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特許6619332ヒトＥＺＨ２遺伝子中の変異を検出するための方法及び組成物

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6619332

(24)【登録日】2019年11月22日

(45)【発行日】2019年12月11日

(54)【発明の名称】ヒトＥＺＨ２遺伝子中の変異を検出するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/6858 20180101AFI20191202BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20191202BHJP

A61K 45/00 20060101ALN20191202BHJP

A61P 35/00 20060101ALN20191202BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6858 Z

C12N15/09 ZZNA

!A61K45/00

!A61P35/00

【請求項の数】9

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-516945(P2016-516945)

(86)(22)【出願日】2014年10月7日

(65)【公表番号】特表2016-533708(P2016-533708A)

(43)【公表日】2016年11月4日

(86)【国際出願番号】EP2014071372

(87)【国際公開番号】WO2015052147

(87)【国際公開日】20150416

【審査請求日】2017年10月4日

(31)【優先権主張番号】61/888,660

(32)【優先日】2013年10月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡＲＯＣＨＥＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100164563

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木貴英

(72)【発明者】

【氏名】シヤオジュイマックスマー

(72)【発明者】

【氏名】チトラマノハー

(72)【発明者】

【氏名】アリソンツァン

【審査官】西村亜希子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０４９７７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第０１／０４２４９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Anal. Biochem.，２００５年，Vol.340，pp.287-294

【文献】 Blood，２０１３年９月１９日，Vol.122，pp.3165-3168

【文献】 Cancer Cytopathology，２０１３年１月２９日，Vol.121，pp.377-386

【文献】 Plant Methods，２０１２年，Vol.8，34

【文献】 Genome Research，１９９２年，Vol.2，pp.14-20

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／６８５８

Ｃ１２Ｎ１５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然に存在するヒトＥＺＨ２遺伝子の配列と１つのミスマッチを含むことを除いて、ＥＺＨ２＿Ｙ６４６Ｈ＿Ｒ（配列番号１１）のオリゴヌクレオチド配列を含む、ヒトＥＺＨ２遺伝子における変異を検出するための、単離されたオリゴヌクレオチドであって、
前記ミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端の最後の５つのヌクレオチドの中のｎ−２位又はｎ−３位に位置し、ここでｎは、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドであり、配列番号１５、１６及び１８〜２０から成る群から選択される、単離されたオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを更に含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

核酸試料中のヒトＥＺＨ２核酸における変異を検出する方法であって、
（ａ）前記核酸試料を請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドが前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列へとハイブリダイゼーションすることができる条件下で前記核酸試料をインキュベートし、
（ｃ）前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列を含む増幅産物を生成させ、そして
（ｄ）前記増幅産物の存在を検出し、それにより前記ＥＺＨ２核酸中の変異の存在を検出すること
を含む、前記方法。

【請求項4】

前記核酸試料は、血液細胞、血漿、血清又はホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

悪性腫瘍を有する患者が、ＥＺＨ２阻害剤に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、
（ａ）前記患者由来の核酸試料を、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドがＥＺＨ２核酸中の標的配列へとハイブリダイゼーションすることができる条件下で前記試料をインキュベートし、前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列を含む増幅産物を生成させ、
（ｃ）前記増幅産物の存在を検出し、それにより前記ＥＺＨ２核酸中の変異の存在を検出すること
を含み、ここで、前記変異の存在は、前記患者がＥＺＨ２阻害剤に応答する可能性があることを示す、前記方法。

【請求項6】

前記悪性腫瘍は癌の兆候であり、ここで前記癌はリンパ腫である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ヒトＥＺＨ２遺伝子における変異を検出するためのキットであって、
請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドと、
ＰＣＲにおける使用のための少なくとも１つの追加の試薬と
を含む、前記キット。

【請求項8】

前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１６、１８、１９及び２０から選択される、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

