特許 6625972 薬物送達用の自己集積ブラシブロックコポリマーナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6625972

(24)【登録日】2019年12月6日

(45)【発行日】2019年12月25日

(54)【発明の名称】薬物送達用の自己集積ブラシブロックコポリマーナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   C08F 293/00 20060101AFI20191216BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20191216BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20191216BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20191216BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20191216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191216BHJP

   C08F 220/38 20060101ALI20191216BHJP

   C08F 220/26 20060101ALI20191216BHJP

   C08G 61/06 20060101ALI20191216BHJP

【ＦＩ】

   C08F293/00

   A61K9/14

   A61K47/32

   A61K47/02

   A61K31/704

   A61P35/00

   C08F220/38

   C08F220/26

   C08G61/06

【請求項の数】27

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2016-521641(P2016-521641)

(86)(22)【出願日】2014年10月7日

(65)【公表番号】特表2016-539206(P2016-539206A)

(43)【公表日】2016年12月15日

(86)【国際出願番号】US2014059517

(87)【国際公開番号】WO2015054269

(87)【国際公開日】20150416

【審査請求日】2017年9月28日

(31)【優先権主張番号】61/887,781

(32)【優先日】2013年10月7日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516104009

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ コネチカット

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ル，シウリン

(72)【発明者】

【氏名】カシ，ラジェスワリ

(72)【発明者】

【氏名】トラン，タン−フェン

(72)【発明者】

【氏名】グェン，キー，タン

(72)【発明者】

【氏名】デーシムク，パラシャント

【審査官】 三原 健治

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１９４５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１１３６４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０２２４７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Prachant Deshmukh et.al，Hierarchically Self-Assembled Photonic Materials from Liquid Crystalline Random Brush Copolymers，Macromolecules，２０１３年，46，4558-4566

【文献】 Yu Shao et.al，Multishape Memory Effect of Norbornene-Based Copolymers with Cholic Acid Pendant Groups，Macromolecules，２０１２年，45，1924-1930

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｆ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

である第１のブロック、
および式：

【化2】

である第２のブロック、
［式中、
ｍおよびｎは、独立に約３〜約５００の整数であり；
Ａは、ノルボルネン、シクロペンテン、シクロオクテン、アクリレート、およびメタクリレートから独立に選択され；
Ｒ_１は、任意にリンカーを含むステロイド部分であり；かつ
Ｒ_２は、ポリアルキレンオキシド部分である］を含み、コア／殻ナノ粒子形状である、ブロックコポリマー。

【請求項2】

前記ステロイド部分がコレステロール、コール酸、デオキシコール酸、またはタウロコール酸を含む、請求項１に記載のブロックコポリマー。

【請求項3】

前記ステロイド部分がコレステロールを含む、請求項２に記載のブロックコポリマー。

【請求項4】

前記Ｒ_１のリンカーが、

【化3】

ポリラクトン、またはシロキサンのオリゴマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項5】

前記ポリアルキレンオキシド部分がポリエチレンオキシドまたはポリエチレンオキシドチオレートを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項6】

それぞれのＡが独立にノルボルネンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項7】

それぞれのＡが独立にアクリレートである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項8】

構造：

【化4】

［式中、
ｘは、約３〜約１００の整数であり；
ｍは、約５〜約２００の整数であり；かつ
ｎは、約５〜約１００の整数である］を含む、請求項１に記載のブロックコポリマー。

【請求項9】

ｘが、約５〜約５０である、請求項８に記載のブロックコポリマー。

【請求項10】

ｘが約８である、またはｘが約４４である、請求項９に記載のブロックコポリマー。

【請求項11】

ｍが約１０〜約１００である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項12】

ｎが約１５〜約８５である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項13】

前記ブロックコポリマーの分子量が約１０，０００〜約１，０００，０００Ｄａである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のブロックコポリマー。

【請求項14】

前記ブロックコポリマーの分子量が約４０，０００〜約７５０，０００Ｄａである、請求項１３に記載のブロックコポリマー。

【請求項15】

前記ブロックコポリマーの分子量が約６０，０００〜約７００，０００Ｄａである、請求項１４に記載のブロックコポリマー。

【請求項16】

請求項１〜１５のいずれか１項に記載のブロックコポリマーおよび疎水性の薬学的に活性な分子を含むナノ粒子。

【請求項17】

前記疎水性の分子がドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、メトトレザト、またはデキサメタゾンである、請求項１６に記載のナノ粒子。

【請求項18】

１種または複数種の金属ナノ粒子をさらに含む、請求項１６または１７に記載のナノ粒子。

【請求項19】

前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１８に記載のナノ粒子。

【請求項20】

前記金属ナノ粒子が磁気ナノ粒子または量子ドットである、請求項１８に記載のナノ粒子。

【請求項21】

前記ナノ粒子が約５〜約５００ｎｍの直径である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項22】

前記ナノ粒子が約１０〜約２００ｎｍの直径である、請求項２１に記載のナノ粒子。

【請求項23】

前記ナノ粒子が約５０〜約１５０ｎｍの直径である、請求項２２に記載のナノ粒子。

【請求項24】

それを必要としている対象に疾患または障害の治療に有効な量で投与されることを特徴とする、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のナノ粒子。

【請求項25】

請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のナノ粒子を調製する工程であって、（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載のブロックコポリマーを有機溶媒中に溶解してコポリマー溶液を得ることと、（ｂ）前記コポリマー溶液を水溶液中で混合して前記ナノ粒子を形成することとを含む工程。

【請求項26】

前記有機溶媒がジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の工程。

【請求項27】

前記コポリマー溶液の混合が前記水溶液中で透析により行われる、請求項２５または２６に記載の工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月７日出願の米国特許仮出願第６１／８８７，７８１号に対する優先権の利益を主張する。これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、水溶液中で容易にナノ粒子に自己集積でき、また、疎水性の薬学的に活性な分子の封入を可能とする、両親媒性液体結晶ブラシブロックコポリマーを提供する。

【背景技術】

【0003】

関連技術の説明
抗癌剤の臨床使用はその疎水性および非特異的毒性により制限される。なぜなら臨床的に使われる抗癌剤の大部分は、身体中の健康な組織および患部組織の両方に急速に拡散し、深刻な副作用を引き起こす低分子量化合物だからである。抗癌剤用の安全で効果的なデリバリーシステムを開発するニーズがますます大きくなっている。自己集積ナノ粒子構造体はコア中への抗癌剤の封入を可能にし、一方で親水性の殻は水溶性および安定性を高めるのを可能とする。適切なサイズおよび表面特性のナノ粒子は、亢進した透過性および滞留性（ＥＰＲ）効果により腫瘍部位に蓄積する機会を有し得る。ＥＰＲ効果は腫瘍血液およびリンパ脈管構造の異常性からもたらされる。

【0004】

抗癌剤送達用の種々の自己集積ナノ粒子が開発されてきた。残念ながら、これらの多くは臨床試験において有益な効果を示さなかった。薬物送達ポリマー系に対する主要な障害は、高希釈および低薬物装填量時のポリマーミセルの安定性の欠如である。さらに、多くの合成生分解性コポリマーは、インビボで侵食される際に周辺組織と有害な相互作用を起こすオリゴマーおよびモノマーを生成する。

【0005】

コレステロール末端基を有するコポリマーもまた、ポリマー足場の土台を形成する、細胞付着および増殖用の膜としての役割、および改善された血液適合性を有する材料としての役割を含む種々の生物医学的適用に興味を持たれている。しかし、コレステロールを含む報告された両親媒性ポリマー構造は、１つまたは２，３のコレステロール分子のみを有する複合体または直鎖コポリマーである。これにより、これらのコレステロール含有コポリマーにおける低い安定性、低い封入効率による２０％（ｗ／ｗ）までの限られた薬物装填容量、および急速な薬物放出がもたらされる。

【発明の概要】

【0006】

薬物装填容量を高めるが、同時にポリマーキャリアの毒性およびその分解生成物を最小化する適切な構造および組成を有するブロックコポリマーの設計は、依然として難しい問題である。コレステロール分子を含む液体結晶ポリマー（ＬＣＰ）は、生理活性材料およびバイオテクノロジーなどの種々の分野で適用されてきたが、ＬＣＰを薬物送達システムとして利用しているのはほんのわずかの研究者に過ぎない。本発明は、新規液体結晶ブラシブロックコポリマー（「ＬＣｂｒｕｓｈＢＣＰ」または「ブロックコポリマー」）を提供する。本開示のブロックコポリマーは、水溶液中で自己集積ナノ粒子を容易に形成した。これらのナノ粒子は、超音波処理またはホモジナイゼーション操作を行うことなく、単純に自己集積により疎水性の薬物の装填を可能にする。また、本開示のナノ粒子は、高ステロイド含量疎水性コアの優れた安定性を示し、かつ疎水性薬物の高容量の封入を実証し、一方で表面上のブラシ状の親水性分子が水性媒体中でのナノ粒子の安定性を可能にした。また、親水性表面は、細網内皮系（ＲＥＳ）の取り込みを遮り、体内での長時間循環を容易にした。本開示の自己集積ナノ粒子は、良好な生体適合性、高薬物装填容量、長時間の循環滞留性、多様な方式の可能性を有し、大規模で容易に製造でき、このことがそれらを薬物送達に適切にする。

【0007】

疎水性抗癌剤を封入した本開示のナノ構造体は、遊離抗癌剤に比べて、毒性の大きく低減された高い腫瘍蓄積性および抗腫瘍効力を示した。これらの性質は本開示のナノ粒子を抗癌剤薬物送達での使用に特に適切にする。

【0008】

最後に、本開示のブロックコポリマーは官能化（例えば、チオール、リン酸、カルボン酸基で）されていてよく、かつこのようなコポリマーも水性媒体中で自己集積してよく定義されたナノ粒子を形成した。例えば、チオール官能化ナノ粒子は、物理的捕捉による疎水性抗癌剤およびチオール基への共有結合による金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）の二重封入用の多官能キャリアとしての役割を果たした。均一な粒度分布および良好な安定性と共に、高薬物装填量および高封入効率は、例えば光熱癌治療および生物学的センシングにおいて、官能化ナノ粒子を抗癌剤および金属ナノ粒子の送達のために使用することを可能にした。
したがって、広義の態様では、本開示は、
式：

【化1】

の第１のブロック、
および式：

【化2】

の第２のブロック、
［式中、
ｍおよびｎは、独立に約３〜約５００の整数であり；
Ａは、ポリノルボルネン、ポリシクロペンテン、ポリシクロオクテン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、およびポリシロキサンから独立に選択され；
Ｒ_１は、任意にリンカーを含むステロイド部分であり、
Ｒ_２は、ポリアルキレンオキシド部分である］を含むブロックコポリマーを提供する。

