特許 6612963 腫瘍抗原を直接認識するために組換えＴ細胞レセプターを使用するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6612963

(24)【登録日】2019年11月8日

(45)【発行日】2019年11月27日

(54)【発明の名称】腫瘍抗原を直接認識するために組換えＴ細胞レセプターを使用するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20191118BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20191118BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20191118BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20191118BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191118BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20191118BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10ZNA

   C12N5/0789

   A61K35/28

   A61K48/00

   A61P35/00

   !C12N15/12

【請求項の数】4

【外国語出願】

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2018-244112(P2018-244112)

(22)【出願日】2018年12月27日

(62)【分割の表示】特願2016-501939(P2016-501939)の分割

【原出願日】2014年3月13日

(65)【公開番号】特開2019-80568(P2019-80568A)

(43)【公開日】2019年5月30日

【審査請求日】2018年12月28日

(31)【優先権主張番号】61/778,673

(32)【優先日】2013年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504206056

【氏名又は名称】ヘルス リサーチ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000475

【氏名又は名称】特許業務法人みのり特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オドゥンシ，クンレ

(72)【発明者】

【氏名】松崎 順子

(72)【発明者】

【氏名】辻 武正

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０３８０５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１３１０９２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００３−５２０６０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４４３２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０６７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５０３０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Immunother., 2006, Vol.29, No.4, p.398-406

【文献】 J. Immunol., 2008. Vol.180, No.9, p.6116-6131

【文献】 Int. J. Cancer, 2009, Vol.125, p.649-655

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞レセプタ−(ＴＣＲ)をコードする組換えポリヌクレオチドを含む改変ヒト造血幹細胞であって、
前記組換えポリヌクレオチドが、配列番号３の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号４の配列を有するＴＣＲβ鎖をコードするか、または前記組換えポリヌクレオチドが、配列番号１１の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号１２の配列を有するＴＣＲβ鎖をコードすること
を特徴とする、改変ヒト造血幹細胞。

【請求項2】

前記α鎖及び／又は前記β鎖をコードする配列がイントロンを含まない、請求項１に記載の改変ヒト造血幹細胞。

【請求項3】

癌が発症または再発していると診断された、その疑いがある、またはそのリスクがある個体を予防及び／又は治療するための組成物であって、前記癌は、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現する癌細胞を有し、当該組成物は、Ｔ細胞レセプタ−(ＴＣＲ)をコードする組換えポリヌクレオチドを含む改変ヒト造血幹細胞を含み、前記組換えポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号４の配列を有するＴＣＲβ鎖をコードしているか、または配列番号１１の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号１２の配列を有するＴＣＲβ鎖をコードしている、組成物。

【請求項4】

前記癌細胞が、膀胱癌細胞、脳癌細胞、乳癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、頭頸部癌細胞、肝胆道癌細胞、腎臓癌細胞、卵巣癌細胞、非小細胞肺癌細胞、骨髄腫 、前立腺癌細胞、肉腫細胞、精巣癌細胞、メラノーマ細胞、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

この出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国出願６１/７７８，６７３に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本明細書中に包含される。

【技術分野】

【0002】

本開示は、一般に免疫療法に関し、より具体的には、Ｔ細胞に直接腫瘍認識能力を付与できる組換えＴ細胞レセプターに関する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍抗原特異的ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞は、「ＣＤ４-ヘルプ」を提供することによって、抗腫瘍免疫応答の誘導及び維持に重要な役割を果たす。局所腫瘍部位におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化は、多重免疫抑制メカニズムを克服するのに役立ち、免疫システムによる腫瘍根絶を促進すると信じられている。しかしながら、局所腫瘍部位における機能的抗原提示細胞の頻繁な欠如により、局所腫瘍部位におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化及びそれに基づくＣＤ４-ヘルプの提供は非常に制限される。したがって、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化及びそれに基づくＣＤ４-ヘルプの提供を達成できる新規な組成物及び方法を提供するという、満たされていない継続したニーズが存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、様々な癌の予防及び／又は治療のための組成物及び方法を提供する。一般に、前記癌は、周知のＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現する癌である。いくつかの実施形態では、前記開示は、組換えＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)、それらをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ポリヌクレオチドが導入された細胞を含み、前記細胞には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、及び造血幹細胞等の前駆細胞が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドが導入された前記細胞は、リンパ球前駆細胞、未熟胸腺細胞(ダブルネガティブＣＤ４^-ＣＤ８^-)、またはダブルポジティブ胸腺細胞(ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺)である。いくつかの実施形態において、前記前駆細胞は、ＣＤ３４, ＣＤ１１７(ｃ-ｋｉｔ)及びＣＤ９０(Ｔｈｙ-１)等のマーカーを含む。

【0005】

一形態において、本開示は、ＴＣＲをコードする組換えポリヌクレオチドを含む改変ヒトＴ細胞を含み、当該Ｔ細胞は、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現している癌細胞を直接認識する能力があり、当該癌細胞の直接認識は、前記癌細胞によって発現されたＮＹ-ＥＳＯ-１抗原への、ＴＣＲの、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)クラスII-拘束(制限)性結合を含む。特定の実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされた及び前記細胞によって発現されたＴＣＲは、配列番号３の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号４の配列を有するＴＣＲβ鎖、または配列番号７の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号８の配列を有するＴＣＲβ鎖、または配列番号１１の配列を有するＴＣＲα鎖及び配列番号１２の配列を有するＴＣＲβ鎖を有する。このようなα及びβ鎖の組み合わせの全ては、本開示中に含まれる。一実施形態では、請求項１の改変細胞において、前記α鎖及び／又は前記β鎖をコードする配列は、イントロンを含まない。いくつかの実施形態では、本開示のＴＣＲは、本明細書に開示されたアミノ酸配列の長さにわたり９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0006】

