特許 6618601 アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6618601

(24)【登録日】2019年11月22日

(45)【発行日】2019年12月11日

(54)【発明の名称】アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 498/10 20060101AFI20191202BHJP

   A61K 31/424 20060101ALN20191202BHJP

   A61P 11/06 20060101ALN20191202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20191202BHJP

【ＦＩ】

   C07D498/10 ACSP

   !A61K31/424

   !A61P11/06

   !A61P43/00 111

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2018-234025(P2018-234025)

(22)【出願日】2018年12月14日

(65)【公開番号】特開2019-108326(P2019-108326A)

(43)【公開日】2019年7月4日

【審査請求日】2018年12月14日

(31)【優先権主張番号】201711346226.7

(32)【優先日】2017年12月15日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518427292

【氏名又は名称】シャンシー・ユニヴァーシティ・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＡＮＸＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】リャン，チェンユン

(72)【発明者】

【氏名】ティアン，レイ

(72)【発明者】

【氏名】クィン，ナン

(72)【発明者】

【氏名】シア，ジュアン

(72)【発明者】

【氏名】ペイ，シャオメン

【審査官】 神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１９−１０８３２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１３３９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Medicinal Chemistry Research，２０１４年，Vol.23，pp.3403-3417

【文献】 European Journal of Medicinal Chemistry，２０１３年，Vol.63，pp.279-289

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化学式Ｉまたは化学式ＩＩの化合物、または、薬学的に許容される当該化合物の塩であって、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、ニトロ基、ヒドロキシル基、シアノ基、ベンジルオキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝ハロアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８直鎖または分枝アルコキシ基、である化合物。

【化1】

【化2】

【請求項2】

Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＦ、Ｒ_３はＨ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＦ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＦ_３、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＮ；Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＦ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＮ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＮＯ_２、Ｒ_３はＦ、Ｒ_４はＨ；または、
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＣＮ、Ｒ_３はＨ、Ｒ_４はＦである請求項１に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ここにすべての目的のためにその全部を合体させる２０１７年１２月１５日に出願された中国特許出願第ＣＮ−２０１７１１３４６２２６．７号の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物およびその使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

世界保健機関（ＷＨＯ）は、喘息を主要な非伝染病の１つと定義しており、それはまた、人の命と生存にとっての重大な危険でもある。中国では、大量のスモッグが頻繁に発生するため、喘息患者の数が増加している。したがって、新しい抗喘息薬の開発には、社会的に大きな利点がある。喘息は、喘息の症状および病理学的特徴に基づいて、臨床的に、エピソード（急性エピソードおよび慢性エピソード）と寛解とに分類される。エピソードと寛解とは交互におこる。気道過敏性および炎症は、寛解の間に依然として存在する（Swedin L、Saarne T、Ｒehnberg Mら、「患者の層別化および喘息における満たされていない必要性」、Pharmacol Ther, 2017, 169: 13-34：非特許文献１）。病気の機序の理解の深まりとともに、喘息治療の焦点は、急性気道平滑筋痙攣の単純な軽減から気道炎症の予防と治療の包括的な処置へと移行している。現代の生物医学的研究は、喘息が様々な炎症細胞およびサイトカイン、特に肥満細胞、好酸球、Ｔ細胞および白血球を含む慢性気道炎症によって引き起こされる炎症であることを示している。ロイコトリエン（ＬＴＣ）、インターロイキン（ＩＬ）およびヒスタミンを含む様々な炎症性因子もまた関与する。

【0004】

最近の研究は、ロイコトリエン（leukotriene）の放出が、炎症および気道閉塞を引き起こし、呼吸器系に多くの異なる作用を有する様々な異なる因子における最終的な共通経路の１つであることを見出した。ロイコトリエンは、アラキドン酸およびアラキドン酸５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）による必須脂肪酸エイコサペンタエン酸の酸化によって白血球において産生されるエイコサノイド炎症メディエータである。ロイコトリエンという名前は、白血球（leukocyte）とトリエン（triene）という言葉から由来する。研究により、ＬＴＣ_４が様々なロイコトリエンの中で最も強力な炎症活性を有することが示されている（Schmidt D、Ｒabe K.F.、「単離されたヒト気道におけるトーン（tone）および応答性の調節におけるロイコトリエンの役割」、Am J Ｒespir Crit Care Med、2000,161 (2 Pt 2): S62-6：非特許文献２）。したがって、ＬＴＣ_４産生の阻害およびロイコトリエン受容体へのＬＴＣ_４結合の遮断は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含む呼吸器炎症関連疾患の処置のための重要な方法である。