【0009】

別の態様では、本開示はコア／殻ナノ粒子形状の本開示のブロックコポリマーを提供する。一実施形態では、コア／殻ナノ粒子形状は、本開示のブロックコポリマーが水溶液中で自己集積したものである。

【0010】

一態様では、本開示は、本開示のブロックコポリマーおよび疎水性の薬学的に活性な分子を含むナノ粒子を提供する。別の態様は、このナノ粒子を含む治療のためのデリバリーシステムを提供する。さらに別の態様は、対象にこのナノ粒子を投与することを含む、薬学的に活性な分子を送達する方法を提供する。さらに別の態様は、対象にこのナノ粒子を投与することを含む、疾病または障害を治療する方法を提供する。例えば、疎水性の薬学的に活性な分子が抗癌剤の場合、疾患または障害は癌である。

【0011】

最後に、本開示は本開示のナノ粒子を調製する工程も提供し、この行程は、（ａ）本開示のブロックコポリマーを有機溶媒中に溶解してコポリマー溶液を得る行程と、（ｂ）コポリマー溶液を水溶液中で混合してナノ粒子を形成する行程を含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、水性媒体中でのＡｕ ＮＰおよびＤＯＸ二重封入Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）の自己集積を示す。

【図2】図２は、水性媒体中でのＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）の自己集積を示す。

【図3】図３は、１ｍｇ／ｍＬの濃度での自己集積および二重封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子を示す。赤色の二重封入ナノ粒子はＡｕ ＮＰ封入Ｐ（ＰＥＯＡ−ｂ−ＰＣ５ＭＡ）−ＳＨナノ粒子より黒っぽく、ＤＯＸの存在を示している。１：水中のブランクＮＰ；２：ＤＭＦ中のＡｕＮＰテンプレートｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ；３：水中のＡｕＮＰ封入ＮＰ；４：水中のＤＯＸ封入ＮＰ；および５：水中の二重封入剤

【図4A】図４Ａは、自己集積および二重封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ、Ｐ（ＰＥＯＡ−ｂ−ＰＣ５Ａ）−ＳＨ：（ａ）ブランクｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子、（ｂ）ＤＭＦ中のＡｕＮＰテンプレートｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ、（ｃ）Ａｕ ＮＰ封入したｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ、（ｄ）水中のＤＯＸ封入ＮＰ、および（ｅ）Ａｕ ＮＰ＋ＤＯＸ二重封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。スケールバーは１００ｎｍ。ＴＥＭ像は、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子が均一のサイズ分布を有する球形状であることを示した。

【図4B】図４Ｂは、ＡｕＮＰテンプレートｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰおよび二重封入ＮＰ内のＡｕＮＰのエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分光を示す。

【図5】図５は、２５℃での動的光散乱（ＤＬＳ）測定による、（ａ、ｂ）：Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_３６）、および（ｃ、ｄ）：Ｐ（ＰＥＯＡＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）の二重封入前（ａ、ｃ）および後（ｂ、ｄ）のｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子の粒度分布を示す。

【図6A】図６Ａは、４℃で貯蔵されたＰＢＳ／ＦＢＳ（１：１）中の二重封入Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_３６）およびＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ_１３）ナノ粒子の安定性を示す。

【図6B】図６Ｂは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＤＯＸ装填Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ）ナノ粒子の放出プロファイルを示す。

【図6C】図６Ｃは、４℃で貯蔵されたＰＢＳ／ＦＢＳ（１：１）中の二重封入Ｐ（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣ５ＭＡ）−ＳＨナノ粒子の安定性を示す。

【図6D】図６Ｄは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＤＯＸ装填および二重装填Ｐ（ＰＥＯＡ−ｂ−ＰＣ５ＭＡ）−ＳＨナノ粒子の放出プロファイルを示す。

【図7】図７は、４００ｋＤａ−５０（ａ）、６００ｋＤａ−７５（ｂ）、６００ｋＤａ−１８０（ｃ）、４００ｋＤａ−５０−ＤＯＸ（ｄ）、６００ｋＤａ−７５−ＤＯＸ（ｅ）、および６００ｋＤａ−１８０−ＤＯＸ（ｆ）のＴＥＭ像を示す。（ａ）、（ｂ）、（ｄ），（ｅ）、および（ｆ）画像のナノ粒子は、１％のリン酸タングステン酸でネガティブ染色された。

【図8A】図８Ａは、４℃で貯蔵されたＰＢＳ／ＦＢＳ（１：１）中のＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子の安定性を示す。

【図8B】図８Ｂは、０．１％ツイーン８０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子の１００ｒｐｍ、３７℃での放出プロファイルを示す。

【図9A】図９Ａは、種々の濃度のブランク４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子と共に４８時間インキュベートしたヒーラ細胞の生存率を示す。

【図9B】図９Ｂは、種々の濃度のＤＯＸの、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子と共に２４時間インキュベートしたヒーラ細胞の生存率を示す。

【図9C】図９Ｃは、種々の濃度の、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ装填Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ）ＮＰおよびＡｕ＋ＤＯＸ装填Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ）ＮＰと共に２４時間インキュベートしたヒーラ細胞の生存率を示す。

【図10】図１０は、２５μｇ／ｍＬのＤＯＸ当量の、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子と共に２時間インキュベートしたヒーラ細胞の生存率を示す。^＊Ｐ＜０．０５。

【図11A】図１１Ａは、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰのインビボ循環時間を示す。

【図11B】図１１Ｂは、担腫瘍ＳＣＩＤマウスにおける、注入の２４時間後のＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの組織分布を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１で示す。

【図12A】図１２Ａは、担腫瘍ＳＣＩＤマウスにおける、注入後１時間、５時間、２４時間後のＤｉＲ装填ナノ粒子のインビボ蛍光像を示す。

【図12B】図１２Ｂは、ＳＣＩＤマウスにおける、注入２４時間後の器官および腫瘍のエクスビボ蛍光像を示す。

【図13】図１３は、担腫瘍ＳＣＩＤマウスにおけるＤＯＸ−ＮＰの抗腫瘍効力を示す。（Ａ）腫瘍体積、（Ｂ）試験終了時点の（ａ）対照、（ｂ）ＤＯＸ−ＮＰで治療したマウスの腫瘍組織の写真、（Ｃ）体重変化、および（Ｄ）生存率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）、^＊＊Ｐ＜０．０１で示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

開示方法および材料を説明する前に、本明細書で記載の態様は、特定の実施形態、方法、装置、または構成に限定されるものではなく、従って、当然のことながら、変えることが可能であることを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを説明することを目的とするものであり、特に定めのない限り限定することを意図したものではないということも理解されたい。

【0014】

本開示を考慮すると、当業者であれば、本明細書記載の方法を所望の必要性に適合するように構成できる。例えば、特定の態様において、開示のコポリマーはステロイド含有ブロックおよびポリアルキレンオキシド含有ブロックからなる。このようなコポリマーは、超音波処理またはホモジナイゼーションを行うことなく水溶液中でナノ粒子として容易に自己集積し、良好な生体適合性、高薬物装填容量、長時間の循環滞留性、多様な方式の可能性を有し、大規模で容易に製造できる。別の例では、本開示のナノ構造体を使って、抗癌剤などの疎水性の治療的に活性な分子を封入できる。抗癌剤を封入するナノ粒子は、遊離抗癌剤に比べて大きく低減された毒性と共に高い腫瘍蓄積性および抗腫瘍効力を示した。別の例では、本開示のブロックコポリマーは官能化（例えば、チオールで）されていてよく、かつこのようなコポリマーも水性媒体中で自己集積して、官能基を有するよく定義されたナノ粒子を形成できる。チオール官能化ナノ粒子は、物理的捕捉による疎水性抗癌剤およびチオール基への共有結合による金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）の二重封入用の多官能キャリアとしての役割を果たした。これらの二重ナノ粒子は、高薬物装填量、高封入効率、均一な粒度分布、および良好な安定性を示した。

【0015】

本開示のブロックコポリマーは、第１のブロックが任意にリンカーを含むステロイド部分を含むことを必要とする。当業者であればわかるように、所望の必要性に適合するように適切なステロイドを選択できる。例えば、本開示の材料に適するステロイド部分は、コレステロール、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸などを含む。一実施形態では、ステロイド部分はコレステロールを含む。

【0016】

ステロイド部分は適切なリンカーを介してポリマー主鎖に結合していてよい。リンカーのいくつかの例には、

【化3】

ポリラクトン、またはシロキサンのオリゴマーが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｒ_１におけるリンカーは、

【化4】

である。

【0017】

別の実施形態では、Ｒ_１におけるリンカーは、

【化5】

【0018】

ステロイドを含有する第１のブロックは、ブロックコポリマーの総重量の約１％〜約８０％（すなわち、約１％〜約８０％の重量分率）であってよい。例えば、第１のブロックの重量分率は、ブロックコポリマーの総重量を基準として、５０％超、または５０％未満、または約５％〜約７０％、または約４０％〜約７０％、または約４０％〜約５０％、または約６０％〜約７０％、または約２％〜約３０％、または約３％〜約３０％、または約５％〜約３０％、または約２％〜約２０％、または約３％〜約２０％、または約５％〜約２０％、または約７％〜約２０％であってよい。

【0019】

本開示のブロックコポリマーは、第２のブロックがポリアルキレンオキシド部分を含むことを必要とする。当業者であればわかるように、所望の必要性に適合するように適切なポリアルキレンオキシドを選択できる。いくつかの実施形態では、ポリアルキレンオキシド部分はポリエチレンオキシドまたはポリエチレンオキシドチオレートを含む。別の実施形態では、ポリアルキレンオキシド部分はポリエチレンオキシドを含む。

【0020】

ポリアルキレンオキシドを含有する第２のブロックは、ブロックコポリマーの総重量の約２０％〜約９９％（すなわち、約２０％〜約９９％の重量分率）であってよい。例えば、第２のブロックの重量分率は、ブロックコポリマーの総重量を基準として、５０%超、または５０%未満、または約３０％〜約９５％、または約３０％〜約６０％、または約５０％〜約６０％、または約３０％〜約４０％、または約７０％〜約９８％、または約７０％〜約９７％、または約７０％〜約９５％、または約８０％〜約９８％、または約８％〜約９７％、または約８０％〜約９５％、または約８０％〜約９３％であってよい。

