特許 6619097 スペキシン基盤のガラニン２型受容体のアゴニスト及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6619097

(24)【登録日】2019年11月22日

(45)【発行日】2019年12月11日

(54)【発明の名称】スペキシン基盤のガラニン２型受容体のアゴニスト及びその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/10 20060101AFI20191202BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20191202BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20191202BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20191202BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20191202BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/10ZNA

   A61K9/08

   A61K9/19

   A61P25/00

   C07K7/08

【請求項の数】5

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2018-523789(P2018-523789)

(86)(22)【出願日】2016年11月30日

(65)【公表番号】特表2018-537444(P2018-537444A)

(43)【公表日】2018年12月20日

(86)【国際出願番号】KR2016013950

(87)【国際公開番号】WO2017095132

(87)【国際公開日】20170608

【審査請求日】2018年5月14日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0168555

(32)【優先日】2015年11月30日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518156428

【氏名又は名称】ニューラクル サイエンス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】特許業務法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ジェヨン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ジョンイク

(72)【発明者】

【氏名】キム，ドンフン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ギフン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ユナ

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ソンシク

(72)【発明者】

【氏名】レイエス−アルカラス，アルファクシャド

【審査官】 小堀 麻子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０１６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３９９７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０３４５１４１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J Neurochem，２００５年，Vol.95, No.3

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の化学式１で表示されるペプチド系ガラニン２型受容体（ＧＡＬＲ２）のアゴニストであって、
［化学式１］
［ｄＮ］^１［Ｗ］^２［Ｔ］^３［Ｐ］^４［Ｎ］^５［Ａ］^６［Ａ］^７［Ｌ］^８［Ｙ］^９［Ｌ］^１０［Ｆ］^１１［Ｇ］^１２［Ｐ］^１３［Ｑ］^１４−ＮＨ_２
前記化学式１において、アミノ酸は一つ又は複数個に随意に置換され、
前記化学式１において、
［ｄＮ］^１は、Ｄ型アスパラギンを示し、ピログルタミン酸（ｐＱ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｌ型アスパラギン（Ｎ）、及びグリシン（Ｇ）のうちいずれか一つに随意に（ｏｐｐｔｉｏｎａｌｌｙ）置換され、又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アセチル基（Ａｃ）、及びＦｍｏｃのうちいずれか一つが結合されたアスパラギンに随意に置換され、
［Ｗ］^２は、トリプトファン（Ｗ）を示し、２−ナフチル（２−Ｎａｐｈｔｙｌ）基に随意に置換され、
［Ｔ］^３は、トレオニン（Ｔ）を示し、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）に随意に置換され、
［Ｐ］^４は、プロリン（Ｐ）を示し、ロイシン（Ｌ）、グルタメート（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）に随意に置換され、
［Ｎ］^５は、アスパラギン（Ｎ）を示し、
［Ａ］^６は、アラニン（Ａ）を示し、セリン（Ｓ）に随意に置換され、
［Ａ］^７は、アラニン（Ａ）を示し、
［Ｌ］^８は、ロイシン（Ｌ）を示し、グリシン（Ｇ）又はグルタミン（Ｑ）に随意に置換され、
［Ｙ］^９は、チロシン（Ｙ）を示し、
［Ｌ］^１０は、ロイシン（Ｌ）を示し、
［Ｆ］^１１は、フェニルアラニン（Ｆ）を示し、
［Ｇ］^１２は、グリシン（Ｇ）を示し、
［Ｐ］^１３は、プロリン（Ｐ）を示し、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）又はＤ型アラニン（ｄＡ）に随意に置換され、
［Ｑ］^１４は、グルタミン（Ｑ）、又はプロリン（Ｐ）を示し、ヒスチジン（Ｈ）に随意に置換され、
２、４、６、１２、１４番目のアミノ酸は対応するＤ型アミノ酸に随意に置換されるが、３、９、１０番目のアミノ酸は対応するＤ型アミノ酸に置換されないアゴニスト。

【請求項2】

アゴニストは、下記の化学式２から化学式４のうちいずれか一つで表示されるものである、請求項１に記載のペプチド系ガラニン２型受容体（ＧＡＬＲ２）のアゴニスト。
［化学式２］
ｄＮＷＴＰＮＡＡＬＹＬＦＧＰＱ−ＮＨ_２
［化学式３］
ＰＥＧ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２
［化学式４］
Ｆｍｏｃ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２

【請求項3】

ペプチド系ガラニン２型受容体（ＧＡＬＲ２）のアゴニストは、ガラニン１型受容体（ＧＡＬＲ１）及びガラニン３型受容体（ＧＡＬＲ３）は活性化せず、ガラニン２型受容体（ＧＡＬＲ２）を特異的に活性化するものである、請求項１に記載のペプチド系ガラニン２型受容体（ＧＡＬＲ２）のアゴニスト。

【請求項4】

請求項１によるペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストを含むガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項5】

組成物は、注射用凍結乾燥粉末又は注射液の剤形に製造される、請求項４に記載のガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スペキシン（Ｓｐｅｘｉｎ）ペプチドを基盤としたガラニン２型（ＧＡＬＲ２）受容体の特異的なアゴニスト、及び前記アゴニストのＧＡＬＲ２によって誘導される疾患の予防又は治療的用途に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｃ１２ｏｒｆ３９（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １２ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ３９）遺伝子によってコードされる新規の神経ペプチドスペキシン（Ｓｐｅｘｉｎ／ＮＱ／ＮＰＱ／ＳＰＸ）は、最初、人間の全遺伝情報を有するバイオインフォマティクスツール（ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ ｔｏｌｌｓ）を用いて発見された。成熟したスペキシンペプチドは、プロタンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）によって二塩基性アミノ酸（ｄｉｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）が切断されて生成される１４個のアミノ酸配列を有しており、人間のみならず、典型的な脊椎動物内で非常に良好に保存されている［Ｍｉｒａｂｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００７，１７：３２０−３２７］。スペキシンのｍＲＮＡ及びタンパク質は、人間、マウス、金魚などの多種の多様な脳領域及び末梢器官で発現しており、これは、スペキシンが脊椎動物において多様な生理的機能を担当していることを示唆する。近来、摂食行動及び物質代謝過程に関与するスペキシンの機能が明らかになった。肥満な人の脂肪においてはスペキシンのｍＲＮＡが著しく減少しており、食餌基盤の肥満誘導マウスにおけるスペキシンの注入は体重減少を誘導し、金魚におけるスペキシンの注入は食欲を抑制することが確認された。スペキシンは、腸の筋肉の収縮を促進させることによって排便活動を誘導し、ヒトの内分泌組織及び上皮組織で発現し、第２型糖尿病患者におけるスペキシンの数値の減少は、糖代謝及び脂肪代謝に関連しているという研究が近年発表された。ま
た、スペキシンは、生殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、心血管（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ）、腎機能（ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）及びノシセプチン（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ）にも関与することが知られている［Ｗａｌｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ ２０１４，２２：１６４３−１６５２；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，２０１３，３０５：Ｅ３４８−３６６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１３，３７４：６５−７２；Ｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０１２，２６：９４７−９５４；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１５，５：１２０９５；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２０１５，７１：２３２−２３９］。しかし、スペキシンが結合して作用する受容体に対する情報不足により、このような機能調節メカニズムに対する研究が良好に進められなかった。近来、本発明者等は、スペキシンがガラニン受容体（ｇａｌａｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＡＬＲという）１、２、３型の全てを活性化させるガラニン（ｇａｌａｎｉｎ）とは異なり、ＧＡＬＲ１型を活性化させることなく、ＧＡＬＲ２、３型に対する内在性リガンドとしてのスペキシンの機能を明らかにした。実際には、ガラニンはＧＡＬＲ３型に対して非常に弱い活性度を示すので、ガラニンとスペキシンはＧＡＬＲ２型と共通して作用するものであると言える［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１５５：１８６４−１８７３］。

【0003】

スペキシンとガラニンはおそらく進化的には遺伝子の複製による同一の祖先遺伝子に由来し、成熟したアミノ酸内にＴｒｐ^２、Ｔｈｒ^３、Ｔｙｒ^９、Ｇｌｙ^１２の保存された序列を共有している［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１５５：１８６４−１８７３］。ガラニンは、スペキシンと同様に、中枢神経系及び末梢組織で広範囲に発現している。しかし、食欲及び生殖と関連するスペキシンとガラニンは相反する機能を有するものと考えられる。例えば、肥満の女性においてはガラニンの数値が増加しており、ガラニンを注入し、ガラニンを過剰発現する遺伝子組み換えマウスにおいては摂食行動が増加することが観察された。結果的に、ガラニンは食欲誘発性（ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ）ペプチドであるが、スペキシンは無食欲誘発性（ａｎｏｒｅｘｉｃ）ペプチドであると言える。また、ガラニン類似ペプチド（ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）の注入は黄体形成ホルモンの分泌を促進させるという点で、スペキシンの金魚への注入が黄体形成ホルモンの分泌を阻害させるという結果と相反する［Ｂａｒｎｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９９７，４６：１３８４−１３８９；Ｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｃｏｈｏｌ，２００４，３３：９１−９７；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，２００６，２９１：Ｅ１２８１−１２８９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１３，３７４：６５−７２］。このような相反する作用は、ＧＡＬＲ１、３型が抑制性Ｇｉ信号伝達体系を誘導する一方、ＧＡＬＲ２型は興奮性Ｇｑ信号伝達体系を誘導することから起こるＧＡＬＲ亜型に特異的な信号伝達体系によるものと考えられる［Ｗｅｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１２，３：１４６］。