別の形態では、本開示は、癌が発症または再発していると診断された、その疑いのある、またはそのリスクがある個体を予防及び／又は治療する方法を含み、ここで、前記癌は、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現するがん細胞を有する。このアプローチは、前記個体に、ＴＣＲをコードする組換えポリヌクレオチドを含む改変ヒトＴ細胞を投与することを含み、前記Ｔ細胞は、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現している癌細胞を直接認識する能力を有し、前記癌細胞の直接認識は、前記癌細胞によって発現されたＮＹ-ＥＳＯ-１抗原への、ＴＣＲのＨＬＡクラスII-拘束性結合を含む。いくつかの実施形態では、前記組換えＴＣＲを含む細胞は、ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記個体に投与される前記組換えＴＣＲを含む細胞は、同種細胞、同系細胞、または自己細胞である。それゆえ、一実施形態において、前記細胞は、第一の個体から採取され、改変され及びそれを必要とする第二の個体に投与される。別の実施形態において、前記細胞は、事前に個体から取り除かれ、組換えＴＣＲを発現するよう改変され、同じ個体に投与される。

【0007】

いくつかの実施形態では、前記ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現する癌は、膀胱癌細胞、脳癌細胞、乳癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、頭頸部癌細胞、肝胆道癌細胞、腎臓癌細胞、卵巣癌細胞、非小細胞肺癌細胞、骨髄腫、前立腺癌細胞、肉腫細胞、精巣癌細胞、メラノーマ細胞、及びそれらの組み合わせから選択される。

【0008】

別の形態では、本開示は一以上の発現ベクターを含む。前記発現ベクター(単数または複数)は、それを発現する細胞に、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を発現する癌細胞を直接認識する能力を付与することができるＴＣＲをコードし、前記癌細胞の直接認識は、前記癌細胞によって発現されたＮＹ-ＥＳＯ-１抗原への、ＴＣＲのＨＬＡクラスII-拘束性結合を含む。

【0009】

別のアプローチでは、発現ベクター及び／又は組換えＴＣＲを発現する細胞を製造する方法が提供される。前記方法は、個体から複数のＴ細胞を採取すること、当該Ｔ細胞に対してＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を提示する抗原提示細胞が無くても、ＨＬＡクラスIIに制限された様式にて、ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を呈する癌細胞を直接認識する能力を有するＴ細胞を同定すること、前記ＴＣＲのα鎖の配列及び前記ＴＣＲのβ鎖の配列を決定すること、前記ＴＣＲのα鎖の配列及び前記ＴＣＲのβ鎖の配列をコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに導入することを含む。一実施形態では、この方法は、前記発現ベクターを、前記ＴＣＲが発現されるように、細胞に導入することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】（Ａ）は、ＪＭ ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンによる癌細胞の直接認識を示す。ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170ペプチド-特異的腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン(Ｃｌｏｎｅ：ＪＭ)(ＴＲ-ＣＤ４)及び非腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン(ＮＴＲ-ＣＤ４)のインターフェロン(ＩＦＮ)-γ及びＣＤ１０７発現は、ＮＹ-ＥＳＯ-１-発現ＳＫ-ＭＥＬ-３７(ＳＫ３７)と、同族ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170(ＥＳＯ_157-170)ペプチドをパルシングした又はしなかったＮＹ-ＥＳＯ-１-ネガティブＳＫ-ＭＥＬ-２９(ＳＫ２９)と共培養後、細胞内サイトカイン染色によって調べられた。（Ｂ）は、ＮＹ-ＥＳＯ-１-特異的ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞クローンによる細胞内及び細胞外ＮＹ-ＥＳＯ-１認識の差を示す。ＮＹ-ＥＳＯ-１-ネガティブＳＫ-ＭＥＬ-２９は、パルスされないか(図中では非パルス)または、ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170ペプチド(図中ではペプチド)もしくは組換えＮＹ-ＥＳＯ-１タンパク質(図中ではタンパク質)でパルスされるか、細胞内ＮＹ-ＥＳＯ-１発現を誘発するアデノウイルスベクターに感染されられた。ＴＲ-ＣＤ４、ＮＴＲ-ＣＤ４及びＮＹ-ＥＳＯ-１-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローンによる認識は、ＩＦＮ-γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価された。

【0011】

【図2】（Ａ）ＴＲ-ＣＤ４(Ｃｌｏｎｅ：ＪＭ)は、ＳＫ-ＭＥＬ-３７と共培養された。培養上清は、培養の１〜４日後に収集された。表示された上清中のサイトカイン及び溶解性分子のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された。（Ｂ）ＴＲ-ＣＤ４及びＮＴＲ-ＣＤ４は、ＳＫ-ＭＥＬ-３７と共培養され、ＳＫ-ＭＥＬ-３７(ＳＫ３７)における初期アポトーシスマーカー、アネキシンＶの発現はフローサイトメトリーで測定された。

【0012】

【図3】表示された比率のＴＲ-ＣＤ４(Ｃｌｏｎｅ：ＪＭ)の存在下または不存在下で、ＮＹ-ＥＳＯ-１-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローン(ＥＳＯ-ＣＤ８)は、ＳＫ-ＭＥＬ-３７と１：２の比率で共培養された。ＳＫ-ＭＥＬ-３７におけるＥＳＯ-ＣＤ８による細胞傷害活性は、ＣＦＳＥによる細胞毒性試験によって評価された。

【0013】

【図4】（Ａ）ＮＹ-ＥＳＯ-１-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローン(ＥＳＯ-ＣＤ８)は、ＴＲ-ＣＤ４(Ｃｌｏｎｅ：ＪＭ)の存在下または不存在下で、ＳＫ-ＭＥＬ-３７(ＳＫ３７)によってまたはそれ無しで刺激された。４日後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の数は、フローサイトメトリーによるＣＤ８染色と組み合わされたトリパンブルー排除分析によって数えられた。（Ｂ）ＥＳＯ-ＣＤ８は、ＴＲ-ＣＤ４の存在下または不存在化で、ＳＫ３７で刺激された。刺激前(０日)及び刺激後(１日及び２日)、ＥＳＯ-ＣＤ８における活性マーカー(ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ１２２)またはセントラルＴ細胞分化マーカー(ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７)の発現は、フローサイトメトリーによって測定された。

