を駆動制御する移動手段駆動制御部、
を含むことを特徴とするレーザーマイクロダイセクション装置。
（２）前記熱可塑性フィルムには少なくとも２以上の採取試料を接着することができ、接着した任意の採取試料と該採取試料に隣接する他の採取試料との中心間距離が、ダイセクションレーザー光を照射した際の試料の中心間距離より大きいことを特徴とする上記（１）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（３）前記任意の採取試料と該採取試料に隣接する採取試料との中心間距離が、（イオン化レーザー光の直径＋採取試料の直径）／２より大きいことを特徴とする上記（２）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（４）前記試料移動手段が垂直方向にも移動することができることを特徴とする上記（１）〜（３）の何れか一に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（５）上記（１）〜（４）の何れか一に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。
（６）前記分析装置が、質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、マイクロチップ分析装置から選ばれる１種であることを特徴とする上記（５）に記載の分析装置。
（７）前記分析装置が、試料の画像と分析装置による分析結果を併せて表示することができる表示部を含むことを特徴とする上記（５）又は（６）に記載の分析装置。
（８）上記（１）〜（４）の何れか一に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を用いた、熱可塑性フィルムに試料が接着したマイクロチップの製造方法。

【発明の効果】

【0017】

本発明のレーザーマイクロダイセクション装置は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料が接着する箇所の熱可塑性フィルムの位置座標を関連付けて記憶する記憶手段を含み、熱可塑性フィルムに接着する採取試料の間隔を、ダイセクションレーザー光を照射して採取する試料の間隔より任意の大きな間隔で設定することができる。
そのため、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を、例えば、従来の質量分析装置に組み合わせることで、空間分解能を向上することができる。更に、試料の位置座標及び熱可塑性フィルムの位置座標を記憶していることから、分析した試料の位置座標と分析結果とを関連付けることで、簡単に２次元及び３次元の質量イメージングを行うことができるので、従来の質量分析装置を用いて安価に質量イメージングを行うことができる。
また、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を用いて試料を調製した場合、試料のイオン化方法として大気圧イオン化法に限定されないことから、分子量が１５，０００程度の試料まで分析することができる。
更に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置は、熱可塑性フィルムに接着する採取試料の間隔を任意の大きさに設定することができる。したがって、例えば、採取試料に液体を塗布して試料を溶液としてコンタミすることなく回収できる間隔にすることで、ＬＣ−ＭＳ等の様々な分析装置用の試料調製装置として使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１の概略を示す図である。

【図2】図２は、レーザーマイクロダイセクションの原理を示す図である。

【図3】図３は、図面代用写真で、中空リング３４の写真である。

【図4】図４は、ダイセクションレーザー光を、試料２３を介して熱可塑性フィルム３１に照射する例を示す図である。

【図5】図５は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱可塑性フィルム３１の位置座標の関係を表す図で、試料を連続的に切り出す場合の例を示している。

【図6】図６は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱可塑性フィルム３１の位置座標の関係を表す図で、試料の切り出す位置を任意に設定する場合の例を示している。

【図7】図７は、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１の一例の断面図及びシステムの概略を示す図である。

【図8】図８は、図面代用写真で、作製したレーザーマイクロダイセクション装置の外観を表す写真である。

【図9】図９は、図面代用写真で、図９（１）は、採取範囲を設定した際の切片の全体像、図９（２）は表示部に表示された採取範囲を拡大したもので、表示部に点で示される採取位置に数字を上書き表示したもの、図９（３）はダイセクションレーザー照射後の採取済み切片に数字及び破線の円を上書き表示したものである。

【図10】図１０は、図面代用写真で、採取した試料が接着したＥＶＡフィルムにマトリックスを塗布した後の写真である。

【図11】図１１は、実施例２で得られた試料の質量イメージングである。

【図12】図１２は、実施例２で得られたペプチドの分析結果の質量スペクトルである。

【図13】図１３は、図面代用写真で、切片の画像、試料の採取範囲、及び当該採取範囲の試料採取位置、Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ染色の結果、及びＡｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ １−４０の質量分析結果のＨｅａｔＭａｐ表示を示している。

【図14】図１４は、図面代用写真で、図１４（１）は正常マウスの海馬の３次元画像、図１４（２）はアルツハイマー病モデルマウスの海馬の３次元画像である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置、該レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置及びマイクロチップの製造方法について詳しく説明する。

【0020】

図１は、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１の概略を示す図で、試料移動手段２、熱可塑性フィルム移動手段３、レーザー照射部４、図示しない記憶手段及び移動手段駆動制御部を含んでいる。

【0021】

図１に示す試料移動手段２は、試料を載せたスライドガラス２１等を載置することができる試料載置台２２と、該試料載置台２２を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に移動するための図示しない駆動原及び該駆動原の駆動力を試料載置台２２に伝達する駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、倒立顕微鏡等に使われている試料載置台を水平方向に駆動するための駆動力伝達機構等、公知のものを用いればよい。