【0004】

ＧＡＬＲ２型による表現型研究は、受容体の遺伝子ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ、ＫＯ）マウス及び受容体に選択的に作用するアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の開発を試みることによって進められた。ＧＡＬＲ２型ＫＯマウスは、感覚機能（ｓｅｎｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、摂食行動（ｆｅｅｄｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ）、生殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、情緒（ｍｏｏｄ）、学習及び記憶（ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ）などにおいて特異的な異常がないものと報告されたが、その後、ＧＡＬＲ２型ＫＯマウスにおいては不安（ａｎｘｉｅｔｙ）、憂鬱行動（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ）が観察された。このような行動変化は、ＧＡＬＲ１型ＫＯと類似しているが、ＧＡＬＲ３型による効果と反対のものであって、ＧＡＬＲ３型特異的拮抗剤の投与による不安及び憂鬱行動の減少が報告されている［Ｇｏｔｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００５，２５：４８０４−４８１１；Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈａｖ，２００７，８６：８−２０；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００８，４２：３８７−３９７；Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００３，２８：１０３１−１０４４；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５，１０２：１７４８９−１７４９４］。また、ＧＡＬＲ２型欠損は、後根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ）発達の損失をもたらすという点と、ＧＡＬＲ２型アゴニストの脊椎内への注入が異痛（ａｌｌｏｄｙｎｉａ）を誘発するという点で痛みを調節する役割を奏すると推測される。ＧＡＬＲ２型が中間辺縁系補償回路に関与することは、背側線条体（ｄｏｒｓａｌ ｓｔｒｉａｔｕｍ）及び側坐核（ｎｕｃｌｅｕｓ ａｃｃｕｍｂｅｎｓ）においてガラニンが興奮性後シナプスの振幅を減少させ、ＧＡＬＲ２型ＫＯマウスではこのような効果がないとから知られている。中心扁桃（ｃｅｎｔｒａｌ ａｍｙｇｄａｌａ）において、ガラニンはＧＡＬＲ２型を通じてＧＡＢＡ性抑制後シナプスの電位の振幅を減少させるものと報告されている。また、ＧＡＬＲ２型の活性化は、セリン／スレオニンキナーゼ（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）であるＡｋｔなどのリン酸化を通じて海馬を神経細胞の損傷から保護することから知られている［Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２３：６２７−６３６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１，９８：９９６０−９９６４；Ｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３，３７：１５４１−１５４９；Ｂａｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｄｉｃｔ Ｂｉｏｌ，２０１２，１７：６９４−７０５；Ｅｌｌｉｏｔｔｅ−Ｈｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００７，１００：７８０−７８９］。このようなＧＡＬＲ２型による現象は、ＧＡＬＲ１型又は３型と共に、相反して又は独立に作用すると考えられるが、学習及び記憶、痛み、不安、情緒調節と関連するＧＡＬＲ２型の役割を示唆している。

【0005】

従来から、ＧＡＬＲ亜型の特異的なアゴニストの開発が試みられている。ガラニンペプチドの２番目〜１１番目（２位〜１１位）のアミノ酸序列（配列）はＧＡＬＲ２型の選択的アゴニストとして最初に開発されたが、その後、ＧＡＬＲ３型に対しても類似する活性度（親和性）を示すことが明からになった。その後も、ガラニンペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端を変形（修飾）したＧＡＬＲ２型選択的アゴニスト開発の試みが報告されている。これらのうち、Ｍ１１４５及びＭ１１５３は、ＧＡＬＲ１型及び３型に比べて２型に対して５０倍〜１００倍ほど良好に反応するが、濃度が高くなると、１型及び３型に対して相当な親和度を示すことが知られている［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１，９８：９９６０−９９６４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００５，３９：１６５−１６７；Ｗｅｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１２，３：１４６；Ｒｕｎｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００９，４３：１８７−１９２；Ｓａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｒｍ Ｉｎｔ，２０１１，６：７１４−７２０］。

【0006】

このように、過去の先行研究で多種のガラニン受容体亜型に特異的なアゴニストを開発する努力がされたにもかかわらず、高濃度のアゴニスト処理による特異性に問題が生じることが判明したという点で、受容体亜型に特異的なアゴニストの開発に伴うＧＡＬＲ亜型による生理学的機能の研究が必要となってきた。

【0007】

そこで、本発明者等は、ガラニン及びスペキシンを構成しているアミノ酸序列の分析及び置換を通じてＧＡＬＲ２型を対象としてスペキシン−受容体の反応性を確認し、安定性を高めるように改善されたアゴニストを開発し、これを動物に注入することによって生理学的機能を確認し、本発明を完成するに至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、ガラニン２型受容体に対する選択性を高め、血液内での安定性を向上させたペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストを提供することにある。

【0009】

本発明の他の目的は、前記ペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストをガラニン２型受容体によって誘導された疾患の予防又は治療に使用する薬剤学的用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記目的を達成するために、本発明は、下記の化学式１で表示されるペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストを提供する。

【0011】

［化学式１］
［ｄＮ］^１［Ｗ］^２［Ｔ］^３［Ｐ］^４［Ｎ］^５［Ａ］^６［Ａ］^７［Ｌ］^８［Ｙ］^９［Ｌ］^１０［Ｆ］^１１［Ｇ］^１２［Ｐ］^１３［Ｑ］^１４−ＮＨ_２

【0012】

前記化学式１において、アミノ酸は一つ又は複数個に随意に置換され、
前記化学式１において、
［ｄＮ］^１は、Ｄ型アスパラギンを示し、ピログルタミン酸（ｐＱ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｌ型アスパラギン（Ｎ）、及びグリシン（Ｇ）のうちいずれか一つに随意に（ｏｐｐｔｉｏｎａｌｌｙ）置換され、又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アセチル基（Ａｃ）、及びＦｍｏｃのうちいずれか一つが結合されたアスパラギンに随意に置換され、
［Ｗ］^２は、トリプトファン（Ｗ）を示し、２−ナフチル（２−Ｎａｐｈｔｙｌ）基に随意に置換され、
［Ｔ］^３は、トレオニン（Ｔ）を示し、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）に随意に置換され、
［Ｐ］^４は、プロリン（Ｐ）を示し、ロイシン（Ｌ）、グルタメート（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）に随意に置換され、
［Ｎ］^５は、アスパラギン（Ｎ）を示し、
［Ａ］^６は、アラニン（Ａ）を示し、セリン（Ｓ）に随意に置換され、
［Ａ］^７は、アラニン（Ａ）を示し、
［Ｌ］^８は、ロイシン（Ｌ）を示し、グリシン（Ｇ）又はグルタミン（Ｑ）に随意に置換され、
［Ｙ］^９は、チロシン（Ｙ）を示し、
［Ｌ］^１０は、ロイシン（Ｌ）を示し、
［Ｆ］^１１は、フェニルアラニン（Ｆ）を示し、
［Ｇ］^１２は、グリシン（Ｇ）を示し、
［Ｐ］^１３は、プロリン（Ｐ）を示し、アルギニン（Ｒ）、Ａ（アラニン）又はＤ型アラニン（ｄＡ）に随意に置換され、
［Ｑ］^１４は、グルタミン（Ｑ）を示し、プロリン（Ｐ）、又はヒスチジン（Ｈ）に随意に置換され、
２、４、６、１２、１４番目のアミノ酸は対応するＤ型アミノ酸に随意に置換されるが、３、９、１０番目のアミノ酸は対応するＤ型アミノ酸に置換されない。

【0013】

好ましくは、前記アゴニストは下記の化学式２〜４のうちいずれか一つで表示され得る。

【0014】

［化学式２］
ｄＮＷＴＰＮＡＡＬＹＬＦＧＰＱ−ＮＨ_２

【0015】

［化学式３］
ＰＥＧ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２

【0016】

［化学式４］
Ｆｍｏｃ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２

【0017】

また、本発明は、前記ペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストを含むガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

【発明の効果】

【0019】

本発明は、ガラニン２型受容体に対する特異性及び安定性を改善したペプチド系アゴニストを提供する。前記ペプチド系アゴニストは、ガラニン２型受容体が関与する体内の生理的機能である摂食、不安、感情、中毒などの調節に関与して食欲を抑制し、不安障害を回復し、快楽中毒性を減少できるという効果を有するので、ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療に使用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】スペキシンとガラニンのアミノ酸序列の比較、及び前記序列内のアミノ酸の突然変異の位置及び変形を示した図である。