【0014】

【図5】（Ａ）ＳＫ-ＭＥＬ-３７は、腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン(ＪＭ：ＴＲ-ＣＤ４)、非腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン(ＮＴＲ-ＣＤ４)、及び／又はＮＹ-ＥＳＯ-１-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローン(ＥＳＯ-ＣＤ８)とともに、または無しでＳＣＩＤマウス(６マウス/グループ)に接種された。腫瘍増殖は２〜３日ごとに測定された。（Ｂ）腫瘍は、接種後４５日で切除され重量測定された。

【0015】

【図6】（Ａ）実験で使用されたレトロウイルスベクター ＬＴＲ：末端反復配列；Ψ：パッケージングシグナル；ＭＣＳ：マルチクローニングサイト；ＩＲＥＳ：配列内リボソーム進入部位；ｅＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質 （Ｂ）ＴＣＲ発現カセット （Ｉ）ＴＣＲβ及びα鎖コードｃＤＮＡ配列は、ＧＳＧ(Gly-Ser-Gly)リンカー及びＰ２Ａリボソームスキッピング配列によって連結される。（II）ＴＣＲβ及びα鎖コードｃＤＮＡ配列は、フューリンプロテアーゼ認識部位(ＲＡＫＲ(Arg-Ala-Lys-Arg)）、ＳＧＳＧ(Ser-Gly-Ser-Gly)リンカー、Ｖ５エピトープ、及び、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によって連結される。

【0016】

【図7】多クローン性に活性化されたＰＢＭＣは、レトロウイルスベクター(Ａ：ＪＭ-ＴＣＲ；Ｂ：ＳＢ９５-ＴＣＲ)を導入された。それらは、ペプチドをパルスされた(図中ではパルス)またはパルスされなかった(図中では非パルス)ＨＬＡ-ＤＲＢ１^*０１＋ＤＰＢ１^*０４＋細胞と、２０時間共培養された。上清中のＩＦＮ-γレベルは、ＥＬＩＳＡで測定された。ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170及びＮＹ-ＥＳＯ-１_91-110ペプチドは、ＪＭ-ＴＣＲ及びＳＢ９５-ＴＣＲの同族ペプチドとして、それぞれ使用された。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、腫瘍抗原及びＭＨＣクラスII-発現癌細胞を直接認識できるように改変された免疫細胞(Ｔ細胞を含むが必ずしもそれらに限定されない)に関する。複数の実施形態において、前記免疫細胞は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、またはそれらの前駆細胞(造血幹細胞/前駆細胞など)である。いくつかの実施形態では、前記造血/前駆細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ１１７(ｃ-ｋｉｔ)及びＣＤ９０(Ｔｈｙ-１)から選択される一以上のマーカーによって特徴付けられる。

【0018】

ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、一般的に、マクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞によってＭＨＣクラスII(ヒトではＨＬＡクラスII)上に提示されたペプチドフラグメントを認識することがよく知られている。抗原提示細胞に加えて、多くのヒト癌細胞も、恒常的にまたはＩＦＮ-γ-誘導的にＭＨＣクラスIIを発現することが知られているが、ヒト癌細胞上のＭＨＣクラスII発現の役割は、多くが依然として不明のままである。

【0019】

我々は、２つの異なる種類の腫瘍抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞があることを発見した。腫瘍抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞の１つの種類は、本明細書で腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞(ＴＲ-ＣＤ４)と呼ばれる。この種類のＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＭＨＣ(ヒトではＨＬＡ)クラスII発現癌細胞を、抗原特異的及びＭＨＣクラスII拘束的に直接認識する。それに対して、従前から知られていたもう１つの種類の抗原特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、本明細書中で、非腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞(ＮＴＲ-ＣＤ４)と呼ばれる。この種類のＴ細胞は、抗原提示細胞によって処理された後の外来性の腫瘍抗原ペプチドを認識するだけである。図１Ａ及び１Ｂは、これらの異なる機能を実証するデータを表し、ＴＲ-ＣＤ４による癌細胞の直接認識を明らかにする。

【0020】

癌細胞の直接認識に関するそれらの異なる能力のため、これら２種類のＣＤ４⁺Ｔ細胞(ＴＲ-ＣＤ４及びＮＴＲ-ＣＤ４)は、局所腫瘍部位において異なる役割を果たすと考えられる。何らかの特定の理論に制約されることは意図しないが、ＴＲ-ＣＤ４細胞は、癌細胞の直接認識によってＣＤ４-ヘルプを提供すると考えられる。本発明は、新規な予防的及び／又は治療的処置方法及び組成物において使用するために、この機能を活用して、ＴＣＲポリペプチド及びそれらをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されるＴＣＲを発現するようＴ細胞を操作することによって、我々は、ＣＤ４⁺細胞に、抗原提示細胞による抗原の提示を必要とすることなく、腫瘍抗原発現癌細胞を直接認識する能力を与えることに成功した。それゆえ、本発明は、癌患者の改良された治療のために、ＴＲ-ＣＤ４細胞を創造し使用するのに有用な組成物及び方法を含む。