【0022】

図１に示す熱可塑性フィルム移動手段３は、熱可塑性フィルム３１を一端に載置することができ他端はアーム支柱３３に取り付けることができるアーム３２、該アーム３２を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に回転及び垂直方向（Ｚ軸方向）に移動することができるアーム支柱３３、アーム３２を水平方向に回転及び垂直方向に移動するための図示しない駆動原及び該駆動原の駆動力を伝達してアーム３２を回転及び移動するための駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、自動分析装置のサンプル移動用のアーム機構等、水平方向に回転及び垂直方向に移動することができる公知のアーム機構を用いればよい。なお、熱可塑性フィルム移動手段３は、図１に例示した実施形態に限定されず、採取試料を接着させるための熱可塑性フィルム３１を水平方向及び垂直方向に移動することができれば特に制限は無い。

【0023】

熱可塑性フィルム３１としては、後述するレーザー照射部４から照射したダイセクションレーザー光により溶解し、採取試料を変性させずに接着できるものであれば特に制限は無い。熱可塑性フィルムとしては、融点が低い方が試料の熱変性を防止できることから、融点が約５０−７０℃程度までの熱可塑性樹脂を原料に用いることが好ましく、例えば、エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリオレフィン、ポリアミド、アクリル、ポリウレタン等が挙げられる。また、熱可塑性フィルムには、ダイセクションレーザー光源の波長域のスペクトルを選択的に吸収するため、ナフタレンシアニン染料等の有機染料を添加してもよく、用いるダイセクションレーザー光源の波長域に応じて好適な有機染料を選択すればよい。熱可塑性フィルム３１としては、上記の熱可塑性樹脂及び有機染料を適宜配合して作製してもよいし、市販の熱可塑性フィルムを用いることもできる。市販されている熱可塑性フィルムとしては、例えば、熱可塑性トランスファフィルム（エレクトロシール社製）、熱可塑性ＥＶＡフィルム（シグマ−アルドリッチジャパン社製）等が挙げられる。

【0024】

レーザー照射部４に含まれるダイセクションレーザー光源としては、照射スポットを最小にするためにシングルモードファイバー出力のレーザー光を用いることが好ましく、また、集光の為の近赤外用高ＮＡ長焦点対物レンズを用いることが好ましい。また、パルス幅は０．１ミリ秒〜１００ミリ秒、好ましくは５ミリ秒、波長は７８５ナノメートル〜９００ナノメートル、好ましくは８０８ナノメートル、出力は０．２ワット〜０．３ワット、照射レーザーパワーは０．１％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％のパルスレーザー光を発生できるものが好ましく、具体的には、Ｚ−８０８−２００−ＳＭ（ルシール社製）等が挙げられる。

【0025】

図２は、レーザーマイクロダイセクションの原理の一例を示す図である。図２（１）に示すようにスライドガラス２１に固定した試料２３、及び熱可塑性フィルム３１を装着した光透過性のアクリル樹脂、ポリカーボネイト樹脂等の樹脂製の支持体を、図２（２）に示すように熱可塑性フィルム３１を試料２３に当接し、支持体及び熱可塑性フィルム３１を通してダイセクションレーザー光４３を試料２３に照射し、次いで図２（３）に示すように、熱可塑性フィルム３１を試料２３から引き離すことで、ダイセクションレーザー光４３を照射して切り出した試料２３を熱可塑性フィルム３１に接着することができる。

【0026】

熱可塑性フィルム３１と試料２３に隙間があると、採取試料が熱可塑性フィルム３１に接着し難くなる。そのため、例えば、ステンレス、チタン等の金属等で作製した中空リング３４の中空部分に上記支持体を保持し、中空リング３４の重みで熱可塑性フィルム３１を試料２３に押し付けるように当接することができる。当接具合は、中空リングの厚み等を調整し重量を変えることで適宜調整すればよい。

【0027】

図３（１）は、中空リング３４の側面写真で、中空の基部３５及び先端に熱可塑性フィルム３１を装着した支持体を保持する中空の凸部３６で構成されている。図３（２）は凸部３６の先端方向から撮影した写真で、基部３５及び凸部３６の中空部３７には熱可塑性フィルム３１を装着した支持体が保持される。また、中空リング３４をスライドガラス２１に当接した際のズレを防止するために、凸部３６には、シリコンゴム、合成ゴム等から作製したＯリング３８を設けてもよい。図３（３）は、アーム３２の先端に中空リング３４を装着した写真で、アーム３２の先端に凸部３６より大きく基部３５より小さな孔を形成し、凸部３６を挿入すればよい。

【0028】

なお、熱可塑性フィルム３１を支持体に装着した場合、採取した試料を分析するためには、支持体から熱可塑性フィルム３１を剥す必要がある。採取した試料を直接質量分析装置等で分析できるようにして効率化するため、例えば、導電処理をしたスライドガラスに熱可塑性フィルム３１を直接装着してもよい。その場合、アーム３２の先端には、例えば、スライドガラスを挟んで固定する固定手段を設け、スライドガラスを挟むように取り付ければよい。

