特許 6620111 Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6620111

(24)【登録日】2019年11月22日

(45)【発行日】2019年12月11日

(54)【発明の名称】Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20191202BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20191202BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20191202BHJP

   A61K 39/29 20060101ALI20191202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191202BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20191202BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20191202BHJP

   C12N 7/04 20060101ALN20191202BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20191202BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/76ZNA

   A61P31/14

   A61P1/16

   A61K39/29

   A61P43/00 121

   A61K48/00

   !C12N15/00

   !C12N7/04

   !C12P21/02 C

【請求項の数】6

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2016-559132(P2016-559132)

(86)(22)【出願日】2015年11月11日

(86)【国際出願番号】JP2015082327

(87)【国際公開番号】WO2016076441

(87)【国際公開日】20160519

【審査請求日】2018年9月25日

(31)【優先権主張番号】特願2014-229283(P2014-229283)

(32)【優先日】2014年11月11日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】591063394

【氏名又は名称】公益財団法人東京都医学総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】505314022

【氏名又は名称】国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】318010328

【氏名又は名称】ＫＭバイオロジクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】小原 道法

(72)【発明者】

【氏名】保富 康宏

(72)【発明者】

【氏名】塩釜 ゆみ子

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２７５１３９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１７６５３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ANNE Fournillier et al.，A Heterologous Prime/Boost Vaccination Strategy Enhances the Immunogenicity of Therapeutic Vaccines，The Journal of Infectious Diseases，２０１３年，208，1008-19，ISSN 0022-1899, 特に要約、Materials and Methods

【文献】 TAKESHI Wada et al.，DNA vaccine expressing the non-structural proteins of hepatitis C virus diminishes the expression of，Vaccine，２０１３年，31，5968-74，ISSN: 0264-410X, 特に要約、Materials and methos、図、第５９７３頁左欄下段

【文献】 YAO Deng et al.，Induction of Broadly Neutralising HCV Antibodies in Mice by Integration-Deficient Lentiviral Vector-，PLOS ONE，２０１３年，Vol.8, No.4, e62684，1-7，ISSN 1932-6203, 特に要約

【文献】 小出 幸夫， 永田 年，DNAワクチンによる感染防御，血液・免疫・腫瘍，２００２年，Vol.7, No.4，372-384，ISSN：1341-5824、特に第３８１頁

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３９／２９

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記(a)の組換えワクシニアウイルスと下記(b)の組換えベクターとを含む、C型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
下記(a)の組換えワクシニアウイルス及び下記(b)の組換えベクターのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、
前記医薬組成物。
(a) 発現プロモーター、及び下記(i)又は(ii)のDNAを含む組換えワクシニアウイルス
(i) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(ii) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA
(b) 発現プロモーター、及び下記(iii)又は(iv)のDNAを含む組換えベクター
(iii) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA
(iv) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA

【請求項2】

下記(a)の組換えワクシニアウイルスと下記(b)の組換えベクターとを含む、C型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
下記(a)の組換えワクシニアウイルス及び下記(b)の組換えベクターのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、
前記医薬組成物。
(a) 発現プロモーター、及び下記(i)又は(ii)のDNAを含む組換えワクシニアウイルス
(i) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA
(ii) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA
(b) 発現プロモーター、及び下記(iii)又は(iv)のDNAを含む組換えベクター
(iii) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(iv) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA

【請求項3】

下記(a)の組換えワクシニアウイルスと下記(b)の組換えワクシニアウイルスとを含む、C型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
下記(a)の組換えワクシニアウイルス及び下記(b)の組換えワクシニアウイルスのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、
前記医薬組成物。
(a) 発現プロモーター、及び下記(i)又は(ii)のDNAを含む組換えワクシニアウイルス
(i) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(ii) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA
(b) 発現プロモーター、及び下記(iii)又は(iv)のDNAを含む組換えワクシニアウイルス
(iii) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA
(iv) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、C型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするDNA

【請求項4】

前記発現プロモーターがハイブリッドプロモーターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ハイブリッドプロモーターの塩基配列が、以下の(a)又は(b)のDNAである、請求項４に記載の医薬組成物。
(a) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、かつ、プロモーター活性を有するDNA

【請求項6】

ワクシニアウイルスがLC16m8株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｃ型肝炎の治療用及び予防用の医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の日本での感染者は２００万人以上存在し、そのうち毎年３万６千人もの人々が肝細胞癌を発症し、そのがん患者の多くが死に至る。現在、抗ＨＣＶ薬としてインターフェロン（ＩＦＮ）が用いられているが、その効果は限られており、副作用も重篤であることから、より安全で効果的な薬剤の開発が求められている。さらには感染者が高齢化し、それに伴う発がんのリスクも高まっていることから、早急な対策が必要とされている。
現状においては、ＨＣＶのウイルス複製を抑制する核酸アナログやプロテアーゼ阻害剤等の薬剤が開発され治療に用いられている。しかしながら、これらの薬剤を用いた治療を行う場合、薬剤耐性ウイルスが出現し易く、またその作用機序からみてもウイルスの完全排除は困難であり、したがって終生投薬治療が必要となる。最近、活性の高い抗ＨＣＶ薬が開発され使用されるようになってきたが、１クールの治療費が８００〜１２００万円と非常に高額なことから受療できる患者が限定されている。このような現状から、終生にわたる投薬治療から離脱・解放される、安全で安価な根治療法の確立が強く望まれている。
本発明者らは、感染性を有するＨＣＶのｃＤＮＡクローン作製、Ｃ型肝炎発症可能なトランスジェニックマウス及びヒト肝臓キメラマウスなどの感染動物の樹立などによりＨＣＶ研究に関わる研究資源を確立し、様々なモデル実験系の確立を行ってきた（例えば、非特許文献１：Ｗａｋｉｔａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，ｖｏｌ．２７３，ｐ．９００１−９００６参照）。ＨＣＶ感染の大きな特徴として挙げられるのは、高率な持続感染成立と慢性肝炎発症への移行である。本発明者らは長い年月にわたり、この機序を免疫寛容の獲得とその破綻という観点から上述のモデル実験系などを用いて鋭意解析・検討を行ってきた（例えば、非特許文献２：Ｉｎｏｕｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００７，ｖｏｌ．４５，ｐ９２１−９２８参照）。
これまでにもＨＣＶに対する感染を予防するワクチンの開発が多く試みられてきたが、完全に感染を防御できる結果は得られていない（例えば、非特許文献３：Ｃｈｏｏ ＱＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，ｖｏｌ．９１，ｐ．１２９４−１２９８、非特許文献４：Ｐｕｉｇ Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００４，ｖｏｌ．２２，ｐ．９９１−１０００、非特許文献５：Ａｂｒａｈａｍ ＪＤ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００４，ｖｏｌ．２２，ｐ．３９１７−３９２８、非特許文献６：Ｅｌｍｏｗａｌｉｄ ＧＡ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００７，ｖｏｌ．１０４，ｐ．８４２７−８４３２参照）。
ところで、一般的に、より強く細胞性免疫を誘導する方法として、ＤＮＡワクチンにより初期免疫を行い、その後、組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）により追加免疫を行う、いわゆるプライム／ブースト（ｐｒｉｍｅ／ｂｏｏｓｔ）法が知られている（例えば、非特許文献７：Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２０１１ Ｊａｎ，ｖｏｌ．２３９（１），ｐ．９９−１０８参照）。

