特許 6636959 脂肪酸、および生体分子へのコンジュゲーションにおけるその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6636959

(24)【登録日】2019年12月27日

(45)【発行日】2020年1月29日

(54)【発明の名称】脂肪酸、および生体分子へのコンジュゲーションにおけるその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20200120BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20200120BHJP

   C07C 59/245 20060101ALI20200120BHJP

   C07C 59/42 20060101ALI20200120BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 3/04 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 1/18 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 3/06 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 1/16 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 5/50 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 9/12 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 9/00 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 9/14 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 9/04 20060101ALN20200120BHJP

   A61P 1/04 20060101ALN20200120BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/54

   A61K38/22

   C07C59/245

   C07C59/42

   !A61P3/10

   !A61P3/04

   !A61P1/18

   !A61P3/06

   !A61P1/16

   !A61P5/50

   !A61P9/12

   !A61P9/00

   !A61P9/10 101

   !A61P9/14

   !A61P9/10

   !A61P9/04

   !A61P1/04

【請求項の数】23

【全頁数】226

(21)【出願番号】特願2016-574916(P2016-574916)

(86)(22)【出願日】2015年6月18日

(65)【公表番号】特表2017-519024(P2017-519024A)

(43)【公表日】2017年7月13日

(86)【国際出願番号】US2015036328

(87)【国際公開番号】WO2015200078

(87)【国際公開日】20151230

【審査請求日】2018年6月4日

(31)【優先権主張番号】62/015,862

(32)【優先日】2014年6月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/082,327

(32)【優先日】2014年11月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/107,016

(32)【優先日】2015年1月23日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】バーンズ，デイビッド ウェニンガー

(72)【発明者】

【氏名】山田 健

(72)【発明者】

【氏名】イベブンジョ，チクウェンドゥ

(72)【発明者】

【氏名】ダッタロイ，アロケシュ

(72)【発明者】

【氏名】カーマン，ルイーズ クレア

(72)【発明者】

【氏名】ブルース，アレクサンドラ マーシャル

(72)【発明者】

【氏名】ウセラ，アイミー リチャードソン

(72)【発明者】

【氏名】ゼクリ，フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】ユアン，ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ルー，チャンギャング

(72)【発明者】

【氏名】カンター，アーロン

(72)【発明者】

【氏名】ボース，アヴィラップ

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０８３５０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１９６８９９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１４８１１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 MICHAEL J HACKETT，A DICARBOXYLIC FATTY ACID DERIVATIVE OF PACLITAXEL FOR ALBUMIN-ASSISTED DRUG DELIVERY，JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES，米国，AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION，２０１２年 ６月 ６日，VOL:101, NR:9,，PAGE(S):3292 - 3304，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1002/jps.23213

【文献】 LEFORT D，FREE-RADICAL ADDITION OF ALCOHOLS AND ACIDS TO 10-UNDECENOIC ESTERS, 10-UNDECEN-1-OL, AND 以下備考，BULLETIN OF THE ACADEMY OF SCIENCES OF THE USSR, DIVISION OF CHEMICAL SCIENCES，米国，SPRINGER NEW YORK LLC，１９６７年，VOL:16, NR:3,，PAGE(S):623 - 627，10-UNDECENYL ACETATE，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1007/BF00906006

【文献】 OLOF CEDER，PIMARICIN. II. HIGH PRESSURE---HIGH TEMPERATURE HYDROGENATION STUDIES，ACTA CHIMICA SCANDINAVICA，１９６４年，V18，P83-97，ＵＲＬ，http://actachemscand.org/pdf/acta_vol_18_p0083-0097.pdf

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ｃ０７Ｃ ５９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、
前記生体分子は、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、もしくは断片、またはその二量体であり、
前記脂肪酸は、次式Ａ１：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

［Ｒ^１は、ＣＯ_２ＨまたはＨであり、
Ｒ^２およびＲ^３は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、
ｎおよびｍは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］を有する、
コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項2】

前記脂肪酸が

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ａｋ^３、Ａｋ^４、Ａｋ^５、Ａｋ^６、およびＡｋ^７は、独立して、線状（Ｃ_８〜２０）アルキレンであり、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、線状（Ｃ_８〜２０）アルキルである］から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項3】

前記脂肪酸が

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項4】

前記リンカーが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および／もしくは前記脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、請求項１、２、または３に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項5】

前記リンカーが、式：

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｙは、０〜３４である］の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項6】

前記リンカーが、次式の１つのヘテロ環部分：

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｒは、０〜２の整数であり、ｓは、０〜３の整数である］を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項7】

前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項8】

前記脂肪酸にリンカーを介して連結している生体分子を含む前記コンジュゲートが、次式：

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

［式ＣおよびＤにおいて、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊の両方のモノマー単位は、両方のＮ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］、または

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

［式ＥおよびＦにおいて、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊のモノマー単位の一方だけが、Ｎ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］の１つを有し、
ｈＧＤＦ１５＊は、Ｎ末端にある２または３つのアミノ酸がアミノ酸配列ＸＨ−またはＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、ＭおよびＡから独立して選択される］でそれぞれ置き換えられているｈＧＤＦ１５であり、
ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５は、１〜６つのヒスチジンアミノ酸と、場合により１または２つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのＮ末端に付加されているｈＧＤＦ１５であり、
ｓは、２０〜３０の間の整数であり、
ｈｉｓ−ｈＤＧＦ１５の２つのモノマー単位間、またはｈＧＤＦ１５＊の２つのモノマー単位間の線は、ジスルフィド結合を表す、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項9】

式Ｃを有する請求項８に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と式Ｅを有する請求項８に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩とを含む混合物、または式Ｄを有する請求項８に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と式Ｆを有する請求項８に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩とを含む混合物。

【請求項10】

前記生体分子が、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＡＨ（１９９−３０８）ＧＤＦ１５、ＭＨＨＨＨＨＨＭ−ｈＧＤＦ１５、もしくはＭＨＨＨＨＨＨ−ｈＧＤＦ１５またはその二量体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項11】

