特許 6629069 イヌ化抗ＮＧＦ抗体およびその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6629069

(24)【登録日】2019年12月13日

(45)【発行日】2020年1月15日

(54)【発明の名称】イヌ化抗ＮＧＦ抗体およびその方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/07 20060101AFI20200106BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200106BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20200106BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20200106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200106BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200106BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200106BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20200106BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/07 100

   A61K39/395 N

   A61P3/00

   A61P3/04

   A61P3/10

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P25/04

   A61P29/00

   A61P43/00 171

   C07K16/22ZNA

   C07K16/46

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   G01N33/53 D

   G01N33/577 B

【請求項の数】10

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2015-516189(P2015-516189)

(86)(22)【出願日】2013年6月6日

(65)【公表番号】特表2015-521461(P2015-521461A)

(43)【公表日】2015年7月30日

(86)【国際出願番号】US2013044430

(87)【国際公開番号】WO2013184871

(87)【国際公開日】20131212

【審査請求日】2016年5月26日

【審判番号】不服2018-6981(P2018-6981/J1)

【審判請求日】2018年5月22日

(31)【優先権主張番号】61/656,056

(32)【優先日】2012年6月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512261355

【氏名又は名称】ゾエティス・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】バージェロン，リサ・マリー

(72)【発明者】

【氏名】ベインブリッジ，グレーム

(72)【発明者】

【氏名】ダナム，スティーブン・エイ

(72)【発明者】

【氏名】ダイ，ミンフア

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 松岡 徹

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５３５９２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０２４６５０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90

ＪＳＴ７５８０／ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍ３）

ＰｕｂＭｅｄ

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列：ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＳＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６：ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）を含む可変軽鎖；及び
アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＱＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）を含む可変重鎖
を含み、イヌ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合する、単離されたイヌ化抗原結合タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載のイヌ化抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体；キメラ抗体、単鎖抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異的抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、小モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）およびＩｇＮＡＲ分子からなる群より選択される、イヌ化抗原結合タンパク質。

【請求項3】

抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を産生する宿主細胞。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療有効量のイヌ化抗原結合タンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアを備える、獣医学用組成物。

【請求項6】

治療有効量の請求項５に記載の獣医学用組成物を投与する工程を備える、ＮＧＦ関連障害についてイヌを治療する方法。

【請求項7】

ＮＧＦ関連障害状態が、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、２型糖尿病、代謝症候群、痛み、および炎症からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ＮＧＦ関連障害状態が痛みである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法であって、痛みの型が、慢性の痛み、炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷から生じる痛み、創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み、神経障害の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、ならびに末梢神経障害からなる群より選択される、方法。

【請求項10】

痛みが骨関節炎の痛みである、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年６月６日に出願された米国仮出願６１／６５６，０５６号の優先権を主張し、これはその全体が参照により組み込まれる。

【0002】

本発明は免疫学の分野に関連する。より詳細には、本発明は、イヌの中で非免疫原性となるように修飾されている、抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質または抗体、特に、イヌＮＧＦに特異的に結合する、キメラ抗体およびイヌ化抗体に関する。本発明はさらに、イヌにおけるＮＧＦ関連障害、特に痛みの治療および／または予防におけるこのような抗原結合タンパク質または抗体の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

神経成長因子（ＮＧＦ）は同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢ニューロンと中枢ニューロンの両方の発生および生存におけるその役割は十分に特徴付けされてきた。ＮＧＦは、末梢交感神経ニューロンおよび胎児感覚ニューロン、ならびに前脳基底部コリン作用性ニューロンの発生において、決定的に重要な生存および維持の因子であることが示されてきた（Ｓｍｅｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７６：１００１−１０１ Ｉ（１９９４））。ＮＧＦは感覚ニューロン中のニューロペプチドの発現をアップレギュレートし（Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３６２−３６４（１９８９））、その活性は、２つの異なる膜結合受容体、ＴｒｋＡチロシンキナーゼ受容体およびｐ７５共通ニューロトロフィン受容体（時折、それぞれ、「高親和性」ＮＧＦ受容体および「低親和性」ＮＧＦ受容体と呼ばれる）を通して媒介され、これは、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーと構造的に関連している（Ｃｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：５１８−５２１（１９８６））。

【0004】

神経系におけるその効果に加えて、ＮＧＦは、神経系の外部のプロセスに関係していると見なされることが増えている。例えば、ＮＧＦは、血管透過性を増強すること（Ｏｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０６：１９９−２０１（１９８４））、Ｔ細胞およびＢ細胞免疫応答を増強すること（Ｏｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００５９−１００６３（１９８９））、リンパ球分化および肥満細胞増殖を誘導すること、ならびに肥満細胞からの可溶性生物学的シグナルの放出を引き起こすこと（Ｍａｔｓｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６５０８−６５１２（１９８８）；Ｐｅａｒｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７２：３７９−３９３（１９８６）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７９：２６６２−２６６９（１９９２）；Ｈｏｒｉｇｏｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４８８１−１４８８７（１９９３））が示されてきた。

【0005】

ＮＧＦは、肥満細胞（Ｌｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３７３９−３７４３（１９９４））、Ｂリンパ球（Ｔｏｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８５：３４５−３５６（１９９６）、ケラチノサイト（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８３８−２２８４６））、平滑筋細胞（Ｕｅｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１１：１０６１−１０６５（１９９３））、線維芽細胞（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７９５−８０１（１９９０））、気管支上皮細胞（Ｋａｓｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ，Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３１：１４３２−４０（２００１））、腎メサンギウム細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｆ７９２−７９８（１９９１））および骨格筋筋管（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ６６：１９５−２００（２００２））を含む多くの細胞型によって産生される。ＮＧＦ受容体は、神経系の外部の様々な細胞型で見い出されてきた。例えば、ＴｒｋＡは、ヒト単球、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、ならびに肥満細胞で見い出されてきた。

【0006】

ＮＧＦレベルの増加と様々な炎症状態の間の関連性は、ヒト患者において、ならびにいくつかの動物モデルにおいて観察されてきた。これらには、全身性エリテマトーデス（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ４：５６３−５６５（１９９３））、多発性硬化症（ＢｒａｃｃｉＬａｕｄｉｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４７：９−１２（１９９２））、乾癬（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，ｅｔ ａｌ．，ＡｃｔＤｅｒｍ．ｌ’ｅｎｅｒｅｏｌ．７８：８４−８６（１９９８））、関節炎（Ｆａｌｃｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：７４５−７４８（１９９６））、間質性膀胱炎（Ｏｋｒａｇｌｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １６１：４３８−４４１（１９９９））およびぜんそく（Ｂｒａｕｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２４０−３２５１（１９９８））が挙げられる。

【0007】

一貫して、末梢組織におけるＮＧＦのレベルの上昇は、痛覚過敏および炎症と関連付けられており、多くの型の関節炎において観察されてきた。関節リウマチに罹患している患者の滑膜は高レベルのＮＧＦを発現しているのに対して、炎症を起こしていない滑膜においては、ＮＧＦは検出不能であると報告されている（Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．３５：３５１−３５５（１９９２））。同様の結果は、実験的に誘導された関節リウマチのラットにおいて見られた（Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：２０３−２０４（１９９２））。ＮＧＦのレベルの上昇は、肥満細胞の数の増加とともに、トランスジェニック関節炎マウスにおいて報告されている（Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ−Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ａｓｐｅｃｔｓ １５：１３９−１４３（１９９３））。

【0008】

骨関節炎（ＯＡ）は、イヌにおける最も一般的な慢性筋骨格疾患の１つであり、１歳齢を超えたイヌ集団の２０％が罹患している。ＯＡの発症は、主として、外傷、関節不安定性、および股関節異形成などの疾患に続発する。骨関節炎は全体の関節の疾患状態であり、すべての関節構造の炎症性と編成性の両方の変化が、身体障害、ならびに跛行および痛みの臨床徴候を生じる。痛みは、イヌのＯＡの最も重要な臨床症状であり、これは、構造的な関節の変化、生化学的および分子的な変化、ならびに末梢および中枢の痛みプロセスメカニズムの間の複雑な相互作用の結果である。このネットワークの中で、炎症性および痛覚過敏性メディエーター（例えば、サイトカイン、プロスタグランジン、およびニューロメディエーター）による末梢侵害受容器の活性化および感作は、関節の痛みの原因である主要な末梢メカニズムの１つである。神経成長因子（ＮＧＦ）は、炎症性と神経障害性の両方の痛みに関与する鍵となる調節因子として、広範な注目を受けているニューロメディエーターの１つである（Ｉｓｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔ Ｃｏｍｐ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａｔｏｌ ４：２０１１ ｐｇｓ ２７９−２８４）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

（発明の要旨）
本発明は、新規なイヌ化抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質（イヌ化抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体など）、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、ＮＧＦ関連障害、特に痛みの治療および／または予防における上記抗原結合タンパク質および／またはヌクレオチドの使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

１つの実施形態において、本発明は、イヌＮＧＦに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質または抗体フラグメントを提供する。ある実施形態において、この抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異的抗体、ドメイン特異的抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｃ融合タンパク質、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、単一ドメイン抗体、ｄＡｂフラグメント、小モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、およびＩｇＮＡＲ分子からなる群より選択される。ある実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体である。ある実施形態において、上記抗体はキメラである。１つ以上の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質はイヌ化されている。１つ以上の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質はイヌ抗体である。

【0011】

１つ以上の実施形態において、イヌＮＧＦに特異的に結合する抗原結合タンパク質は、イヌＮＧＦがイヌＴｒｋＡに結合すること、およびより低い程度でｐ７５に結合することを妨害し、従って、イヌのＴｒｋＡおよびｐ７５を通したシグナル伝達を阻害し、このことは、感覚ニューロンを通したシグナル伝達を減少し、従って、痛みのレベルを減少することが示されてきた。１つ以上の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、イヌの免疫系に対して顕著な有害効果を有さない。

【0012】

１つ以上の実施形態において、イヌＮＧＦに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質は、イヌにおけるＮＧＦ関連障害を治療する。ある実施形態において、イヌにおけるＮＧＦ関連障害は、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、代謝症候群、痛み、および炎症からなる群より選択される。ある実施形態において、ＮＧＦ関連障害は痛みである。ある実施形態において、痛みの型は、慢性の痛み；炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷から生じる痛み、創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み、神経障害の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、ならびに末梢神経障害なる群より選択される。ある実施形態において、痛みの型は慢性の痛みである。ある実施形態において、痛みの型は骨関節炎の痛みである。

【0013】

１つ以上の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択される少なくとも１つを備える単離された抗原結合タンパク質を提供する：
アミノ酸配列ＬＩＧＹＤＩＮ（配列番号（ＳＥＣ ＩＤ ＮＯ．）１）；ＬＩＱＹＤＩＮ（配列番号７）またはＬＩＥＹＤＩＮ（配列番号８）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ１）を備える可変重鎖（ＶＨ）；
アミノ酸配列ＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号２）；またはＭＩＷＧＴＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（アミノ酸配列１３）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ２）を備える可変重鎖（ＶＨ）；
アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号３）；またはＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号９）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ３）を備える可変重鎖（ＶＨ）；および
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の少なくとも１つにおける１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。

【0014】

１つ以上の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択される少なくとも１つを備える単離された抗原結合タンパク質を提供する：
アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮ（配列番号４）；またはＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮ（配列番号１０）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ１）を備える可変軽鎖（ＶＬ）；
アミノ酸配列ＹＩＳＲＦＨＳ（配列番号５）またはＹＩＳＳＦＨＳ（配列番号１１）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ２）を備える可変軽鎖（ＶＬ）；
アミノ酸配列ＱＱＳＫＴＬＰＹＴ（配列番号６）またはＱＱＳＨＴＬＰＹＴ（配列番号１２）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ３）を備える可変軽鎖（ＶＬ）；および
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の少なくとも１つにおける１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。ある実施形態において、本発明は、上述の可変軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つを備える単離された抗原結合タンパク質を提供し、さらに以下からなる群より選択される下記の可変重鎖ＣＤＲの少なくとも１つを含む。：
アミノ酸配列ＬＩＧＹＤＩＮ（配列番号１）；ＬＩＱＹＤＩＮ（配列番号７）またはＬＩＥＹＤＩＮ（配列番号８）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ１）を備える可変重鎖（ＶＨ）；
アミノ酸配列ＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号２）；またはＭＩＷＧＴＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号１３）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ２）を備える可変重鎖（ＶＨ）；
アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹ（アミノ酸配列３）；またはＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号９）を有する相補性決定領域（ＣＤＲ３）を備える可変重鎖（ＶＨ）；および
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の少なくとも１つにおける１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。

【0015】

１つ以上の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は下記の少なくとも１つを含んでもよい：
以下を備える可変重鎖：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＲＴＤＤＴＡＴＹＳＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４；ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５；ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＱＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７；ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８；ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＴＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９；ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨ）；
および１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。

【0016】

１つ以上の実施形態において、本発明の単離された抗原結合タンパク質は、下記の少なくとも１つを含んでもよい：
以下を備える可変軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５；ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６；ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８；ＣＡＮ−６１８−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９；ＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０；ＣＡＮ−６１８ＦＷ１−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１；ＣＡＮ−６１８ＦＷ２−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２；ＣＡＮ−６１８ＦＷ３−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３；ＣＡＮ−６１８ＦＷ４−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４；ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＳＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６；ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＳＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０；ＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬ）；
および
１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。ある実施形態において、本発明は、上記の可変軽鎖の少なくとも１つを有する単離された抗原結合タンパク質を提供し、そして以下からなる群より選択される単離された抗体またはその抗原結合部分の以下の可変重鎖の少なくとも１つをさらに含むことができる：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＲＴＤＤＴＡＴＹＳＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４；ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５；ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＱＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７；ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８；ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＴＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９；ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨ）；
および、１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。

【0017】

１つ以上の実施形態において、本発明の単離された抗原結合タンパク質は以下の少なくとも１つを含むことができる：
ａ）以下を備える可変軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５；ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６；ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８；ＣＡＮ−６１８−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９；ＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬ））；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０；ＣＡＮ−６１８ＦＷ１−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１；ＣＡＮ−６１８ＦＷ２−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２；ＣＡＮ−６１８ＦＷ３−ＶＬ）；
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＳＫＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３；ＣＡＮ−６１８ＦＷ４−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＲＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４；ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＹＩＳＳＦＨＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＴＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６；ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）；
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＦＲＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＩＳＳＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＳＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０；ＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬ）；
および
１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型；ならびに
ｂ）以下を備える可変重鎖：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＲＴＤＤＴＡＴＹＳＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４；ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹＹＧＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５；ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＱＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７；ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８；ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨ）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＡＲＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＶＳＧＦＳＬＩＥＹＤＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＴＭＩＷＧＴＧＴＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＶＳＲＤＮＡＭＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９；ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨ）；
および１つ以上の保存性アミノ酸置換を有するこれらの変異型。

【0018】

１つ以上の実施形態において、本発明は、可変軽鎖が配列番号１６（ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ）を備え、可変重鎖が配列番号１７（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）を備える、単離された抗原結合タンパク質を提供する。

【0019】

１つ以上の実施形態において、本発明は、配列番号２６（ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）を備える可変軽鎖および配列番号２７（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）を備える可変重鎖を備える、単離された抗原結合タンパク質を提供する。

【0020】

１つ以上の実施形態において、本発明は、配列番号３０（ＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬ）を備える可変軽鎖および配列番号２７（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）を備える可変重鎖を備える、単離された抗原結合タンパク質を提供する。

【0021】

１つ以上の実施形態において、本発明は、治療有効量の任意の１種以上の本発明の単離された抗原結合タンパク質を備える獣医学用組成物を提供する。１つ以上の実施形態において、本発明の獣医学用組成物は、イヌの免疫系に対して顕著な有害効果を有さない。

【0022】

１つ以上の実施形態において、本発明は、任意の１種以上の本発明の抗原結合タンパク質を産生する宿主細胞を提供する。

【0023】

１つの実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されるイヌ化抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を備える単離された核酸を提供する：
配列番号３２（ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨｎｔ）；配列番号３４（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨｎｔ）；配列番号３８（ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨｎｔ）；配列番号４０（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨｎｔ）；配列番号４１（ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨｎｔ）；配列番号４２（ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨｎｔ）；および１つ以上の保存性核酸置換を有するこれらの変異型からなる群より選択される可変重鎖（ＶＨ）をコードする核酸。

【0024】

１つ以上の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されるイヌ化抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を備える単離された核酸を提供する：
配列番号３１（ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＬｎｔ）；配列番号３３（ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬｎｔ）；配列番号３５（ＣＡＮ−６１８−ＶＬｎｔ）；配列番号３６（ＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬｎｔ）；配列番号３７（ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＬｎｔ）；配列番号３９（ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬｎｔ）；配列番号４３（ＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬｎｔ）；および１つ以上の保存性核酸置換を有するこれらの変異型からなる群より選択される可変軽鎖（ＶＬ）をコードする核酸。

【0025】

ある実施形態において、本発明は、配列番号３２（ＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨｎｔ）；配列番号３４（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨｎｔ）；配列番号３８（ＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨｎｔ）；配列番号４０（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨｎｔ）；配列番号４１（ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨｎｔ）；または配列番号４２（ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨｎｔ）；および１つ以上の保存性核酸置換を有するこれらの変異型からなる群より選択される可変重鎖（ＶＨ）をコードする核酸をさらに備える。

【0026】

１つ以上の実施形態において、本発明は、配列番号３３（ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬｎｔ）を備えるイヌ化抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質の可変軽鎖をコードし、配列番号３４（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨｎｔ）を備える可変重鎖をコードする、単離された核酸を提供する。

【0027】

１つ以上の実施形態において、本発明は、配列番号３９（ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬｎｔ）を備える可変軽鎖をコードし、配列番号４０（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨｎｔ）を備える可変重鎖をコードする、単離された核酸を提供する。

【0028】

１つ以上の実施形態において、本発明は、配列番号４３（ＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬｎｔ）を備える可変軽鎖をコードし、配列番号４０（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨｎｔ）を備える可変重鎖をコードする、単離された核酸を提供する。

【0029】

１つ以上の実施形態において、本発明は、本発明の任意の１種以上の核酸を備えるベクターを提供する。

【0030】

１つ以上の実施形態において、本発明は、本発明の任意の１種以上の核酸を備える宿主細胞を提供する。

【0031】

１つ以上の実施形態において、本発明は、本発明の任意の１種以上の核酸を備えるベクターを備える宿主細胞を提供する。

【0032】

１つの実施形態において、本発明は、イヌ化抗原結合タンパク質の産生を生じる条件下で、本明細書に記載されるような本発明の宿主細胞のいずれかを培養する工程、およびこの宿主細胞から、またはこの宿主細胞の培養培地から、イヌ化抗体抗原結合タンパク質を単離する工程を備える、抗原結合タンパク質を産生する方法を提供する。

【0033】

１つの実施形態において、本発明は、治療有効量の本発明の獣医学用組成物を投与する工程を備える、ＮＧＦ関連障害についてイヌを治療する方法を提供する。ある実施形態において、ＮＧＦ関連障害は、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、代謝症候群、痛み、および炎症からなる群より選択される。本発明のある実施形態において、痛みの型は、慢性の痛み、炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷から生じる痛み、創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み、神経障害の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、ならびに末梢神経障害からなる群より選択される。ある実施形態において、痛みの型は骨関節炎の痛みである。

【0034】

１つ以上の実施形態において、本発明は、本発明の獣医学用組成物を投与することによって、イヌにおけるＮＧＦ活性を阻害する方法を提供する。

【0035】

１つの実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＮＧＦレベルを検出または定量する方法を提供し、この方法は以下の工程を備える：
（ａ）本発明のイヌ化抗体、抗原結合タンパク質、またはフラグメントのいずれか１つの存在下で、ＮＧＦを含有する臨床的サンプルまたは生物学的サンプルをインキュベートする工程；および
（ｂ）上記サンプル中のＮＧＦに結合している抗原結合タンパク質またはフラグメントを検出する工程。