【発明の概要】

【0003】

このような状況下において、Ｃ型肝炎に対してより強く細胞性免疫を誘導することができ、ＨＣＶの完全排除に有効な治療手段及び予防手段の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物等を提供するものである。
（１）下記（ａ）の組換えワクシニアウイルスと下記（ｂ）の組換えベクターとを含む、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
下記（ａ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｂ）の組換えベクターのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、前記医薬組成物。
（ａ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｂ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部（但し、前記（ａ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えベクター
（２）下記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスと下記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスとを含む、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
下記（ｃ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、前記医薬組成物。
（ｃ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｄ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部（但し、前記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えワクシニアウイルス
（３）前記Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡは、それぞれ独立して、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードするもの、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードするもの、又は、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするものである、上記（１）又は（２）の医薬組成物。
（４）前記Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡは、それぞれ独立して、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡである、上記（１）又は（２）の医薬組成物。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
（５）前記発現プロモーターがハイブリッドプロモーターである、上記（１）〜（４）いずれかの医薬組成物。
（６）前記ハイブリッドプロモーターの塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、上記（５）の医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（７）ワクシニアウイルスがＬＣ１６ｍ８株である、上記（１）〜（６）のいずれかの医薬組成物。

【図面の簡単な説明】

【0004】

図１は、Ｃ型肝炎モデルマウスと、ＨＣＶ遺伝子発現ＤＮＡワクチン及び組換えワクシニアウイルスの遺伝子構造を示す図である。
図２は、ＨＣＶ部分長コードＴｇマウスにおいて、ＨＣＶ−ＤＮＡワクチンとｒＶＶの併用プライム／ブーストワクチンがＨＣＶ特異的細胞性免疫反応を誘導する結果を示す図である。
図３は、ＨＣＶ−ＤＮＡワクチンとｒＶＶとを併用したプライム／ブーストワクチンが、ＤＮＡワクチン単独に比べ、肝臓中のコアタンパク質発現量をさらに減少させる結果を示す図である。
図４は、ＨＣＶ部分長コードＴｇマウスにおける、プライム／ブーストワクチン投与後の肝臓の形態学的検索の結果を示す図である。
図５は、ＨＣＶ全長コードＴｇマウスにおいて、プライム／ブーストワクチンでも特異的細胞性免疫の活性化が弱かった結果を示す図である。
図６は、新規プライム／ブーストワクチン接種法の開発過程を示す図である。
図７は、ＨＣＶ部分長コードＴｇマウスにおいて、異なる領域のＤＮＡワクチンと組換えワクシニアウイルス（組換えワクシニアワクチン）との併用によって特異的細胞性免疫の更なる活性化が認められた結果（その１）を示す図である。
図８は、ＨＣＶ部分長コードＴｇマウスにおいて、異なる領域のＤＮＡワクチンと組換えワクシニアウイルス（組換えワクシニアワクチン）との併用によって特異的細胞性免疫の更なる活性化が認められた結果（その２）を示す図である。
図９は、免疫抑制が強くかかっているＨＣＶ全長コードＴｇマウスにおいてもＮ２５−ＤＮＡワクチンとＣＮ２−ｒＶＶの併用によって特異的細胞性免疫の活性化が認められた結果を示す図である。
図１０は、Ｒｚ１５ＨＣＶ全長コードＴｇマウスにおけるプライム／ブーストワクチン投与後のマウス肝臓における形態学的検索の結果を示す図である。図中、ｒＶＶ−Ｎ２５群は、Ｎ２５ ＤＮＡ（プライムワクチン）とＮ２５ ｒＶＶ（ブーストワクチン）を投与、ＨＣＶ−Ｎ２５群は、Ｎ２５ ＤＮＡ（プライムワクチン）とＮ２５ ＤＮＡ（ブーストワクチン）を投与、及び、プライム／ブーストワクチン群は、Ｎ２５ ＤＮＡ（プライムワクチン）とＣＮ２ｒＶＶ（ブーストワクチン）を投与したものである。