脂肪酸にリンカーを介して連結している生体分子を含む前記コンジュゲートが、式Ｇまたは式Ｈのものである、請求項８または１０に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５は、配列番号７であり、前記脂肪酸は、２つのモノマー単位の一方または両方のＮ末端において、リンカーを介して連結しており、２つのＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５単位間の線は、ジスルフィド結合を表す］。

【請求項12】

式Ｇを有する請求項１１に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と式Ｈを有する請求項１１に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩とを含む混合物。

【請求項13】

前記混合物は、１：１のモル比の式Ｇのコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と式Ｈのコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載の混合物。

【請求項14】

１０時間を超える、２０時間を超える、または３０時間を超える血漿安定性半減期を有する、請求項１〜８、１０および１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項15】

コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向上が、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または７５倍である、請求項１〜８、１０、１１および１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。

【請求項16】

請求項１から８、１０、１１、１４または１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または請求項９、１２または１３に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の混合物を含む、医薬組成物。

【請求項17】

代謝性障害または疾患、糖尿病、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含む）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害の治療または予防において使用するための、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、請求項１から８、１０、１１、１４または１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または請求項９、１２または１３に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の混合物を含む、医薬組成物。

【請求項18】

前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、請求項１から８、１０、１１、１４または１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または請求項９、１２または１３に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の混合物を含み、治療活性のある１種または複数の共薬剤と組み合わせて用いるための、医薬組成物。

【請求項19】

前記共薬剤が、抗糖尿病薬、脂質低下薬、抗肥満薬、降圧薬、およびペルオキシソーム増殖因子−活性化因子受容体のアゴニストから選択されたものである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記共薬剤が、インスリン、インスリン誘導体および模倣物；インスリン分泌促進物；グリブリド、Ａｍａｒｙｌ；インスリン分泌性スルホニル尿素受容体リガンド；チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン（netoglitazone）、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン（adaglitazone）、ダルグリタゾン、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）阻害薬；ＲＸＲリガンド；ナトリウム依存的グルコース共輸送体阻害薬；グリコーゲンホスホリラーゼＡ阻害薬；ビグアナイド；α−グルコシダーゼ阻害薬、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１模倣物；ＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害薬；スクアレンシンターゼ阻害薬；ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）、ＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）リガンド；コレスチラミン；フィブラート；ニコチン酸、アスピリン；オーリスタットまたはリモナバント；ループ利尿薬、フロセミド、トルセミド；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬；Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜ポンプの阻害薬；中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害薬；ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害薬；アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト；レニン阻害薬；β−アドレナリン受容体遮断薬；強心薬、ドブタミン、ミルリノン；カルシウムチャネル遮断薬；アルドステロン受容体アンタゴニスト；アルドステロンシンターゼ阻害薬；フェノフィブレート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、ＢＭＳ−２９８５８５、およびＬ−７９６４４９から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

治療有効量の、請求項１から８、１０、１１、１４または１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または請求項９、１２または１３に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の混合物と、薬学的に許容される１種または複数の担体とを含む医薬組成物。

【請求項22】

式：

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

［Ｒ^１は、ＣＯ_２Ｈであり、
Ｒ^２およびＲ^３は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、但し、Ｒ^２およびＲ^３は、同一でなく、
ｎおよびｍは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項23】

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

からなる群から選択される、請求項２２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、半減期および作用持続時間が改善されている、ＧＤＦ１５の新規なコンジュゲート、その作製方法、およびその使用方法に関する。本発明はさらに、新規な脂肪酸、および生体分子の半減期をコンジュゲーションによって延長する際のその使用に関する。

【0002】

発明の背景
ペプチドおよびタンパク質は、医療業務において広く使用されており、組換えＤＮＡ技術によって産生することができるので、その重要性は、今後も増していくと予想できる。興味深い生物学的活性を有する既知の内因性ペプチドおよびタンパク質の数は、ヒトゲノムの調査が進展していることもあって、急速に増えている。こうしたポリペプチドおよびタンパク質の多くは、その生物学的活性のために、基本的には、治療薬として使用できることになる。しかし、内因性ペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、ペプチダーゼによる急速な分解、および／または腎臓での濾過、尿中への排出により、半減期が数分しかないため、薬物候補として必ずしも安定しているとは限らない。ヒト血漿中でのポリペプチドまたはタンパク質の半減期は、ばらつきが激しい（数分から１週間超まで）。

【0003】

治療薬のクリアランスが高いことは、長期間にわたってその血中濃度を高く保つことが望ましい場合には、不都合である。この欠点を克服するために現在使用されている一手段は、対象となる治療用ペプチドまたはタンパク質を大量の投薬量で患者に投与して、一部の治療用ペプチドまたはタンパク質が分解されたとしても、十分に治療上有効なままとなるようにすることである。しかし、この方法は、患者にとって快適ではない。大半の治療用ペプチドまたはタンパク質は経口投与するできないので、治療用ペプチドまたはタンパク質は、絶えず注入する、静脈内注射によって頻回注入する、または皮下注射という不便な経路によって頻回投与することのいずれかの必要があることになる。頻回投与が必要になると、大いに可能性のあるペプチドまたはタンパク質治療薬に、許容されない非常に突出した治療コストが伴う結果にもなる。分解された多量のペプチドまたはタンパク質の存在によって、望ましくない副作用も生じかねない。

【0004】

投与の苦痛および高いコストは、魅力的な生物活性プロファイルを有する大半の治療用ペプチドまたはタンパク質を薬物候補として開発することができない、２つの理由である。

【0005】

したがって、ペプチドまたはタンパク質の半減期を延長する一つの手法は、生物学的活性を依然として維持しながら、その分解の速度を緩めるように、治療用ペプチドまたはタンパク質を修飾することである。血清アルブミンは、半減期が１週間より長く、ペプチドまたはタンパク質の血漿半減期を延長する一つの手法は、血清アルブミンまたは他の血漿タンパク質に結合する化学的エンティティを用いてこれを誘導体化することとされている。

【0006】

しかし、低い毒性および治療上の利点を維持しながらｉｎ ｖｉｖｏでの作用持続時間をより長くするためには、ペプチドやタンパク質などの治療用生体分子を修飾する新たな半減期延長性部分を特定することが依然として求められている。

