特許 6615063 ノロウイルスに対して防御免疫応答を付与する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6615063

(24)【登録日】2019年11月15日

(45)【発行日】2019年12月4日

(54)【発明の名称】ノロウイルスに対して防御免疫応答を付与する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/125 20060101AFI20191125BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20191125BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20191125BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20191125BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20191125BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20191125BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20191125BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20191125BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20191125BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/125ZMD

   A61K39/39

   A61K47/36

   A61K47/32

   A61K47/38

   A61K47/42

   A61K9/14

   A61K9/08

   A61P31/14

【請求項の数】19

【外国語出願】

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2016-149168(P2016-149168)

(22)【出願日】2016年7月29日

(62)【分割の表示】特願2014-95094(P2014-95094)の分割

【原出願日】2008年9月18日

(65)【公開番号】特開2016-196502(P2016-196502A)

(43)【公開日】2016年11月24日

【審査請求日】2016年8月18日

(31)【優先権主張番号】60/973,389

(32)【優先日】2007年9月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/986,826

(32)【優先日】2007年11月9日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507028479

【氏名又は名称】タケダ ワクチン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】リチャードソン，チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェドヴィック，トーマス エス．

(72)【発明者】

【氏名】フォーベルト，トーマス アール．

(72)【発明者】

【氏名】ティノ，ウィリアム

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０８１４４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 LigoCyte Pharmaceuticals, Inc.，LIGOCYTE PHARMACEUTICALS INITIATES U.S. CLINICAL TRIAL OF NOROVIRUS VACCINE，[online]，２００７年 ４月 ３日，[２０１２年１月２８日検索]，インターネット，ＵＲＬ，http://www.ligocyte.com/news/documents/LIGOCYTE-PHARMACEUTICALS-4-3-2007.pdf

【文献】 Ball JM, et al.，Recombinant Norwalk virus-like particles given orally to volunteers: phase I study，Gastroenterology，１９９９年 ７月，Vol.117, No.1，p.40-48

【文献】 Biomolecular Engineering，２００１年，Vol.18, No.3，p.69-85

【文献】 Ball JM, et al.，Recombinant Norwalk virus-like particles as an oral vaccine，Archives of Virology. Supplementa，１９９６年，Vol.12，p.243-249

【文献】 Tacket CO, et al.，Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus-like particles in volunteers，Clinical Immunology，２００３年，Vol.108, No.3，p.241-247

【文献】 Vaccine，２００６年，Vol.24, No.24，p.5220-5234

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのノロウイルス遺伝子群Ｉウイルス株からのノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）および少なくとも１つのノロウイルス遺伝子群ＩＩウイルス株からのノロウイルスＶＬＰを含む、ヒトにおいてノロウイルス感染に対する防御免疫を誘発するためのワクチン組成物であって、前記ノロウイルスＶＬＰの少なくとも１つのタイプが、前記組成物中に１投与あたり約１５μｇ〜約５０μｇの用量で存在し、全ノロウイルスＶＬＰ抗原が、前記組成物中に１投与あたり約３０μｇ〜約２００μｇの用量で存在する、ワクチン組成物。

【請求項2】

前記ノロウイルスＶＬＰが一価ＶＬＰである、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

第１のノロウイルスＶＬＰがノーウォークウイルスＶＬＰであり、第２のノロウイルスＶＬＰがヒューストンウイルスＶＬＰである、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

前記ワクチンが送達剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

前記送達剤が生体付着剤である、請求項４に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

前記生体付着剤が粘膜付着剤である、請求項５に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

前記粘膜付着剤が、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ペクチン、ムチン、アルギン酸塩、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質、およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン組成物。

【請求項8】

前記粘膜付着剤が多糖である、請求項７に記載のワクチン組成物。

【請求項9】

前記多糖が、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基である、請求項８に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

前記ワクチンがアルミニウム塩をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

前記ワクチンが粉末製剤である、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項12】

前記ワクチンが液体製剤である、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項13】

前記ワクチンが、粘膜、鼻腔内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、真皮下、および経皮投与経路からなる群から選択される経路によってヒトに投与される、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項14】

前記ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項１３に記載のワクチン組成物。

【請求項15】

前記ワクチンが、鼻通路の近くに保持される前記ワクチンを含む１つ以上のデバイスからの鼻道内における迅速な被着によって、鼻粘膜に投与される、請求項１４に記載のワクチン組成物。

【請求項16】

前記ワクチンが、一方または両方の鼻孔に投与される、請求項１５に記載のワクチン組成物。

【請求項17】

前記ノロウイルスＶＬＰが、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約８０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項18】

前記ノロウイルスＶＬＰが、前記組成物中に１投与あたり約１００μｇ以下の用量で存在する、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項19】

前記ワクチンが、ノロウイルス感染の１つ以上の症状に対して防御する、請求項１に記載のワクチン組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／９７３，３８９号および２００７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９８６，８２６号（それらの全体が参照により本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、ワクチン、特に、ノロウイルスのワクチンの分野に属する。加えて、本発明は、ワクチン組成物を調製する方法および防御免疫応答を誘導する方法に関する。

【0003】

政府支援についての陳述
本発明は、契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−０５−Ｃ−０１３５において、US Army Medical Research and Material Commandの政府支援によって成された。政府は、本発明に対し一定の権利を有することができる。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎の集団発生の最も重要な原因として出現する培養不可のヒトカリシウイルスである（Glass et al., 2000; Hardy et al, 1999）。高感度の分子診断アッセイが開発される以前は、ノロウイルスの臨床的意義が正しく評価されていなかった。原型の遺伝子群Ｉノーウォークウイルス（Norwalk virus）（ＮＶ）ゲノムのクローニングおよび組み換えバキュロウイルス発現システムからのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生によって、広範な局面でのノロウイルスの感染を明らかにするアッセイが開発された（Jiang et al. 1990;1992）。

【0005】

ノロウイルスは、非分節ＲＮＡゲノムを含有する一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、３つのオープンリーディングフレームをコードし、後方の２つのフレームは、それぞれ、メジャーなカプシドタンパク質およびマイナーな構造タンパク質の産生を指令する（Glass et al. 2000）。真核細胞発現系において高レベルで発現させる場合、ＮＶ、および他の所定のノロウイルスのカプシドタンパク質が自己アセンブルして、天然のノロウイルスビリオンに構造的に類似するＶＬＰを形成する。透過型電子顕微鏡で観察する場合、ＶＬＰは、ヒト糞便サンプルから単離される感染性ビリオンとは形態学的に区別できない。

【0006】

ノロウイルスに対する免疫応答は複雑であり、防御に関して相関する事柄が、現在解明されつつある。天然のウイルスによって実施されたヒト志願者試験によって、粘膜から誘導されるメモリー免疫応答が感染に対して短期間の防御を提供することが実証され、ワクチンを仲介する防御が可能であることが示唆された（Lindesmith et al. 2003;Parrino et al. 1997;Wyatt et al, 1974）。

【0007】

ノロウイルスをインビトロで培養することはできないが、ＶＬＰが入手可能であり、それらを多量に産生させることが可能であるため、ノロウイルスカプシドの抗原および構造としての仕組みの定義が、かなり進められた。ＶＬＰは、ウイルスカプシドタンパク質の真正の高次構造を保存する一方、感染性の遺伝子材料が欠如する。従って、ＶＬＰは、ウイルスと細胞受容体との機能的相互作用を模倣し、それによって、適切な宿主免疫応答を誘発する一方、複製または感染を引き起こす能力を欠く。ＮＩＨとの共同で、Baylor College of Medicineでは、学術的な研究者主導型（investigator-sponsored）の第Ｉ相臨床治験において、ヒト志願者のＮＶ ＶＬＰに対する体液性、粘膜および細胞性免疫応答に関する試験が行われた。経口投与されたＶＬＰは、健常な成人において安全かつ免疫原性である（Ball et al. 1999;Tacket et al. 2003）。他の学術的な施設では、動物モデルの前臨床実験により、細菌外毒素アジュバントを鼻腔内に投与した場合、ＶＬＰに対する免疫応答が増強されることが実証された（Guerrero et al. 2001;Nicollier-Jamot et al. 2004;Periwal et al. 2003;Souza et al. (2007) Vaccine, doi:10.1016/j.vaccine.2007.09.040）。しかし、いずれの試験においても、何らかのノロウイルスワクチンを使用して、ノロウイルスに対する防御免疫を達成することが可能であることについては報告されていない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の概要
本発明は、少なくとも１つのノロウイルス抗原を含むワクチンを投与することを含む、被験体、特に、ヒト被験体におけるノロウイルス感染に対する防御免疫を誘導する方法を提供する。一実施形態では、抗原はノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。本発明の方法において使用されるワクチンは、１つ以上のアジュバントをさらに含んでもよい。ノロウイルスＶＬＰは、遺伝子群Ｉもしくは遺伝子群ＩＩのウイルスまたはそれらの混合物から選択することができる。一実施形態では、ワクチンは、約０．０１％〜約８０重量％の濃度でノロウイルスＶＬＰを含む。別の実施形態では、ワクチンは、１用量あたり約１μｇ〜約１００ｍｇの用量のノロウイルスＶＬＰを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、抗原取り込みを増強するか、デポー効果を提供するか、送達部位における抗原保持時間を増加するか、または送達部位における細胞タイトジャンクションの弛緩を介して免疫応答を増強するように機能する送達剤をさらに含む。送達剤は、生体付着剤、好ましくは、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ペクチン、ムチン、アルギン酸塩、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質、およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される粘膜付着剤であり得る。好ましくは、粘膜付着剤は多糖である。より好ましくは、粘膜付着剤は、キトサン、またはキトサン塩もしくはキトサン塩基などのキトサンを含有する混合物である。

【0010】

他の実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。前記アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、合成脂質Ａ、脂質Ａ擬似体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロソーム（virosomes）、コキレート（cochleate）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、ポロキサマー粒子、微小粒子、内毒素、例えば、細菌内毒素およびリポソームからなる群から選択されてもよい。好ましくは、アジュバントはｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。より好ましくは、アジュバントはＭＰＬ（登録商標）である。