【0021】

本開示のブロックコポリマーは、主鎖部分Ａを必要とする。本明細書で記載のブロックコポリマーは、当業者が利用可能な、例えば、ポリノルボルネン、ポリシクロペンテン、ポリシクロオクテン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、およびポリシロキサン主鎖Ａを含んでよく、所望の生成物に応じて変化してよい。一実施形態では、開示ブロックコポリマーは、それぞれのＡが独立にポリノルボルネンまたはポリアクリレートであるものである。別の実施形態では、Ａは独立にポリノルボルネンである。別の実施形態では、それぞれのＡは独立にポリアクリレートである。

【0022】

一実施形態では、本開示のブロックコポリマーは、構造、

【化6】

または、
［式中、ｘは約３〜約１００の整数であり、ｍは約５〜約２００の整数であり、ｎは約５〜約１００の整数である］を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、ｘは約５〜約５０である。他の実施形態では、ｘは約８であるか、またはｘは約４４である。

【0024】

当業者なら、本開示のブロックコポリマーが１種または複数種の追加の官能基をさらに含んでもよいことを理解するであろう。官能基の例としては、チオール、リン酸、カルボン酸基、などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者なら、特定用途に基づき所望の官能基を選択できるであろう。例えば、チオール官能化ブロックコポリマーは、疎水性抗癌剤（すなわち、物理的捕捉による）およびチオール基への共有結合による金ナノ粒子（Ａｕ ＮＰ）の二重封入用の多官能キャリアとしての役割を果たし得る。同様に、リン酸またはカルボン酸官能化ブロックコポリマーは、量子ドット（例えば、ＣｄＳｅなど）または磁気ナノ粒子を封入するのに使用できる。

【0025】

ｍおよびｎの値は、当業者が選択でき、所望の生成物に応じて変わり得る。例えば、ｍは約１０〜約１００であってよく、および／またはｎは約１５〜約８５であってよい。本開示のブロックコポリマーの分子量は、約１０，０００〜約１，０００，０００Ｄａであってよい。一実施形態では、本開示のブロックコポリマーは、約４０，０００〜約７５０，０００Ｄａ、または約６０，０００〜約７００，００Ｄａ、または約６０，０００〜約１００，０００Ｄａ、または約４０，０００〜約２００，０００Ｄａである。

【0026】

本明細書で開示のブロックコポリマーは、例えば、比較的低い多分散性を含む、多くの望ましい特性を有する。本発明の実施形態では、任意選択で、ポリマー鎖は、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約２．５であるような多分散指数を示す。いくつかの実施形態では、多分散指数は、約１．０〜約２．０、または約１．０〜約１．９、または約１．１〜約１．９、または約１．０〜約１．８、または約１．１〜約１．８、または約１．０〜約１．５、または約１．５〜約１．５、または約１．０〜約１．３、または約１．０〜約１．２、または約１．０、または約１．１、または約１．２、または約１．３、または約１．４、または約１．５、または約１．６、または約１．７、または約１．８、または約１．９、またはさらには約２．０である。特定の実施形態では、ポリマーは、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約１．５の多分散度を示す。いくつかのその他の実施形態では、ポリマーは、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎが約１．０〜約１．２の多分散度を示す。

【0027】

別の態様では、本開示はコア／殻ナノ粒子形状の本開示のブロックコポリマーを提供する。一実施形態では、コア／殻ナノ粒子形状は、本開示のブロックコポリマーが水溶液中で自己集積したものである。一態様では、本開示は本開示のブロックコポリマーおよび疎水性の薬学的に活性な分子を含むナノ粒子を提供する。任意の好適な疎水性の薬学的に活性な分子は、所望の治療効果に応じて使用できる。いくつかの実施例は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、メトトレザト、またはデキサメタゾンを含むが、これらに限定されない。

【0028】

本開示のナノ粒子は、金ナノ粒子などの１種または複数種の金属ナノ粒子および／または磁気ナノ粒子および／または量子ドット（例えば、ＣｄＳｅなど）をさらに含んでよい。

【0029】

本明細書で開示のブロックコポリマーは、例えば、均一な粒度分布を有するよく定義されたものを含む、多くの望ましい特性を有する。本開示のナノ粒子は、約５〜約５００ｎｍの範囲のいずれの大きさであってもよい。例えば、ナノ粒子は、約１０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約２５０ｎｍ、または約１００〜約２００ｎｍ、または約１２０〜約１５０ｎｍ、または約１１０〜約１５０ｎｍ、または約１２０〜約１８０ｎｍ、または約１５０〜約２５０ｎｍ、または約１５０〜約２００ｎｍであってよい。

【0030】

定義
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書の全体を通して、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記述した成分、特徴、要素、もしくはステップまたは一群の成分、特徴、要素もしくはステップを含むが、いかなる他の整数もしくはステップまたは一群の整数もしくはステップを除外するものではないことを意味すると理解されよう。

【0031】

明細書および付随する請求項の記載で用いられ単数形の「ａ」「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。

【0032】

本明細書では、範囲を、「約（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値から、および／または「約（ａｂｏｕｔ）」別の特定の値までとして表記できる。そのような範囲が表記される場合、別の態様は、その１つの特定の値からおよび／またはその他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」を用いることにより近似値として表される場合、その特定の値が別の態様を形成するものと理解される。さらに、複数の範囲の各々の終点が、その他の終点と関連して、およびその他の終点から独立して有効であることが理解されるであろう。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語の「混ぜ合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）」は、１種または複数種のものを反応混合物に加えることを含む。

【0034】

本明細書で使用する場合、用語の「分散度」、「多分散度」、「多分散指数」、「ＰＤＩ」、および「Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ」は同じ意味で用いられ、分子量の分布を基準にしたポリマーの均一性の尺度を意味する。分散度は、重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を数平均分子量（Ｍ_ｎ）で除算して計算できる（すなわち、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）。特定の実施形態では、分散度は重合度に従って計算でき、この場合、分散度はＸ_ｗ／Ｘ_ｎに等しく、式中、Ｘ_ｗは重量平均重合度でありＸ_ｎは数平均重合度である。

【0035】

本明細書での全てのパーセンテージ、比率および割合は、他に規定されない限り、重量による。成分の重量パーセント（重量％、ｗｔ％とも表す）は、そうでない記載が特にない限り、その成分が含まれる組成物の総重量（例えば、反応混合物の総量）を基準とする。

【0036】

実施例
本開示の材料および方法が次の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は、本開示の範囲または趣旨をそれらに記載の特定の手順および材料に制限するものと解釈されるべきものではない。

【0037】

材料および方法
すべてのガラス器具を１２０℃の乾燥オーブン内で数時間保持した。ドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ・ＨＣｌ）およびイダルビシン塩酸塩をＢｉｏｔａｎｇＩｎｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ピレンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン−０．０３％（Ｗ／Ｖ）ＥＤＴＡ溶液、ＲＰＭＩ １６４０、およびＤＭＥＭ培地をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。ヒト子宮頸癌（Ｈｅｌａ）およびヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を米国国立癌研究所（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）をＡｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｄｒａｑ５、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’ ，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＲ）およびインビトロ毒性アッセイキット（ＭＴＴベース）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ膜をＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。 ２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）、チオグリコール酸（９８％）、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（ＰＴＳＡ）、Ｄ，Ｌ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ）、クエン酸ナトリウム、コレステロール（９６％）、１，５−ペンタンジオール（９７％超）をＡｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡから入手した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ポリエチレングリコール（ＭＷ＝１５００）、１，４−ジオキサン（９９．８％、超乾燥（ｅｘｔｒａ ｄｒｙ））、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（９９．９％、超乾燥）、塩化アクリロイル（＞９７％）をＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ ＵＳＡから購入した。５−コレステリルオキシペンチルアクリレート（Ｃ５Ａ）は報告された手順に従って調製した。ＲＡＦＴ剤のＳ−１−ドデシルーＳ’−（α，α’−ジメチル−α”−酢酸）トリカーボネート（ＣＴＡ）を報告された手続きに従って合成した。ツイーン（登録商標）８０（ポリソルベート８０）をＣｒｏｄａ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｃｉｒｃｌｅ Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）から寄贈品として入手した。全ての化学薬品は、分析等級であり、精製しないで使用した。

【0038】

データは、平均±標準偏差として表す。実験群と対照群との間の差異の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定を使って決定した。０．０５未満の確率（ｐ）であれば、統計的に有意であると見なした。

【0039】

実施例１：Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）の合成および精製
スキーム１

【化7】

【0040】

Ｃ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，５ （８），２７７４−２７８３）に記載の可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）などの制御ラジカル重合を使ってブロックコポリマーを合成した。簡単に説明すると、ポリエチレングリコール（ＭＷ＝１５００Ｄａ）（１ｍｍｏｌ）およびＰＴＳＡ（０．１ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ中に加え、トルエン（１０ｍｌ）を添加した。この反応混合物に、チオグリコール酸（０．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、この混合物を窒素雰囲気下で一晩還流した。反応混合物を冷却した後、溶媒を留去し、残留物をＤＣＭ／水を使って分配し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。有機層を集めて、減圧下で濃縮した。ジスルフィド官能基を還元するために、集めた化合物をメタノールに溶解し、続けてＤＴＴ（１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。その後、得られた溶液をジエチルエーテル中で沈殿させてＤＴＴを除去し、チオール化ＰＥＯ（ＰＥＯ_ＳＨ）生成物を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−、ＰＥＯ末端基中）、３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの反復単位）、３．３５（ｓ，２Ｈ）、１．５５（ｓ，’ＳＨ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ）、７０．３および６４．８（ＰＥＯの反復単位中の−ＣＨ_２）、２７．７（−ＣＨ_２−Ｓ）。

【0041】

最初に、ＰＥＯ_ＳＨを１０重量％の濃度でＤＣＭ中に溶解した。次に、塩化アクリロイルおよびＴＥＡをその溶液中に加えて、窒素雰囲気下で一晩攪拌した。ＰＥＯ_ＳＨ、塩化アクリロイルおよびＴＥＡのモル比は、１：２：２であった。反応の完結後、不溶性の塩（ＴＥＡ・ＨＣｌ）を濾過して除去し、溶液を集めた。ポリエチレンオキシドチオレートアクリレート（ＰＥＯＡ_ＳＨ）を過剰の冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、淡黄色固体として集めた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−、ＰＥＯ末端基中）、３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの反復単位）、６．４２，６．０９，５．５４（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＯＯ−）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ）、１３３，１２６．６（ビニル基中の−ＣＨ_２，ＣＨ），７０．３および６４．８（−ＣＨ_２ＰＥＯ中の反復単位）、２７．７（−ＣＨ_２−Ｓ）。