【0007】

発明の概要
本発明は、リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、前記脂肪酸は、次式Ａ１、Ａ２、またはＡ３：

【0008】

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

［Ｒ^１は、ＣＯ_２ＨまたはＨであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分枝状Ｃ_６〜Ｃ_３０アルキレンであり、
ｎ、ｍ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］を有する、コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩に関する。

【0009】

式Ａ１、Ａ２、およびＡ３の脂肪酸は、対象となる生体分子にリンカーを介してコンジュゲートさせたとき、前記生体分子の半減期を、より一般的に使用される脂肪酸残基よりはるかに大きく延長させることが判明した。

【0010】

別の実施形態では、本発明は、Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方がＣＯ２Ｈである式Ａ１の脂肪酸に連結している生体分子を含むコンジュゲートに関する。

【0011】

本発明の別の実施形態では、対象となる生体分子は、治療用ペプチド、治療用タンパク質、またはＲＮＡである。この実施形態のさらに別の態様では、対象となる生体分子は、ペプチドまたはポリペプチドである。この実施形態のさらに別の態様では、ペプチドまたはポリペプチドは、ＡＰＪアゴニストペプチド、オキシトシン受容体アゴニストペプチド、セレラキシン（serelaxin）、ＮＰＦＦ、ＰＩＰペプチド、ＦＧＦ２３ペプチド、ＡｇＲＰペプチド、または増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、これらの相同体、変異体、断片、および他の修飾形態である。

【0012】

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される１種または複数の担体とを含む医薬組成物に関する。

【0013】

さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲート、および治療活性のある１種または複数の薬剤の医薬組合せを含むを含む組合せに関する。

【0014】

別の実施形態では、本発明は、式Ａ１、Ａ２、およびＡ３の脂肪酸に関する。

【0015】

別の実施形態では、本発明は、種々の疾患、障害、状態、および／またはその症状を治療および／または予防するための、本明細書に記載のコンジュゲートおよびその組成物の使用を企図する。

【0016】

たとえば、本発明は、それを必要とする対象においてＡＰＪ受容体を活性化させる方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がＡＰＪアゴニストである、方法に関する。本発明のコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体の活性化を介して、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含める）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含める）、および子癇前症の治療において有用である。この実施形態の好ましい態様では、本発明のコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）または慢性心不全の治療において有用である。

【0017】

別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてオキシトシン受容体を活性化させる方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がオキシトシン受容体アゴニストペプチドである、方法に関する。本発明のコンジュゲートは、オキシトシン受容体の活性化を介して、自閉症（治療または予防）、偏頭痛、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、反抗挑戦性障害（ＯＤＤ）、外傷後ストレス障害を含めたストレス、不安障害を含めた不安、うつ病、統合失調症、精神障害、および記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖、プラダー・ウィリー症候群、代謝性障害または疾患、２型真性糖尿病、肥満、異脂肪血症、グルコースレベルの上昇、インスリンレベルの上昇、および糖尿病性腎症、線維筋痛症、睡眠障害、睡眠時無呼吸、拡張期心不全、尿失禁、アテローム性動脈硬化症、高血圧、勃起機能不全、前立腺肥大症状、非アルコール性脂肪性肝疾患、易感染性授乳条件（compromised lactation condition）、分娩誘発障害（labor induction impairment）、子宮弛緩状態、過度の出血、炎症、疼痛、腹痛、背痛、男性および女性の性機能不全、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、便秘、胃腸管閉塞、外科的失血、分娩後出血、創傷治癒、感染症、乳腺炎、胎盤娩出障害、骨粗鬆症の治療において、またがんおよび胎盤機能不全の診断に有用である。この実施形態の好ましい態様では、本発明のコンジュゲートは、自閉症、不安障害を含めた不安、うつ病、偏頭痛、ＡＤＨＤ、反抗挑戦性障害、統合失調症、精神障害、肥満、易感染性授乳条件、分娩誘発障害、子宮弛緩状態、過度の出血、分娩後出血の治療において有用である。さらに、より好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、プラダー・ウィリー症候群の治療に有用である。

【0018】

さらに別の実施形態では、本発明は、クッシング症候群、コルチゾン過剰症、異所性ＡＣＴＨ症候群、副腎皮質質量の変化、原発性色素性結節状副腎皮質病変（ＰＰＮＡＤ）カーニー複合（ＣＮＣ）、コルチゾール誘発性ミネラルコルチコイド過剰、外傷後ストレス障害と関連する状態、多毛症、薄い皮膚、筋症、骨粗鬆症、組織脆弱性の増大、不十分な創傷治癒、高血圧、真性糖尿病、少ない血清カリウム、少ない好酸球、およびリンパ球減少症を治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がＡｇＲＰペプチドである、方法に関する。この実施形態の好ましい態様では、本発明のコンジュゲートは、クッシング症候群、コルチゾン過剰症、異所性ＡＣＴＨ症候群、骨粗鬆症の治療において有用である。

【0019】

さらに別の実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２３関連疾患、たとえば、（サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節炎、免疫不適格、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶喪失、しわ、腎臓機能の障害、および加齢性失聴からなる群から選択される）加齢性状態、（ＩＩ型糖尿病、メタボリック症候群、高血糖、および肥満からなる群から選択される）代謝性障害、高リン血症（腫瘤様石灰沈着症、高リン血性骨化過剰症候群（hyperphosphatemic hyperostosis syndrome））、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および／または筋萎縮を治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がＦＧＦ２３ペプチドである、方法に関する。

【0020】

さらに別の実施形態では、本発明は、急性心不全、駆出率が低下した慢性心不全（ＨＦｒＥＦ）、駆出率が保たれた慢性心不全（ＨＦｐＥＦ）、拡張機能障害、心筋梗塞後リモデリング、アンギナ、高血圧、肺高血圧、肺動脈高血圧、線維症（びまん性、心、腎、肺、肝）、強皮症、創傷治癒、重症下肢虚血、末梢血管疾患、間欠性跛行、腎機能障害、および慢性腎臓病を治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がセレラキシンペプチドである、方法に関する。この実施形態の好ましい態様では、本発明のセレラキシコンジュゲートは、急性心不全、駆出率が低下した慢性心不全（ＨＦｒＥＦ）、駆出率が保たれた慢性心不全（ＨＦｐＥＦ）、拡張機能障害、心筋梗塞後リモデリング、アンギナ、高血圧、肺高血圧、または肺動脈高血圧の治療において有用である。

