特許 6626448 核酸含有混合物のデコンボリューション法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6626448

(24)【登録日】2019年12月6日

(45)【発行日】2019年12月25日

(54)【発明の名称】核酸含有混合物のデコンボリューション法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20191216BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6869 ZZNA

【請求項の数】13

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2016-546428(P2016-546428)

(86)(22)【出願日】2015年1月12日

(65)【公表番号】特表2017-505611(P2017-505611A)

(43)【公表日】2017年2月23日

(86)【国際出願番号】EP2015050414

(87)【国際公開番号】WO2015104411

(87)【国際公開日】20150716

【審査請求日】2017年10月24日

(31)【優先権主張番号】102014200446.2

(32)【優先日】2014年1月13日

(33)【優先権主張国】DE

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】519065008

【氏名又は名称】ディーエヌエー バインド ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン イーシン

(72)【発明者】

【氏名】ヘルマン ヤナ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーデュヴィルト ローベルト

(72)【発明者】

【氏名】ボーデン アネット

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４２２５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１４０７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０３７７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１８８４７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／００７９５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Krishnan A et al，Barcodes for DNA sequencing with guaranteed error correction capability，Electronics Letters，２０１１年 ２月１７日，Vol. 47, No. 4

【文献】 Faircloth B et al，Large sets of edit-metric sequence identification tags to facilitate large-scale multiplexing of reads from massively parallel sequencing，Nature Precedings，２０１１年，p. 1-15，［インターネット］，ＵＲＬ，http://hdl.handle.net/10101/npre.2011.5672.1

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を含む混合物のデコンボリューションのための方法であって、
ａ）最初のステップにおいて、互いに異なる、Ｎ_０〜Ｎ_ｎ配列位置を有する、複数の標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）が、所定アルゴリズムに従って複数のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）から生成されるものであって、先ず、形成されるＴＮＳの全長が前記配列位置の仕様によって確立され、次いで演算ｚ、ａ、ｄまたはｅが、各配列位置Ｎ_０〜Ｎ_１３に対して規定され、演算ｚが規定された第１配列位置Ｎ_０において、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）に対する制限は規定されず、形成されるＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の各配列位置Ｎ_０＋１〜Ｎ_ｎにおいて、先行する配列位置のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）に関する制限が、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）について規定され、
ｂ）次に、少なくとも１つの前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）が、それぞれ少なくとも１つの物質または物質組合せに割り当てられると共に、後者と化学的に結合し、
ｃ）さらに、分析される少なくとも１つの混合物が、その中に含有された少なくとも２つの異なるＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）またはＴＮＳ結合物質と共に調整され、前記少なくとも１つの混合物は、配列決定法に従って配列決定され、前記混合物中に含有される前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の全てが、共通の配列スペクトルにおいて同時に検出され、
ｄ）これと同時又は略同時に、前記配列スペクトルにおいて重ね合わされた前記配列は、前記所定アルゴリズムに従って前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎをスキャンすることによってデコンボリュートされ、かつそれらの割当てに従って物質又は物質組合せとして同定され、前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎでのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度は、前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎでのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の頻度に相当するものであり、前記ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度は、前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにて、少なくとも５％増大した場合に有意であると判断され、個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の前記シグナル強度が有意に増大した配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎが、所定アルゴリズムに従ってスキャンされ、
形成されるＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎでのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）についてのヌクレオチド占有が、前記所定アルゴリズムに従って確立され、かつ少なくとも１つの更なる配列位置のヌクレオチド占有に関連がある条件によって規定される方法。

【請求項2】

前記配列スペクトルにおいて個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度が有意に増大した配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎが、前記所定アルゴリズムに従ってスキャンされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記配列スペクトルにおける個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の有意に増大したシグナル強度を、多くとも１つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の全配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにおいて検出可能最小強度に到達するまで段階的に減少させ、それによって得られた前記減算スペクトルは、それぞれ少なくとも配列部分または配列フラグメントを有し、前記所定アルゴリズムに従って前記配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにおいてスキャンされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）は、少なくとも２つの配列位置において、および／または少なくとも５つの配列位置からなる少なくとも１つのヌクレオチド配列によって、互いに異なることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）は、全長が少なくとも５つの配列位置で形成されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

配列差異が少なくとも５０％であるＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）が、互いに最も大きな構造的および／または機能的差異を有する物質にそれぞれ割り当てられることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