【0029】

また、図２に示すレーザーマイクロダイセクション装置は、倒立顕微鏡をベースにしているため、ダイセクションレーザー光４３を、熱可塑性フィルム３１を通して試料２３に照射しているが、ダイセクションレーザー光４３を、試料２３を介して熱可塑性フィルム３１に照射してもよい。図４は、ダイセクションレーザー光４３を、試料２３を介して熱可塑性フィルム３１に照射する例を示す図で、ダイセクションレーザー光４３を透過できる材料、例えばガラスや光透過性樹脂で作製したスライド２４に固定した試料２３に、基材３９に装着した熱可塑性フィルム３１を当接し、スライド２４側からダイセクションレーザー光４３を照射すればよい。この場合、基材３９は光を透過してもしなくてもよいことから、ガラス等の光透過性材料に加え、そのまま各種分析装置に使用できる光不透過性材料で作製してもよい。また、分析装置として質量分析装置を用いる場合は、基材３９を導電処理しておいてもよく、例えば、金属等の導電性材料、導電加工したスライドガラス、導電加工した粘着テープを貼付けた任意の素材等で作製すればよい。

【0030】

図５は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱可塑性フィルム３１の位置座標の関係を表す図で、試料を連続的に切り出す場合の例を示している。例えば、図５（１）の試料２３をａ、ｂ、ｃ・・・のように連続的に切り出す場合、（ｉ）試料移動手段２により、試料２３のａの部分をダイセクションレーザー光が照射される位置に移動する。（ｉｉ）次に、熱可塑性フィルム移動手段３により、図５（２）に示す熱可塑性フィルム３１の採取試料ａが接着する箇所ａ′を、試料２３ａと重なる位置に移動し、アーム３２を垂直方向に下げることで熱可塑性フィルム３１と試料２３を当接する。（ｉｉｉ）ダイセクションレーザー光を照射することで、試料２３ａの箇所から採取した試料を熱可塑性フィルム３１のａ′の位置に接着し、次いで、アーム３２を垂直方向に上げることで熱可塑性フィルム３１を試料２３から離し、熱可塑性フィルム３１の予め決められた箇所に、試料２３ａを接着する。試料２３ｂ、ｃ・・・についても、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の手順を繰り返すことで、試料２３ｂ、ｃ・・・を、熱可塑性フィルム３１のｂ′、ｃ′・・・に接着することができる。

【0031】

試料２３から採取する試料の大きさＡは、対象とする組織切片や目的に応じて切り出す試料の大きさを変えればよい。例えば、細胞下構造体の分析や高空間分解能を得たい場合には１μｍ〜５μｍ、単一細胞を採取する場合には１５μｍ〜３０μｍ、癌や変性部位などを採取する場合は５０μｍ〜１００μｍの大きさの試料を、ダイセクションレーザー光を照射して試料２３から切り出し採取すればよい。切り出す試料の大きさは、照射するダイセクションレーザー光の直径および強度を調整することで、ダイセクションレーザー光の直径と同じ大きさの試料を切り出すこともできるし、ダイセクションレーザー光の強度を強くしたり照射時間を長くすることで、ダイセクションレーザー光の直径より大きな試料を切り出すこともできる。採取する試料に応じて、ダイセクションレーザー光の直径や強度を適宜調整すればよい。ダイセクションレーザー光の直径は、光学絞りや集光レンズ等を用いて焦点を絞ればよい。ダイセクションレーザー光の強度は、可変抵抗などを用いてレーザーの発振体の電圧を変化させれば良い。

【0032】

本発明においては、試料２３から採取した試料を、採取する前の試料の間隔より大きな任意の間隔で熱可塑性フィルム３１に接着できる。したがって、採取した試料を分析する分析装置の空間分解能や試料の前処理等に応じて、採取した試料を接着する間隔を調製することで、分析の空間分解能を向上することができる。例えば、質量分析装置で分析する場合は、（イオン化レーザー光の直径＋採取試料の直径）／２より大きくすればよく、汎用のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの場合、イオン化レーザー光の直径は約２００μｍであることから、熱可塑性フィルム３１に接着した採取試料と隣の採取試料の中心間距離は、（２００μｍ＋採取試料の直径）／２より大きくすればよい。なお、試料の種類により、採取試料の形状が円形にならない場合は、採取試料の任意の外周点と外周点を結ぶ最も長い線を直径としてもよく、また、ダイセクションレーザー光の直径及び／又はダイセクションレーザー光の強度を調整することで設定した切り出す予定の試料の直径を採取試料の直径としてもよい。なお、（２００μｍ＋採取試料の直径）／２については、採取試料の中心とイオン化レーザー光の中心が同じになるように照射した場合であって、例えば、イオン化レーザー光の直径より採取試料の直径が非常に小さく、イオン化レーザー光の端の部分が採取試料に照射できるように照射制御を行えば、採取試料と隣の採取試料の中心間距離は、（２００μｍ＋採取試料の直径）／２より小さくてもよい。また、試料を液化して液体クロマトグラフィー等で分析を行う場合は、試料を液化・回収する際に、隣の採取試料とコンタミしない距離となるように、液化に要する液体量等を考慮し、適宜調整すればよい。