【0005】

グローバルな喘息予防および制御イニシアチブのガイダンスによれば、ロイコトリエン経路の阻害は、肺機能を改善し、気管支喘息症状を有意に改善することができる。したがって、ロイコトリエンモジュレータは、喘息の症状を抑制し、発作を減少させる薬剤として分類されている。このクラスの薬物の臨床効果は広く確認されている（Arakawa H、Hamasaki Y、Kohno Yら、「小児喘息のための日本のガイドライン２０１７」、Allergol Int, 2017, 66(2):190-204：非特許文献３）。現在、ロイコトリエン産生の阻害に基づく抗喘息薬は１つしか存在しない：すなわち、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤であるＺＩＬＥＵＴＯＮである。新規なロイコトリエン産生阻害剤の開発は、広範な適用見通しおよび商業的価値を有する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Swedin L、Saarne T、Ｒehnberg Mら、「患者の層別化および喘息における満たされていない必要性」、Pharmacol Ther, 2017, 169: 13-34

【非特許文献2】Schmidt D、Ｒabe K.F.、「単離されたヒト気道におけるトーン（tone）および応答性の調節におけるロイコトリエンの役割」、Am J Ｒespir Crit Care Med、2000,161 (2 Pt 2): S62-6

【非特許文献3】Arakawa H、Hamasaki Y、Kohno Yら、「小児喘息のための日本のガイドライン２０１７」、Allergol Int, 2017, 66(2):190-204

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らはスピロアリールイソオキサゾリン化合物の薬理学的活性の研究において、アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物（化学式Ｉおよび化学式ＩＩ）が肥満細胞におけるＬＴＣ_４の産生を有意に阻害し得ることを見出した。さらなる研究により、代表的な化合物の半阻害濃度が７１．２１ｎＭに達し、これは文献で報告されたＬＴＣ_４産生を阻害する最も高い活性であることが見出された。それらの化合物は、ロイコトリエン経路の調節に基づく抗炎症および抗喘息薬発見のためのリード化合物および薬物候補である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一実施形態において、本発明は、化学式Ｉまたは化学式ＩＩの化合物（アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物）、または、薬学的に許容される当該化合物の塩を提供する。Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、ニトロ基、ヒドロキシル基、シアノ基、ベンジルオキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝ハロアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８直鎖または分枝アルコキシ基、である。

【0009】

【化1】

【0010】

【化2】

【0011】

別の実施形態において、化学式Ｉまたは化学式ＩＩにおいて、
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＦ、Ｒ_３はＨ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＦ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＦ_３、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＮ；Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＦ、Ｒ_２はＨ、Ｒ_３はＣＮ、Ｒ_４はＨ；
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＮＯ_２、Ｒ_３はＦ、Ｒ_４はＨ；または、
Ｒ_１はＨ、Ｒ_２はＣＮ、Ｒ_３はＨ、Ｒ_４はＦである。

【0012】

なお、前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示および説明のためのものであり、クレームされている本発明のさらなる説明を提供することを意図していると理解される。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、その具体例が添付図面に図示されている、本発明の実施形態に詳細に言及する。以下の例はより本発明を例示するものであるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0014】

本発明は、アラントラクトン／イソアラントラクトンスピロアリールイソオキサゾリン化合物、または、薬学的に許容される当該化合物の塩を提供する。化合物は化学式Ｉまたは化学式ＩＩの構造を有する。

【0015】

【化3】

【0016】

【化4】

【0017】

アラントラクトンは下記の構造を有し、

【化5】

また、イソアラントラクトンは下記の構造を有する。

【化6】

【0018】

化学式Ｉまたは化学式ＩＩにおいて、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立で、水素、ハロゲン、ニトロ基、ヒドロキシル基、シアノ基、ベンジルオキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８の直鎖または分枝ハロアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_８直鎖または分枝アルコキシ基である。化学式Ｉおよび化学式ＩＩにおいて、スピロ炭素はキラル原子である。化学式Ｉおよび化学式ＩＩの化合物は、それらの個々のジアステレオ異性体に分離することができる。