【発明を実施するための形態】

【0005】

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１４−２２９２８３号明細書（２０１４年１１月１１日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
本発明は、前述のとおり、下記（ａ）の組換えワクシニアウイルスと下記（ｂ）の組換えベクターとを含むか、あるいは、下記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスと下記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスとを含む、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」ということがある）であり、
下記（ａ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｂ）の組換えベクターのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与するか、あるいは、
下記（ｃ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与する
ことを特徴とする、前記医薬組成物である。ここで、下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）は、一般に、いわゆるワクシニアワクチンと称されるものに該当し、下記（ｂ）は、一般に、いわゆるＤＮＡワクチンと称されるものに該当するといえるが、特に限定はされない。
（ａ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｂ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部（但し、前記（ａ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えベクター
（ｃ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｄ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部（但し、前記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部又は一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えワクシニアウイルス
一般に、従来公知のプライム／ブースト（ｐｒｉｍｅ／ｂｏｏｓｔ）法は、より強く細胞性免疫を誘導する方法として、まずＤＮＡワクチンにより初期免疫を行い、その後、組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）により追加免疫を行う、感染症等に対する免疫治療・予防等の方法である（前掲の非特許文献７等）。この従来公知のプライム／ブースト法では、初期免疫に用いるＤＮＡワクチンに組み込むＤＮＡ（原因ウイルス等のゲノムｃＤＮＡ由来のＤＮＡ）と、追加免疫に用いる組換えワクシニアウイルスに組み込むに挿入するＤＮＡとについて、互いに、実質的に同一の塩基配列からなるＤＮＡを用いる（互いに、当該ゲノムｃＤＮＡ中の同一領域のＤＮＡを用いる）ことが、当業者において技術常識となっていた。
しかしながら、本発明者は、従来全く想定されていなかった、初期免疫用ワクチンに組み込むＤＮＡと追加免疫用ワクチンに組み込むＤＮＡとを別の塩基配列からなるＤＮＡとする（互いに、原因ウイルス等のゲノムｃＤＮＡ中の別領域のＤＮＡを用いる）ことにより、互いに同一領域のＤＮＡを用いた場合に比べ、有意かつ非常に強力な特異的細胞性免疫が誘導されるという効果を見出した。しかもこの効果は、免疫賦活化が誘導されづらいＨＣＶ全長遺伝子を発現するモデル動物（トランスジェニックマウス）において、より顕著であることを見出した。さらに本発明者は、ＤＮＡワクチンと組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）のどちらを初期免疫に用い、どちらを追加免疫に用いても、上記顕著な効果が発揮され、加えて、初期免疫と追加免疫の両方に組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）を用いても、上記顕著な効果が発揮される、という従来のプライム／ブースト法では全く想定されていなかったことも見出した。本発明は、本発明者が繰り返し行った鋭意実験・検討の結果得られた、上述の様々な知見に基づいて完成されたものである。
２．ワクシニアワクチン（組換えワクシニアウイルス）
前記１．項で述べた（ａ）、（ｃ）、（ｄ）の組換えワクシニアウイルス（すなわちＨＣＶ組換えワクシニアウイルス；いわゆるワクシニアワクチン）及びその作製方法等について、以下に説明する。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタンパク質をコードしているすべての遺伝子、外殻を構成する構造タンパク質領域をコードする遺伝子、及び複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。したがって、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。
本発明の好ましい態様においては、上記プラスミドに挿入されているＨＣＶ遺伝子（遺伝子型１ｂ；核酸番号１−９６１１；ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ；ＡＹ０４５７０２）を鋳型に用いることができる。そして、ＨＣＶ遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし、ＨＣＶ遺伝子特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＨＣＶの各遺伝子領域を調製することができる。本発明においては、ＨＣＶのすべての遺伝子領域を「ＣＮ５」、主に外殻を構成する構造タンパク質の構造タンパク質領域をコードする遺伝子（非構造タンパク質領域をコードする遺伝子も一部に含む）を「ＣＮ２」、主に複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子（構造タンパク質領域（具体的には、Ｅ２領域の一部（Ｅ２領域の全長ではない）とｐ７領域）をコードする遺伝子も一部に含む）を「Ｎ２５」という。
ＣＮ２、Ｎ２５及びＣＮ５の塩基配列を、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す。但し、配列番号１〜３に示される塩基配列からなるＤＮＡのほか、以下のＤＮＡも、本発明において使用することができる。
配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＮ２の変異型ＤＮＡ）。
配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｎ２５の変異型ＤＮＡ）。
配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＮ５の変異型ＤＮＡ）。
ここで、「Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスの外殻を構成するタンパク質をコードすることを意味し、具体的には、少なくともコア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域をコードする。また、「Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスが増殖するときに細胞中に産生されるタンパク質をコードすることを意味し、具体的には、少なくともＮＳ２領域、ＮＳ３領域、ＮＳ４ａ領域、ＮＳ４ｂ領域、ＮＳ５ａ領域、ＮＳ５ｂ領域をコードする。また、「Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスの外殻を構成するタンパク質と、ウイルスが増殖するときに細胞中に産生されるタンパク質をコードすることを意味し、具体的には、少なくともコア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域、ＮＳ２領域、ＮＳ３領域、ＮＳ４ａ領域、ＮＳ４ｂ領域、ＮＳ５ａ領域、ＮＳ５ｂ領域をコードする。
また、上記構造タンパク質をコードする遺伝子及び非構造タンパク質をコードする遺伝子には、全長配列のほか、その一部の配列も含まれる。
ＣＮ２の場合は、コア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域、ｐ７領域、及びＮＳ２領域（又はその一部）の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号１に示す塩基配列中のＥ１領域（５８９〜１１６４番）、Ｅ２の領域（１１６５〜２２５３番）を使用することができる。
Ｎ２５の場合は、Ｅ２領域（具体的にはその一部）、ｐ７領域、ＮＳ２領域、ＮＳ３領域、ＮＳ４ａ領域、ＮＳ４ｂ領域、ＮＳ５ａ領域、及びＮＳ５ｂ領域の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号２に示す塩基配列中のＮＳ２領域（８０５〜１４５５番）、ＮＳ３領域（１４５６〜３３４８番）を使用することができる。
ＣＮ５の場合は、コア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域、ｐ７領域、ＮＳ２領域、ＮＳ３領域、ＮＳ４ａ領域、ＮＳ４ｂ領域、ＮＳ５ａ領域、及びＮＳ５ｂ領域の全部又はいずれかの領域を含む限り、全長である必要はなくその一部でもよい。例えば、配列番号３に示す塩基配列中のＥ１領域（５８９〜１１６４番）、Ｅ２領域（１１６５〜２２５３番）、ＮＳ２領域（２４４３〜３０９３番）、ＮＳ３領域（３０９４〜４９８６番）を使用することができる。