【0021】

組換えＴＣＲを作り使用する試みは以前にもあった。例えば、米国特許第８，００８，４３８(４３８特許)は、ＮＹ-ＥＳＯ-１タンパク質(ＮＹ-ＥＳＯ-１：１５７-１６５)に由来するペプチド配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣに結合する組換えＴＣＲを開示する。しかしながら、及び重要なことに、４３８特許の開示は、古典的ＣＤ８⁺ＴＣＲに関係し、これはＨＬＡ-Ａ^*０２０１クラスＩ拘束(制限)エレメントとの関連でＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１６５ペプチドを認識するだけである。これは本発明とは大きな相違点を構成する、なぜなら上述したように、本発明の組換えＴＣＲは、クラスII拘束性である。さらに、同じく上述したように、標準的なクラスII拘束と異なり、本発明の組換えＴＣＲを発現するよう操作された細胞は、驚くべきことに、それらが特異的である抗原を認識するために、抗原提示細胞による補助を必要としない。代わりに、それらは、腫瘍細胞によって提示されたペプチドのように生体内に存在する抗原を認識できる。さらに、本発明のＴＣＲは、４３８特許において開示されたものによってペプチドを認識する。したがって、本発明は、従来技術に対し著しく且つ予期できない発展である。一実施形態では、ＴＲ-ＣＤ４は、抗原(それに対してＴＣＲがＨＬＡII構成において特異的である)を発現する細胞に直接さらされた際、サイトカイン分泌(ＩＦＮ-γ生成等)を示すＣＤ４⁺細胞である。この性能を有する自然発生細胞由来のＴＣＲを導入することによって、ＣＤ４⁺Ｔ細胞によるＮＹ-ＥＳＯ-１-発現腫瘍の直接認識性能を与える能力は、予期できなかった。

【0022】

一実施形態では、本発明は、本発明の組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを多クローン性に増殖したＣＤ４⁺Ｔ細胞に導入し、当該ポリヌクレオチドのＴＣＲポリペプチドコード領域を発現させることによって、ＣＤ４⁺細胞をＴＲ-ＣＤ４に変換することを含む。

【0023】

様々な実施形態において、本発明は、特定のＴＣＲポリペプチドをコードする単離及び／又は組換えポリヌクレオチド、当該ＴＣＲポリペプチドを発現するよう操作された細胞、当該ＴＣＲポリペプチドを発現する細胞を含む医薬製剤、患者の癌に対して予防的及び／又は治療的効果を達成するために、当該医薬製剤を使用する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、異なる癌抗原に特異的な、複数のＴＣＲを発現している細胞の混合物、または本明細書に記載された二以上のＴＣＲを発現している細胞の混合物を提供し、それゆえ、ＴＣＲに関して多価と考えられる細胞集団を提示する。本開示において使用される「組換えＴＣＲ」は、細胞内に導入されたポリヌクレオチドから発現されたＴＣＲを意味し、当該ポリヌクレオチドの導入前に、当該ＴＣＲが細胞の染色体の配列によってコードされていなかったことを意味する。

【0024】

本発明によって提供されるＴＣＲは、アミノ酸配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦからなる抗原であるＮＹ-ＥＳＯ-１；１５７-１７０を認識する能力があるか、または、アミノ酸配列ＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲからなる抗原であるＮＹ-ＥＳＯ-１；９５-１０６を認識する能力がある。上述したように、ある実施形態では、本発明によって提供される細胞は、ＨＬＡクラスII分子と会合した抗原と相互作用するＴＣＲを経てこれらの抗原を認識する能力のある改変ＣＤ４⁺Ｔ細胞であり、前記ＨＬＡクラスII分子と抗原は、腫瘍細胞によって提示されている。

【0025】

本発明は、本発明の及び本明細書に開示された一以上のＴＣＲポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含み、そのような配列を含む及び／又はそのような配列からなる単離及び／又は組換えポリヌクレオチドを含む。本発明は、前記組換えポリヌクレオチドを含む細胞も含む。前記細胞は、単離細胞であっても、培養液中で成長及び／又は増殖及び／又は維持されている細胞であってもよく、原核細胞または真核細胞であってもよい。原核及び真核細胞培養物は、例えば、本発明のＴＣＲ発現ベクターを増殖あるいは増幅するために使用されることができる。複数の実施形態において、前記細胞は、パッケージング・プラスミド（例えば、偽ウイルス粒子のような組換えウイルス粒子中に、発現コンストラクトのＲＮＡコピーを転写及びパッケージングするために使用されるいくつかあるいは全てのタンパク質を提供する）を含むことができる。複数の実施形態において、前記発現ベクターは、細胞内に一時的にまたは安定的に導入される。複数の実施形態において、前記発現ベクターは、それらの製造に使用される細胞の染色体中に組み込まれる。複数の実施形態において、ウイルス粒子等の発現ベクターによって細胞内に導入されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、前記細胞の一以上の染色体に組み込まれる。このような細胞は増殖のために使用されてもよく、あるいはそれらは治療的及び／又は予防的アプローチのために使用される細胞であっても良い。前記真核細胞は、本発明のＴＣＲ発現コンストラクトがその中に導入された、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、及びそれらの前駆細胞を含む。前記ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、いかなる起源に由来してもよく、前記起源はヒト患者を含むがそれに限定されず、当該ヒト患者は、本発明に係るＴＣＲを発現するように一度改変されたＣＤ４⁺Ｔ細胞の最終的なレシピエントであってもよく、なくてもよい。

【0026】

この開示の実施形態で使用するための発現ベクターは、何らかの適切な発現ベクターであればよい。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスに由来するような改変ウイルスポリヌクレオチドを含む（レンチウイルスベクター等）。前記発現ベクターは、組換えウイルスに限定されず、ＤＮＡプラスミド、及びインビトロで転写されたｍＲＮＡ等の非ウイルスベクターを含む。