【0042】

ＲＡＦＴ重合を使用してＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ）マクロ連鎖移動剤を合成した。モノマーＰＥＯＡＳＨ（０．５ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を備えたシュレンクチューブ中で３ｍＬのトルエンに溶解し、続けて、ＲＡＦＴ剤ＣＴＡ（１８．３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、および開始剤ＡＩＢＮ（０．８２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。シュレンクチューブを３回の凍結−排気−解凍サイクルにより脱気した後、７０℃の油浴中に置いた。反応を２０時間進行させた。反応混合物をジエチルエーテル中で濃縮し、沈殿させた。ポリアクリレート含有ＰＥＯ_ＳＨ（Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ））ポリマーを集めて、真空下で一晩乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−、ＰＥＯ末端基中）、３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの反復単位）、３．１５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），１．６０−１．７５（ｍ，６Ｈ，−Ｓ−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＯＯ−），１．２５（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−），０．８７（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−）。ＧＰＣ（４０℃、ＴＨＦ移動相、ポリスチレン標準）：Ｍ_ｎ＝８５４０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．１８。

【0043】

代表的手順では、Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ）マクロ連鎖移動剤（１．２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、Ｃ５Ａ（３．８ｇ、２８．０ｍｍｏｌ），およびＡＩＢＮ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の混合物を１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、３回の凍結−排気−解凍サイクルを行うことにより脱気した。この反応混合物を密閉した後、予熱した７５℃の油浴中に２０時間置いた。得られた混合物をジエチルエーテル中で濃縮し、沈殿させた。生成物を集めて、真空下で乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：５．３３（ｄ，１Ｈ，−Ｃ＝ＣＨ−，コレステリル部分のオレフィン基），３．９（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２），３．６４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＰＥＯの反復単位），３．４５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＯＣＨ−），３．１２（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ_２ＯＣＨ−），２．５０−０．５５（ｍ，５４Ｈ，コレステリル中の−ＣＨ_３，−ＣＨ_２−，−ＣＨ−，−ＣＨ−（ＣＨ_３）−，スペーサー中の−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）。ＧＰＣ（４０℃、ＴＨＦ移動相、ポリスチレン標準）：Ｍ_ｎ＝１５２７０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．２１。

【0044】

^１Ｈ−ＮＭＲにより、得られたＬＣＰブロックコポリマーのモル組成（ｎ：ｍ）および分子量を決定できた。５．３、３．９および２．５−０．５５ｐｐｍでの信号は、コレステロールのプロトンに帰属された。さらに、６．４２、６．０９および５．５４ｐｐｍでのモノマーオレフィンピークは、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰには存在しなかったが、これはモノマーからポリマーへの完全な変換を示している。ＰＥＯ反復単位およびＰＥＯ末端基のＣＨ_２に対応するＰＥＯブロックの信号は、それぞれ、３．６ｐｐｍおよび４．２５ｐｐｍに観察された。５．３３ｐｐｍ（コレステリル部分のオレフィン基）と３．６４ｐｐｍ（ＰＥＯ反復単位）でのＮＭＲスペクトルによるピークの積分を比較することにより、２つの異なるブロックの重量分率を決定した。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使って、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰの数平均分子量（Ｍ_ｎ）および多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰは、狭い分子量分布の高分子量領域に明確にシフトした。結果は、単峰性対称分布を示し、良好にコントロールされた重合プロセスであることを示している。コレステロール比率を調整することによりＰＣ５Ａの分子量を７０００〜１８０００ｇ／ｍｏｌに制御しながら分子量を９０００ｇ／ｍｏｌに固定したＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ）マクロ連鎖移動剤を使って、異なる重量分率（またはＭＷ）のコレステロールブロックを有する２つの異なるｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰを得た。

【表1】

【0045】

実施例２：Ｐ（ＰＥＯ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−ＳＨの合成および精製
スキーム２

【化8】

メタクリル酸塩グラフトポリエチレンオキシド（ＭＡ−ｇ−ＰＥＯ）：マクロモノマーのＭＡ−ｇ−ＰＥＯを合成するために、ポリエチレンオキシドメチルエーテル（ＭＷ：２０００Ｄａ、４ｇ、２ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶解し、続けて、メタクリロイルクロライドおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加え、窒素下で一晩撹拌した。ＰＥＯ、メタクリロイルクロライドおよびＴＥＡのモル比は、１：２：２であった。１２時間後、不溶性の塩（ＴＥＡ・ＨＣｌ）を濾過して除去し、溶液を集めた。マクロモノマー生成物を過剰の冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、淡黄色固体として集めた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：６．１５，５．５４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＯＯ−），４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−、ＰＥＯ末端基中），３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの反復単位），３．３６（ｓ，−ＯＣＨ_３）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ），１３３，１２６．６（ビニル基中の−ＣＨ_２，ＣＨ），７０．３および６４．８（−ＣＨ_２，ＰＥＯ中の反復単位）。

【0046】

ＰＥＯマクロ開始剤（ＰＭＡ−ｇ−ＰＥＯ−チオエステル）：ＲＡＦＴ重合を使用してＰＭＡ−ｇ−ＰＥＯ−チオエステルマクロ連鎖移動剤を合成した。撹拌棒を備えたシュレンクチューブ中で、マクロモノマー（ＭＡ−ｇ−ＰＥＯ、０．５ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、続けて、ＲＡＦＴ剤（ＣＴＡ、１８．３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、および開始剤（ＡＩＢＮ、０．８２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。シュレンクチューブを３回の凍結−排気−解凍サイクルにより脱気した後、８０℃の油浴中に置いた。反応を２４時間進行させた。反応混合物をジエチルエーテル中で濃縮し、沈殿させた。生成物を集めて、真空下で一晩乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：４．２７（ｔ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２−、ＰＥＯ末端基中）、３．７９−３．４４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−，ＰＥＯの反復単位）、３．３６（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），１．６０−１．７５（ｍ，６Ｈ，−Ｓ−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＯＯ−），１．２５（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−），０．８７（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２Ｓ−）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ），１３３，１２６．６（ビニル基中の−ＣＨ_２，ＣＨ），７４．５（−ＣＯＯＣＨ−），７０．３および６４．８（−ＣＨ_２，ＰＥＯ中の反復単位），５１．３−１１．２（−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−）。ＧＰＣ（４０℃、ＴＨＦ移動相、ポリスチレン標準）：Ｍ_ｎ＝８９５０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．２７。

【0047】

Ｐ（ＰＥＯ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−チオエステル（Ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステル；または（ＰＭＡ−ｇ−ＰＥＯ）−ｂ−ＰＣ５ＭＡ−チオエステル）：代表的手順では、ＰＭＡ−ｇ−ＰＥＯマクロ連鎖移動剤（１．２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、Ｃ５ＭＡ（３．８ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）、およびＡＩＢＮ（６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の混合物を１，４−ジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、３回の凍結−排気−解凍サイクルを行うことにより脱気した。この反応混合物を密閉した後、９０℃に維持した油浴中に２０時間置いた。得られた混合物を大過剰のメタノール中で濃縮し、沈殿させた。粗生成物を集めて、メタノールを使って一晩ソックスレー抽出して未反応のモノマーを除去した後、ＴＨＦで抽出し、メタノール中で沈殿させた。生成物のｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステルを集めて、真空下で乾燥した。紫外可視分光法により測定すると、チオエステルピークが３１０ｎｍの位置に現れた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：５．３３（ｄ，１Ｈ，−Ｃ＝ＣＨ−，コレステリル部分のオレフィン基），４．５（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ），３．９（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_２），３．６４（ｍ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＰＥＯの反復単位），３．４５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＯＣＨ−），３．３６（ｓ，−ＯＣＨ_３），３．２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_３Ｃ_１０Ｈ_２０ＣＨ_２−Ｓ−），２．５０−０．５５（ｍ，５６Ｈ，コレステリル部分中の−ＣＨ_３，−ＣＨ_２−，−ＣＨ−，−ＣＨ−（ＣＨ_３）−，スペ−サー中の−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−，−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，δｐｐｍ）：１７０．９（−ＣＯＯ），１４０．９（−Ｃ＝ＣＨ，コレステロール中のオレフィン基），１２１．９（−Ｃ＝ＣＨ−，コレステロール中のオレフィン基），１３３，１２６．６（ビニル基中の−ＣＨ_２，ＣＨ），７４．５（−ＣＯＯＣＨ−），７０．３および６４．８（−ＣＨ_２，ＰＥＯ中の反復単位），５１．３−１１．２（−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯＯ−、−コレステロ−ル）。ＧＰＣ（４０℃、ＴＨＦ移動相、ポリスチレン標準）：Ｍ_ｎ＝１８３２０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．１６。

【0048】

Ｐ（ＰＥＯ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−チオール（（ＰＭＡ−ｇ−ＰＥＯ）−ｂ−ＰＣ％ＭＡ−チオール；またはｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオール）：ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオールを得るために、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステルをＴＨＦ中のｎ−ブチルアミンで還元した。代表的手順では、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステル（０．３５ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）およびｎ−ブチルアミン（８０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でＴＨＦに溶解し、溶液の色が淡黄色から無色に変化するまで撹拌した。その後、余剰メタノール中でポリマーを沈殿させた。粗生成物を集めて、メタノールを使って一晩ソックスレー抽出して未反応のモノマーを除去した後、ＴＨＦで抽出し、最終的にメタノール中で沈殿させた。生成物を集めて、真空下で乾燥した。反応動力学を確立するために、ＴＨＦ中のｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステル溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を紫外可視分光装置の試料室に備えられた石英キュベット中に置いた。適切な量のＴＨＦ中ｎ−ブチルアミン溶液を加え、３１０ｎｍでの溶液の吸光度を時間の関数として測定した。構造を^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲで確認した。

【0049】

ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオールの形成をＦＴ−ＩＲで確認し、２４５０ｃｍ^−１にチオールピークが認められた。加えて、^１Ｈ ＮＭＲ分光法は、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオールのチオエステル基のプロトンに対応する３．２ｐｐｍでのピークの不存在を示し、チオエステル基がチオール基でうまく置換されたことが認められた。紫外可視スペクトルでは、元のｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステルは、チオエステル基に帰属される３１０ｎｍを中心とする強い吸収を示したが、還元後にはこのスペクトル領域における吸収を検出できない。この結果により、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオールにおけるチオール基の形成が確証された。さらに、紫外可視スペクトルは、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ−チオエステル溶液中へのｎ−ブチルアミンの注入時の３１０ｎｍでの吸収の経時的減少を測定することにより、還元ステップの動力学も提供した。吸収強度はｎ−ブチルアミン添加時に２時間以内に急速に減少して低い一定値に到達し、還元が９６％を超える効率で完結したことを示した。ブラシ状ブロックコポリマーの分子キャラクタリゼーションを表２にまとめている。