【0033】

図６は、ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標と採取試料が接着する熱可塑性フィルム３１の位置座標の関係を表す図で、試料を採取する位置を任意に設定する場合の例を示している。図６に示す例では、試料２３のどの箇所の試料をどの順番で採取するのか予め設定し、採取試料を熱可塑性フィルム３１のどの箇所に接着させるのか予め決めておけばよい。図６に示す例では、試料中の任意の箇所の試料を切り出すことができるので、例えば、サブセルラー等の分析や試料上に点在する複数の目的物の弁別的採取に有効である。

【0034】

図７は、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１の一例の断面図及びシステムの概略を示す図である。図７に示すレーザーマイクロダイセクション装置１は、倒立型光学顕微鏡をベースに作製した例を示しており、試料載置台２２の上方には、照明部５０が設けられている。この照明部５０の内部には、レーザー照射部４の他に、照明光源５１、光学レンズ５２、ダイクロイックミラー５３、集光レンズ５４が設けられ、照明光源５１より放射される照明光が光学レンズ５２、ダイクロイックミラー５３、集光レンズ５４を通して試料載置台２２上方から試料２３に照射されるようになっている。試料２３は、スライドガラス２１の中央に、カバーガラスで覆われることなく固定されている。試料２３の固定は、バネ力によりスライドガラス２１を抑えつけて固定する公知の固定手段を試料載置台２２に設け、スライドグラス２１を試料載置台２２に固定すればよい。

【0035】

レーザー照射部４には、ダイセクションレーザー光源４１とダイセクションレーザー光源４１から出力されるダイセクションレーザー光の光軸上に配置されるコリメータレンズ４２が設けられ、ダイセクションレーザー光源４１から出力されるダイセクションレーザー光は、コリメータレンズ４２を通ってダイクロイックミラー５３で反射して照明光の光軸と同軸上を進んで観察視野中心にある熱可塑性フィルム３１を通して試料２３に照射されるようになっている。

【0036】

レーザーマイクロダイセクション装置１の試料載置台２２の下方には、対物レンズ５７、ハーフミラー５８、ミラー５９および接眼レンズ６０からなる観察光学系６１とＣＣＤカメラ６２が配置されている。観察光学系６１は、照明光源５１からの照明光が照射され試料２３を透過した観察光を対物レンズ５７、ハーフミラー５８を通してミラー５９で反射し、接眼レンズ６０で目視観察可能にしている。また、ＣＣＤカメラ６２は、ハーフミラー５８の分光光軸上の観察光の結像位置に撮像面が位置するように配置され、接眼レンズ６０で目視観察されるのと同じ観察像が撮像できるようになっている。なお、図７は倒立顕微鏡をベースに作製した例を示しているが、試料２３を接眼レンズ６０で観察する必要は無く、表示部６５への表示のみを行う場合は、ハーフミラー５８、ミラー５９および接眼レンズ６０を設ける必要は無く、対物レンズ５７を通過した観察光が直接又はミラーを介して結像する位置にＣＣＤカメラ６２を配置すればよい。

【0037】

レーザー照射部４には、レーザーコントローラ６３が接続され、このレーザーコントローラ６３には、制御用コンピュータ６４が接続されている。また、制御用コンピュータ６４には、表示部６５、例えばマウス等のポインティングデバイス６６が接続されるとともに、ＣＣＤカメラ６２および試料移動手段２及び熱可塑性フィルム移動手段３の駆動制御を行う移動手段駆動制御部６７が接続されている。

【0038】

制御用コンピュータ６４は、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１専用のソフトウェアを組み込んだパーソナルコンピュータ等で、この制御用コンピュータ６４の命令に基づいて、レーザーコントローラ６３により、ダイセクションレーザー光源４１から出力されるダイセクションレーザー光の出力状態が制御されるとともに、移動手段駆動制御部６７により、試料移動手段２及び熱可塑性フィルム移動手段３の駆動原に対する電源供給とパルス信号が制御されるようになっている。

【0039】

移動手段駆動制御部６７には、ジョイスティックコントローラ６８が接続されている。このジョイスティックコントローラ６８には、図示しないジョイスティックが組み込まれ、このジョイスティックの操作に応じたパルス信号を試料移動手段２に与えるようにしている。ここでは、例えば、ジョイスティックの傾き方向で、パルス信号を送る試料移動手段２の駆動原の選択と、駆動原の回転方向が決まり、傾き角度に応じた周波数でパルス信号が発振されて駆動原が回転し、試料移動手段２が移動するようにしている。なお、ジョイスティックコントローラ６８は必須ではなく、例えば、ＣＣＤカメラ６２で撮影した画像を表示部６５に表示し、ポインティングデバイス６６を差した箇所が表示部６５の中心となるように、また、表示部６５をタッチ機能を有する画面で作製してタッチした箇所が表示部６５の中心となるように制御することで、ジョイスティックを使用することなく、試料移動手段２の駆動原の選択と、駆動原の回転方向を制御してもよい。