【図2A】本発明に使用されたアミノ酸の突然変異、置換及び変形が行われたスペキシン基盤の突然変異ペプチドのリストである。

【図2B】本発明に使用されたアミノ酸の突然変異、置換及び変形が行われたスペキシン基盤の突然変異ペプチドのリストである。

【図3A】本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのうち単一突然変異があるペプチドのＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図3B】本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのうち単一突然変異（Ｎ５）、二重突然変異（Ａ７Ｆ１１）、三重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１）、四重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１Ｐ１３）ペプチドのＧＡＬＲ１に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図3C】本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのうち単一突然変異（Ｎ５）、二重突然変異（Ａ７Ｆ１１）、三重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１）、四重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１Ｐ１３）ペプチドのＧＡＬＲ２に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図3D】本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのうち単一突然変異（Ｎ５）、二重突然変異（Ａ７Ｆ１１）、三重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１）、四重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１Ｐ１３）ペプチドのＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図4】本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を数値化した値を示した図である。

【図5A】Ｄ−型アミノ酸への置換が行われた本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図5B】１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］の置換／変形が行われた本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図6】Ｄ−型アミノ酸への置換及び１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］の置換／変形が行われた本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドのＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３に対する活性度を測定した結果を数値化した値を示した図である。

【図7A】１００％ＦＢＳにおける本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドの安定性を検証した結果を示した図である。

【図7B】１００％ＦＢＳにおける本発明のスペキシン基盤の四重突然変異ペプチドであるＱｕ類似体の安定性を検証した結果を示した図である。

【図7C】ヒト血清における本発明のスペキシン基盤の四重突然変異ペプチドであるＱｕ類似体の安定性を検証した結果を示した図である。

【図7D】ＧＡＬＲ２型を発現するＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株において、本発明のスペキシン基盤の四重突然変異ペプチド類似体のガラニン受容体に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図7E】ＧＡＬＲ３型を発現するＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株において、本発明のスペキシン基盤の四重突然変異ペプチド類似体のガラニン受容体に対する活性度を測定した結果を示した図である。

【図8】１００％ＦＢＳ及びヒト血清における本発明のスペキシン基盤の突然変異ペプチドの安定性を検証した結果を数値化した値を示した図である。

【図9A】ＧＡＬＲ２アゴニスト及びスペキシンペプチドの摂食行動調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図9B】ＧＡＬＲ２アゴニスト及びスペキシンペプチドの体重変化の効果を検証した結果を示した図である。

【図9C】ＧＡＬＲ２アゴニストの濃度による摂食行動調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図9D】ＧＡＬＲ２アゴニストの濃度による体重変化の効果を検証した結果を示した図である。

【図9E】ＧＡＬＲ２アゴニスト及びＧＡＬＲ２アンタゴニストの処理による摂食行動調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図9F】ＧＡＬＲ２アゴニスト及びＧＡＬＲ２アンタゴニストの処理による体重変化の効果を検証した結果を示した図である。

【図10】本発明のＧＡＬＲ２アゴニストの濃度別処理による弓状核内の神経細胞の活性度の増加を検証した結果を示した図である。

【図11A】ＧＡＬＲ２アゴニストの処理による細胞内の信号伝逹調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図11B】ＧＡＬＲ２アゴニストの処理によるＰＯＭＣ遺伝子発現増加の効果を検証した結果を示した図である。

【図11C】ＧＡＬＲ２アゴニストの処理による−ＭＳＨ分泌調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図11D】インスリン抵抗性を有する状態でのＧＡＬＲ２アゴニストの処理による−ＭＳＨホルモン分泌調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図11E】ＧＡＬＲ２アゴニストの濃度別処理による−ＭＳＨホルモン分泌調節の効果を検証した結果を示した図である。

【図12】動物モデルにおいてＧＡＬＲ２アゴニストの不安障害に対する治療効果を検証するために、ＥＰＭ検査法を用いて十字迷路で開放部分に存する時間（ｔｉｍｅ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｒｍ）（上部図面）、回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｏｐｅｎ ａｒｍ ｅｎｔｒｙ）（中間図面）及び全体の動き（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｅｎｔｅｒ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）（下部図面）を測定した結果を示した図である。

【図13A】動物モデルにおいてＧＡＬＲ２アゴニストの注入による活動性及び不安に対する治療効果を検証するために、ＯＦＴ検査法を用いて実験動物が１０分間（０分〜５分）中央部に入った比率（％ｔｉｍｅ ｉｎ ｃｅｎｔｅｒ）、全体の動きのうち中央で動いた距離の比率（％ｄｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｅｎｔｅｒ）及び全体の動き（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定した結果を示した図である。

【図13B】動物モデルにおいてＧＡＬＲ２アゴニストの注入による活動性及び不安に対する治療効果を検証するために、ＯＦＴ検査法を用いて実験動物が１０分間（５分〜１０分）中央部に入った比率、全体の動きのうち中央で動いた距離の比率及び全体の動きを測定した結果を示した図である。

【図14】ＧＡＬＲ２アゴニストの濃度別処理による扁桃体内の神経細胞の活性度増加を検証した結果を示した図である。

【図15A】ＧＡＬＲ２アゴニスト処理による扁桃体以外の脳領域における神経細胞の活性を検証した結果を示した図である。

【図15B】ＧＡＬＲ２アゴニスト処理による扁桃体以外の脳領域における神経細胞の活性を検証した結果を示した図である。

【図15C】ＧＡＬＲ２アゴニスト処理による扁桃体以外の脳領域における神経細胞の活性を検証した結果を示した図である。

【図15D】ＧＡＬＲ２アゴニスト処理による扁桃体以外の脳領域における神経細胞の活性を検証した結果を示した図である。

【図16】動物モデルにおいてＧＡＬＲ２アゴニストの中毒性減少効果を検証するために、ＳＰＴ検査法を用いて２日間の液体中の砂糖水消費の比率（上部図面）、全体の液体消費量（中間図面）及び１％砂糖水消費量（下部図面）を測定した結果を示した図である。

【図17】鼻腔吸収伝達方式を通じてマウスモデルの脳組織に伝達されたＦＩＴＣ−スペキシンを免疫組織化学法で測定した結果を示した図である。

【図18】ＧＡＬＲ２アゴニストの効果的な伝達方式としての鼻腔吸収伝達方式による扁桃体及び弓状核内の神経細胞の活性度増加を検証した結果を示した図である。

【発明を実施するための最善の形態】

【0021】

以下、本発明の構成を具体的に説明する。

【0022】

本発明は、下記の化学式１で表示されるペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストに関するものである。

【0023】

［化学式１］
［ｄＮ］^１［Ｗ］^２［Ｔ］^３［Ｐ］^４［Ｎ］^５［Ａ］^６［Ａ］^７［Ｌ］^８［Ｙ］^９［Ｌ］^１０［Ｆ］^１１［Ｇ］^１２［Ｐ］^１３［Ｑ］^１４−ＮＨ_２

【0024】

前記化学式１において、アミノ酸は一つ又は複数個に随意に置換され、［Ａ］^７はＡ（アラニン）、［Ｆ］^１１はＦ（フェニルアラニン）である。そして、好ましくは、［Ｎ］^５はＮ（アスパラギン）ある。さらに、好ましくは、［Ｐ］^１３はＰ（プロリン）である、
そして、［ｄＮ］^１は、Ｄ型アスパリギンを示し、ピログルタミン酸（ｐＱ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｌ型アスパラギン（Ｎ）、及びグリシン（Ｇ）のうちいずれか一つに置換され、又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アセチル基（Ａｃ）、及びＦｍｏｃのうちいずれか一つが結合されたアスパラギンに随意に置換され、
［Ｗ］^２は、Ｄ型トリプトファン（ｄＷ）又は２−ナフチル（２−Ｎａｐｈｔｙｌ）基に随意に置換され、
［Ｔ］^３は、Ａ（アラニン）、又はＫ（リシン）に随意に置換され、
［Ｐ］^４は、Ｄ型アラニン（ｄＡ）、又はＤ型バリン（ｄＶ）に随意に置換され、
［Ｎ］^５はＱ（グルタミン）に随意に置換され、
［Ａ］^６はＤ型アラニン（ｄＡ）に随意に置換され、
［Ａ］^７はＭ（メチオニン）に随意に置換され、
［Ｆ］^８は、リシン（Ｋ）、Ｌ（ロイシン）、又はＹ（タイロシン）に随意に置換され、
［Ｐ］^９は、Ｄ型アラニン（ｄＡ）、又はＡ（アラニン）に随意に置換され、
［Ｑ］^１０は、Ｄ型グルタミン（ｄＱ）、又はＨ（ヒスチジン）に随意に置換され得る。

【0025】

好ましくは、前記アゴニストは下記の化学式２〜４のうちいずれか一つで表示され得る。

【0026】

［化学式１］
ｄＮＷＴＰＮＡＡＬＹＬＦＧＰＱ−ＮＨ_２

【0027】

［化学式３］
ＰＥＧ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２

【0028】

［化学式４］
Ｆｍｏｃ−ＮＷＴｄＡＮＡＡＬＹＬＦＧＰｄＱ−ＮＨ_２

【0029】

本発明のガラニン２型受容体のアゴニストは、ガラニン２型受容体（以下、「ＧＡＬＲ２」という）にのみ選択的に作用しながら長く作用し得るペプチド系アゴニストであることを特徴とする。