【0011】

本発明の方法は、液体または乾燥粉末として処方されたノロウイルスワクチンを投与することを含む。乾燥粉末製剤は、直径約１０〜約５００マイクロメートルの粒度を含有してもよい。ワクチンを投与するための適切な経路は、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下（subcutaneous）、皮内、真皮下（subdermal）、または経皮経路を含む。特に、投与経路は、筋肉内または粘膜経路であってもよく、好適な粘膜投与経路は、鼻腔内、経口、もしくは膣投与経路を含む。別の実施形態では、ワクチンは、点鼻スプレー、点鼻薬、または乾燥粉末として処方され、ここで、ワクチンは、鼻通路の近くに保持される前記ワクチンを含有するデバイスからの鼻道内における迅速な被着によって投与される。別の実施形態では、ワクチンは、一方または両方の鼻孔に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ノーウォークウイルス（Norwalk virus）（ＮＶ）−特異的ＩｇＧが、乾燥粉末ＶＬＰで免疫したウサギにおいて誘発されることを示す。ウサギに、鼻腔内投与経路を介して５０μｇのＮＶ−ＶＬＰおよび５０μｇのＭＰＬを３回、１、２２および４３日目（矢印）に投与した。示された日に、ＥＬＩＳＡによって、各ウサギ由来の血清を、ＮＶ−ＶＬＰ−特異的ＩｇＧについて試験した。ＶＬＰをワクチン接種したウサギにおいてのみＮＶ−ＶＬＰ−特異的ＩｇＧが認められたが、非処置およびプラセボ処置群では、検出可能な抗原−特異的抗体が認められなかった（データ示さず）。応答の算術平均を示し、Ｕ／ｍＬ（１Ｕ 約１μｇ）で表す。棒は、平均の標準誤差を示す。

【図2】対照（アジュバント／賦形剤）、または３種類の用量のノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＶＬＰ（５、１５、もしくは５０μｇ）のうちの１つを含有するワクチン製剤で免疫したヒト志願者由来の血清ＩｇＡ（パネルＡ）およびＩｇＧ（パネルＢ）レベルを測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。用量レベルのそれぞれについて、２回目の免疫化の３５日後（５６日目）における抗ＶＬＰ力価の増加倍率の幾何平均を示す。志願者には０および２１日目に免疫化を行った。

【図3】５０μｇの用量のノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＶＬＰまたは対照（アジュバント／賦形剤）を伴うワクチン製剤を投与されたヒト志願者におけるＩｇＡ（パネルＡ）およびＩｇＧ（パネルＢ）抗体分泌細胞（ＡＳＣ）のレベルを示す。１０^６個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）あたりのＡＳＣの幾何平均（ＧＭＮ）を、試験日（７日目または２８日目）、具体的には、免疫化の７日後に対してプロットする。志願者には０および２１日目に免疫化を行った。

【発明を実施するための形態】

【0013】

発明の詳細な説明
本発明は、被験体においてノロウイルス感染に対する防御免疫を誘発する方法に関する。特に、本発明は、ノロウイルスＶＬＰおよび少なくとも１つのアジュバントを含むワクチンをヒトに投与する方法を提供し、ここで、ワクチンは、ノロウイルス感染の少なくとも１つの症状に対して防御する。それに加えて、またはその代わりに、ワクチンは、少なくとも１つの送達剤をさらに含んでもよい。

【0014】

ノロウイルス抗原
本発明は、１つ以上のノロウイルス抗原を含む組成物を提供する。「ノロウイルス（Norovirus）」、「ノロウイルス（ＮＯＲ）」、「ノロウイルス（norovirus）」および文法的均等物は、本明細書において、カリシウイルス（Caliciviridae）科のノロウイルス（Norovirus）属のメンバーである。いくつかの実施形態では、ノロウイルスは、関連するプラス−センス一本鎖ＲＮＡ、ヒトまたは非ヒト哺乳動物種に対して感染性であり得る非エンベロープウイルスの群を含むことができる。いくつかの実施形態では、ノロウイルスは、ヒトにおいて急性胃腸炎を引き起こす。ノロウイルスはまた、電子顕微鏡で観察した場合、はっきりした表面構造または不規則な辺縁を有する小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）と称することができる。１５の遺伝子クラスターを含む核酸およびアミノ酸配列によって定義される少なくとも４つの遺伝子群（ＧＩ〜ＩＶ）もノロウイルス内に含まれる。主な遺伝子群はＧＩおよびＧＩＩである。ＧＩＩＩおよびＧＩＶが提唱されるが、一般的に受け入れられる。ＧＩＩＩの代表はウシのジェナ（Jena）株である。ＧＩＶは、この時点で、１つのウイルス、アルファトロン（Alphatron）を含有する。ノロウイルスのさらなる記載については、Vinje et al. J. Clin. Micro. 41:1423-1433 (2003)を参照のこと。「ノロウイルス」とは、本明細書において、組み換えノロウイルスウイルス様粒子（ｒＮＯＲ ＶＬＰ）をも意味する。いくつかの実施形態では、細胞中における、少なくともＯＲＦ２によってコードされるノロウイルスカプシドタンパク質の組み換え発現により（例えば、Ｓｆ９細胞中におけるバキュロウイルスベクター由来の）、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的自己アセンブルを生じさせることができる。いくつかの実施形態では、細胞中における、少なくともＯＲＦ１およびＯＲＦ２によってコードされるノロウイルスタンパク質の組み換え発現により（例えば、Ｓｆ９細胞中のにおけるバキュロウイルスベクター由来の）、カプシドタンパク質のＶＬＰへの自発的自己アセンブルを生じさせることができる。ＶＬＰは、構造的にノロウイルスに類似するが、ウイルスＲＮＡゲノムが欠如し、従って、感染性はない。従って、「ノロウイルス」は、欠損粒子を含む感染性または非感染性であり得るビリオンを含む。

【0015】

ノロウイルスの非限定的例として、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）（ＮＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８７６６１， ＮＰ_{０５６８２１}）、サウサンプトンウイルス（Southampton virus）（ＳＨＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ０７４１８）、デザートシールドウイルス（Desert Shield virus）（ＤＳＶ， Ｕ０４４６９）、ヘッセウイルス（Hesse virus）（ＨＳＶ）、チバウイルス（Chiba virus）（ＣＨＶ， ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０４２８０８）、ハワイウイルス（Hawaii virus）（ＨＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ０７６１１）、スノーマウンテンウイルス（Snow Mountain virus）（ＳＭＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ７００５９）、トロントウイルス（Toronto virus）（ＴＶ， Leite et al, Arch. Virol. 141:865-875）、ブリストルウイルス（Bristol virus）（ＢＶ）、ジェナウイルス（Jena virus）（ＪＶ， ＡＪ０１０９９）、メリーランドウイルス（Maryland virus）（ＭＶ， ＡＹ０３２６０５）、セトウイルス（Seto virus）（ＳＶ， ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０３１０１３）、キャンバーウェル（Camberwell）（ＣＶ， ＡＦ１４５８９６）、ローズデールウイルス（Lordsdale virus）（ＬＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ８６５５７）、グリムズビーウイルス（Grimsby virus）（ＧｒＶ， ＡＪ００４８６４）、メキシコウイルス（Mexico virus）（ＭＸＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２２４９８）、ボクサー（Boxer）（ＡＦ５３８６７９）、Ｃ５９（ＡＦ４３５８０７）、ＶＡ１１５（ＡＹ０３８５９８）、ＢＵＤＳ（ＡＹ６６０５６８）、ヒューストンウイルス（Houston virus）（ＨｏＶ， ＡＹ５０２０２３）、ＭＯＨ（ＡＦ３９７１５６）、パリス・アイランド（Parris Island）（ＰｉＶ； ＡＹ６５２９７９）、ＶＡ３８７（ＡＹ０３８６００）、ＶＡ２０７（ＡＹ０３８５９９）、およびオペレーション・イラク・フリーダム（Operation Iraqi Freedom）（ＯＩＦ， ＡＹ６７５５５４）が挙げられる。それぞれの核酸および対応するアミノ酸配列はすべて、それらの全体が参照により援用される。いくつかの実施形態では、同定目的のための記号を使用することができ、系統化される：ウイルスが単離された宿主種／属の略号／種の略号／株の名称／発生年／由来する国。（Green et al, Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol.1, 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)）。ノーウォークウイルス（Norwalk virus）、スノーマウンテンウイルス（Snow Mountain virus）、およびヒューストンウイルス（Houston virus）が、いくつかの実施形態において好適である。

【0016】

ノロウイルス抗原は、ペプチド、タンパク質、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態であってもよい。好適な実施形態では、ノロウイルス抗原はＶＬＰを含む。本明細書において使用する「ウイルス様粒子またはＶＬＰ」は、ノロウイルスのカプシドタンパク質コード配列から産生され、感染性ノロウイルス粒子の抗原特徴に類似の特徴を含むウイルス様粒子、フラグメント、凝集体、またはそれらの部分を指す。ノロウイルス抗原はまた、ＶＬＰのカプシド単量体、カプシド多量体、タンパク質もしくはペプチドフラグメント、またはそれらの凝集体もしくは混合物の形態であってもよい。ノロウイルス抗原タンパク質またはペプチドもまた、変性形態であってもよく、当該技術分野において公知の方法を使用して、産生されてもよい。

【0017】

本発明のＶＬＰは、当該技術分野において標準的な方法を使用して、ＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質などの全長ノロウイルスカプシドタンパク質あるいは所定のＶＰ１誘導体もしくはＶＰ２誘導体のいずれかから形成させることができる。あるいは、ＶＬＰを形成させるために使用されるカプシドタンパク質は、切断型カプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、例えば、ＶＬＰの少なくとも１つは、トランケート型ＶＰ１タンパク質を含む。他の実施形態では、すべてのＶＬＰは、トランケート型ＶＰ１タンパク質を含む。トランケーションは、Ｎ末端トランケーションであっても、またはＣ末端トランケーションであってもよい。トランケート型カプシドタンパク質は、適切には、機能的カプシドタンパク質誘導体である。機能的カプシドタンパク質誘導体は、（必要であれば、適切にアジュバント化された場合に）全長カプシドタンパク質からなるＶＬＰによって免疫応答が惹起されるのと同じ方法で、免疫応答を惹起することが可能である。

【0018】

ＶＬＰは、メジャーなＶＰ１タンパク質および／またはマイナーなＶＰ２タンパク質を含有し得る。好ましくは、各ＶＬＰは、一価ＶＬＰを生じる単一のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質を含有する。本明細書において使用する用語「一価の」は、抗原性タンパク質が、単一のノロウイルス遺伝子群に由来することを意味する。例えば、ＶＬＰは、遺伝子群Ｉのウイルス株由来のＶＰ１および／またはＶＰ２（例えば、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）由来のＶＰ１およびＶＰ２）を含有する。好ましくは、ＶＬＰは、優勢なＶＰ１タンパク質を含む。本発明の一実施形態では、抗原は、一価ＶＬＰの混合物であって、ここで、組成物は、複数のウイルス株から採取された、異なるノロウイルス遺伝子群（例えば、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）およびヒューストンウイルス（Houston virus））由来のＶＰ１およびＶＰ２を含むＶＬＰと混合された単一のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１およびＶＰ２を含むＶＬＰを含む。単なる例として、組成物は、ノロウイルス遺伝子群ＩＩの１つ以上の株由来の一価ＶＬＰと共に、ノロウイルス遺伝子群Ｉの１つ以上の株由来の一価ＶＬＰを含有することができる。好ましくは、ノロウイルスＶＬＰ混合物は、ノーウォークおよびヒューストンノロウイルスの株からなる。