物質グループ、物質サイズ、曝露位置または日付のジオ座標をコード化する少なくとも１つの配列部分を有するＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）が形成されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）は、少なくとも１つの配列部分を有し、これによってＴＮＳとして同定されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）は、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）および／またはＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の配列部分は、互いに組み合わされることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）は、前記割り当てられた物質と共有結合することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の少なくとも１つおよび／または少なくとも１つのＴＮＳ結合物質の選択のための少なくとも１つの方法工程を実施し、分析される混合物が、液体移動相、および／または静止相の液体溶出によって提供されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記分析される混合物は、蛍光標識化ジデオキシヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つのＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の配列部分と相補的である少なくとも１つのプライマーを用いて配列決定されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、合成的に生成した標的ヌクレオチド配列を用いた、核酸を含む混合物のデコンボリューション法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸は、自然界で遺伝情報をコードするのに役立っている。したがって、ヌクレオチド配列（これから核酸が形成される）を検出かつ解釈する方法が、多くの研究分野にとって重要である。マクサム・ギルバート法、またはサンガー法によって、核酸の配列決定のための先駆的な基本原理が与えられ得る。短いヌクレオチド配列の合成（オリゴヌクレオチド合成）法、例えば亜リン酸トリエステル法もまた既に確立されており、技術水準の一部となっている。これらを活用し、ヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列を情報キャリアとして使用可能にする更なる方法が開発されてきた。情報を保存するためにＤＮＡ分子を用いる技術は、ＤＮＡバーコーディングと呼ばれる。当該技術では、短いＤＮＡ配列（いわゆるＤＮＡバーコード）を合成して、それを公知の（通常、より大きな）ヌクレオチド配列もしくは物質に割り当てること、またはそれを表すヌクレオチド配列もしくは物質にそれを結合させることを目的とする。ヌクレオチド配列、またはこのように調製された物質の同定は、各ＤＮＡバーコードを用いて単純な方法で可能であり、その短い配列は、短い時間で配列決定され得、かつ／または対応する方法（ＰＣＲ）で増幅され得、そして結果的に濃縮され得る。ヌクレオチド配列の増幅能力により、核酸カウントに基づく方法が、分析化学および生化学の分野において、最も感度がよい検出法となっている。

【0003】

更なる用途として、化学的研究、生物学的研究、および医学的研究の分野がある。その主たる目的は、タンパク質に対する特異的な結合親和性を有する分子構造の発見にある。この目的のために、ＤＮＡコード化された化学分子ライブラリが、医薬的に関連するタンパク質についてのリガンドを追跡する有効なツールとして役立つ。ゆえに、ＤＮＡコード化分子は、例えば親和性ベースの選択によって濃縮されてから、その明解なＤＮＡコーディング（ＤＮＡバーコード）に基づいてデコードされ得る。通常、ＤＮＡコード化混合物は、そのような選択実験（スクリーニング）で得られる。そのような混合物は通常、多数のＤＮＡコード化物質を含む。

【0004】

かかる事情にもかかわらず、単離工程または精製工程が、選択実験由来の混合物分析にかかるコストの理由から、大幅に省かれる。このため、検出されるデータは、便宜上、濃縮物質のＤＮＡバーコードが、そのような混合物中に高い可能性で存在し、その結果、高い可能性で配列されているという仮定に基づいて取り扱われる。しかしながら、この相関関係が、必ずしも当てはまるというわけではない。即ち、例えば、（サンガー配列決定用に調製される際の）細菌中の様々なプラスミドの形質転換による、またはマイクロ／ナノ構造上でのアニーリングプロセスおよび増幅プロセス（ディープシークエンシング法）といった、様々な因子によって損なわれる虞がある。このため、一応は同定された物質に対し、混合物中で濃縮された物質と実際に関わっているかどうかを確認する処理が必要となり、さらに時間のかかる工程が必要となってしまう。

【0005】

標準的な配列決定法（マクサムおよびギルバート、またはサンガーに従うジデオキシ法）の低い並列化能力（ｐａｒａｌｌｅｌｉｓａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）に関して、特に、求められる核酸、またはヌクレオチド配列の濃縮が十分でない混合物の場合、複雑なサンプル調製が不可欠となる。さらに、新世代の配列決定法、例えばパイロシークエンシング法もまた、実際の配列決定が開始され得る前に、サンプル混合物の単離および精製処理を必要とする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、本発明は、核酸を含む混合物における個々のヌクレオチド配列を、短時間で経済的に同定できる方法を提案することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

この目的は、請求項１に従う方法によって達成される。有利な実施形態、および本発明に従う方法の開発は、下位請求項に記載される特徴により達成され得る。

【0008】

本発明により、核酸を含む混合物のデコンボリューション法が、上記目的を達成するために提案される。その場合、第１の工程において、互いに異なる、Ｎ_０〜Ｎ_ｎ配列位置を有する、複数の標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）が、所定アルゴリズムに従って、複数のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）から生成される。更なる工程において、生成されたＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の少なくとも１つが、それぞれ少なくとも１つの物質または１つの物質の組合せに割り当てられると共に、後者と化学的に結合する。さらに、本発明の方法によれば、分析される少なくとも１つの混合物が、その中に含有された少なくとも２つの異なる物質ＴＮＳおよび／またはＴＮＳ結合物質と共に調製され、当該少なくとも１つの混合物は、配列決定法に従って配列決定され、当該混合物中に含有される全ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）または更なる核酸もしくはヌクレオチド配列は、共通の配列スペクトルにおいて同時に検出される。デコンボリューションを促進し、よって濃縮ＴＮＳを同定するために、混合物の配列スペクトルは、選択実験の前後に互いから回収される／減じられるべきである。

【0009】

同時に、または続いて、配列スペクトルにおいて重ね合わされた（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ）配列は、所定アルゴリズムに従って配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎをスキャンすることによってデコンボリュートされ、かつそれらの割当てに従って、物質または物質組合せとして同定される。例えば、当該処理は、配列スペクトルにおいて個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度が有意に増大した配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎが、所定アルゴリズムに従ってスキャンされるように、実行される。

【0010】

配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎでのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度は、観察配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎでのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の頻度に相当する。シグナルは、好ましくは、例えば外部から励起される蛍光または化学ルミネセンスといった光シグナルに関するものであるとよい。したがって、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）を検出するための検出限界は、バックグラウンドノイズや、利用される方法および／もしくは検出器の感度に依存する。