【0019】

化学式Ｉまたは化学式ＩＩの化合物は、以下の反応式１に従って調製することができる。

【0020】

【化7】

【0021】

（反応式１の試薬および条件）
（ａ）１）ＮＣＳ、ＤＭＦ、４０℃；２）ＮＨ_２ＯＨ・ＨＣｌ、Ｈ_２Ｏ、室温；（ｂ）アラントラクトン、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、室温；（Ｃ）イソアラントラクトン、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、室温。

【0022】

化学式ＩＶ、化学式Ｉ、および化学式ＩＩにおける置換基は、以下の表１に列挙される。化学式ＩＶの化合物は、化合物１ａ〜１ｇを含み；化学式Ｉの化合物は、化合物２ａ〜２ｇを含み；化学式ＩＩの化合物は、化合物３ａ〜３ｂを含む。

【0023】

表１：化合物

【表1】

【0024】

本発明の第２の目的は、ロイコトリエン産生の阻害に基づく抗炎症および抗喘息の分野における化学式Ｉおよび化学式ＩＩの化合物の使用を開示することである。それは、これらの化合物が肥満細胞ＬＴＣ_４の産生を阻害することを特徴とする。試験濃度において、化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｆの阻害率は９０％を超える。炎症および喘息の病因におけるロイコトリエンの重要な役割に鑑みて、この知見は、化学式Ｉおよび化学式ＩＩの化合物の抗炎症および抗喘息適用の可能性を示すものである。

【実施例】

【0025】

〔実施例１〕化合物１ａ〜１ｇの調製
反応フラスコ中のアセトニトリルと水の混合物（体積比１：１）にアリールアルデヒド（反応式１の化学式ＩＩＩの化合物）を溶解し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１．１当量）を室温で反応フラスコに加えた。反応物を室温で撹拌し、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）でモニターした。反応完了時に、減圧下で溶媒を除去して中間体を得た。中間体をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＤＭＦ溶液にＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）（１当量）を少しずつ加えた。反応溶液を４０℃で撹拌し、ＴＬＣでモニターした。反応完了時に、酢酸エチル（反応混合物の２０倍）を加えて反応混合物を希釈し、酢酸エチル溶液を水で洗浄した（水２０ｍＬ、５回）。酢酸エチル層を収集し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して化合物１ａ〜１ｇとした。化合物１ａ〜１ｇを精製せずに次の工程で使用した。

【0026】

〔実施例２〕化合物２ａ〜２ｇの調製
化合物１ａ〜１ｇ（０．１６ｍｍｏｌ）をフラスコ中の０．７５ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解した。次いで、０．７５ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解したトリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）（０．１３ｍｍｏｌ）およびアラントラクトン（０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。反応完了時に、反応混合物を減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（抽出溶媒 ＰＥ：ＥＡ＝６：１〜３：１、体積比）で精製して化合物２ａ〜２ｇを得た。

【0027】

（２．１）化合物２ａ、無色油状物、収率６１．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.47-7.39 (m, 3H), 7.14 (q, J = 1.6 Hz, 1H), 5.15-5.14 (m, 1H), 5.11 (d, J= 3.2 Hz, 1H), 3.64 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 3.12-3.10 (m, 1H), 2.52-2.49 (m, 1H), 2.21 (dd, J = 3.24, 11.64 Hz, 1H), 1.90-1.79 (m, 1H), 1.66-1.51 (m, 4H), 1.49-1.42 (m, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.64 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3): δ173.29, 163.25 (d, J = 245.4 Hz), 155.68 (d, J = 2.9 Hz), 154.06, 130.68 (d, J = 8,14 Hz), 130.48 (d, J = 12 Hz), 122.77 (d, J = 3.1 Hz), 117.62 (d, J = 21 Hz), 113.79 (d, J = 23 Hz), 112.27, 90.37, 77.59, 43.04, 42.42, 42.14, 38.68, 36.65, 32.97, 32.67, 28.43, 22.81, 16.76.

【0028】

（２．２）化合物２ｂ、白色固体、収率６３．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.72-7.69 (m, 2H), 7.14-7.09 (m, 2H), 5.16-5.13 (m, 1H), 5.12 (d, J = 3.2 Hz , 1H), 3.64 (d, J = 17.0 Hz , 1H), 3.50 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 3.12-3.10 (m, 1H), 2.53-2.48 (m, 1H), 2.21 (dd, J = 14.9, 3.4 Hz, 1H), 1.90-1.78 (m, 1H), 1.67-1.55 (m, 4H), 1.49-1.39 (m, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.6 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.36, 164.2(d, J = 250.1 Hz), 155.53, 153.96, 128.98 (d, J = 8.6 Hz), 124.92 (d, J = 3.2 Hz), 115.97 (d, J = 21.91 Hz), 112.43, 90.15, 77.52, 43.09, 42.46, 42.15, 38.68, 36.89, 32.98, 32.83, 28.40, 22.79, 16.76.