【0030】

一具体例によると、脊椎動物の多様な種に存在するガラニンとスペキシンのアミノ酸序列（配列）を比較した結果、ほとんどが異なるアミノ酸序列を有するが、ガラニンとスペキシンはトリプトファン［Ｔｒｐ^２］、９番目のチロシン［Ｔｙｒ^９］、１０番目のロイシン［Ｌｅｕ^１０］及び１２番目のグリシン［Ｇｌｙ^１２］を共通的に有することを確認した。スペキシンのアミノ酸序列とガラニンのアミノ酸序列とが同一である場合はＤ−型アミノ酸に置換し、スペキシン特異的にスペキシンのアミノ酸序列とガラニンのアミノ酸序列とが異なる場合は、該当のスペキシンのアミノ酸序列をガラニンのアミノ酸に置換するだけでなく、１４個のスペキシンのアミノ酸序列のそれぞれ異なるアミノ酸又はＤ−型アミノ酸に置換することによって各突然変異ペプチドを調製した。突然変異ペプチドのガラニン受容体に対する活性変化を観察した。

【0031】

このとき、ガラニン受容体に対する活性変化を観察するためにＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株を使用した。前記ＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株は、ＧｑのＣ−末端をＧｉのアミノ酸３個に置換し、Ｇｉの信号をＧｑ信号伝逹経路に転換したものであった。アルファ（ａ）、ベータ（ｂ）、及びガンマ（ｇ）の３つのサブユニットからなるヘテロ三量体（ｈｅｔｅｒｏ ｔｒｉｍｅｒ）であるＧタンパク質は、アルファサブユニットが細胞内の信号伝逹に関与する。アルファユニットは、s型（Ｇａｓ）、i型（Ｇａｉ）またはq / 11型であってもよい。アルファサブユニットがｓ型である場合（Ｇａｓ）は、細胞内酵素の一つであるアデニルシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）を活性化させることによってＡＴＰから代表的な二次メッセンジャーであるｃＡＭＰを生産し、ＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ）を活性化させる。アルファサブユニットがｉ型である場合（Ｇａｉ）は、上述したアデニルシクラーゼの活性を抑制する信号を送り、アルファサブユニットがｑ／１１型である場合は、細胞内のカルシウムの量を増加させたり、ＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）を活性化させる。ＧＡＬＲ亜型は、ＧＡＬＲ１、３型が抑制性Ｇｉ信号伝達体系を誘導する一方、ＧＡＬＲ２型は興奮性Ｇｑ信号伝達体系を誘導するという点で互いに異なるので、ＧｑのＣ−末端をＧｉの３個のアミノ酸に置換し、Ｇｉの信号をＧｑ信号伝逹経路に転換したＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株を使用しなければならない。

【0032】

前記突然変異ペプチドのガラニン受容体に対する活性変化を測定した結果、四重突然変異、すなわち、５番目のアミノ酸をアスパラギン［Ａｓｎ^５］に、７番目のアミノ酸をアラニン［Ａｌａ^７］に、１１番目のアミノ酸をフェニルアラニン［Ｐｈｅ^１１］に、１３番目のアラニンをプロリン［Ｐｒｏ^１３］に置換（Ｎ５Ａ７Ｆ１１Ｐ１３又はＱｕ）した場合、スペキシン水準でＧＡＬＲ２型に対する活性度は残っているが、３型に対する活性度は完全に消えた（図３Ａ〜図３Ｄ、図４参照）。また、このようなガラニンアミノ酸序列のスペキシンへの導入はＧＡＬＲ１型に対する活性度を誘導しないという点で、当該アミノ酸はＧＡＬＲ２型を活性化させるのに特異的であると言える。

【0033】

また、Ｄ型アミノ酸の置換は、受容体活性化に対する重要な序列を究明し、血清に存在する多様なペプチド分解酵素からペプチドを保護するために行われる。スペキシンの１番目のアミノ酸を除いて他の位置にあるアミノ酸のＤ型アミノ酸への置換は、ガラニン受容体の活性度を失う結果をもたらした。しかし、スペキシンの１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］のＤ−型置換［ｄＮ１］は、むしろＧＡＬＲ２型、３型の双方に対して活性度がやや増加することを示した（図５Ａ、図５Ｂ及び図６）。このような変化は、スペキシンの１番目のアミノ酸序列を置換することによって、血清内のペプチド分解酵素に対して安定的なアゴニストを開発することが可能であることを示している。

【0034】

そこで、スペキシンの１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］をピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ、ｐＱ）、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ、Ｃｉｔ）、Ｆｍｏｃなどに置換、又は、スペキシンのＮ−末端をポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ、ＰＥＧ）又はアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）させた結果、Ｄ型置換と同様に、これらの変形はＧＡＬＲ２型、３型に対する活性度に影響を与えなかった（図５Ａ〜図５Ｂ及び図６）。これは、スペキシンの１番目のアミノ酸序列の置換がＧＡＬＲの活性度には影響を与えないと共に、血清内のペプチド分解酵素に対する安定性を増加させることを強く示唆している。

【0035】

他の具体例において、本発明のペプチド系ＧＡＬＲ２アゴニストの安定性を検証するために、血清内でＧＡＬＲ２に対する活性度を測定し、受容体に対する活性度は、ＧＡＬＲ２を発現する細胞におけるＩＰ３生成程度を通じて測定した。

【0036】

その結果、スペキシンの活性度は、１２時間以内に８０％以下と非常に急速に減少するが、突然変異ペプチドは、スペキシンに比べてＩＰ３生成の減少は少なかった（図７ａ〜図７ｅ及び図８）。また、突然変異ペプチドは、スぺキシンに比べて血清内の分解速度が遅いので血清内の安定性が高いことが分かる。そこで、安定性が高く、ＧＡＬＲ２に対する特異的な形態であるｄＮ１−Ｑｕ四重突然変異と、ＰＥＧ、Ｆｍｏｃ−ＱｕｄＡ４ｄＱ１４六重突然変異（ＰＥＧ、Ｆｍｏｃ−ｓｅ）とを最終的に開発した（図７Ａ〜図７Ｅ及び図８）。

【0037】

ＧＡＬＲ２アゴニストの効果を検証するために、動物モデルの第３脳室に導管を挿入した後、ＧＡＬＲ２アゴニストを注入し、体重及び食餌量の変化を比較した。その結果、ＧＡＬＲ２アゴニストを注入した動物モデルの場合、スペキシンを注入した動物モデルに比べて食餌摂取が有意に減少し、これは体重の減少を誘導した（図９Ａ〜図９Ｄ）。ＧＡＬＲ２アゴニストの濃度に依存した食餌摂取減少及び体重減少の効果を確認した。市販されているＧＡＬＲ２アンタゴニストＭ８７１によってＧＡＬＲ２アゴニストの効果がなくなることを観察した（図９Ｅ、図９Ｆ）。

【0038】

また、脳室にＧＡＬＲ２アゴニストを注入すると、ｃ−ｆｏｓ抗体を通じて食欲を調節するものと知られている弓状核において神経細胞の活性が増加することが確認された（図１０）。

【0039】

脳内で摂食を調節することが知られているＰＯＭＣ神経細胞をインビトロで培養し、ＧＡＬＲ２アゴニストを処理したとき、細胞回路のｐＥＲＫがリン酸化され、インスリンとは効果が異なることを観察した。これは、ＧＡＬＲ２による効果がインスリンと異なる経路を通じて作用することを意味する（図１１Ａ）。また、ＧＡＬＲ２アゴニスト処理によるＰＯＭＣ遺伝子の増加及びａ−ＭＳＨホルモンの増加を確認できた（図１１Ｂ〜図１１Ｅ）。

【0040】

したがって、ＧＡＬＲ２アゴニストは、摂食行動を抑制し、肥満を治療するための薬物として使用可能であることを示唆する。

【0041】

次に、不安障害克服に対するＧＡＬＲ２アゴニストの効果を検証するために、動物モデルの側脳室に導管を挿入し、ＥＰＭ検査法を行って不安／強迫度を測定した結果、ＧＡＬＲ２アゴニストの注入によって全体の動きには差がないが、不安度が減少することが示された（図１２）。これはＯＦＴ検査法でも確認された（図１３）。また、ＧＡＬＲ２アゴニストの注入による不安調節脳領域である扁桃体で神経細胞の活性増加が観察され（図１４）、他の脳領域では神経細胞の活性は増加しなかった（図１５）。よって、ＧＡＬＲ２アゴニストは、不安障害治療のための薬物として使用可能であることを示唆する。

【0042】

また、ＧＡＬＲ２アゴニストの中毒性減少効果を検証するために、動物モデルの側脳室に導管を挿入し、ＳＰＴ検査法を行って中毒性を測定した結果、砂糖水の消費量は著しく減少し、甘い成分に対する中毒性が減少したことが分かった（図１６）。また、砂糖水をエネルギー源として認識すると見たとき、砂糖水消費量の減少は食欲又は摂食行動の減少を意味すると見ることができ、中毒に対する治療剤及び摂食障害治療剤としてＧＡＬＲ２アゴニストを使用可能であることが分かる。

【0043】

また、ペプチド性薬物が体内に伝達されて脳に作用するためには、血液脳障壁（Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過できる薬物伝達システムを導入しなければならない。鼻腔吸収（鼻吸入）方式を用いると、血液脳障壁を通過する小型分子の開発を経なくても薬物の脳内への伝達が可能である。