【0019】

しかし、本発明の代替実施形態では、ＶＬＰは、例えば、あるノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質と第２のノロウイルス遺伝子群由来のＶＰ１および／またはＶＰ２タンパク質とを混合したものを含む多価ＶＬＰであってもよく、ここで、異なるＶＰ１およびＶＰ２タンパク質は、キメラのＶＰ１およびＶＰ２タンパク質ではないが、同じカプシド構造内で共に会合して、免疫原性ＶＬＰを形成する。本明細書において使用する用語「多価の」は、抗原性タンパク質が、２つ以上のノロウイルス遺伝子群または株に由来することを意味する。多価ＶＬＰは、２つ以上のウイルス株から採取されるＶＬＰ抗原を含有してもよい。単なる例として、組成物は、ノロウイルス遺伝子群ＩＩの１つ以上の株（例えば、ヒューストンウイルス（Houston virus））由来のカプシド単量体または多量体と共にノロウイルス遺伝子群Ｉ（例えば、ノーウォークウイルス（Norwalk virus））の１つ以上の株由来のカプシド単量体または多量体からなる多価ＶＬＰを含有することができる。好ましくは、多価ＶＬＰは、ノーウォークおよびヒューストンノロウイルスの株由来のカプシドタンパク質を含有する。

【0020】

組成物内の一価または多価ＶＬＰの組み合わせは、好ましくは、各ＶＬＰタイプの免疫原性を減少しない。特に、本発明の組み合わされたＶＬＰ組成物が、ワクチンにおいて提示されるそれぞれのノロウイルス遺伝子型ごとに、感染に対する免疫を誘発することが可能であるように、本発明の組み合わせにおいてノロウイルスＶＬＰ間で干渉が生じないことが好ましい。適切には、組み合わせ中の所与のＶＬＰタイプに対する免疫応答は、個々に測定する場合、同じＶＬＰタイプの免疫応答の少なくとも５０％、好ましくは、１００％または実質的に１００％である。免疫応答は、適切には、例えば、本明細書の実施例において例示するように、抗体応答によって、測定してもよい。

【0021】

個々のカプシドタンパク質を個別に発現させることによって多価ＶＬＰを産生させ、続いて、それらを組み合わせてＶＬＰを形成させてもよい。あるいは、同じ細胞内において、１つ以上のＤＮＡ構築物から複数のカプシドタンパク質を発現させてもよい。例えば、複数のＤＮＡ構築物を宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトしてもよく、各ベクターは異なるカプシドタンパク質をコードする。あるいは、共有のプロモーターまたは複数の個々のプロモーターによって制御される複数のカプシド遺伝子を有する単一のベクターを使用してもよい。また、適切であれば、ＩＲＥＳエレメントをベクターに組み入れてもよい。そのような発現ストラテジーを使用して、共発現されたカプシドタンパク質は、以後のＶＬＰ形成のために共精製してもよく、または自発的に多価ＶＬＰを形成させ、次いで、精製することができるようにしてもよい。

【0022】

多価ＶＬＰ産生のための好適なプロセスは、異なるノロウイルス遺伝子型由来のＶＬＰカプシドタンパク質または誘導体、例えば、ＶＰ１タンパク質を調製して、タンパク質を混合すること、およびタンパク質をアセンブルさせて、多価ＶＬＰを産生することを含む。ＶＰ１タンパク質は、粗抽出物の形態であってもよく、部分的に精製されていてもよく、または混合前に精製されていてもよい。異なる遺伝子群のアセンブルした一価ＶＬＰを、ディスアセンブルし、共に混合し、多価ＶＬＰに再アセンブルしてもよい。好ましくは、タンパク質またはＶＬＰは、組み合わせる前に、少なくとも部分的に精製される。任意選択により、アセンブル後に、多価ＶＬＰをさらに精製してもよい。

【0023】

適切には、本発明のＶＬＰは、均質かつ純粋なＶＬＰを提供するために、ＶＬＰのディスアセンブリおよび再アセンブリによって作製される。一実施形態では、多価ＶＬＰは、２つ以上のＶＬＰのディスアセンブリによって作製してもよく、続いて、再アセンブリ前の任意の適切なポイントにおいて、ディスアセンブリされたＶＬＰ成分が組み合わされる。例えば、いくつかの酵母株において生じるように、発現されたＶＰ１タンパク質からＶＬＰが自発的に形成する場合、このアプローチは適切である。ＶＰ１タンパク質の発現が、自発的なＶＬＰ形成をもたらさない場合、ＶＬＰへのアセンブリの前に、ＶＰ１タンパク質またはカプソマーの製剤を組み合わせてもよい。

【0024】

多価ＶＬＰを使用する場合、好ましくは、ＶＬＰの成分は、最終的に混合されたＶＬＰにおいてそれらが所望される割合で、混合される。例えば、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）およびヒューストンウイルス（Houston virus）（または他のノロウイルス株）由来の同量の部分精製ＶＰ１タンパク質の混合により、ほぼ等量の各タンパク質を伴う多価ＶＬＰが提供される。

【0025】

多価ＶＬＰを含む組成物は、国際公開第９８／４４９４４号、国際公開第００／４５８４１号（本明細書において参照により援用される）に記載のような当該技術分野において公知の溶液によって、安定化してもよい。

【0026】

本発明の組成物は、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質または誘導体に加えて、他のタンパク質またはタンパク質フラグメントを含んでもよい。また、他のタンパク質またはペプチドを、本発明の組成物と共に同時投与してもよい。任意選択により、組成物はまた、非ノロウイルス抗原と共に処方してもよく、または同時投与してもよい。適切には、これらの抗原は、他の疾患を防御することができる。

【0027】

ＶＰ１タンパク質または機能的タンパク質誘導体は、適切には、ＶＬＰを形成することが可能であり、ＶＬＰ製剤は、例えば、電子顕微鏡および動的レーザ光散乱などの標準的な技術によって評価することができる。

【0028】

抗原の調製
本発明の抗原分子は、生物体内で天然に存在するものを単離および精製することによって調製されるか、または組み換え技術によって調製され得る。好ましくは、ノロウイルスＶＬＰ抗原は、Ｓｆ９またはＨ５細胞などの昆虫細胞から調製されるが、さらに、大腸菌（E. coli）、もしくは酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの任意の適切な細胞、または他のピキア（Pichia）発現系、ＣＨＯもしくはＨＥＫ系などの哺乳動物細胞発現を使用してもよい。組み換え方法または合成によって調製する場合、ペプチドを構成するアミノ酸の１つ以上の挿入、欠失、逆位または置換を行ってもよい。上記の抗原のそれぞれは、好ましくは、実質的に純粋な状態で使用される。

【0029】

昆虫細胞培養におけるノロウイルスＶＬＰの産生手順については、米国特許第６，９４２，８６５号（本明細書においてその全体が参照により援用される）において先に公開されている。簡単に説明すると、ウイルスカプシド遺伝子（ＯＲＦ２）とマイナーな構造遺伝子（ＯＲＦ３）とを含有するゲノムの３’末端由来のｃＤＮＡをクローニングした。ウイルスカプシド遺伝子を担持する組み換えバキュロウイルスを、クローニングしたｃＤＮＡから構築した。ノロウイルスＶＬＰは、Ｓｆ９またはＨ５昆虫細胞培養において産生させた。

【0030】

アジュバント
本発明は、ノロウイルス抗原と共に使用するためのアジュバントを含む組成物をさらに提供する。ほとんどのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱油などの、迅速な異化作用から抗原を防御するように設計された物質、およびボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）またはヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来するタンパク質などの、免疫応答の刺激因子を含有する。適切なアジュバントは市販されており、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Pifco Laboratories, Detroit, Mich.）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）；水酸化アルミニウムゲル（alum）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁液；カチオンまたはアニオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；ならびにＱｕｉｌＡがある。

【0031】

また、適切なアジュバントとして、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａ擬似体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロソーム、コキレート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、ポロキサマー粒子、微小粒子、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アジュバントは、細菌に由来する外毒素である。また、３ＤＭＰＬまたはＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントも好適である。

【0032】

モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、サルモネラ（Salmonella）由来の脂質Ａの非毒性誘導体は、ワクチンアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Evans et al. 2003）。前臨床マウス試験では、鼻腔内ＭＰＬが、分泌性、ならびに全身性、体液性応答を増強することが示されている（Baldridge et al. 2000;Yang et al. 2002）。それはまた、１２０，０００例を超える患者の臨床試験において、ワクチンアジュバントとして安全かつ有効であることが証明されている（Baldrick et al., 2002;2004）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激し、それ故、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方、ウイルス、および寄生体を含む広範な感染性病原体に対して非特異的な免疫応答を誘発することが可能である（Baldrick et al. 2004;Persing et al. 2002）。鼻腔内製剤にＭＰＬを封入することによって、自然応答が迅速に誘導されるべきであり、ウイルス暴露（viral challenge）に対する非特異的免疫応答が誘発される一方、ワクチンの抗原成分によって生じる特異的応答が増強される。

【0033】

従って、一実施形態では、本発明は、獲得および自然免疫のエンハンサーとしてモノホスホリル脂質Ａ（MPL（登録商標））または３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（3D-MPL（登録商標））を含む組成物を提供する。化学的に、3D-MPL（登録商標）は、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと４，５または６アシル化鎖との混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好適な形態が、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（SmithKline Beecham Biologicals SA）（本明細書において参照により援用される）に開示されている。別の実施形態では、本発明は、合成脂質Ａ、脂質Ａの擬似体または類似体、例えば、BioMira製ＰＥＴ脂質Ａ、もしくはＴＬＲ−４アゴニストのように機能するように設計された合成誘導体を含む組成物を提供する。

【0034】

用語「有効アジュバント量」または「アジュバントの有効量」は、当業者によって良好に理解され、投与された抗原に対して免疫応答を刺激することが可能な１つ以上のアジュバントの量、即ち、投与された抗原組成物の免疫応答を増加する量を含み、それは、鼻洗浄液中のＩｇＡレベル、血清ＩｇＧもしくはＩｇＭレベル、またはＢおよびＴ細胞増殖について測定される。免疫グロブリンレベルにおける適切に有効な増加は、何もアジュバントを伴わない同じ抗原組成物と比較して、５％を超える、好ましくは、２５％を超える、特に、５０％を超える増加を含む。