【0036】

ある実施形態において、抗原結合タンパク質またはフラグメントは、検出可能に標識されている。ある実施形態において、抗原結合タンパク質またはフラグメントは標識されておらず、検出可能に標識されている第２の抗原結合タンパク質またはフラグメントと組み合わせて使用される。１つの実施形態において、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質を備えるキットを備える。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、抗原結合部位を強調表示した、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子の一般的構造の略図である。

【図2】図２は、マウス／イヌのキメラＩｇＧの一般的構造の略図である。

【図3】図３は、スペシエーション、すなわちマウスＩｇＧの「イヌ化」を示す図解であり、マウスＣＤＲがイヌのフレームワークに移植されている。

【図4】図４は、キメラ軽鎖が完全にイヌ化された重鎖と対になっているヘテロキメラモノクローナル抗体の図解である。

【図5】図５は、定常領域へのプライマー、およびマウス可変領域に向けられた縮重プライマーを示す、抗体可変鎖の図解である。

【図6】図６（Ａ）成熟ヒトβ−ＮＧＦ上のＲＮ ９１１エピトープの分子モデリング。ＮＧＦは、典型的には、ホモダイマー化されている。ＮＧＦの各モノマーは、薄い灰色と中程度の灰色の記号表示によって区別されており、ＲＮ９１１結合に影響を与える同定された残基は黒で示される。様々なマウスｍＡｂの結合に影響を及ぼす各々の可変領域はそのように標識されている。図６（Ｂ）β−ＮＧＦ上のＲＮ９１１結合エピトープの種を横切るアミノ酸配列保存性。ＮＧＦへのＲＮ９１１結合のために決定的に重要なアミノ酸は灰色で影を付けている。

【図7】図７は、ビーグル犬へのＩＶ投与後の血清レベルの遊離のＲＮ９１１のグラフ表示である。

【図8】図８は、ビーグル犬へのＩＶ投与後の血清レベルの「結合ＮＧＦ」（すなわち、ＲＮ９１１に結合したＮＧＦ）のグラフ表示である。

【図9】図９は、ビーグル（ＬＰＳ誘導）滑膜炎痛みモデルにおける跛行に対するＲＮ９１１（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の効果のグラフ表示である。＊Ｐ＜０．１、ＰＢＳビヒクルと比較した場合。

【図10】図１０は、発現を回復し、結合を保持するための軽鎖に対して行われたフレームワーク置換の一例の略図である。

【図11】図１１は、異なるフレームワーク配列を使用するイヌ化誘導体の発現および変異の結果を要約する。

【図12A】図１２ＡおよびＢは、イヌ化ｍＡｂ（左）の親和性データのグラフ表示である。（右）プレインキュベートしたｍＡｂ＋ＮＧＦを用いたｔｒｋＡ阻害データ。（下）

【図12B】図１２ＡおよびＢは、イヌ化ｍＡｂ（左）の親和性データのグラフ表示である。（右）プレインキュベートしたｍＡｂ＋ＮＧＦを用いたｔｒｋＡ阻害データ。（下）

【図13】図１３は、各ｍＡｂのＥＣ５０を決定するための、ｔｒｋＡ発現細胞系統を使用する細胞ベースのアッセイによって決定されたイヌ化ｍＡｂの親和性データのグラフ表示である。

【図14】図１４は、イヌ化抗ＮＧＦ ｍＡｂ ＰＦ ０６４４２５９０（ＣＡＮＳＳＭ５７−ＶＨ／ＣＡＮ ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）の効果のグラフ表示である。

【図15】図１５は、ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）および部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）のために使用されるライブラリー設計の図解である。

【図16】図１６は、３５日間測定した場合の、イヌにおける抗ＮＧＦモノクローナル抗体の薬物動態学（ＰＫ）研究のグラフ表示である。

【図17】図１７は、ラット（ＭＩＡラット痛みモデル）におけるＯＡ様病変を再生するために使用されたＭＩＡの関節内注射による炎症誘導の図式記述である。

【図18】図１８は、ＭＩＡラット痛みモデルにおける痛み治療（モルヒネ、モノクローナル抗体）後の結果のグラフ表示である。

【図19】図１９は、ＭＩＡラット痛みモデルにおける痛み治療（モルヒネ、モノクローナル抗体）後の結果のグラフ表示である。

【0038】

（配列の簡単な説明）
配列番号１は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＨ−ＣＤＲ１と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。

【0039】

配列番号２は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＨ−ＣＤＲ２と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。

【0040】

配列番号３は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＨ−ＣＤＲ３と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。

【0041】

配列番号４は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＬ−ＣＤＲ１と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。

【0042】

配列番号５は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＬ−ＣＤＲ２と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。

【0043】

配列番号６は、本明細書中でＲＮ９１１−ＶＬ−ＣＤＲ３と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。

【0044】

配列番号７は、本明細書中でＳＳＭ５７−ＶＨ−ＣＤＲ１と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。

【0045】

配列番号８は、本明細書中でＳＳＭ５８−ＶＨ−ＣＤＲ１と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。

【0046】

配列番号９は、本明細書中でＬＴＭ１０９−ＶＨ−ＣＤＲ３およびＳＳＭ５７−ＶＨ ＣＤＲ３と呼ばれる可変重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。

【0047】

配列番号１０は、本明細書中でＬＴＭ１０９−ＶＬ−ＣＤＲ１と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。

【0048】

配列番号１１は、本明細書中でＳＳＭ５７−ＶＬ−ＣＤＲ２と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。

【0049】

配列番号１２は、本明細書中でＬＴＭ１０９−ＶＬ−ＣＤＲ３と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。

【0050】

配列番号１３は、本明細書中でＳＳＭ６６−ＶＨ−ＣＤＲ２およびＳＳＭ５７−ＶＨＣＤＲ２と呼ばれる可変軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。

【0051】

配列番号１４は、本明細書中でＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0052】

配列番号１５は、本明細書中でＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0053】

配列番号１６は、本明細書中でＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0054】

配列番号１７は、本明細書中でＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0055】

配列番号１８は、本明細書中でＣＡＮ−６１８−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0056】

配列番号１９は、本明細書中でＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0057】

配列番号２０は、本明細書中でＣＡＮ−６１８ＦＷ１−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0058】

配列番号２１は、本明細書中でＣＡＮ−６１８ＦＷ２−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0059】

配列番号２２は、本明細書中でＣＡＮ−６１８ＦＷ３−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0060】

配列番号２３は、本明細書中でＣＡＮ−６１８ＦＷ４−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0061】

配列番号２４は、本明細書中でＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0062】

配列番号２５は、本明細書中でＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0063】

配列番号２６は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬと呼ばれる可変軽鎖のアミノ酸配列である。

【0064】

配列番号２７は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0065】

配列番号２８は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0066】

配列番号２９は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0067】

配列番号３０は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬと呼ばれる可変重鎖のアミノ酸配列である。

【0068】

配列番号３１は、本明細書中でＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0069】

配列番号３２は、本明細書中でＭＵ−ＲＮ９１１−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0070】

配列番号３３は、本明細書中でＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0071】

配列番号３４は、本明細書中でＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0072】

配列番号３５は、本明細書中でＣＡＮ−６１８−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0073】

配列番号３６は、本明細書中でＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0074】

配列番号３７は、本明細書中でＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0075】

配列番号３８は、本明細書中でＣＡＮ−ＬＴＭ１０９−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0076】

配列番号３９は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0077】

配列番号４０は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0078】

配列番号４１は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0079】

配列番号４２は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨｎｔと呼ばれる可変重鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0080】

配列番号４３は、本明細書中でＣＡＮ−ＳＳＭＱＣ２３−ＶＬｎｔと呼ばれる可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。

【0081】

配列番号４４は、本明細書中でＣＡＮ−６５Ｅ−ＨＣと呼ばれるイヌ重鎖定常領域のアミノ酸配列である。

【0082】

配列番号４５は、本明細書中でＣＡＮ−６５Ｅ−ＨＣｎｔと呼ばれるイヌ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列である。

【0083】

配列番号４６は、本明細書中でＣＡＮ−ＫＡＰＰＡ−ＬＣと呼ばれるイヌカッパ定常軽鎖領域のアミノ酸配列である。

【0084】

配列番号４７は、本明細書中でＣＡＮ−ＫＡＰＰＡ−ＬＣｎｔと呼ばれるイヌカッパ定常軽鎖領域のヌクレオチド配列である。

【0085】

配列番号４８は、本明細書中でＣＡＮ−６５ ＨＣｎｔと呼ばれるイヌ重鎖定常領域のヌクレオチド配列である。

【0086】

配列番号４９は、本明細書中でＣＡＮ−６５ ＨＣと呼ばれるイヌ重鎖定常領域のアミノ酸配列である。

【0087】

配列番号５０は、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ神経成長因子Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＹ１６１９５のアミノ酸配列である。

【0088】

配列番号５１は、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ神経成長因子のヌクレオチド配列である。

【発明を実施するための形態】

【0089】

（発明の詳細な説明）
本明細書に開示される発明は、高親和性でイヌＮＧＦを結合するイヌ化抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質を提供する。本発明はさらに、上記抗原結合タンパク質の変異型であるイヌＮＧＦにも結合するイヌ化抗原結合タンパク質およびポリペプチド、ならびにこれらの抗原結合タンパク質を作成する方法および使用する方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、上記抗原結合タンパク質および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。本明細書に開示される発明は、治療有効量のイヌ化抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質の投与によってイヌの痛みを予防および／または治療するための方法もまた提供する。

【0090】

（一般的技術）
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、そのようなものとして、変動してもよいことが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためであって、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明は特許請求の範囲によってのみ規定される。

【0091】

他に規定されない限り、本明細書に記載される抗体に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって共通して理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むべきであり、複数形の用語は単数形を含むべきである。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションと関連して利用される命名法、および技術は、周知でありかつ当該分野において共通して使用されるものである。

【0092】

同定されたすべての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用されるかもしれないこのような刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的のために、明確に参照により組み込まれる。これらの刊行物は、単に、本願の出願日の前のこれらの開示のために提供される。

【0093】

標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養およびトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応および精製技術は、製造者の説明書に従って、または当該分野において共通して達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。一般的に、前述の技術および手順は、当該分野において周知でありかつ記載されるような従来的な方法に従って実施されるが、本明細書の全体にわたって引用および議論される様々な一般的文献およびより特定の文献に限定されない。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（３^rd ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｊ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．１．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｙ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）を参照のこと。

【0094】

操作の例、または他に示される場合以外では、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表現するすべての数字は、「約」という用語によりすべての場合において修飾されると理解されるべきである
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明の文脈において使用されるいくつかの用語が定義される。これらの用語に加えて、他の用語は必要に応じて明細書中の他の箇所で定義される。本明細書中で他に明確に定義されない限り、本明細書中で使用される当該分野の用語は、それらの分野で認識されている意味を有する。

【0095】

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈が明確に反対を指示していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「抗体」という言及は、複数のこのような抗体を含む。

【0096】

本明細書で使用される場合、「備える」という用語は、組成物および方法が、列挙された構成要素を含むが、他の構成要素を除外しないことを意味することが意図される。

【0097】

本明細書で使用される場合、「神経成長因子」および「ＮＧＦ」という用語は、ＮＧＦの生物学的活性の少なくとも一部を保持している神経成長因子およびその変異型をいう。

【0098】

「ＮＧＦ受容体」とは、ＮＧＦによって結合されるかまたは活性化されるポリペプチドをいう。ＮＧＦ受容体には、イヌのＴｒｋＡ受容体、およびより低い程度では、ｐ７５受容体が含まれる。

【0099】

一般的に、ＮＧＦの「生物学的活性」とは、ＮＧＦ受容体に結合し、および／またはＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力をいう。限定するわけではないが、生物学的活性には、以下の任意の１つ以上が含まれる：ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５など）を結合する能力；ＴｒｋＡ受容体のダイマー化および／または自己リン酸化を促進する能力；ＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力；細胞の分化、増殖、生存、成長、ならびに、（ニューロンの場合においては、末梢ニューロンおよび中枢ニューロンを含む）ニューロンの形態の変化、シナプス形成、シナプス機能、神経伝達物質および／またはニューロペプチド放出、ならびに損傷後の再生を含む、細胞生理学における他の変化を促進する能力；マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存を促進する能力；ならびに手術後の痛みを含む、痛みを媒介する能力。

【0100】

本明細書で使用される場合、「抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質」（交換可能に「抗ＮＧＦ抗体」および「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」と呼ばれる）とは、ＮＧＦに結合し、かつＮＧＦシグナル伝達によって媒介されるＮＧＦ生物学的活性および／または下流経路を阻害することが可能である、抗原結合タンパク質をいう。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ＮＧＦシグナル伝達によって媒介される下流経路を含む、ＮＧＦ生物学的活性を遮断、拮抗、抑制、もしくは減少させる（顕著なものを含む）抗体、ならびに／または受容体結合および／もしくはＮＧＦに対する細胞応答の誘発などの、ＮＧＦがその受容体であるｔｒｋＡに結合することを阻害する抗体を包含する。本発明の目的のために、「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」という用語が、すべての以前に同定された用語、タイトル、ならびに機能的な状態および特徴を包含し、それによって、ＮＧＦそれ自体、ＮＧＦの生物学的活性（手術後の痛みの任意の局面を媒介する能力を含むがこれに限定されない）、または生物学的活性の結果が、任意の意味のある程度、実質的に無効にされ、減少され、または中和されることが明確に理解される。ある実施形態において、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体はＮＧＦを結合し、そしてＮＧＦダイマー化および／またはＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよび／またはｐ７５など）への結合を妨害する。他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦを結合し、そしてＴｒｋＡ受容体のダイマー化および／またはＴｒｋＡの自己リン酸化を妨害する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の例は本明細書において提供されている。

【0101】

本明細書で使用される場合、交換可能に使用されてもよい「抗原結合タンパク質」、「抗体」などの用語は、抗原結合部位を備える、ポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することが可能であるインタクトな免疫グロブリンをさらに提供する。インタクトな抗体は２つの軽鎖および２つの重鎖を有する。従って、単独の単離されたインタクトな抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヘテロキメラ抗体であってもよい。「抗原結合タンパク質」「抗体」という用語は、好ましくは、ＮＧＦタンパク質およびそのフラグメントに結合できる、モノクローナル抗体およびそのフラグメント、およびその免疫学的結合等価物をいう。抗体および抗原結合タンパク質という用語は、均一な分子、または複数の異なる分子的な実体から作られた、血清製品などのような混合物をいうために使用される。本明細書で使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するのみならず、そのフラグメントもまた包含する。本発明の目的のために、「抗体」および「抗原結合タンパク質」は、他に言及されない限り、抗体フラグメントもまた含む。例示的な抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ディアボディ、これらの抗原認識フラグメント、小モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、ＩｇＮＡＲ分子、および、当業者によって、抗原結合タンパク質または抗体フラグメントであると認識されているすべての同様のもの、および任意の上述のフラグメント、およびそれらの化学的にまたは遺伝子的に操作された対応物、ならびに他の抗体フラグメントおよびその変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、および抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成が含まれる。抗体および抗原結合タンパク質は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５４９９（１９７５））、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１５９７（１９９１））を介して作製できる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８ならびに当業者に周知である他の技術を参照のこと。

【0102】

本明細書に定義されるような「モノクローナル抗体」は、単一クローンの細胞によって産生される抗体であり（具体的には、ハイブリドーマ細胞の単一クローン）、それゆえに、単一の純粋な均質な型の抗体である。同じクローンから産生されたすべてのモノクローナル抗体は同一であり、同じ抗原特異性を有する。モノクローナル抗体は、そのモノクローナル抗体が抗原の選択的結合に関与しているアミノ酸（天然に存在するかまたは天然に存在しない）から構成されている、均質な抗体集団である。モノクローナル抗体の集団は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して方向付けられている。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体を包含するのみならず、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ディアボディ、これらの抗原認識フラグメント、小モジュール免疫医薬（ＳＭＩＰ）ナノボディ、ＩｇＮＡＲ分子など）、これらの変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ならびに必要とされる特異性および抗原に結合する能力の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成もまた包含する。抗体の供給源またはそれが作られた様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物による、など）に関しては、限定されることは意図されない。

【0103】

本発明のモノクローナル抗体は、具体的に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であるのに対して、残りの鎖は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、他の種から誘導された抗体中の対応する配列、ならびにこのような抗体のフラグメントと同一であるかまたは相同である。典型的には、キメラ抗体は、それらの軽鎖および重鎖の遺伝子が、典型的には、遺伝子操作によって、異なる種に属する抗体の可変領域および定常領域の遺伝子から構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントが、イヌ定常セグメントに結合されてもよい。図２は、マウス：イヌＩｇＧの１つの実施形態の一般的構造の略図である。この実施形態において、抗原結合部位はマウスから誘導されているのに対して、Ｆｃ部分はイヌである。

【0104】

本明細書で定義されるような「ヘテロキメラ」という用語は、抗体鎖の１つ（重鎖または軽鎖）がイヌ化されており、一方他はキメラである抗体をいう。図４は、ヘテロキメラ分子の１つの実施形態を描写する。この実施形態において、イヌ化可変重鎖（ここでは、すべてのＣＤＲがマウスであり、すべてのＦＲがイヌである）はキメラ可変軽鎖（ここでは、すべてのＣＤＲがマウスであり、すべてのＦＲがマウスである）と対になっている。この実施形態において、可変重鎖と可変軽鎖の両方がイヌの定常領域と融合されている。

【0105】

「イヌ化」型の非イヌ（例えば、マウス）抗体は、非イヌ免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、遺伝子操作された抗体である。「イヌ化」は、イヌにおける治療学として有用である治療を生成するために、非イヌ抗原結合情報を、ドナー抗体から、免疫原性がより少ないイヌ抗体アクセプターまで移すための方法として定義される。イヌ化抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、サメ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒト化、組換え配列、または所望の特性、特異性、親和性、および収容能力を有する操作された配列などの非イヌ種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によってレシピエントの超可変領域残基が置き換えられている、イヌの免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、イヌの免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非イヌ残基によって置き換えられている。さらに、イヌ化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見い出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させるために行われる。本明細書に記載されるような超可変領域および／またはフレームワーク領域に対する修飾は、当業者に公知である実験に基づき、各々別々に操作され、スペシエーションされた（イヌ化）抗体について決定され、そして上記の実験の前には予測できない。一般的に、イヌ化抗体は、少なくとも１つの実質的にすべて、典型的には２つの可変ドメインを含み、そこでは、すべてまたは実質的にすべての超可変領域が非イヌの免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのＦＲがイヌの免疫グロブリン配列のものである。イヌ化抗体は、選択的に、完全な、または少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、イヌの免疫グロブリンのそれを備える。図３は、マウスＩｇＧのスペシエーションまたはイヌ化を示す１つの実施形態の図解である。この実施形態において、マウスＣＤＲはイヌのフレームワークに移植される。ある場合において、超可変領域の外側であるその中のマウスフレームワークまたは残基は維持されている。

【0106】

「組換えイヌ抗体」という語句は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え、コンビナトリアルイヌ抗体ライブラリーから単離された抗体、イヌの免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照のこと）、またはイヌ免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列までスプライシングすることを含んでいる任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたイヌ抗体を含む。

【0107】

「イヌ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、標的に対して生成され、そして当業者に周知でありかつ本明細書に記載されているハイブリドーマ法によって調製されるイヌ抗体をいう。

【0108】

「ネイティブ抗体」および「ネイティブ免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖と軽鎖もまた、規則的に間隔の空いた鎖間のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し（ＶＬ）、その他方の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと一緒に配列されており、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一緒に配列されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。図１は、抗原結合部位を強調表示する、ネイティブマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）の一般的構造の一例である。

【0109】

本明細書における「親の」抗体とは、変異型の調製のために使用されるアミノ酸配列によってコードされているものである。好ましくは、親の抗体は、イヌのフレームワーク領域を有し、そして、存在する場合、イヌ抗体定常領域を有する。例えば、親の抗体はイヌ化抗体またはイヌ抗体であり得る。