【表2】

【0050】

実施例３：Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）またはＰ（ＰＥＯＡ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−ＳＨを用いた自己集積ナノ粒子およびＤＯＸ−ＮＰの調製およびキャラクタリゼーション
Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）をベースにした自己集積ナノ粒子をナノ沈殿法により調製した。簡単に説明すると、Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）（１０ｍｇ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、続けて、２０，０００ｒｐｍでのホモジナイゼーション下で、ツイーン（登録商標）８０を含む（１％、Ｗ／Ｖ）蒸留水（１０ｍＬ）中に滴下注入した。その後、ＴＨＦを周囲温度にて窒素流下で蒸発させた。５０，０００ｒｐｍで６０分間の超遠心分離によりツイーン（登録商標）８０を除去してナノ粒子を集め、続けて、蒸留水中に分散させた。同一手順を使ってＰ（ＰＥＯＡ−ｂ−Ｃ５Ａ）−ＳＨナノ粒子を調製した。

【0051】

ピレンを疎水性プローブとして用いる蛍光技術により、臨界凝集濃度（ＣＡＣ）を測定した。アセトン中のピレン溶液（３ｘ１０^−４Ｍ）を試験チューブに加え、続けて、蒸発させて有機溶媒を除去した。その後、蒸留水（１０ｍＬ）中の種々の濃度のコポリマー溶液を試験チューブに加え、６０℃で３時間超音波処理してピレンとナノ粒子を平衡化した。試料溶液の濃度を０．００５〜０．５ｍｇ／ｍＬの範囲で変化させた。ピレンの最終濃度は６．０ｘ１０^−７Ｍであった。３３６ｎｍの励起波長で蛍光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５５Ｂ、ＵＳＡ）を使って、３５０〜４５０ｎｍの範囲でピレンの発光スペクトルを記録した。ピレン発光スペクトルの第１に高いエネルギーバンド（３７４．５ｎｍ）および第３に高いエネルギーバンド（３８６ｎｍ）の強度比の測定のために、励起および発光スペクトル用のスリット開口を２．５ｎｍに設定した。

【0052】

ＬＣＰ濃度の増加に伴い直線的な減少が観察された。このプロトコルに基づくと、Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ_１３）のＣＡＣ値はＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_３６）コポリマーの値より小さく、それぞれの値は９．４および１５．８を示し（表３）、より高いコレステロール含量を有するＰ（ＰＥＯＡＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ３６）ナノ粒子の内側コアでのより強力な疎水性相互作用を示唆した。チオール官能化コポリマーＰ（ＰＥＯＡ−ｂ−Ｃ５Ａ）−ＳＨのＣＭＣ値は１５．２であった（表３）。ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰのこれらの低いＣＡＣ値は、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰが全身性の薬物送達に望ましく、自己集積ナノ粒子としてインビボで長期間循環可能であることを示唆した。

【表3】

【0053】

実施例４：Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）またはＰ（ＰＥＯＡ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−ＳＨを有する二重装填ナノ粒子の調製およびキャラクタリゼーション
Ａｕ ＮＰ封入Ｐ（ＰＥＯＡＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）を調製するために、凝縮器を備えた５０ｍＬの丸底フラスコ中で、最初に、１０ｍＬのＤＩ水中０．０１重量％のＨＡｕＣｌ_４を激しく撹拌しながら沸騰するまで加熱した。次に、０．２ｍＬのＤＩ水中１重量％のクエン酸ナトリウムを素早く添加し、青色から暗紅色への色の変化が生じた。同一温度でさらに１０分間撹拌後、得られた溶液を、撹拌を続けながら室温まで冷却してクエン酸塩キャップされたＡｕ ＮＰを得た。Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−Ｃ５Ａ）溶液（２ｍＬのＴＨＦ中１０ｍｇ）をツイーン（登録商標）８０を含む（１％、Ｗ／Ｖ）Ａｕ ＮＰ溶液中に１５分間かけて滴下注入した。その後、溶液を室温で２時間撹拌し、クエン酸塩分子をＰＥＯのチオール基と完全に交換させた。得られた溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿したＡｕ ＮＰを取り出した。同一手順を使って二重装填Ｐ（ＰＥＯＡ−ｂ−Ｃ５ＭＡ）−ＳＨナノ粒子を調製した。

【0054】

二重封入ナノ粒子を調製するために、最初にＤＯＸ・ＨＣｌを２当量のＴＥＡを含むＤＭＦに溶解し、暗所で一晩撹拌して疎水性ＤＯＸを形成させた。真空乾燥機で有機溶媒を除去して乾燥した疎水性ＤＯＸを得た。疎水性ＤＯＸをＴＨＦに溶解し、その溶液を２０，０００ｒｐｍのホモジナイゼーション下でＡｕ ＮＰ封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ溶液中に滴下注入した。得られた溶液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、続けて０．４５μｍシリンジを通して濾過して全ての沈殿した遊離ＤＯＸを除去した。超遠心分離および凍結乾燥後に、最終生成物を得た。動的光散乱（ＤＬＳ）装置（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使って、二重封入ナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）の平均粒径および粒度分布を測定した。８０ＫＶ加速電圧のＴｅｃｎａｉ Ｂｉｏｔｗｉｎ Ｇ２透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）により二重封入ナノ粒子の形態を撮像した。フォルムバール膜をコートした銅グリッド上にナノ粒子溶液を滴下し、続けて風乾することにより試料を調製した。

【0055】

二重封入ナノ粒子中のＤＯＸの量を比色分析法により測定した。凍結乾燥した二重封入ナノ粒子（０．５ｍｇ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解して透明溶液を得た。可視・紫外分光法分光光度計により４８０ｎｍにおける吸光度を検出した。種々の濃度のＤＯＸ標準溶液を調製し、４８０ｎｍでの吸光度を測定して薬剤装填量を計算するための較正曲線を作成した。薬剤装填量（ＤＬＣ）および封入効率（ＥＥ）を次のように計算した：

【数1】

【0056】

静脈内経路を介して投与されるナノキャリアは、キャリアの安定性と組織分布を変え得る血液成分中の主要化学種である血清タンパク質との相互作用を起こす。したがって、血清タンパク質に遭遇するときにナノキャリアがその完全性を維持すれば、標的組織への効果的薬物送達が期待できる。安定性試験のために、凍結乾燥した二重封入ナノ粒子をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（１：１）中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させ、続けて、約１０分間の超音波処理および０．４５μｍシリンジフィルター膜を通して濾過を行った。４℃で貯蔵中、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使ってナノ粒子の粒径をモニターした。

【0057】

結果
特定の理論に拘泥するものではないが、ナノ粒子は、疎水性薬物のリザーバーとして機能し得る疎水性のコレステロール内側コア、およびチオール基を含む親水性のＰＥＯ殻を有するコア／殻構造を有するであろうと考えられる。溶液相中で生成されたＡｕ ＮＰは、Ａｕとチオール基との間の相互作用に起因して、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ境界面に沈着しているであろうと考えられる。ＴＥＭで確認したように、Ａｕ ＮＰはｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ中へうまく封入された（図３および４を参照）。Ａｕ ＮＰ装填ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰは、金属ナノ粒子のより高い密度が理由で、Ａｕ ＮＰを含まないナノ粒子に比べてＴＥＭ像中でより黒っぽい球状ナノ粒子として認められた。加えて、２．１ｋｅＶにピークのあるエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）スペクトルは、自己集積ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ内にＡｕの存在を示した（データは示さず）。

【0058】

さらに、ＤＯＸとコレステロール部分との疎水性相互作用により、疎水性ＤＯＸ分子はＡｕ ＮＰ封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ中へうまく封入された。２５％（ｗ／ｗ）のＤＯＸ供給比を使って、Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_３６）ナノ粒子中の２３．８％（ｗ／ｗ）の高薬物装填量（ＤＬＣ）を、９５．２％の高封入効率（ＥＥ）で達成できた。薬物装填量は、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰの分子量により影響を受けた。例えば、より少ない疎水性ブロックを有するＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_１３）は、１９．３％（ｗ／ｗ）のより低い薬物装填量およびより大きな粒径（約２００ｎｍ）をもたらした。特定の理論に拘泥するものではないが、これは、自己集積ナノ粒子における親水性セグメントと疎水性セグメントとの間のバランスの変化が原因であると思われ、これが今度は疎水性コアとＤＯＸの相互作用に影響を与えると考えられる。コレステロール側鎖の分子内相互作用および交絡特性に起因して、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ内の疎水性相互作用が安定性を高め、このことがナノ粒子の全身性の薬物送達に有益であると思われる。加えて、これらのポリマーにおける分子間および分子内の両方の疎水性相互作用が薬物封入に好ましい影響を与え、薬物装填容量および効率の改善に繋がる。また、薬物装填容量は、優れたコレステロール−ＤＯＸ適合性に起因して、コレステロール部分の存在により大きく影響を受ける。

【0059】

ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子の平均粒径は、１２８〜１７５ｎｍの範囲であり、狭い粒度分布（０．１より小さいＰＤＩ）であった（表３）。ナノスケールサイズおよび狭い単峰性ＰＤＩは、ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ集積ナノ粒子がＡｕ ＮＰおよびＤＯＸ封入用のナノキャリアとして良好な物理的特性を有することを示している。ナノ粒子の平均サイズは、より密な疎水性の内側コアの形成が原因で、コレステロール含量の増加と共に減少した。ＴＥＭ像は、ナノ粒子ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰ集積ナノ粒子が、ブランクナノ粒子では１００〜１７０ｎｍのサイズの、Ａｕ ＮＰ封入ナノ粒子ではより大きいサイズの１５０〜２００ｎｍの球形状であり（図４）、これはＤＬＳで測定したサイズよりわずかに小さかったことを示した。ＤＯＸの物理的封入はナノ粒子の粒径および多分散度を大きくし、二重封入Ｐ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_１３）、およびＰ（ＰＥＯＡ_ＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ_３６）についてそれぞれ２３０．２ｎｍ、および１８３．８ｎｍのサイズを示した。二重封入Ａｕ ＮＰ＋ＤＯＸを含むナノ粒子は、ＴＥＭ像で示されるように１８２〜２３０ｎｍのサイズの球形状であった（図４）。インビボ適用を考慮すると、粒径はナノ粒子の体内分布に影響すると思われるので重要である。直径２００ｎｍより小さいナノ粒子は、亢進した透過性および滞留性（ＥＰＲ）効果により腫瘍塊中に優先的に蓄積し留まり、一方より大きな直径を有する薬物キャリアは網内系により容易に除去される。

