特許 6632010 プランクトンからの３、５−ジヒドロキシ−４−メトキシベンジルアルコール（３、５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の生成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6632010

(24)【登録日】2019年12月20日

(45)【発行日】2020年1月15日

(54)【発明の名称】プランクトンからの３、５−ジヒドロキシ−４−メトキシベンジルアルコール（３、５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の生成方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/22 20060101AFI20200106BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20200106BHJP

   C07C 41/44 20060101ALI20200106BHJP

   C07C 43/23 20060101ALI20200106BHJP

   C09K 15/08 20060101ALN20200106BHJP

   A23L 17/40 20160101ALN20200106BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/22

   C12N1/12 Z

   C07C41/44

   C07C43/23 A

   !C09K15/08

   !A23L17/40 C

【請求項の数】4

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2019-53147(P2019-53147)

(22)【出願日】2019年3月20日

【審査請求日】2019年4月10日

(31)【優先権主張番号】特願2018-148628(P2018-148628)

(32)【優先日】2018年8月7日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】596161031

【氏名又は名称】株式会社渡辺オイスター研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100082658

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 儀一郎

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 貢

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−０４２８２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１５３８５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１８−１１８９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１７−１３２７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 付着生物研究 (1994) Vol.10, No.2, pp.7-25

【文献】 Food Chemistry (2012) Vol.134, pp.2086-2089

【文献】 J. Agric. Food Chem. (2012) Vol.60, No.3, pp.830-835

【文献】 Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries (1977) Vol.43, No.12, pp.1391-1396

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ７／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ０９Ｋ １５／００

Ｃ０７Ｃ ４１／００

Ｃ０７Ｃ ４３／００

Ａ２３Ｌ １７／００

Ａ２３Ｌ ３１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、前記フィルター上に残ったプランクトンにつき細胞内容物の取り出しを行ない、その後取り出した細胞内容物を100℃の温度で1時間以上加熱し、該加熱した加熱物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とするプランクトンからの3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の生成方法。

【請求項2】

採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、フィルター上に残ったプランクトンにつき抽出液を加えて破砕し、前記プランクトンから細胞内容物の抽出を行った後、100℃の温度で1時間以上加熱し、該加熱した加熱物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とするプランクトンからの3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の生成方法。

【請求項3】

採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、前記フィルター上に残ったプランクトンにつき細胞内容物の取り出しを行ない、その後取り出した細胞内容物を２気圧で１時間以上加圧し、該加圧した加圧物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とするプランクトンからの3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の生成方法。

【請求項4】

採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、フィルター上に残ったプランクトンにつき抽出液を加えて破砕し、前記プランクトンから細胞内容物の抽出を行った後、２気圧で１時間以上加圧し、該加圧した加圧物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とするプランクトンからの3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の生成方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プランクトンから抗酸化物質である3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成する3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の生成方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

本件発明者は、すでに新規の抗酸化物質である3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール：3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol（以下ＤＨＭＢＡ（ディーバ）と称する）を加熱したカキ肉より見いだし、その合成、同定にも成功している。尚、生カキ肉からはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されていない。
ここで、カキの生態的特徴としては、多量の海水を吸い込み、吸い込んだ多量の海水より餌となるプランクトンを取り込むことが一般に知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１６−４２８２５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかして、本件発明者は、本発明において、プランクトンにＤＨＭＢＡ（ディーバ）が含まれるとの仮説を立てた。
そこでプランクトンを採取、濾過し、プランクトン中のＤＨＭＢＡ（ディーバ）を測定したところ、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されなかった。次にそのプランクトンを採取、濾過し、加熱したところ、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された。また、プランクトンを採取、濾過し、加圧したところ、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された。