【0044】

そこで、スペキシンの脳内への伝達を検証するために、プロピレングリコールと組み合わせて蛍光スペキシンを動物モデルの鼻に注入して、鼻腔吸収伝達方式を実施した。その結果、食欲を調節するものと知られている弓状核（ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＡＲＣ）領域と情緒調節に関与するものと知られている黒質−腹側被蓋領域（sｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ−ｖｅｎｔｒａｌ ｔｅｇｍｅｎｔａｌ ａｒｅａ、ＳＮ−ＶＴＡ）において蛍光斑点（ｐｕｎｃｔａｔｅ）の形態で発見された（図１７）。また、鼻腔吸収方式は、脳室注射と同様に扁桃体及び弓状核の神経細胞の活性を誘導することが観察された（図１８）。これは、鼻腔吸収方式を用いた方法がペプチド性薬物の脳内への伝達に利用可能であり、スペキシンのアミノ酸序列の置換を通じて開発したＧＡＬＲ２アゴニストが摂食及び情緒関連疾患治療剤として開発可能であることを示唆する。

【0045】

本発明のＧＡＬＲ２アゴニストは、当業界における通常のペプチドの化学的合成方法（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，１９８３）によって合成することができる。具体的には、液相ペプチド合成法（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）、断片凝縮法、及びＦ−ｍｏｃ又はＴ−ＢＯＣ化学法で合成することが好ましいが、これらに限定されることはない。

【0046】

また、本発明のＧＡＬＲ２アゴニストは遺伝工学的方法によって製造され得る。まず、通常の方法によって前記ペプチドをコーディングするＤＮＡ序列を構築する。ＤＮＡ序列は、適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって構築することができる。他の方法として、当業界で公知となった標準方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機（例えば、ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ又はＡｐｐｌｉｅｄ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の製品）を用いてＤＮＡ序列を合成することもできる。前記ＤＮＡ序列は、これに作動可能に連結されてＤＮＡ序列の発現を調節する一つ又はそれ以上の発現調節序列（例：プロモーター、インヘンサーなど）を含むベクターに挿入する。 発現制御序列がＤＮＡ配列の発現を調節するわけではない。形成された組み換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。生成された形質転換体を、前記ＤＮＡ序列を発現させるのに適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記ＤＮＡ序列によってコーディングされた実質的に純粋なペプチドを当業界で公知となった方法（例えば、クロマトグラフィー）を用いて回収する。前記「実質的に純粋なペプチド」とは、本発明に係るペプチドが宿主に由来したいずれのタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のペプチド合成のための遺伝工学的方法は次の文献を参考することができる：Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｓｅｃｏｎｄ（１９９８） ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ（２０００） Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｔｈｒｉｅ ＆ Ｆｉｎｋ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，１９９１；及びＨｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：１２０７３−１２０８０、１９９０。

【0047】

また、本発明は、前記ペプチド系ガラニン２型受容体のアゴニストを含むガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

【0048】

前記ガラニン２型受容体によって誘導される疾患は、注意欠陥過活動性障害（ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＡＤＨＤ）、双極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、身体醜形障害（ｂｏｄｙ ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経性過食症（ｂｕｌｍｉａ ｎｅｒｖｏｓａ）を始めとした摂食障害、脱力発作（ｃａｔａｐｌｅｘｙ）、気分変調（ｄｙｓｔｈｙｍｉａ）、全般性不安障害（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、色情症（ｈｙｐｅｒｓｅｘｕａｌｉｔｙ）、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、衝動調節障害（ｉｍｐｕｌｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＭＤＤ）、病的盗癖（ｋｌｅｐｔｏｍａｎｉａ）、偏頭痛（ｍａｇｒａｉｎｅ）、大鬱病性障害（ｍａｊｏｒ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、ナルコレプシー（ｎａｒｃｏｌｅｐｓｙ）、強迫性障害（ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ−ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、反抗挑戦性障害（ｏｐｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ−ｄｅｆｉａｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、パニック障害（ｐａｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、外傷後ストレス障害（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＰＴＳＤ）、月経前不快気分障害（ｐｒｅｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｄｙｓｐｈｏｒｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＰＭＤＤ）、社会不安障害（ｓｏｃｉａｌ ａｎｘｉｅｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、慢性痛（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ）、間欠性爆発性障害（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病的賭博（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｇａｍｂｌｉｎｇ）、性格異常（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、放火狂（ｐｙｒｏｍａｎｉａ）、薬物乱用及び中毒（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｂｕｓｅ ａｎｄ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）、抜毛癖（ｔｒｉｃｈｏｔｉｌｌｏｍａｎｉａ）及びアルツハイマー病のうちいずれか一つであり得るが、これに限定されない。好ましくは、本発明のＧＡＬＲ２アゴニストは、神経性大食症、摂食障害、肥満障害、全般性不安障害、外傷後ストレス障害、強迫性障害、パニック障害、社会不安障害、薬物乱用及び中毒、又はアルツハイマー病の予防又は治療に使用可能である。

【0049】

また、本発明の医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含み得る。

【0050】

前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野で通常的に使用される担体及びビヒクルを含む。具体的には、イオン交換樹脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例：ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例：各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩又は電解質（例：硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコール又は羊毛脂などを含むが、これらに制限されることはない。

【0051】

また、本発明の組成物は、前記各成分以外に、滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、又は保存剤などをさらに含み得る。

【0052】

一様態として、本発明に係る組成物は、非経口投与のために水溶性溶液を用いて調製することができ、好ましくは、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）又は物理的に緩衝された塩水などの緩衝溶液を用いて調製することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのように懸濁液の粘度を増加可能な基質を添加することができる。

【0053】

本発明の組成物は、全身的又は局所的に投与することができ、このような投与のために公知の技術で適切な剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤又は食用担体と混合したり、硬質又は軟質ゼラチンカプセルに密封したり、又は錠剤に打錠して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合されて摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリクシール、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で使用可能である。

【0054】

注射用又は非経口投与用などの各種剤形は、当該技術分野で公知となった技法又は通用する技法によって注射用凍結乾燥粉末又は注射液に調製することができる。ＧＡＬＲ２アゴニストは、食塩水又は緩衝液に良好に溶解するので、冷凍乾燥状態で保管した後、有効量のＧＡＬＲ２アゴニストを、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などに適した形態で食塩水又は緩衝液に投与する直前に溶液に溶解させて投与することもできる。より好ましくは、前記組成物は、脳伝達のための鼻腔投与用剤形に調製可能である。

【0055】

本発明に係る医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防、抑制又は軽減効果を果たすのに必要な量を意味する。

【0056】

したがって、本発明に係る医薬組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物を始めとした多様な因子によって調節可能である。これらに制限されることはないが、本発明の医薬組成物は、大人の場合、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで１日１回〜３回投与され得る。

【0057】

また、本発明は、薬剤学的有効量の前記ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物を、それを必要とする対象体に投与することを含むガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0058】

前記ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の治療方法に使用される薬学的組成物及び投与方法は既に記述したので、これらに共通した内容の記載は、本明細書が過度に複雑となることを避けるために省略する。

【0059】

一方、前記ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療用組成物を投与できる対象体は、全ての動物であり、例えば、人間、豚、ゴリラ、猿、犬、猫、マウスなどの哺乳動物であり得る。

【0060】

前記ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の種類は上述した通りである。

【発明を実施するための形態】

【0061】

本発明の利点及び特徴、そして、それらを達成する方法は、詳細に後述している各実施例を参照すれば明確になるであろう。しかし、本発明は、以下で開示する各実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現可能である。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に発明の範囲を完全に知らせるために提供されるものであって、本発明は、請求項の範囲によって定義される。

【0062】

＜実施例１＞スペキシンのアミノ酸序列の置換によるＧＡＬＲ２型特異的、安定的なアゴニストの開発

【0063】

ＧＡＬＲ２型に選択的に作用しながら長く作用し得るアゴニストを開発するために、スペキシン１、スペキシン２、ガラニン及びガラニン類似ペプチドのアミノ酸序列を比較した。アミノ酸序列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からダウンロードし、これらのアミノ酸序列のうち成熟した序列を比較した。脊椎動物内の多様な種に存在するガラニンとスペキシンのアミノ酸序列を比較したとき、ほとんどが異なるアミノ酸を有しているが、ガラニンとスペキシンは、いずれも２番目のトリプトファン［Ｔｒｐ^２］、９番目のチロシン［Ｔｙｒ^９］、１０番目のロイシン［Ｌｅｕ^１０］及び１２番目のグリシン［Ｇｌｙ^１２］を共通的に有することを確認した。スペキシンのアミノ酸序列とガラニンのアミノ酸序列とが同一である場合は、Ｄ−型アミノ酸に置換し、スペキシン特異的にスペキシンのアミノ酸序列とガラニンのアミノ酸序列とが異なる場合は、該当のスペキシンのアミノ酸序列をガラニンのアミノ酸に置換した。また、スペキシンのアミノ酸序列をガラニンのアミノ酸に置換すること以外にも、１４個のスペキシンのアミノ酸序列のそれぞれを他のアミノ酸又はＤ−型アミノ酸に置換し、それぞれの突然変異ペプチドのガラニン受容体に対する活性の変化を観察した（図１及び図２Ａ〜図２Ｂ）。