【0027】

上述したポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに関して、ある面では、本発明はＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖を含む機能性ＴＣＲを提供し、ここで前記２本の鎖は、互いに物理的結合にて存在し(例えば、コンプレックスで)且つ、互いに非共有結合的につながっているか、または、前記２本の鎖は異なるポリペプチドであるものの、互いに共有結合的につながっている(ペプチド結合とは異なる、ジスルフィドあるいは他の共有結合によってなど)。他の適切な結合は、例えば、置換あるいは非置換ポリアルキレン・グリコール、及びエチレングリコールとプロピレングリコールの組み合わせ(例えば、コポリマーの形態による)を含むことができる。他の実施形態では、前記ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖を構成する２つのポリペプチドは、両方とも、融合タンパク質等の単一のポリペプチド中に含まれることができる。ある実施形態では、前記融合タンパク質は、同じオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)、または異なるＯＲＦ、あるいは非連続翻訳をもたらすシグナルを含むＯＲＦから翻訳されたＴＣＲα鎖アミノ酸配列とＴＣＲβ鎖アミノ酸配列を含む。一実施形態では、前記ＯＲＦは、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の間に位置するＰ２Ａ-介在翻訳スキッピングサイトを含む。Ｐ２Ａ含有タンパク質を作るためのコンストラクト(２Ａペプチド-結合マルチシストロン性ベクターとも呼ばれる)は、当該分野において既知である(例えば、Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual, (2007), Friedman et al., International Standard Book Number (ISBN) 978-087969765-5参照)。手短に説明すると、２Ａペプチド配列は、コード領域の間に含まれると、２Ａペプチド配列中で発生する新規な切断現象を通じて、単一のベクター内で別々のタンパク質生成物の化学量論的な製造を可能にする。２Ａペプチド配列は一般に、１８〜２２のアミノ酸を含む短い配列で、異なるアミノ末端配列を有することができる。それゆえ、一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｐ２Ａアミノ酸配列を含む。複数の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の間にリンカー配列を含むことができる。ある実施形態では、前記リンカー配列は、ＧＳＧ(Gly-Ser-Gly)リンカーまたはＳＧＳＧ(Ser-Gly-Ser-Gly)リンカーを含むことができる。ある実施形態では、前記ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖は、フューリンプロテアーゼ認識部位(ＲＡＫＲ[Arg-Ala-Lys-Arg]部位等)を含むアミノ酸配列によって互いに連結されている。

【0028】

一実施形態では、ＴＣＲをコードする前記発現コンストラクトは、さらなるポリヌクレオチドをコードすることもできる。前記さらなるポリヌクレオチドは、例えば検出可能マーカー(蛍光性または発光性タンパク質等)をコードすることによって、ＴＣＲ発現細胞の同定(特定)を可能とするものであってもよい。前記さらなるポリヌクレオチドは、チミジンキナーゼ遺伝子等の、ＴＣＲ発現細胞の選択的除去を可能にするエレメントをコードするものであってもよい。複数の実施形態において、前記さらなるポリヌクレオチドは、内因性にコードされたＴＣＲの発現の阻害を促進するようなものであってもよい。一実施形態において、前記ＴＣＲをコードする前記発現コンストラクトは、一以上の内因性ＴＣＲのＲＮＡｉ-介在下方制御を促進できるポリヌクレオチドもコードする。例えば、Okamoto S, et al. (2009) Cancer Research, 69:9003-9011,及び Okamoto S, et al. (2012). Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1, e63を参照。一実施形態では、前記ＴＣＲをコードする発現コンストラクトは、内因性にコードされたＴＣＲを標的とするｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードすることができる。別の実施形態では、内因性のＴＣＲ生成を下方制御するのに使用されるポリヌクレオチドをコードする第二の別の発現コンストラクトを使用することができる。

【0029】

図６は、本発明のＴＣＲポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド/発現ベクターの代表的な構造を提供する。一実施形態では、図６に概要が示されているように、ＴＣＲβ鎖タンパク質のＣ末端側のアミノ酸配列は、フューリンプロテアーゼ介在切断によって除去され、機能性ＴＣＲα及びβ鎖タンパク質を生じる。また、ＴＣＲ鎖は、β鎖がα鎖との関係でＮ末端側に配向された発現コンストラクトから発現されることができ、このように、本発明のＴＣＲは、この鎖配向または他の配向も含むことができることが、図６から認識できる。別の実施形態では、前記ＴＣＲα及びβ鎖タンパク質は、同じ細胞に導入された別々の発現ベクターから発現されることができる。

【0030】

本発明に関連して、我々は以下のことも発見した：ある例では、細胞内腫瘍抗原は、腫瘍中のＨＬＡクラスIIのリサイクルを通じてＨＬＡクラスII上に負荷される；腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞による直接腫瘍認識が、インビボの腫瘍増殖阻害を導く；ＣＤ４⁺Ｔ細胞が、直接腫瘍認識を通じてＣＤ８⁺Ｔ細胞による細胞傷害性を効率的に増大させる；ＣＤ４⁺Ｔ細胞が、抗原提示細胞を利用しない直接の腫瘍認識を通じて同族の抗原-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖、生存、及びメモリー分化をサポートする；同様に、本発明の臨床の場での実施は、改変された腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞による直接腫瘍認識をもたらし、ヒト患者においてインビボ腫瘍増殖阻害を導き、改変ＣＤ４⁺Ｔ細胞によりＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞傷害性を効率的に増大させ、且つ、本発明によって改変されたＣＤ４⁺Ｔ細胞を投与されたヒト患者において、改変ＣＤ４⁺Ｔ細胞が、同族の抗原-特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖、生存、及びメモリー分化をサポートすると予期される。

【0031】

本発明の改変されたＣＤ４⁺Ｔ細胞の使用に関して、前記方法は、一般的に、前記ＣＤ４⁺Ｔ細胞を含む組成物の有効量(静脈内または腹腔内注射により典型的には１０¹⁰細胞)を、それを必要とする個体に投与することを含む。それを必要とする個体は、様々な実施形態において、ＮＹ-ＥＳＯ-Ｉを発現する悪性細胞を特徴とする癌を有する、または有する疑いのある、または発症のリスクがある個体である。当該分野においてよく知られているように、ＮＹ-ＥＳＯ-Ｉは、様々な癌細胞及び腫瘍タイプによって発現される。特定の且つ非限定的な例では、そのような癌は、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、骨髄腫、前立腺癌、肉腫及びメラノーマを含む。特定の実施形態は、脂肪肉腫及び肝内胆管癌を含むが、これらに限定されない。前記個体は、初期または進行型のこれらの癌のいずれかを有していてもよく、あるいはこれらの癌のいずれかから完解している状態であってもよい。一実施形態では、本発明の組成物を投与される前記個体は、ＮＹ-ＥＳＯ-１を発現する何らかの癌タイプの再発のリスクを有する。ある実施形態では、前記個体は、ＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１７０及び／又はＮＹ-ＥＳＯ-１:９５-１０６によって定義されるアミノ酸配列を含むタンパク質を発現する細胞を含む腫瘍を有しているか、有している疑いがあるか、発症するもしくは再発するリスクがある。複数の実施形態において、本開示は、１５から２４の間のアミノ酸残基長を有するＮＹ-ＥＳＯ-１のペプチドフラグメントに特異的な組換えＴＣＲを含み、ここでそのようなペプチドは、ＨＬＡ-IIとの複合体において提示されている。複数の実施形態において、本開示は、ＨＬＡ-IIとの複合体を形成しているペプチドに特異的な組換えＴＣＲを含み、ここで、前記ペプチドは、ＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１７０及び／又はＮＹ-ＥＳＯ-１:９５-１０６のアミノ酸配列を含むか、それからなる。