【0005】

よって、本件発明者は、前記ＤＨＭＢＡ（ディーバ）がプランクトン由来の有用物質であると考え、当該プランクトンからのＤＨＭＢＡ（ディーバ）の生成方法を創案するに至ったものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、
採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、前記フィルター上に残ったプランクトンにつき細胞内容物の取り出しを行ない、その後取り出した細胞内容物を100℃の温度で1時間以上加熱し、該加熱した加熱物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とし、
または、
採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、フィルター上に残ったプランクトンにつき抽出液を加えて破砕し、前記プランクトンから細胞内容物の抽出を行った後、100℃の温度で1時間以上加熱し、該加熱した加熱物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とし、
または、
採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、前記フィルター上に残ったプランクトンにつき細胞内容物の取り出しを行ない、その後取り出した細胞内容物を２気圧で１時間以上加圧し、該加圧した加圧物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とし、
または、
採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、フィルター上に残ったプランクトンにつき抽出液を加えて破砕し、前記プランクトンから細胞内容物の抽出を行った後、２気圧で１時間以上加圧し、該加圧した加圧物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、
前記プランクトンは、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である、
ことを特徴とするものである。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、プランクトンを含む海水を採取し、該海水に含まれるプランクトンから抗酸化物質であるＤＨＭＢＡ（ディーバ）の生成方法を提供できるとの優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】採取した海水を濾過する説明図である。

【図2】濾過したフィルター上に残ったプランクトンをソニケーションし、その後ＤＨＭＢＡ（ディーバ）を加熱抽出する説明図である。

【図3】濾過したフィルター上に残ったプランクトンをソニケーションし、その後ＤＨＭＢＡ（ディーバ）を加圧抽出する説明図である。

【図4】広島の所定海域で所定時期に採取した海水に存するプランクトンを加熱したときにＤＨＭＢＡ（ディーバ）が生成されているか否かを説明する説明図（１）である。

【図5】広島の所定海域で所定時期に採取した海水に存するプランクトンを加熱したときにＤＨＭＢＡ（ディーバ）が生成されているか否かを説明する説明図（２）である。

【図6】宮城の所定海域で所定時期に採取した海水に存するプランクトンを加熱したときにＤＨＭＢＡ（ディーバ）が生成されているか否かを説明する説明図である。

【図7】宮城の所定海域で所定時期に採取した海水に存するプランクトンを加圧したときにＤＨＭＢＡ（ディーバ）が生成されているか否かを説明する説明図である。

【図8】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（１）である。

【図9】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（２）である。

【図10】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（１）である。

【図11】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（２）である。

【図12】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（３）である。

【図13】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（４）である。

【図14】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（５）である。

【図15】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（３）である。

【図16】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（４）である。

【図17】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（５）である。

【図18】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（６）である。

【図19】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（７）である。

【図20】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（８）である。

【図21】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（６）である。

【図22】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（７）である。

【図23】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（８）である。

【図24】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（９）である。

【図25】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（１０）である。

【図26】検索条件を環境由来配列を除く全体に対して検索した結果を説明する説明図（１１）である。

【図27】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（９）である。

【図28】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（１０）である。

【図29】検索条件をタイプ由来配列に限定して検索した結果を説明する説明図（１１）である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

まず、主にカキ養殖が行われている海域（例えば広島・宮城海域）での所定時期の海水を採取し、採取した海水につき、濾過を行い、濾過に使用したフィルター上に残ったプランクトン１を取り出し、それを加熱、あるいは加圧後、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出されるか否かの探索・分析を行ったものである。

【0010】

まず、加熱によるＤＨＭＢＡ（ディーバ）の検出につき説明する。
カキ養殖の現場海域（例えば広島・宮城海域）での海水を採取した。

【0011】

（プランクトンを含む海水の採取）
カキ養殖が行われている海域（例えば、広島、宮城海域）における所定時期での海水、即ち、広島県での海域では、９月、３月のプランクトンを含む海水を、宮城県での海域では５月のプランクトンを含む海水をポンプなどで汲み上げる。
なお、本実施例では、広島や宮城での海域の海水を採取したが、広島や宮城の海水に限定されるものではない。
また、時期についても９月或いは３月の海水に限定はされない。