【0029】

（２．３）化合物２ｃ、白色固体、収率５８．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.83-7.81 (m, 2H), 7.69-7.67 (m, 2H), 5.16-5.12 (m, 2H), 3.67 (d, J = 17.2Hz , 1H), 3.53 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 3.13 (s, 1H), 2.53-2.50 (m, 1H), 2.21 (dd, J = 14.9, 3.4 Hz, 1H), 1.86-1.83 (m, 1H), 1.66-1.55 (m, 4H), 1.48-1.45 (m, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.7 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.18, 155.53, 154.19, 132.22 (d, J = 32.0 Hz), 132.06 (d, J = 32.4 Hz), 127.20, 125.77 (d, J = 4.0 Hz), 123.72 (d, J = 270.5 Hz), 112.16, 90.62, 43.02, 42.40, 42.13, 38.69, 36.47, 32.98, 32.81, 28.40, 22.79, 16.75.

【0030】

（２．４）化合物２ｄ、白色固体、収率７０．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.82 (d, J = 8.3 Hz , 2H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.17-5.16 (m, 1H), 5.11 (d, J = 3.2 Hz , 1H), 3.65 (d, J = 17.1 Hz , 1H), 3.50 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 3.14-3.12 (m, 1H), 2.53-2.48 (m, 1H), 2.22 (dd, J = 15.0, 3.4 Hz, 1H), 1.90-1.80 (m, 1H), 1.67-1.55 (m, 4H), 1.49-1.44 (m, 1H), 1.42 (d, J = 6.5 Hz , 1H), 1.25 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.6 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.0, 155.3, 154.4, 132.9, 132.6, 127.4, 118.1,114.0, 112.0, 90.9, 77.6, 43.0, 42.4, 42.15, 38.7, 36.2, 33.0, 32.8, 28.4, 22.8, 16.76.

【0031】

（２．５）化合物２ｅ、白色固体、収率４４．８％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.05-8.01 (m, 1H), 7.54-7.46 (m, 2H), 5.16-5.11 (m, 2H), 3.72 (d, J = 17.8 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 17.9 Hz, 1H), 3.13-3.12 (m, 1H), 2.54-2.50 (m, 1H), 2.22 (dd, J = 14.9, 3.4 Hz, 1H), 1.90-1.80 (m, 1H), 1.67-1.55 (m, 4H), 1.48-1.43 (m, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.6 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.87, 160.83, 158.28, 154.35, 152.10 (d, J = 3.1 Hz), 130.24 (d, J = 3.5 Hz), 128.26 (d, J = 3.6 Hz ), 121.81 (d, J = 11.6 Hz), 120.39 (d, J = 25.6 Hz), 116.87, 115.34 (d, J = 9.8 Hz), 111.97, 91.08, 42.94, 42.41, 42.14, 38.65, 32.98, 32.81, 28.37, 22.75, 16.75.

【0032】

（２．６）化合物２ｆ、黄色固体、収率３２．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.31 (d, J = 6.76Hz , 1H), 8.7(m, 1H), 7.39 (t, J = 9.48 Hz,1H), 5.15 (m, 2H), 3.65 (d, J= 17.08 Hz, 1H), 3.52 (d, J = 17.12 Hz, 1H), 3.14 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.24 (dd, J = 3.0, 11. 8Hz , 1H), 1.91-1.81(m, 1H), 1.68-1.42 (m, 6H), 1.25 (s,3H), 1.20-1.15 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.94, 157.79, 154.83 (d, J= 55.0 Hz), 153.99, 133.58 (d, J= 9.0 Hz), 126.07 (d, J = 5.0 Hz), 124.55 (d, J = 3.0 Hz ), 119.39 (d, J = 22.0 Hz ), 111.86, 91.01, 42.89, 42.36, 42.15, 38.72, 36.37, 33.00, 32.81, 28.41, 22.82, 16.74.