【0032】

本開示は、ＴＣＲによって認識される、ＨＬＡ-クラスII複合体と組み合わされたＮＹ-ＥＳＯ-１抗原の提示に関与する、組換えＴＣＲ、それらを発現している細胞、及び、治療／予防方法を含む。複数の実施形態では、前記ＨＬＡ-IIは、ＨＬＡ-ＤＰ、ＨＬＡ-ＤＱ、及びＨＬＡ-ＤＲから選択される。複数の実施形態では、前記ＮＹ-ＥＳＯ-１抗原は、ＨＬＡ-ＤＲＢ１*０１またはＨＬＡ-ＤＰＢ１*０４と協働するＴＣＲによって認識される。

【0033】

我々は、この発明において、我々が作製したＴＲ-ＣＤ４が、癌細胞の直接認識を通じて複数の分子を製造し、癌細胞のアポトーシスを誘導することを実証する（図２Ａ及び２Ｂ）。重要なことに、ＴＲ-ＣＤ４が、抗原提示細胞の不存在下で癌細胞の直接認識を経て、腫瘍抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞傷害活性を効率的に増強することが見出された（図３）。さらに、癌細胞によってＴＲ-ＣＤ４と同時刺激されたＣＤ８⁺Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞マーカーを能動的に増殖し、上方制御した（図４Ａ及び４Ｂ）。

【0034】

ＴＲ-ＣＤ４は、免疫不全マウスにおけるヒト癌細胞の増殖を阻害するために、有意なインビボ抗腫瘍活性を示した（図５）。さらに、ＴＲ-ＣＤ４と腫瘍抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、生体内の腫瘍増殖を協同的に阻害した（図５）。このように、本明細書で提示されるデータは、局所腫瘍部位でのＴＲ-ＣＤ４の動員が、抗腫瘍免疫応答を増強し、その結果、クリニックにおける広範な使用のために、効果的且つ従来利用できなかった治療的アプローチとなるであろうということを強く示唆する。

【0035】

以下の説明は、本発明の様々な実施形態を作製し使用するために用いられる物質や方法の説明に役立つ実例を提供する。

【0036】

腫瘍認識Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)遺伝子を用いた遺伝子工学によって、多数のＴＲ-ＣＤ４を効率的に産生する方法を開発するために、３つのＴＲ-ＣＤ４クローンに由来する完全長のＴＣＲ遺伝子が、５'-ＲＡＣＥ-ＰＣＲ技術を使用してクローン化され、配列決定された。以下のＴＣＲが作製された：
１．ＨＬＡ-ＤＲＢ１*０１-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１:９６-１０６-特異的ＴＲ-ＣＤ４
（本明細書では、クローン「ＳＢ９５」と呼ばれる）
２．ＨＬＡ-ＤＰＢ１*０４-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１７０-特異的ＴＲ-ＣＤ４
（本明細書では、クローン「５Ｂ８」と呼ばれる）
３．ＨＬＡ-ＤＰＢ１*０４-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１７０-特異的ＴＲ-ＣＤ４
（本明細書では、クローン「ＪＭ」と呼ばれる）

【0037】

ＳＢ９５とＪＭに由来するＴＣＲ遺伝子が、レトロウイルス発現ベクター(ＭＳＣＶ-由来ｐＭＩＧ-IIあるいはｐＭＩＧ-ｗベクター等)に挿入された。５Ｂ８ＴＣＲ-発現ベクターが同じ方法で作られた。

【0038】

これらのＴＣＲ遺伝子のレトロウイルスによる形質導入は、健康な個体から得た末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)由来の多クローン性に増殖したＴ細胞に、同族ペプチドに対する反応性を効率的に導入した。以下に示されるヌクレオチドとアミノ酸配列は、本発明を実証するために使用されたものを表す。本発明は、本明細書に記載されたＴＣＲコンストラクトのアミノ酸配列をコードするあらゆるポリヌクレオチド配列を含む。さらに、前記ＴＣＲ中のアミノ酸配列におけるバリエーションが、それらが前記ＴＣＲの機能に悪影響を与えない限り、予期される。様々な実施形態において、本発明の組換えＴＣＲを発現する細胞が、ＮＹ-ＥＳＯ-１を発現する腫瘍細胞を直接及び特異的に認識できる限り（ここで、認識は、ＮＹ-ＥＳＯ-１の発現及び、腫瘍細胞によるＨＬＡクラスII拘束様式においてそれから加工されたペプチドの提示に依存する）、本明細書に提示された配列と比較して一以上のアミノ酸の変化を含むＴＣＲは、保存的アミノ酸置換または他の置換、追加あるいは削除を含むであろう。複数の実施形態において、本発明のＴＣＲは、抗原提示細胞の関与なしで、腫瘍細胞上の腫瘍抗原の直接認識を促進するアミノ酸配列を含む。複数の実施形態において、本開示によって提供されるＴＣＲのアミノ酸配列は、本開示の一部である配列表において提供されたアミノ酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同様である。様々な実施形態において、本発明のＴＣＲは、同じエピトープについて、自然発生的なＴＲ-ＣＤ４のＴＣＲによって示される同族エピトープのためのＫ_off値と本質的に同じである、本明細書で定義されたその同族エピトープのためのＫ_off値を有することができる。複数の実施形態において、前記ＴＣＲアミノ酸配列は、それらの定常領域における変更を含むことができる。これに関連して、当該分野において、一般に、ＴＣＲの定常領域が抗原認識に実質的に寄与しないことが知られている。例えば、ＴＣＲのヒト定常領域の一部を、マウス配列に置き換えて、ＴＣＲの機能を保持することは可能である（例えば、Goff SL et al. (2010) Cancer Immunology, Immunotherapy, 59: 1551-1560参照）。それゆえ、本明細書に開示されたＴＣＲ配列の様々な修正が予期され、それは、特定の鎖の組み合わせを改良する、またはＣＤ３複合体のＴ細胞シグナルタンパク質とのより強い会合を促進する、または内因性と導入されたＴＣＲ間の二量体の形成を阻害する変更を含むが、これらに限定されない。複数の実施形態において、前記アミノ酸の変更は、ＣＤＲ領域(ＣＤＲ３領域等)中に存在してもよく、ＣＤＲ３配列中の、１，２，３またはより多くのアミノ酸の置換を含むが、必ずしもそれらに限定されない。複数の実施形態において、前記アミノ酸の変更は、前記ＴＣＲの機能に影響を及ぼさない。