【0021】

さらに別の実施形態では、本発明は、代謝性障害、たとえば、２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、膵臓β細胞障害、耐糖能障害、高血糖、インスリン抵抗性、肥満、異脂肪血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、メタボリック症候群、および他の代謝性障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がＰＩＰペプチドである、方法に関する。

【0022】

さらに別の実施形態では、本発明は、代謝性障害または疾患、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、非アルコール性脂肪性肝炎、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、切迫尿失禁、沈静、神経障害性および炎症性疼痛、記憶喪失、および他の代謝性障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がＮＰＦＦペプチドである、方法に関する。

【0023】

本発明のさらに別の態様では、本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、糖尿病、２型真性糖尿病、肥満、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、膵炎、異脂肪血症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を、それを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、方法に関する。

【0024】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明において解明される。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実施例２４が、参考例３より効果的に血漿ＡＰＯＣ３レベルを低下させたことを示す図である。

【0026】

詳細な記述
定義：
本明細書を解釈する目的では、別段指定しない限り、以下の定義が適用され、適切な場合は必ず、単数で使用された用語は複数も包含し、逆もまたそうなる。

【0027】

本明細書で使用するとき、また添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が、文脈によって明らかにそうでなく規定されない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」への言及は、１つまたは複数のコンジュゲートへの言及を包含し、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」への言及は、１つまたは複数のポリペプチドへの言及を包含する、などである。

【0028】

用語アルキルとは、１〜３０個の炭素原子を含む、完全飽和の分枝状もしくは非分枝状（または直鎖もしくは線状）炭化水素部分を指す。アルキルは、５〜２０個の炭素原子、より好ましくは１０〜１５個の炭素原子を含むことが好ましい。Ｃ_{１０〜１５}アルキルとは、１０〜１５個の炭素を含むアルキル鎖を指す。用語「アルキレン」とは、二価の、上で定義したとおりのアルキルを指す。

【0029】

用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する分枝状または非分枝状炭化水素を指す。用語「Ｃ_２〜３０−アルキニル」とは、２個〜７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重を含む炭化水素を指す。

【0030】

用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する分枝状または非分枝状炭化水素を指す。用語「Ｃ_２〜３０−アルキニル」とは、２個〜７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む炭化水素を指す。

【0031】

用語アリールとは、環部分に６〜１０個の炭素原子を有する、単環式または二環式の芳香族炭化水素基を指す。アリールの代表例は、フェニルまたはナフチルである。

【0032】

用語ヘテロアリールは、炭素原子と１〜５個のヘテロ原子とから選択される５〜１０個の環員を含んでおり、各ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから独立して選択され、ＳおよびＮは、種々の酸化状態に酸化されていてもよい、単環式または二環式ヘテロアリールを包含する。二環式ヘテロアリール系については、系は完全に芳香族である（すなわち、すべての環が芳香族である）。

【0033】

用語シクロアルキルとは、３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個、または３〜７個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが非芳香族の単環式、二環式、または三環式炭化水素基を指す。二環式および三環式のシクロアルキル系については、すべての環が非芳香族である。たとえば、シクロアルキルは、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルを包含する。用語「シクロアルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。用語「シクロアルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。

【0034】

用語ヘテロシクリルとは、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでおり、ＮおよびＳは、場合により種々の酸化状態に酸化されていてもよい、飽和または不飽和の非芳香族（部分的不飽和であるが非芳香族の）単環式、二環式、または三環式環系を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、５〜７個の環原子と、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択されるさらなるヘテロ原子とを場合により含んでいる、飽和した単環に相当する。このヘテロ環は、アルキル、ハロ、オキソ、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシで置換されていてもよい。他の実施形態では、ヘテロシクリルは、二環式または三環式である。多環式の系については、一部の環が芳香族で、飽和または部分的に飽和した１つまたは複数の環に縮合していてもよい。全体的に縮合した系は、完全には芳香族でない。たとえば、ヘテロ環系は、芳香族ヘテロアリール環が飽和または部分的に飽和したシクロアルキル環系と縮合したものである場合もある。

【0035】

用語「コンジュゲート」とは、生体分子と脂肪酸部分とをリンカーを介して共有結合させた結果として生成されたエンティティを指すものである。用語「コンジュゲーション」とは、生体分子と脂肪酸部分との共有結合をもたらす化学反応を指す。

【0036】

生体分子：
本明細書で使用するとき、生体分子という用語は、限定はしないが、抗体（たとえば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、およびその断片など）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法薬および他のタイプの抗悪性腫瘍薬、低分子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素性核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびその類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、小核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、伝令リボ核酸（伝令ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸ボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部グメント化干渉性ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉性ＲＮＡ）、ならびに細胞培養物、対象、または生物中などの該当する細胞および／または組織に対して、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチを１、２、またはそれ以上有するｓｉＲＮＡを包含する。このような化合物は、精製または部分的に精製されたものでよく、自然に存在するものでも合成品でもよく、化学修飾されていてもよい。

【0037】

一実施形態では、生体分子は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、またはＲＮＡｉ剤、短鎖干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。

【0038】

他の実施形態では、生体分子は、ポリペプチド（もしくはタンパク質）、またはペプチドである。ポリペプチドまたはペプチドの例は、ＡＰＪアゴニストペプチド、オキシトシンペプチド、セレラキシン、ＮＰＦＦ、ＰＩＰペプチド、ＦＧＦ２３ペプチド、ＡｇＲＰペプチド、およびＧＤＦ１５ペプチドである。好ましい実施形態では、生体分子は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である。