【0033】

（２．７）化合物２ｇ、白色固体、収率５１．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.75-7.70 (m, 2H), 7.44-7.43 (m, 1H), 5.17 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 3.62 (d, J = 17.1Hz , 1H), 3.48 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 3.13 (s, 1H), 2.54-2.50 (m, 1H), 2.22 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 1.87-1.81 (m, 1H), 1.67-1.55 (m, 4H), 1.49-1.39 (m, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.14 (d, J = 7.6 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.74, 154.64, 132.58, 126.38, 120.73 (d, J = 24.7 Hz), 118.34 (d, J = 23.2 Hz), 111.81, 91.15, 42.90, 42.39, 42.16, 38.73, 36.11, 33.02, 32.81, 28.37, 22.79, 16.74.

【0034】

〔実施例３〕化合物３ａ〜３ｂの調製
化合物１ａ〜１ｂ（０．１６ｍｍｏｌ）をフラスコ中の０．７５ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解した。次いで、０．７５ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解したトリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）（０．１３ｍｍｏｌ）およびイソアラントラクトン（０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。反応完了時、反応混合物を減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（抽出溶媒 ＰＥ：ＥＡ＝６：１〜３：１、体積比）で精製して化合物３ａ〜３ｂを得た。

【0035】

（３．１）化合物３ａ、白色固体、収率５４．０％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.46-7.37 (m, 3H), 7.16-7.12 (m, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.46 (s, 1H), 3.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 8.52 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 6.26 Hz, 1H), 2.36-2.25 (m, 2H), 2.04-1.97 (m, 1H), 1.88 (d, J = 6.16 Hz, 1H), 1.69-1.51 (m, 6H), 1.29-1.23 (m, 1H), 1.16-1.07 (m, 1H), 0.80 (s, 3H); ¹³CNMR (100 MHz, CDCl₃): δ173.45, 163.27 (d, J = 245.8 Hz), 155.54, 148.88, 130.68, 130.49 (d, J = 8.1 Hz), 122.72 (d, J = 2.96 Hz), 117.65 (d, J = 21.21 Hz), 113.77 (d, J = 23.1 Hz), 106.57, 91.17, 78.24, 46.37, 43.30, 41.96, 41.15, 36.69, 36.20, 34.44, 22.60, 21.34, 17.79.

【0036】

（３．２）化合物３ｂ、白色固体、収率６７．２％。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.71-7.68 (m, 2H), 7.14-7.09 (m, 2H), 5.00 (brs, 1H), 4.81 (s , 1H), 4.46 (s , 1H), 3.73 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 3.42 (d, J = 17.0, 1H), 2.59-2.53 (m, 1H), 2.37-2.33 (m, 1H), 2.27 (dd, J = 15.6, 1.2Hz, 1H), 2.05-1.97 (m, 1H), 3.42 (d, J = 12.3, 1H), 1.70-1.52 (m, 5H), 1.41 (t, J = 7.3Hz, 1H), 1.30-1.23 (m, 1H),1.12 (q, J = 5.4, 1H), 0.81(s, 3H). ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 173.62, 163.9 (d, J = 250.1 Hz), 155.43, 148.91, 128.94 (d, J = 8.6 Hz), 124.83 (d, J = 3.4 Hz), 116.07 (d, J = 21.9 Hz), 112.43, 106.54, 90.95, 78.26, 46.35, 45.80, 43.29, 41.93, 41.14, 36.68, 36.42, 34.43, 22.59, 21,36, 17.78.

【0037】

〔実施例４〕マウス骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣｓ）中のロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ_４）に対する前記化合物の阻害作用

【0038】

（４．１）ＢＭＭＣｓの抽出

【0039】

（１）実験動物
６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（特定の病原体なし）。

【0040】

（２）抽出工程
頸部脱臼によりマウスを屠殺した。マウスの死を確認した後、アルコールに３〜５分間浸漬した。クリーンベンチ上でピンセットとはさみでマウスの背中の皮膚を切断した。脾臓を取り出し、フィルターに入れた。フィルターを無血清培地を含むペトリ皿に入れた。脾臓を、２×１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度を有する細胞懸濁液中に粉砕した。２．５μｇ／ｍＬのレクチンを加え、細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地で５日間培養した。上清を回収した。マウスの大腿骨を除去し、骨の関節を切断した。無血清培地を用いて骨髄を遠心チューブに洗い落とした。次いで、骨髄含有培地を遠心分離し、上清を捨て、ペレットを赤色骨髄とした。