上記変異型ＤＮＡは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１〜３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣ、０．１％〜１．０％ＳＤＳ及び２０℃〜８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、３７℃〜５６℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０〜２０分の洗浄を１〜３回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））等を参照することができる。
また、配列番号１に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＮ２の変異型ＤＮＡ）、配列番号２に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｎ２５の変異型ＤＮＡ）、配列番号３に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質及び構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＣＮ５の変異型ＤＮＡ）を用いることができる。
本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれるプロモーターは、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域内にポックスウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス７．５ｋＤａタンパク質（ｐ７．５）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターである。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばｐＢＭＳＦ７Ｃが知られている（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８，３１５−３３０，１９９４；特開平６−２３７７７３号公報）。
本発明において使用可能なハイブリッドプロモーターの塩基配列を配列番号４に示す。但し、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡのほか、配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡも、本発明において使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。また、配列番号４に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、プロモーター活性を有するＤＮＡも用いることができる。
このハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。本発明においては、ｐＢＭＳＦ７Ｃのプロモーター下流にＨＣＶ遺伝子（ＣＮ５）を挿入したプラスミドベクターをｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ５という。また、本発明において、ｐＢＭＳＦ７Ｃのプロモーター下流に、主に構造タンパク質領域（非構造タンパク質領域も一部に含む）遺伝子（ＣＮ２）を挿入したプラスミドベクターをｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ２という。さらに、ｐＢＭＳＦ７Ｃのプロモーター下流に、主に非構造タンパク質領域（構造タンパク質領域も一部に含む）遺伝子（Ｎ２５）を挿入したプラスミドベクターをｐＢＭＳＦ７Ｃ−Ｎ２５という。
これらのプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製することができる。プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株を感染した動物細胞中にプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ５、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−Ｎ２５をそれぞれ導入することにより、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域で相同組換えを引き起こし、ＨＣＶの各タンパク質をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２及びｒＶＶ−Ｎ２５）を作製することができる。
なお、組換えワクシニアウイルスの作製に用いたワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株は、動物個体で増殖可能であるが、神経細胞における増殖性は極めて低い弱毒株である。日本では痘瘡ワクチンとして認可されており、約５万人の小児に接種の結果、重篤な副作用は発生していない（厚生省種痘研究班研究報告、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５）。一方、免疫誘導能に関しては親株であるＬｉｓｔｅｒ株と同等であることが報告されており、ＬＣ１６ｍ８株は安全で効果的なワクチンである。
作製したｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２及びｒＶＶ−Ｎ２５は、ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子領域にＨＣＶのタンパク質遺伝子が挿入されるため、ＨＡタンパク質の発現が欠如し、赤血球凝集反応を起こさない。したがって、ｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２及びｒＶＶ−Ｎ２５を動物細胞に感染させ、これにより形成するプラークへのニワトリ赤血球の凝集反応を指標にして、組換えワクシニアウイルスのスクリーニングを行う。目的の組換えワクシニアウイルスは、赤血球凝集が認められないホワイトプラークを選別すればよい。
ホワイトプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてＨＣＶ遺伝子特異的なプライマーによりＰＣＲを行い、ＨＣＶの遺伝子導入を確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の発現は、ｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２及びｒＶＶ−Ｎ２５を感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、ＨＣＶポリペプチドを免疫して作製した抗血清から（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１４５３１−１４５４１，２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧによりＩｇＧを精製した物を用いることができる。
組換えワクシニアウイルスの作製において目的遺伝子の挿入部位として、ＨＡ遺伝子領域以外として、一般にはチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子領域が用いられるが、ＴＫ遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することにより、ＴＫの発現欠損により組換えワクシニアウイルスの増殖性が低下することが知られている。一方、ＨＡタンパク質発現欠損による組換えワクシニアウイルスの増殖性はほとんど影響がないことが報告されている（Ｖａｃｃｉｎｅ １２，６７５−６８１，１９９４）。したがって、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてＨＡ遺伝子領域が好ましい。
３．ＤＮＡワクチン（組換えベクター）
前記１．項で述べた（ｂ）の組換えベクター（いわゆるＤＮＡワクチン）及びその作製方法等について、以下に説明する。
ＤＮＡワクチンは、遺伝子を運ぶベクター（プラスミドやウイルス）に、所望の遺伝子（本発明ではＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡ）を組み込んで患者等に投与し、このＤＮＡワクチンを取り込んだ細胞に上記所望の遺伝子から発現するタンパク質やペプチドを産生させるというものである。産生されたタンパク質等は免疫系を刺激し、その抗体を誘導する。ＤＮＡワクチンは、投与後長時間体内に止まり、タンパク質等を緩徐に産生し続けるため、過剰な免疫反応を避けることが可能であり、単純な構造であるために改良も可能である（Ｔａｎｇ ＤＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４，１９９２；Ｂａｒｒｙ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７７：６３２−６３５，１９９５）。さらに、宿主に誘導される免疫反応はＴｈ２型であるという利点がある（Ｔａｎｇ ＤＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４，１９９２；Ｕｌｍｅｒ ＪＢ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３；Ｈｏｆｆｍａｎ ＳＬ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７２：８８−９４，１９９５）。
本発明で用いるＤＮＡワクチンとしては、前記２．項で説明した組換えワクシニアウイルスに組み込まれるＨＣＶゲノム由来ｃＤＮＡ等（当該ｃＤＮＡの変異型を含む）と同様のｃＤＮＡやこれに対応するＲＮＡ等が組み込まれたプラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。具体的には、本発明で用いるＤＮＡワクチンとしては、前述したプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ５、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−Ｎ２５が好ましく挙げられるが、特に限定はされない。