【0039】

「リボ核酸」（ＲＮＡ）とは、各ヌクレオチドがリボースまたはその修飾物を糖成分として含んでいる、ホスホジエステル結合で連結されたヌクレオチドのポリマーである。各ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、またはこれらの修飾物を塩基として含んでいる。ｍＲＮＡ分子の中の遺伝情報は、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド塩基の配列にコードされており、塩基は、取り合わされて、それぞれ３つのヌクレオチド塩基からなるコドンをなしている。翻訳（タンパク質合成）を終結させる終止コドンを除き、各コドンは、ポリペプチドの特定のアミノ酸をコードする。生細胞内では、ｍＲＮＡは、タンパク質合成の場であるリボソームに輸送され、そこで、タンパク質合成（翻訳）のための遺伝情報を提供する。これ以上の記述については、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照されたい。

【0040】

本明細書で使用する用語「ＲＮＡｉ剤」、「短鎖干渉性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉性核酸」、「ｓｉＮＡ」などは、配列特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子サイレンシングを介して遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下向き調節することのできる、いずれかの核酸分子を指す。この用語は、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉性オリゴヌクレオチド、化学修飾された短鎖干渉性核酸分子、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部セグメント化干渉性ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉性ＲＮＡ）、該当する細胞および／または組織に対して、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチを１、２、またはそれ以上有するｓｉＲＮＡ、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチが１つまたは複数存在するＲＮＡｉ剤、センス鎖がアンチセンス鎖に比べて非常に短い、かつ／または１つもしくは複数の一本鎖ニックを有する、ＲＮＡｉ剤、またはＲＮＡ干渉を仲介しうる他のいずれかの分子を包含する。ＲＮＡｉ剤は、リボヌクレオチドを含むものでもよいし、または１つもしくは複数の糖、塩基、および／もしくはリン酸において修飾または置換されていてもよい。非限定的な例として、ＲＮＡｉ剤は、２’位において修飾される場合があり、２’−修飾は、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される。一実施形態では、すべてのピリミジン（ウリジンおよびシチジン）が、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオシドである。種々の実施形態において、１つまたは複数のリン酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ボラノホスホノエート、およびアミドリンカーから選択される、修飾されたヌクレオシド間リンカーで置換されていてよい。種々の実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチドは、ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、アラビノース核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロアラビノース核酸（ＦＡＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）で修飾または置換されていてよい。ＲＮＡｉ剤の種々の修飾および置換は、当業界で知られており、本開示の状況で使用することができる。ｓｉＲＮＡは、動物および植物において、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であるＲＮＡ干渉を担う。ｓｉＲＮＡは、発現停止された遺伝子ターゲットと相同である、またはそれに特異的である、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から、リボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって自然に生じ、人工ＲＮＡｉ剤は、当業界で知られているいずれかの方法によって製造することができる。

【0041】

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」とは、自然に産生されようが合成によって生成されようが、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ぶのが普通である。用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の配列を示すものであり、前記アミノ酸は、天然でも天然でなくてもよい。この用語は、たとえばシステイン架橋などの共有結合性相互作用、または非共有結合相互作用によってまとまった２つ以上のペプチドからなるものでよい、用語ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語は、Ｄ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語は、Ｌ−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたはアミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、Ｎ末端を左側にして示し、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記す。

【0042】

本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、自然界では発生しない化合物）を含んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いてもよい。

【0043】

ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンが導入される。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる。本発明のポリペプチドに諸部分をコンジュゲートさせる目的で有益な特定の非天然アミノ酸として、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を有するものが挙げられる。

【0044】

「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。こうしたポリペプチド鎖はそれぞれ、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の脂肪酸分子とコンジュゲートさせることができる。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド成分も含んでよい。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生されるところの細胞によってタンパク質に付加される場合があり、細胞の種類によって様々となる。タンパク質は、本明細書では、そのアミノ酸主鎖構造に関して定義しており、炭水化物基などの置換基は一般に指定してないが、それにもかかわらず存在してよい。非宿主ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質またはポリペプチドは、「異種」タンパク質またはポリペプチドである。

【0045】

「単離ポリペプチドまたは単離タンパク質」とは、本来はポリペプチドに随伴する炭水化物、脂質、または他のタンパク質性不純物などの細胞成分を本質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質（たとえば、ＧＤＦ１５）である。通常、単離ポリペプチドまたはタンパク質の調製物は、高度に精製された形、すなわち、純度少なくとも約８０％、純度少なくとも約９０％、純度少なくとも約９５％、純度９５％超、たとえば、９６％、９７％、９８％、もしくはこれより高い純度、または純度９９％超のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドまたはタンパク質を含有することを示す１つの手段は、タンパク質調製物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色した後の単一バンドの出現によるものである。しかし、用語「単離」は、二量体などの別の物理的形態、または別法としてグリコシル化もしくは誘導体化された形態の同じポリペプチドまたはタンパク質の存在を除外しない。単離ポリペプチドは、その治療、診断、予防、または研究用途の妨げとなる、その自然環境において見出される他のいかなる混入ポリペプチドまたは他の混入物も、実質的に含まないことが好ましい。

【0046】

当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの配列において、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的アミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、化学的特徴が同等であるアミノ酸での置換）を包含する。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性（親水性）天然アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなどが挙げられる。

【0047】

本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能である場合、すべて、そのＤおよびＬ立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でないアミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで呼ぶ。

【0048】

用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）を指す。

【0049】

本明細書で使用する用語「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」は、同じであろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すものである。これら用語は、自然に存在する（野生型）タンパク質配列または本発明の配列中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、２０種の自然に存在するアミノ酸の１つ、セレノシステイン、ピロリシン（Ｐｙｌ）、またはピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ、たとえば、ＰＣＴ特許公開第２０１０／４８５８２号に記載のとおり）でない、改変アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を包含する。このような非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または自然に存在する（野生型）タンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる。非天然アミノ酸残基は、分子に所望の機能性、たとえば、機能性部分（たとえば、ＰＥＧ）を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「Ｕ」は、本明細書で使用される「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。

【0050】

ポリペプチドまたはタンパク質について本明細書で使用する用語「類似体」とは、ペプチド／タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置き換えられている、かつ／または１つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド／タンパク質から欠失している、かつ／または１つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド／タンパク質に付加されている、修飾されたペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのＮ末端および／またはペプチドのＣ末端で起こりうる。