【0035】

送達剤
本発明はまた、抗原取り込みを増強するか、デポー効果を提供するか、または送達部位における抗原保持時間を増加する（例えば、抗原の排除を遅延する）ように機能する送達剤を含む組成物を提供する。そのような送達剤は、生体付着性剤であってもよい。特に、生体付着剤は、キトサン、キトサン塩、またはキトサン塩基（例えば、キトサングルタミン酸）などの粘膜付着性剤であってもよい。

【0036】

甲殻類の外殻のキチンに由来する正に荷電した直鎖状多糖であるキトサンは、上皮細胞およびそれらの表面を覆う粘膜層のための生体付着剤である。キトサンを伴う抗原の製剤は、それらの鼻粘膜との接触時間を増加し、それ故、デポー効果による取り込みを増加する（Ilium et al. 2001;2003;Davis et al. 1999;Bacon et al. 2000;van der Lubben et al. 2001;2001;Lim et al. 2001）。キトサンは、動物モデルおよびヒトの両方においてインフルエンザ、百日咳およびジフテリアを含むいくつかのワクチンの鼻送達システムとして試験されている（Ilium et al. 2001;2003;Bacon et al. 2000;Jabbal-Gill et al. 1998;Mills et al. 2003;McNeela et al. 2004）。これらの治験では、キトサンが、全身免疫応答を非経口ワクチン接種に等価なレベルまで増強することを示した。加えて、粘膜分泌液においてもまた、有意な抗原特異的ＩｇＡレベルが測定された。それ故、キトサンは、鼻ワクチンの有効性を顕著に増強することができる。さらに、その物理学的特長のため、キトサンは、粉末として処方される鼻腔内ワクチンに特に良好に適している（van der Lubben et al. 2001;Mikszta et al. 2005;Huang et al. 2004）。

【0037】

従って、一実施形態では、本発明は、鼻腔内投与に適応された抗原またはワクチン組成物を提供し、ここで、組成物は、抗原および有効量のアジュバントを含む。好適な実施形態では、本発明は、キトサンなどの少なくとも１つの送達剤およびＭＰＬ（登録商標）、ＣＰＧ、イミキモド、ガルジキモド、あるいは合成脂質Ａまたは脂質Ａ擬似体もしくは類似体などの少なくとも１つのアジュバントとの組み合わせで、ノロウイルスＶＬＰなどのノロウイルス抗原を含む抗原またはワクチン組成物を提供する。

【0038】

キトサンの分子量は、１０ｋＤａ〜８００ｋＤａの間、好ましくは、１００ｋＤａ〜７００ｋＤａの間、より好ましくは、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの間であってもよい。組成物中のキトサンの濃度は、典型的に、約８０％（ｗ／ｗ）まで、例えば、５％、１０％、３０％、５０％、７０％または８０％である。キトサンは、好ましくは、少なくとも７５％脱アシル化、例えば、８０〜９０％、より好ましくは、８２〜８８％脱アシル化されているものであり、特定の例として、８３％、８４％、８５％、８６％および８７％脱アシル化される。

【0039】

ワクチンおよび抗原製剤
本発明の組成物は、ワクチンまたは抗原製剤としての投与のために処方することができる。本明細書において使用する用語「ワクチン」は、脊椎動物に投与することが可能な形態であり、感染を防御および／または改善するため、ならびに／あるいは感染の少なくとも１つの症状を減少させるため、ならびに／あるいは別の用量のＶＬＰもしくは抗原の効力を増強するために、免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する上記のような本発明のノロウイルスＶＬＰまたは他のノロウイルス抗原を含有する製剤を指す。本明細書において使用する用語「抗原製剤」または「抗原組成物」は、脊椎動物に投与する場合、例えば、哺乳動物が免疫応答を誘導する製剤を指す。本明細書において使用する用語「免疫応答」は、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を指す。体液性免疫応答は、例えば、感染因子を中和する、感染因子の細胞への侵入を阻止する、前記感染因子の複製を阻止する、および／または感染および破壊から宿主細胞を防御する抗体のＢリンパ球による産生を刺激することに関与する。細胞性免疫応答は、脊椎動物（例えば、ヒト）に認められる感染因子に対するＴ−リンパ球および／またはマクロファージなどの他の細胞によって仲介される免疫応答を指し、感染を防御もしくは改善するか、またはその少なくとも１つの症状を減少する。特に、「防御免疫」または「防御免疫応答」は、脊椎動物（例えば、ヒト）に認められる感染因子に対する免疫、または免疫応答を誘発することを指し、感染を防御もしくは改善するか、またはその少なくとも１つの症状を減少させる。具体的には、ワクチンの投与から防御免疫応答が誘導されることは、胃腸炎の１つ以上の症状が解消または減少されること、あるいはそのような症状の期間または重症度が減少することから明白である。ノロウイルス由来の胃腸炎の臨床症状として、悪心、下痢、軟便、嘔吐、発熱、および全身の倦怠感が挙げられる。疾患症状を減少または解消する防御免疫応答は、ノロウイルスの集団発生の拡大を減少または停止させる。ワクチンの調製については、Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York）に概説されている。本発明の組成物は、例えば、口、消化器、および呼吸器（例えば、鼻）粘膜のうちの１つ以上への送達のために、処方することができる。

【0040】

組成物が、呼吸器（例えば、鼻）粘膜への送達を意図する場合、典型的に、エアゾルまたは点鼻薬として投与するための水溶液としてか、あるいは、例えば、鼻道内における迅速な被着のための乾燥粉末として、処方される。点鼻薬として投与するための組成物は、そのような組成物に通常含まれるタイプの１つ以上の賦形剤、例えば、保存剤、粘度調整剤、張度調整剤、緩衝剤などを含有してもよい。増粘剤は、微結晶セルロース、キトサン、澱粉、多糖類などであり得る。乾燥粉末として投与するための組成物もまた、そのような組成物に通常含まれる１つ以上の賦形剤、例えば、粘膜付着性剤、充填剤、ならびに適切な粉末流動およびサイズ特徴を送達するための剤を含有してもよい。充填剤ならびに粉末流動化およびサイズ剤として、マンニトール、スクロース、トレハロース、およびキシリトールを挙げることができる。

【0041】

一実施形態では、本発明のノロウイルスワクチンまたは抗原製剤は、免疫原として１つ以上のノロウイルス遺伝子群抗原、ＭＰＬ（登録商標）などのアジュバント、粘膜表面への付着を促進するためのキトサンなどのバイオポリマー、ならびにマンニトールおよびスクロースなどの充填剤を含有する。例えば、ノロウイルスワクチンは、１つ以上のノロウイルス遺伝子群抗原（例えば、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）、ヒューストンウイルス（Houston virus）、スノーマウンテンウイルス（Snow Mountain virus））、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント、キトサン粘膜付着剤、ならびに充填剤としておよび適切な流動特徴を提供するためのマンニトールおよびスクロースを含有する１０ｍｇの乾燥粉末として処方してもよい。製剤は、約７．０ｍｇ（２５〜９０％ｗ／ｗの範囲）のキトサン、約１．５ｍｇのマンニトール（０〜５０％ｗ／ｗの範囲）、約１．５ｍｇのスクロース（０〜５０％ｗ／ｗの範囲）、約２５μｇのＭＰＬ（登録商標）（０．１〜５％ｗ／ｗの範囲）、および約１００μｇのノロウイルス抗原（０．０５〜５％ｗ／ｗの範囲）を含んでもよい。

【0042】

ノロウイルス抗原は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約８０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在してもよい。一実施形態では、ノロウイルス抗原は、両鼻孔（１つの鼻孔あたり１０ｍｇ）への投与について、１０ｍｇの乾燥粉末製剤あたり約５μｇ、約１５μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約５００μｇ、および約１ｍｇ（０．０５、０．１５、０．２５、０．５、１．０、２．０、５．０、および１０．０％ｗ／ｗ）、または一方の鼻孔への投与について、２０ｍｇの乾燥粉末製剤あたり約１０μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約４００μｇ、約１ｍｇ、および約２ｍｇ（０．１、０．３、０．５、１．０、２．０、４．０、１０．０および２０．０％ｗ／ｗ）の用量で処方することができる。製剤は、それぞれの投与中一方の鼻孔に投与してもよく、または両方の鼻孔に投与してもよい。免疫応答を改善するために、１回目の投与の１〜１２週間後に追加投与を行ってもよい。ワクチンおよび抗原製剤中の各ノロウイルス抗原の含有量は、１μｇ〜１００ｍｇの範囲、好ましくは、１〜１０００μｇの範囲、より好ましくは、５〜５００μｇ、最も典型的には、１０〜２００μｇの範囲であり得る。各用量において投与される全ノロウイルス抗原は、約１０μｇ、約３０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、または約１０００μｇのいずれかであり得る。ワクチン全用量を、一方の鼻孔に投与することができ、または両鼻孔への投与のために、半分に分割することができる。乾燥粉末特徴は、直径１０μｍ未満の粒子が粒子の１０％未満であることである。平均粒度は、直径１０〜５００μｍの範囲である。

【0043】

別の実施形態では、抗原およびワクチン組成物は、被験体へのその後の投与のために、液体として処方することができる。鼻腔内投与を意図する液体製剤は、ノロウイルス遺伝子群抗原、アジュバント、およびキトサンなどの送達剤を含む。筋肉内（ｉ．ｍ．）投与のための液体製剤は、ノロウイルス遺伝子群抗原、アジュバント、および緩衝液を含み、送達剤（例えば、キトサン）を伴わない。

【0044】

好ましくは、上記の抗原およびワクチン組成物は、それらを使用する準備ができ、その時点で、それらが希釈剤によって再構成されるまで、凍結乾燥され、貯蔵される。あるいは、組成物の異なる成分は、キット中に個別に貯蔵されてもよい（任意のまたはすべての成分が凍結乾燥される）。成分は、乾燥製剤のための凍結乾燥形態のままでもよく、または液体製剤のために再構成してもよく、使用前に混合されるか、または患者に個別に投与されるかのいずれかである。乾燥粉末投与のために、ワクチンまたは抗原製剤を、鼻腔内送達デバイスに予め充填し、使用するまで貯蔵してもよい。好ましくは、そのような鼻腔内送達デバイスは、その内容物の安定性を保護および確実にする。