４．Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前記１．項で述べた（ａ）の組換えワクシニアウイルスと（ｂ）の組換えベクターとを併用する医薬組成物、及び、前記１．項で述べた（ｃ）の組換えワクシニアウイルスと（ｄ）の組換えワクシニアウイルスとを併用する医薬組成物である。
ここで、上記併用にあたり、上記（ａ）の組換えワクシニアウイルスに含まれる（組み込まれる）ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡの全部または一部と、上記（ｂ）の組換えベクターに含まれる（組み込まれる）ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡの全部または一部とが、互いに塩基配列が異なるものであることが重要である。
同様に、上記併用にあたり、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスに含まれる（組み込まれる）ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡの全部または一部と、上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスに含まれる（組み込まれる）ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡの全部または一部とが、互いに塩基配列が異なるものであることが重要である。
このように、組み込まれるＨＣＶゲノムのｃＤＮＡが、互いに異なる塩基配列のものであることにより、前述した顕著な効果、すなわち非常に強力な特異的細胞性免疫誘導の効果が発揮される。
上記（ａ）の組換えワクシニアウイルスと上記（ｂ）の組換えベクターにそれぞれ組み込むＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡの組みわせや、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスと上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスにそれぞれ組み込むＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡの組みわせとしては、特に限定はされず、前記２．項で説明した本発明に利用できる各種ＨＣＶゲノム由来ｃＤＮＡ等から任意に選択することができる。例えば、上記（ａ）の組換えワクシニアウイルスにＮ２５を組み込み、上記（ｂ）の組換えベクターにＣＮ２を組み込む組合せや、またその逆の組合せが挙げられ、あるいは、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスにＮ２５を組み込み、上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスにＣＮ２を組み込む組合せや、またその逆の組合せが挙げられるが、これらに限定はされない。
さらに、本発明の医薬組成物においては、上記（ａ）の組換えワクシニアウイルスと上記（ｂ）の組換えベクターとの併用の場合は、いずれか一方を初期免疫用に投与し、その後他方を、追加免疫用に投与することが重要である。また、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスと上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスとの併用の場合も、いずれか一方を初期免疫用に投与し、その後他方を、追加免疫用に投与することが重要である。本発明においては、初期免疫の投与自体をさらに複数回（好ましくは２回）に分けて行ってもよいし、追加免疫の投与自体をさらに複数回（好ましくは２回）に分けて行ってもよい。例えば、初期免疫の投与を０ｗｅｅｋと２ｗｅｅｋ後の２回に分けて行った後、４ｗｅｅｋ後に追加免疫の投与を行う投与スケジュールや、初期免疫の投与を０ｗｅｅｋに行った後、２ｗｅｅｋ後と４ｗｅｅｋ後の２回に分けて追加免疫の投与を行う投与スケジュールなどが好ましく挙げられる。異なる種類のワクチンを、初期免疫と追加免疫の２段階に経時的に分けて投与する細胞性免疫誘導の方法は、プライム／ブースト法の特徴である。
なお、本発明においては、被験動物（患者）に、下記（ａ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｂ）の組換えベクターのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防方法を提供することもできる。
（ａ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｂ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部（但し、前記（ａ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えベクター
また本発明においては、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防をするための、本発明の医薬組成物の使用、具体的には、上記（ａ）の組換えワクシニアウイルス及び上記（ｂ）の組換えベクターの使用、特に、上記（ａ）の組換えワクシニアウイルス及び上記（ｂ）の組換えベクターのいずれか一方の初期免疫用の使用、並びに、他方の追加免疫用の使用を提供することもできる。
さらに本発明においては、被験動物（患者）に、下記（ｃ）の組換えワクシニアウイルス及び下記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスのいずれか一方を初期免疫用に投与した後、他方を追加免疫用に投与することを特徴とする、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防方法を提供することもできる。
（ｃ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部を含む組換えワクシニアウイルス
（ｄ）発現プロモーター、及びＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部（但し、前記（ｃ）の組換えワクシニアウイルスに含まれるＣ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全部または一部とは、塩基配列が異なるものである。）を含む組換えワクシニアウイルス
また本発明においては、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防をするための、本発明の医薬組成物の使用、具体的には、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルス及び上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスの使用、特に、上記（ｃ）の組換えワクシニアウイルス及び上記（ｄ）の組換えワクシニアウイルスのいずれか一方の初期免疫用の使用、並びに、他方の追加免疫用の使用を提供することもできる。
本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に投与することができ、限定はされない。なお、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスの投与の際には、既存の抗ウイルス薬（例えばインターフェロン）を併用することもできる。この併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）や組換えベクター（ＤＮＡワクチン）の一日投与量としては、経口の場合は１０００〜１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００００〜１００００００００ＰＦＵ程度であり、非経口の場合は１００〜１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００〜１００００００００ＰＦＵ程度である。組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）や組換えベクター（ＤＮＡワクチン）は、１日１回投与することもでき、複数回に分けて投与することもできる。
本発明に用いる組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）や組換えベクター（ＤＮＡワクチン）は、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
例えば、組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）としてのｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２、ｒＶＶ−Ｎ２５、または親株であるＬＣ１６ｍ８株に対する抗体価は、これらのウイルス株をウサギに接種後、経時的に血清を回収し、血清のＨＣＶに対するＥＬＩＳＡ価を測定することで得ることができる。組換えベクター（ＤＮＡワクチン）の抗体価も、上記と同様の手法により測定することができる。
また、細胞性免疫活性は、ｒＶＶ−ＣＮ５、ｒＶＶ−ＣＮ２、ｒＶＶ−Ｎ２５、または親株であるＬＣ１６ｍ８株をマウスに接種後、免疫したマウスから脾臓細胞を分離し、ＨＣＶ特異的なＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）が誘導されている否かを、ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙにより測定することができる。組換えベクター（ＤＮＡワクチン）の細胞性免疫活性も、上記と同様の手法により測定することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例1】