【0012】

（プランクトンを含む海水の濾過）
プランクトン１を含む海水を採取した後、この海水を不織布などで構成された、例えばＧＦ/Ｃフィルター４にて濾過する（図１参照）。
ここで、濾過する海水の量については、何ら限定されるものではないが、今回は広島あるいは宮城の海域においておのおの約３１００リットルの海水を採取し、これを濾過した。
なお、上記手法にて濾過済みのフィルターには、その上に多くのプランクトン１が付着しており、このプランクトン１が付着したフィルターは抽出作業を行うまで冷凍保存することができる。

【0013】

（超音波処理）
次に、例えばプランクトン１が付着したフィルターを冷凍保存し、その冷凍保存してあるフィルターを遠沈管等の容器５に入れ、該容器５内に例えば超純水を加えて、プランクトン１をさらに例えば超音波で１時間程度ソニケーションまたはボールミルによって、細胞壁を破壊し、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）などを抽出しやすくする。

【0014】

（抽出）
前記例えばソニケーション等の方法でプランクトン１の細胞を破壊した後、それを加熱して該細胞の内容物を取り出す。すなわち前記のプランクトンなどを約１００℃で湯煎抽出など行う（図２参照）。
ここで、湯煎抽出による加熱であるから、前記容器５内のプランクトン１を直接加熱するものではない。すなわち、ビーカーなどに加熱した湯を貯留し、この湯の中に容器５を入れて、いわゆる間接的な加熱を行う。これにより、温度を一定にして加熱出来ることなど安定的な加熱抽出が出来る利点がある。

【0015】

（サンプリング）
そして、前記湯煎抽出については、１時間ごとに５時間のサンプリングを行った。

【0016】

（有用物質分析）
前記サンプリングしたプランクトン１のＤＨＭＢＡ（ディーバ）の濃度をLC-MS/MSで測定した。

【0017】

（広島海域サンプリングの抽出実験の結果）
すると、前記の２０１６年９月、２０１７年３月の広島海域サンプリングについては、９月、３月ともに、加熱前のプランクトンにはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されなかった。
しかし、９月の広島海域サンプルについては、加熱した後、すなわち湯煎抽出後１時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．３０３（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。また、湯煎抽出後２時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．２９７（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後３時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．２７９（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。さらに、湯煎抽出後４時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．２７４（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後５時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．２１７（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。

【0018】

また、３月の広島海域サンプルについては、加熱した後、すなわち湯煎抽出後１時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．９０６（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。また、湯煎抽出後２時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．６６（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後３時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．６８６（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。さらに、湯煎抽出後４時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．５１７（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後５時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．７９４（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた（図４、図５参照）。

【0019】

（宮城海域サンプリングの抽出実験の結果）
２０１６年５月の宮城海域サンプリングでのＤＨＭＢＡ（ディーバ）の検出結果を図６に示す。

【0020】

図６には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量の時間ごとの変化が示されている。加熱前のサンプルには、広島海域サンプルと同様に、加熱前のプランクトンにはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されなかった。しかし、加熱した後、すなわち湯煎抽出後１時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．１０８（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。また、湯煎抽出後２時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．１１３（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後３時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．１５６（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。さらに、湯煎抽出後４時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．１２５（ｎｇ／Ｌ）検出され、湯煎抽出後５時間後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．１３４（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた（図６参照）。

【0021】

尚、加熱時間については１時間経過後との時間に限定されない。１時間より短い加熱時間でＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出される可能性もある。
いずれにせよ、プランクトンを加熱しないときには、そのプランクトンからはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されないが、プランクトンを加熱したときは、速やかに加熱したプランクトンからＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出できることが明らかになった。

【0022】

次に、加圧によるＤＨＭＢＡ（ディーバ）の検出につき説明する。
まず、カキ養殖の現場海域（例えば宮城海域）での海水を採取した。

【0023】

（プランクトンを含む海水の採取）
カキ養殖が行われている海域（例えば、宮城海域）における所定時期での海水、即ち、宮城県での海域では２０１６年５月のプランクトンを含む海水をポンプなどで汲み上げる。
なお、本実施例では、宮城での海域の海水を採取したが、宮城の海水に限定されるものではない。また、時期についても５月の海水に限定はされない。