【0041】

（３）細胞培養
ＲＰＭＩ１６４０、１０％ Ｇｉｂｃｏ ＦＢＳ、２０％脾臓上清、１％ＡＥＰＳ、１％ＭＥＭ、１％二重抗体で４週間培養した。

【0042】

（４．２）化合物の非細胞毒性濃度を決定するためのＭＴＴアッセイ

【0043】

（１）ＭＴＴ溶液の調製
ＭＴＴ（（２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−３，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾール）の量を秤量して５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を調製し、ＭＭＴをＰＢＳ（溶媒）に溶解し、０．２２μｍの微多孔膜を用いて濾過した。溶液は淡黄色であり、−２０℃で保存した。

【0044】

（２）方法
ウェル当たり１００μＬで２×１０^５／ｍＬの密度で９６ウェルプレートにＢＭＭＣを播種し、異なる濃度の前記化合物を添加した。ブランク対照として１００μＬの培養培地および１００μＬのＰＢＳを使用した。７時間後、２０μＬのＭＭＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートをインキュベータ（５％ＣＯ_２、３７℃）中に４時間置いた。反応が完了した後、上清を捨て、１５０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。混合後、４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ値）をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

【0045】

細胞生存率＝（ＯＤ_化合物−ＯＤ_培養培地）／（ＯＤ_ＰＢＳ−ＯＤ_培養培地）×１００％

【0046】

１０μＭでの化合物のＢＭＭＣの増殖に対する阻害率を表２に示す。

【0047】

表２：化合物（１０μＭ）によるＢＭＭＣの増殖の阻害

【表2】

【0048】

（４．３）ＢＭＭＣからの炎症因子ＬＴＣ_４の放出に対する化合物の効果

【0049】

（１）原理
この実験は、ＬＴＣ_４抗血清の量を決定するための、ＬＴＣ_４のＬＴＣ_４−アセチルコリンエステラーゼコンジュゲート（ＬＴＣ_４トレーサー）への競合的結合に基づくものである。ＬＴＣ_４トレーサーの濃度は一定であり、ＬＴＣ_４の濃度は変化するので、ＬＴＣ_４抗血清に結合したＬＴＣ_４トレーサーの量は、ＬＴＣ_４の量に反比例する。抗体−ＬＴＣ_４複合体はネズミモノクローナル抗ウサギＩｇＧに結合するが、ネズミモノクローナル抗ウサギＩｇＧはあらかじめキットにコンジュゲートされている。反応系が安定化した後、未結合試薬を洗い流した。エルマン試薬（アセチルコリンエステラーゼを含む基質）を添加した。酵素反応は明確な黄色反応を示し、４０５ｎｍにおいて強い吸収を示した。色深度を分光光度法により測定し、ここで色深度はＬＴＣ_４トレーサーの量に比例し、ＬＴＣ_４トレーサーの量はＬＴＣ_４の量に反比例する。

【0050】

（２）方法
（ａ）試料調製
成熟ＢＭＭＣを培養し、一晩ＩｇＥを添加し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで９６ウェルプレート（１×１０^６細胞／ウェル）中に広げた。試験化合物溶液をプレートに添加し、プレートを１〜１．５時間インキュベートし、ＤＮＰ−ＨＳＡで１５分間刺激した。次いで、溶液を３０００ｒｐｍで３分間、４℃で遠心分離し、上清を回収し、ＲＰＭＩ１６４０で５倍に希釈して試料溶液を得た。

【0051】

（ｂ）ＥＬＩＳＡキット反応
キット説明書に従って試薬を添加し、４℃で１８時間反応させ、洗浄緩衝液で洗浄した。エルマン試薬２００μＬを各ウェルに添加し、４０分間反応させた。

【0052】

（ｃ）吸光度の測定
４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0053】

（３）結果
１０μＭの濃度でのＢＭＭＣによるＬＴＣ_４産生に対する化合物の阻害率を表３に示す。さらに、化合物２ｂの濃度依存性の検証を行い、半減期濃度（ＩＣ_５０）は７１．２１ｎＭと計算された。

【0054】

表３：ＢＭＭＣ（１０μＭ）によるＬＴＣ_４産生に対する化合物の阻害率（％）

【表3】

【0055】

本発明の要旨または範囲から逸脱することなく、本発明において様々な変更および変形が可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入るならば、本発明の改変および変形を包含することが意図される。