【0006】

トランスジェニックマウス
ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与することで、任意の時期にＨＣＶ遺伝子を誘導発現できるトランスジェニック（ＨＣＶ−Ｔｇ）マウス（ＣＮ２−２９^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}（ＭｘＣｒｅ／ＨＣＲ６−ＣＮ２）、ＲｚＣＮ５−１５^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}（ＭｘＣｒｅ／ＨＣＲ６−ＲｚＢ１５））（図１Ｂ）、Ｃ５６ＢＬ／６マウスを用いた。
ＨＣＶ−Ｔｇマウスはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与後、ＨＣＶタンパク質を３ヶ月間持続的に発現させた後に、実験に使用した。ＣＮ２−２９^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}マウスはＨＣＶ遺伝子の一部を、ＲｚＣＮ５−１５^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}マウスは全長をコードしている。

【実施例2】

【0007】

ＨＣＶ遺伝子発現ワクチン（ＤＮＡワクチン）の作製
すべてのＨＣＶ遺伝子領域（図１Ａ）を含むｐＢＭＳＦ７ＣプラスミドベクターからＰＣＲ法と制限酵素反応を用いて、ＨＣＶの主に構造タンパク質の領域（ＣＮ２）、ＨＣＶの主に非構造タンパク質の領域（Ｎ２５）の遺伝子領域を、ｐＣＡＧＧＳプラスミドベクターにそれぞれ組み込むことにより作製したＨＣＶ−ＤＮＡワクチン（ＨＣＶ−ＣＮ２（又はＣＮ２ ＤＮＡ）、ＨＣＶ−Ｎ２５（又はＮ２５ ＤＮＡ））をプライムワクチン（初期免疫用ワクチン）あるいはブーストワクチン（追加免疫用ワクチン）として使用した（図１Ｃ）。これらのワクチンのコントロールとしてＨＣＶ遺伝子領域を含まないＤＮＡワクチン（ｅｍｐ）をコントロールとして使用した。また、ＤＮＡワクチンに組み込んだ配列と同じ配列をワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株に組み込んだ組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）であるｒＶＶ−ＣＮ２及びｒＶＶ−Ｎ２５をプライムワクチンあるいはブーストワクチンとして使用した（図１Ｃ）。

【実施例3】

【0008】

組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）の作製
ｐＢＭＳＦ７Ｃプラスミド（特開平６−２３７７７３号参照）のＳｂｆＩとＳｇｆＩサイトにＣ型肝炎ウイルスのすべての遺伝子領域（ＣＮ５）、外殻を構成する構造タンパク質領域（ＣＮ２）、及び複製に関与している非構造タンパク質領域（Ｎ２５）の遺伝子領域（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ；ＡＹ０４５７０２）をそれぞれ組み込むことにより、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域内のＡＴＩ・ｐ７．５ハイブリットプロモーター下流にＨＣＶゲノム由来遺伝子が挿入されたプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ５、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−Ｎ２５を作製した。
ウサギ初代腎培養細胞をＴ１７５フラスコに播種し、コンフルエントに達したところで、ワクシニアウイルス弱毒株ＬＣ１６ｍ８株をｍｏｉ＝１０で３０℃、２時間感染させた。なお、ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）とは、細胞１個あたりのＰＦＵをいう。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）により処理し、１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地、ＰＢＳ（−）、ＨｅＢＳ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、細胞をＨｅＢＳ ｂｕｆｆｅｒ ６００μｌに懸濁した。プラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ５、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ＣＮ２及びｐＢＭＳＦ７Ｃ−Ｎ２５の各４０μｇを、それぞれ全量２００μｌになるようにＨｅＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、細胞懸濁液に加えて混和し、氷上で１０分間静置した。プラスミドベクターを加えた細胞懸濁液を０．４ｃｍキュベットに移し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーション（０．２ｋＶ、９６０μＦ）を行った。エレクトロポレーション後、直ちに１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地１ｍｌを細胞懸濁液に加えて希釈した。この細胞懸濁液をあらかじめＴ１７５フラスコに播種しておいたＲＫ１３細胞又はウサギ初代腎培養細胞に添加し、３０℃で２４時間培養した。
２４時間培養後、培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（−）により細胞を洗浄した。次いで、０．０５％ トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）処理を行った後、細胞を１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地に懸濁した。細胞懸濁液を回収し、冷水中において超音波処理（３０ｓｅｃ×４回）を行った後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。その上清をウイルス溶液として使用した。ウイルス溶液を１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地に希釈し、１００ｍｍディッシュに播種しておいた初代腎培養細胞に３０℃、１時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。１０％ＦＣＳ／０．５％メチルセルロース／ＭＥＭ培地を添加して、３０℃で７２時間培養した。７２時間培養後、上清を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ＰＢＳ（＋）で希釈したニワトリ赤血球溶液を１００ｍｍディッシュに添加し、３７℃で３０ｍｉｎ培養した。赤血球溶液を吸引除去した後、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した。ニワトリ赤血球が吸着しないプラークを、ピペットマンを用いて回収した。回収したプラークはＰＣＲならびに遺伝子配列の決定によりＨＣＶ遺伝子の導入を確認した。遺伝子導入が確認されたプラークについてはプラーク精製を３回繰り返した。
３回プラーク精製したウイルスについて、小スケール培養を行った。３回目に得たコロニーを７００μｌの１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、冷水中で超音波処理を行った。遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行った後、上清５００μｌをＴ２５フラスコに播種しておいた初代腎培養細胞に添加し、３０℃、２時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、２．５ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地で細胞を洗浄した。培地を吸引除去し、新たに２．５ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地を添加し、３０℃、７２時間培養した。７２時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収した。回収した細胞懸濁液を冷水中で超音波処理（３０ｓｅｃ、４回）した後、遠心分離し、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液は、段階希釈して６ウェルプレートに播種しておいたＲＫ１３細胞又はウサギ初代腎培養細胞に添加し、３０℃、１時間感染させた。ウイルス溶液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で細胞を２回洗浄した後、１０％ＦＣＳ／０．５％メチルセルロース／ＭＥＭ培地を添加して、３０℃で７２時間培養した。７２時間後に、ウェル中に形成されるプラーク数をカウントすることによりｔｉｔｅｒを算出した。
この算出したｔｉｔｅｒをもとに大スケール培養を行った。Ｔ１７５フラスコ１０枚にＲＫ１３細胞又はウサギ初代腎培養細胞を播種し、コンフルエントに達したところで、組換えワクシニアウイルス溶液をｍｏｉ＝０．１で３０℃、２時間感染させた。感染後、ウイルス溶液を吸引除去し、２０ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地で細胞を洗浄した。培地を吸引除去し、新たに２０ｍｌの１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地を添加し、３０℃、７２時間培養した。７２時間後にスクレーパーを用いて細胞をフラスコからはがし、細胞懸濁液を回収し、−８０℃で凍結保存した。この細胞懸濁液は凍結融解を三回行った後、冷水中で超音波処理（３０ｓｅｃ、４回）、遠心分離をし、その上清をウイルス溶液として回収した。回収したウイルス溶液を高速遠心用チューブに移しいれ、１８０００ｒｐｍで４５分間遠心分離を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を吸引除去した後、ペレットを少量の１０％ＦＣＳ／ＭＥＭ培地で再懸濁させた。この操作によりＴ１７５フラスコでの培養時に比べて１０倍濃縮のウイルス溶液を調製する。この濃縮ウイルス溶液を段階希釈して、６ウェルプレートに播種しておいたＲＫ１３細胞又は初代腎培養細胞に感染させて、上記と同様な方法により溶液中のウイルスｔｉｔｅｒを算出した。Ｔｉｔｅｒを算出したこの濃縮ウイルス溶液を以下の実施例に示す種々の実験に使用した。