【0060】

二重封入ナノ粒子の物理的安定性を調査するために、ＤＬＳを使ってリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液中のナノ粒子のサイズ変化をモニターした。二重封入ナノ粒子の平均粒径は５０％ＦＢＳ中、４℃での１週間の貯蔵後で大きくは変化せず（図６Ａおよび６Ｃ）、かつ沈殿または凝集は観察されなかった。このことは、コレステロール分子間および／またはコレステロール、Ａｕ ＮＰおよびＤＯＸの間の疎水性相互作用により優れた安定性が達成されたことを示している。この知見は、二重封入ｂｒｕｓｈ−ｃｈｏｌ−ＢＣＰナノ粒子が安定であり、水性媒体中でそれらの形態および構造を保持し、かつインビボ適用に対し適切であることを示している。

【0061】

実施例５：Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）の合成および精製
スキーム３

【化9】

【0062】

ノルボルネン官能化モノマー、５−｛９−（コレステリルオキシカルボニル）−ノニルオキシカルボニル｝−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（ＮＢＣｈ９）およびメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）（Ｍ_ｎ＝２ｋｇ／ｍｏｌ）官能化ノルボルネン（ＮＢＰＥＧ）の合成は以前に報告された。全てのブロックコポリマーを、Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，４６，８２４５−８２５２）に記載の開環メタセシス重合（ＲＯＭＰ）を使用して合成した。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。ブラシ状ブロックコポリマーの分子キャラクタリゼーションを表４にまとめている。

【表4】

【0063】

この方法に従って追加のブラシ状ブロックコポリマーを調製し、結果を表４Ａにまとめている。これらのブロックコポリマーもまたナノ構造体を形成できる。

【表5】

【0064】

実施例６：自己集積ナノ粒子およびＤＯＸ−ＮＰの調製およびキャラクタリゼーション
透析法によりブランク自己集積ナノ粒子を調製した。簡単に説明すると、超音波の補助によりＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）をＤＭＦに溶解した。その後、溶液を透析バッグ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）に移し、蒸留水に対し４８時間透析した。ＤＯＸ装填Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子（ＤＯＸ−ＮＰ）を調製するために、最初にＤＯＸ・ＨＣｌを２当量のＴＥＡを含むＤＭＦに溶解し、暗所で一晩撹拌して疎水性ＤＯＸおよびＴＥＡ・ＨＣｌを形成させた。それぞれのコポリマーを加え、溶液を暗所でさらに1時間撹拌した。その後、溶液を蒸留水に対し４８時間透析してＤＯＸおよび溶媒を除去した。８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離、続いて０．４５μｍシリンジを通す濾過により沈殿したＤＯＸを除去した。凍結乾燥後に最終生成物を集めた。

【0065】

実施例４に記載のように、動的光散乱（ＤＬＳ）を使ってＤＯＸ−ＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）の平均粒径、粒度分布およびゼータ電位を測定した。実施例３に記載のように、ピレンを疎水性プローブとして用いる蛍光測定により、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）コポリマーの臨界凝集濃度（ＣＡＣ）を測定した。励起および発光スペクトル用のスリット開口を５ｎｍに設定した。実施例４に記載のように、比色分析法によりナノ粒子中のＤＯＸ装填量を測定した。

【0066】

結果
ＭＷ４００ｋＤａ（４００ｋＤａ−５０）および６００ｋＤａ（６００ｋＤａ−７５および６００ｋＤａ−１８０）の３種の両親媒性Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ブラシ状コポリマーは、コレステロール部分間の疎水性相互作用により、水溶液中で容易に自己集積してナノ粒子を形成した。自己凝集形成の閾値濃度であるＣＡＣを、ピレンの２つの蛍光発光ピークの強度比（Ｉ３７４／Ｉ３８５）により決定した。Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）濃度の増加に伴い直線的な減少が観察された。４００ｋＤａ−５０コポリマーのＣＡＣ値は、コレステロール含有６００ｋＤａコポリマーのいずれの値よりも小さく（表４）、４００ｋＤａ−５０コポリマーのより大きな安定性を示している。同じ分子量では、より高いコレステロール含量を有する６００ｋＤａコポリマー（６００ｋＤａ−１８０）が、より低いコレステロール含量を有する６００ｋＤａコポリマー（６００ｋＤａ−７５）より大きなＣＡＣ値を有し、より高いコレステロール含量を有するＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の内側コアにおけるより強い疎水性相互作用を示している。これらのＣＡＣ値は、ＰＥＧベースブロックコポリマーの典型的な範囲内にあり、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）コポリマーが自己集積ナノ粒子として長期間インビボ循環可能であることを示している。特定の理論に拘泥するものではないが、ナノ粒子は、疎水性薬物のリザーバーとして機能し得る疎水性のコレステロール内側コアを有するコア／殻構造を有するであろうと考えられる。

【0067】

透析法を使用して、疎水性ＤＯＸがＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）自己集積ナノ粒子中へうまく封入された。２５％（ｗ／ｗ）のＤＯＸ供給比では、４００ｋＤａ−５０ナノ粒子のＤＬＣは８８．４％のＥＥで約２２．１％であった。薬物装填量は、コポリマーの分子量により影響を受けた。４００ｋＤａ−５０コポリマーより高いコレステロール含量を有するにもかかわらず、６００ｋＤａ−１８０コポリマーのＤＬＣおよびＥＥ値はより低かった（表５）。これは、ナノ粒子の異なる自己集積挙動をもたらす６００ｋＤａ−１８０親水性セグメントと疎水性セグメントとの間のバランスの変化に起因すると思われる。より高いコレステロール含量を有する６００ｋＤａ−１８０コポリマーは、６００ｋＤａ−７５コポリマーよりわずかに大きなＤＬＣおよびＥＥ値を有した。

【表6】

【0068】

ブランクＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＭＰＥＧ）ナノ粒子およびＤＯＸ−ＮＰの粒径および形態を、それぞれ、ＤＬＳおよびＴＥＭにより測定した。ブランクＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の平均粒径は、１２４〜１７９ｎｍの範囲であり、狭い粒度分布（０．１より小さいＰＤＩ）であった（表５）。分子サイズが４００ｋＤａから６００ｋＤａに増加するに伴い、ナノ粒子の平均サイズは増加した。６００ｋＤａの同じＭＷでは、ナノ粒子のサイズは、より密な疎水性の内側コアの形成が原因で、コレステロール含量の増加と共に減少した。ＤＯＸの物理的封入は、ナノ粒子の粒径および多分散度を大きくした（表５）。ＴＥＭ像は、ＤＯＸ装填の有無のナノ粒子が、ブランクナノ粒子では１００〜１６０ｎｍおよびＤＯＸ−ＮＰでは１２０〜１７０ｎｍの直径を有する球形状であることを示した（図７）。ＴＥＭで測定した粒径は、ＤＬＳで測定したサイズよりわずかに小さかった。インビボ適用を考慮すると、粒径はナノ粒子の体内分布に影響するので重要であり、自己集積ナノ粒子がＥＰＲ効果により腫瘍組織に蓄積するのに理想的なサイズは２００ｎｍ未満である。したがって、ＥＰＲ効果による受動的腫瘍ターゲティングのためには、ナノスケール粒径（２００ｎｍ以下）のＤＯＸ−ＮＰが好ましい。４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０に対してそれぞれ、−１８．８、−１４．９、および−６．９ｍＶのゼータ電位値に反映されているように、コレステロール誘導体のペンダント型カルボニルヒドロキシル基のために、４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０ナノ粒子はそれらの表面で負に帯電した。標的腫瘍部位に薬物を効率的に送達するために、ナノ粒子は、単核食細胞系（ＭＰＳ）により排除されることなく、かなりの時間、血流中に残る能力を有する必要がある。この能力は、それらのサイズおよび表面特性に依存する。親水性表面を有するナノ粒子がマクロファージの捕捉から逃れられることは、負に帯電した約２００ｎｍの直径のリポソームが中性のリポソームに比べて増大した肝臓取り込み比率を示したという報告とともによく知られている。−４０ｍＶから−１５ｍＶへの負電荷の低減により、肝臓取り込み比率の大きな減少および長期の血中循環がもたらされた。したがって、親水性表面および中性表面電荷を有するＤＯＸ−ＮＰは、血漿タンパク質吸着およびＭＰＳによる排出を妨げるのに適する。

【0069】

実施例７：ナノ粒子からのＤＯＸの安定性およびインビトロ放出
凍結乾燥したＤＯＸ−ＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を血清含有リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（５０％ＦＢＳ）中に懸濁させ、続けて１０分間の超音波処理および０．４５μｍシリンジフィルター膜を通して濾過を行った。４℃で貯蔵したナノ粒子の粒径を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使って貯蔵時間中モニターした。

【0070】

ナノ粒子からのＤＯＸのインビトロ放出を透析法を用いて調査した。簡単に説明すると、凍結乾燥したＤＯＸ−ＮＰ（６ｍｇ）を３ｍＬのＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）中に懸濁し、続けて、超音波処理を１０分間行い、光学的に透明な懸濁液を得た。懸濁液を５ｍＬの透析器（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ）に導入し、１００ｒｐｍの振盪恒温水槽中で３７℃にてツイーン８０（０．１％、Ｗ／Ｖ）を含む２０ｍＬのＰＢＳ中に浸漬した。選択された時間間隔で、一定分量（１０ｍＬ）を溶解培地から取り出し、等容量の新しい培地を補った。ＤＯＸの濃度を４８０ｎｍのＵＶにより直ちに測定した。放出されたＤＯＸのパーセンテージを既知のＤＯＸ濃度の検量線に基づき計算した。

【0071】

Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子が静脈内（ｉｖ）投与を意図していることを考慮して、血清を含む培地中でのそれらの安定性を評価した。ナノ粒子のサイズ変化をモニターするＤＬＳを使ってＤＯＸ−ＮＰの安定性を調査した。ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５、および６００ｋＤａ−１８０の平均粒径は５０％ＦＢＳ中４℃での１週間の貯蔵後に大きな変化はなく（図８Ａ）、かつ沈殿または凝集は認められなかった。

【0072】

Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の薬物キャリアとしての可能性を更に評価するために、透析法を使って０．１％ツイーン８０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４、３７℃）中でＤＯＸ放出試験を実施した。Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子は初期のバースト放出を起こさずに徐放パターンでＤＯＸを放出し、第１日目の後に約２％を放出し、および１３日後に、４００ｋＤａ−５０−ＤＯＸナノ粒子では約２５％および６００ｋＤａ−１８０−ＤＯＸナノ粒子では１７％を放出した。４００ｋＤａ−５０ナノ粒子からの薬物放出は、６００ｋＤａナノ粒子からの放出よりも比較的早かった。コレステロール含量の大きな差異にも関わらず、６００ｋＤａ−７５および６００ｋＤａ−１８０からのＤＯＸ放出は類似していた。バーストのないナノ粒子の遅い放出特性は抗癌剤の送達に有用であり、その場合、ナノ粒子が腫瘍組織に達するまでは限定量の薬物が血流中に放出され、腫瘍組織において酵素の存在下でコポリマーの分解により細胞内部での薬物放出を高めることができる。