【0011】

ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）のシグナル強度は、配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにて、少なくとも１つのヌクレオチドに対して、好ましくは２つのヌクレオチドに対して、特に好ましくは３つのヌクレオチドに対して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも３０％増大した場合に、有意であると判断することができる。また、配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにて、２つまたは３つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）が存在する場合に、有意に増大したシグナル強度が存在し得る。

【0012】

配列決定中に吸収される配列スペクトルは、同定されるＴＮＳの少なくともＮ_０〜Ｎ_ｎ配列位置を示すはずである。このことは、個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の相対頻度が、配列スペクトルにおける各配列位置にて実証され得るならば、特に有利である。そのような頻度分布は、各配列位置における個々のヌクレオチドのシグナル強度を比較することで判定できる。頻度の判定はまた、配列決定工程がもたらされる前に、既知の濃度において分析される混合物に供給される少なくとも１つの標準ＴＮＳによってもたらされてもよい。

【0013】

ゆえに、配列スペクトルのデコンボリューヂョンを追加的にまたは代替的に実行し、それによって、配列スペクトルにおける個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の有意に増大したシグナル強度を、多くとも１つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）の全配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにおいて最も小さな（読取り可能な）シグナル強度に到達するまで、段階的に減少させる。これにより、それぞれ少なくとも１つの配列または少なくとも配列部分を有する減算スペクトルを取得することができ、所定アルゴリズムに従って配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにおいてスキャンされる。

【0014】

本発明の方法による本質的な利点は、所定アルゴリズムの使用することにより、高度に分化した多数のＴＮＳが生成され得ることにある。高度な分化は、特に、感度の増大により結果的にもたらされ得る、個々のＴＮＳの同定に有益な効果を及ぼす。ゆえに、ＴＮＳの、または可能性のあるＴＮＳ候補の同一性は、実際、規定可能なアルゴリズムに従ってスキャンされるヌクレオチド配列のうちの少数の配列位置によって判定することができる。このように、個々の配列または配列フラグメントが複数回重ね合わされる配列スペクトルですら、デコンボリュートされ得、そこでは、好ましくは配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎが、所定アルゴリズムに従って、公知の配列差異によりスキャンされ得る。したがって、核酸を含む混合物のデコンボリューションは、増幅工程も単離工程も要することなく、同定される一ＴＮＳに対して効果をもたらす。

【0015】

通常、デコード化は、ＤＮＡアレイおよび高スループットシークエンシング／ディープシークエンシング／次世代シークエンシングによって実施される選択実験を実行した後にもたらされる。これは高価であり、かつ複雑である。しかし、選択実験を実行した後に本発明の方法を用いれば、核酸、例えばＤＮＡ混合物を含む混合物を、迅速、経済的、かつ簡単に、例えばサンガー配列決定によって、デコンボリュートすることができる。

【0016】

濃縮（類似の）ＴＮＳの同定は、実際のところ、個々のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）についてシグナル強度が有意に増大している配列スペクトルの配列位置を単にスキャンするだけで十分である。確定されたＴＮＳはその後、それらにそれぞれ割り当てられた物質の存在証明に役立つ。なお、物質、好ましくは分子、分子構成成分、そして特にその機能的および／または構造的グループといった文言によって、これらは理解されるはずである。物質という文言の場合、用途のタイプに応じて、カーボンブラック、タバコの煙、スモッグ、油フューム、排気管ダスト、セメントダスト、金属、金属酸化物、プラスチック材料、花粉、細菌、またはウィルス粒子といった物質を意味する。

【0017】

形成されるＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎにおけるヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）についてのヌクレオチド占有は、所定アルゴリズムによって確立することができる。この目的のために、少なくとも１つの更なる配列位置のヌクレオチド占有に関連がある各配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎについて、条件を定めてもよい。ゆえに、該アルゴリズムに従うＴＮＳの形成において、そのプロセスは、例えば、形成されるＴＮＳの各配列位置Ｎ_０＋１〜Ｎ_ｎについて、先行する配列位置のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）に関する制限が、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ／Ｕ）に対して規定されるように実行されてもよい。

【0018】

ＴＮＳの好適かつ単純な同定においては、形成されたＴＮＳが、少なくとも２つの配列位置において、および／または少なくとも５つの配列位置からなる少なくとも１つのヌクレオチド配列によって、互いに異なる場合に有利である。適切には、配列差異が少なくとも７５％、好ましくは８０％を超える、特に好ましくは９０％を超えるＴＮＳが、互いに最も大きな構造的および／または機能的差異を有する物質にそれぞれ割り当てられる。

【0019】

好ましくは、個々の物質をそれぞれ表すＴＮＳは、それぞれ同じ長さである。すなわち、それぞれ配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎの数が同じである。ゆえに、同定は、デコンボリューションを、所定の配列長に制限することによって、容易に単純化できる。また、これにより、重ね合わされたＴＮＳの各配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎを直接対比することが可能になる。本記載において、全ＴＮＳが共通の配列部分を有するならば、さらに有利であり、それに基づいて、それらはそのようなものとして同定することができる。この配列部分は、好ましくは、ＴＮＳの開始領域または端部領域において生じるはずである。