【実施例4】

【0009】

免疫方法
２５μｌのＰＢＳに懸濁した１００μｇのＤＮＡワクチンをマウスの下腿部筋肉に、エレクトロポレーション（５０Ｖ，９９ｍｓｅｃ，８ｔｉｍｅｓ）により、２週毎に２回投与した。組換えワクシニアウイルスは１×１０^８ｐｆｕ／５０μｌで背皮内投与した。最終投与後２週目に脾臓、肝臓を回収し解析を行った。

【実施例5】

【0010】

ＥＬＩＳＰＯＴ法による特異的細胞性免疫誘導能の測定
赤血球溶血処理を行った脾細胞（１×１０^５）又は、脾細胞を磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分離したＣＤ８^＋、ＣＤ４^＋細胞（２×１０^５）を予めマイトマイシン処理を行った刺激細胞（ＨＣＶの各遺伝子部位を過剰発現した腫瘍細胞（ＥＬ−４／ＣＮ２，／Ｃ，／Ｅ２，／ＮＳ２，／Ｎ３−４Ａ））（１×１０^４）で刺激し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間培養、ＨＣＶ抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴ法により測定した。
（１日目）
９６ｗｅｌｌニトロセルロースプレートに精製抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を最終濃度８μｇ／ｍｌに調整（ｓｔｅｒｉｌｅ ＰＢＳにて１２５倍希釈）し、７５〜１００μｌ／ｗｅｌｌでまき、４度で一晩静置した。
（２日目）
マウスより脾臓細胞を取り出し、洗浄用ＲＰＭＩで適量に浮遊させた。洗浄用ＲＰＭＩは２．５％ ＦＣＳを添加したものを使用した。１２００ｒｐｍ，４度で５分間遠心し細胞を集めた。ＡＣＫ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）処理し、洗浄用ＲＰＭＩで適量に浮遊し、再度１２００ｒｐｍ，４度で５分間遠心し細胞を集めた。フィルターに５００μｌの洗浄用ＲＰＭＩを通した後に細胞浮遊液を通し、完全に通った後洗浄用ＲＰＭＩ １．５ｍｌで洗った。１０％ ＦＣＳ添加ＲＰＭＩで１回洗浄し、Ｈ−ｈ培地に浮遊後、１×１０^７／ｍｌに調整した。
１）Ｈ−ｈ培地：１０％ ＦＣＳ添加ＲＰＭＩと１０％ ＦＣＳ添加ＣＬＩＣＫ’Ｓ ｍｅｄｉｕｍを等量混合したもの
２）１０％ ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ：ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ Ｒ８７５８），ＦＣＳ（ｆｉｎａｌ １０％），２−メルカプトエタノール（終濃度５μＭ），ペニシリン−ストレプトマイシン（終濃度ＰＣｓ：１００μ／ｍｌ，ＳＭ：０．１ｍｇ／ｍｌ），７．５％ ＮａＨＣＯ_３４ｍｌ
３）１０％ ＦＣＳ添加ＣＬＩＣＫ’Ｓ培地：ＣＬＩＣＫ’Ｓ培地（ＳＩＧＭＡ Ｃ５５７２），ＦＣＳ（終濃度１０％），２−メルカプトエタノール（終濃度５μＭ），ペニシリン−ストレプトマイシン（終濃度ＰＣｓ：１００μ／ｍｌ，ＳＭ：０．１ｍｇ／ｍｌ），７．５％ ＮａＨＣＯ_３４ｍｌ
培養の開始
上記９６ｗｅｌｌニトロセルロースプレートをＰＢＳ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１０％ ＦＣＳ添加ＲＰＭＩを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７度で１時間ＣＯ_２インキュベーター中に入れブロッキングを行った。培地を捨て、エフェクター細胞を１×１０^６／１００μｌ／ｗｅｌｌから０．１２５×１０^６／１００μｌ／ｗｅｌｌまで２倍階段希釈で播いた。
ペプチド溶液（２００μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（終濃度１００μｇ／ｍｌ）にて加え、３７度で２４時間ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。
（３日目）
培地を捨て、ＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（２００μｌ／ｗｅｌｌ）で１０回洗浄した。ビオチン化抗−マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）（０．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を最終濃度２μｇ／ｍｌに調整（ＰＢＳにて２５０倍希釈）し、１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。４度で１晩静置した。
（４日目）
上記９６ｗｅｌｌニトロセルロースプレートをＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（２００ｕｌ／ｗｅｌｌ）で１０回洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（１ｍｇ／ｍｌ）（ＭＡＢＴＥＣＨ ＡＢ）を最終濃度１μｇ／ｍｌに調整（ＰＢＳにて１０００倍希釈）し、１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。