【0045】

抗原製剤およびワクチンの凍結乾燥は当該技術分野において周知である。典型的に、液体の抗原は、凍結乾燥プロセス中の抗原を保護し、所望の粉末特徴を伴うケーキを産出するための剤の存在下で凍結乾燥される。スクロース、マンニトール、トレハロース、またはラクトースなどの糖（１０〜２００ｍｇ／ｍＬの初期濃度で存在する）は、タンパク質抗原の凍結保護のために、および所望の粉末特徴を伴う凍結乾燥されたケーキを産出するために、一般的に使用される。組成物を凍結乾燥することは、理論的に、より安定な組成物をもたらす。ほとんどの処方プロセスの目的は、タンパク質の凝集および分解を最小限にすることであるが、本発明者らは、凝集した抗原の存在により、ノロウイルスＶＬＰに対する免疫応答が増強されることを開示した（実施例３および４を参照のこと）。従って、本発明者らは、抗原の凝集の百分率を凍結乾燥プロセス中に制御して、凝集した抗原対無傷（intact）の抗原の最適な比を求めて、最大の免疫応答を誘導することができる方法を開発した。

【0046】

それ故、本発明はまた、（ａ）ノロウイルス抗原、スクロース、およびキトサンを含む凍結乾燥前溶液を調製すること（ここで、スクロース対キトサンの比は約０：１〜約１０：１である）と；（ｂ）溶液を液体窒素で凍結することと；（ｃ）周囲温度で４８〜７２時間、凍結溶液を凍結乾燥すること（ここで、最終凍結乾燥生成物は、ある百分率の前記ノロウイルス抗原を凝集形態で含有する）とを含む、ノロウイルス抗原製剤を作製する方法を包含する。一実施形態では、凍結乾燥前溶液は、充填剤をさらに含む。別の実施形態では、前記充填剤はマンニトールである。

【0047】

所望される百分率の凝集を得るためのスクロースおよびキトサンの比は、以下の指針によって決定することができる。約２．５：１〜約１０：１の範囲でスクロース対キトサンの重量比を含有する凍結乾燥前混合物は、凍結乾燥後に９５％を超える無傷のノロウイルス抗原（即ち、５％未満の凝集した抗原；実施例１３を参照こと）を産出する。約１：１〜約２．１：１のスクロース対キトサン重量比の範囲が、約５０％〜約９０％の無傷のノロウイルス抗原（即ち、約１０％〜約５０％の凝集した抗原）を産出する。スクロース対キトサンの重量比が０：１であれば、３０％未満の無傷のノロウイルス抗原が生じる。スクロースおよびキトサンが両方とも含まれていなければ、５％未満の無傷な抗原（即ち、９５％を超える凝集した抗原）を生じる。これらの指針を使用すれば、当業者は、凍結乾燥前混合物におけるスクロース対キトサン重量比を調整して、最適な免疫応答を生じさせるのに必要な所望される量の凝集体を得ることが可能である。

【0048】

加えて、スクロースおよびキトサンを凍結乾燥前溶液に封入することによって、無傷のノロウイルス抗原の経時的な安定性が促進される。製剤用量における凝集した抗原／無傷の抗原の比は、乾燥粉末として貯蔵する場合、約１２箇月以上の期間、増加しない（実施例１０を参照のこと）。それ故、この凍結乾燥手順は、凝集したノロウイルス抗原対無傷のノロウイルス抗原の予想可能かつ制御可能な比を伴う安定な製剤を確実にする。

【0049】

免疫応答を刺激する方法
各抗原またはワクチン製剤用量における抗原の量は、有意な有害な副作用を伴わずに、強い免疫応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どのような特異的抗原が用いられるか、投与経路、および使用されるアジュバントに依存して、変動する。一般に、本発明に関して、患者に投与される用量は、患者において経時的に防御免疫応答を生じさせるか、または抗原特異的抗体の産生を誘導するのに十分であるべきである。それ故、組成物は、特異的抗原に対して免疫応答を誘発する、ならびに／あるいは疾患または感染由来の症状および／または合併症を予防、緩和、減少、もしくは治癒するのに十分な量で患者に投与され、ひいては、ノロウイルスの集団発生の拡大を減少または停止させる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」として定義される。

【0050】

ノロウイルス抗原の実質的に純粋な形態では、各用量は、製剤中の各ノロウイルス抗原について約１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは、約１５〜５００μｇを含むことが期待される。本発明の抗原製剤を用いる典型的な免疫化法では、製剤は、何回かに分けた用量（例えば、１〜４回）（各用量は各抗原の１〜１０００μｇを含有する）で投与してもよい。用量は、組成物が生じる免疫学的活性および患者の病態、ならびに処置しようとする患者の体重または体表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の組成物の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。

【0051】

本発明の抗原およびワクチン製剤は、非粘膜を介して投与してもよく、または粘膜経路を介して投与してもよい。これらの投与は、非経口的注入（例えば、静脈内、皮下、および筋肉内）、または他の従来の直接的経路、例えば、口腔／舌下、直腸、経口、鼻、局所（例えば、経皮および眼）、膣、肺、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻腔内経路を介するか、あるいは特定の組織へ直接的なインビボ投与を含んでもよい。あるいは、本発明のワクチンは、経口、局所、皮下、粘膜、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、経皮、真皮下、皮内および坐剤を介するような多様な経路のいずれかによって、投与してもよい。投与は、針、カテーテル、または関連するデバイスを、単一の時点もしくは複数の時点で使用する直接的投与によって、簡単に達成することができる。

【0052】

好適な実施形態では、本発明の抗原およびワクチン製剤は、鼻腔内経路によって投与される。粘膜表面を介する免疫化は、他の免疫化経路よりも多数の潜在的利点を付与する。最も明白な便益性は、１）粘膜免疫化が、投与のための針、または高度に訓練された人員を必要としないこと、および２）免疫応答が、病原体の進入部位において、ならびに全身的に惹起されることである（Isaka et al. 1999;Kozlowski et al. 1997;Mestecky et al. 1997;Wu et al. 1997）。

【0053】

さらなる態様では、本発明は、患者の粘膜表面（好ましくは、鼻腔内）に、１つ以上のノロウイルス抗原、少なくとも１つの有効なアジュバントおよび／または少なくとも１つの送達剤を含む抗原またはワクチン組成物を投与することによって、ＩｇＡ粘膜免疫応答およびＩｇＧ全身性免疫応答を誘発する方法を提供する。

【0054】

本発明はまた、上記で定義したノロウイルス抗原、および上記で定義したような少なくとも１つのアジュバントまたは少なくとも１つの送達剤の鼻腔内製剤を投薬するための手段を提供することも考慮している。投薬デバイスは、例えば、エアゾル送達システムの形をとってもよく、ただ１回の用量、または複数回の用量を投薬するように構成してもよい。そのようなデバイスは、計量された用量のワクチンまたは抗原製剤を鼻道に送達する。適切なデバイスの他の例として、ドロッパー、スワブ、エアロゾライザー、インサフレーター（例えば、Valois Monopowder Nasal Administration Device、単回用量のBespak UniDose DP乾燥粉末鼻腔内送達デバイス）、ネブライザー、および吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。デバイスは、被験体が製剤を鼻腔に吸入することを必要とする受動的手段によって、抗原またはワクチン製剤を送達してもよい。あるいは、デバイスは、用量を鼻腔に圧送または噴霧することによって、製剤を能動的に送達してもよい。抗原製剤またはワクチンは、１つ以上のそのようなデバイスによって、一方または両方の鼻孔に送達してもよい。投与は、１例の被験体あたり２つのデバイス（１つの鼻孔あたり１つのデバイス）を含むことができる。有効成分（ノロウイルス抗原）の実際の用量は、約５〜１０００μｇであってもよい。好適な実施形態では、抗原またはワクチン製剤は、鼻通路の近くに保持される製剤を含有するデバイスからの鼻道内における迅速な被着によって、鼻粘膜に投与される。

【0055】

本発明はまた、１つ以上のノロウイルス抗原に対する抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、上記のようなワクチンまたは抗原製剤の被験体への投与を含む。これらの抗体は、当該技術分野において日常的な方法によって単離および精製することができる。ノロウイルス抗原に特異的な単離された抗体は、診断用免疫学的アッセイの開発に使用することができる。これらのアッセイを用いて、臨床サンプル中のノロウイルスを検出し、感染を引き起こす特定のウイルス（例えば、ノーウォーク（Norwalk virus）、ヒューストン（Houston virus）、スノーマウンテン（Snow Mountain）など）を同定することができる。あるいは、単離された抗体を、ノロウイルス感染が疑われる被験体に投与して、受動免疫または短期免疫を付与することができる。

【0056】

本発明は、ワクチンを被験体に投与することを含む、被験体において、ノロウイルス感染に対する防御免疫を誘発するための方法を提供し、ここで、前記ワクチンは、ノロウイルスＶＬＰおよび少なくとも１つのアジュバントを含む。一実施形態では、被験体はヒトであり、ワクチンは、ノロウイルス感染の１つ以上の症状に対する防御を付与する。ノロウイルス抗原によって免疫応答を誘発する方法が他で報告されている（米国特許出願公開第２００７／０２０７５２６号を参照のこと）が、ヒトにおける防御免疫応答の誘導を実証したものはない。ワクチンの有効性が血清抗体と相関する、米国において現在許諾されているいくらかのワクチンとは異なり、研究により、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）に対する血清抗体の力価の増加などの免疫応答のマーカーは、ヒトの防御免疫に関連しないことが示されている（Johnson et al. (1990) J. Infectious Diseases 161:18-21）。さらに、ヒトにおけるノーウォーク（Norwalk）ウイルス暴露について調べた別の研究により、ノーウォーク（Norwalk）感染に対する感受性は、多機能的であり、分泌型の状態およびメモリー粘膜免疫応答などの因子を含むことが示された（Lindesmith et al (2003) Nature Medicine 9: 548-553）。ノロウイルスは、インビトロで培養することができないため、現在利用可能なウイルス中和アッセイは存在しない。中和アッセイの代わりとして役立つ機能アッセイは、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイである。ノロウイルスＶＬＰは赤血球抗原に結合するため、ＨＡＩは、ノロウイルスワクチンから誘導される抗体が、ノロウイルスＶＬＰによる抗原被覆赤血球の凝集を阻害する能力を測定する。このアッセイでは、一定量のノロウイルスＶＬＰを、免疫した被験体由来の一定量の赤血球および血清と混合する。血清サンプルが機能的抗体を含有する場合、抗体は、赤血球への結合についてＶＬＰと競合し、それによって、赤血球の凝集を阻害する。

【0057】

ロタウイルスなどの他のウイルスのワクチンでも、類似の所見が観察されている。ロタウイルスワクチンについては、血清抗体が直接防御に関与するのか、または最近の感染を単に反映するものなのかについて論争されている（Jiang, 2002;Franco, 2006）。防御に関してそのような関連する事柄を定義することは、ロタウイルスまたはノロウイルスなどの下痢性疾患に関しては特に困難であり、ここで、防御について推論しようとする前臨床試験は、粘膜免疫（例えば、腸ＩｇＡ）、サイトカイン同化、および細胞性免疫による多面的寄与の影響を受け得る。臨床開発においてそのような免疫応答を測定することが困難であること、および血清抗体測定との相関が認められないことから、ヒト臨床暴露実験のみを介して、これらのタイプのウイルスのワクチンの有効性を実証し得ることが要求される。