【0020】

さらに、形成されたＴＮＳは、物質グループ、物質サイズ、曝露位置または日付のジオ座標（ｇｅｏｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）をコードする少なくとも１つの配列部分を有してよい。また、物質の性質は、ＴＮＳの全長を介して、すなわち配列位置の数を介して、コード化されてもよい。また、物質の性質は、様々なプライマー結合部位の形態でコード化されてもよい。例えば、ＴＮＳは、ジオ座標をコードしてよい。物質グループは、配列決定中にプライマー結合部位として作用する更なる配列部分でコード化されてもよい。それゆえに、配列決定反応中に様々なプライマーを用いることで、各ＴＮＳの配列、そしてジオ座標を判定することができる。配列決定中に用いられる各プライマーによって、その際にどの基質グループが観察／考慮されているのかが分かる。プライマー結合部位の配列の生成中は、前記したアルゴリズムは用いられない。その代わり、この配列は、首尾良いプライマー結合／配列決定を可能にするパラメータを参照しながら設計される。例えば、Ｇ／Ｃ含量、プライマー長、およびプライマー融解温度であり得る。

【0021】

組み合わされた物質、特に選択実験または親和性実験の結果として互いに組み合わされた物質は、それに応じて組み合わされたＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）と化学的に結合し得る。適切には、ＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）および／またはＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）の配列部分を互いに組み合わすことができる。

【0022】

起こり得る配列組合せは多岐にわたるため、ＴＮＳの形成は、所定アルゴリズムに従ってコンピュータによって（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）シミュレートされてもよい。形成されたＴＮＳは、それによって、既知のヌクレオチド配列との起こり得る不一致（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ）に関しても調査されてよい。ＴＮＳの化学的合成はその後、好ましくは亜リン酸トリエステル法に従ってもたらされてよい。

【0023】

起こり得る配列組合せの数は、利用可能な配列位置の数に依存するので、長さが十分であるＴＮＳ、すなわち十分な数の配列位置Ｎ_０〜Ｎ_ｎが形成されるべきである。したがって、全長が５つの配列位置を超えるＴＮＳが、形成または合成される。

【0024】

ＴＮＳは、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であってよく、二本鎖ＤＮＡ分子が好ましい。ＴＮＳの、それを表す物質への化学的結合は、好ましくは、共有結合によってもたらされてよい。

【0025】

本発明の方法では、少なくとも１つのＴＮＳ（Ａ_１〜Ａ_ｎ、Ｂ_１〜Ｂ_ｎ、…、Ｚ_ｎ）または少なくとも１つのＴＮＳ結合物質を選択する少なくとも１つの方法工程が提供されてよい。ゆえに、第１の選択工程は、例えば、不正確なＴＮＳを除去するために、ＴＮＳの形成／合成後に実施されてよい。ＴＮＳを、その割り当てられた物質に結合させた後にさらなる選択工程を設けることで、不正確な結合物質を特定することができ、これによりライブラリの品質が評価され得る。したがって、そのプロセスは、液体移動相に配置された選択される成分（物質またはＴＮＳ）が、当該成分に対応する結合パートナーまたは当該成分の結合体が固定されている静止相に結合するように実行される。ゆえに、それぞれ、分析される混合物は、液体移動相、および／または静止相の液体溶出によって提供される。

【0026】

代わりに、または付加的に、不要または不正確にＴＮＳと結合した物質の割合が、更なる選択工程において判定されてもよい。不要な物質は、先行する反応工程の物質構築ブロック（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）と同じ反応基を備えるターミネーション試薬を用いた離脱反応（ｂｒｅａｋ−ｏｆｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって標識化（ｍａｒｋ）される。したがって、ターミネーション試薬は、依然として未反応の前駆体分子と反応して、これらを標識化し得るので、ターミネーション試薬はマーカー物質と呼ばれてもよい。マーカー物質は、例えば、静止相との結合を可能にするために、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列、ビオチン分子もしくはストレプトアビジン／アビジン分子、および／またはアジド／アルキンを有し得る。

【0027】

このように調製された混合物はその後、マーカー物質を結合させるための対応するコレクタードメイン、結合体、ＲＮＡ配列および／またはＤＮＡ配列が固定されている静止相に対し、移動相の形態で接触する。不要な物質は、静止相に結合されて、判定かつ／または定量化される。マーカーコレクタ系として、例えばビオチン−ストレプトアビジン／アビジン、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、またはアジド−アルキン−ヒュスゲンクリック反応が可能である。

【0028】

上記した選択工程は、特に、分析される混合物の第１の配列決定後にもたらされてよい。そのために、第１の配列決定工程において既に同定されたＴＮＳまたはＴＮＳ結合物質は、分析される混合物から取り出されてよい。さらに、結果的に、ＴＮＳまたはＴＮＳ結合物質の単離もまた達成される。それゆえに、より少量で存在する更なるＴＮＳが、残存する混合物の新たな（ｒｅｎｅｗｅｄ）配列決定によって同定され得る。したがって、分析される混合物を調製するために、少なくとも１つのＴＮＳまたはＴＮＳ結合物質の選択のための１つまたは複数の選択工程を提供してもよい。

【0029】

（分析される混合物を配列決定するために）用いられる配列決定法に関して、制限は設けられない。好ましくは、蛍光標識化ジデオキシヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つのＴＮＳの配列部分と相補的である少なくとも１つのプライマーを用いるサンガー法に従う配列決定が、実施されてよい。