１又は２以上の対応する第二プライマー、標識されていてもよい１又は２以上のプローブ、ヌクレオチド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び／又は緩衝液をさらに含む、請求項７又は８に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の技術分野
本発明は、癌診断、及び癌療法のためのコンパニオン診断に関する。特に、本発明は、癌の診断及び予後判定（prognosis）のために、並びに癌治療の有効性を予測するために有用である、変異の検出に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ＥＺＨ２は、クロマチン−修飾酵素標的化ヒストンタンパク質である。特に、ＥＺＨ２タンパク質は、ヒストン３（Ｈ３）のリシン−２７（Ｋ２７）に対して特異的なヒストンメチルトランスフェラーゼであるポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の触媒サブユニットである。メチル化されたＨ３−Ｋ２７は、遺伝子抑制に関連している。ＥＺＨ２の異常に高められたレベルが、種々の癌組織に見出されており、そして遺伝子抑制に関連しており、このことは、Simon, J., and Lange, C. (2008) Roles of EZH2 histone methyltransferase in cancer epigenetics, Mut. Res. 647:21に報告されている。特定の変異がその基質選択性を変えることにより、ＥＺＨ２タンパク質のヒストン−修飾機能を変更することもまた発見されている。位置Ｙ６４６変異誘発されたＥＺＨ２（Wiggle, T., et al. (2011) FEBS Lett. 585:3011を参照のこと）は、ジメチル化Ｈ３（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２）をトリメチル化形（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）へとメチル化することについて異常に活性的である。位置Ａ６２９で変異誘発されたＥＺＨ２（Majer, C., et al. (2012) FEBS Lett, 586:3348を参照のこと）は、ジメチル化について異常に活性的であり；そして位置Ａ６８２で変異誘発されたＥＺＨ２（McCabe, M., et al. (2012), PNAS 109:2989を参照のこと）は、すべての３種のメチル化段階で異常に活性的である。ヒト癌においては、それらの変異は、ヒストン過剰メチル化を介して遺伝子抑制を促進することが示されている。

【0003】

ＥＺＨ２標的化治療が開発されている。ＥＺＨ２の選択的小分子阻害剤は、ＥＺＨ２（及びＰＲＣ２）活性をブロックし、そしてインビトロで癌細胞の死滅化を促進することが知られている（Knutson, S, et al. (2012) Nature Chem. Bio. 8:890）。その阻害剤は、野生型ＥＺＨ２（Ｉｄ．）を有する細胞に影響を及ぼさないで、異常活性変異体ＥＺＨ２を有する細胞の死滅化で独自に効果的である。従って、コンパニオン診断試験は、腫瘍が変異体ＥＺＨ２を有し、そしておそらく、ＥＺＨ２阻害剤の恩恵を受ける得る患者を同定するために必要である。ＥＺＨ２変異についての臨床試験は十分な感度で、できるだけ多くの変異を標的とすることが必須である。これは、めったにない変異を有する患者が「偽陰性」試験結果を受け、そして救命治療を潜在的に見逃していないことを確証する。同時に、この試験は、患者が「偽陽性」結果を受け取り、そして高コストで且つ効果のない治療を受けないことを保証するために非常に特異的であるべきである。

【0004】

敏感で且つ多重化に適している１つの技法は、対立遺伝子特異的 (allele-specific)ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）である。この技法は、配列の野生型変異体の存在下で、核酸配列の変異及び多型を検出する。成功した対立遺伝子特異的ＰＣＲにおいては、標的核酸の所望する変異体が増幅されるが、他の変異体は存在しないか、又は少なくとも検出可能レベルではない。対立遺伝子特異的ＰＣＲにおいては、少なくとも１つのプライマーは、配列の特定の変異体が存在する場合のみ、プライマー伸長が起こるように、対立遺伝子特異的である。１又は２以上の多型部位を標的とする１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーは、同じ反応混合物に存在することができる。成功する対立遺伝子特異的プライマーの設計は、予測不可能な技術である。既知配列のためのプライマーを設計することは日常的であるが、非常に類似する配列を識別できるプライマーを設計するための製法は存在しない。