【0110】

抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、様々なクラスに割り当てることができる。現在では、５つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ、およびＩｇＡ₂に分けられてもよい（マウスおよびヒトの指定によって規定されるように）。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとそれぞれ呼ばれている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は、複数の種において周知である。これらの定常ドメインと関連がある個別のアイソタイプおよび機能活性の普及は種特異的であり、実験的に規定されなければならない。

【0111】

任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（Ｋ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別できる型のうちの１つに割り当てることができる。

【0112】

抗体の「可変領域」は、単独かまたは組み合わせたかのいずれかである、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々が、超可変領域としてもまた知られる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖の中のＣＤＲは、ＦＲによって密接な近くに一緒に保持されており、そして他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために少なくとも２つの技術が存在する：（１）近い種の配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；ＡＩ−Ｉａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｉ．２７３：９２７−９４８））。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによって、または両方のアプローチの組み合わせによって定義されるＣＤＲをいってもよい。

【0113】

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）、上記）からのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基を備える（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるような超可変領域以外の可変ドメイン残基である。

【0114】

本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用し、かつ
抗体に抗原についての抗体の特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含有する抗体
分子の一部をいう。抗体結合領域は、抗原−結合残基の適切なコンホメーションを維持す
るために必要である「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。

【0115】

「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つののエフェクター機
能を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性
（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；新生児受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（Ａ
ＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレ
ーション、などが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的には、Ｆｃ領域が、
結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、そしてこ
のような抗体エフェクター機能を評価するために、当該分野で公知である様々なアッセイ
を使用して評価できる。

【0116】

「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見い出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一で
あるアミノ酸配列を備える。「変異型Ｆｃ領域」または「変異した」または「変異体」Ｆ
ｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、ネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸
配列とは異なるアミノ酸配列を備え、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェ
クター機能を保持してもよいし、保持しなくてもよい。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、
ネイティブ配列Ｆｃ領域または親のポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つの
アミノ酸置換、例えば、約１個〜約１０個のアミノ酸置換、および好ましくは、ネイティ
ブ配列Ｆｃ領域または親のポリペプチドのＦｃ領域における約１個〜約５個のアミノ酸置
換を有する。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域
および／または親のポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性を保有し
、そして最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、そ
れと少なくとも約９５％の配列同一性を保有する。変異型または変異したＦｃ領域はまた
、抗体のＦｃ領域の機能を本質的に排除してもよい。例えば、Ｆｃ領域変異は、抗体のエ
フェクター機能を排除してもよい。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、
変異したＦｃ領域を備える。

【0117】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲはネイティブ配列ＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これには、これらの受容体の対立遺伝子多型および選択的スプライシング型が含まれる。ＦｃｙＲＩＩ受容体には、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃｙＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主としてそれらの細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１において概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、母体のＩｇＧの胎児への移動の原因である、新生児受容体、ＦｃＲｎもまた含まれる（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９）。

【0118】

本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応をいう。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを使用して評価できる。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されるもののような動物モデルにおいて、評価されてもよい。

【0119】

「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的の溶解をいう。補体活性化経路は、同種抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）において記載されたようなＣＤＣアッセイが実施されてもよい。

【0120】

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを産生し、各々が単一の抗原結合部位、および残りの「Ｆｃ」フラグメントを有し、この名称は容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能である、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを生み出す。

【0121】

Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有しているＦａｂ’についての本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた公知である。

【0122】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合的な会合である、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が、Ｖ_H−Ｖ_Lダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するのはこの立体配置の中である。集合的に、６個の超可変領域は、抗原結合の特異性を抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのみの超可変症域を備えるＦｖの半分）でさえもが抗原を認識および結合する能力を有するが、全体の結合部位よりも低い親和性である。

【0123】

「抗原」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるような抗原結合タンパク質または抗体のＣＤＲによって認識される抗原決定基をいう。換言すれば、エピトープとは、抗体によって認識可能であり、そして抗体によって結合可能である任意の分子の一部をいう。他に示されない限り、「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質／抗体／因子が結合するＮＧＦの領域をいう。

【0124】

「抗原結合ドメイン」、「抗体の活性フラグメント」などの用語は、抗原の一部またはすべてに対して特異的に結合するか、または相補的である領域を備える抗体または抗原結合タンパク質の部分をいう。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合してもよい。「エピトープ」、「エピトープの活性フラグメント」、または「抗原決定基」などは、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因である抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなる、いわゆるＦｄ抗体フラグメント）によって提供されてもよい。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を備えてもよい（米国特許第５，５６５，３３２号）。

【0125】

抗体の「結合部分」（または「抗体部分」）または抗原結合ポリペプチドなどの用語は、１つ以上の完全なドメイン、例えば、完全なドメインの対、ならびに、抗原、例えば、ＮＧＦに特異的に結合する能力を保持している抗体のフラグメントを含む。抗体の結合機能は全長抗体のフラグメントによって実施できることが示されてきた。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な切断によって産生される。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、単鎖、単鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ、および単一ドメイン抗体（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，２６：２３０−５）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを備える二価フラグメントである。ＦｄフラグメントはＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなり、そしてＦｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる。ｄＡｂフラグメントはＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子によってコードされる一方、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が一価分子を形成するために対となる単鎖タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、連結できる（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。このような単鎖抗体はまた、抗体の「結合部分」という用語の中に包含されることが意図される。ディアボディなどの他の型の単鎖抗体もまた包含される。ディアボディは、二価の、二特異的抗体であり、ここでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対を作ることを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、別の鎖の相補的ドメインと対を作ることをドメインに強制し、そして、２つの抗原結合部位を作製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。抗体またはその結合部分はまた、抗体または抗体部分の、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的な会合によって形成される、より大きな免疫付着分子の一部であってもよい。このような免疫付着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作るためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）、および二価かつビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）の使用が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの結合フラグメントは、それぞれ、全体の抗体の、パパインまたはペプシン消化などの従来的な技術を使用して、全体の抗体から調製できる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫付着分子は、本明細書に記載されているような、および当該分野に公知であるような、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。「二特異的」または「二機能的」抗体以外は、抗体は、同一であるその結合部位の各々を有すると理解される。「二特異的」または「二機能的抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二特異的抗体はまた、介在定常領域を伴う２つの抗原結合領域を含むことができる。二特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって産生できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１，１９９０．；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照のこと。

【0126】

「復帰突然変異」という用語は、イヌ抗体の体細胞変異したアミノ酸のいくつかまたはすべてが相同生殖系列抗体配列からの対応する生殖系列残基で置き換えられるプロセスをいう。本発明のイヌ抗体の重鎖および軽鎖の配列は、最高の相同性を有する配列を同定するために、生殖系列配列と別々に整列される。本発明のイヌ抗体の差異は、このような異なるアミノ酸をコードする規定されたヌクレオチド位置を変異させることによって、生殖系列配列に戻される。復帰突然変異のための候補としてこのように同定された各アミノ酸の役割は、抗原結合における直接的または間接的な役割について調べられるべきであり、そしてイヌ抗体の任意の望ましい特徴に影響を与えることが変異後に見い出された任意のアミノ酸は、最終的なイヌ抗体の中に含められるべきでではない；一例として、選択的変異誘発アプローチによって同定された、活性を増強させるアミノ酸は、逆変異誘発には供せられない。最も近い生殖系列配列とは異なるが、第２の生殖系列における対応するアミノ酸と同一であることが見い出されたこれらのアミノ酸の位置は、第２の生殖系列配列が本発明のイヌ抗体の配列と同一でありかつ共線的であるならば、逆変異誘発に供せられるアミノ酸の数を最小化するために、そのままの状態であり得る。対応するドナー残基への選択された標的フレームワーク残基の復帰突然変異は、親和性を回復し、およびまたは改善するために必要とされるかもしれない。

【0127】

本明細書で使用される場合、抗体の「免疫特異的」結合とは、抗体の抗原結合部位と、その抗体によって認識される特定の抗原の間で起こる抗原特異的な結合相互作用をいう（すなわち、抗体は、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいてタンパク質と反応し、そして関連がないタンパク質とは検出可能に反応しない）。抗体またはポリペプチドに「特異的に結合」または「優先的に結合」（本明細書で交換可能に使用される）エピトープは、当該分野において十分に理解されている用語であり、このような特異的または優先的な結合を決定する方法はもまた、当該分野において周知である。分子は、代わりの細胞または物質よりも、より頻度が高く、より迅速に、より長期間、および／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合するならば、「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すといわれる。抗体は、他の物質に結合するよりも、より親和性が高く、より結合力が高く、より容易に、および／またはより長期間結合するならば、標的に「特異的に結合」または「優先的に結合」する。例えば、あるＮＧＦエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、他のＮＧＦエピトープまたは非ＮＧＦエピトープに結合するよりも、より親和性が高く、より結合力が高く、より容易に、および／またはより長期間、このＮＧＦエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第２の抗体に特異的にまたは優先的に結合してもよいし、結合しなくてもよいこともまた理解される。このようなものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも要求しない（それを含めることはできるが）。一般的に、必ずしも必要ではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。

【0128】

抗体結合の文脈での「特異的に」という用語は、特異的抗原、すなわち、ポリペプチドまたはエピトープへの抗体の高結合力および／または高親和性結合をいう。抗体特異的にある抗原を結合することは、同じ抗体の他の抗原への結合よりも強力である。あるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが、なお検出可能なレベルで、他のポリペプチドを結合することが可能であり得る（例えば、目的のポリペプチドへの示される結合の１０％以下）。このような弱い結合、すなわち、バックグラウンド結合は、例えば、適切な対照の使用によって、対象のポリペプチドへの特異的抗体結合から容易に識別できる。一般的に、特異的抗体は、１０^-7Ｍ以下、例えば、１０^-8Ｍ以下、例えば、１０^-9Ｍ以下、１０^-10以下、１０^-11以下、１０^-12以下、または１０^-13以下、などのＫ_dの結合親和性で抗原に結合する。

【0129】

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗原決定基との単一の抗原結合部位の結合の強化をいう。親和性は、抗体または抗原結合タンパク質結合部位と、抗原決定基の間の立体化学的な一致の密接さ、これらの間の接触の領域のサイズ、電荷を有する基と疎水性基の分布などに依存する。抗体の親和性は、平衡分析によって、または表面プラズモン共鳴−「ＳＰＲ」法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））によって測定できる。ＳＰＲ法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象に依存しており、これは、表面プラズモン波が金属／液体の界面で励起されるときに起こる。光は、サンプルと接触していない表面の側に方向付けられ、そこから反射し、そしてＳＰＲは、特定の角度と波長の組み合わせで光強度の反射の減少を引き起こす。生体分子結合事象は、表面層における屈折率の変化を引き起こし、これは、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。

【0130】

「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことが意図される。解離定数、Ｋｄ、および結合定数、Ｋａは、親和性の定量的な尺度である。平衡状態においては、遊離の抗原（Ａｇ）および遊離の抗体（Ａｂ）は、抗原−抗体複合体（Ａｇ−Ａｂ）と平衡状態にあり、そして速度定数、ｋａおよびｋｄは、個々の反応の速度を定量する。平衡状態においては、ｋａ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｄ［Ａｇ−Ａｂ］である。解離定数、Ｋｄは：Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ−Ａｂ］によって与えられる。Ｋｄは濃度の単位を有し、最も典型的には、Ｍ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどである。Ｋｄとして表現された抗体親和性を比較するとき、ＮＧＦについてより高い親和性を有することは、より低い値によって示される。結合定数、Ｋａは：Ｋａ＝ｋａ／ｋｄ＝［Ａｇ−Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］によって与えられる。Ｋａは濃度の逆数の単位であり、最も典型的には、Ｍ^-1、ｍＭ^-1、μＭ^-1、ｎＭ^-1、ｐＭ^-1、などである。本明細書で使用される場合、「結合力」という用語は、可逆的複合体の形成後の抗原−抗体結合の強さをいう。抗ＮＧＦ抗体は、約（より低いＫｄ値）から約（より高いＫｄ値）までの範囲の解離定数（Ｋｄ）を伴う結合として、ＮＧＦタンパク質へのそれらの結合についてのＫｄによって、特徴付けられてもよい。

【0131】

「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために本明細書で交換可能に使用される。このポリマーは直鎖状であってもよく、分枝鎖であってもよく、これは修飾アミノ酸を備えてもよく、そしてこれは非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入によって；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化などの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。この定義の中には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当該分野において公知である他の修飾を含有するポリペプチドもまた含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているので、ポリペプチドは単鎖または会合した鎖として存在することができることが理解される。

【0132】

「保存性アミノ酸置換」という用語は、所定のアミノ酸残基についての任意のアミノ酸置換を示し、ここでは、置換残基は、所定の残基と化学的に類似であるので、ポリペプチド機能（例えば、酵素活性）の実質的な減少は生じない。保存性アミノ酸置換は、当該分野において一般に公知であり、その例は、例えば、米国特許第６，７９０，６３９号、同第６，７７４，１０７号、同第６，１９４，１６７号、または同第５，３５０，５７６号に記載されている。好ましい実施形態において、保存性アミノ酸置換は、以下の６つのグループの１つの中に存在するいずれかである：
・１．小さな脂肪族、実質的に非極性の残基：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ；
・２．大きな脂肪族、非極性残基：ｌｉｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌ；Ｍｅｔ；
・３．極性、負に荷電した残基およびそれらのアミド：ＡｓｐおよびＧｌｕ；
・４．極性、負に荷電した残基のアミド：ＡｓｎおよびＧｉｎ；Ｈｉｓ；
・５．極性、正に荷電した残基：ＡｒｇおよびＬｙｓ；Ｈｉｓ；ならびに
・６．大きな芳香族残基：ＴｒｐおよびＴｙｒ；Ｐｈｅ。

【0133】

好ましい実施形態において、保存性アミノ酸置換は、ネイティブ残基（保存性置換）対として列挙されている以下のいずれか１つである：Ａｌａ（Ｓｅｒ）；Ａｒｇ（Ｌｙｓ）；Ａｓｎ（Ｇｉｎ；Ｈｉｓ）；Ａｓｐ（Ｇｌｕ）；Ｇｉｎ（Ａｓｎ）；Ｇｌｕ（Ａｓｐ）；Ｇｌｙ（Ｐｒｏ）；Ｈｉｓ（Ａｓｎ；Ｇｉｎ）；ｌｉｅ（Ｌｅｕ；Ｖａｌ）；Ｌｅｕ（ｌｉｅ；Ｖａｌ）；Ｌｙｓ（Ａｒｇ；Ｇｉｎ；Ｇｌｕ）；Ｍｅｔ（Ｌｅｕ；ｌｉｅ）；Ｐｈｅ（Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ）；Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）；Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）；Ｔｒｐ（Ｔｙｒ）；Ｔｙｒ（Ｔｒｐ；Ｐｈｅ）；およびＶａｌ（ｌｉｅ；Ｌｅｕ）。

【0134】

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」などの用語は、本明細書では交換可能に使用されてもよく、ＤＮＡおよびＲＮＡの中の一連のヌクレオチド塩基（ヌクレオチドとも呼ばれる）をいう。この核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはこれらのアナログを含有してもよい。「核酸」という用語は、例えば、単鎖分子および二本鎖分子を含む。核酸は、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、組換え核酸、プラスミド、および他のベクター、プライマー、およびプローブであり得る。５’から３’（センス）と３’から５’（アンチセンス）の両方のポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを備えてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前後で付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合体化などによって、ポリマー化の後でさらに修飾されてもよい。他の型の修飾には、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、荷電していない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメートなど）および荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を伴うもの、ペンダント部分を含有するもの、例えば、タンパク質など（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーターを伴うもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ボロン、酸化金属など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾リンカーを伴うもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびに非修飾型のポリペプチドが含まれる。さらに、糖の中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えられてもよく、標準的な保護基によって保護されてもよく、または、さらなるヌクレオチドにさらなる連結を準備するために活性化されてもよく、あるいは、固体支持体に結合体化されてもよい。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化でき、またはアミンもしくは１個〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置き換えできる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当該分野において一般的に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似型を含有でき、これには、例えば、２’−０−メチル−、２’−０−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖アナログ、アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えば、メチルリボシドが含まれる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置き換えられてもよい。これらの代替の連結基には、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられており、各ＲまたはＲ’は、独立してＨまたは置換されたもしくは置換されていない、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を任意に含有する、アルキル（１−２０Ｃ）である実施形態が含まれるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。先の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。

【0135】

本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、目的の１つ以上の遺伝子または配列を宿主細胞中に送達し、そして好ましくは発現することが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤が付随するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えば、プロデューサー細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載されるようなベクターは、核酸の転写を方向付ける核酸配列であることを意味する発現制御配列を有する。発現制御配列は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであるか、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に「作動可能に連結」されている。核酸は、別の核酸配列との機能的関連性に置かれているときに、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするために配置されるならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合には、連続的でありかつリーディングフェーズの中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続的でなければならないわけではない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実務に従って使用される。

【0136】

ちょうどポリペプチドが保存性アミノ酸置換を含有するかもしれないのと同様に、それらのポリヌクレオチドは、保存性コドン置換を含有してもよい。コドン置換は、発現したときに、それが上記のように保存性アミノ酸置換を産生するならば、保存性であると見なされる。アミノ酸の置換を生じない縮重コドン置換もまた、本発明に従うポリヌクレオチドにおいて有用である。従って、例えば、本発明の１つの実施形態において有用である選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それを用いて形質転換される発現宿主細胞によって示されるコドン使用頻度に近似するため、または他にその発現を改善するために、縮重コドン置換によって変異されてもよい。

【0137】

「変異型」抗ＮＧＦ抗体は、本明細書では、親の抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、および／または置換によって「親の」抗ＮＧＦ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、ならびに親の抗ＮＧＦ−抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する分子をいう。変異型抗ＮＧＦは、本明細書に記載されるように、抗体の超可変領域において保存性アミノ酸置換を備えてもよい。所望される活性には、特異的に抗原を結合する能力、動物においてＮＧＦ活性を減少し、阻害し、または中和する能力を含めることができる。１つの実施形態において、変異型は、親の抗体の１つ以上の超可変領域および／またはフレームワーク領域において１つ以上のアミノ酸置換を備える。例えば、変異型は、親の抗体の１つ以上の超可変領域および／またはフレームワーク領域において、少なくとも１つ、例えば、約１個〜約１０個、好ましくは、約２個〜約５個の置換を備えてもよい。通常、変異型は、親の抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％。そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列を整列し、ギャップを導入した後で、親の抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または挿入はどれも、配列同一性または相同性に影響を与えると解釈されるべきではない。変異型はＮＧＦを結合する能力を保持し、好ましくは、親の抗体と同程度または親より優れた所望の活性を有する。例えば、変異型は、より強力な結合親和性、動物においてＮＧＦ活性を減少、阻害、もしくは中和する増強された能力、ならびに／またはＮＧＦがＴｒｋ Ａおよびｐ７５に結合することを阻害する増強された能力を有してもよい。

【0138】

高親和性ＮＧＦ受容体と見なされているＴｒｋ Ａは、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体（ＮＴＫＲ）ファミリーのメンバーである。このキナーゼは、ニューロトロフィン結合の際に、それ自体をリン酸化（自己リン酸化）し、そしてＭＡＰＫ経路のメンバーをリン酸化する、膜結合型受容体である。このキナーゼの存在は細胞分化に導き、感覚ニューロンサブタイプを特定する際に役割を果たすかもしれない。ｐ７５受容体は、低親和性ＮＧＦ受容体と見なされている。

【0139】

「変異型」核酸とは、本明細書では、「親の」核酸とは配列が異なる分子をいう。ポリヌクレオチド配列の相違は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、または付加などの突然変異的な変化から生じるかもしれない。これらの変化の各々は、所定の配列において、単独でまたは組み合わせて、１回以上起こるかもしれない。