【0039】

特定の具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列は以下の通りであり、当該ポリヌクレオチド配列中の翻訳開始及び終始コドンは太字で表される：
「ＪＭ」 ＨＬＡ-ＤＰＢ１*０４０１/０４０２-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170-特異的腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン
（ａ） ＴＣＲα及びβ鎖のｃＤＮＡヌクレオチド配列

【数1】

（ｂ）ＴＣＲα及びβ鎖のアミノ酸配列（ＴＣＲ可変領域はイタリック体、ＣＤＲ３領域は太字で表される）

【数2】

「５Ｂ８」ＨＬＡ-ＤＰＢ１*０４０１/０４０２-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１_157-170-特異的腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン
（ａ）ＴＣＲα及びβ鎖のｃＤＮＡヌクレオチド配列

【数3】

（ｂ）ＴＣＲα及びβ鎖のアミノ酸配列（ＴＣＲ可変領域はイタリック体、ＣＤＲ３領域は太字で表される）

【数4】

「ＳＢ９５」ＨＬＡ-ＤＲＢ１*０１０１-拘束ＮＹ-ＥＳＯ-１_95-106-特異的腫瘍認識ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローン
（ａ）ＴＣＲα及びβ鎖のｃＤＮＡヌクレオチド配列

【数5】

（ｂ）ＴＣＲα及びβ鎖のアミノ酸配列（ＴＣＲ可変領域はイタリック体、ＣＤＲ３領域は太字で表される）

【数6】

【0040】

ＴＣＲ発現ベクターの説明
ウイルス形質導入は、マウス幹細胞ウイルスベクターｐＭＳＣＶ-由来プラスミド(ｐＭＩＧ-IIやｐＭＩＧ-ｗ等)を使用して行われた（図６Ａ）。ＴＣＲ-発現コンストラクトは、ｐＭＩＧプラスミドのマルチクローニングサイト(ＭＣＳ)に挿入された。ｐＭＩＧプラスミドは、形質導入の有効性が、ＧＦＰ発現によってモニターできるように、マルチクローニングサイトの後にＩＲＥＳ-ＧＦＰを有する。

【0041】

ＴＣＲα及びβ鎖タンパク質の等モル発現を誘発するために、ＴＣＲα及びβ鎖をコードするｃＤＮＡがＰ２Ａ翻訳スキッピングサイトを含むリンカー配列によって連結された（図６Ｂ(I)）。この配列を使用して、ｍＲＮＡが一つの配列として転写された。Ｐ２Ａ配列によるリボソーム・スキッピングのため、２つのタンパク質が前記ｍＲＮＡから翻訳され、ＴＣＲβ-Ｐ２Ａ融合タンパク質及びＰ(Pro)-ＴＣＲα鎖タンパク質を産生した。

【0042】

ＴＣＲ発現カセット(I)におけるＴＣＲβ鎖タンパク質の後に付加されたＰ２Ａペプチドによる潜在的な機能阻害を避けるために、ＴＣＲβ鎖遺伝子の後にフューリンプロテアーゼ認識サイト(ＲＡＫＲ)を導入するもう一つのＴＣＲ発現カセットが構築された（図６Ｂ(II)）。この発現カセットにおいて、ＴＣＢβ鎖タンパク質の後の付加ペプチドが、フューリンプロテアーゼ-介在切断によって除去され、その結果、最小の改変を伴うＴＣＲα及びβ鎖タンパク質が発現する。特に、ＲＡＫＲ配列有りまたは無しの発現カセットにおいて、本明細書に示される配列と比べて、アミノ酸は除去されない。しかしながら、ＲＡＫＲ無しのカセットでは（図６Ｂ(I)）、ＧＳＧリンカーとＰ２Ａ配列がβ鎖のＣ末端に付加され、プロリン(Ｐ２Ａ由来)が、α鎖のＮ末端に付加される。ＲＡＫＲ有りのカセットでは（図６Ｂ(II)）、アルギニン(ＲＡＫＲ由来)がβ鎖のＣ末端に付加され、プロリン(Ｐ２Ａ由来)が、α鎖のＮ末端に付加される。このように、いくつかの実施形態では、前記発現ベクターがＴＣＲアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態ではＴＣＲアミノ酸配列のみが、本明細書に示されるＴＣＲアミノ酸から選択される。