【0024】

（プランクトンを含む海水の濾過）
プランクトン１を含む海水を採取した後、この海水を不織布などで構成された、例えばＧＦ/Ｃフィルター４にて濾過する（図１参照）。
ここで、濾過する海水の量については、何ら限定されるものではないが、今回は宮城の海域において約３１００リットルの海水を採取し、これを濾過した。
なお、上記手法にて濾過済みのフィルターには、その上に多くのプランクトン１が付着しており、このプランクトン１が付着したフィルターは抽出作業を行うまで冷凍保存することが出来る。

【0025】

（超音波処理）
次に、例えばプランクトン１が付着したフィルターを冷凍保存し、その冷凍保存したフィルターを遠沈管等の容器５に入れ、該容器５内に例えば超純水を加えて、プランクトン１をさらに例えば超音波で１時間程度ソニケーションまたはボールミルによって、細胞壁を破壊し、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）などを抽出しやすくする。

【0026】

（抽出）
その後、前記例えばソニケーション等の方法でプランクトン１の細胞を破壊した後、それを加圧して該細胞の内容物を取り出す。すなわち前記のプランクトンなどを約２気圧に加圧して抽出した（図３参照）。
ここで、加圧方法については何ら限定されない。一般的な方法である加圧釜を使用して行って加圧しても構わない。また、ほかの方法で加圧しても構わない。

【0027】

（サンプリング）
そして、前記加圧抽出については、１時間ごとに５時間のサンプリングを行った。

【0028】

（有用物質分析）
前記サンプリングしたプランクトン１のＤＨＭＢＡ（ディーバ）の濃度をLC-MS/MSで測定した。

【0029】

（宮城海域サンプリングの抽出実験の結果）
宮城海域サンプリングでのＤＨＭＢＡ（ディーバ）の検出結果を図７に示す。

【0030】

図７には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量の時間ごとの変化が示されている。加圧前のプランクトンにはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されなかった。２気圧で加圧した後、すなわち２気圧で１時間加圧後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．０５（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。また、２気圧で２時間加圧後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．２９（ｎｇ／Ｌ）検出され、２気圧で３時間加圧後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．４９（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた。さらに、２気圧で４時間加圧後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．５８（ｎｇ／Ｌ）検出され、２気圧で５時間加圧後には、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出量は、０．６７（ｎｇ／Ｌ）検出されたことが確認できた（図７参照）。

【0031】

いずれにせよ、プランクトンを加圧しないときには、そのプランクトンからはＤＨＭＢＡ（ディーバ）は検出されないが、プランクトンを加圧したときは、速やかに加圧したプランクトンからＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出できることが明らかになった。

【0032】

（ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出できるプランクトン1の特定）
海水中のプランクトン1は多種類存在しており、いかなる種類のプランクトン1につきＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出されたのかは不明であった。そこで本件発明者は、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出されたプランクトン1を特定することにした。
本件発明者は、前記のように海水を採取し、その中のプランクトン１を取得した。
取得した大量種類のプランクトン１から約２００種類ほど選択し、その約２００種類のプランクトン１をそれぞれ培養した。
そして、それぞれ培養した約２００種類のプランクトンにつき、前述のＤＨＭＢＡ（ディーバ）抽出処理を行った。すなわち、前記した超音波処理、前記の加熱あるいは加圧による抽出処理などを行ったのである。

【0033】

その結果、ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出されたプランクトン1は、微細藻類４株であった。そして、この微細藻類４株の形態上から詳細に観察したところ、これらは、珪藻であることが特定出来た。
尚、珪藻は植物プランクトンの中で最も豊富であり、多種類存在している。
しかるに、本件発明者がＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された前記微細藻類４株の形態を顕微鏡によって詳細に観察したところ、４株すべて珪藻であった。ここで、使用した顕微鏡の倍率は、1,000倍（接眼レンズ：10倍、対物レンズ：100倍）である。
前記微細藻類４株、すなわち、珪藻は、湾内の海水に広く分布する海産珪藻の仲間で、豊富な不飽和脂肪酸を生産する珪藻として知られている。また、超浮遊性の珪藻としても知られている。