【0040】

次に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１により試料を切り出す手順と制御用コンピュータ６４に組み込まれた専用ソフトウェアによる動作について説明する。

【0041】

まず、レーザーマイクロダイセクション装置１の電源を投入して制御用コンピュータ６４の専用ソフトウェアを起動し、自動的に実行される初期化動作に従って、試料載置台２２を初期化のために所定の位置に移動する。そして、図示していない原点検出器により原点位置検出を行って、原点から所定の距離だけ離れたダイセクションレーザー光の照射領域へ移動して待機する。待機する時の試料載置台２２の位置は、試料載置台２２上に固定したスライドガラス２１上の試料が、ダイセクションレーザー光の照射領域と照明光の照射領域に入る位置である。この状態で、試料２３を固定したスライドガラス２１を試料載置台２２に取り付ける。

【0042】

次に、照明光源５１から照明光を光学レンズ５２、ダイクロイックミラー５３、集光レンズ５４を通して試料載置台２２の上方からスライドガラス２１上の試料２３に照射し、試料２３を透過した観察光を対物レンズ５７、ハーフミラー５８、ミラー５９を通してＣＣＤカメラ６２で撮像し、表示部６５上に映し出す。その際、ジョイスティックコントローラ６８又は表示部６５のタッチ機能等により試料載置台２２の位置を微調整し、試料２３の採取したい位置を表示部６５に表示できるようにする。

【0043】

次に、図５に示すように、試料２３から連続的に試料を切り出す場合には、表示部６５に表示された試料２３の採取したい範囲をポインティングデバイス６６等により設定する。制御用コンピュータ６４は、照射するダイセクションレーザー光の直径に基づき、設定された範囲の試料２３を連続的に切り出せるよう、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標を算出する。なお、前記の例は、試料２３を連続的に切り出す場合であるが、例えば、設定した範囲の試料を任意の間隔をおいて切り出せるように、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標を設定してもよい。

【0044】

次に、採取試料を熱可塑性フィルム３１に接着する際の試料の位置座標を設定する。位置座標の設定は、例えば、設定した範囲の試料２３を、熱可塑性フィルム３１に、５×５、２５×２５、５０×５０等のスポットで接着する等、予め制御用コンピュータ６４に記憶したリストの中から選択してもよいし、制御用コンピュータ６４に、所望の間隔値を入力することで座標位置を制御用コンピュータ６４で計算させてもよい。制御用コンピュータ６４は、選択又は計算した位置座標を、制御用コンピュータ６４の図示しない記憶手段に、ＣＣＤカメラで撮像した試料の画像、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標及びダイセクションレーザー光の照射により採取した試料を熱可塑性フィルム３１に接着する位置座標を関連付けて記憶手段に記憶しておく（以下、記憶した情報を「採取情報」と記載することがある。）。

【0045】

また、図６に示すように、試料２３の採取する位置を任意に設定する場合は、表示部６５に表示された試料２３のダイセクションレーザー光を照射して採取したい箇所をポインティングデバイス６６等により設定、もしくは画像解析ソフトにより色情報、染色強度、目的物の面積、周囲長、長径、形状などを利用して自動的に識別してそれぞれの位置座標を設定し、制御用コンピュータ６４の記憶手段に設定した箇所の位置座標を記憶しておく。その際、表示部６５に表示されている試料２３のポインティングデバイス６６で設定した箇所にも、例えば、マークを表示又は設定した順番毎に数字を表示したりする等、どの箇所の試料を切り出すのか表示することが好ましい。

【0046】

次に、上記と同様に、採取試料を熱可塑性フィルム３１に接着する位置座標を算出し、制御用コンピュータ６４の図示しない記憶手段に、ＣＣＤカメラで撮像した試料、好ましくはどの箇所の試料を切り出すのか表示した試料の画像、ダイセクションレーザー光を照射する試料の位置座標及びダイセクションレーザー光の照射により採取試料を熱可塑性フィルム３１に接着する位置座標を関連付けて記憶手段に記憶しておく（以下、記憶した情報を「採取情報」と記載することがある。）。

【0047】

上記の手順により採取情報を記憶した後、移動手段駆動制御部６７は、採取情報の位置座標情報に基づき、最初にダイセクションレーザー光を照射する試料２３の箇所がダイセクションレーザー光の光軸上に位置するように試料移動手段２を駆動制御する。次に、移動手段駆動制御部６７は、該記憶手段に記憶された位置座標情報に基づき、試料２３の最初に採取した箇所が接着する熱可塑性フィルム３１の箇所をダイセクションレーザー光の光軸上に位置し、次いで熱可塑性フィルム３１が試料２３に当接するように熱可塑性フィルム移動手段３を駆動制御する。

【0048】

次に、制御用コンピュータ６４からの指示により、レーザーコントローラ６３はダイセクションレーザー光源４１からダイセクションレーザー光を照射するよう制御する。ダイセクションレーザー光照射後は、移動制御手段６７は、熱可塑性フィルム３１を上方に移動するよう熱可塑性フィルム移動手段３を駆動制御することで、最初に採取した試料２３を熱可塑性フィルム３１に接着させた状態で試料切片から剥離する。その後は、予め設定した採取する試料の全てを熱可塑性フィルム３１に接着剥離するまで上記手順を繰り返す。