【0043】

前記ＴＣＲ発現配列は、ｐＭＩＧプラスミドのマルチクローニングサイトにクローン化された。レトロウイルスは、クロンテック社(Clontech)から販売されているＧＰ２-２９３とＰＴ６７パッケージング細胞株を使用して、一時的にまたは安定的に製造された。手短に説明すると、ＧＰ２-２９３は、ウイルスｇａｇ-ｐｏｌ遺伝子を安定に発現し、それらはｐＭＩＧとｐＶＳＶ-Ｇの同時導入後、一時的にＶＳＶ-Ｇウイルス・エンベロープ発現プラスミドを製造する。ＰＴ６７は、ウイルスｇａｇ-ｐｏｌ及び１０Ａ１ウイルス・エンベロープ遺伝子を安定に発現する。ＧＰ２-２９３から製造されたレトロウイルスによる感染後、ＰＴ６７は、ｐＭＩＧ由来の発現コンストラクトと一体化され、それゆえ安定的に(持続的に)レトロウイルスを産生する。一実施形態では、５'-ＬＴＲ(末端反復配列)のプロモーター活性は、導入遺伝子発現を行わせるために使用される。しかしながら、ＥＦ-１αプロモーター等の他のプロモーターが、導入遺伝子発現の増強のために導入されることができる。

【0044】

ＰＢＭＣ-由来Ｔ細胞へのレトロウイルスの感染
ＰＢＭＣ(全細胞)が、密度勾配分離法によって得られ、使用するまで、９０％のウシ胎児血清(ＦＢＳ)と１０％のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中で、液体窒素タンク中で保管された。ＰＢＭＣ(３-４×１０⁶細胞/ウェル；２４-ウェル培養プレート)は、培地(１０％ＦＢＳ、Ｌ-グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン及びヒト組換えＩＬ-２を含むＲＰＭＩ１６４０培地)中で２日間、１０μｇ/ｍＬのフォトヘマグルチニン(ＰＨＡ)によって多クローン的に活性化された。１００μＬ培地中の１×１０⁵のプレ活性化ＰＢＭＣが、ＰＢＳ中の２０〜２５μｇ/ｍＬのレトロネクチンでプレコートされ、ＰＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)でブロックされた９６ウェル培養プレートのウェルに添加された。いくつかの実験では、５μｇ/ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体(クローン：ＯＫＴ３)が、レトロネクチンとともにコートされた。１００μＬのレトロウイルスを含む上清が、ＰＢＭＣに添加され２４時間インキュベートされた。レトロウイルス感染は、２４時間ごとに２〜３回実施された。感染後、細胞は１０〜１４日間増殖され、機能分析のために使用された。

【0045】

結果

【0046】

高力価レトロウイルス産生ＰＴ６７クローンが樹立された。以下のレトロウイルス産生クローンが樹立された。
（１）ｐＭＩＧ-II/ＪＭ-ＴＣＲ(II)
（２）ｐＭＩＧ-II/ＳＢ９５-ＴＣＲ(II)
（３）ｐＭＩＧ-ｗ/ＪＭ-ＴＣＲ(I)
（４）ｐＭＩＧ-ｗ/ＳＢ９５-ＴＣＲ(I)
（５）ｐＭＩＧ-ｗ/ＪＭ-ＴＣＲ(II)
（６）ｐＭＩＧ-ｗ/ＳＢ９５-ＴＣＲ(II)

【0047】

上に列挙されたリストにおいて、（I）及び（II）は、図６Ｂにそれぞれ示されるように、フューリンプロテアーゼ認識サイト(ＲＡＫＲ)無し及び有りの発現カセットである。ジャーカット細胞への単独感染後のＧＦＰ発現によって測定された形質導入の有効性は、(１)で６０％、(２)で５５％、(３)で７５％、(４)で７５％、(５)で６４％；及び(６)で６２％であった。

【0048】

レトロウイルスベクター(１)及び(２)は、多クローン性に活性化されたＰＢＭＣに導入された。ＧＦＰ発現によって測定された形質導入の有効性は、約４０〜５０％であった。レトロウイルスによって発現されたＴＣＲの反応性は、元のＴＲ-ＣＤ４クローンによって認識される同じＮＹ-ＥＳＯ-１-由来同族ペプチド(ＳＢ９５-ＴＣＲについてはＮＹ-ＥＳＯ-１:９１-１１０、及びＪＭ-ＴＣＲについてはＮＹ-ＥＳＯ-１:１５７-１７０)に対してテストされた。ペプチド-非パルス標的細胞よりも、ペプチド-パルス標的細胞に対して、有意に多いＩＦＮ-γが産生され（図７）、これはクローン化ＴＣＲ遺伝子が、それらがウイルスベクターによって形質導入された際、元のＴＲ-ＣＤ４クローンと同じ抗原特異性を導入する機能があることを実証する。残りのＴＣＲ発現ベクターの機能テストは、同じ方法(本明細書に開示されたＴＣＲ遺伝子を移入するレトロウイルスで、活性化ヒト末梢血単核細胞を感染させることによって等)で実施されることができる。ＴＣＲ遺伝子が形質導入された細胞及び形質導入されなかった細胞は、ＮＹ-ＥＳＯ-１-発現細胞株または腫瘍サンプル、及び、適切な手段(ＥＬＩＳＡ等)を使用して測定される当該形質導入細胞によって産生されたＩＦＮ-γとともに、２４時間共培養されることができる。ＴＣＲ遺伝子が形質導入された細胞による、上清中のＩＦＮ-γ濃度は、ＮＹ-ＥＳＯ-１を発現する細胞又はＮＹ-ＥＳＯ-１ペプチドパルス細胞とともに共培養された際により高くなり、他方、ＮＹ-ＥＳＯ-１を発現しない細胞とともに共培養された細胞は、有意に少ないＩＦＮ-γ産生を示すであろう。同様に、形質導入無しの細胞等のネガティブコントロールは、有意に少ないＩＦＮ-γ産生を示すであろう。このように、代表的な組換えＴＣＲの遺伝子導入は、癌細胞上のＮＹ-ＥＳＯ-１抗原を直接認識する同じ抗原特異性を有するという細胞の能力をもたらすであろう（前記細胞は、その中に当該ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）。

【0049】

本発明は、説明の目的のために詳細に記載されてきたが、そのような詳細は単に説明の目的のためであり、続く特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、当業者によって変更が加えられてもよいことが理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]