【0034】

次に本件発明者は、前記微細藻類４株、すなわち珪藻のＤＮＡ分析を行い、さらなる珪藻の具体的特定を企図した。
ＤＮＡ分析では、珪藻がいかなる分級階級に属するかについて行うものであり、前記分級階級は「門」、「亜門」、「綱」、「亜綱」、「目」、「科」、「属」、「種」と分類されている。そして「門」から「種」に近づくにつれより特定されていくものとなる。
以下にそのＤＮＡ分析の経過につき説明する。

【0035】

ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された珪藻（H-7-09株）の同定
クサリケイソウ亜綱の珪藻であると思われる。但し、「目」以下のレベルの同定には至らなかった。

【0036】

（方法）
Genbank（NCBI, NHI）でmegablast検索を実施
検索条件（１） 環境由来配列を除く全体に対して検索（図８、図９）
→こちらの結果に基づいて考察する。
検索条件（２） タイプ由来配列に限定して検索（図１０、図１１）
→比較対象の配列データの情報量が不十分であったため、こちらの結果に基づく考察は行わない。

【0037】

（megablast検索結果）
・18S
Humidophila schmassmannii isolate HYU-D030株の配列と約96.2％の相同性を示した。
→相同性が96％程度と低い。
但し、2番目以降にヒットした配列も考慮すると、クサリケイソウ綱サリケイソウ亜綱の珪藻であると推定される。
・28S D2R2による配列
Pseudo-nitzschia multistriata strain HAB-132株の配列と約96.1％の相同性を示した。
→相同性が96％程度と低い。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率とも低く、18Sの結果に比べ、同定結果への信頼度が低い。
但し、18Sの結果から推定される、クサリケイソウ亜綱の珪藻である可能性と矛盾していない。

【0038】

（同定結果）
珪藻門、クサリケイソウ亜門、サリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱の珪藻であると思われる。
但し、「目」以下のレベルは同定できない。

【0039】

ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された珪藻（H-9-05株）の同定
珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると思われる。
但し、「種」レベルの同定には至らなかった。

【0040】

（方法）
Genbank（NCBI, NHI）でmegablast検索を実施
検索条件（１） 環境由来配列を除く全体に対して検索（図１２、図１３、図１４）
→こちらの結果に基づいて考察する。
検索条件（２） タイプ由来配列に限定して検索（図１５、図１６、図１７）
→比較対象の配列データの情報量が不十分であったため、こちらの結果に基づく考察は行わない。

【0041】

（megablast検索結果）
・18S
Entomoneis paludosa L431株の配列と98％の相同性を示した。
→相同性が98％と低めであるが、2番目以降もヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）がヒットしていることを考慮すると、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると推定される。
・28S D2C2による配列
Entomoneis ornata 27D株の配列と92％の相同性を示した。
→相同性が92％とかなり低く、あまり参考にならない。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率とも低く、18Sの結果に比べ、同定結果への信頼度がかなり低い。
但し、18Sの結果から推定される、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である可能性と矛盾していない。
・28S D2R2による配列
Pseudo-nitzschia multistriata HAB-132株の配列と96％の相同性を示した。
→相同性が96％と低く、あまり参考にならない。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率がD2C2に比べても低く、同定結果への信頼度がかなり低い。
但し、18Sの結果から推定される、クサリケイソウ亜綱の珪藻である可能性と矛盾していない。

【0042】

（同定結果）
珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると思われる。
但し、「種」レベルの同定には至らなかった。

【0043】

ＤＨＭＢＡ（ディーバ）が検出された珪藻（H-9-06株）の同定
珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると思われる。
但し、「種」レベルの同定には至らなかった。