【0051】

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲートのエステル」とは、カルボン酸基のエステル誘導体が存在する（たとえば、Ｃ末端の−ＣＯ_２Ｈが−ＣＯＯＲに変換されている）ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートを指し、エステルのＲは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１〜６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３〜８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６〜１０アリール基、Ｃ_６〜１０アリールＣ_１〜６アルキル基、たとえば、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニルＣ_１〜２アルキル基、およびα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１〜２アルキル基などを指す。コンジュゲートのペプチドまたはポリペプチド部分が、Ｃ末端以外の位置に追加のカルボキシル基またはカルボキシレート基を有するとき、こうした基がアミド化またはエステル化されているポリペプチドも、本発明のポリペプチドの範疇に入る。そうした場合において、エステルは、たとえば、上述のＣ末端エステルと同じ種類のエステルでよい。

【0052】

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲートのアミド」とは、カルボン酸基のアミド誘導体が存在する（たとえば、−ＣＯ_２Ｈが−ＣＯ（ＮＲ’Ｒ’に変換されている）ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートを指し、Ｒ’は、ＨまたはＲであり、Ｒは、上で規定している。用語「コンジュゲートのアミド」は、アミノ基のアミド誘導体が存在する（すなわち、脂肪酸にコンジュゲートしているアミノ基以外）（たとえば、−ＮＨ_２が−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｒに変換されている）ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートも指し、Ｒは、上で規定している。好ましい実施形態では、「コンジュゲートのアミド」は、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されている（たとえば、−ＣＯ_２Ｈが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１〜２アルキルフェニル、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ_１〜６アルキル）_２に変換されている）ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートである。

【0053】

用語「ＡＰＪ」（「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様１受容体」、「アンジオテンシンＩＩ様１受容体」などとも呼ばれる）とは、３８０残基、７回膜貫通ドメインのＧｉ共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの１１番染色体の長腕上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５１５２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５１６１によってコードされる）。ＡＰＪは、１９９３年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡから初めてクローン化され（O’Dowd et al. Gene, 136:355-60、1993）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性にもかかわらず、アンジオテンシンＩＩは、ＡＰＪを結合しない。この内因性リガンドは、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された（Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)）。

【0054】

用語「ＡＰＪアゴニスト」はアペリンポリペプチドを含む：アペリンは、７７残基のプレタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９１０９．３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１７４１３．３によってコードされる）を指し、これがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２になる。「アペリン−３６」と呼ばれる全長成熟ペプチドは、３６アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Ｐｙｒ−１−アペリン−１３またはＰｙｒ^１−アペリン−１３」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のアペリン１３量体（アペリン−１３）である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許第６，４９２，３２４Ｂ１号明細書に記載されている。アペリンペプチドアゴニストは、参照により本明細書に援用される、特許出願国際公開第２０１３／１１１１１０号パンフレット、米国特許出願公開第１４／０８２７７１号明細書、ならびに米国仮特許出願公開第６１／８５８２６３号明細書、米国仮特許出願公開第６１／８５８２８０号明細書、および米国仮特許出願公開第６１／８５８２９０号明細書にも記載されている。

【0055】

用語「オキシトシン受容体アゴニストペプチド」または「オキシトシンペプチド」は、互換的に使用され、オキシトシンおよびその類似体を包含する。オキシトシンは、１位と６位の間にジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基を有する、９アミノ酸の環状ペプチドホルモンである。ヒトオキシトシンは、配列Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含む。用語「オキシトシン受容体アゴニストペプチド」は、生物活性を保持するオキシトシンの類似体も包含する。そのような類似体分子は、オキシトシン受容体を結合することを含めて、内因性オキシトシンと似たようにして作用しうる。特に重要なオキシトシンの類似体は、ＰＣＴ出願番号、国際公開第２０１４／０９５７７３号パンフレット（詳細には実施例１３）で開示されているもの、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０４４９０５号明細書（詳細には実施例４９）で開示されているもの、ならびにKazimierz Wisniewski et al., Journal of Medicinal Chemistry 2014, 57, 5306-5317およびZbigniew Grzonka et al., Journal of Medicinal Chemistry 1983, 26, 1786-1787で開示されているものであり、これら文献は、すべて参照により本明細書に援用される。

【0056】

「ＰＩＰ」または「プロラクチン誘導ペプチド」とは、多様な生物学的過程において役割を示す、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＮＰ＿００２６４３であるタンパク質を意味する。ＰＩＰは、当業界において、巨大な嚢胞性疾患流体タンパク質（gross cystic disease fluid protein）１５（ＧＣＤＦＰ−１５）、分泌性アクチン結合性タンパク質（ＳＡＢＰ）、耳下腺外糖タンパク質（ＥＰ−ＧＰ）、および１７ｋＤａ ＣＤ４結合性タンパク質（ＧＰ１７）としても知られている。ＰＩＰは、外分泌臓器ならびに良性および悪性のヒト乳腺腫瘍において発現される。成熟分泌ＰＩＰタンパク質は、分子質量が１３ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１７〜２０ｋＤａのポリペプチドとして移動し、グリコシル化事象が示唆される。ＰＩＰは、ヒトの体液に寄与するほとんどの臓器において発現され、ＰＩＰの発現は、唾液腺に続いて、涙腺、前立腺、筋肉、気管線、および乳腺で最も高い。ＰＩＰ遺伝子は、ＰＩＰポリペプチドをコードする。

【0057】

本明細書で使用する「ＰＩＰペプチド」とは、ヒトＰＩＰ、またはヒトＰＩＰの少なくとも１つの活性を保持するその相同体、変異体、断片、もしくは修飾形態を意味する。

【0058】

ヒトＰＩＰの非限定的な例の配列は、配列番号１１で示される。
1 MRLLQLLFRA SPATLLLVLC LQLGANKAQD NTRKIIIKNF DIPKSVRPND EVTAVLAVQT
61 ELKECMVVKT YLISSIPLQG AFNYKYTACL CDDNPKTFYW DFYTNRTVQI AAVVDVIREL
121 GICPDDAAVI PIKNNRFYTI EILKVE（配列番号１１）