【0073】

実施例８：ＤＯＸ−ＮＰの細胞傷害性
ヒーラ細胞（７５００細胞／ウエル）を９６ウエルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、１％の抗生物質、および１％のＬ−グルタミンを補充した２００μＬのＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。インキュベーション後、サプリメントのないＤＭＥＭに溶解した種々の濃度のブランクナノ粒子（０．２〜１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＯＸ−ＮＰ、および遊離ＤＯＸ（１〜５０μｇ／ｍＬのＤＯＸ当量）を加えた。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰとのインキュベーションの２４時間後、およびブランクナノ粒子とのインキュベーションの４８時間後、マイクロプレートリーダー（Ｔｗｃａｎ ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて５４０ｎｍでの３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド染料（ＭＴＴ染料、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）の取り込みを使って細胞傷害性を測定した。

【0074】

図９Ａ〜Ｂは、異なるナノ粒子および等価ＤＯＸ濃度にてブランクＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子、遊離ＤＯＸ、およびＤＯＸ−ＮＰで処理したヒーラ細胞の生存率を示す。ブランクＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子は、１ｍｇ／ｍＬの濃度においてさえもヒーラ細胞に対し無視できる毒性を示し、処理の４８時間後の細胞生存率は９０％以上であり（図９Ａ）、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の細胞に対する低毒性および良好な適合性を明らかにした。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰは、インキュベーションの２４時間後に用量依存的（１〜５０μｇ／ｍＬのＤＯＸ）に細胞生存率を４０〜９５％減少させ（図９Ｂ）、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子がＤＯＸを放出してその目的の細胞部位に送達したことを示唆する。ＤＯＸ濃度を１μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで増やすことにより、遊離ＤＯＸは細胞生存率を急激に低下させ、一方、ＤＯＸ−ＮＰは細胞生存率を徐々に低下させた。全てのＤＯＸ濃度で、遊離ＤＯＸはＤＯＸ−ＮＰより著しく高い細胞傷害性を示した。大きな細胞傷害性を示すためには、細胞により取り込まれたＤＯＸ−ＮＰは遊離型のＤＯＸを放出する必要がある。図８Ｂに示すように、２４時間以内に３％のみのＤＯＸがナノ粒子から放出されたにすぎない。その結果、ナノ粒子から放出されたＤＯＸの濃度は、特定のインキュベーション時間後の遊離ＤＯＸの濃度よりも遙かに低かった。したがって、遊離ＤＯＸとＤＯＸ−ＮＰとの間の細胞傷害性の差異は、おそらく遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの取り込み経路の差異、ならびにＤＯＸ−ＮＰの徐放特性に起因するものであろう。類似のＤＯＸ量では、ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０の細胞傷害性はＤＯＸ装填６００ｋＤａ−７５よりも著しくより高く、１０μｇ／ｍＬのＤＯＸ量で、ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０では４０％、およびＤＯＸ装填６００ｋＤａ−７５では７０％の生存率値を示した。ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０およびＤＯＸ装填６００ｋＤａ−１８０の細胞傷害性は、２５μｇ／ｍＬのＤＯＸの場合を除いて、大きな差異はなかった。

【0075】

同様に、図９Ｃは、遊離ＤＯＸ、ＤＯＸ装填Ｐ（ＰＥＯＡＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ）ＮＰ、およびＡｕとＤＯＸ装填Ｐ（ＰＥＯＡＳＨ−ｂ−ＰＣ５Ａ）ＮＰで処理したヒーラ細胞の生存率を示す。

【0076】

実施例９：ＤＯＸ−ＮＰの細胞内取り込み
細胞取り込みを観察するために、１．０ｘ１０^５細胞／ウエルの密度で、Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライドの８ウエルチャンバー中にヒーラ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間プレインキュベートした。等価用量（２５μｇ／ｍＬ）で遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを含む無血清ＤＭＥＭを各ウエルに加え、続いて、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで濯ぎ、１０μＭのＤｒａｑ５で染色し、４％のホルムアルデヒド溶液で１０分間固定した。次に、カバーガラスをスライドガラス上に置いた。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの細胞取り込みを、ＤＯＸに対しては４８８ｎｍおよびＤｒａｑ５に対しては６３３ｎｍでの励起波長を使って共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｅｎｇｌａｎｄ）により撮像した。

【0077】

細胞取り込みを定量化するために、０．５ｍＬ中でヒーラ細胞（５ｘ１０^５細胞／ウエル）を２４ウエルプレートで、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、２４時間増殖させた。等価用量（２５μｇ／ｍＬ）で遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを含む無血清ＤＭＥＭを各ウエルに加え、その後、２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理により採取し、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）チューブ中に移した。全ての試料をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により分析し、細胞内部移行を測定した。細胞内ＤＯＸの蛍光測定値をＦＬ２チャネルで行った。

【0078】

共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて、ヒーラ細胞におけるＤＯＸ−ＮＰの細胞取り込み挙動を、遊離ＤＯＸの場合と比較して調査した。ＤＯＸそれ自体が蛍光性であるので、ナノ粒子中に追加のマーカーを加えることなく、それを直接に細胞取り込みの調査に使用した。細胞核をＤｒａｑ５で染色し、共焦点ソフトウェアで青色に変更した。２時間のインキュベーション後、遊離ＤＯＸ（２５μｇ／ｍＬ）−処理細胞は、細胞核中で強い赤色を呈し、遊離ＤＯＸが素早く細胞質に運ばれ細胞核に拡散したことを示している（結果は図示せず）。ＤＯＸ−ＮＰとインキュベートした細胞におけるＤＯＸの細胞内分布は、大きく異なっていた。インキュベーションの２時間後、強いＤＯＸ蛍光が細胞核中ではなく細胞質中で観察され、ＤＯＸ−ＮＰがヒーラ細胞により効果的に内部移行され得たことを意味する。遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの細胞取り込みを比較するために、フローサイトメトリー分析を行った。蛍光強度は細胞により内部移行されたＤＯＸの量に比例するので、平均蛍光強度を使って細胞取り込みの定量的比較を行った。ＤＯＸ装填４００ｋＤａ−５０、６００ｋＤａ−７５および６００ｋＤａ−１８０で処理した細胞の蛍光強度の差異は無視できたが、遊離ＤＯＸで処理した細胞は、同じ当量ＤＯＸ濃度およびインキュベーション時間にてＤＯＸ−ＮＰで処理したものより大きな蛍光強度を示した。細胞膜が１ｋＤａより大きい分子量の複合体に対して本来不透過性であることは、以前に報告されている。ＤＯＸの分子量は５４３．５２Ｄａであるが、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＭＰＥＧ）ナノ粒子の分子量は４００ｋＤａを超える。したがって、遊離ＤＯＸ分子の急速細胞取り込みは細胞膜を介する小分子の急速な拡散によるものであったが、一方、ナノ粒子の細胞取り込みはエンドサイトーシス経路によるものと思われ、それらは細胞核に侵入できない。その急速な細胞取り込みに起因して、癌治療での遊離ＤＯＸの使用は、遊離ＤＯＸが身体を通って健康組織および患部組織の両方へ急速に拡散できるので、重篤な毒性を引き起こす場合がある。理想的なサイズを有するナノ粒子がＥＰＲ効果により腫瘍微小環境内に蓄積されることはよく知られている。しかし、抗癌剤がそれらの生物学的機能を腫瘍細胞内部で発揮するためには細胞内部移行が必要であるために、腫瘍組織内への蓄積が必ずしも治療結果と相関するとは限らない。この結果は、薬学的に活性な分子を装填したＮＰの効果的な細胞取り込みにより、それらの薬学的に活性な分子の癌に対する治療効果を改善できることを示唆している。

【0079】

実施例１０：ＤＯＸ−ＮＰのインビボ循環時間および組織分布
循環時間のインビボ測定のために、自家育成した６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをランダムに各群５匹のマウスの２つの群に分割し、遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰを５ｍｇ／ｋｇの等価ＤＯＸの単回投与で静脈内に注射した。注射後の５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間で、血液（１５０μＬ）を２つの時点について顔面静脈からヘパリン処置チューブ中に採血し、その後、次の時点の心臓穿刺による採血のためにマウスを屠殺した。各群のマウスを、３つの時点で採血した。血漿を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により分離し、分析するまで−８０℃で貯蔵した。

【0080】

組織分布調査のために、担腫瘍重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）の６〜８週齢マウスの右脇腹に、２ｘ１０^６個のヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を含む０．１ｍＬのＰＢＳを接種した。腫瘍注入の４週後、２．５ｍｇ／ｋｇの等価ＤＯＸで遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰ（１００μＬ）を尾静脈中に注射した。注射の２４時間後、血液ならびに腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、および心臓を含む器官採取のためにマウスを屠殺した。その後、組織を秤量し、溶解緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００）中でプローブ超音波処理器（Ｑｓｏｎｉｃａ ＬＬＣ，ＣＴ）を使ってホモジナイズした。各組織のライセートを１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。血液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。

【0081】

いくつかの変更を加え報告された手順を使って試料抽出を行った。簡単に説明すると、血漿（５０μＬ）または組織（１００μＬ）に内部標準（ＩＳ）として１００μＬのイダルビシン（１μｇ／ｍＬ）を加えた。１００μＬの１．０Ｍトリス緩衝液を加えた後で、２．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（７５：２５、ｖ／ｖ）混合物を加え５分間ボルテックスすることによりＤＯＸおよびＩＳの抽出を２回行った。８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、有機相中の試料を集め、周囲温度、窒素流下で蒸発乾固させた。血漿および組織からの乾燥残留物を１００μＬのメタノール中に溶解し、続けて、遠心分離して全ての沈殿物を除去した。得られた上清をオートサンプラーおよび蛍光検出器を備えたＨＰＬＣ装置（島津製作所、京都、日本）を使って分析した。０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）およびアセトニトリル（７３．５：２６．５）を移動相として使用して、２０μＬの試料をＣ_１８カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ、１５０ｘ４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）に注入した。流量を１ｍｌ／分とし、４８０／５５８ｎｍの励起および放出波長（Ｅｘ／Ｅｍ）での蛍光検出により信号をモニターした。