【0005】

診断アッセイにおいては、正確な識別が必要とされる。例えば、ＥＺＨ２変異検出の場合、対立遺伝子特異的プライマーの性能は、患者の癌治療の経過を決定することができる。従って、最大の特異性及び感度で最大数のＥＺＨ２変異を検出できる総合的アッセイが必要とされる。

【発明の概要】

【0006】

一実施形態において、本発明は、天然に存在するヒトＥＺＨ２遺伝子の配列と少なくとも１つのミスマッチを含むことを除いて、ＥＺＨ２＿Ｙ６４６Ｎ＿Ｒ（配列番号１）、Ｙ６４６Ｈ＿Ｒ（配列番号１２）、Ｙ６４６Ｆ＿Ｒ（配列番号２１）、Ｙ６４６Ｃ＿Ｒ（配列番号４１）、Ａ６８２Ｇ＿Ｒ（配列番号５９）及びＡ６９２Ｖ＿Ｒ（配列番号７３）に対応する配列番号から選択されるオリゴヌクレオチド配列からなる、ヒトＥＺＨ２遺伝子における変異を検出するための、単離されたオリゴヌクレオチドである。配列番号１、１２、２１、４１、５９及び７３の各々は、ＴＴデュープレット（duplet）及びＴＴＴ又はＣＴＣトリプレット（triplet）を少なくとも含む。任意の前記配列番号の長さは、２０〜３０ヌクレオチドである。これらの実施形態の変形において、ミスマッチは、各々のオリゴヌクレオチドの３’末端の最後の５つのヌクレオチドの中に位置する。これらの実施形態のさらなる変形において、当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然オリゴヌクレオチドを更に含む。

【0007】

別の実施形態において、本発明は、試料中のヒトＥＺＨ２核酸における変異を検出する方法であって、（ａ）前記試料中の核酸を、上記の配列番号１、１２、２１、４１、５９及び７３に対応する配列番号から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させ、（ｂ）前記リゴヌクレオチドが前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列へとハイブリダイゼーションすることができる条件下で前記試料をインキュベートし、（ｃ）前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列を含む増幅産物を生成させ、そして（ｄ）前記増幅産物の存在を検出し、それにより前記ＥＺＨ２核酸中の変異の存在を検出することを含む、方法である。この実施形態の変形において、サンプル中の核酸が、表２〜４に列記された対立遺伝子特異的プライマーから選択されるオリゴヌクレオチドであって、ヒトＥＺＨ２遺伝子の天然に存在する配列と少なくとも１つのミスマッチを含む前記オリゴヌクレオチドと接触される。

【0008】

別の実施形態において、本発明は、悪性腫瘍を有する患者が、ＥＺＨ２阻害剤に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、（ａ）前記患者由来の試料中の核酸を、表２〜４に列記された対立遺伝子特異的プライマーから選択されるオリゴヌクレオチドであって、ヒトＥＺＨ２遺伝子の天然に存在する配列と少なくとも１つのミスマッチを含む前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと接触させ、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドがＥＺＨ２核酸中の標的配列へとハイブリダイゼーションすることができる条件下で前記試料をインキュベートし、前記ＥＺＨ２核酸中の標的配列を含む増幅産物を生成させ、（ｃ）前記増幅産物の存在を検出し、それにより前記ＥＺＨ２核酸中の変異の存在を検出することを含み、ここで、前記変異の存在は、前記患者がＥＺＨ２阻害剤に応答する可能性があることを示す、方法である。この実施形態の変形において、オリゴヌクレオチドは、位置Ｙ６４６における変異、Ａ６８２における変異及びＡ６９２における変異から選択される変異のうち、少なくとも２つに特異的である。この実施形態のさらなる変形において、オリゴヌクレオチドが、Ｙ６４６Ｎ、Ｙ６４６Ｈ、Ｙ６４６Ｓ、Ｙ６４６Ｆ、Ｙ６４６Ｃ、Ａ６８２Ｇ及びＡ６９２Ｖから選択される変異のうち、少なくとも２つに特異的である。