【0059】

配列番号１１は、機能にとって必要とならないシグナルペプチド（アミノ酸１〜２８）を含む全長ヒト野生型ＰＩＰに相当する。

【0060】

本明細書で使用する用語「ＰＩＰ」の別の非限定的な例は、それゆえシグナルペプチド（アミノ酸１〜２８）を欠いている配列番号１１のアミノ酸（ａａ）２９〜１４６であり、以下に配列番号１２として示す。
1 QDNTRKIIIK NFDIPKSVRP NDEVTAVLAV QTELKECMVV KTYLISSIPL QGAFNYKYTA
61 CLCDDNPKTF YWDFYTNRTV QIAAVVDVIR ELGICPDDAA VIPIKNNRFY TIEILKVE
（配列番号１２）

【0061】

ＰＩＰなどの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒトＰＩＰに類似しているが同一でないものの、ヒトＰＩＰの少なくとも１つの活性を保持する、ポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチドは、ヒトＰＩＰの配列（たとえば、配列番号１２）と同一でない配列を有する場合もあれば、またはヒトＰＩＰの配列（たとえば、配列番号１２）と同一の配列を有するが、他のいくつかの様態（たとえば、翻訳後修飾）が異なっている場合もある。そうしたポリペプチドは、たとえば、配列番号１２に対する配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％でよく、または、たとえば、配列番号１２のアミノ酸配列とに、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０アミノ酸の相違（たとえば、置換、欠失、および／もしくは付加）を有していてよい。一部の実施形態では、そのＰＩＰ相同体、変異体、断片、または修飾形態は、少なくとも９０％の配列同一性を保持し、または配列番号１２とに最大で２５アミノ酸の相違を有する。ＰＩＰ相同体、変異体、断片、または修飾形態は、ヒトＰＩＰの少なくとも１つの活性を保持する。

【0062】

「ＦＧＦ２３」または「線維芽細胞増殖因子２３」とは、ＦＧＦ−２３、ＡＤＨＲ；ＦＧＦＮ；ＨＰＤＲ２；ＨＹＰＦ；ＰＨＰＴＣ；外部ＩＤ：ＯＭＩＭ：６０５３８０ ＭＧＩ：１８９１４２７ ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：１０７７１ ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＦＧＦ２３Ｇｅｎｅ；種：ヒト；Ｅｎｔｒｅｚ８０７４；Ｅｎｓｅｍｂｌ ＥＮＳＧ０００００１１８９７２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＧＺＶ９；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２０６３８；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０６５６８９；所在（ＵＣＳＣ）：Ｃｈｒ１２：４．４８〜４．４９Ｍｂ；種：マウス；Ｅｎｔｒｅｚ：６４６５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００００１８２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＥＰＣ２；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２２６５７；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０７３１４８；所在（ＵＣＳＣ）：Ｃｈｒ６：１２７．０７〜１２７．０８Ｍｂとしても知られているポリペプチドを意味する。ＦＧＦ２３遺伝子は、ＦＧＦ２３ポリペプチドをコードする。

【0063】

本明細書で使用する「ＦＧＦ２３ペプチド」とは、ヒトＦＧＦ２３、またはヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持するその相同体、変異体、断片、もしくは修飾形態を意味する。

【0064】

シグナルペプチドを含むヒトＦＧＦ２３の非限定的な例の配列は、配列番号９で示される。
10 20 30 40 50
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
210 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I（配列番号９）

【0065】

配列番号９は、機能にとって必要とならないシグナルペプチド（アミノ酸１〜２４）を含む全長ヒト野生型ＦＧＦ２３に相当する。Yamashita et al. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498、Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500-6505、およびZhang et al. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824。

【0066】

本明細書で使用する用語「ＦＧＦ２３」の非限定的な例は、それゆえシグナルペプチド（アミノ酸１〜２４）を欠いている配列番号９のアミノ酸（ａａ）２５〜２５１であり、以下に配列番号８として示す。
10 20 30 40 50
YPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
210 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I（配列番号８）

【0067】

ＦＧＦ２３などの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒトＦＧＦ２３（たとえば、配列番号８）に類似しているが同一でないものの、ヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持する、ポリペプチドを意味する。そうしたポリペプチドは、たとえば、配列番号８に対する配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％でよく、または、たとえば、配列番号８のアミノ酸配列とに、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０アミノ酸の相違（たとえば、置換、欠失、および／もしくは付加）を有していてよい。一部の実施形態では、そのＦＧＦ２３相同体、変異体、断片、または修飾形態は、少なくとも９０％の配列同一性を保持し、または配列番号８とに最大で２５アミノ酸の相違を有する。そのＦＧＦ２３相同体、変異体、断片、または修飾形態は、ヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持する。そのような活性（または機能）には、非限定的な例として、ＦＧＦ２３受容体への結合、Ｋｌｏｔｈｏタンパク質との相互作用、細胞の増殖、および細胞シグナル伝達における役割；Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼアッセイを始めとする、ＦＧＦ２３活性の種々のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける活性、ならびに、ＦＧＦ２３関連疾患、たとえば、（サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節炎、免疫不適格、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶喪失、しわ、腎臓機能の障害、および加齢性失聴からなる群から選択される）加齢性状態、（ＩＩ型糖尿病、メタボリック症候群、高血糖、および肥満からなる群から選択される）代謝性障害、高リン血症（腫瘤様石灰沈着症、高リン血性骨化過剰症候群）、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および／または筋萎縮に関連した活性を含めて、ヒトＦＧＦ２３について知られているものが含まれる。Yamashita et al. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498、Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500-6505、Urakawa et al. 2006 Nature 444: 770-774、Zhang et al. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824、国際公開第２０１３／０２７１９１号パンフレット、国際公開第２０１１／０９２２３４号パンフレット、および国際公開第２００９／０９５３７２号パンフレット。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の脂肪酸と、ＦＧＦ２３ペプチドとを含み、ＦＧＦ２３ペプチドは、ＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持する、コンジュゲートを提供し、一部の実施形態では、保持されるＦＧＦ２３の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼアッセイにおける機能である。