【0044】

（方法）Genbank（NCBI, NHI）でmegablast検索を実施
検索条件（１） 環境由来配列を除く全体に対して検索（図１８、図１９、図２０）
→こちらの結果に基づいて考察する。
検索条件（２） タイプ由来配列に限定して検索（図２１、図２２、図２３）
→比較対象の配列データの情報量が不十分であったため、こちらの結果に基づく考察は行わない。

【0045】

（megablast検索結果）
・18S
Entomoneis paludosa L431株の配列と99％の相同性を示した。
→相同性が99％あること、また2番目以降もヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）がヒットしていることを考慮すると、珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると推定される。
・28S D2C2による配列
Entomoneis ornata 27D株の配列と91％の相同性を示した。
→相同性が91％とかなり低く、あまり参考にならない。また、配列が短いうえスコアが低く、18Sの結果に比べ、同定結果への信頼度がかなり低い。
但し、18Sの結果から推定される、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻である可能性と矛盾していない。
・28S D2R2による配列
Vannella septentrionalis（アメーバ）と88％の相同性を示した。
また、アーバスキュラー菌根を形成する真菌類と79％以下の相同性を示した。
→相同性が90％未満である。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率がD2C2に比べても低く、同定結果への信頼度がかなり低い。
このため、今回の同定の考察からは除外する。

【0046】

（同定結果）
珪藻門、クサリケイソウ亜門、クサリケイソウ綱、クサリケイソウ亜綱、コバンケイソウ目（スリレラ（Surirellales）目）、ヨジレケイソウ科（エントモネイス（Entomoneidaceae）科）、ヨジレケイソウ属（エントモネイス（Entomoneis）属）の珪藻であると思われる。

【0047】

H-9-09株 同定
不明

【0048】

（方法）Genbank（NCBI, NHI）でmegablast検索を実施
検索条件（１） 環境由来配列を除く全体に対して検索（図２４、図２５、図２６）
→こちらの結果に基づいて考察する。
検索条件（２） タイプ由来配列に限定して検索（図２７、図２８、図２９）
→比較対象の配列データの情報量が不十分であったため、こちらの結果に基づく考察は行わない。

【0049】

（megablast検索結果）
・18S
Caecitellus paraparvulus HFCC320株（ビコソエカ）の配列と97％の相同性を示した。
2番目以降も、いずれも同属の珪藻と97％の相同性を示した。
→相同性が97％と低めであるが、ビコソエカ類の配列が増幅された可能性を否定できない。
但し、事前の検鏡では、検体が珪藻様の形状を示すことが確認されている。
・28S D2C2による配列
Caecitellus paraparvulus HFCC71株（ビコソエカ）の配列と88％の相同性を示した。
→相同性が90％未満である。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率とも低く、18Sの結果に比べ、同定結果への信頼度がかなり低い。
このため、今回の同定の考察からは除外する。
但し、18Sの結果（ビコソエカであること）とは矛盾していない。
・28S D2R2による配列
Pseudo-nitzschia multistriata HAB-132株（クサリケイソウ亜綱）の配列と92％の相同性を示した。
→相同性が92％と低い。また、配列が短いうえ、スコア、カバー率とも低く、18Sの結果に比べ、同定結果への信頼度が低い。
但し、事前の形態観察（珪藻であること）とは矛盾していない。

【0050】

（同定結果）
不明

【符号の説明】

【0051】

１ プランクトン
４ ＧＦ/Ｃフィルター
５ 容器

【要約】

【課題】本発明はプランクトンを含む海水を採取し、該海水に含まれるプランクトンから抗酸化物質であるＤＨＭＢＡ（ディーバ）の生成方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、採取したプランクトンを含む海水につき、フィルターを用いてろ過を行い、前記フィルター上に残ったプランクトンにつき細胞内容物の取り出しを行ない、その後取り出した細胞内容物を加熱し、該加熱した加熱物から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を生成してなり、前記プランクトンは、珪藻であるとすることを特徴とする。
【選択図】 図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】