【0009】

さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＥＺＨ２遺伝子における変異を検出するためのキットであって、表２〜４に列記された対立遺伝子特異的プライマーから選択されるオリゴヌクレオチドであって、ヒトＥＺＨ２遺伝子の天然に存在する配列と少なくとも１つのミスマッチを含む前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つと、場合により、ＰＣＲにおける使用のための少なくとも１つの追加の試薬とを含む、前記キットである。この実施形態の変形において、キットは、配列番号１〜５１、５８〜６８及び７２〜８３のうち、２つ以上を含む。この実施形態のさらなる変形において、キットは、位置Ｙ６４６における変異、Ａ６８２における変異及びＡ６９２における変異から選択される変異と各々特異的である、２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。この実施形態のさらなる変形において、キットは、Ｙ６４６Ｎ、Ｙ６４６Ｈ、Ｙ６４６Ｓ、Ｙ６４６Ｆ、Ｙ６４６Ｃ、Ａ６８２Ｇ及びＡ６９２Ｖから選択される変異と各々特異的である、２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。

【0010】

さらに別の実施形態において、本発明は、癌を有する患者を処置する方法であって、前記患者へ適当用量のＥＺＨ２阻害剤を投与することを含み、ここで、前記患者の腫瘍は、表２〜４に列記された対立遺伝子特異的プライマーから選択されるオリゴヌクレオチドであって、ヒトＥＺＨ２遺伝子の天然に存在する配列と少なくとも１つのミスマッチを含む前記オリゴヌクレオチドを用いて検出されたＥＺＨ２遺伝子中の体細胞変異を有する、前記方法である。

【0011】

さらに別の実施形態において、本発明は、癌を有する患者を処置する方法であって、表２〜４に列記された対立遺伝子特異的プライマーから選択されるオリゴヌクレオチドであって、ヒトＥＺＨ２遺伝子の天然に存在する配列と少なくとも１つのミスマッチを含む前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを用いて、ＥＺＨ２遺伝子中の変異に関して前記患者の試料を調査し、変異が発見される場合に、前記患者へ投与量のＥＲＨ２阻害剤を投与することを含む、前記方法である。この実施形態の変形において、変異は、位置Ｙ６４６、Ａ６８２及びＡ６９２に存在する。この実施形態のさらなる変形において、変異は、Ｙ６４６Ｎ、Ｙ６４６Ｈ、Ｙ６４６Ｓ、Ｙ６４６Ｆ、Ｙ６４６Ｃ、Ａ６８２Ｇ及びＡ６９２Ｖから選択される。この実施形態のさらなる変形において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５１、５８〜６８及び７２〜８３から選択される。この実施形態のさらなる変形において、ＥＺＨ２阻害剤は、ＥＩ１、ＥＰＺ６４３８（Ｅ７４３８）、ＧＳＫ３４３又はＧＳＫ１２６から選択される。この実施形態のさらなる変形において、癌はリンパ腫である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
定義
本開示の理解を促進するために、本明細書に使用される用語の次の定義が提供される。

【0013】

用語「Ｘ［ｎ］Ｙ」とは、位置［ｎ］における、アミノ酸Ｘのアミノ酸Ｙへの置換を生じる変異のことである。例えば、用語「Ｙ６４６Ｃ」とは、位置６４６におけるチロシンがシステインへ置換される変異のことである。

【0014】

用語「対立遺伝子−特異的プライマー」（allele-specific primer）又は「ＡＳプライマー」（ＡＳ primer）とは、標的配列の２つ以上の変異体に対してハイブリダイズするが、標的配列の変異体間を区別できるプライマーのことであり、ここで前記変異体の１つによってのみ、プライマーは適切な条件下で核酸ポリメラーゼにより効果的に延長される。標的配列の他の変異体によれば、その延長は低効率的又は非効率的である。

【0015】

用語「共通プライマー」（common primer）とは、対立遺伝子特異的プライマーを含むプライマー対における第二プライマーのことである。共通プライマーは、対立遺伝子特異的ではなく、すなわち対立遺伝子特異的プライマーが区別する標的配列の変異体間を区別しない。