【0140】

「単離された」という用語は、物質（例えば、抗体または核酸）が、その天然の環境の成分から分離および／または回収されていることを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、その物質についての診断的または治療的使用と干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含むかもしれない。核酸に関しては、単離された核酸は、染色体中で通常付随している５’から３’の配列から分離されているものを含んでもよい。好ましい実施形態において、この物質は、その物質の９５重量％より上まで精製され、最も好ましくは、９９重量％より上である。単離された物質は、組換え細胞中の物質をインサイチュで含む。なぜなら、その物質の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在していないからである。しかし、通常、単離された物質は少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0141】

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞系統」、および「細胞培養」という用語は、交換可能に使用されてもよい。これらのすべての用語はまた、それらの子孫も含み、これらは、任意のおよびすべての次に続く世代である。意図的な変異または故意でない変異に起因して、すべての子孫は同一でなくてもよいことが理解される。異種核酸配列を発現することの文脈において、「宿主細胞」とは、インビトロで配置されるかまたはインビボで配置されるかに関わらない、原核生物または真核生物（例えば、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞）をいう。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物の中に配置されてもよい。宿主細胞は、ベクターのためのレシピエントとして使用でき、そしてベクターを複製し、および／またはベクターによってコードされている異種核酸を発現することが可能である、任意の形質転換可能な生物を含んでもよい。

【0142】

「標識」という言葉は、本明細書で使用されるとき、抗体または核酸に直接的または間接的に結合体化されている、検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体、それ自体によって検出可能であってもよく（例えば、ラジオアイソトープ標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。

【0143】

「被験体」または「患者」とは、本発明の分子によって影響を受けることができる、治療の必要がある動物をいう。本発明に従って治療できる動物には脊椎動物が含まれ、イヌなどの哺乳動物は特に好ましい例である。

【0144】

「組成物」は、化学的組成物、生物学的組成物、または生物学的治療剤（特に、本明細書に記載されるような抗原結合タンパク質）、および、不活性（例えば、標識）または活性な、例えば、アジュバントであり得る別の化合物または組成物であるか否かに関わらず、活性薬剤の組み合わせを意味することが意図される。

【0145】

本明細書で使用される場合、本発明における使用のために適切な「薬学的に受容可能なキャリア」は、当業者に周知である。このようなキャリアには、非限定的に、水、緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。他の従来的に利用される希釈剤、アジュバント、および賦形剤は、従来的な技術に従って加えられてもよい。このようなキャリアには、エタノール、ポリオール、および適切なそれらの混合物、植物油、および注射用有機エステルを含むことができる。緩衝液およびｐＨ調整剤もまた、利用されてもよい。緩衝液には、非限定的に、有機酸または塩基から調製された塩が挙げられる。代表的な緩衝液には、非限定的に、クエン酸の塩などの有機酸塩、例えば、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン−Ｈｅｌ、炭酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、またはフタル酸塩、Ｔｒｉｓ、トリメタミン（ｔｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）塩酸塩、またはリン酸緩衝液が挙げられる。非経口的キャリアには、塩化ナトリウム溶液、リンガー液デキストロース、デキストロース、トレハロース、スクロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油を含めることができる。静脈内キャリアには、体液および栄養補給液、電解質補給液、例えば、リンガー液デキストロースなどに基づくものなどを含めることができる。保存剤、および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、不活性ガスなどのような他の添加物もまた、薬学的キャリアの中で提供されてもよい。本発明は、キャリアの選択によって限定されない。適切なｐＨ、等張性、安定性、および他の便利な特徴を有する、上記の成分からのこれらの薬学的に受容可能な組成物の調製は、当業者の範囲内である、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｕｂ！．，２０００；およびＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔ．，ｅｄｓ．Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ，ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３などのテキストを参照のこと。

【0146】

「治療有効量」（または「有効量」）とは、被験体または患者に投与したときに、有益または所望の結果をもたらすために十分である、活性成分、例えば、本発明に従う薬剤の量をいう。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬量で投与できる。本発明に従う組成物の治療有効量は、当業者によって容易に決定されてもよい。本発明の文脈において、「治療有効量」は、痛みの感覚の緩和または減少などの臨床結果を含む有益なまたは所望の結果をもたらすために十分である、ＮＧＦ関連状態に付随する１つ以上のパラメーターの客観的に測定された変化を産生するものである。有効量は、１回以上の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、手術後の痛み、関節リウマチの痛み、および／または骨関節炎の痛みを含む痛みを治療し、寛解し、その強さを減少し、および／または予防するために十分な量である。ある実施形態において、「有効量」は、休息時の痛み（休息痛）、または機械的に誘導される痛み（動作後の痛みを含む）、または両方を減少させてもよく、これは、痛み刺激の前、その間、またはその後に投与されてもよい。臨床文脈において理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と組み合わせて達成されてもよいし、されなくてもよい。従って、「有効量」は、１種以上の治療剤を投与することの文脈において考慮されてもよいし、１種以上の他の薬剤と組み合わせて、所望の効果が達成されるかもしれないか、または達成されるならば、単一の薬剤が有効量で与えられることが考慮されてもよい。当然、治療有効量は、治療される特定の被験体および状態、被験体の体重および年齢、状態の重篤度、選択された特定の化合物、後に続く投薬計画、投与のタイミング、投与の様式などに依存して変動し、これらのすべてが、当業者によって容易に決定できる。

【0147】

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、疾患、状態、または障害のための治療の全体のスペクトルを包含する。本発明の「治療」剤は、リスクがあると同定できる動物を標的とするように設計された手順を取り込むものを含む、予防的もしくは妨害的な様式で（薬理遺伝学）；または、天然で寛解的もしくは治癒的である様式で作用してもよく；または、治療される疾患もしくは障害の少なくとも１つの徴候の進行の速度もしくは程度を遅延させるように作用してもよい。

【0148】

さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体が治療的または予防的な使用のために提供される、獣医学的組成物を特徴とする。本発明は、特定の抗原、例えば、疾患または状態と関連するものを有するイヌ被験体を治療するための方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載される組換え抗体を用いて、特定の抗原に特異的な治療有効量の組換え抗体を投与する工程を含む。

【0149】

治療効果を産生するために有用な抗体の量は、当業者に周知である標準的な技術によって決定できる。これらの抗体は、薬学的に受容可能な緩衝液中で、標準的な技術によって一般的に提供され、任意の所望の経路によって投与されてもよい。本発明の抗体または抗原結合部分の投与の経路は、経口、非経口、吸入による、または局所的であってもよい。好ましい実施形態において、投与の経路は非経口である。本明細書で使用されるような非経口という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、または腹腔内の投与が含まれる。

【0150】

本明細書で使用される「痛み」とは、急性および慢性の痛み、ならびに炎症性要素を伴う任意の痛みを含む、任意の病因の痛みをいう。痛みの例には、炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷（ｂｕｍ）から生じる痛み、熱傷または創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み（外傷性頭部損傷を含む）、神経障害の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、ならびに癌と関連する痛み（「突出痛」および末期癌と関連する痛みを含む）、末梢神経障害、ならびにヘルペス後神経痛が挙げられる。

【0151】

本明細書で使用される場合、「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のための有益なまたは所望の臨床結果には、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：急性、慢性、炎症性、神経障害性、手術後の痛み、関節リウマチの痛み、または骨関節炎の痛みが挙げられる、痛みの任意の態様の改善または緩和。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：重篤度を軽減すること、任意の痛みの態様を含む痛みと関連する１つ以上の徴候の緩和（痛みの期間の短縮、痛みの感度または感覚の減少など）。

【0152】

ＮＧＦ関連障害とは、本明細書に記載される場合、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、肥満、２型糖尿病、代謝症候群、痛み、および炎症を含む障害をいう。本発明のある実施形態において、ＮＧＦ関連障害とは、痛み、特に、慢性の痛み、炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷（ｂｕｍ）から生じる痛み、熱傷または創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み（外傷性頭部損傷を含む）、神経障害の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、ならびに癌と関連する痛み（「突出痛」および末期癌と関連する痛みを含む）、末梢神経障害、ならびにヘルペス後神経痛をいう。

【0153】

痛みの「発生の減少」とは、重篤度の減少（この状態のために必要なものの減少、および／または、例えば、鎮静剤を含む、この状態のために一般的に使用される他の薬物および／または治療の量（例えば、曝露の量）の減少）、期間の減少、および／または頻度の減少（例えば、個体における手術後の痛みまでの時間を遅延または増加させることを含む）のいずれかを意味する。当業者によって理解されているように、個体は、治療に対するそれらの応答によって変動する可能性があり、このようなものとして、例えば、「個体における関節リウマチの痛みまたは骨関節炎の痛みの発生を減少させる方法」は、このような投与は特定の個体におけるこのような発生の減少を引き起こす可能性が高いという合理的な予想に基づいて、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することを反映している。

【0154】

痛みまたは痛みの１つ以上の徴候（関節リウマチの痛みまたは骨関節炎の痛みなど）を「寛解する」とは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与しないことと比較した場合の、痛みの１つ以上の徴候の軽減または改善を意味する。「寛解」は、徴候の期間の短縮または減少もまた含む。

【0155】

痛みまたは痛みの１つ以上の徴候（関節リウマチの痛みまたは骨関節炎の痛みなど）を「緩和する」とは、本発明に従って抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体で治療された個体または個体の集団における手術後の痛みの１つ以上の望ましくない臨床徴候の程度の軽減を意味する。

【0156】

本明細書で使用される場合、痛みの発症を「遅延する」とは、手術後の痛み、関節リウマチの痛み、または骨関節炎の痛みなどの痛みの進行を引き延ばし、邪魔し、遅くし、遅れさせ、安定させ、および／または延期させることを意味する。この遅延は、疾患および／または治療される個体の履歴に依存して、時間の長さを変化させることであり得る。当業者に明白であるように、十分なまたは意味のある遅延は、事実上、個体が痛みを発症しないという点で予防を包含する。徴候の発症を「遅延する」方法は、この方法を使用しないことと比較して、所定の時間フレームの中で徴候を発症する可能性を減少し、および／または所定の時間フレームの中で症候の程度を減少する方法である。このような比較は、典型的には、被験体の統計学的に有意な数を使用する、臨床研究に基づく。

【0157】

「手術後の痛み」（交換可能に、「切開後」または「外傷後の痛み」と称する）とは、個体の組織への切断、穿刺、切開、裂傷、または創傷などの外部的な外傷（侵襲性か非侵襲性かに関わらず、すべての外科的手順から生じるものを含む）から生じるかまたは起こる痛みをいう。本明細書で使用される場合、手術後の痛みは、外部の身体的な外傷を伴わずに起こる（生じるまたは始まる）痛みを含まない。ある実施形態において、手術後の痛みは、内部または外部（末梢を含む）の痛みであり、創傷、切断、外傷、裂傷、または切開は、偶然に（外傷性創傷のように）または意図的に（外科切開のように）起こるかもしれない。本明細書で使用される場合、「痛み」には、痛覚および痛みの感覚が含まれ、痛みは、痛みスコアおよび当業者に周知である他の方法を使用して、客観的および主観的に評価できる。手術後の痛みには、本明細書で使用される場合、異痛（すなわち、非侵害刺激に対する応答の増加）および痛覚過敏（すなわち、通常侵害性または不快な刺激に対する応答の増加）が含まれ、これらは、次には、天然では、熱的または機械的（触覚的）であり得る。ある実施形態において、手術後の痛みは、熱感受性、機械的感受性、および／または休息痛によって特徴付けられる。ある実施形態において、手術後の痛みは機械的に誘導される痛み、または休息痛を備える。他の実施形態において、手術後の痛みは休息痛を備える。痛みは、当該分野において周知であるように、一次的な痛みまたは二次的な痛みであり得る。

【0158】

本発明の方法が記載される前に、本発明は、特定の方法、および実験条件に限定されないことが理解される。このような方法および条件は変動してもよいからである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するのみのためであり、限定することは意図されないこともまた理解される。なぜなら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるからである。

【0159】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な任意の方法および物質が本明細書の実施または試験において使用できるが、好ましい方法または物質がここで説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物はそれらの全体が参照により組み込まれる。

【0160】

本明細書に記載される本発明は、本明細書に記載されるように「抗原結合タンパク質」という用語と交換可能に使用され、神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合する抗体に関係し、そして、特に、それがハイブリドーマもしくはファージディスプレイ技術によって産生されたイヌ抗体であるか、または完全な「イヌ化」モノクローナル抗体であるかに関わらず、イヌＮＧＦに特異的に結合し、従って、イヌＮＧＦがイヌＴｒｋＡに、そしてより低い程度ではイヌｐ７５受容体に結合することを妨害し、従って、シグナル伝達経路がＮＧＦによって活性化されることから妨害されるという点で、アンタゴニストとして働く抗体に関係する。

【0161】

ＮＧＦは最初に同定されたニューロトロフィンであり、末梢ニューロンと中枢ニューロンの両方の発生および生存におけるその役割は十分に特徴付けされてきた。ＮＧＦは、末梢交感神経ニューロンおよび胎児感覚ニューロン、ならびに前脳基底部コリン作用性ニューロンの発生において、決定的な生存および維持の因子であることが示されてきた（Ｓｍｅｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７６：１００１−１０１１（１９９４））。ＮＧＦは感覚ニューロン中のニューロペプチドの発現をアップレギュレートし（Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３６２−３６４（１９８９））、その活性は、２つの異なる膜結合受容体、ＴｒｋＡ受容体および低親和性ｐ７５共通ニューロトロフィン受容体と見なされているものを通して媒介される。

【0162】

ＮＧＦは、損傷または疾患を有する組織中に上昇した量のＮＧＦが存在する、ＮＧＦ関連障害において上昇していることが示されてきた。ＮＧＦ関連障害は、障害があるか、疾患があるか、または損傷がある組織中でのＮＧＦの上昇に起因する痛みの増加として定義できる。痛みは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるように定義され、慢性の痛み、炎症性の痛み、手術切開後の痛み、神経障害の痛み、骨折の痛み、骨粗しょう症骨折の痛み、ヘルペス後神経痛、癌の痛み、熱傷から生じる痛み、熱傷または創傷と関連する痛み、外傷と関連する痛み（外傷性頭部損傷を含む）、神経障害の痛み、慢性の痛み、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節症、非関節リウマチおよび関節周囲障害などの筋骨格障害と関連する痛み、および癌と関連する痛み（「突出痛」および末期癌と関連する痛みを含む）、末梢神経障害、およびヘルペス後神経痛を含む障害をいう。

【0163】

本発明の１つの実施形態において、ＮＧＦ障害は、イヌにおける骨関節炎として定義される。骨関節炎（ＯＡ）は、イヌにおける関節軟骨の喪失および引き続く軟骨下骨の露出によって特徴付けられるゆっくりと進行する変性性関節疾患である。これは、最終的には、関節痛によって特徴付けられる自己永続的な潜行性障害を生じる。慢性炎症、および動作と痛みの両方を制限する試みの中での局所的組織損傷に応答して、新たな骨形成が起こる。肉眼的には、関節軟骨の喪失、関節腔の狭小化、軟骨下骨の硬化、および関節骨棘の産生が存在する（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｆｏｃｕｓ：Ｖｏｌ １７ Ｎｏ３；２００７）。

【0164】

イヌにおいては、原発性ＯＡの発症は品種に依存する。発症の平均年齢は、Ｒｏｔｔｗｅｉｌｅｒで３．５年、プードルで９．５年であり、例えば、他の品種または混合品種については広範な範囲の発症を伴う。発生整形外科的疾患および付随する骨関節炎は、イヌにおいて最も一般的な関節疾患であり、これらは、付属肢骨格の中に関節疾患および関連する問題について、医療訪問のおよそ７０％を計上する。症例の２２％が１年以下、齢をとっていた。ＯＡの発生は、外傷、ならびに、肥満、加齢、および遺伝子異常によって増加された。特に、年齢はＯＡ発生の１つの因子であり得、ここで、＞５０％の関節炎の症例が８〜１３歳の年齢のイヌにおいて観察されている。筋骨格系疾患は高齢患者において非常に一般的であり、ほぼ２０％の高齢イヌが整形外科的障害を示す。＞８歳年齢のＬａｂｒａｄｏｒ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒにおいて、いくつかの関節（肘、肩、腰、膝）におけるＯＡが典型的である。さらに、イヌのサイズがＯＡの発症において同様に役割を果たす。関節炎を有するイヌの４５％が大きな品種のイヌである。これらの間で、＞５０％が巨大な品種のイヌであるのに対して、２８％のみが中くらいの品種のイヌであり、２７％が小さな品種のイヌである。イヌにおけるＯＡの痛みのための薬学的介入の必要性は非常に高い。

【0165】

本明細書で言及されるように、ＮＧＦのレベルの上昇は、ＮＧＦ関連障害、特に、ＯＡを示す。ＮＧＦのレベルの上昇は、肥満細胞の数の増加とともに、トランスジェニック関節炎マウスにおいて報告されてきた（Ａｌｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ−Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ａｓｐｅｃｔｓ １５：１３９−１４３（１９９３））。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０２／０９６４５８は、炎症状態（例えば、関節リウマチ）などの様々なＮＧＦ関連障害を治療する際の特定の特性の抗ＮＧＦ抗体の使用を開示している。ヒト腫瘍壊死因子遺伝子を有する関節炎トランスジェニックマウスに注射した精製された抗ＮＧＦ抗体は、肥満細胞の数の減少、ならびに関節炎マウスの滑膜中のヒスタミンおよびサブスタンスＰのレベルの減少を引き起こすことが報告されてきた（Ａｌｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１４：２４９−２５２（１９９５））。ＮＧＦ抗体の外因性投与は、関節炎マウスに存在するＴＮＦαのレベルの増強を減少することが示されてきた（Ｍａｒｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１８：９７−１０２（１９９８））。齧歯類抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が報告されてきた。例えば、Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，ハイブリドーマａ（２０００）１９（３）：２１５−２２７；Ｒｕｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１３（５）：５５９−５６８を参照のこと。しかし、齧歯類抗体が非マウス哺乳動物において治療的に使用されるとき、有意な数の治療された個体において、抗マウス抗体応答が発生する。従って、イヌ使用のための、特に、ＯＡを治療する際の使用のための、本発明の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を含む、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗原結合タンパク質についての重大な必要性が存在する。

【0166】

抗体の特性はそれらを非常に魅力的な治療剤にする一方、多くの制限が存在する。圧倒的多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、以前に記した通り、齧歯類起源である。このような抗体が異なる種において投与されるとき、患者は、このような異種抗体に対するそれら自体の応答を開始し得る。このような応答は、抗体の最終的な中和および除去を生じるかもしれない。上記に記載されたように、マウスはモノクローナル抗体の産生において広範に使用されている。特定の種、一般的には、最初にマウスで産生される抗体を使用することの使用の１つの問題点は、上記抗体で治療される非マウス被験体が、あたかも外来物質であるかのようにマウス抗体と反応し、従って、マウス抗体に対する抗体の新たなセットを作製することである。マウス抗体は、非マウス、例えば、イヌの免疫系によって外来性と見られ、次いで、被験体は、その分子に対する免疫応答を開始する。この分野の当業者は、抗原特異的抗体を用いて被験体を治療するが、しかし、その抗体を種特異的にすることが可能である必要性を認識している。異種間抗体投与、例えば、イヌに投与されるマウスモノクローナル抗体から生成する反応の一部は、発疹のような軽度型から、より極度の腎不全などの生命に関わる応答までの範囲であり得る。この免疫応答はまた、被験体がマウス抗体を含有する引き続く治療を与えられるならば、治療の有効性を減少し、または将来の反応を生み出すことがあり得る。従って、本発明者らは、抗体の「イヌ化」によってこの不利益を克服することを説明する。特に、このプロセスは、免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域に焦点を当てているが、可変ドメインの相補性決定（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）領域（ＣＤＲ）もまた含むことができる。実現する工程およびこのプロセスについて実施するための単純化は本開示の中で説明される。