【0064】

既存の各文献によると、Ｇタンパク質−連結受容体は作用剤と結合した後、細胞内への信号伝逹を引き起こすために既存のＧタンパク質のアルファサブユニットに連結されたＧＤＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）型をＧＴＰ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）型に置換することが知られている。Ｇタンパク質は、アルファ（ａ）、ベータ（ｂ）、及びガンマ（ｇ）の三つのサブユニットからなるヘテロ三量体（ｈｅｔｅｒｏ ｔｒｉｍｅｒ）である。このうち、細胞内への信号伝逹において最も主要な信号はアルファサブユニットから発生する。例えば、アルファサブユニットがｓ型である場合（Ｇａｓ）は、細胞内酵素の一つであるアデニルシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）を活性化させることによってＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から代表的な二次メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）であるｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ）を生成し、ＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ）を活性化させる。一方、アルファサブユニットがｉ型である場合（Ｇａｉ）は、上述したアデニルシクラーゼの活性を抑制する信号を送る。アルファサブユニットがｑ／１１型である場合は、細胞内でカルシウムの量を増加させたり、ＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）を活性化させる。このように、Ｇタンパク質−連結受容体とＧタンパク質との間の結合は、受容体類型に依存的な固有の特性である。ＧＡＬＲ亜型の場合は、ＧＡＬＲ１、３型が抑制性Ｇｉ信号伝達体系を誘導する一方、ＧＡＬＲ２型は興奮性Ｇｑ信号伝達体系を誘導するという点で互いに異なるので、ＧｑのＣ−末端をＧｉのアミノ酸３個に置換し、Ｇｉの信号をＧｑ信号伝逹経路に転換したＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ安定細胞株が使用された。ＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）プロモータによってルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ｌｕｃ）を発現させるＳＲＥ−ｌｕｃ分析システムが受容体の活性度を測定するために使用された。ルミノメーターを使用すると発現するルシフェラーゼと、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）との反応でもたらされる光を感知することによって受容体亜型特異的又はリガンド特異的な細胞活性を観察することができる。ＨＥＫ２９３−Ｇ_ｑｉ細胞を４８ウェル−プレートに継代（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）してから１日後、ＧＡＬＲ２型又は３型をそれぞれコードするプラスミドＤＮＡとＳＲＥ−ｌｕｃプラスミドＤＮＡを１：１で混ぜ｛（７５ｎｇ ＋ ７５ｎｇ）／ｗｅｌｌ｝、エフェクテン（ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）試薬を混合（２μｌ／ｗｅｌｌ）して溶液を処理した。３時間後、これを１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭに取り替えた。２４時間後、ＦＢＳがないＤＭＥＭ培地に取り替え、これから１６時間後に構築したスペキシン基盤の突然変異ペプチドを６時間にわたって３７℃でさらに培養した。この段階が終了した各細胞は、ＰＢＳで洗浄した後、ライシスバッファー（０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）１００μｌで２０分間常温で溶解した。ルシフェラーゼの活性は、ルシフェリン溶液（０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２、０．１Ｍ ＡＴＰ、０．０５Ｍ Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．８）が自動的に投入されるｓｙｎｅｒｇｙ ２ マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉ−ｍｏｄｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（ＢｉｏＴｅｋ社、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で測定した。

【0065】

図３Ａ〜図３Ｄ及び図４に示したように、スペキシン突然変異ペプチドのうちスペキシンの８番目のロイシンをグリシン［Ｇｌｙ^８］に置換したとき、ＧＡＬＲ２型と３型の双方に対する活性度が減少した。１番目のアルパラギンをグリシン［Ｇｌｙ^１］に、４番目のプロリンをロイシン［Ｌｅｕ^４］に、１４番目のグルタミンをヒスチジン［Ｈｉｓ^１４］に置換したとき、二つの受容体に対する活性度はスペキシンと同様に維持された。５番目のグルタミンをアスパラギン［Ａｓｎ^５］に、７番目のメチオニンをアラニン［Ａｌａ^７］に、１１番目のリシンをロイシン［Ｌｅｕ^１１］又はフェニルアラニン［Ｐｈｅ^１１］に、１３番目のアラニンをプロリン［Ｐｒｏ^１３］に置換したとき、ＧＡＬＲ２型に対する活性度には変化がなかったが、ＧＡＬＲ３型に対する活性度は減少することを確認できた。これは、スペキシンのアミノ酸序列の５番目のグルタミン［Ｇｌｎ^５］、７番目のメチオニン［Ｍｅｔ^７］、１１番目のリシン［Ｌｙｓ^１１］及び１３番目のアラニン［Ａｌａ^１３］が、ＧＡＬＲ２型の活性化よりもＧＡＬＲ３型の活性化において重要な序列であることを示唆する。追加的な検証のために、スペキシンペプチドの５、７、１１、１３番目の序列をガラニンの序列に置換させた多重突然変異を構築した。二重突然変異（Ａ７Ｆ１１、７番目のアミノ酸をアラニン［Ａｌａ^７］に、１１番目のアミノ酸をフェニルアラニン［Ｐｈｅ^１１］に置換）と三重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１、５番目のアミノ酸をアスパラギン［Ａｓｎ^５］に、７番目のアミノ酸をアラニン［Ａｌａ^７］に、１１番目のアミノ酸をフェニルアラニン［Ｐｈｅ^１１］に置換）のＧＡＬＲ３型に対する活性度が著しく減少したことを確認できた。また、二重、三重突然変異は、１０μＭの高濃度でのみＧＡＬＲ３型を最大に活性化させることができた。四重突然変異（Ｎ５Ａ７Ｆ１１Ｐ１３又はＱｕ、５番目のアミノ酸をアスパラギン［Ａｓｎ^５］に、７番目のアミノ酸をアラニン［Ａｌａ^７］に、１１番目のアミノ酸をフェニルアラニン［Ｐｈｅ^１１］に、１３番目のアラニンをプロリン［Ｐｒｏ^１３］に置換）は、スペキシン水準でＧＡＬＲ２型に対する活性度は残っているが、３型に対する活性度が完全に消えた（図３Ａ〜図３Ｄ、図４）。また、このようなガラニンのアミノ酸序列のスペキシンへの導入はＧＡＬＲ１型に対する活性度を誘導しないという点で、該当のアミノ酸はＧＡＬＲ２型を活性化させるのに特異的であると言える。

【0066】

Ｄ−型アミノ酸序列を置換する目的は、受容体の活性化に対して重要な序列を究明することにあり、また、Ｄ−型アミノ酸が血清に存在する多様なペプチド分解酵素からペプチドを保護する役割をするという点でＤ−型アミノ酸への変化に影響を受けない部分を究明することにある。スペキシンのアミノ酸序列のそれぞれがＤ−型アミノ酸に置換された各突然変異は、ＧＡＬＲ２型又は３型を発現する細胞に処理した後で活性度を測定した（図５Ａ〜図５Ｂ、図６）。突然変異のうち３、９、１０番目のアミノ酸がＤ−型に置換された場合、ＧＡＬＲ２型、３型の全てに対する活性度を失うことを示した。これは、スペキシンの３、９、１０番目のアミノ酸がガラニン受容体の活性化において重要な序列であることを意味する。また、６、１２、１４番目のアミノ酸のＤ−型置換は、受容体に対する活性度がやや減少したことを示した。２、４番目のアミノ酸のＤ−型置換は、受容体に対する活性度の変化を少し示すが、これは、スペキシンの２番目のトリプトファン［Ｔｒｐ^２］及び４番目のアラニン［Ａｌａ^４］がＧＡＬＲ２型と３型の活性化において重要でないことを意味する。スペキシンの１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］のＤ−型置換［ｄＮ^１］は、むしろＧＡＬＲ２型、３型の全てに対する活性度がやや増加することを示した（図５Ａ〜図５Ｂ、図６）。このような変化は、スペキシンの１番目のアミノ酸序列を置換することによって血清内のペプチド分解酵素に対して安定的なアゴニストを開発可能であることを示す。そこで、スペキシンの１番目のアスパラギン［Ａｓｎ^１］をピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ、ｐＱ）、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ、Ｃｉｔ）、Ｆｍｏｃに置換、又は、スペキシンのＮ−末端をポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ、ＰＥＧ）又はアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）させた。Ｄ−型置換と同様に、これらの変形は、ＧＡＬＲ２型、３型に対する活性度に影響を与えなかった（図５ａ、図５ｂ及び図６）。これは、スペキシンの１番目のアミノ酸序列の置換がＧＡＬＲの活性度に影響を与えないと共に、血清内のペプチド分解酵素に対する安定性を増加させることを強く示唆している。