得られた溶液を室温で１．５時間静置した。２５×ＡＰ ｃｏｌｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）をＤＷで２５倍希釈し、１／１００量のＡＰ ｃｏｌｏｒ ｒｅａｇｅｎｔ Ａ ａｎｄ Ｂ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）をそれぞれ加えて反応混合物を調製した。上記９６ｗｅｌｌニトロセルロースプレートをＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（２００μｌ／ｗｅｌｌ）で１０回洗浄した。反応混合物を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温で１０〜２０分静置した。発色しｄａｒｋｓｐｏｔが出現したら反応混合物を捨て、水中でよく洗った。９６ｗｅｌｌニトロセルロースプレートの底を剥がし乾燥させ、ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｅｒでスポットの数を計数した。
ＨＣＶ−Ｎ２５ワクチン及びｒＶＶ−Ｎ２５を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスより脾臓を採取し、脾細胞中のＨＣＶ抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴ法により測定した。コントロール群由来の脾細胞は刺激後、何ら特異的なスポットを示さなかったが、ＨＣＶ−Ｎ２５投与群由来の脾臓細胞では、ＥＬ−４／Ｅ２，／ＮＳ２，／Ｎ３−４Ａ細胞による刺激後に、顕著にＩＦＮ−γを産生することを確認した（図２）。また、プライム／ブースト群においても同様にＥＬ−４／Ｅ２，／ＮＳ２，／Ｎ３−４Ａ細胞に対し、ＩＦＮ−γを産生することを確認した。
計数した結果を示す。図２はＨＣＶ部分長ＴｇマウスへのＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−Ｎ２５のプライム／ブーストワクチン接種の結果を示している。ＨＣＶ−Ｎ２５単独接種に比較してＨＣＶ特異的細胞性免疫反応を強く誘導している。図３はそのときの肝臓中ＨＣＶコアタンパク質量を示しており、ＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−Ｎ２５のプライム／ブーストワクチン接種の方が強く排除されている。図４はそのときの肝臓組織所見で、ＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−Ｎ２５のプライム／ブーストワクチン接種が最も肝炎の改善が認められる。しかしながら、図５に示すようにＨＣＶ全長ＴｇマウスへのＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−Ｎ２５のプライム／ブーストワクチン接種では十分なＨＣＶ特異的細胞性免疫反応の誘導が認められなかった。そこで、図６に示すようにプライム／ブーストワクチン接種の組み合わせを各種に変えて検討を行った。
その結果、図７に示すようにＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−ＣＮ２プライム／ブーストワクチン接種のように異なった遺伝子領域の組み合わせで、強くＨＣＶ特異的細胞性免疫反応を誘導できることが明らかとなった。さらに各種の組み合わせで解析した結果を図８に示す。このように異なった遺伝子領域であればＨＣＶ−ＤＮＡとｒＶＶのプライム／ブーストワクチン接種のみならず、異なった遺伝子領域のｒＶＶのプライム／ブーストワクチン接種でも強くＨＣＶ特異的細胞性免疫反応を誘導できることが明らかとなった。この異なった遺伝子領域の組み合わせでＨＣＶ全長ＴｇマウスへのＨＣＶ−Ｎ２５とｒＶＶ−ＣＮ２プライム／ブーストワクチン接種を行ったところ、図９に示すように非常に強いＨＣＶ特異的細胞性免疫反応の誘導が認められた。

【実施例6】

【0011】

肝臓の解析
ワクチンを投与した後、肝臓を回収し、肝臓組織抽出液の作製並びにホルマリン固定を行った。肝臓組織抽出液中のＨＣＶコアタンパク質発現量は市販のＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡキット（Ｏｒｔｈｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて定量した（図３）。肝臓中のＨＣＶコアタンパク質発現量はｅｍｐｔｙ投与群に比べワクチン投与群全てにおいて、肝臓中コアタンパク質発現量が減少しており、中でもプライム／ブーストワクチン接種群が最もコアタンパク質発現量を減少させていることを確認した（図３）。ホルマリン固定した肝臓片はパラフィン包埋後、組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った（図４）。肝臓の形態学的検索を行ったところ、ＨＣＶタンパク質を３ヶ月間持続的に発現させたＣＮ２−２９^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}マウスの肝臓では、肝細胞の膨化や索状配列の乱れなどの形態学的異常が多数観察されるが、ワクチン投与群においてそれらの異常が改善され、特にプライム／ブーストワクチン接種群でその改善が顕著であったことを確認した（図４）。
また、ＨＣＶタンパク質を３ヶ月間持続的に発現させたＲｚ１５^{（＋／−）}／ＭｘＣｒｅ^{（＋／−）}マウスの肝臓でも、肝細胞の膨化や索状配列の乱れなどの形態学的異常が多数観察されるが、ワクチン投与群においてそれらの異常が改善され、特にプライム／ブーストワクチン接種群でその改善が顕著であったことを確認した（図１０）。

【産業上の利用可能性】

【0012】

本発明によれば、Ｃ型肝炎に対する従来公知のワクシニアウイルスやＤＮＡワクチンをそれぞれ単独で用いた場合よりも、特異的細胞性免疫を更に活性化することが可能であり、ＨＣＶの完全排除に有効な、Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供することができる。
［配列表］

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】