【0167】

種への治療的投与のために、動物からのモノクローナル抗体を修飾して、免疫原性を少なくするプロセスは、積極的に追求されており、多くの刊行物の中に記載されてきた（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９２）。しかし、このプロセスは、最近まで、非ヒト、特に、イヌのための治療薬または診断薬の開発のために適用されてはいなかった。実際、イヌ可変ドメインに関しては非常にわずかしか公開されていない。Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６、３１６０（１９７７）は、イヌのＩｇＭとイヌのＩｇ重鎖の間の可変領域のアミノ酸配列を決定した。Ｗａｓｓｅｒｍａａ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１５、３０３（１９７８）は、イヌのＩｇＡからのＫ軽鎖のアミノ酸配列を決定した。ＭｃＣｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６、５６５（１９７９）は、イヌのミュー鎖の完全アミノ酸配列を開示する。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８０、２５９（２００１）は、単一のイヌＩｇＧ−Ａｙ鎖のｃＤＮＡおよび４つのイヌＩｇＧ−Ａｙ鎖のタンパク質配列を開示している。これは、ヒト、マウス、ブタ、およびウシのＩｇＧの保存領域から設計された縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるイヌ脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅を記載している。イヌの抗体上で利用できる情報の不足は、イヌの疾患の治療のための治療薬としてのそれらの開発を妨害してきた。

【0168】

これらの顕著な制限は、「スペシエーション」として知られる操作技術の開発を促進してきており、治療抗体の「ヒト化」によって当業者に周知である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ抗体またはそのフラグメントとして生成できる。大部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、特異性、親和性、および効力などの所望の特性を有する、マウスなどの非ヒト種（すなわち、「ドナー抗体」または「元々の種の抗体」）のＣＤＲからの残基によって置き換えられているヒト抗体（すなわち、「レシピエント抗体」または「標的種抗体」）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。このヒト化ストラテジーは、ヒト化抗体の作製のために報告されたように、「ＣＤＲ移植」と呼ばれる（Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号）。選択された標的フレームワーク残基の対応するドナー残基への復帰突然変異は、親和性を回復およびまたは改善するために必要とされるかもしれない。構造に基づく方法はまた、例えば、米国特許出願シリアル番号１０／１５３，１５９および関連する出願においてヒト化について記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために利用されてもよい。いくつかの抗体のヒト化において要求される必須のフレームワーク残基、ならびに抗体結晶構造に基づくコンピュータモデリングの比較は、「ベルニエ領域残基」と呼ばれるフレームワーク残基のセットを明らかにした（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９（１９９２））。加えて、ＶＨ−ＶＬ界面におけるいくつかの残基は、抗原についての親和性を維持する際に重要であることが示唆されてきた（Ｓａｎｔｏｓ，Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６０：１６９−９４（１９９８）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．、４：７７３−７８３（１９９１））。イヌにおける使用のための抗体の「ヒト化」のための同様のストラテジーは、米国特許第７，２６１，８９０号に記載されている。

【0169】

あるいは、ヒト化抗体は、個別のヒトフレームワーク領域のプール（例えば、ライブラリー）に移植された非ヒト配列からのＣＤＲを含有してもよい。この新たに操作された抗体は、元々の抗体と同じ抗原に結合することが可能である。この抗体定常領域はヒト抗体から誘導されている。この態様を実施するための方法論は、一般的には、フレームワークシフトとして記載されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３−６０（２００５））。さらに、ヒト化抗体は、ドナー種に対して高い相同性を有する少なくとも２つのヒト抗体生殖系列配列から誘導された２つ以上のフレームワーク領域からの配列を含有してもよい。この方法を使用して設計された抗体は、ハイブリッド抗体として記載されており（Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第７，３９３，６４８号）、そして、ヒト化の外側のスペシエーション、例えば、イヌ化のために適用可能であり得る。

【0170】

上記に記載されるアプローチは、ドナー種からＣＤＲを受け取るように操作されている
標的種の１つ以上の可変重鎖または可変軽鎖からの本質的に完全なフレームワーク領域を
利用する。ある場合において、可変領域中の選択された残基の復帰突然変異は、ＣＤＲの
提示を増強するために使用される。有効性を十分に維持するために抗体の抗原結合領域を
保存するのと同時の間に、抗体中の非ネイティブ配列に対して被験体中の免疫原性反応を
最小化する抗体を設計することは、困難であることが判明してきた。

【0171】

治療用抗体標的化タンパク質を開発するための別の挑戦は、異なる種の中の相同タンパク質上のエピトープが頻繁に異なっており、他のタンパク質との交差反応性についての潜在能力もまた異なることである。結果として、抗体は、治療される特定の種における特定の標的のために、作製、試験、および開発されなければならない。

【0172】

抗体は、抗体分子の可変領域との相互作用によって、抗原上の特異的エピトープのその結合を通して、抗原を標的とする。さらに、抗体は、様々な生物学的活性を媒介し、阻害し（本発明のアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗原結合タンパク質の場合と同様に）、および／または開始する能力を有する。治療抗体の広範な機能が存在し、例えば、抗体は、アゴニストまたはアンタゴニストとしての受容体−リガンド相互作用を調節できる。抗体結合は、細胞増殖、サイトカイン産生、またはアポトーシスを刺激するための細胞内シグナル伝達を開始できる。抗体は、Ｆｃ領域に結合した薬剤を特定の部位まで送達することができる。抗体はまた、抗体媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）、および食作用を誘発する。変化され、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、Ｃ１ｑ結合、および食作用が排除されている抗体もまた存在する。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、上記抗体のエフェクター機能を変化させる抗体のＦｃ領域に変化を備える。

【0173】

（イヌ化）
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」とは、イヌによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、および／または、当該分野において公知であり、もしくは本明細書に開示される技術のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。このイヌ化抗体の定義には、少なくとも１つのイヌ重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのイヌ軽鎖ポリペプチドを備える抗体が含まれる。抗体の、および特に抗体のヒト化の「スペシエーション」は、それ自体、当業者に周知の研究の分野である。ヒト化を超えた抗体のスペシエーションが、任意の他の種において有効であり得る治療抗体を生み出すか否かは最近まで不明であった。本発明は、イヌにおける治療的使用のための抗ＮＧＦ抗体のイヌ化を実証する。

【0174】

キメラ抗体は、少なくとも２つの種からの配列を備える。１つの例として、組換えクローニング技術が、可変領域を含むために使用されてもよく、これは、非イヌ抗体からの抗原結合部位（すなわち、抗原で免役された非イヌ種の中で調製された抗体）およびイヌ免疫グロブリンから誘導された定常領域を含有する。

【0175】

イヌ化抗体はキメラ抗体の１つの型であり、ここでは、抗原結合の原因である可変領域残基（すなわち、相補性決定領域の残基、短縮相補性決定領域、または抗原結合に参加する任意の他の残基）が非イヌ種から誘導されており、一方、残りの可変領域残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）および定常領域は、少なくとも部分的に、イヌ抗体配列から誘導されている。イヌ化抗体のフレームワーク領域残基および定常領域残基のサブセットは、非イヌ供給源から誘導されてもよい。イヌ化抗体の可変領域もまた、イヌ化されたとして記載されている（すなわち、イヌ化された軽鎖または重鎖可変領域）。非イヌ種は、典型的には、マウス、ラット、非ヒト霊長類、または他の非イヌ哺乳動物種などの、抗原を用いる免疫のために使用されるものである。

【0176】

相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合に参加する抗体可変領域の残基である。ＣＤＲを同定するためのいくつかの番号付けシステムが普通に使われている。Ｋａｂａｔの定義は配列変動性に基づいており、Ｃｌｏｔｈｉａの定義は構造的ループ領域の位置に基づいている。ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔのアプローチとＣｌｏｔｈｉａのアプローチの間の妥協である。本発明のイヌ化抗体は、１つ以上のＣＤＲを備えるように構築されてもよい。なおさらに、ＣＤＲは、別々に、またはＳＭＩＰなどの合成分子および小さな抗体模倣物と組み合わせて使用されてもよい。

【0177】

フレームワーク残基は、超可変残基またはＣＤＲ残基以外の抗体可変領域の残基である。フレームワーク残基は、本発明の抗体のフレームワーク領域と実質的に同様であるイヌのフレームワークなどの天然に存在するイヌの抗体から誘導されてもよい。個々の配列に間でコンセンサスを表す人工のフレームワーク配列もまた使用されてもよい。イヌ化のためにフレームワーク領域を選択するとき、イヌにおいて広範に表される配列は、数が多くない配列よりも好ましいかもしれない。イヌのフレームワークアクセプター配列のさらなる変異は、抗原の接触に関与すると考えられているマウス残基、および／もしくは抗原結合部位の構造的完全性に関与する残基を回復させるために、または抗体発現を改善するために作製されてもよい。

【0178】

ＣＤＲの移植は、アクセプター抗体（例えば、イヌ化抗体または所望のフレームワーク残基を備える他の抗体）の１つ以上のＣＤＲを、ドナー抗体（例えば、非イヌ抗体）のＣＤＲで置き換えることによって実施される。アクセプター抗体は、候補アクセプター抗体とドナー抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択されてもよい。例えば、イヌのフレームワーク領域は、関連の非イヌ抗体の各フレームワーク領域に対して実質的な配列相同性を有するとして同定され、非イヌ抗体のＣＤＲは、様々なイヌのフレームワーク領域の複合物に移植される。

【0179】

利用可能なアミノ酸配列データの分析と組み合わせた、抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、ＣＤＲの中の各位置に存在するアミノ酸の構造的相違に基づいて、配列変動性をモデリングするために使用されてもよい。本発明のＣＤＲはまた、２つのＣＤＲ領域および１つのフレームワーク領域を備える小さな抗体模倣物中でも利用できる（Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２５；９２１−９２９；Ａｕｇｕｓｔ ２００７）。

【0180】

ＣＤＲまたは短縮ＣＤＲの移植のためのアクセプターフレームワークは、所望の残基を導入するためにさらに修飾されてもよい。例えば、アクセプターフレームワークは、１つ以上の位置における非イヌドナー残基を任意に有する、イヌコンセンサス配列の重鎖可変領域を備えてもよい。移植後、抗体結合および機能性を最適化するために、ドナー配列および／またはアクセプター配列において、さらなる変化が作製されてもよい。例えば、国際公開ＷＯ ９１／０９９６７を参照のこと。

【0181】

本発明は、本発明の抗体を発現する細胞および細胞系統をさらに提供する。代表的な宿主細胞には、細菌、酵母、哺乳動物およびヒト細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。宿主細胞への異種構築物の形質転換後の安定な細胞系統を生成するための方法は、当該分野において公知である。代表的な非哺乳動物宿主細胞には、昆虫細胞（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２−３）：１０３−１１２）が挙げられる。抗体はまた、トランスジェニック動物（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５−６２９）およびトランスジェニック植物（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０（３）：４３３−４５）において産生されてもよい。

【0182】

上記に議論されたように、例えば、抗体の他の部分、例えば、定常領域を欠失、付加、または置換することによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびイヌ化抗体もまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体は、以下のようにして修飾できる：（ｉ）定常領域を欠失させることによる；（ｉｉ）定常領域を、別の定常領域、例えば、抗体の半減期、安定性、もしくは親和性を増大させることを意味する定常領域、または別の種もしくは抗体のクラスからの定常領域で置き換えることによる；あるいは（ｉｉｉ）例えば、とりわけ、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞の機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体結合を変化させるために定常領域中の１つ以上のアミノ酸を修飾することによる。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体は、抗体のエフェクター機能を変化させる、変化させたＦｃ領域を備える。

【0183】

抗体定常領域を変化させるための方法は、当該分野において公知である。変化させた機能を有する抗体、例えば、細胞上のＦｃＲまたは補体のＣ１成分は、抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることによって産生できる（例えば、ＥＰ ３８８，１５１ Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号を参照のこと、これらのすべての内容は参照により組み込まれる）。

【0184】

例えば、特定の残基を、側鎖に適切な官能基を有する残基で置き換えることによって、あるいは、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの電荷を有する官能基、または、ことによると、フェニルアラニン、チロシン、もしくはアラニンなどの芳香族性非極性残基を導入することによって、ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ１）またはＣ１ｑ結合が、抗体のＦｃ領域の親和性を変化させることが可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照のこと）。抗体またはその結合フラグメントは、細胞毒素、治療剤、または放射性金属イオンと結合体化されてもよい。１つの実施形態において、結合体化されるタンパク質は抗体またはそのフラグメントである。細胞毒素または細胞傷害性因子には、細胞に対して有害である任意の薬剤が挙げられる。非限定的な例には、カリケアマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシル ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるがこれらに限定されない。このような部分をタンパク質に結合体化するための技術は当該分野において周知である。

【0185】

（組成物、誘導された組成物、およびこれらの組成物を作製する方法）
本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドをコードする配列を備える抗体、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを包含する薬学的組成物を含む組成物を包含する。

【0186】

本明細書で使用される場合、組成物は、イヌＮＧＦに結合する１種以上の抗体、抗原結合タンパク質もしくはポリペプチド（これは抗体であってもよいし、抗体でなくでもよい）、および／またはＮＧＦに結合する１種以上の抗体もしくはポリペプチドをコードする配列を備える１種以上のポリヌクレオチドを備える。これらの組成物は、緩衝液を含む薬学的に受容可能な賦形剤などの適切な賦形剤をさらに備えてもよく、これらは当該分野において周知である。本発明はまた、単離された抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの実施形態もまた包含する。本発明はまた、実質的に純粋な抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの実施形態もまた包含する。

【0187】

ある実施形態において、本発明は、イヌＮＧＦに特異的に結合する新規なイヌ化モノクローナル抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＮＧＦに結合し、その受容体ＴｒｋＡ、およびより低い程度ではｐ７５へのその結合、およびその活性化を妨害し、従って、本明細書に記載されるようなシグナル伝達カスケードを妨害する。本発明のモノクローナル抗体は、「ＳＭ５７」、「ＳＭ５８」、「ＳＭ６６」、「ＣａｎＥ３Ｍ６５−１２」、および「ＣＡＮＳＳＭ−ＱＣ２３−ＶＬ／ＣＡＮＳＳＭ５７−ＶＨ」（「ＳＳＭＱＣ２３ＨＣＬＣ」）として本明細書で同定される。

【0188】

１つ以上の実施形態において、本発明は、可変軽鎖が配列番号１６（ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ）を備え、可変重鎖が配列番号１７（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）を備える、単離されたイヌ化抗原結合タンパク質を提供する。

【0189】

１つ以上の実施形態において、本発明は、可変軽鎖が配列番号２６（ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）を備え、可変重鎖が配列番号２７（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）を備える、単離されたイヌ化抗原結合タンパク質を提供する。

【0190】

１つ以上の実施形態において、本発明は、可変軽鎖が配列番号３０（ＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬ）を備え、可変重鎖が配列番号２７（ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ）を備える、単離されたイヌ化抗原結合タンパク質を提供する。

【0191】

本発明のさらなる実施形態は、以前に記載されたような様々な抗原結合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0192】

本発明は、組換えモノクローナル抗体およびペプチド、ならびに、臨床的投与、および診断手順を含む科学的手順におけるこれらの使用を提供する。分子生物学および組換え技術の方法の出現により、組換え手段により抗体および抗体様分子を産生し、それによって、抗体のポリペプチド構造において見い出される特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を生成することが可能である。このような抗体は、上記の抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングすること、または上記ポリペプチド鎖の直接合成のいずれかによって、特定のエピトープおよび抗原決定基についての親和性を有する活性四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成するための合成した鎖のアセンブリーを用いて、産生することができる。このことは、異なる種および供給源からの中和抗体の配列特性を有する抗体の即時産生を可能にする。

【0193】

抗体の供給源、またはどのようにして抗体が組換え的に構築されたか、または抗体がどのようにして合成されたか、インビトロかインビボか、トランスジェニック動物の使用、研究用または商業用のサイズの大きな細胞培養、トランスジェニック植物の使用、またはプロセスの任意の段階で生きている生物を利用しない直接化学合成によるかに関わらず、すべての抗体は類似の全体的な三次元構造を有する。この構造は、しばしば、Ｈ２Ｌ２として与えられ、抗体が共通して２つの軽（Ｌ）鎖アミノ酸鎖および２つの重（Ｈ）鎖アミノ酸鎖を備えるという事実をいう。両方の鎖は、構造的に相補的な抗原性標的を相互作用することが可能である領域を有する。標的と相互作用する領域は「可変」または「Ｖ」領域といい、様々な抗原特異性の抗体からのアミノ酸配列の違いによって特徴付けられる。Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域は、抗原性標的に特異的に結合することが可能であるアミノ酸配列を含有する。

【0194】

本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」とは、抗原と相互作用し、抗体に、抗原についてのその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含有する、抗体分子の部分をいう。抗体結合領域は、抗原結合残基の適切なコンホメーションを維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。抗原結合領域を提供するＨ鎖とＬ鎖の可変領域の中に、異なる特異性の抗体間でのその配列の極度の変動性のために「超可変」との異名のある小さな配列がある。このような超可変領域はまた、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域ともいわれる。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造についての抗体の基本的特異性を説明する。

【0195】

ＣＤＲは、可変領域の中のアミノ酸の非連続的なストレッチを表すが、しかし、種に関わらず、可変重鎖と可変軽鎖領域の中の決定的に重要なアミノ酸配列の位置的な配置は、可変鎖のアミノ酸配列の中の同様の位置を有することが見い出されている。すべての抗体の可変重鎖および可変軽鎖は、各々が、３つのＣＤＲ領域を有し、各々が他とは非連続的である。すべての哺乳動物種において、抗体ペプチドは、定常（高度に保存性）領域および可変領域を含有し、そして、後者の中には、ＣＤＲ、および、重鎖または軽鎖の可変領域の中であるが、ＣＤＲの外側であるアミノ酸配列から作られる、いわゆる「フレームワーク領域」が存在する。

【0196】

本発明は、上記の核酸の少なくとも１種を含むベクターをさらに提供する。遺伝コードが縮重しているので、１種より多くのコドンが使用されて、特定のアミノ酸をコードすることができる。遺伝コードを使用すると、１つ以上の異なるヌクレオチド配列が同定でき、これらの各々は、アミノ酸をコードすることが可能である。特定のオリゴヌクレオチドが実際に実際のコード配列を構成する可能性は、異常な塩基の対合の関連性および特定のコドンが（特定のアミノ酸をコードするために）、抗ＮＧＦ抗体または一部を発現する真核生物細胞または原核生物細胞において実際に使用される頻度を考慮することによって見積もることができる。このような「コドン使用頻度の規則」は、Ｌａｔｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１８３ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１−１２（１９８５）によって開示されている。Ｌａｔｈｅの「コドン使用頻度の規則」を使用して、抗ＮＧＦ配列をコードすることが可能である理論的に「最もありそうな」ヌクレオチド配列を含有する単一のヌクレオチド配列、または一連のヌクレオチド配列が同定できる。本発明における使用のための抗体コード領域はまた、本明細書に記載される抗体およびペプチドの変異型（アゴニスト）を生じる、標準的な分子生物学的技術を使用して、既存の抗体遺伝子を変化させることによってもまた提供できることもまた意図される。このような変異型には、抗ＮＧＦ抗体またはペプチドのアミノ酸配列の欠失、付加、および置換が挙げられるがこれらに限定されない。

【0197】

例えば、置換の１つのクラスは、保存性アミノ酸置換である。このような置換は、同様の特徴の別のアミノ酸によって、抗ＮＧＦ抗体ペプチド中の所定のアミノ酸を置換するものである。典型的には、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびｌｉｅの間での１つのものを別のものへの置き換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｉｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置き換えなどが、保存性置換として見られる。アミノ酸交換が表現型的にサイレントであるようであることに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，２４７ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０６−１０（１９９０）において見い出される。

【0198】

変異型またはアゴニスト抗ＮＧＦ抗体またはペプチドは、完全に機能的であってもよく、１つ以上の活性を欠いていてもよい。完全に機能的な変異型は、典型的には、保存性のバリエーションまたは決定的でない残基もしくは決定的でない領域のバリエーションのみを含有する。機能的な変異型はまた、機能の変化を生じないか、または機能の重要でない変化を生じる類似のアミノ酸の置換を含有できる。あるいは、このような置換は、ある程度まで、機能にポジティブまたはネガティブな影響を与えてもよい。非機能的な変異型は、典型的には、１つ以上の非保存性アミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、または欠失または切断、あるいは、決定的な残基または決定的な領域における置換、挿入、反転または欠失を含有する。