【0058】

上記のように、本発明のワクチンの投与は、ノロウイルス感染の少なくとも１つの症状を予防および／または減少させる。ノロウイルス感染の症状は、当該技術分野において周知であり、悪心、嘔吐、下痢、および胃痙攣を含む。

【0059】

さらに、ノロウイルスに感染した患者は、低度の発熱、頭痛、悪寒、筋肉痛、および疲労を呈し得る。本発明はまた、被験体に本発明のワクチン製剤を投与して、ノロウイルス感染に関連する少なくとも１つの症状が緩和および／または減少されるようにすることによって、ノロウイルス感染を経験する被験体において、防御免疫応答を誘導する方法を包含する。症状の減少は、自覚的または他覚的、例えば、被験体の自己評価によって、臨床医の評価によって、あるいは例えば、生活の質の評価、ノロウイルス感染またはさらなる症状の進行の遅延、ノロウイルス症状の重症度の減少を含む適切なアッセイもしくは測定（例えば、体温）、または適正なアッセイ（例えば、抗体価、ＲＴ−ＰＣＲ抗原検出、および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞活性化アッセイ）を行うことによって、決定してもよい。有効な応答はまた、糞便サンプル中のウイルス含有量を直接測定する（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）ことによって決定してもよく、これは、腸から放出されたウイルスの量を反映する。他覚的評価は、動物およびヒトの評価の両方を含む。

【0060】

本明細書において開示するワクチンおよび抗原製剤の動物モデルにおける安定性および効力については、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７９９２９号（その全体が参照により本明細書に援用される）に報告されている。

【実施例】

【0061】

実施例
これより、以下の実施例に記載の特定の実施形態を参考にして、より詳細に本発明を例示する。実施例は、本発明の純粋な例示を意図するものであり、決してその範囲を限定することを意図しない。

【0062】

実施例１．ウサギにおけるノロウイルスワクチン製剤のＧＬＰ毒性試験
本試験の目的は、ウサギへの３回の鼻腔内投薬後、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）−ウイルス様粒子（ＮＶ−ＶＬＰ）ワクチンの潜在的毒性を評価することであった。ＮＶ−ＶＬＰワクチンは、（１０ｍｇの乾燥粉末あたり）２５μｇの遺伝子群Ｉ ＶＬＰ、２５μｇのＭＰＬ、７ｍｇのキトサングルタミン酸、１．４７５ｍｇのマンニトール、および１．４７５ｍｇのスクロースを含有した。試験は、８週間の期間、行った。４週間の非処置回復間隔後、効果の持続性、可逆性、または発症の遅延を評価した。６０匹のニュージーランドホワイト（New Zealand White）種ウサギ（３０匹／性別）を、無作為に３つの群（１０匹のウサギ／性別／群）に割り当てた。群１の動物には、投薬しなかった（即ち、未処置）。群２の動物に、１０ｍｇ／鼻孔（合計で２０ｍｇ）のプラセボ（即ち、アジュバント／賦形剤：ＭＰＬ、キトサン、スクロース、およびマンニトール）を投与した。群３の動物に、１０ｍｇ／鼻孔（合計で２０ｍｇ）のＮＶ−ＶＬＰワクチン（１つの鼻孔あたり２５μｇの抗原（合計で５０μｇ）を示す）を投与した。群２および３の動物に対し、試験日（ＳＤ）１、２２、および４３日目に、Bespak Unidose鼻腔内乾燥粉末デバイスを使用する鼻腔内投与によって、投薬を行った。動物（５匹／群／性別）を、ＳＤ４６および７４日目に、全体的な肉眼的剖検に供した。試験中に評価したパラメータには、死亡率、臨床観察およびケージ観察、体重、体重変化、食物摂取、体温、眼科検査、臨床病理（臨床検査、血液検査、および尿検査）、肉眼的病理、器官重量データ、および組織病理が含まれる。試験の概要を表１にまとめて示す。試験の結果を表２にまとめて示す。

【0063】

【表1】

【0064】

【表2】

【0065】

ケージ観察では、有意な所見は認められなかった。血液検査の測定値（グロブリンおよび総タンパク質の増加）は、Ｂリンパ球ポリクローナル活性化の特徴を示したが、これは、アジュバントの影響が原因と考えられ得る。組織病理学的所見は、両方の群のウサギの鼻甲介の粘膜固有層内か、もしくは鼻道内において離れて認められる様々な程度の炎症性浸潤、および／または鼻道に認められる軽度の出血からなった。観察された病巣は、免疫反応において予想され得るものであった。両群の病巣は、本質的に制限され、試験日７４日目までに完全に消失した。

【0066】

ＥＬＩＳＡによりＮＶ−ＶＬＰ特異的ＩｇＧについて分析した血清学的サンプルは、単回投薬の１０日目に、免疫動物の３０％において測定可能な抗ＮＶ−ＶＬＰ力価を示した（図１を参照のこと）。２２および４３日目の追加処置により、抗体陽転した動物数および産物特異的抗体のレベルの両方が増加し、７３日目までに、免疫動物の９０％が抗体陽転した。未処置またはマトリックス処置対照のうち、定量化可能なレベルのＮＶ−ＶＬＰ特異的抗体を有するものは認められなかった（データ示さず）。

【0067】

１、１５および２９日目に同じ製剤で鼻腔内に免疫を行ったさらなる組のウサギのメモリーＢ細胞応答を評価することによって、免疫応答をさらに特徴付けた。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７９９２９号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように、メモリーＢ細胞応答を測定した。最後の追加処置の１５６日後に採取した組織では、末梢血液、脾臓、および最も顕著には、腸間膜リンパ節においてＮＶ−ＶＬＰ−特異的メモリーＢ細胞の存在が認められた。腸間膜リンパ節の抗原−特異的メモリーＢ細胞は、ＩｇＡ陽性であった。さらに、ＮＶ−ＶＬＰ−特異的抗体−分泌長寿命形質細胞が骨髄に存在した。

【0068】

実施例２．ヒトにおけるノーウォーク（Norwalk）ワクチン製剤の用量増加安全性試験
ノロウイルス遺伝子群１ワクチンの安全性および免疫原性に関する二重盲検比較用量増加第１相試験を行った。ワクチンは、鼻腔内投与のために設計された乾燥粉末マトリックス中の凍結乾燥されたノーウォーク（Norwalk）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなった。ワクチン被験体は、Ｈの１型抗原分泌型である健常成人志願者を含んだ。Ｈの１型抗原分泌型の登録の根拠は、Ｈの１型抗原分泌型がノーウォーク（Norwalk）ウイルス感染に感受性である一方、非分泌型は耐性であることである。対照として、それぞれの用量レベルの２例のさらなる志願者に、マトリックス単独を投与した。乾燥粉末マトリックスは、２５μｇのＭＰＬ（登録商標）アジュバント、７ｍｇのキトサン、１．５ｍｇのマンニトール、および１．５ｍｇのスクロースを含んだ。志願者に、０および２１日目に投薬し、各投薬後の症状について、７日間の日誌を書くように要求した。血清学、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）のための血液、ならびに粘膜抗体評価のための糞便および唾液サンプルを採取した。

【0069】

ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンの成分を表３に列挙する。ワクチンを鼻腔内送達デバイス内に包装する。単回投与のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンを、単回用量のBespak（Milton Keynes, UK）UniDose DP乾燥粉末鼻腔内送達デバイスに包装した。各デバイスは、１０ｍｇの乾燥粉末ワクチン製剤を送達した。ワクチンの各用量は、２つの送達デバイス（各鼻孔において１つ）よりなった。全ワクチン用量は、２０ｍｇの乾燥粉末であった。アジュバント／賦形剤の製剤は、製剤にノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原が含まれないことを除いて、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンと同じである。アジュバント／賦形剤の製剤（乾燥粉末マトリックスとも称される）を、表４にまとめて示す。

【0070】

【表3】

【0071】

【表4】

【0072】

具体的には、ワクチンの用量増加を、次のとおりに行った：健常者の適切なスクリーニング後、３例の志願者の群を無作為に分けて、鼻腔内経路により、５μｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンおよび乾燥粉末マトリックス（ｎ＝２）または乾燥粉末マトリックス単独（ｎ＝１）のいずれかを投与した。これらの３例の志願者を、２１日間、安全性について追跡し、それらの安全性データを、独立した安全性監視者（Independent Safety Monitor）（ＩＳＭ）が検討した。ＩＳＭの承認を基に、２１日目に、これらの個体に、前回投与したワクチンまたはマトリックスの２回目の投薬を行い、４例のさらなる志願者を無作為に分けて、鼻腔内により、５μｇのＶＬＰタンパク質および乾燥粉末マトリックス（ｎ＝３）またはマトリックス単独（ｎ＝１）のいずれかを投与した。ＩＳＭは、この第２の群由来の安全性データを再検討し、ＩＳＭの承認を基に、１回目の投薬の２１日後に、２回目の鼻腔内投薬を行った。志願者は、各投薬後の症状について７日間の日誌を書いた。ＩＳＭが、次のより高い用量への増加が許容可能であることを決定した後、７例の志願者の別の群を無作為に分け、０日目および２１日目に、鼻腔内経路により、１５μｇのＶＬＰタンパク質（ｎ＝５）または乾燥粉末マトリックス単独（ｎ＝２）を含有するいずれかのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンを投与した。さらに、７日間の症状日誌に記録を付けさせ、２１日目の２回目の投薬前に、ＩＳＭが再検討を行った。最後に、最初の２回の投薬コホート由来の安全性データの再検討後、ＩＳＭは、用量増加が許容可能であることを決定し、７例の志願者の最終群を無作為に分けて、０日目および２１日目に、鼻腔内経路によって、５０μｇのＶＬＰタンパク質（ｎ＝５）または乾燥粉末マトリックス単独（ｎ＝２）を含有するいずれかのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンを投与した。２１日目の２回目の投薬前に、７日間の症状日誌および安全性データを、ＩＳＭが再度検討を行った。

【0073】

志願者は、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンまたは乾燥粉末マトリックス単独の投与後７日間、症状（局所的症状、例えば：鼻漏、鼻痛／不快感、鼻詰まり、鼻水、鼻部掻痒感、鼻出血、頭痛、ならびに全身症状、例えば：連日の口腔温、筋肉痛、悪心、嘔吐、腹部痙攣、下痢、および食欲不振を含む）に関する連日の日誌を書いた。暫定的な病歴を、各再診時（７±１、２１±２、２８±２、５６±２および１８０±１４日目）に入手した；志願者に、暫定的な病気、投薬、および医師の受診について質問した。志願者には、再診中に教唆しなかった事象を含むすべての深刻または重度の有害事象について報告するように依頼した。志願者は、ＣＢＣおよび血清クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、およびＡＬＴについて、７および２８日目（各免疫化の７日後）に評価を受け、異常が認められた場合、異常な検査試験値を、試験値が正常になるか、または安定になるまで、追跡した。