【0016】

用語「相補的」（complementary）又は「相補性」（complementarity）は、ワトソン−クリック塩基対規則により関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖に関連して使用される。用語「完全に相補的」（perfectly complementary）又は「１００％相補的」（１００％ complementary）とは、逆平行鎖間のすべての塩基のワトソン−クリック対を有する相補的配列のことであり、すなわちポリヌクレオチド二重鎖における任意の２つの塩基間にミスマッチは存在しない。しかしながら、二重鎖は、完全な相補性の不在下でさえ、逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的」（partially complementary）又は「不完全に相補的」（incompletely complementary）とは、１００％未満、完全である逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意の配置のことである（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖に少なくとも１つのミスマッチ又はマッチしない塩基が存在する）。部分的に相補的な鎖間の二重鎖は一般的に、完全に相補的な鎖間の二重鎖よりも低い安定性を有する。

【0017】

用語「試料」（sample）とは、核酸を含むか又は含むと推定される任意の組成物のことである。これは、個人から単離された組織又は体液、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官及び腫瘍の試料、並びに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）又はコア針生検を含む、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物、及びそれらから単離される核酸の試料のことである。

【0018】

用語「ポリヌクレオチド」（polynucleotide）及び「オリゴヌクレオチド」（oligonucleotide）は、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドを含んでも良い。

【0019】

用語「一次配列」（primary sequence）とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列のことである。ヌクレオチド修飾、例えば窒素含有塩基修飾、糖修飾又は他のバックボーン修飾は、一次配列の一部ではない。標識、例えばオリゴヌクレオチドに接合される発色団 (chromophore) もまた、一次配列の一部ではない。従って、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ一次配列を共有することができるが、修飾及び標識に関しては異なることができる。

【0020】

用語「プライマー」（primer）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして核酸の相補鎖に沿って合成の開始点として、そのような合成のために適切な条件下で作用することができるオリゴヌクレオチドのことである。本明細書において使用される場合、用語「プローブ」（probe）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして通常、検出可能に標識されるオリゴヌクレオチドのことである。プローブは、修飾、例えば核酸ポリメラーゼによってプローブを延長できなくさせる修飾、及び１つ又は２つ以上の発色団を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つのアッセイにおけるプライマーとして、及び異なったアッセイにおけるプローブとして作用することができる。

【0021】

用語「ミスマッチ」とは、核酸二重鎖における相補鎖間のワトソン−クリック塩基対を欠いていることである。例えば、（グアニンの代わりに）アデニンが相補鎖中のシトシンの反対側に存在する場合にミスマッチが生じる。一本鎖核酸（例えば増幅プライマー）がミスマッチを有するといわれる場合、それは、その標的配列とハイブリダイズするときに、当該プライマーが相補鎖上の対応する塩基とワトソン−クリック塩基対を欠く塩基を有するヌクレオチドを有することを意味する。

【0022】

用語「標的配列」、「標的核酸」又は「標的」とは、増幅されるか、検出されるか、又はその両方がなされる、核酸配列の一部のことである。

【0023】

用語「ハイブリダイズされる」（hybridized）及び「ハイブリダイゼーション」（hybridization）とは、二重鎖の形成をもたらす、２つの核酸間の塩基対合相互作用のことである。２種の核酸は、ハイブリダイゼーション及び鎖伸長を達成するために、それらの全長にわたって１００％の相補性を有することは必要条件ではない。