【0199】

機能のために必須であるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発などの当該分野において公知の方法によって同定できる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２４４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８１−８５（１９８９）。後者の手順は、分子のあらゆる残基において、単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、エピトープ結合またはインビトロＡＤＣＣ活性などの生物学的活性について試験される。リガンド−受容体結合のために決定的な部位もまた、結晶学、核磁気共鳴、または光親和性標識などの構造分析によって決定できる。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２２４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，２５５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６−１２（１９９２）。

【0200】

さらに、ポリペプチドは、しばしば、２０種の「天然に存在する」アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。さらに、末端のアミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然のプロセス、または当業者で公知の化学的修飾によって修飾されてもよい。公知の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡが媒介するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が挙げられるがこれらに限定されない。このような修飾は当業者には周知であり、科学文献において非常に詳細に記載されてきた。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン残基のガンマカルボキシル化、水酸化、およびＡＤＰリボシル化は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍ＆ Ｃｏ．，ＮＹ，１９９３）などの最も基本的なテキストに記載されている。この主題に対して多くの詳細な概説が、例えば、Ｗｏｌｄ，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１−１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１８２ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６２６−４６（１９９０）；およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．６６３ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４８−６２（１９９２）などによって利用可能である。

【0201】

従って、本発明の抗体およびペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされるものではない、誘導体またはアナログもまた包含する。同様に、アミノ酸配列における付加および置換、ならびにバリエーション、およびちょうど記載された修飾は、ＮＧＦ抗原および／またはそのエピトープまたはペプチドのアミノ酸配列に対して等しく適用可能であるかもしれず、従って、本発明によって包含される。上記に言及されたように、本発明に従うモノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ＮＧＦの認識において特に有効である。

【0202】

（抗体誘導体）
抗体誘導体は本発明の範囲に含まれる。抗体の「誘導体」は、通常はタンパク質の一部ではないさらなる化学部分を含有する。タンパク質の共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。このような修飾は、抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することが可能である有機誘導体化剤と反応させることによって、分子に導入されてもよい。例えば、当該分野において周知である二官能性剤を用いる誘導体化が、抗体またはフラグメントを、水不溶性支持体マトリックスまたは他の高分子キャリアに架橋するために有用である。

【0203】

誘導体はまた、標識されている放射能標識されたモノクローナル抗体も含む。例えば、放射性ヨウ素（２５１，１３１Ｉ）、炭素（４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、インジウム、トリチウム（Ｈ³）などを用いて；ビオチンまたはアビジンとのモノクローナル抗体の結合体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボン酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、またはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素を用いて；およびまた、生物発光剤（ルシフェラーゼなど）、化学発光剤（アクリジンエステルなど）または蛍光剤（フィコビリンタンパク質など）とモノクローナル抗体の結合体である。

【0204】

本発明の別の誘導体二機能抗体は、２つの異なる抗原性基を認識する２つの別々の抗体の部分を合わせることによって生成された二特異的抗体である。これは、架橋技術または組換え技術によって達成されてもよい。加えて、（例えば、血流からのクリアランスまでの時間を長くすることによって）インビボでの半減期を増加させるための部分が抗体またはその一部に加えられてもよい。このような技術には、例えば、ＰＥＧ部分を加えること（ペグ化とも呼ばれる）が挙げられ、これらは当業者に周知である。米国特許出願公開第２００３００３１６７１号を参照のこと。
（抗体の組換え発現）
ある実施形態において、対象のモノクローナル抗体をコードする核酸は宿主細胞に直接導入され、その細胞はコードされた抗体の発現を誘導するために十分な条件下でインキュベートされる。対象の核酸が細胞に導入された後で、細胞は、典型的には、抗体の発現を可能にするために、通常、３７℃で、時折、選択下で、約１〜２４時間の間、インキュベートされる。１つの実施形態において、抗体は、細胞が増殖している培地の上清に分泌される。伝統的に、モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ系統中でネイティブ分子として産生されてきた。この技術に加えて、本発明は、モノクローナル抗体の組換えＤＮＡ発現を提供する。これは、選択した宿主種における、イヌ化抗体、ならびに一定のスペクトルの抗体誘導体および融合タンパク質の産生を可能にする。

【0205】

少なくとも１種の本発明の抗ＮＧＦ抗体、部分、またはポリペプチドをコードする核酸配列は、ライゲーションのためのブラントエンドまたはスタガードエンド末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切に付着末端のフィルイン、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼを用いるライゲーションを含む、従来的な技術に従ってベクターＤＮＡを用いて組換えられてもよい。このような操作のための技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８２ ａｎｄ １９８９），ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９３ 前出によって開示されており、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用されてもよい。

【0206】

ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写および翻訳の調節情報を含有しているヌクレオチド配列を含有し、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されているならば、ポリペプチドを「発現することが可能」であるといわれる。作動可能な連結は、調節ＤＮＡ配列および発現されることが求められているＤＮＡが、抗ＮＧＦペプチドまたは抗体部分としての遺伝子発現を回収可能な量で可能にするようなやり方でつながれている連結である。遺伝子発現のために必要とされる調節領域の正確な性質は、類似の分野において周知であるように、生物から生物で異なるかもしれない。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ 前出；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ 前出を参照のこと。

【0207】

従って、本発明は、原核生物または真核生物のいずれかにおいて、抗ＮＧＦ抗体またはペプチドの発現を包含する。適切な宿主には、インビボもしくはインサイチュでの細菌、酵母、昆虫、真菌、鳥類、および哺乳動物の細胞、または哺乳動物、昆虫、鳥類、もしくは酵母起源の宿主細胞を含む、細菌宿主または真核生物宿主が挙げられる。哺乳動物の細胞または組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、齧歯類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、またはネコ起源であってもよいが、任意の他の哺乳動物細胞が使用されてもよい。

【0208】

１つの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、レシピエント宿主における自律複製が可能であるプラスミドまたはウイルスベクターに導入される。広範な種々のベクターのいずれかがこの目的のために利用されてもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、前出を参照のこと。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要性についての因子には、ベクターを含有するレシピエント細胞が、ベクターを含有しないレシピエント細胞から認識および選択され得る容易さ；特定の宿主において所望されているベクターのコピーの数；および様々な種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」できることが所望されているか否か、が挙げられる。

【0209】

当該分野において公知である原核生物ベクターの例には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製が可能であるものなどのプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ １８４、πｖＸなど）が挙げられる。このようなプラスミドは，例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９ 前出；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９３ 前出によって開示されている。バシラスプラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ，ｉｎ ＴＨＥ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯ．ＯＦ ＴＨＥ ＢＡＣＩＬＬＩ ３０７−３２９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８２）によって開示されている。適切なストレプトミセスプラスミドには、ｐｌＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１６９ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４１７７−８３（１９８７）が挙げられ、そしてストレプトミセスバクテリオファージは、ｐｈＬＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＳＩＸＴＨ ＩＮＴ’Ｌ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＯＮ ＡＣＴＩＮＯＭＹＣＥＴＡＬＥＳ ＢＩＯ．４５−５４（Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ １９８６）などである。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，８ Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６９３−７０４（１９８６）；ｌｚａｋｉ，３３ Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７２９−４２（１９７８）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ 前出において概説されている。

【0210】

あるいは、抗ＮＧＦ抗体またはペプチドをコードするｃＤＮＡの発現のために有用な遺伝子発現エレメントには、（ａ）ＳＶ４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３），ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ６７７７（１９８２）、およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，４１ Ｃｅｌｌ ８８５（１９８５）などのウイルス転写プロモーターおよびそれらのエンハンサーエレメント；（ｂ）ＳＶ４０後期領域から誘導されたもの（Ｏｋａｙａｒｅａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）などのスプライシング領域およびポリアデニル化部位、ならびに（ｃ）ＳＶ４０におけるもの（Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８３）などのポリアデニル化部位が挙げられるがこれらに限定されない。

【0211】

免疫グロブリンｃＤＮＡ遺伝子は、Ｗｅｉｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，５１ Ｇｅｎｅ ２１（１９８７）によって記載されているように、発現エレメントとして、ＳＶ４０初期プロモーターおよびそのエンハンサー、マウス免疫グロブリンＨ鎖プロモーターエンハンサー、ＳＶ４０後期領域 ｍＲＮＡスプライシング、ウサギＳ−グロビン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギＳ−グロビンポリアデニル化部位、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化エレメントを使用して、発現できる。一部ｃＤＮＡ、一部ゲノムＤＮＡから構成される免疫グロブリン遺伝子（Ｗｈｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．４９９（１９８７）については、転写プロモーターはヒトサイトメガロウイルスであり得、プロモーター エンハンサーは、サイトメガロウイルスおよびマウス／ヒト免疫グロブリンであり得、そしてｍＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化領域はネイティブ染色体免疫グロブリン配列であり得る。

【0212】

１つの実施形態において、齧歯類細胞におけるｃＤＮＡ遺伝子の発現のために、転写プロモーターはウイルスＬＴＲ配列であり、転写プロモーター エンハンサーは、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーとウイルスＬＴＲエンハンサーのいずれかまたは両方であり、スプライシング領域は３１ｂｐよりも大きなイントロンを含有し、そしてポリアデニル化領域および転写終結領域は、合成される免疫グロブリン鎖に対応するネイティブな染色体配列から誘導される。他の実施形態において、他のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞中のタンパク質の発現を達成するための上記に列挙された発現エレメントと組み合わされる。

【0213】

各々の融合された遺伝子は、発現ベクターの中にアセンブルでき、またはそこに挿入できる。次いで、キメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産物を発現することが可能なレシピエント細胞は、抗ＮＧＦペプチドまたはキメラＨ鎖もしくはキメラＬ鎖をコードする遺伝子を用いて単独でトランスフェクトされるか、あるいはキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖の遺伝子とともに同時トランスフェクトされる。トランスフェクトされたレシピエント細胞は、組み込まれた遺伝子の発現を可能にする条件下で培養され、発現された免疫グロブリン鎖またはインタクトな抗体もしくはフラグメントが培養から回収される。

【0214】

１つの実施形態において、抗ＮＧＦペプチドまたはキメラＨ鎖およびＬ鎖、またはこれらの部分をコードする融合した遺伝子は、別々の発現ベクターにアセンブルされ、次いで、これらはレシピエント細胞を同時トランスフェクトするために使用される。あるいは、キメラＨ鎖およびＬ鎖をコードする融合した遺伝子は同じベクター上でアセンブルできる。発現ベクターのトランスフェクションおよびキメラ抗体の産生のために、レシピエント細胞系統はミエローマ細胞であってもよい。ミエローマ細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされる免疫グロブリンを合成、アセンブル、および分泌でき、免疫グロブリンのグリコシル化のためのメカニズムを保有する。ミエローマ細胞は、培養中またはマウスの腹腔中で増殖でき、このマウスの腹腔では、分泌された免疫グロブリンは腹水から入手できる。他の適切なレシピエント細胞には、ヒトまたは非ヒト起源のＢリンパ球などのリンパ細胞、ヒトまたは非ヒト起源のハイブリドーマ細胞、または種間ヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられる。

【0215】

本発明のキメラ、イヌ化抗体構築物、または抗ＮＧＦポリペプチドを持っている発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、結合体化、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンを用いる適用などの生化学的手段、ならびにエレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、および微粒子銃などの機械的手段を含む種々の適切な手段のいずれかによって適切な宿主細胞に導入できる。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｔ，２４０ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３８（１９８８）。

【0216】

酵母は、免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖の産生のために、細菌を超えた実質的な利益を提供できる。酵母は、グリコシル化を含む翻訳後修飾を実行する。多数の組換えＤＮＡストラテジーが現在存在しており、これは、酵母における所望のタンパク質の産生のために使用できる、強力なプロモーター配列および高コピー数プラスミドを利用する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド（すなわち、プレペプチド）を分泌する。Ｈｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１１ｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｙｅａｓｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｎｔｐｅｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８２）。

【0217】

酵母遺伝子発現系は、抗ＮＧＦペプチド、抗体、およびアセンブルされたマウスおよびキメラ、ヘテロキメラ、イヌ化、抗体、そのフラグメント、およびその領域の産生、分泌、および安定性のレベルについて日常的に評価された。酵母がグルコースが豊富である培地中で増殖されるときに、大量に産生される糖分解酵素をコードする活発に発現される遺伝子からのプロモーターおよび終結エレメントを組み込む一連の酵母遺伝子発現系のいずれかが利用できる。公知の糖分解遺伝子もまた、非常に効率的な転写制御シグナルを提供することができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターシグナルおよびターミネーターシグナルが利用できる。多数のアプローチが、酵母におけるクローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡの発現のための最適な発現プラスミドを評価するために取られることができる。Ｖｏｌ．ＩＩ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、４５−６６，（Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ．，）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ １９８５）を参照のこと。

【0218】

細菌株もまた、本発明によって記載される抗体分子またはペプチドの産生のための宿主として利用できる。宿主細胞と適合可能である種から誘導される、レプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの細菌種と関連して使用される。ベクターは、複製部位、ならびに、形質転換された細胞において表現型選択を提供することが可能である特定の遺伝子を持っている。多数のアプローチが、細菌におけるクローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡによってコードされる、マウス、キメラ、ヘテロキメラ、イヌ化抗体、フラグメント、領域、または抗体鎖の産生のための発現プラスミドを評価するために取られることができる（Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５ 前出；Ａｕｓｕｂｅｌ、１９９３ 前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１ 前出；Ｃｏｌｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７−２００１）を参照のこと）。

【0219】

宿主哺乳動物細胞は、インビトロまたはインビボで増殖されてもよい。哺乳動物細胞は、リーダーペプチドの除去、Ｈ鎖およびＬ鎖の折りたたみおよびアセンブリー、抗体分子のグリコシル化、および機能的抗体タンパク質の分泌を含む、免疫グロブリンタンパク質分子に対する翻訳後修飾を提供する。上記のリンパ起源の細胞に加えて、抗体タンパク質の産生のための宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８１）細胞またはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６１）細胞などの線維芽細胞起源の細胞が挙げられる。多くのベクター系は、哺乳動物細胞中でクローニングされた抗ＮＧＦペプチドＨ鎖およびＬ鎖遺伝子の発現のために利用可能である（Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５前出を参照のこと）。完全なＨ２Ｌ２抗体を得るために、異なるアプローチに従うことができる。完全な四量体Ｈ２Ｌ２抗体および／または抗ＮＧＦペプチドへのＨ鎖およびＬ鎖の細胞内会合および連結を達成するために、同じ細胞の中でＨ鎖とＬ鎖を同時発現させることが可能である。この同時発現は、同じ宿主において、同じプラスミドまたは異なるプラスミドのいずれかを使用することによって行うことができる。Ｈ鎖およびＬ鎖、および／または抗ＮＧＦペプチドの両方についての遺伝子が同じプラスミドに配置でき、次いで、これは細胞にトランスフェクトされ、それによって、両方の鎖を発現する細胞について直接選択される。あるいは、細胞は、１つの鎖、例えば、Ｌ鎖をコードするプラスミドで最初にトランスフェクトでき、続いて、第２の選択マーカーを含有するＨ鎖プラスミドを用いて、得られる細胞系統のトランスフェクションを行うことができる。いずれかの経路を介して抗ＮＧＦペプチドおよび／またはＨ２Ｌ２分子を産生する細胞系統は、さらなる選択マーカーとともに、ペプチド、Ｈ鎖、Ｌ鎖、またはＨ鎖プラスＬ鎖のさらなるコピーをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、アセンブルされたＨ２Ｌ２抗体分子のより高い産生、またはトランスフェクトされた細胞系統の安定性の増強などの、増強された特性を有する細胞系統を生成することができる。

【0220】

長期的な、高収率の組換え抗体の産生のために、安定な発現が使用されてもよい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系統が操作されてもよい。複製のウイルス起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、免疫グロブリン発現カセットおよび選択マーカーを用いて形質転換できる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、富化培地中で１〜２日間の間増殖され、次いで、選択培地に切りかえられる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗を付与し、染色体にプラスミドを安定して組み込むこと、および増殖して増殖巣を形成することを可能にし、これは、次には、クローニングされて細胞系統に拡大できる。このような操作された細胞系統は、抗体分子と間接的または直接的に相互作用する化合物／成分のスクリーニングおよび評価において特に有用であるかもしれない。

【0221】

一旦、本発明の抗体が産生されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のために当該分野において公知である任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡの後の特異的抗原についてのアフィニティー、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製されてもよい。多くの実施形態において、抗体は、細胞から培養培地に分泌され、培養培地から収集される。

【0222】

（薬学的および獣医学的適用）
本発明の抗ＮＧＦ抗体またはペプチドは、例えば、イヌにおけるＮＧＦ関連障害の治療において使用できる。より具体的には、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、および、活性成分として、本発明に従う抗体またはペプチドを備える薬学的組成物をさらに提供する。この抗体は、本発明に従う、キメラ、ヘテロキメラ、イヌ化、または抗体であり得る。インタクトな免疫グロブリン、またはそれらの結合フラグメント、例えば、Ｆａｂもまた想定される。本発明の抗体またはその薬学的組成物は、非経口的投与、例えば、皮下、筋肉内、または静脈内の投与のために有用である。

【0223】

本発明の抗ＮＧＦ抗体および／またはペプチドは、個別の治療剤として、または他の治療剤と組み合わせてのいずれかで投与できる。これらは単独で投与できるが、しかし、一般的には、選択された投与の経路および標準の薬学的実務に基づいて、選択された薬学的キャリアと一緒に投与される。本明細書に開示される抗体の投与は、非経口注射（腹腔内、皮下、または筋肉内の注射）、経口、または気道表面への抗体の局所投与（薬学的製剤中で局所的に運ばれる）を含む、任意の適切な手段によって実行されてもよい。気道表面への局所投与は、鼻内投与によって実行できる（例えば、ドロッパー、スワブ、または吸入器の使用によって）。気道表面への抗体の局所投与はまた、エアロゾル懸濁液としての抗体を含有する薬学的製剤（固体粒子と液体粒子の両方を含む）の呼吸用粒子を作製すること、次いで、被験体に呼吸用粒子を吸入させることによるなどの、吸入投与によっても実行できる。薬学的製剤の呼吸用粒子の投与のための方法および装置は周知であり、任意の従来的な技術が利用できる。

【0224】

ある所望の実施形態において、抗体は非経口注射によって投与される。非経口投与のために、抗ＮＧＦ抗体またはペプチドが、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと共同して、溶液、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末として製剤化できる。例えば、ビヒクルは、水性キャリアなどの受容可能なキャリア中に溶解された、抗体の溶液またはそのカクテルであってもよく、このようなビヒクルは、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、トレハロースまたはスクロース溶液、または５％血清アルブミン、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどであり得る。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルもまた使用できる。これらの溶液は滅菌性であり、一般的には、粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来的な、周知の滅菌技術によって滅菌されてもよい。これらの組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などの適切な生理学的条件に対して要求されるような薬学的に受容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤中の抗体の濃度は、幅広く変動でき、例えば、約０．５重量％未満、通常、約１重量％または少なくとも約１重量％から、１５重量％または２０重量％程度の濃度まで変動でき、そして選択された投与の特定の様式に従って、主として液体の体積、粘度などに基づいて選択される。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加剤（例えば、緩衝剤および保存剤）を含有できる。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に公知であるかまたは明白であり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡ．ＳＣＩ．（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）においてより詳細に記載されている。