【0030】

続いて、本発明の方法を、図面を参照しながら、実施形態および適用例として、より詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】様々な標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生成のためのアルゴリズムの一例である。

【図2】ＴＮＳを選択する選択工程の一例である。

【図3】所定アルゴリズムに従う配列スペクトルのデコンボリューションの一例である。

【図4a】本発明に従う方法の適用例の概略図である。

【図4b】本発明に従う方法の適用例の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

図１に、様々な標的ヌクレオチド配列（ＴＮＳ）の生成を、一例として示す。ＴＮＳの生成は、アルゴリズムＸに従ってｉｎ ｓｉｌｉｃｏでもたらされる。先ず、形成されるべきＴＮＳの全長が、配列位置の仕様によって確立される。この場合、配列長は、１４個の位置Ｎ_０〜Ｎ_１３であり、演算ｚ、ａ、ｄまたはｅが、各配列位置Ｎ_０〜Ｎ_１３に対して規定される。配列位置Ｎ_０にて、演算はｚであり、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対する制限は規定されていない。それ以外の各配列位置Ｎ_１〜Ｎ_１３について、それぞれ演算ａ、ｄまたはｅを実行後、先行する配列位置のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに関する制限が、それぞれ２つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴについて規定される。アルゴリズムＸは、形態ｚ−ａ−ａ−ｄ−ｄ−ｅ−ａ−ａ−ｄ−ｄ−ｅ−ａ−ｄ−ｅを有する。こうして形成されたＴＮＳの選択は、付属するコード表から導き出され得る。また、図１に符号１０で示す表に示されるように、恣意的に選択された（生成された）ＴＮＳ対は、少なくとも６つの配列差異を有する。

【0033】

図示しないが、こうして形成されたＴＮＳを、更なる配列位置で拡張／進展させる可能性が存在し、それによって更なる情報が保存（コード化）され得る。ゆえに、付加的な配列位置または配列部分が提供され得、これらはそれぞれ、結合される物質の性質、例えば物質のグループ、物質サイズ、曝露位置または日付のジオ座標をコードする。さらに、補完的な配列位置を提供してもよく、それによって、ＴＮＳはそのようなものとして同定することができる。概して類似するＴＮＳは、同じ配列長を有するはずである。

【0034】

続いて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成したＴＮＳの試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）合成が、亜リン酸トリエステル法を用いて実施される。

【0035】

合成ＴＮＳの、それを表す物質への化学的結合は、ペプチドカップリング試薬の助けを借りて、アミド結合の形成によってもたらすことができる。

【0036】

図２は、第１の配列決定において、ＴＮＳが混合物から濃縮され、かつ取り出されるようにして同定される、選択工程の一例を示す。結果として、更なるＴＮＳを配列決定によって同定することができる。即ち、ＴＮＳは、頻繁に生じるＴＮＳのシグナル強度を用いた第１の配列決定の間、混合物内の数が少ない（そして然るに、関係するシグナル強度がより低い）ために隠れているが、最も濃縮されたＴＮＳだけでなく、それほど濃縮されなかったＴＮＳもまた、同定することができる。

【0037】

この例において、１１個の位置を有するＴＮＳ混合物が図面左側に示されており、各位置は、組み合わされたＴＮＳを表す。大文字は、それぞれ単一のＴＮＳを表す。ヌクレオチド配列Ａ１’、Ａ３’、Ａ５’、Ｂ３’、Ｂ４’およびＢ９’が固定されている静止相を符号２０で示す。これらのヌクレオチド配列は、ＴＮＳ Ａ１、Ａ３、Ａ５、Ｂ３、Ｂ４およびＢ９と相補的であるので、前述したＴＮＳの結合を可能とする。位置１から位置１１のＴＮＳ混合物が、移動相として静止相２０と接触すると、位置１から位置９は、静止相２０に結合して、移動相から除去される。その後、この選択実験に由来するＴＮＳ混合物（右側）は、位置１０および位置１１のＴＮＳのみとなる。

【0038】

図３は、核酸を含む混合物の配列決定の間に吸収された配列スペクトル３１のデコンボリューションの一例である配列図を示す。この例において、配列決定は、蛍光標識化ジデオキシヌクレオチドを用いるサンガー法に従って実施された。ジデオキシヌクレオチドのシグナル強度に基づいて、配列スペクトル３１における各配列位置Ｎ_０〜Ｎ_１３のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの相対頻度が判定される。この相対頻度は棒グラフで図示される。配列位置Ｎ_０〜Ｎ_１３における各ヌクレオチドの頻度分布から、同定が可能な様々なＴＮＳ候補が、配列スペクトル３１から誘導され得る。この例においては、ＴＮＳ候補３２１および３２２が判定された。これらは、操作可能シーケンス
ｚ−ａ−ａ−ｄ−ｄ−ｅ−ａ−ａ−ｄ−ｄ−ｅ−ａ−ｄ−ｅ
を用い、所定アルゴリズムＸによってスキャンされ、デコンボリュートされる。