【0049】

上記手順により、熱可塑性フィルム３１に接着した試料２３は、公知の手法により分析を行えばよい。例えば、試料２３を熱可塑性フィルムに接着したまま、必要な前処理を行い、公知の質量分析装置の真空チャンバーにセットして、接着している採取試料２３を順番にイオン化レーザー光を照射してイオン化して質量分析を行えばよい。従来の大気圧イオン化法を用いての分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに限られていたが、本発明では、ＬＣ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ等、全ての質量分析装置を用いて分析することができる。また、質量分析以外にも、例えば、熱可塑性フィルムに接着した試料を液化することで、ＨＰＬＣ−蛍光分光機、ＨＰＬＣ−電気化学的検出器等のクロマトグラフィーを含む分析装置、電子線マイクロアナライザ、Ｘ線光電子分光装置等の元素分析装置、ＰＣＲまたはＬＣＲで遺伝子を増幅しシークエンサーを用いて試料に含まれるＤＮＡ配列の解析を行う核酸配列分析装置、試料に含まれる核酸を鋳型にＤＮＡをハイブリダイズするＤＮＡチップ、タンパク質に抗体を反応させる抗体チップ等のマイクロチップ分析装置、等を用いて分析することができる。

【0050】

また、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置は、上記の質量分析装置、クロマトグラフィーを含む分析装置、元素分析装置、核酸配列分析装置、マイクロチップ分析装置の試料採取装置として、当該分析装置に組み込むこともできる。更に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を用いると、採取した試料を所望の間隔で熱可塑性フィルムに接着・配列することができることから、例えば、ＤＮＡチップや抗体チップを製造するための製造装置として使用することもできる。

【0051】

分析により得られた採取試料２３の分析結果を記憶手段に記憶する場合には、それぞれの採取試料２３の位置座標と分析結果を関連付けて記憶手段に記憶する（以下、記憶した情報を「分析情報」と記載することがある。）。そして、記憶手段に記憶された採取情報及び分析情報に基づき画像構成を行うことで、試料の画像を表示するとともに、試料を採取した箇所に含まれていた試料の分析結果を併せて表示することができる。

【0052】

試料画像と分析結果の表示は、レーザーマイクロダイセクション装置１と分析装置が別体の場合は、例えば、レーザーマイクロダイセクション装置１の制御用コンピュータ６４により分析情報を読み込み、レーザーマイクロダイセクション装置１の記憶手段に記憶されている採取情報と読み込んだ分析情報に基づき画像構成を行い、表示部６５に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。分析装置の表示部に表示を行いたい場合は、分析装置の制御用コンピュータにより採取情報を読み込み、分析装置の記憶手段に記憶されている分析情報と読み込んだ採取情報に基づき画像構成を行い、分析装置の表示部に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。

【0053】

レーザーマイクロダイセクション装置１を組み込んだ分析装置の場合は、採取情報と分析情報に基づき画像構成を行い、表示部に試料画像と分析結果を併せて表示すればよい。また、採取情報と分析情報を、レーザーマイクロダイセクション装置１と分析装置とは別のパーソナルコンピュータ等に読み込ませ、当該パーソナルコンピュータの表示部に試料画像と分析結果を併せて表示してもよい。また、本装置は、自動化することも可能であることから遠隔操作、解析をすることもでき、離れた場所から分析をしたり、検査を行ったりすることもできる。

【0054】

上記の例は、採取試料から２次元の分析を行う例を示しているが、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置１又は該装置を組み込んだ分析装置を用いて、３次元イメージングを行うこともできる。例えば、同じ組織から複数枚の試料切片を作製し、試料切片毎に上記と同様の手順で採取情報と分析情報を取得する際に、当該試料切片が組織から作製した何枚目の試料切片であるのかを関連付けて記憶することで、簡単に３次元イメージングを行うことができる。このとき各切片の画像の位置ずれをおこさない手段として、（１）検体の包埋時に包埋剤のしかるべき場所に有色ナイロンフロス等を位置マーカとして刺入する、（２）検体中の複数の特定箇所に墨汁等によるマーキングもしくは微小切削によるメスマークを作る等により位置マーカを作成し、制御用コンピュータ６４に組み込んだ画像処理機能により試料採取前に位置補正をした画像を表示すればよい。なお、各切片の厚みは非常に薄い場合には、組織から切り出した連続した試料切片はほとんど同じ大きさであるため、１枚目の試料を上記手順により採取情報を取得した後、２枚目の試料のＣＣＤカメラで撮像した画像を表示部６５に表示する際に、１枚目の画像に重ね合うようにして表示し、１枚目の画像で設定した試料の採取範囲と同じになるように２枚目の画像で試料の採取範囲を設定してもよい。