【0067】

＜実施例２＞１００％胎児血清におけるＧＡＬＲ２アゴニストの安定性

【0068】

スペキシン基盤の突然変異ペプチドの安定性を調査するために、変形した突然変異ペプチドを初期濃度１０μＭ、１００％胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）内で３７℃で０、３、６、１２、２４、４８、７２時間反応させた後、ＧＡＬＲ２型に対する活性度を測定した。受容体に対する活性度は、ＧＡＬＲ２型を発現する細胞におけるＩＰ３（ｉｎｏｓｉｔｏｌ １，４，５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）生成程度を介して測定された。ＩＰ３生成を確認するために、細胞を１２ウェル−プレートに継代（２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）してから１日後、ＧＡＬＲ２型をコードするプラスミドＤＮＡ １μｇと、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを混合した溶液で処理した。１日後、１％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％抗生剤及びｍｙｏ−^３ Ｈイノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）（１ｕＣｉ／ｗｅｌｌ）が含まれたＭ１９９培地で２０時間にわたって追加的に培養し、イノシトールリン酸塩（ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を放射性標識した。この段階が終了した各細胞は、バッファーＡ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、４ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ＭｇＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬの遊離脂肪酸含有ウテア血清アルブミン、１０ｍＭ ＬｉＣｌ、ｐＨ７．２）で３０分間反応させた後、１００％ＦＢＳで反応させた突然変異ペプチドを処理して３７℃で４０分間反応させた。反応が終了した後で培地を除去し、１０ｍＭのギ酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）を１ｍＬ入れて反応を終了させた。反応が終了したプレートを３０分間４℃に維持した後、ギ酸によって抽出された溶液を５００μｌのＡＧ１−８Ｘ陰イオン交換カラムが入っている６ｍＬプラスチックチューブに移して軽くボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）をすると、上層液と標識された混合物とが分離されるが、ここで上層液を除去した。１ｍＬの３次蒸留水で２回ずつ洗った後、６０ｍＭのギ酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ）／５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ）で２回ずつ洗った。放射性標識された混合物を１Ｍのギ酸アンモニウム／０．１Ｍのギ酸１ｍＬで溶出した。このうち８００μｌをシンチレーション（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ）チューブに移した後、２ｍＬのシンチレーション溶液（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ^ＴＭ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）と混ぜた。放射性標識された混合物とシンチレーション溶液とが混じった混合溶液をＴＲＩ ｃａｒｂ ２１００ＴＲ液体シンチレーションアナライザー（ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｐａｃｋａｒｄ社）で測定した。

【0069】

図７Ａ〜図７Ｅ及び図８に示したように、スペキシンの活性度は、１２時間以内に８０％以下にと非常に速く減少した。その一方、４番目のアラニン置換のみならず、Ｎ−末端変形があるペプチド（ｄＡｌａ４）は、野生型スペキシンに比べてＩＰ３生成程度が減少し、より良い安定性を示した（図７ａ）。これは、スペキシンのＮ−末端をＰＥＧ又はＦｍｏｃなどの疎水性分子に置換、又は、スペキシンの４番目のアラニン及び１４番目のグルタミンをＤ−型に変えたとき、ペプチドの血清内の安定性が増加することを意味する。

【0070】

一方、ｄＡｌａ４及びｄＧｌｎ１４置換は、血清内のペプチドの寿命を延した。

【0071】

また、四重突然変異（Ｑｕ）及び四重突然変異のＮ−末端変形及び／又は４、１４番目のアミノ酸をＤ−型に置換したとき、ペプチドの血清内の分解程度を測定した。四重突然変異は、野生型スペキシンに比べて分解が速く起こったが、四重突然変異のＮ−末端のＰＥＧ、Ｆｍｏｃ置換、４、１４番目のアミノ酸のＤ−型二重置換は、血清（ＦＢＳ及びヒト血清）内でペプチドの寿命を増加させ、安定性を高めることを示した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。

【0072】

また、四重突然変異のＮ−末端変形ペプチドは、ＧＡＬＲ２型、３型に対して四重突然変異と同じ程度の活性度を示した（図７ｄ、図７ｅ及び図８）。四重突然変異変形ペプチドのＧＡＬＲ３型に対する活性度は１０μＭの高濃度でのみ示された。結果的に、図８で提示した突然変異ペプチドは、スペキシン、四重突然変異と同じ程度にＧＡＬＲ２型に特異的に作用し、血清内でさらに安定的に維持される、改善されたＧＡＬＲ２型のアゴニストであると言える。

【0073】

＜実施例３＞改善されたＧＡＬＲ２アゴニストの摂食抑制効果の検証

【0074】

９週齢の黒い雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ｍｏｕｓｅ）を、オリエントバイオ社（ｗｗｗ．ｏｒｉｅｎｔ．ｃｏ．ｋｒ）から購入した。購入したマウスは、飼料及び水が適切に与えられ、２０℃〜２４℃に温度が維持され、湿度が４０％〜７０％であるケージ（ｃａｇｅ）で飼育された。また、この野生型マウスは、午前８時に点灯し、午後８時に消灯する１２／１２明暗サイクル（ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｃｙｃｌｅ）で保管された。全ての実験は、最小限数のマウスを使用するように設計され、実験動物倫理に従って麻酔法を実施し、実験に使用されたマウスの苦痛を最小化した。これは、高麗大学動物管理及び利用委員会によって証明された。マウスの脳に導管を挿入するために、マウスをペントバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した後、定位固定（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）装置で２６−ケージカニューラを右側脳室に挿入した。これを、二つの小さいねじを用いて脳の頭蓋骨に堅固に固定した後、歯科用セメントで縫合した。２週間の回復期を経たマウスにハミルトンシリンジ（ｈａｍｉｌｔｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて分当たり０．５μｌの速度でアゴニストを注入した。食餌の摂取量及び体重の変化は、アゴニストを注入する前の飼料及びマウスの重さを測定した後、１、２、４、１２、２４時間にわたって飼料の重さを測定し、２４時間後のマウスの重さを測定することによって既存の重さとの差を比較した。

【0075】

ＧＡＬＲ２アゴニストの摂食行動及び体重変化の効果を検証するために、第３脳室に導管を挿入した後、対照群である人工脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ、ａｃｓｆ）又は実験群であるスペキシン３μｇ、そして、四重突然変異の１番目のアミノ酸をＤ−型に置換し、安定性を高めたペプチド（ｄＮ１−Ｑｕ）３μｇを注入した後、２４時間にわたって体重及び食餌量の変化を比較した。その結果、対照群と比較したとき、ＧＡＬＲ２のアゴニストを注入したマウスは、スペキシンを注入したマウスに比べて時間の経過と共に食餌摂取が有意に減少することを示し、体重の減少効果を誘導することが分かった（図９Ａ〜図９Ｂ）。また、ＰＥＧ六重突然変異を０．５、１、３μｇずつ濃度別に注入した後、食餌摂取及び体重減少を確認した（図９Ｃ、図９Ｄ）。また、Ｍ８７１を１０μｇ注入した後、ＰＥＧ六重突然変異を３μｇ注入したとき、このような食餌摂取及び体重減少の効果がなくなることが分かった（図９Ｅ、図９Ｆ）。

【0076】

ＧＡＬＲ２アゴニストの注入による食欲調節脳神経細胞の活性度増加を確認するために免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を実施した。成体マウスに対してＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕ ０．４、４、４０μｇを脳室に注入してから１時間後に腹腔麻酔を実施し、胸部の皮を切開し、左心室（ｌｅｆｔ ｃａｒｄｉａｃ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に注射針を刺入し、０. ９％生理食塩水５０ｍＬで血液を抜き出した後、５０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドが含有された０．９％リン酸緩衝食塩水で２４時間固定し、３０％の砂糖が含有されたリン酸緩衝食塩水で２４時間ほど処理した。その後、これを脳組織用鋳型（ｍｏｌｄ）に置き、３０％の砂糖溶液を含むＯＣＴ合成物を入れ、ドライアイス上で冷たく維持させたイソペンタン（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｅ）溶液に移して凍らせ、利用前まで８０℃で保管した。保管されたマウスの脳組織を冷凍微細切断機（ｃｒｙｓｔａｔ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて４０μｍに薄く切断した後、免疫組織化学法を実施した。神経細胞の活性度を検証できるｃ−ｆｏｓ抗体（１：２０００希釈比率）を通じてＧＡＬＲ２アゴニストの注入による食欲調節脳領域である弓状核におけるｃ−ｆｏｓを発現する神経細胞の増加を確認できた（図１０）。また、弓状核に存在して食欲を調節するものと知られているＰＯＭＣ神経細胞をインビトロで培養し、Ｆｍｏｃ六重突然変異１μＭ及びインスリン１０ｎＭを処理してＰＢＳで洗浄した後、ライシスバッファー（０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）１００μｌで２０分間常温で溶解した。

【0077】

細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットによって分析した。インスリンによってはＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化が示されるが、ＧＡＬＲ２アゴニストによってはＥＲＫ経路のみがリン酸化されることによって、ＧＡＬＲ２がインスリンとは異なる経路を通じて作用することが分かった（図１１Ａ）。また、ＰＯＭＣ神経細胞にＧＡＬＲ２アゴニストを処理した後、ｍＲＮＡを抽出したときにＰＯＭＣ神経細胞が増加し、ａ−ＭＳＨホルモンが増加することが分かった（図１１Ｂ〜図１１Ｅ）。これは、改善されたＧＡＬＲ２アゴニストが摂食行動を抑制し、肥満を治療できる薬物として使用可能であることを示唆している。