【0024】

ヒトＥＺＨ２遺伝子は、癌において頻繁に変異することが知られている。表１は、現時点で報告されている、最も一般的な変異を示す。

【0025】

表１ヒトＥＺＨ２遺伝子における変異

【表1】

【0026】

対立遺伝子特異的ＰＣＲは、米国特許第６，６２７，４０２号に記載されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲにおいては、識別プライマーは、標的配列の所望する変異体に対して相補的であるが、しかし標的配列の所望しない変異体とミスマッチする配列を有する。典型的には、プライマーにおける識別ヌクレオチド、すなわち標的配列の１つの変異体のみとマッチするヌクレオチドは、３’−末端ヌクレオチドである。しかしながら、プライマーの３’末端は、特異性の多くの決定因子の１つに過ぎない。対立遺伝子特異的ＰＣＲにおける特異性は、マッチされたプライマーの伸長速度よりも、マッチされたプライマーのより遅い伸長速度に起因し、究極的には、ミスマッチされた標的の相対的増幅効率を低める。低められた伸長動態及びＰＣＲ特異性は、酵素の性質、反応成分及びそれらの濃度、伸長温度及びミスマッチの全体的な配列属性を包含する多くの要因により影響される。各特定のプライマーに対するそれらの要因の効果は、確実には定量化され得ない。信頼できる定量的ストラテジーなしでは、及び膨大な数の変数の存在のために、対立遺伝子特異的プライマーの設計は、しばしば、驚くべき結果を伴っての試行錯誤の問題である。下記に記載されるＥＺＨ２の変異対立遺伝子の場合、試験されるプライマーの一部のみが、適切な性能、すなわち許容できるＰＣＲ効率、及び同時に、変異体と野生型鋳型との間の識別性を提供する。

【0027】

対立遺伝子特異的プライマーの特異性を高める１つのアプローチは、末端ミスマッチの他に、内部ミスマッチヌクレオチドを含むことによってであり、米国特許公開第２０１０／００９９１１０号を参照のこと。プライマー中の内部ミスマッチヌクレオチドは、所望する及び所望しない両標的配列によりミスマッチされ得る。ミスマッチは所望する及び所望しない両鋳型を有するプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定にするので、ミスマッチのいくつかは、両鋳型の増幅を妨げ、そしてＰＣＲの障害を引起す。従って、特定の対立遺伝子特異的ＰＣＲに対するそれらの内部ミスマッチの効果は予測され得ない。

【0028】

プライマーの成功した伸長のためには、プライマーは、標的配列に対して少なくとも部分的な相補性を有する必要がある。一般的には、プライマーの３’末端での相補性は、プライマーの５’末端での相補性よりも、より決定的である（Innis et al. Eds. PCR Protocols, (1990) Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11）。従って、本発明は、表１〜７に開示されるプライマー、及び５’末端の変動(variations)を有するそれらのプライマーの変異体を包含する。

【0029】

一般的に、ＰＣＲ増幅に関して、プライマー特異性は、プライマー中のヌクレオチドの化学的修飾の使用により高められ得ることは、これまで記載されている。環外アミノ基の共有的修飾を有するヌクレオチド、及びＰＣＲへのそのようなヌクレオチドの使用は、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。修飾は、所望する及び所望しない両鋳型を有するプライマー−鋳型ハイブリッドにおけるワトソン−クリック水素結合を崩壊するので、修飾のいくつかは、両鋳型の修飾を妨げ、そしてＰＣＲの不良を引き起こす。従って、対立遺伝子特異的ＰＣＲに対するそれらの共有的修飾の効果は予測され得ない。

【0030】

一実施形態によれば、本発明は、単一のチューブにおいて、複数のＥＺＨ２変異を同時に検出するための単離されたオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＺＨ２遺伝子における位置Ｙ６４６での変異を特異的に検出するための単離されたオリゴヌクレオチドを含む（表２）。別の実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＺＨ２遺伝子における位置Ｙ６８２での変異を特異的に検出するための単離されたオリゴヌクレオチドを含む（表３）。さらに別の実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＺＨ２遺伝子における位置Ｙ６９２での変異を特異的に検出するための単離されたオリゴヌクレオチドを含む（表４）。それらのオリゴヌクレオチドプライマーのいくつかは、内部ミスマッチ、例えば表２〜４に示されるように、天然に存在する変異体又は野生型配列に存在しないヌクレオチドを含む。それらのオリゴヌクレオチドプライマーは、前記表に示されるような非天然のヌクレオチドを含む。