【0039】

該デコンボリューションにより、２つのＴＮＳ３３１およびＴＮＳ３３２が同定され、ＴＮＳ３３１は物質ｉを、ＴＮＳ３３２は物質ｉｉを表す。

【0040】

図４ａは、ＴＮＳ結合物質の適用例の概略図である。本実施形態により、環境におけるＴＮＳ結合粒子またはＴＮＳ標識化粒子の伝播が理解されるはずである。この目的のために、位置ＸにてＴＮＳ−Ａ１Ｂ３と結合した粒子、位置ＹにてＴＮＳがＡ３Ｂ４と結合した粒子、および位置ＺにてＴＮＳがＡ８Ｂ７と結合した粒子が曝される。粒子としては、例えば、サイズが１０ｎｍから１００μｍの範囲である汚染物質粒子が用いられる。粒子が曝されるそれぞれの位置Ｘ、Ｙ、Ｚは、各ＴＮＳの別個の配列部分においてコード化される。さらに、ＴＮＳはまた、粒子の曝露の日付を（各位置Ｘ、Ｙ、Ｚにて）コード化する別個の配列部分を有してもよい。サンプリングは、例えば位置Ｌにてもたらされてもよい。これは、例えば対応する空気フィルタにより実現できる。空気フィルタによって収集された粒子は、液体中に分散される。このように調製された核酸を含む混合物は、その後、配列決定にかけられてよい。よって、有利なことに、配列決定前に分析対象の核酸を含む混合物に対して、ＴＮＳ Ａ１Ｂ３、ＴＮＳ Ａ３Ｂ４、およびＴＮＳ Ａ８Ｂ７に対応するプライマーであるＰＣＲを用いた増幅にかけることができる。これにより、粒子ＴＮＳ Ａ１Ｂ３、ＴＮＳ Ａ３Ｂ４、およびＴＮＳ Ａ８Ｂ７によって標識化された粒子の存在を、位置Ｌにて判定することができ、その結果として、位置Ｘ、Ｙ、およびＺからの粒子の移動が理解され得る。

【0041】

図４ｂは、どのＴＮＳ標識化粒子が曝され、かつ収集されるかを図示した一例である。この目的のために、１６個の小さな四角１．１〜１．１６から形成される表面Ａが示される。小さな四角の辺長は、例えばそれぞれ４０ｋｍであるので、この場合の表面Ａは、拡張部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）が１６００ｋｍ^２である。小さな正方形１．１〜１．１６の角に円で示される点は、それぞれ、ＴＮＳ標識化粒子が曝される位置を示しており、表面Ｌ１．１〜Ｌ１．１６のうち少なくとも１６ｍ^２、好ましくはその中心部分が、それぞれＴＮＳ標識化粒子を収集または検出するために提供される。

【0042】

ＴＮＳ標識化粒子が検出されることで、１つまたは複数のＴＮＳ標識化粒子が位置付け及び分析された各位置に対して局所割当てが実現される。これは、特に、外部からの影響の結果として、ある位置から他の位置に移されたＴＮＳ標識化粒子の特異的な局所分布が検出する場合を想定すると、有利である。

【0043】

記載される適用例は、水生系に適合されてもよい。

【0044】

更なる用途として、化学的研究、生物学的研究、および医学的研究の分野がある。ＴＮＳは、例えば、タンパク質に対する特異的な結合親和性を有する分子構造を同定するために用いられ得る。さらに、ＴＮＳコード化学分子ライブラリまたはＤＮＡコード化化学分子ライブラリもまた、医薬的に関連するタンパク質についてのリガンドを追跡する有効なツールとして用いられ得る。ＴＮＳコード化分子またはＤＮＡコード化分子は、例えば親和性ベースの選択によって濃縮された後、その明解なＴＮＳコーディングまたはＤＮＡコーディングにより、デコードされ得る。そのような選択実験において得られたＴＮＳコード化混合物またはＤＮＡコード化混合物はその後、混合物の単離／精製も増幅も要することなく、本発明の方法によって容易にデコンボリュートすることができる。