【0082】

図１１Ａは、５ｍｇ／ｋｇ用量での遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰのｉｖ注射後のＤＯＸの血漿中濃度−時間プロファイルを示す。遊離ＤＯＸの血漿中濃度は、注射後５分で７５．６±５μｇ／ｍＬであったが、注射後１時間で５．３±０．３μｇ／ｍＬへと急激に減少し、注射４時間で１．４±０．１μｇ／ｍＬまで減少し、遊離ＤＯＸの循環からの急速な排出を示す。対照的に、ＤＯＸ−ＮＰは著しく遅れた血液排出を示し、注射後５分で８８．０±５．２μｇ／ｍＬ、注射後１時間で６８．８±７．３μｇ／ｍＬおよび注射後４時間で４５．４±７．１μｇ／ｍＬのＤＯＸの血漿中濃度を示した。特に、ＤＯＸ−ＮＰの投与の２４時間後、ＤＯＸ血漿中濃度はまだ１２．６±１．９μｇ／ｍＬであり、一方、遊離ＤＯＸの場合この時点ではほとんど検出限界以下であった。遊離ＤＯＸの急速排出の結果として、血清中で見出される薬物は、ナノ粒子中に封入されていると考えられる。このような循環時間の増加は、ＤＯＸ分子がＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子のコア内で安定化されており、それらの腎臓排出および肝臓内での酵素による代謝を防ぐことができることによると思われる。それらのナノサイズおよび親水性ＰＥＧ殻により誘導されたＰ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子のこのような挙動により、単核食細胞系（ＭＰＳ）取り込み比率を減らし、かつ血漿タンパク質吸収を減らすことができる。腫瘍組織への受動的薬物ターゲティングの成功は、ＥＰＲ効果を活用するためのナノ粒子の血流内の長い循環時間、およびナノ粒子コア中の薬物封入の安定性に基づく。したがって、安定性および長い循環時間を有する、薬学的に活性な分子を装填したＮＰは、優先的に腫瘍組織に蓄積する可能性がある。

【0083】

図１１Ｂからわかるように、遊離ＤＯＸの投与後のＤＯＸの濃度は、肝臓で最大であり腫瘍で最小であった。対照的に、ＤＯＸ−ＮＰの投与後のＤＯＸの濃度は血液中で最大であり、腫瘍中濃度は遊離ＤＯＸの投与後に観察されるより顕著に大きかった。この結果から、遊離ＤＯＸは体内で広範にわたって分布するが、肝臓、脾臓、肺、および腎臓などの宿主の防御および代謝器官に主として捕捉され、これらの器官により代謝または急速に排泄されて腫瘍中での低い薬物濃度をもたらすことが示唆された。特に、遊離ＤＯＸの投与に比べてＤＯＸ−ＮＰの投与の２４時間後に、ＤＯＸの肝臓での６．５倍低い濃度および腫瘍中の２．３倍高い濃度が達成された。ＤＯＸ−ＮＰ投与後のＤＯＸの血漿中レベルは、遊離ＤＯＸの同用量投与後の場合より１１倍大きかった。血漿中のこの高い薬物濃度は、ナノ粒子の血液循環時間の増加に伴うＤＯＸ−ＮＰの腫瘍組織中でのさらなる蓄積に寄与するであろう。さらに、ＤＯＸ−ＮＰは心臓中の薬物濃度を遊離薬物に比べて３．９倍低減させた。したがって、心筋症が遊離ＤＯＸの用量制限副作用であるので、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子はＤＯＸの心臓毒性を大きく低減できる。一方で、ナノ粒子は肺中のＤＯＸ量も遊離ＤＯＸに比べて１０倍低減させ、このことは肺に対する損傷を抑え、そのバイオセーフティを高める可能性がある。この結果は、ＰＥＧ遮蔽効果および優れた安定性を有するＤＯＸ−ＮＰが、遊離薬物に比べてより長い血液循環、ＭＰＳによるより少ない取り込みおよびより高い腫瘍蓄積を示すことを確証した。

【0084】

実施例１１：Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子のインビボイメージング
Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）自己集積ナノ粒子の体内分布を、インビボ近赤外線（ＮＩＲ）イメージングにより評価した。ＮＩＲフルオロフォアであるＤｉＲを、セクション２．５に記載のように透析法によりナノ粒子中に装填した。簡単に説明すると、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）（１０ｍｇ）およびＤｉＲ（０．６ｍｇ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を蒸留水に対し４８時間透析し、０．４５μｍ膜を通して濾過した後、凍結乾燥した。ＤｉＲの装填量は、７５０ｎｍの波長での分光測定により決定した。

【0085】

雄ＳＣＩＤマウスの側腹部へのＡ５４９細胞（１００μＬのＰＢＳ中の２ｘ１０^６細胞）の皮下注射により、腫瘍モデルを確立した。腫瘍が許容可能なサイズに達すると、マウスを尾静脈注射によりＤｉＲ装填自己集積ナノ粒子（５μｇ／ｋｇの等価ＤｉＲ）で治療した。Ｍａｅｓｔｒｏインビボイメージングシステム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使って、注射の１、５、および２４時間後に全身像を得た。注射の２４時間後のマウスの屠殺後に、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、肺、および腫瘍を含む種々の器官の画像も取得した。

【0086】

注射後１時間で、動物全体の蛍光が検出可能であり、強い蛍光信号が肝臓で可視化され、ナノ粒子が主として肝臓中に蓄積したことを示す（図１２Ａ）。注射後５時間に強い全身の蛍光が連続的に観察され、ＤｉＲ装填Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の長い循環時間を示している。さらに、動物の周辺組織と比べて腫瘍中のＤｉＲ信号のコントラストは、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の注射後５時間ですでに明らかであった。２４時間後、腫瘍組織中で強い赤色信号が観察され、肝臓中では弱い信号のみが観察された。注射後２４時間で、マウスを屠殺し主要器官を分離してＤｉＲ装填ナノ粒子の組織分布を分析した。図１２Ｂに示すように、最高のＮＩＲＦ強度は腫瘍組織中で観察され、一方で、その他の組織では信号強度はより低く、心臓での蛍光信号は特に低かった。結果は、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子の腫瘍組織中での効果的な蓄積を示した。特定の理論に拘泥するものではないが、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子のこの顕著な腫瘍特異的送達は、ナノ粒子の安定性により実現された長期の循環時間およびそれらの小さいサイズによる腫瘍組織中でのＥＰＲ効果から得られたものであろう。

【0087】

実施例１２：抗腫瘍活性の評価
ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰの抗腫瘍効力を、２ｘ１０^６個のＡ５４９細胞を含む０．１ｍＬのＰＢＳを右脇腹皮下に接種したＳＣＩＤマウスで評価した。腫瘍が約２０〜３０ｍｍ^３に成長したとき（腫瘍注入の９日後）、マウスをランダムに３つの群（ｎ＝５〜６）に分割し、この日を０日目とした。マウスに尾部静脈経由で週２回、食塩水（対照）、２．５ｍｇ／ｋｇの等価ＤＯＸでの遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰ（１００μＬ）を静脈内注射した。抗腫瘍活性を腫瘍体積にの観点から評価し、腫瘍体積は、次の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝幅^２ｘ長さ／２。同時に、全身性の毒性の指標として体重を測定した。

【0088】

図１３は、２．５ｍｇ／ｋｇのＤＯＸにて遊離ＤＯＸおよびＤＯＸ−ＮＰで治療したマウスの腫瘍体積、体重、および生存率の変化を示す。対照群（食塩水）およびＤＯＸ−ＮＰで治療した群での腫瘍体積は、２４日以内に、それぞれ、約２３０．７±９８．２ｍｍ^３および１７６．６±４４．０ｍｍ^３までゆっくり増加した（図１３Ａ）。腫瘍成長は遊離ＤＯＸ治療により抑制されたが、この動物群の体重は、対照群およびＤＯＸ−ＮＰ治療群に比べて急激に低下し（図１３Ｃ）、所定の用量の遊離ＤＯＸにより重篤な毒性が誘発されたことを示している。最終的に、遊離ＤＯＸ群の全ての動物は人道的理由から１１日目に終了しなければならなかった。２４日後、対照群の腫瘍体積が急速に増加し、５２日目に８８３．４±１６５．７ｍｍ^３に達した。対照的に、ＤＯＸ−ＮＰで治療した群の腫瘍体積はわずかに増加して２２４．８±８４．７ｍｍ^３になり、注射の３８日後には縮小し始め、５２日目には１３０±１０２．０ｍｍ^３まで縮小し、治療群が対照群より有意に低い平均腫瘍体積（ｐ、＜０．０１）を有したことを示した。加えて、初期の腫瘍体積（約３０ｍｍ^３）に比べて、ＤＯＸ−ＮＰ治療マウスでは、腫瘍体積はほとんど増加しなかった。この結果は、ＤＯＸ−ＮＰが効果的に腫瘍成長を抑制したことを示す。治療の５２日後、全てのマウスを屠殺し腫瘍を摘出した。図１３Ｂは、実験の終了時点での各群の代表的な写真を示す。対照群の腫瘍サイズは治療群のサイズより大きく、この結果は相対的腫瘍体積測定の結果と一致した。高められたインビボ効力は腫瘍部位でのＤＯＸ−ＮＰの蓄積の向上により説明でき、それはコア内でのＤＯＸのそれらの効果的な維持、したがって長期の血液循環中に血流中でのそれらの漏出を防止することによると考えられる。加えて、一旦ＤＯＸ−ＮＰが腫瘍組織に蓄積されると、ナノ粒子からのＤＯＸの徐放により腫瘍細胞へのＤＯＸの暴露時間が増加し、腫瘍成長の抑制が起こる。

【0089】

体重変化は、担腫瘍動物における薬物関連毒性の重要な指標である。図１３Ｃ〜Ｄに示すように、担腫瘍ＳＣＩＤマウスの２．５ｍｇ／ｋｇでの遊離ＤＯＸによる治療は、体重の急速な低下（２８．１±１．２％）および３回目の注射後１１日以内に全てのマウスの死亡を生じ、遊離薬物が担腫瘍ＳＣＩＤマウス中で有毒であったことを実証した。ＤＯＸ−ＮＰによる治療は耐容性良好であるように見え、対照群に比べて体重の減少はほとんどなく、かつ生存率の変化もなかった。これらの結果は、Ｐ（ＮＢＣｈ９−ｂ−ＮＢＰＥＧ）ナノ粒子に組み込まれた場合のＤＯＸの向上した抗腫瘍活性および大きく低減された毒性を実証した。

【0090】

本文で記述された実施例および実施形態が説明の目的のみのものであり、それらを考慮すれば種々の修正または変更が当業者に対して示唆され、また、それらの修正または変更は、本出願の趣旨および範囲内に、ならびに添付請求項の範囲内に包含されるべきであることは、理解されよう。本明細書に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は本出願において参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】