【0055】

また、熱可塑性フィルム３１は、ダイセクションレーザー光を吸収することで溶解し、ダイセクションレーザー光の照射を止めることで再び固化し、固化する際にダイセクションレーザー光により切り出された試料と接着する。そのため、試料２３のダイセクションレーザー光を照射する位置座標を同じにしておき、１回目のダイセクションレーザー光の照射により採取された試料を熱可塑性フィルム３１の予め設定した位置に接着した後、試料２３は移動させず、熱可塑性フィルム３１のみを次に採取する試料の接着位置に移動し、ダイセクションレーザー光を照射する。そうすると、溶解した熱可塑性フィルム３１は、既に試料が採取された凹部に染み込むが、熱可塑性フィルム３１は粘性があることから、溶解した熱可塑性フィルム３１は固化する際には溶解していない熱可塑性フィルム３１に引き戻されるように固化するので、ダイセクションレーザー光で切り出された試料を接着してスライドガラス２１に固定した試料２３から採取することができる。

【0056】

なお、上記の方法により試料を採取する場合、凹部の深さにより採取できる試料の量が異なる可能性がある。そのため、試料載置台２２を、水平方向への移動に加え垂直方向に移動できるようにしてもよい。試料載置台２２を垂直方向に移動して、試料を採取した後のスライドガラス２１に固定された試料の凹部面に光学系のピントを合わせることで、凹部の深さを測定し、採取された試料の量を求めることができるので、３次元イメージングをする際の定量性を向上することができる。

【0057】

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

【実施例】

【0058】

＜実施例１＞
倒立顕微鏡（オリンパス社製ＩＸシリーズ）をベースに、駆動原としてステッピングモータ（Ｂｉｏ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ；ルードル社製）、移動手段駆動制御部として３Ｄ−Ａ−ＬＣＳソフトウエア（ルシール社製）、ダイセクションレーザー光源としてＺ−８０８−２００−ＳＭ（ルシール社製）を取り付けることで、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を作製した。図８は作製したレーザーマイクロダイセクション装置の外観写真である。

【0059】

＜実施例２＞
上記実施例１で作製したレーザーマイクロダイセクション装置を用いて、以下の手順でスライドガラスに固定した試料を採取しイメージング処理を行った。

【0060】

〔分析組織の取得〕
分析組織には、以下の手順で取得したＡＰＰ／ＰＳ１マウス（１０ヶ月齢、約２５ｇ）の脳を用いた。
１．マウスをジエチルエーテルで麻酔後、仰臥位にし、四肢を固定した。
２．開腹後、横隔膜を切開し、左右の肋骨を頭部方向へ切開した。
３．剣状突起をつまんで頭部方向へ反転し、鉗子で固定し、心臓を露出させた。
４．左心室に翼状針を刺し、１×ＰＢＳ溶液（生理食塩水）を注入した。
５．剪刀で右心耳を切開し、約７０ｍｌの生理食塩水で脱血・灌流した。
６．灌流後、頭部を切断し、開頭後脳を摘出した。
７．摘出した脳は矢状断で半切し切断面を下面（切削面）に配置後、包埋剤（ＯＣＴコンパウンド）に入れ凍結し、凍結ブロックを作製した。

【0061】

〔試料切片の作製〕
上記の手順で得られた凍結ブロックから、以下の手順で試料切片を作製した。
１．凍結ブロックから１０μｍの厚さで切片を作製した。なお、スライドガラスはコートなしのものを使用した。
２．凍結切片を以下の手順で乾燥させた。
（１）１００％アセトン １０分
（２）ＰＢＳ １分
（３）７０％エタノール １分
（４）１００％エタノール １分
（５）１００％エタノール １分
（６）１００％キシレン ２分
（７）１００％キシレン ２分

【0062】

〔切片から試料の切出し及び熱可塑性フィルムへの接着〕
以下の手順で、上記の手順で得られた凍結切片から設定した箇所の試料を採取し、熱可塑性フィルムに接着させた。
１．実施例１で作製したレーザーマイクロダイセクション装置の電源を入れ、試料載置台の初期化を行った後、得られた凍結切片をレーザーマイクロダイセクション装置の試料載置台にセットした。また、先端にＥＶＡフィルム（シグマ−アルドリッチジャパン社製）を装着した中空リングを熱可塑性フィルム移動手段のアームの先端の孔に挿入した。
２．凍結切片の画像を表示部に表示し、一辺が８００μｍの正方形の部分を１５×１５＝２２５点で採取できるように試料にダイセクションレーザー光を照射する位置座標を設定した。
３．採取した試料をＥＶＡフィルムに試料中心の間隔が２３３μｍで接着するように、位置座標を設定した。
４．Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ７（ルシール社製）のプログラムに従い、上記２．３．の位置座標にしたがって、スライドガラスに固定した試料にダイセクションレーザー光（出力：３００ｍＡ、照射時間：５ｍｓｅｃ、照射径：３０μｍ）を照射し、切り出した試料をＥＶＡフィルムの予め設定した箇所に接着・回収した。当該実施例で採取した試料の直径は６０μｍとなるようにレーザー強度を調節した。