【0045】

コード表
番号（＝配列番号） ＴＮＳ−コード ラウンドＮｏ．
１ ＧＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＴＧＴ ０
２ ＡＴＣＡＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡ １
３ ＴＡＧＡＣＡＴＣＡＴＡＧＡＧ ２
４ ＴＡＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＡＧ ３
５ ＡＧＡＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣ ４
６ ＴＣＴＣＧＴＡＧＴＣＴＣＧＴ ５
７ ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＴＣＴ ６
８ ＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧ ７
９ ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＴＧＣ ８
１０ ＣＧＣＡＣＴＡＧＡＴＧＣＧＴ ９
１１ ＧＣＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣ １０
１２ ＡＧＣＧＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧ １１
１３ ＣＴＣＧＡＣＴＡＴＣＡＧＡＣ １２
１４ ＣＧＡＴＧＣＴＣＡＴＡＧＴＡ １４
１５ ＡＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＡＧ １５
１６ ＧＡＧＴＧＣＧＡＴＣＡＧＡＧ １７
１７ ＣＴＡＣＡＣＴＣＡＣＴＡＣＡ １８
１８ ＴＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＡＴＡ ２０
１９ ＴＣＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＡＣ ２１
２０ ＧＡＴＣＡＣＴＣＧＴＡＴＣＡ ２３
２１ ＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＧＴＡ ２４
２２ ＴＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＴＡ ２５
２３ ＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＣＧＴＧ ２７
２４ ＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧ ２９
２５ ＧＡＧＴＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡ ３０
２６ ＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＴＡ ３１
２７ ＣＴＡＣＧＴＡＴＧＴＡＴＣＴ ３２
２８ ＴＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＡＴＡ ３４
２９ ＧＡＧＡＣＴＣＧＴＧＣＧＴＧ ３６
３０ ＴＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＧＡＣ ３７
３１ ＴＡＴＣＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴ ４０
３２ ＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧ ４１
３３ ＧＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴ ４７
３４ ＡＧＣＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴ ５０
３５ ＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧ ５２
３６ ＴＣＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧ ５３
３７ ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＡ ５４
３８ ＣＴＡＣＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣ ５５
３９ ＣＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧ ５６
４０ ＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡ ５７
４１ ＴＡＧＴＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣ ５９
４２ ＡＴＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＣＡ ６０
４３ ＣＴＡＴＧＣＴＡＣＡＣＧＡＣ ６８
４４ ＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＧＴ ７２
４５ ＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＣＴ ７４
４６ ＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＡＴＧＴ ７９
４７ ＧＡＴＧＴＡＧＣＡＣＴＡＣＴ ８４
４８ ＴＡＴＧＴＡＴＣＧＡＣＴＣＴ ８８
４９ ＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧ ９２
５０ ＣＴＣＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＴ ９９
５１ ＣＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＣＧＴ １００
５２ ＴＡＧＴＧＣＧＡＣＧＣＴＣＴ １０５
５３ ＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴ １０８
５４ ＧＣＧＡＣＴＣＧＡＴＧＡＣＡ １０９
５５ ＡＧＡＣＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡ １１４
５６ ＡＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧ １１８
５７ ＧＡＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣ １２２
５８ ＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＴＡ １２４
５９ ＣＧＡＴＧＴＡＴＣＡＣＧＴＡ １３９
６０ ＣＴＡＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＴ １４０
６１ ＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡ １４７
６２ ＣＴＣＧＴＧＡＧＴＣＡＧＴＡ １４８
６３ ＴＣＴＧＡＣＧＣＧＡＧＡＣＴ １５５
６４ ＴＡＧＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＣ １６１
６５ ＣＧＣＧＡＣＴＡＴＧＣＴＧＴ １６３
６６ ＧＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＣＧＣ １６７
６７ ＡＧＡＴＣＡＴＡＣＡＧＡＣＴ １６８
６８ ＴＡＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣ １７０
６９ ＴＣＧＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＣ １７７
７０ ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＧＴＡＴＧ １８５
７１ ＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡ １８７
７２ ＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＴ １９７
７３ ＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＡＧＴＧ １９８
７４ ＴＣＴＧＴＧＣＧＴＧＴＡＣＴ ２０２
７５ ＧＡＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＴＡ ２０９
７６ ＴＣＧＡＣＴＡＧＡＣＡＧＴＡ ２３５
７７ ＧＣＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧ ２３９
７８ ＣＧＣＡＣＴＡＴＧＴＡＧＴＡ ２４５
７９ ＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＧＴ ２６１
８０ ＣＴＣＡＴＡＴＣＧＴＧＣＧＣ ２６３
８１ ＧＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＴＧ ２７０
８２ ＧＣＴＣＧＣＴＡＣＧＴＣＡＧ ２９５
８３ ＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡ ２９９
８４ ＧＣＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡ ３１１
８５ ＡＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧＡＣ ３２２
８６ ＴＣＧＴＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣ ３２５
８７ ＡＧＣＧＴＡＧＣＡＴＡＧＡＣ ３３０
８８ ＴＡＴＣＡＧＡＧＡＴＧＣＧＴ ３４２
８９ ＴＣＧＴＣＴＡＴＣＧＴＣＧＴ ３４４
９０ ＣＴＣＧＡＣＧＡＣＡＣＧＴＡ ３６０
９１ ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＡ ３６２
９２ ＣＴＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣ ３６８
９３ ＴＣＴＣＡＣＴＡＴＣＡＴＧＣ ３８０
９４ ＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＣ ３８１
９５ ＡＴＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＣＴ ３８６
９６ ＧＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＴＣＴ ４０１
９７ ＴＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＧ ４０５
９８ ＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡ ４１４
９９ ＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＡＧ ４２４
１００ ＡＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧ ４３７