【0074】

盲検データは、低用量（ｎ＝５）またはマトリックス（ｎ＝２）を投与した志願者のデータを示し、７例中４例が、次のいくつかまたはすべてを報告した：ワクチン接種の最初の２４時間後における鼻漏、鼻痛、鼻閉、掻痒感、くしゃみ、頭痛、および／または咽喉炎。１例の志願者が、１および６日目のそれぞれに、若干の鼻出血を報告した。中用量（ｎ＝５）またはマトリックス（ｎ＝２）を投与した志願者のうち、７例中５例は、最初の２４時間に、軽度の鼻漏、鼻閉、掻痒感、くしゃみ、および／または頭痛を報告した。症状は、最初の７２時間で概ね消失したが、１例の志願者では、鼻閉が７日目まで持続した。非盲検データに対する所見の概要を、以下の表５（これはまた、高用量で報告された有害事象も含む）に示す。これらの所見は、鼻腔内ノロウイルスＶＬＰワクチンが、ＶＬＰ濃度に無関係であるように思われる局所的な、通常、軽度の一時的な症状に関連することを示す。有害事象、血液学、血液化学および／または身体検査の結果について、アジュバント／賦形剤（またはマトリックス）対照群とノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチン群との間で、差異は認められなかった。

【0075】

【表5】

【0076】

免疫化の前および７±１、２１±２、２８±２、５６±２、および１８０±１４日目に血液を採取して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を測定した。各用量のワクチンまたは乾燥粉末マトリックス単独の投与の前および投与後７日目に、末梢血リンパ球を採取して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより抗体分泌細胞を検出した。ワクチン接種前およびワクチン接種後２１±２、５６±２および１８０±１４日目に、全血を入手して、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原に対する応答におけるサイトカイン産生およびリンパ球増殖を含む細胞性免疫の将来の研究のために、細胞を分離し、凍結した。抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ ｓＩｇＡスクリーニングのために、免疫化前および７±１、２１±２、２８±２、５６±２日目、および１８０±１４日目に、全糞便サンプルを採取した。免疫化前および７±１、２１±２、２８±２、５６±２日目に、市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）により、唾液を採取し、５６日目に粘膜抗体について陽性であった場合、１８０±１４日目のサンプルを採取し、抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ ｓＩｇＡについてスクリーニングした。最後に、最も高い用量のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ（５０μｇ、上記の第３のコホート）を投与した志願者由来の血液を、０、２１、５６および１８０日目に、メモリーＢ細胞についてスクリーニングした。

【0077】

以下の方法を使用して、免疫した個体または乾燥粉末マトリックス単独を投与した個体から採取した血液、糞便、および唾液サンプルを分析した：
Ａ．ＥＬＩＳＡによる血清抗体測定
精製された組み換えノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰを標的抗原として使用するＥＬＩＳＡによるノーウォークウイルス（Norwalk virus）に対する抗体の測定のために、ワクチン接種前およびワクチン接種後の複数の時点において、２０ｍＬの血液を採取して、コード化された標本をスクリーニングした。簡単に説明すると、炭酸コーティング緩衝液ｐＨ９．６中ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰを使用して、マイクロタイタープレートをコーティングした。コーティングしたプレートを洗浄し、ブロッキングし、２倍連続希釈の試験血清と共にインキュベートし、続いて、洗浄およびヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡに特異的な酵素−コンジュゲート第二抗体試薬とのインキュベーションを行った。適切な基質溶液を添加し、発色させ、プレートを読み取り、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡのエンドポイント力価を、各抗体クラスの参照標準曲線と比較して、決定した。陽性の応答を、ワクチン接種後の力価の４倍上昇として定義した。ワクチン用量のそれぞれについての５６日目（２回目の免疫化の３５日後）の血清力価を、図２に示す。結果は、ＩｇＧおよびＩｇＡについての血清力価の用量依存的増加を示す。ＩｇＧおよびＩｇＡの両方について有意な血清力価を、５０μｇのノロウイルス抗原を含有するワクチンを投与した志願者において観察した。

【0078】

Ｂ．抗体分泌細胞アッセイ
ＡＳＣアッセイのために、ヘパリン処理血液（コホート１および２について３０ｍＬ、コホート３について２５ｍＬ）からＰＢＭＣを採取して、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰに対する抗体を分泌する細胞を検出した。ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンまたは乾燥粉末マトリックス単独の投与後０、７±１、２１±２、および２８±２日目に、これらのアッセイを実施した。各投薬の各時点における応答率および１０^６個のＰＢＭＣあたりのＡＳＣの平均数について記載した。陽性の応答を、すべての被験体についてのワクチン接種前の平均計数を超える少なくとも３標準偏差（ＳＤ）である１０^６個のＰＢＭＣあたりのワクチン接種後のＡＳＣ計数（対数的測度（log metric））および少なくとも８つのＡＳＣスポットとして定義したが、これは、類似のアッセイで決定した培地により刺激された陰性対照のウェル（２つのスポット）＋３ＳＤの平均に対応する。

【0079】

５０μｇ用量のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰのＡＳＣアッセイの結果を、図３に示す。循環ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を分泌する細胞が、初回および追加ワクチン接種の７日後に観察されたが、これは、ワクチンが免疫原性であることを示唆する。

【0080】

Ｃ．機能的抗体応答の測定
上記の段落Ｂに記載のように採取した機能的抗体応答血清の測定をさらに分析して、抗ノーウォークウイルス（Norwalk virus）抗体の機能的特性を決定した。２倍連続希釈の試験血清を、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ（防御免疫応答を示す機能アッセイ）によって、赤血球の血球凝集を阻害するそれらの能力に関して、分析した。陽性の応答を、ワクチン接種後の力価の４倍上昇として定義した。５０μｇ用量のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンを投与した５例の被験体について、５６日目（追加処置の３５日後）における血清力価および血球凝集阻害力価を表６に示す。結果は、血清ＩｇＧ力価によって測定され抗体陽転応答を示した個体の７５パーセント（７５％）がまた、血球凝集阻害によって測定されるとヒト赤血球上の結合性受容体を遮断することが可能な機能的抗体応答を呈したことを示す。

【0081】

【表6】

【0082】

Ｄ．ノーウォークウイルス（Norwalk virus）−特異的メモリーＢ細胞の測定
コホート３からヘパリン処理血液を採取（０および２１日目に３０ｍＬ、５６および１８０日目に５０ｍＬ）して、インビトロ抗原刺激に続いて、ワクチン接種後０、２１、５６および１８０日目に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用してメモリーＢ細胞を測定した。類似のアッセイを首尾よく使用して、ウサギにおいてノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ製剤により誘発されるメモリーＢ細胞の頻度を測定した（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７９９２９号（本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。末梢血単核細胞（５×１０^６個の細胞／ｍＬ、２４ウェルプレート中１ｍＬ／ウェル）を、４日間、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原（２〜１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートして、抗原−特異的メモリーＢ細胞のクローンを拡大させ、抗体分泌細胞へ分化させた。対照は、抗原の非存在下で同じ条件でインキュベートした細胞および／または無関連の抗原と共にインキュベートした細胞を含む。刺激後、細胞を洗浄し、計数し、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＶＬＰでコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔプレートに移した。全Ｉｇ分泌Ｂリンパ球あたりのウイルス−特異的メモリーＢ細胞の頻度を決定するために、拡大されたＢ細胞もまた、抗ヒトＩｇＧおよび抗ヒトＩｇＡ抗体でコーティングしたウェルに添加した。結合抗体は、ＨＲＰ−標識抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＡ、それに続くTrue Blue基質によって表される。また、ＩｇＡおよびＩｇＧサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＧ１〜４）に対するコンジュゲートを使用して、異なるエフェクター機構に関連し得る抗原−特異的サブクラス応答および免疫プライミングの局在を決定してもよい。スポットを、ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置により計数した。志願者ごとに拡大された細胞集団を、フローサイトメトリーによって調べて、それらのメモリーＢ細胞表現型、即ち、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＩｇＧ＋、ＩｇＭ＋、ＣＤ３８＋、ＩｇＤ−を確認する。

【0083】

Ｅ．細胞性免疫応答
ヘパリン処理血液（５０ｍＬコホート１および２、２５ｍＬコホート３）を、コードされた標本として採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原に対するＣＭＩ応答の将来可能な評価のために、液体窒素において凍結保存した。実施され得るアッセイは、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原に対して増殖性のＰＢＭＣおよびサイトカイン応答を含み、確立された技術に従って、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよびインターロイキン（ＩＬ）−４レベルを測定することによって、決定することができる。

【0084】

Ｆ．抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ ｓＩｇＡのための糞便および唾液の採取
糞便および唾液サンプル中の抗組み換えノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＩｇＡを測定する。唾液標本を、プロテアーゼ阻害剤（即ち、ＡＥＢＳＦ、ロイペプチン、ベスタチン、およびアプロチニン）（Sigma, St. Louis, MO）で処置し、−７０℃で貯蔵し、先に記載のアッセイ（Mills et al. (2003) Infect. Immun. 71:726-732）の改変法を使用して、アッセイする。ワクチン接種後、複数の日に糞便を採取し、分析まで標本を−７０℃で貯蔵する。標本を融解し、プロテアーゼ阻害剤緩衝液を添加して、１０％ｗ／ｖ糞便懸濁液を調製する。以下に記載のように、糞便上清液を、組み換えノーウォークウイルス（Norwalk virus）（ｒＮＶ）−特異的粘膜ＩｇＡについて、ＥＬＩＳＡによって測定する。

【0085】

約２〜３ｍＬの全唾液を、ワクチン接種前、およびワクチン接種後の複数の時点で採取した。唾液を、市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）（唾液が染み込むまでSalivetteスワブを咀嚼するか、または３０〜４５秒間、舌の下側に置く）によって採取した。遠心分離によって、スワブから唾液を採取した。

【0086】

Ｇ．糞便および唾液中の抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰの測定
抗ヒトＩｇＡ抗体試薬または標的ｒＮＶ ＶＬＰ抗原コーティング剤のいずれかでコーティングされたプレートを利用して、ＥＬＩＳＡを実施して、全ＩｇＡを決定し、各標本について、特異的抗ＶＬＰ ＩｇＡ応答の力価を測定する。上記のように、全ＩｇＡまたは特異的ＩｇＡは、ＨＲＰ−標識抗ヒトＩｇＡによって表される。内部全ＩｇＡ標準曲線を含めて、ＩｇＡ含有量を定量する。応答は、特異的抗体の４倍上昇として定義される。