【0225】

本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥でき、使用前に適切なキャリア中で再構築できる。この技術は、従来的な免疫グロブリンとともに有効であることが示されてきた。任意の適切な凍結乾燥技術および再構築技術が利用できる。凍結乾燥および再構築は、抗体活性の喪失の程度の変化をもたらすことができ、補償するために使用レベルが調整されてもよいことが当業者によって評価される。本発明の抗体またはそのカクテルを含有する組成物は、再発の予防および／または既存の疾患のための治療的処置のために投与できる。適切な薬学的キャリアは、この技術分野における標準的な参考テキストであるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳの最も最近の版に記載されている。治療的適用において、組成物は、すでに疾患に罹患している被験体に、疾患またはその合併症を治癒するため、または少なくとも部分的に阻止もしくは軽減するための量で投与される。これを達成するために適正な量は、「治療有効用量」または「治療有効量」として定義される。この使用のための有効量は、疾患の重篤度および被験体自体の免疫系の一般的状態に依存するが、しかし、一般的には、ｋｇ体重あたり約０．１ｍｇからｋｇ体重あたり約１０ｍｇまで、好ましくは、体重のｋｇあたり約０．３ｍｇから体重のｋｇあたり約５ｍｇまでの範囲である。本発明のイヌ様抗体によって達成される、余分な物質の最小化および「外来物質」拒絶の低い可能性の観点において、これらの抗体の実質的な過剰量を投与することが可能であるかもしれない。

【0226】

投与される投薬量は、特定の薬剤の薬力学的特性などの公知の因子、およびその投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康、および体重；徴候の性質および程度、併用治療の種類、治療の頻度、および所望される効果に依存して変動する。

【0227】

非限定的な例として、イヌにおけるＮＧＦ関連病理の治療は、上記の投薬量範囲である本発明の抗ＮＧＦ抗体の２週間に１回、または１ヶ月に１回の投薬量として提供できる。イヌの治療使用のための例示的な抗体は、本発明に従う、高親和性（これらはまた、高い結合力であってもよい）抗体、ならびに、強力なインビボ抗ＮＧＦ活性を有する抗体のフラグメント、領域、および誘導体である。組成物の単回または複数回投与は、治療する獣医によって選択される用量レベルおよびパターンに伴って実行できる。いずれにしても、薬学的製剤は、被験体を効果的に治療するために十分である本発明の抗体の量を提供するべきである。

【0228】

（診断的適用）
本発明はまた、ＮＧＦ関連障害を有することが知られているか、またはそのことが疑われているイヌにおけるＮＧＦを検出するための診断方法における使用のための上記の抗ＮＧＦ抗体およびペプチドを提供する。本発明の１つの実施形態において、ＮＧＦ関連障害は痛みである。別の実施形態において、ＮＧＦ関連障害は骨関節炎である。本発明の抗ＮＧＦ抗体および／またはペプチドは、サンプル中のＮＧＦまたは抗ＮＧＦ抗体を検出または定量するイムノアッセイのために有用である。ＮＧＦのイムノアッセイは、典型的には、ＮＧＦに選択的に結合することが可能である、検出可能に標識された高親和性（または高結合力）の本発明の抗ＮＧＦ抗体またはポリペプチドの存在下で、臨床または生物学的サンプルをインキュベートすること、および、サンプル中で結合している標識ペプチドまたは抗体を検出することを備える。様々な臨床アッセイ手順が当該分野において周知である。例えば、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ８０’Ｓ（Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｕｎｉｖ．Ｐａｒｋ，１９８１）を参照のこと。このようなサンプルには、動物被験体から収集され、かつ以下に記載されるようなＥＬＩＳＡ分析に供される、組織生検、血液、血清、および糞便のサンプルが挙げられる。従って、抗ＮＧＦ抗体またはポリペプチドは、細胞、細胞粒子、または可溶性タンパク質を固定化可能である、ニトロセルロースまたは別の固体支持体に固定できる。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され、続いて、検出可能に標識されたＮＧＦ特異的ペプチド、抗体、または抗原結合タンパク質を用いる処理を行う。次いで、この固相支持体は、結合していないペプチドまたは抗体を除去するために、緩衝液を用いて２回目の洗浄をされる。次いで、この固相支持体上に結合した標識の量は、公知の方法の工程によって検出できる。

【0229】

「固相支持体」または「キャリア」とは、ペプチド、抗原、または抗体を結合可能な任意の支持体をいう。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトが挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度まで可溶性であるか、または不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体の材料は、結合される分子がＮＧＦまたは抗ＮＧＦ抗体に結合可能である限り、実質的に任意の可能な構造的構成を有することができる。従って、支持体の構成は、球状であり得、同様に、ビーズ状、または円筒状、同様に、試験管の内部表面中、またはロッドの外部表面であり得る。あるいは、この表面は、シート、培養ディッシュ、試験ストリップなどのように平らであり得る。例えば、支持体はポリスチレンビーズを含んでもよい。当業者は、抗体、ペプチド、または抗原を結合するための多くの他の適切なキャリアを知っており、または日常的な実験によってそのことを確認できる。周知の方法の工程は、所定のロットの抗ＮＧＦペプチドおよび／または抗体もしく抗原結合タンパク質の結合活性を決定できる。当業者は、操作的なおよび最適なアッセイ条件を日常的な実験によって決定できる。

【0230】

ＮＧＦ特異的ペプチドおよび／または抗体の検出可能な標識化は、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）における使用のために、酵素に結合することによって達成できる。結合された酵素は、露出された基質と反応し、例えば、分光光度法的に、蛍光分析的に、または視覚的手段によって検出できる化学部分を生成する。本発明のＮＧＦ特異的抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ５ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。ＮＧＦ特異的抗体を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して、ＮＧＦを検出することが可能である。Ｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＬＡＢ．ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＆ ＢＩＯＣＨＥＭ．ＩＮ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯ（Ｎｏ．Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，１９７８）を参照のこと。放射性同位元素は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの使用のような手段によって検出できる。本発明の目的のために特に有用な同位元素には、³Ｈ、¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、および¹⁴Ｃが挙げられる。

【0231】

ＮＧＦ特異的抗体を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露されたとき、その存在は、次に、蛍光によって検出できる。最も共通して使用されている蛍光標識化合物には、フルオレセインイソシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンがある。ＮＧＦ特異的抗体または抗原結合タンパク質はまた、¹²⁵Ｅｕなどの蛍光放射金属またはランタニド系列の他の金属を使用して検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート剤を使用して、ＮＧＦ特異的抗体に結合される。

【0232】

ＮＧＦ特異的抗体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識できる。次いで、化学発光標識された抗体の存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

【0233】

同様に、生物発光化合物は、本発明のＮＧＦ特異的抗体、一部、フラグメント、ポリペプチド、または誘導体を標識するために使用できる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の有効性を増加させる生物学的系において見い出される化学発光の１つの型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。

【0234】

ＮＧＦ特異的抗体、一部、フラグメント、ポリペプチド、または誘導体の検出は、例えば、検出可能な標識が放射能ガンマカウンターである場合には、シンチレーションカウンターによって、または、例えば、標識が蛍光物質である場合には、フルオロメーターによって達成できる。酵素標識の場合には、検出は、酵素の基質を利用する比色分析（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）方法によって達成できる。検出はまた、同様の準備された標準と比較において、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によって達成できる。

【0235】

本発明の目的のために、上記のアッセイによって検出されるＮＧＦは、生物学的サンプル中に存在し得る。ＮＧＦを含有する任意のサンプルが使用されてもよい。例えば、サンプルは、例えば、血液、血清、リンパ、尿、糞便、炎症性滲出液、脳脊髄液、羊水、組織抽出液、ホモジネートなどの体液である。本発明は、これらのサンプルのみを使用することに限定されないが、しかし、当業者は、本明細書に照らして、他のサンプルの使用を可能にする適切な条件を決定することが可能である。

【0236】

インサイチュ検出は、動物被験体から組織学的試料を取り出すことによって達成でき、このような試料への本発明の標識された抗体の組み合わせを提供する。抗体（またはその一部）は、生物学的サンプルに、標識された抗体（またはその一部）を適用することによって、または標識された抗体（またはその一部）重ね合わせることによって提供されてもよい。このような手順の使用を通して、調べられた組織中のＮＧＦの存在のみならず、ＮＧＦの分布もまた決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範な種々の組織学的方法のいずれか（染色手順など）が、このようなインサイチュ検出を達成するために修飾できることを容易に認知する。

【0237】

本発明の抗体、フラグメント、または誘導体は、「二部位」または「サンドイッチ」アッセイとしてもまた知られる免疫測定アッセイにおける利用のために適合できる。典型的な免疫測定アッセイにおいて、未標識抗体（または抗体のフラグメント）の量は、試験される液体中に不溶性である固体支持体に結合され、一定量の検出可能に標識された可溶性抗体が、固相抗体、抗原、および標識抗体の間で形成された三成分複合体の検出および／または定量を可能にする。

【0238】

抗体は、サンプル中のＮＧＦを定量的もしくは定性的に検出するために、またはＮＧＦを発現する細胞の存在を検出するために使用されてもよい。これは、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、または蛍光測定検出と結びつけられた、蛍光標識された抗体（以下を参照のこと）を利用する免疫蛍光技術によって達成できる。診断目的のために、抗体は、標識されるか、または標識されないかのいずれであってもよい。未標識抗体は、イヌ免疫グログリン定常領域に特異的な抗体などの抗体と反応性である、他の標識された抗体（二次抗体）と組み合わせて使用できる。あるいは、抗体は、直接標識できる。放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）などのような広範な種々の標識が利用されてもよい。以前に議論された多くの型のイムノアッセイが利用可能であり、当業者に周知である。重要なことに、本発明の抗体は、イヌにおけるＮＧＦ関連障害を診断する際に役に立つかもしれない。より具体的には、本発明の抗体は、コンパニオンアニマルにおけるＮＧＦの過剰発現を同定してもよい。従って、本発明の抗体は、重要な免疫組織化学ツールを提供してもよい。本発明の抗体は、遺伝子発現プロフィールを測定するために高度に適切である、抗体アレイ上で使用されてもよい。

【0239】

（キット）
対象の方法を実施するためのキットもまた、本発明の範囲に含まれる。これらのキットは、１種以上の本発明の抗体、これをコードする核酸、またはこれを含有する細胞を少なくとも含む。本発明の抗体は、通常は、凍結乾燥型で、容器中に提供されてもよい。標識もしくは毒素に結合体化されてもよいか、または結合体化されなくてもよい抗体は、典型的には、Ｔｒｉｓ、リン酸、炭酸などの緩衝液、安定剤、殺生物剤、不活性タンパク質、タンパク質、例えば血清アルブミンなどを伴うキットの中に含まれる。一般的には、これらの材料は、活性抗体の量に基づいて、５重量％未満、通常、抗体濃度に再度基づいて、少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。頻繁には、活性成分を希釈するために不活性増量剤または賦形剤を含めることが所望され、ここでは、賦形剤は、総組成物の約１重量％〜９９重量％で存在してもよい。一次抗体に結合可能である二次抗体がアッセイで利用されるとき、これは、通常、別々のバイアル中に存在する。二次抗体は、典型的には、標識と結合体化され、上記の抗体製剤と類似の様式で製剤化される。キットは、一般的には、使用のための一連の説明書もまた含む。

【0240】

本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

【0241】

（実施例）
本発明は、下記の実施例によってさらに例証および支持される。しかし、これらの実施例は、いかなる場合であっても、本発明の範囲をさらに限定するとは見なされるべきではない。それとは反対に、当業者は、本発明の技術思想、および／または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態、改変、および等価物が存在することを容易に理解する。

【0242】

（実施例１）
（イヌの神経成長因子（ＮＧＦ）を認識するマウスモノクローナル抗体の同定）
一連のマウスｍＡｂは成熟ヒトβ−ＮＧＦに対して産生された（米国特許第７，７２７，５２７号）。一旦これらのｍＡｂが生成されると、これらは、エピトープマッピング、ならびに１）ＮＧＦへの結合、および２）ＮＧＦのその受容体ＴｒｋＡおよびより低い程度でのｐ７５への結合を遮断する能力、および３）ＮＧＦ遮断（ＴｒｋＡ自己リン酸化の遮断、ニューロンのＮＧＦ依存的生存の遮断）と関連する機能的拮抗作用の評価についてのインビトロ試験を含む様々な分析に供せられた。これらの結果に基づいて、可変領域１（β−ヘアピンターンＡ’−Ａ”）、４（β−鎖ＣおよびＤ）およびカルボキシ末端に結合するｍＡｂは、ＴｒｋＡおよびｐ７５結合を遮断することが可能であることが見い出された。これらのマウスｍＡｂの１つ、ＲＮ９１１のＮＧＦ上の結合エピトープの分子モデリングは図６Ａに示されている。ＲＮ９１１は、関節炎、癌、手術切開、ならびに神経障害の痛み、および内臓の痛みと関連する痛みの前臨床齧歯類モデルにおいて有効であることが示された。

【0243】

（イヌにおける関節の痛みのための抗ＮＧＦ治療）
イヌ、マウス、およびヒトにわたって、β−ＮＧＦ上のＲＮ９１１の結合エピトープの中でアミノ酸配列同一性は１００％保存されている（図６Ｂ、上）。ＲＮ９１１の組換えイヌＮＧＦへの高親和性結合（Ｋ_D＝７５５ｐＭ）は実験的に確証され、そして痛みモデルを評価する際に当業者によって日常的に使用され、以下に記載されるイヌの滑膜炎痛みモデルにおける抗ＮＧＦｍＡｂの有効性が、ＲＮ９１１を使用して評価された。ＲＮ９１１は、専用に繁殖されたビーグルにおける薬物動態学／耐性と有効性の両方の研究のために、当業者の技術を使用して、十分な量で産生された。ＲＮ９１１のＩＶ注射の３日後および７日後の滑膜炎の誘導、ならびに滑膜炎誘導後の複数の時点での跛行／痛みの評価を含んだ有効性研究が設計された。次のセクションにおいて説明される薬物動態学／耐性研究は、ビーグルにおけるＲＮ９１１の安全性の信頼を得るために、および有効性研究のための用量選択の指導を補助するデータを収集するために、有効性研究に先立って実施された。

【0244】

（ＤＭＰＫ）
（代謝および体内動態）
すべてのタンパク質と同様に、ＲＮ９１１はアミノ酸および他の内因性成分に異化されることが推測できる。変化していないＲＮ９１１が排出されることはなさそうである。

【0245】

（薬物動態学）
イヌにおけるマウス抗ＮＧＦ ｍＡｂ ＲＮ９１１の薬物動態学（ＰＫ）は、単回ＩＶ投与後に研究された。３匹のイヌはプラセボ、４匹のイヌは１．２ｍｇ／ｋｇ、４匹のイヌは３．５ｍｇ／ｋｇ、そして１匹のイヌは９．８ｍｇ／ｋｇを投薬された。１匹のイヌのみが最高用量で利用された。薬物動態学データは低い変動性を示し、そしてすべての用量における「遊離の」ＲＮ９１１のプロフィールの類似の形状は、標的媒介性体内動態がＰＫの要因ではないことを示唆した。データは優秀な用量比例を示した。Ｔ_1/2はすべての用量で同様であり、平均では１０２±２７時間であった（ｎ＝９）。クリアランスは０．０００５１±０．００００５Ｌ／ｈ／ｋｇであり、非常に遅かった。分配量は０．０７２±０．０２１Ｌ／ｋｇであり、イヌの血液量に制約されるタンパク質について予測される量に近かった。図７は、以下に記載される滑膜炎有効性研究から分析されたマーカーの血清分析からのデータを示す。有効性研究における３ｍｇ／ｋｇでの血清濃度および薬物動態学は、ＰＫ研究における３．５ｍｇ／ｋｇでの値とほぼ同一であったことは明白である。

【0246】

「結合型」ＲＮ９１１は、ＥＬＩＳＡ法を使用して両方の研究でアッセイされた（図８）。濃度はＮＧＦ等価物として報告されている。少なくとも１週間の間、ほぼピークレベルのままであった典型的なＲＮ９１１−ＮＧＦ濃度は、ＮＧＦ等価物中でおよそ０．５ｎｇ／ｍＬであった。これは、イヌ血清中の内因性ＮＧＦ濃度（〜４０−６０ｐｇ／ｍＬ）よりも大体１０倍高い。

【0247】

典型的なＲＮ９１１−ＮＧＦ血清濃度は、ＲＮ９１１等価物に転換されたときに、およそ５ｎｇ／ｍＬ（０．５ｎｇ／ｍＬ＊分子量比率、１５０，０００／１３，４２５）であった。これは、最初の図において示された測定された遊離のＲＮ９１１濃度よりもはるかに下であり、ｍＡｂが、≧３ｍｇ／ｋｇの用量での数週間の間、過度のままである（ＮＧＦ濃度と比較した場合に）かもしれないことを示唆している。

【0248】

（免疫原性）
抗薬物抗体（ＡＤＡ）力価は、投薬前および研究の最後に決定された。表１に示されるように、少なくとも２匹のビーグルにおいて、ＡＤＡ力価の上昇の証拠が存在した（イヌ８および１２を参照のこと）。もしもこれがマウスｍＡｂであるならば、ＲＮ９１１がビーグルにおいて免疫応答を生成することは驚くべきことではない；このｍＡｂを用いて反復投薬研究を実施する試みは行われなかった。

【0249】

【表1】

【0250】

（生物分析アッセイの方法）
遊離のＲＮ９１１ ＥＬＩＳＡは、捕捉因子としての組換えイヌＮＧＦおよび検出抗体としてのペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗マウスＩｇＧの使用に基づいた。ＱＣならびに標準がアッセイランに含められた。

【0251】

結合型ＲＮ９１１−ＮＧＦ ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジンプレートに吸着させたビオチン化ウサギ抗ヒトＮＧＦの使用に基づいた。ＮＧＦ−ＲＮ９１１と遊離のＮＧＦの両方を捕捉したが、ＮＧＦ−ＲＮ９１１を捕捉しなかったこの抗体は、ペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗マウスＩｇＧを使用して選択的に検出された。標準は、既知の濃度のイヌＮＧＦを、わずかにモル過剰のＲＮ９１１とともに、インキュベーションすることによって調製された。

【0252】

抗薬物抗体ＥＬＩＳＡは、捕捉因子としてＲＮ９１１を利用した。イヌ血清サンプル中のＡＤＡはプレート上で捕捉され、４種すべてのイヌＩｇＧサブクラスを検出可能であったペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗イヌ抗体の混合物を使用して検出された。

【0253】

（薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ））
ＰＫ／ＰＤデータは、滑膜炎有効性研究において標的種の中でＲＮ９１１を用いて生成された。滑膜炎痛みモデルにおいて、単一の膝関節の滑膜の一過性炎症が、細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の関節内注射を介して誘導される。定量可能な跛行は滑膜炎誘導の２時間以内に起こり、３〜４時間のピークは６時間までに徐々に弱くなり、２４時間後には完全に消散した。ＩＡＣＵＣの見込みから、最初の滑膜炎誘導と関連する跛行が完全に消散したならば、２つの別々の場合に対して（すなわち、各々の膝関節において）滑膜炎を誘導することは受容可能である。それゆえに、本発明者らは、滑膜炎が、同じビーグルにおいて、ＩＶ処理（ＲＮ９１１またはＰＢＳビヒクル）の３日後および７日後に誘導される研究を設計した。各々の滑膜炎誘導後、跛行は、視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を使用して定量された。

【0254】

本研究の結果は、ＲＮ９１１（３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）が、投薬３日後において、滑膜炎関連跛行の統計学的に有意な減少を引き起こしたことを示す（図４）。この時点で、遊離のＲＮ９１１血清濃度は、平均で２４４００±３９００ｎｇ／ｍＬであった（１７０±２７ｎＭ；図２）。ＲＮ９１１は、７日目においてさらにより有効であり（図９）、このとき、遊離のＲＮ９１１血清濃度が平均で１３２００±３５００ｎｇ／ｍＬであった（９１±２４ｎＭ；図７）。