【0063】

図９（１）は、採取範囲を設定した際の切片の全体像、図９（２）は表示部に表示された採取範囲を拡大したもので、表示部に点で示される採取位置に数字を上書き表示したもの、図９（３）はダイセクションレーザー照射後の採取済み切片に数字及び破線の円を上書き表示したものである。

【0064】

〔採取した試料の質量分析〕
１．中空リングから装着した樹脂製支持体を取り出し、回収した試料が上になるようにＥＶＡフィルムを剥がし、どの位置の試料が最初に採取した試料であるのかわかるように黒色の油性マジックで印をつけた導電性両面テープに、ＥＶＡフィルムを貼り付けた。
２．ケミカルプリンタを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供するためのマトリックスを採取した試料に塗布した。マトリクスにはＣＨＣＡ（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）を用い、１００００ｐｌ（１００ｐｌ×５滴／１ｓｐｏｔ×２０回）の量を塗布した。図１０は、採取した試料が接着したＥＶＡフィルムにマトリックスを塗布した後の写真である。
３．キャリアブラントには、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ２（Ｍ．Ｗ．１０４６．３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｍ．Ｗ． ５８０４．６）を用いて、キャリアブラントの位置情報を設定した。
４．ＣＳＶファイル（スポット位置の座標）を作成した。
５．ＥＶＡフィルムをデシケーターに移し、真空ポンプで２０分乾燥させた後、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（株式会社 島津製作所）にて質量分析を行った。質量分析の測定条件は、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ ６５、Ｐｒｏｆｉｌｅ １、Ｓｈｏｔｓ ２００で、ＣｈＩＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔに各パラメーターを設定した。

【0065】

〔試料と質量イメージング表示〕
ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅによる分析結果を、ＢｉｏＭａｐソフトウェア、もしくはＩｍａｇｅ Ｐｒｏ ＰｌｕｓソフトウェアのＨｅａｔＭａｐ表示を用いてイメージング化し、試料の位置座標と関連付けて画像構成を行い、表示部に結果を表示した。図１１は表示部に表示された画像である。以上の結果より、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を用いることで、試料の位置座標と関連付けて効率よく質量イメージングを行うことができる。

【0066】

また、図１２は、上記試料から得られたペプチドの分析結果の質量スペクトルである。分子量１４、１７３のペプチドが検出できた。

【0067】

＜実施例３＞
次に、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ジャクソン・ラボラトリー社）の左脳の海馬の質量イメージングを行った。マウスから実施例２と同様の手順で切片を作製し、左脳の海馬の部分を３０×３０＝９００点で切片から採取した以外は、実施例２と同様の手順で熱可塑性フィルムに試料を接着・回収し、採取した試料の分析を行った。また、当該切片に隣接する別の切片で左脳の海馬の部分を、ＦＳＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（株式会社 同人化学）を用いてＡｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ染色を行った。図１３は、切片の画像、試料の採取範囲、及び当該採取範囲の試料採取位置、Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ染色の結果、及びＡｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ １−４０の質量分析結果のＨｅａｔＭａｐ表示を示している。Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ染色では、写真から明らかなように、数か所染色が確認されたに過ぎなかった。一方、Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ １−４０の質量イメージング結果では、Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ １−４０が海馬の形状に類似した形状で検出された（質量イメージングの色の濃い部分）。以上の結果より、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を使用すると、現在最も感度が高いと言われているペプチドの特異的蛍光染色よりも、一般的な質量分析装置を用いて高感度で生体内ペプチドを分析できた。

【0068】

＜実施例４＞
次に、本発明のレーザーマイクロダイセクション装置を含む質量分析装置により、３次元イメージングを行った。試料は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス及び同腹の正常マウス（アルツハイマー病モデルマウス；ジャクソン・ラボラトリー社）を準備し、検体の包埋時に包埋剤のしかるべき場所に有色ナイロンフロスを位置マーカとして刺入した以外は、実施例２と同様の手順で切片を作製し、同様の手順で質量分析を行った。なお、実施例４では、３次元画像を得るため１０枚の切片（試料の厚みは計１００μｍ）で質量分析を行い、分析を行う際には切片番号と関連付けて分析結果を記憶し、実施例２と同様の手順でイメージング化した画像を重ね合わせた。図１４（１）は正常マウスの海馬の３次元画像、図１４（２）はＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬の３次元画像である。図１４（１）及び（２）から明らかなように、正常マウスではアミロイドベータ１−４０は観察されなかったが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスでは、図１４（２）に示すとおり、アミロイドベータ１−４０の分布が３次元で確認された。

【産業上の利用可能性】

【0069】

本発明に係るレーザーマイクロダイセクション装置を用いることで、従来の質量分析装置の空間分解能を向上することができ、更に、簡単に質量イメージングを行うことができる。本発明に係るレーザーマイクロダイセクション装置を用いることで、質量分析装置に限らず、採取した試料を様々な分析装置で分析を行い、その結果をイメージング表示することができる。したがって、医療機関や大学医学部などの研究機関、一般病院等において、組織分析のための装置として利用が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】