【0078】

＜実施例４＞不安障害克服のためのアゴニストの効能測定

【0079】

不安障害克服に対するＧＡＬＲ２アゴニストの効果を検証するために、実施例３の方法でマウスの側脳室に導管を挿入し、対照群であるジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）又は実験群であるＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕを４μｇ注入してから２時間〜３時間後、不安／強迫度を測定するＥＰＭ検査法（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を実施した。ＥＰＭ検査法は、閉鎖部分（ｃｌｏｓｅｄ ａｒｍ）及び開放部分（ｏｐｅｎ ａｒｍ）で構成された高架式十字迷路において閉鎖部分を好むマウスの性質を用いた方法であって、開放部分に多く出るほど不安度が低いことを用いた検査法である。マウスを十字迷路に載せた後、開放部分に存する時間（ｔｉｍｅ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｒｍ）、回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｏｐｅｎ ａｒｍ ｅｎｔｒｙ）及び全体の動き（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｅｎｔｅｒ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）を１５分間測定し、後半１０分を結果分析に使用した。

【0080】

その結果、ＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕの注入によって全体の動きには差がないが、開放部分に留まる時間及び開放部分に入る回数の増加によって不安度が減少することを示した（図１２）。

【0081】

また、このような不安度減少効果は、活動性及び不安効果を同時に測定するＯＦＴ検査法（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ）を行って検証した。ＯＦＴは、四角い領域でマウスが中央より周辺部に留まる行動を用いた検査法である。マウスを四角い領域の中央に下ろし、周辺部に移動した瞬間から１０分間、中央部に入った比率（％ｔｉｍｅ ｉｎ ｃｅｎｔｅｒ）、全体の動きのうち中央から動いた距離の比率（％ｄｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｅｎｔｅｒ）及び全体の動き（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定し、前半と後半５分をそれぞれ分析に使用した。対照群と反復的な電気衝撃を通じて不安度増加を誘導したマウスの側脳室にＤＭＳＯ又はＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕを４μｇ注入してから２時間〜３時間後、不安度及び活動性を測定した。

【0082】

前半５分区間で不安が誘導されたマウスの場合、対照群であるＤＭＳＯに比べて全体の動きには差がないが、ＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕの注入による中央への動きが増加することによって不安度が減少することを確認できた。また、後半５分区間で不安が誘導された後、ＤＭＳＯを注入したマウスで不安度が増加するのとは対照的に、ｄＮ１−Ｑｕの注入による中央での動きが増加することによって不安度減少効果を検証できた（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。

【0083】

また、ＧＡＬＲ２アゴニストの注入による不安調節脳神経細胞の活性度増加を確認するために免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を実施した。成体マウスに対してＧＡＬＲ２アゴニスト０．４、４、４０μｇを脳室に注入してから１時間〜２時間後に腹腔麻酔を実施し、胸部の皮を切開し、左心室に注射針を刺入し、０．９％生理食塩水５０ｍＬで血液を抜き出した後、５０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドが含有された０．９％リン酸緩衝食塩水で２４時間固定し、３０％の砂糖が含有されたリン酸緩衝食塩水で２４時間ほど処理した。その後、これを脳組織用鋳型に置き、３０％の砂糖溶液を含むＯＣＴ合成物を入れ、ドライアイス上で冷たく維持させたイソペンタン溶液に移して凍らせ、利用前まで８０℃で保管した。保管されたマウスの脳組織を冷凍微細切断機を用いて４０μｍに薄く切断した後、免疫組織化学法を実施した。

【0084】

神経細胞の活性度を検証できるｃ−ｆｏｓ抗体（１：２０００希釈比率）を通じて、ＧＡＬＲ２アゴニストの注入による不安調節脳領域である扁桃体におけるｃ−ｆｏｓを発現する神経細胞の増加を確認できた（図１４）。他の情緒調節脳領域における神経細胞が活性化されないことによって、ＧＡＬＲ２アゴニストの不安調節に特異的な効果を示すことを検証できた（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。これは、ＧＡＬＲ２アゴニストが不安障害治療のための薬物として使用可能であることを示唆する。また、扁桃体は、不安障害及び外傷後ストレス症侯群（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＰＴＳＤ）とも密接に関連しており、これにより、ＧＡＬＲ２アゴニストがＰＴＳＤの治療のための薬物として使用可能であることが示唆される。

【0085】

＜実施例５＞ＧＡＬＲ２アゴニストの中毒性減少効能の検証

【0086】

ＧＡＬＲ２アゴニストの中毒性減少効果を検証するために、実施例３の方法でマウスの側脳室に導管を挿入し、ＤＭＳＯ及び０．４、４、４０μｇのｄＮ１−Ｑｕを注射した後、中毒性を測定できるＳＰＴ検査法（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）を通じて２日間の水消費量及び１％砂糖水消費量を測定した。水槽に水及び砂糖水をそれぞれ入れ、アゴニストを注射する前の重さを測定した後、２日間自由に液体を消費できるようにしてから２日後に水槽の重さを測定し、全体の液体消費量と全体の液体中の砂糖水消費との比率を比較する方法を用いた。

【0087】

２日間の測定結果、全体の液体消費量には差がないが、対照群の場合は、全体の液体消費量中の７０％程度を砂糖水で消費する一方、ＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕを注入したときは全体の液体消費量に対する砂糖水の消費量が６０％以下に減少することが示された。また、砂糖水の消費量のみを比較したとき、ＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕを注入すると砂糖水の消費量が著しく減少したことが分かった（図１６）。これは、甘い成分に対する中毒性がＧＡＬＲ２アゴニストｄＮ１−Ｑｕの注入によって減少していることを意味する。その一方で、砂糖水をエネルギー源として認識すると見たとき、砂糖水消費量の減少は、食欲又は摂食行動の減少を意味すると見ることもできる。よって、中毒に対する治療剤及び摂食障害治療剤としてのＧＡＬＲ２アゴニストの用途を示唆している。

【0088】

＜実施例６＞鼻腔吸収方式を通じた脳内伝達方法の検証

【0089】

ペプチド性薬物が体内に伝達されて脳に作用するためには、血液脳障壁（Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過できる薬物伝達システムを導入しなければならない。鼻腔吸収技法によると、血液脳障壁を通過する小型分子の開発を経なくても薬物の脳内への伝達が可能である。実際に、鼻腔吸収方式は、オキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）の薬物伝達方式として検証されたことがあり、オキシトシンの注入後、ヒトの脳活性に変化が誘導されたというｆＭＲＩ結果を通じて、ペプチド性薬物が脳に作用する効果をより効率的に高められる方法として期待される。スペキシンの脳内への伝達を検証するために、スペキシンに蛍光物質であるＦＩＴＣを標識（ＦＩＴＣ−スペキシン）し、鼻腔吸収伝達方式の研究に使用されるプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）と組み合わせ、ペントバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔されたマウスの鼻に４μｇを注入し、３時間後に免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を行ってＦＩＴＣ蛍光信号を示す脳領域を調査した。成体マウスに腹腔麻酔を実施し、胸部の皮を切開し、左心室（ｌｅｆｔ ｃａｒｄｉａｃ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に注射針を刺入し、０．９％生理食塩水５０ｍＬで血液を抜き出した後、５０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドが含有された０．９％リン酸緩衝食塩水で２４時間固定し、３０％の砂糖が含有されたリン酸緩衝食塩水で２４時間ほど処理した。その後、これを脳組織用鋳型に置き、３０％の砂糖溶液を含むＯＣＴ合成物を入れ、ドライアイス上で冷たく維持させたイソペンタン溶液に移して凍らせ、利用前まで８０℃で保管した。保管されたマウスの脳組織を冷凍微細切断機（ｃｒｙｓｔａｔ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて４０μｍに薄く切断した後、免疫組織化学法を実施した。

【0090】

その結果、ＦＩＴＣ−スペキシンの鼻腔吸収方式を介したＦＩＴＣ蛍光信号は、食欲を調節するものと知られている弓状核（ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＡＲＣ）領域と、情緒調節に関与するものと知られている黒質−腹側被蓋領域（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ−ｖｅｎｔｒａｌ ｔｅｇｍｅｎｔａｌ ａｒｅａ、ＳＮ−ＶＴＡ）で斑点（ｐｕｎｃｔａｔｅ）の形態で発見された（図１７）。また、鼻腔吸収方式のためにプロピレングリコールと組み合わせたＧＡＬＲ２アゴニストＰＥＧ−ｓｅを８μｇ鼻に注入してから１時間〜２時間後に脳室注射と比較したとき、脳室注射によって神経細胞活性の増加を示した扁桃体及び弓状核において、鼻腔吸収によって二つの脳領域の全てでＧＡＬＲ２アゴニストによる神経細胞活性の増加を確認できた（図１８）。これは、鼻腔吸収方式を用いた方法がペプチド性薬物の脳内への伝達に利用可能であり、スペキシンのアミノ酸序列置換を通じて開発したＧＡＬＲ２アゴニストが摂食及び情緒関連疾患治療剤として開発可能であることを示唆している。

【産業上の利用可能性】

【0091】

本発明は、ガラニン２型受容体によって誘導される疾患の予防又は治療分野で使用可能である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]