【0255】

（実施例２）
（イヌ化ストラテジー）
抗薬物抗体（ＡＤＡ）の生成は、モノクローナル抗体を含む任意の生物治療タンパク質の効力の損失と関連付けることができる。文献の包括的な評価は、免疫原性完全ヒトｍＡｂおよび非免疫原性キメラｍＡｂの例を見い出すことができるが、モノクローナル抗体のスペシエーションが、ｍＡｂが免疫原性である傾向を減少できることを示した。本明細書に提供されるマウス抗ＮＧＦ、ＲＮ９１１、モノクローナル抗体についてのＡＤＡ製剤に付随するリスクを和らげることを補助するために、イヌ化ストラテジーが利用された。このイヌ化ストラテジーは、ＣＤＲ移植のために最も適切なイヌの生殖系列抗体配列を同定することに基づいている（図３）。重鎖と軽鎖の両方についてのすべての利用可能なイヌ生殖系列配列の広範な分析後、生殖系列候補は、ＲＮ９１１に対するそれらの相同性に対して選択され、ＲＮ９１１からのＣＤＲが、ネイティブイヌＣＤＲを置き換えるために使用された。目的は、インビボでの免疫原性の潜在能力を最小化するために、完全なイヌフレームワークを使用して、高い親和性および細胞ベースの活性を保持することであった。イヌ化ｍＡｂは、哺乳動物発現のために最適化され、発現され、そしてＳＰＲを介してＮＧＦを結合するそれらの能力について特徴付けられた。これらの結果は、実施例３において以下に説明される。イヌ化後の信頼できる発現レベルとＮＧＦを結合する能力の両方を保持したｍＡｂのみがさらなる特徴付けに進められた。一過性に発現されず、またはＮＧＦを結合する能力を失ったｍＡｂは体系的に精査され、１）機能の喪失または発現の欠如の原因である鎖、２）発現または機能の喪失の原因であるフレームワーク、および３）発現または機能の喪失の原因であるアミノ酸を同定した。

【0256】

（実施例３）
（ＲＮ９１１抗体のイヌ化）
ｍＡｂ ＲＮ９１１のイヌ化可変重鎖および軽鎖を表す合成構築物が作られた。それぞれのイヌ化重鎖またはカッパ構築物領域を含有するプラスミドへの各々の可変鎖のサブクローニング後に、プラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞の中での抗体発現のために同時トランスフェクトされた。本発明のイヌ重鎖定常領域は任意の特定のサブタイプに限定されないが、しかし、ある実施形態において、イヌ重鎖は配列番号４５または配列番号４８に記載されている。イヌカッパ軽鎖定常領域は任意の特定の配列に限定されないが、しかし、本発明のある実施形態において、イヌカッパ軽鎖定常領域は配列番号４７に記載されている。ｍＡｂ「ｃａｎＥ３Ｍ６５」のために使用されるフレームワークはＨＥＫ２９３一過性発現系において発現され、イヌ化に際してＮＧＦ結合を保持した（アミノ酸配列３３「ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ」、配列番号３４「ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ」）。

【0257】

対照的に、ｃａｎ６１８（ＣＡＮ−６１８−ＶＬ；ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ）イヌ化の試みのために使用された生殖系列配列は、特定の非発現ｍＡｂを生じた。キメラ、ヘテロキメラ、およびイヌ化バージョンのｍＡｂ ＲＮ９１１が発現され、ＳＰＲを介してイヌＮＧＦを結合するそれらの能力について特徴付けされた。これらの結果は、イヌ化抗体が発現しなかったことを実証した。また、ヘテロキメラに関しては、イヌ化軽鎖と対合したキメラ重鎖が発現を失ったのに対して、キメラ軽鎖と対合したイヌ化重鎖は、ＨＥＫ２９３細胞における発現を保持した。ヘテロキメラから得られた結果に基づいて、イヌ化軽鎖が発現の喪失の原因であることが推定された。発現が失われたＲＮ９１１のイヌ化バージョンの発現を回復させるための試みにおいて、イヌ化軽鎖は、フレームワーク配列を交換することによって修飾された。図１０は、ｃａｎ９１１軽鎖フレームワーク置換作業の概観を提供する。この作業は、イヌのフレームワークＩＩ（ＦＷＩＩ）の中の残基を、マウスのフレームワークＩＩ配列で置き換え、ＨＥＫ２９３細胞における発現を回復した抗体（配列番号３５「ＣＡＮ−６１８−ＶＬ」、配列番号３６「ＣＡＮ−ＱＣ２３−ＶＬ」、および可変重鎖配列番号３４「ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ」）を同定した。

【0258】

図１１は、発現とそれぞれの変異の両方の結果を要約する。これらのデータは、フレームワーク３および４を使用するイヌ化誘導体が、両方とも、それらの前駆体分子と比較可能なＨＥＫ発現レベルを保持し、イヌＮＧＦへの結合を示すことを実証する。フレームワーク１は、より低い程度まで発現を保持したが、これもまたイヌＮＧＦへの結合を維持した。

【0259】

（実施例４）
（イヌ化抗ＮＧＦｍＡｂへのイヌＮＧＦ結合の特徴付け）
各イヌ化抗ＮＧＦ抗体のイヌＮＧＦへの親和性は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を使用して測定された。加えて、機能的インビトロアッセイが、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を阻害するｍＡｂの能力についての阻害定数を測定するために開発された。ｃａｎ６５１２（ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ、ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ、ＣＡＮ−６５Ｅ−ＨＣ、ＣＡＮ−ＫＡＰＰＡ−ＬＣ）およびＲＮ９１１について図１２および１３に示されたデータは、ｍＡｂのＮＧＦへの高い親和性結合、およびＮＧＦの受容体ｔｒｋＡへの結合のｍＡｂによる強力な阻害を例証する。しかし、ある程度の親和性は、ｍＡｂ ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ、ＣＡＮ−Ｅ３Ｍへのイヌ化の際に失われた。この親和性の喪失に起因して、イヌ化ｍＡｂは、効力を取り戻すために、親和性成熟化されている（詳細については実施例５を参照のこと）。各ＳＰＲアッセイ上での親和性成熟化された、ＳＳＭ５７（配列番号２７「ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＨ」、配列番号２６「ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ」）、ＳＳＭ５８（配列番号２８ ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨ、配列番号２６「ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ」）、およびＳＳＭ６６（アミノ酸配列２９ ＣＡＮ−ＳＳＭ６６、配列番号２６ ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ）の結果が図１２および１３に含まれた。

【0260】

（実施例５）
（イヌ化抗ＮＧＦｍＡｂの親和性成熟）
ｃａｎＥ３Ｍ６５（配列番号１６「ＣＡＮ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ」、配列番号１７「ＣＡＮ−Ｎ２Ｇ９−ＶＨ」）の親和性成熟は、イヌ化ｍＡｂの親和性を先祖のマウス抗体に戻すために必要である。ＣＤＲ領域のみにおける抗体配列中の個々の点変異を含有するための、２つの抗体ライブラリーが設計された。図１５は、各Ｆａｂライブラリーの設計ストラテジーを概観する。ここでは、ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）ライブラリーは、代表的な９個の保存性アミノ酸残基のうちの１個に限定された個別の変異誘発を備えるのに対して、部位特異的変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリーは、任意の天然のアミノ酸（ＣｙｓおよびＭｅｔはここでは除外されている）をサンプリングできる。このＬＴＭライブラリーは、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＬ３における有益な変異を同定するために構築された。あるいは、ＳＳＭライブラリーが、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＬ２に配置され、本発明者らが各ライブラリーからの有益な変異を組み合わせることを可能にする。

【0261】

ＬＴＭライブラリーは、当業者によって共通して使用されるオリゴヌクレオチド設計プログラムを使用して設計された一連のプライマーから構築された。ＰＣＲ産物は、３つの特定のＣＤＲの各々上での単一の変異、ならびにＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、および／またはＣＤＲＬ３上のバリエーションを含む組み合わせから構成されるＦａｂライブラリーを達成するために組み合わされた。９３％ライゲーション効率が、〜１０＾４のライブラリーサイズを用いて達成された。減少量のビオチン化イヌＮＧＦを用いる４ラウンドのパニングが実行され、拡張オフレートが、延長された一晩の洗浄工程によって選択された。１ｎｇ／μＬビーズから１０ｐｇ／μＬビーズまでの量の範囲で使用されたＮＧＦ抗原は、過剰の非ビオチン化ＮＧＦを使用して溶出された。４回目のパニングのラウンド後、アウトプットはＴＯＰＯベクターにクローニングされ、配列決定された。富化された変異は表２に示される。

【0262】

【表2】

【0263】

示された構築物は、全長ＩｇＧに転換され、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現された。個々のおよび組み合わせた変異についての発現の結果は、表３および４において以下に示される。

【0264】

【表3-1】

【0265】

【表3-2】

【0266】

【表4】

【0267】

上清に対するＳＰＲは、初期のスクリーニングとして実施され、良好な結合物が精製され、純粋なｍＡｂが再度ＳＰＲを介して実施され、イヌＮＧＦへの結合を測定した（表５）。構築物ＬＴＭ１０９およびＬＴＭ１３５は、結合親和性に基づいて進行するよう選択された。

【0268】

【表5-1】

【0269】

様々なＫＤは異なるセンサーに対応しており、表面密度はわずかに変動する。Ａｇｇは、抗体凝集の徴候を示す結合曲線が少なくとも１回の実行で見られたことを示す。

【0270】

ＳＳＭライブラリーを使用するファージディスプレイの４回のラウンドは、ＬＴＭのために使用される同じ野生型配列上での単一の部位変異を使用して実施された。ライブラリーは、ビオチン化または遊離のイヌＮＧＦに対してパンされ、各ラウンド後に、高親和性および遅いオフレートについて選択された。選択は以下に示されるように実行され、ラウンド４のアウトプットがＴＯＰＯクローニングされ、配列決定された。

【0271】

【表5-2】

【0272】

【表5-3】

【0273】

【表5-4】

【0274】

【表5-5】

【0275】

【表5-6】

【0276】

【表6】

【0277】

上記の表６は、ＳＳＭライブラリーディスプレイならびに初期の多様性から配列決定されたアウトプットを示す。富化された部位は、単一部位変異と複数部位変異（富化部位の組み合わせ）と、引き続くＩｇＧ転換の両方について選択された。重鎖と軽鎖の両方のＳＳＭ変異は、３つの鋳型：（１）野生型ｍＡｂ、（２）ＬＴＭ１０９（３）ＬＴＭ１３５に対して生成された。

【0278】

変異した抗体はＨＥＫ２９３細胞中で発現され、イヌＮＧＦに対する結合親和性について評価された（以下の結果；表７〜９における発現の結果）。抗体ＳＳＭ５７（配列番号２７「ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＶＬ」、配列番号２６「ＣＡＮ−ＳＳＭ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ））、ＳＳＭ５８（配列番号２８「ＣＡＮ−ＳＳＭ５８−ＶＨ」、配列番号２６「ＣＡＮ−ＳＳＭ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ」）、およびＳＳＭ６６（配列番号２９「ＣＡＮ−ＳＳＭ６６−ＶＨ」、配列番号２６「ＣＡＮ−ＳＳＭ−Ｅ３Ｍ−ＶＬ」）が最高の親和性を示した。

【0279】

【表7】

【0280】

【表8-1】

【0281】

【表8-2】

【0282】

【表8-3】

【0283】

【表9】

【0284】

（実施例６）
（イヌ化抗体型グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）プラスミドの産生）
イヌ化ＲＮ９１１ ｍＡｂをコードする遺伝子は、ＧＳプラスミドｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１２．４にそれぞれクローニングされた（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。得られたプラスミドは、製造業者のプロトコールに従って消化され、一緒にライゲーションされて、単一の哺乳動物発現プラスミドを形成した。各プラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用され、発現は２０Ｌの培養培地中で実行された。タンパク質は、馴化ＨＥＫ培地からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、標準的なタンパク質精製方法に従って単離された。培地はクロマトグラフィー樹脂上にロードされ、ｐＨシフトによって溶出された。溶出されたタンパク質はｐＨ調整され、透析され、そして使用前に滅菌ろ過された。得られた抗体は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって９９パーセントより上のモノマーであり、高分子量凝集物は観察されなかった。抗体は、インビボ有効性を評価するために、イヌ滑膜炎モデルにおける評価のために引き続き使用された。

【0285】

（実施例７）
（イヌ滑膜炎モデルにおけるイヌ化抗体の評価）
イヌ化ｍＡｂ（ＣＡＮ−ＳＳＭＥ３Ｍ−ＶＬ、ＣＡＮ−ＳＳＭ５７−ＨＣ）は、５ｍｇ／ｋｇ ＩＶおよび５ｍｇ／ｋｇ ＳＣで、イヌ滑膜炎モデルにおいて試験された。研究の結果は図１４に示され、投薬の７日後および２８日後に滑膜炎を誘導した。イヌ化ｍＡｂは、投薬の７日後と２８日後の両方で、ＳＣとＩＶの投薬計画について有効性を示した。
（実施例８）
（イヌ化抗体の薬物動態学）
イヌ化ＳＳＭ５７ ｍＡｂ（ＰＦ−０６４４２５９１）の薬物動態学（ＰＫ）が、６匹のイヌにおいて、５ｍｇ／ｋｇで、皮下（ＳＣ）投与を使用して研究された。イヌは、合計３回の注射について、５ｍｇ／ｋｇ ＳＣのｍＡｂを用いて、１４日ごとに１回投薬され（０日目、１４日目、２８日目）、完全安全評価のために３５日目に安楽死させられた（以下の安全情報を参照のこと）。各イヌからの血清サンプルは各投薬の前、および３５日にわたって定期的に収集された。抗体濃度は、ＥＬＩＳＡベース形式で測定され、そこでは、イヌＮＧＦは、血清からｍＡｂを捕捉するために使用された。次いで、抗体は、抗体サブクラスのＦｃ部分を認識する標識された抗イヌ抗体を使用して検出された。結果は図１６に示される。

【0286】

（実施例９）
（ラットＭＩＡモデルにおけるイヌ化抗体の評価）
骨関節炎（ＯＡ）は、関節痛および関節軟骨の進行性の喪失によって特徴付けられる変性関節疾患である。ＭＩＡの関節内注射は、ＯＡの病変に類似する軟骨下骨病変の進行を伴う関節軟骨の喪失を誘導する。このモデルは、齧歯動物種におけるＯＡ様病変を再生するための迅速かつ最小限に侵襲性の方法を提供する。

【0287】

骨関節炎のラットＭＩＡモデルにおける１用量のＭＩＡにおけるイヌ化抗ＮＧＦ抗体の鎮痛効果は、研究の間に２回、研究７日目と研究１４日目にイヌ化ＳＳＭ５７ ｍＡｂ（ＰＦ−０６４４２５９１）を投薬することによって実証された。痛みは、持続性の痛みのために重量負荷試験を、機械的痛覚過敏のために関節圧迫（Ｒａｎｄａｌｌ Ｓｅｌｉｔｔｏ）試験を使用して評価された。ラットＭＩＡ手順の図解については、図１７を参照のこと。

【0288】

（試験群の構成と用量レベル）
この表は研究において比較される実験群とそれぞれの用量レベルを列挙する。

【0289】

【表10-1】

【0290】

（感作物質の調製）
６０ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＩＡ溶液が生理食塩水中で調製された。各ラットは調製された溶液の５０μｌ、すなわち、３ｍｇのＭＩＡを投薬された。

【0291】

（ビヒクル調製（群１））
ビヒクル対照は生理食塩水であった。
（１０ｍｇ／ｋｇの用量でのモルヒネ調製（群２））
１．１３．５ｍｌ生理食塩水を１．５ｍｌモルヒネに加える
２．ラット体重２００ｇあたり１ｍｌの溶液を受容するように注射する
（試験項目の準備（群３〜４））
抗体は５ｍｇ／ｍｌであった。化合物は２〜８℃で保存され、使用前に光から遮断された。激しい振盪はしない。化合物は投薬前１時間の間、室温まであたためられた。

【0292】

（処理）
ビヒクル（群１）および試験項目ｍＡｂ（群３および４）は試験日７日目と１４日目にＳＣを経由して１回投与された。本研究におけるポジティブ対照であるモルヒネ（群２）は試験日７日目と１４日目にＳＣを経由して１回投与された。

【0293】

（投与の経路）
ｉ． ビヒクル対照 ＳＣ
ｉｉ， ポジティブ対照（モルヒネ）１０ｍｇ／ｋｇの用量 ＳＣ
ｉｉｉ． 試験項目 ｍＡｂ ＳＣ
（統計学／評価）
すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示される。各処理群は、一元ＡＮＯＶＡ分析、続いてテューキー検定を使用して（Ｐｒｉｓｍ Ｖ ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ビヒクル群と比較された。モデルを評価するための、ビヒクル群とモルヒネ群の間、およびのビヒクル群の中での比較は、Ｔ−検定を使用して実施された。ｐ値＜０．０５が有意差を表しているものとして考慮された。

【0294】

（動物の世話と使用）

【0295】

【表10-2】

【0296】

研究は、実験動物の世話および使用における倫理的行為のための委員会（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｎｄｕｃｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に提出された、示される規則および規定に準拠していると述べている申し込み書式の認可後に実施された。

【0297】

（重量負荷試験）
ラットトレーニング−試験環境への習慣付け
実験の中での変動性のレベルが比較的高いことが予期されたので、このトレーニング計画が必要とされた。従って、このプロトコールの使用は、変動性を減少させる手助けととなり、首尾よい研究の可能性を増加させる。各ラットは１分間取り扱われ、試験装置（インキャパシタンスメーター）の中に５分間配置された（試験装置への馴化）。この手順は研究−２日目に実施された。

【0298】

（重量負荷評価の詳細）
重量負荷の欠乏は、研究−１日目にすべてのラットにおいて測定され、この測定はベースラインとして役立った。次いで、重量負荷は、研究９日目、１６日目、２１日目、および２８日目に記録された。インキャパシタンスメーターは、５秒間の時間にわたる３回の測定を記録し、次いで、これらを平均して１つの値を得る。

【0299】

（機械的痛覚過敏（Ｒａｎｄａｌｌ Ｓｅｌｉｔｔｏ試験））
痛覚計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を使用するＲａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ試験を用いて、グラムで表現される、ラットにおける機械的閾値が測定された。この試験は、後足に対して有害な圧力を適用することによって実施された。モーターを作動させるペダルを押すことによって、線形スケール上で一定の速度で力が増加した。動物が、足の引っ込みまたは発声により痛みを示したとき、ペダルはすぐに解放され、侵害性の閾値がスケール上で読み取られた。４００ｇのカットオフが使用されて、潜在的な組織損傷を回避した。Ｒａｎｄａｌｌ Ｓｅｌｉｔｔｏ試験は、研究−１日目（ベースライン）と２８日目に実施された。

【0300】

（臨床徴候）
３０日間の研究の全体を通して、注意深い臨床試験が少なくとも１日１回実施された。何らかの異常が観察された場合、これらは記録された。観察には、皮膚、毛皮、眼、粘膜の変化、分泌物および排泄物（例えば、下痢）の発生、自律神経活性化（例えば、流涙、流涎、立毛、瞳孔の大きさ、異常な呼吸パターン）、歩行、姿勢、および取り扱いに対する反応、ならびに異常な行動、ふるえ、けいれん、眠り、および昏睡の存在が含まれた。

【0301】

（結果）
すべての群についての平均群体重（ｇ）。

【0302】

【表11】

【0303】

（重量負荷試験に対する応答（足の間の違い）（ｇ））
＊ビヒクルに対してｐ＜０．０５一方向ＡＮＯＶＡ、続いてテューキー検定を使用
各足の重量負荷試験は、重量負荷装置（ＩＩＴＣ，Ｓｅｒｉｅｓ ８，Ｍｏｄｅｌ ６００（登録商標））によって別々に測定された。この試験は、２つの別々のセンサー上で、動物が各後足に適用する重量を独立して測定することによって、自発性の痛みを反映する自発性の姿勢の変化を定量する。

【0304】

結果が計算され、２つの後足にかかるもたれた重さの総量からの、動物が、損傷した右足またはインタクトな左足にもたれた重量のパーセンテージとして表された。次いで、インタクトな左足の値−損傷した右足の値の２つの値の間の差が計算される。

【0305】

重量負荷試験は、動物の重量を後足上にかけるその動物の能力を測定する。通常の条件では、動物は、その重量を両方の後足に均等にかける（左足に５０％および右足に５０％）。従って、各足にかかる重量のパーセンテージの間の違いは０％に近い。動物が痛みを経験するとき、この状況は変化する。動物は、痛みのない足により多くの重量をかけ、痛みのある足により少ない重量をかける傾向がある。結果として、両方の足にかかる重量のパーセンテージの違いは増大する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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