【0031】

実験結果（表５〜７）に示されるように、同じ原理に従って設計される対立遺伝子特異的プライマーの性能は大きく変化する。本発明は、いくつかの密接に関連する配列（すなわち、単一コドン６４６での一連の変異）の１つに対して各々特異的な単離されたオリゴヌクレオチドを包含する。表５〜７に示されるように、プライマーは、類似する変異及び同じコドンでの野生型配列と、それらの標的変異とを独自に区別することができる。

【0032】

選択肢として、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいては、表２〜４に開示される対立遺伝子特異的プライマーは、「共通の (common)」、すなわち、表２〜４に開示される対立遺伝子特異的ではない第二プライマーと、そして適切な場合、表２〜４に同様に開示される検出プローブと対合され得る。当業者は、ＡＳ−ＰＣＲにより、ヒトＥＺＨ２遺伝子中の位置Ｙ６４６、Ａ６８２及びＡ６９２で変異を検出するために、代わりの共通プライマー及び検出プローブが設計され、そして本発明の対立遺伝子特異的プライマーと組合わされ得ることを、ただちに理解するであろう。

【0033】

表２．位置Ｙ６４６での変異を検出するためのオリゴヌクレオチド

【表2】

【表3】

【0034】

表３．位置Ａ６８２での変異を検出するためのオリゴヌクレオチド

【表4】

【0035】

表４．位置Ａ６９２での変異を検出するためのオリゴヌクレオチド

【表5】

【0036】

別の実施形態によれば、本発明は、表２〜４に開示されるオリゴヌクレオチドを用いて、ＥＺＨ２変異を検出するための診断方法である。前記方法は、核酸を含む試験試料と、表２〜４から選択されたＥＺＨ２変異のための１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーとを、その対応する第二プライマー、（任意には、また表２〜４から選択される）、ヌクレオチド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下で、前記１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーが、ＥＺＨ２変異が試料中に存在する場合のみ、効果的に伸長され得るよう、接触し；そして伸長生成物の有無を検出することにより、ＥＺＨ２変異の有無を検出することを含んで成る。

【0037】

特定の実施形態によれば、伸長生成物の存在は、プローブにより検出される。本実施形態の変形例によれば、プローブは表２〜４から選択される。プローブは、放射性、蛍光又は発色団標識により標識され得る。例えば、変異は、リアル・タイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）による伸長生成物の増幅を検出することにより検出され得、ここで伸長生成物へのプローブのハイブリダイゼーションが、プローブの酵素消化及び得られる蛍光の検出をもたらす（TaqMan（登録商標）プローブ法, Holland et al. (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280）。ｒｔ−ＰＣＲでの増幅生成物の存在はまた、プローブと伸長生成物との間での核酸二重鎖の形成のために、蛍光の変化を検出することによっても検出され得る（米国特許公開番号２０１０／０１４３９０１号）。他方では、伸長生成物及び増幅生成物の存在は、Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning, 3^rd ed. CSHL Press, Chapters 5 and 9に記載されるように、ゲル電気泳動により、続いて染色又はブロット、及びハイブリダイゼーションにより検出され得る。

【0038】

さらなる別の実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＺＨ２遺伝子中の位置Ｙ６４６、Ａ６８２及びＡ６９２での変異を同時に検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせである。この実施形態の変形例によれば、前記組み合わせは、表２〜４の個々からの少なくとも１つの対立遺伝子特異的プライマー、及び表２〜４の個々からの少なくとも１つの共通プライマー、及びさらに任意には、表２〜４の個々からの少なくとも１つのプローブを含む。例えば、表５に示されるように、本発明の単離されたオリゴヌクレオチドは、試験キットに組み合されるためにも適切である。表５は、各オリゴヌクレオチドは、密接に関連する変異が試料中に存在していてさえ、その標的変異に対して特異的であることを示している。