１０１ ＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＴＡＴＧ ４４０
１０２ ＧＣＧＡＴＧＣＧＴＧＴＣＡＣ ４４５
１０３ ＴＣＧＴＧＴＣＧＡＴＡＧＡＧ ４５８
１０４ ＧＡＴＣＡＣＴＡＴＧＣＧＴＡ ４８４
１０５ ＣＴＡＣＧＴＡＧＴＣＴＡＴＡ ５３５
１０６ ＧＡＧＴＧＣＧＣＡＣＴＣＧＴ ５４１
１０７ ＴＣＧＴＧＣＴＡＴＧＴＡＴＧ ５４２
１０８ ＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＴＡＣＴ ５８１
１０９ ＡＴＡＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＣ ５９４
１１０ ＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＴＡ ５９６
１１１ ＣＧＡＣＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧ ６０８
１１２ ＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＧＣ ６２５
１１３ ＴＡＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡ ６６４
１１４ ＡＧＣＡＴＧＣＧＡＣＴＡＣＡ ６６９
１１５ ＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡ ６８０
１１６ ＧＡＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＧＣ ７５６
１１７ ＣＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧ ７７９
１１８ ＧＣＧＴＣＡＴＣＧＡＧＣＧＣ ７９０
１１９ ＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＴ ８１７
１２０ ＡＴＡＣＧＣＧＣＡＣＴＣＡＣ ８９３
１２１ ＣＴＡＴＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣ ８９９
１２２ ＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧ ９５１
１２３ ＣＧＣＧＡＣＧＣＡＣＡＴＧＣ ９９７
１２４ ＣＴＡＴＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧ １０４９
１２５ ＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＣＧＡＧ １１１２
１２６ ＡＴＡＣＧＴＡＴＣＡＣＴＧＣ １２５１
１２７ ＣＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣ １３１１
１２８ ＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧ １３５５
１２９ ＡＴＣＡＣＴＣＧＡＴＡＧＴＧ １３７６
１３０ ＣＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡＴＣＴ １３９９
１３１ ＣＧＣＧＡＧＡＧＴＧＴＡＣＡ １５２５
１３２ ＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣ １５６８
１３３ ＡＧＣＡＴＧＡＧＴＧＣＴＧＴ １５８９
１３４ ＣＧＣＧＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧ １７７８
１３５ ＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣ １８９０
１３６ ＴＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＡ １９０９
１３７ ＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡ ２１６９
１３８ ＴＣＧＴＣＴＣＴＣＡＧＡＴＡ ２１９６
１３９ ＡＴＡＣＡＣＧＡＴＧＴＡＴＧ ２６０９
１４０ ＡＴＡＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＡ ２８３３
１４１ ＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＧ ２８５７
１４２ ＧＡＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＧ ２９１０
１４３ ＧＡＧＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴ ３３９５
１４４ ＡＴＡＣＧＴＡＧＡＴＧＣＡＧ ３４１５
１４５ ＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＡＣ ３４２８
１４６ ＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＧＣ ３６５１
１４７ ＴＡＧＴＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧ ３６８０
１４８ ＧＣＴＣＡＧＡＴＣＧＴＡＣＴ ４１７０
１４９ ＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴ ４２４３
１５０ ＡＧＣＧＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴ ４３９１
１５１ ＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴ ４５６８
１５２ ＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＡＧＴＡ ５４４０
１５３ ＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＡＣ ５５５４
１５４ ＧＣＧＡＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣ ５９３８
１５５ ＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＣＡ ７００３
１５６ ＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡ ７２２９
１５７ ＧＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣ ７３６４
１５８ ＧＣＧＡＴＡＧＣＡＴＧＣＡＧ ８３４３
１５９ ＧＡＴＣＧＴＡＧＴＧＣＧＡＣ ８５２０
１６０ ＣＴＣＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴ ８５２２
１６１ ＣＧＡＴＧＴＣＧＡＴＡＴＧＴ ８７４４
１６２ ＡＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＴＣＴ ８８０９
１６３ ＴＣＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＴ ８９６３
１６４ ＡＴＡＣＡＣＴＣＧＴＡＧＡＧ ９３０８
１６５ ＧＣＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＴ ９８４７
１６６ ＴＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＡ １００９０
１６７ ＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＡＧＡＣ １０６２９
１６８ ＧＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＡ １０６９０
１６９ ＴＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＣ １１５７０
１７０ ＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＴ １２１３２
１７１ ＣＧＡＴＣＡＧＡＴＣＡＧＡＣ １２９０６
１７２ ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＧＡＴＧ １３４４２
１７３ ＡＧＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣ １３４４５
１７４ ＧＣＧＴＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡ １３８９８
１７５ ＡＧＣＧＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣ １４０７２
１７６ ＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴ １５１３１
１７７ ＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＴＡＴＡ １５６９３
１７８ ＴＡＴＧＡＣＴＡＴＣＴＡＣＴ １６０３５
１７９ ＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＧ １７３１１
１８０ ＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＴ １９２６５
１８１ ＧＣＴＧＡＣＴＣＡＣＴＣＧＣ １９８１１
１８２ ＧＡＧＴＧＴＣＴＣＧＴＣＡＣ １９９８８
１８３ ＣＧＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴ ２１２７６
１８４ ＴＡＴＣＡＣＧＣＧＡＣＴＧＣ ２１８８２
１８５ ＡＧＡＴＧＴＡＴＧＴＡＧＡＧ ２１９５５
１８６ ＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＣ ２２２１４
１８７ ＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＧ ２２３２８
１８８ ＴＣＴＧＡＧＡＴＧＴＡＴＧＣ ２５６６８
１８９ ＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣ ２５６７１
１９０ ＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＴ ３１０８４
１９１ ＧＣＴＧＴＧＡＧＴＧＣＧＴＧ ３４９０６
１９２ ＣＴＣＡＴＧＣＧＴＣＴＣＧＴ ３４９２３
１９３ ＴＡＴＧＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣ ４２５９３
１９４ ＡＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴ ４３０５０
１９５ ＣＧＣＧＴＡＧＡＴＧＣＧＴＧ ４８６２４
１９６ ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＴ ５０１０９
１９７ ＣＧＡＴＧＴＣＧＴＧＣＧＡＧ ６６６０３
１９８ ＴＡＧＡＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣ ９３９１２

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]