【0087】

実施例３．ヒトにおける鼻腔内ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンの２回投薬の安全性および免疫原性試験
健常者における無作為化二重盲検試験を行って、アジュバント／賦形剤を伴うノーウォーク（Norwalk）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンとプラセボ対照（空のデバイス）との２回の投薬レベルの安全性および免疫原性を比較する。ワクチンは、実施例２に記載のように、鼻腔内投与のために設計された乾燥粉末マトリックス中のノーウォーク（Norwalk）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる。ワクチン被験体は、Ｈの１型抗原分泌型である健常成人志願者を含む。ヒト志願者を、４つの群のうちの１つに無作為に割り当て、各群に、次の処置のうちの１つを投与する：５０μｇの用量のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチン、１００μｇの用量のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチン、アジュバント／賦形剤、またはプラセボ。志願者に、０および２１日目に投薬し、各投薬後の症状について、７日間の日誌を書くように要求する。血清学、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）のための血液、ならびに粘膜抗体評価のための糞便および唾液サンプルを採取する。

【0088】

ワクチンの成分を、実施例２の表３に列挙する。ワクチンを鼻腔内送達デバイス内に包装する。単回投与のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンを、単回用量のBespak（Milton Keynes, UK）UniDose DP乾燥粉末鼻腔内送達デバイスに包装する。各デバイスは、１０ｍｇの乾燥粉末ワクチン製剤を送達する。ワクチンの各用量は、２つの送達デバイス（各鼻孔において１つ）からなる。全ワクチン用量は、２０ｍｇの乾燥粉末である。従って、５０μｇのワクチン用量は、それぞれ、１０ｍｇの乾燥粉末製剤を送達する２つのデバイスからなり、ここで、各１０ｍｇの乾燥粉末製剤は、２５μｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ、２５μｇのＭＰＬ（登録商標）アジュバント、７ｍｇのキトサン、１．５ｍｇのマンニトール、および１．５ｍｇのスクロースからなる。同様に、１００μｇのワクチン用量は、それぞれ、１０ｍｇの乾燥粉末製剤を送達する２つのデバイスからなり、ここで、各１０ｍｇの乾燥粉末製剤は、５０μｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ、２５μｇのＭＰＬ（登録商標）アジュバント、７ｍｇのキトサン、１．５ｍｇのマンニトール、および１．５ｍｇのスクロースからなる。アジュバント／賦形剤の製剤は、製剤にノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原が含まれないことを除いて、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンと同じである。アジュバント／賦形剤の製剤（乾燥粉末マトリックスとも称される）を、実施例２の表４にまとめて示す。プラセボ群には、２つの空デバイスを投与する。

【0089】

志願者は、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチン、乾燥粉末マトリックス単独、またはプラセボのいずれかの２回の用量の投与後７日間、症状（局所的症状、例えば：鼻漏、鼻痛／不快感、鼻詰まり、鼻水、鼻部掻痒感、鼻出血、頭痛、ならびに全身症状、例えば：連日の口腔温、筋肉痛、悪心、嘔吐、腹部痙攣、下痢、および食欲不振を含む）に関する連日の日誌を書く。暫定的な病歴を、各再診時（７＋１、２１＋２、２８＋２、５６＋２および１８０＋１４日目）に入手する；志願者に、暫定的な病気、投薬、および医師の受診について質問する。志願者には、再診中に教唆しなかった事象を含むすべての深刻または重度の有害事象について報告するように依頼する。志願者は、ＣＢＣおよび血清クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、およびＡＬＴについて、７および２８日目（各免疫の７日後）に評価を受け、異常が認められた場合、異常な検査試験値を、試験値が正常になるか、または安定になるまで、追跡する。

【0090】

免疫化の前および７＋１、２１＋２、２８＋２、５６＋２、および１８０＋１４日目に血液を採取して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を測定する。各用量のワクチン、乾燥粉末マトリックス単独、またはプラセボの投与の前および７日目に、末梢血リンパ球を採取して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより抗体分泌細胞を検出する。ワクチン接種前およびワクチン接種後２１＋２、５６＋２および１８０＋１４日目に、全血を入手して、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原に対する応答におけるサイトカイン産生およびリンパ球増殖を含む細胞性免疫の将来の研究のために、細胞を分離し、凍結する。抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ ｓＩｇＡスクリーニングのために、免疫化前および７＋１、２１＋２、２８＋２、５６＋２日目、および１８０＋１４日目に、全糞便サンプルを採取する。免疫化前および７＋１、２１＋２、２８＋２、５６＋２日目に、市販のデバイス（Salivette, Sarstedt, Newton, NC）により、唾液を採取し、５６日目に粘膜抗体について陽性であった場合、１８０＋１４日目のサンプルを採取し、抗ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ ｓＩｇＡについてスクリーニングする。また、０、２１、５６および１８０日目に、メモリーＢ細胞について血液をスクリーニングする。

【0091】

免疫した個体、または乾燥粉末マトリックス単独もしくはプラセボを投与した個体から採取した血液、糞便、および唾液サンプルを分析するために使用される方法については、実施例２に詳述している。

【0092】

実施例４．ノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＶＬＰワクチン製剤で免疫されたヒトにおけるノーウォークウイルス（Norwalk virus）暴露試験
多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ比較第１〜２相暴露試験を、上記の実施例２に記載のノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンで免疫した８０例のヒト志願者において行った。適格な被験体には、Ｈの１型オリゴ糖（陽性の唾液分泌型状態によって測定される）を発現し、血液型がＢ型でもＡＢ型でもない健常な年齢１８〜５０歳の者が含まれる。非Ｈの１型分泌型であるかまたはＢ型もしくはＡＢの血液を有する被験体は、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）による感染に対してより耐性であることが報告されており、試験から除外される。志願者の少なくとも８０％は、これらの２つの基準に基づいて適格であることが予想される。

【0093】

スクリーニング後、すべての許容判定基準を満たす適格な志願者を、各コホートにおいて約４０例の志願者を伴う２つの等しいサイズのコホートのうちの１つに無作為に（１：１）分ける。コホート１を、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰで免疫し、コホート２にプラセボを投与する。志願者を、各鼻孔において１０ｍｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチン（２０ｍｇの全乾燥粉末）またはプラセボで免疫する。ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンの各１０ｍｇは、５０μｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ、７ｍｇのキトサン、２５μｇのＭＰＬ（登録商標）、１．５ｍｇのスクロースおよび約１．５ｍｇのマンニトールを含有する。それ故、コホート１の各志願者には、、全用量で１００μｇのノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰ抗原を、各免疫化において投与する。試験日０および２１日目に、志願者に、ワクチンまたはプラセボを投与する。

【0094】

プラセボと比較したノーウォークウイルス（Norwalk virus）ＶＬＰワクチンの安全性を評価する。志願者は、ワクチンまたはプラセボによる各免疫化後の７日間、日誌を書き、有害事象の重症度および期間を記録する。深刻な有害事象（ＳＡＥ）および何らかの有意な新たな病状の発生について、ワクチンまたはプラセボの最後の投薬後の６箇月間、および感染性ウイルスによる暴露後の４箇月間、追跡する。

【0095】

ワクチンまたはプラセボの２回目の投薬の２１〜４２日後の間（試験日４２〜５６日目の間）、すべての志願者を感染性ノーウォークウイルス（Norwalk virus）に暴露する。各志願者に、≧５０％のヒト感染用量（ＨＩＤ５０）、即ち、プラセボ群の少なくとも５０％の志願者において疾患を引き起こすことが予想される感染性ウイルスの量を投与する。ＨＩＤ５０は、ノーウォークウイルス（Norwalk virus）の約４８〜約４８０の間のウイルス等価物である。ノーウォークウイルス（Norwalk virus）を滅菌水と混合し、経口投与する。播種の前に、水中５００ｍｇ重炭酸ナトリウムを摂取させ、胃酸およびペプシンによるウイルスの分解を防止する。感染性ウイルスの経口播種の５分後に、重炭酸ナトリウム溶液（水中５００ｍｇの重炭酸ナトリウム）の２回目の摂取を行う。志願者は、少なくとも４日間、および急性胃腸炎の症状／徴候（嘔吐、下痢、軟便、腹痛、悪心、および発熱）が認められなくなった後少なくとも１８時間、暴露施設に留まる。

【0096】

いくらかの測度（metrics）が、ウイルス暴露によって誘導される急性胃腸炎の症状／徴候の予防または減少においてノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰワクチンの効力を決定するためにモニターされる。すべての志願者は、急性胃腸炎の臨床症状を記録し、これらの症状は、試験施設の試験スタッフによって記録される。ワクチン投与したコホート１由来の疾患症状／徴候を、コホート２プラセボレシピエントと比較する。

【0097】

ワクチンまたはプラセボによる免疫化の前、および暴露後、すべての志願者から、血清および糞便サンプルを日常的に採取する。血清サンプルを、ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＡおよびＩｇＧ、ノーウォーク（Norwalk）ＶＬＰに対する力価について、分析する。糞便サンプル中のノーウォーク（Norwalk）抗原およびノーウォーク（Norwalk）ＲＮＡを、それぞれＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ（ウイルスの存在、腸から放出されるウイルスの量、およびウイルスの放出の期間を示す）によって、試験する。暴露後、病状を呈した被験体を、症状／徴候が消失するまで、血清化学、ＢＵＮ、クレアチニン、および肝機能試験を含むさらなる検査試験に供する。

【0098】

ワクチン群（コホート１）およびプラセボ群（コホート２）の結果を比較して、ノロウイルス疾患全体に対するワクチンの防御効力（一次エンドポイント）、ならびに／あるいは症状／徴候（病状の重症度および病状の日数）を改善するその効力、および／または放出しているウイルスの存在、量および／または期間の減少（二次エンドポイント）を評価する。

【0099】

本発明は、本発明の個々の態様の単なる例示を意図する記載の特定の実施形態によって、範囲が限定されるべきはなく、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内にある。実際、本明細書において示しかつ説明される改変の他にも、本発明の多様な改変が存在することは、通常の範囲を超えない実験を使用することにより、先の記載および添付の図面から当業者には明らかであろう。そのような改変および均等物は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

【0100】

本明細書において言及するすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個別に本明細書において参照により組み入れられて示されているが如く、同程度に、参照により、本明細書に援用される。

【0101】

本明細書に記載の参考文献の引用または説明は、それが本発明の先行技術であることを認めたものと解釈されるべきではない。

【0102】

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【図1】

【図2】

【図3】