【0039】

別の実施形態によれば、本発明は、変異ＥＺＨ２遺伝子を有する細胞をおそらく保有する腫瘍を有する患者の治療方法である。前記方法は、患者からの試料と、表２〜４から選択されたＥＺＨ２変異に対する１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーとを、その対応する第二プライマー（任意には、また表２〜４から選択される）の存在下で接触せしめ、対立遺伝子特異的増幅を実施し、そして伸長生成物の有無を検出することにより、ＥＺＨ２変異の有無を検出し、そして少なくとも１つの変異が見出される場合、その変異誘発された遺伝子によりコードされる変異ＥＺＨ２タンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物を、患者に投与することを含んで成る。この実施形態の変形例によれば、ＥＺＨ２阻害剤は、ＥＩ１ (Qi, W., et al. (2012) PNAS USA 109(52):21360); ＥＰＺ６４３８−Ｅ７４３８ (Knutson, S.K., et al. (2012) Nat Chem Biol. 8(11):890; ＧＳＫ３４３又はＧＳＫ１２６ (McCabe, M.T., et al. (2012) Nature 108:108；又は利用できるか、又は利用可能になるであろう何れか他の適切な選択的ＥＺＨ２阻害剤から選択される。

【0040】

さらなる別の実施形態によれば、本発明は、ＥＺＨ２遺伝子における変異を検出するために必要な試薬を含むキットである。試薬は、各表２〜４から選択されたＥＺＨ２変異に対する１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマー、１又は２以上の対応する第二プライマー（任意にはまた、各表２〜４から選択される）、及び任意には、１又は２以上のプローブ（任意にはまた、各表２〜４から選択される）を含む。キットはさらに、増幅及び検出アッセイの実施のために必要な試薬、例えばヌクレオチド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼの機能のために必要な緩衝液を含む。いくつかの実施形態によれば、プローブは検出可能的に標識される。そのような実施形態によれば、キットは標識し、そしてその標識を検出するための試薬を含む。

【実施例】

【0041】

典型的反応条件
プライマーの性能を試験するために使用される典型的な反応条件は、次の通りである。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７５〜９０ｍＭの塩化カリウム、それぞれ１６０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、３２０μＭのｄＵＴＰ，０．０７５〜０．２μＭの各選択及び共通プライマー、００５〜０．１μＭのプローブ、標的ＤＮＡ（変異体を含む組換えプラスミドの１００及び１０，０００のコピー）、又は１０，０００のコピーの野生型ゲノムＤＮＡ（プールされたゲノムＤＮＡ、プールされたゲノムＤＮＡ、Promega, Madison, Wisc., Cat. No. DD2011）、０．２Ｕ／μｌのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、２００ｎＭのＮＴＱ２１−４６Ａアプタマー、４０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．２５％〜２％のＤＭＳＯ、２．５ｍＭの酢酸マグネシウムを含むＰＣＲ混合物。増幅及び分析は、Roche LightCycler（登録商標）480 装置 (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)を用いて行われた。次の温度プロフィールを使用した：９５℃（１０秒）〜６２℃（３０秒）の２サイクル、続いて、９３℃（１０秒）〜６２℃（３０秒）の５５回のサイクル、３７℃（１０秒）への冷却（１サイクル）及び２５℃（１０秒）への冷却（１サイクル）。蛍光データを、５５サイクルにおける各６２℃段階の開始で集めた。任意には、反応は、内因性陽性対照鋳型を含んだ。

【0042】

対立遺伝子特異的ＰＣＲの成功を、標的配列により得られたＣ_t及び非標的配列により得られたＣ_t、例えば同じ位置での異なった変異又は野生型配列を比較することにより測定した。

【0043】

実施例１
ヒトＥＺＨ２遺伝子における位置Ｙ６４６での変異を検出するためのプライマー
表２に示されたプライマー及びプローブを、上記に示される実験条件下で試験した。表５は増幅を示す（Ｃ_tにより測定される通り）。

【0044】

表５．ヒトＥＺＨ２遺伝子における位置Ｙ６４６でのプライマーの性能

【表6】