【0068】

ＦＧＦ２３の「相同体」とは、ヒトＦＧＦ２３に相当するが、哺乳動物、たとえば、マウス、ラット、カニクイザル、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌなどの異なる供給源由来であり、それでもなおヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの機能を保持する、ポリペプチドを意味する。

【0069】

ＦＧＦ２３の「変異体」とは、たとえば配列番号８に対して１つまたは複数の突然変異（たとえば、欠失、置換、または付加）を含むが、それでもなおヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの機能を保持するＦＧＦ２３を意味する。ＦＧＦ２３の突然変異としては、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４位における突然変異が挙げられる。このような突然変異は、以前に記載されている。Ｒ１７９における突然変異によって、ＦＧＦ２３に耐タンパク質分解性が付与され、ＡＤＨＲでは、１７６ＲＸＸＲ１７９部位の突然変異によって、ＦＧＦ２３の切断および不活性化が妨げられる。White et al. 2000 Nat. Genet. 26: 345-348、Liu et al. 2003 J. Biol. Chem. 278: 37419-37426。Ｙ１５４における突然変異によって、分解が減少し、Ｑ１５６における突然変異によって、切断部位が消去され、Ｃ２０６およびＣ２４４における突然変異によって、二量体化および凝集が減少する。国際公開第２０１３／０２７１９１号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０９２２３４号パンフレット。ＦＧＦ２３相同体、変異体、または修飾形態は、（野生型ヒトＦＧＦ２３には通常見られない）１つまたは複数の追加のアミノ酸をさらに含んでもよい。

【0070】

ＦＧＦ２３変異体の非限定的な例をここに示す。
10 20 30 40 50
MYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
110 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I（配列番号１０）

【0071】

配列番号１０は、シグナルペプチド（ａａ１〜２４）が欠失しているが、１位における最初のＭが再導入されており、Ｒ１７９に対応するアミノ酸がＱに突然変異している、ＦＧＦ２３の変異体を示す。配列番号１０は、「ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９Ｑ」、「ＦＧＦ２３ Ｒ１７９」、「ｈＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）」などとも呼ばれ、実施例２８Ｃで使用されるＦＧＦ２３変異体に相当する。

【0072】

追加のＦＧＦ２３変異体には、非限定的な例として、配列番号８または配列番号１０の配列を有するが、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４のうちの１箇所以上にも突然変異を有するものが含まれる。追加のＦＧＦ２３変異体には、非限定的な例として、配列番号８または配列番号１０の配列を有するが、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４のうちの１箇所以上にも突然変異を有し、（野生型ヒトＦＧＦ２３には通常見られない）１つまたは複数の追加のアミノ酸をさらに含むものが含まれる。

【0073】

ＦＧＦ２３の「断片」とは、たとえば配列番号８に対して１つまたは複数の欠失したアミノ酸を含むが、それでもなおヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの機能を保持するＦＧＦ２３を意味する。ＦＧＦ２３の機能しうる断片は、配列番号８のアミノ酸１８０〜２５１を含む。Goetz et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 407-412。ＦＧＦ２３断片は、たとえば、Ｙ１５４、Ｑ１５６、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４位のいずれか１つまたは複数において、１つまたは複数の突然変異を有する場合もあるが、ヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持しうる。

【0074】

ＦＧＦ２３の「修飾形態」とは、ＦＧＦ２３の配列、たとえば配列番号８と同様または同一の配列を含むが、１つまたは複数の修飾を含み、ヒトＦＧＦ２３の少なくとも１つの活性を保持するＦＧＦ２３を意味する。このような修飾には、非限定的な例として、翻訳後修飾（リン酸化、メチル化、もしくは炭水化物の付加）、またはＦＧＦ２３でない第２の部分へのコンジュゲーションを含めることができる。そのような第２の部分は、非限定的な例として、シグナルペプチド、αもしくはβＫｌｏｔｈｏもしくはその断片（たとえば、可溶性ＫｌｏｔｈｏもしくはｓＫｌｏｔｈｏ）、Ｆｃ（たとえば、ＦｃＬＡＬＡ）、または他の修飾でよい。国際公開第２０１１／０９２２３４号パンフレットおよび国際公開第２００９／０９５３７２号パンフレット。

【0075】

本明細書で使用するとき、用語「ＡｇＲＰペプチドまたはポリペプチド」などとは、アグーチ関連ペプチド、すなわち、翻訳後プロセシングを受けてその活性または成熟形態であるＡｇＲＰ（８３〜１３２）になる、３２アミノ酸で構成されたシグナル伝達分子を指し、１０のシステイン残基を含んでおり、５つのジスルフィド結合の網状組織を形成する。ＡｇＲＰは、メラノコルチン受容体ＭＣ３ＲおよびＭＣ４Ｒの逆アゴニストとしての役割を果たす。用語「ＡｇＲＰペプチド」は、すべての例において、その塩を包含する。一部の実施形態では、ＡｇＲＰは、たとえば、Ｃ末端−ＣＯ２Ｈがアミド化されてＣ（Ｏ）−ＮＨ２を形成することによる、アミドの形でよい。他の実施形態では、ＡｇＲＰは、酸の形でよい。

【0076】

用語「ＡｇＲＰペプチド」は、ＡｇＲＰの、生物学的に活性のあるより短い断片も包含する。断片とは、配列が同一であるが、親配列より長さがより短く、生物学的活性（すなわち、逆アゴニズム）を保持する、親配列の一部分である。ＡｇＲＰポリペプチドの断片ならびにその変異体は、参照により本明細書に援用される、Jackson, P. J. et al., Biochemistry 41, 7565-757にも記載されている。たとえば、ＡｇＲＰ（８７〜１２０）およびＡｇＲＰ（８７〜１３２）は、ＡｇＲＰ（８３〜１３２）とほぼ同じＭＣ３ＲおよびＭＣ４Ｒ親和性を有し、同等の逆アゴニズムを示す。ＡｇＲＰポリペプチドのその他の断片は、参照により本明細書に援用される、Christine G. Joseph et al., Peptides 24 (2003), 263-270に記載されている。断片の例は、ＡｇＲＰ（８６〜１３２）および単環ＡｇＲＰ（１０９〜１１８）、ならびにＮおよび／またはＣ末端におけるこれらの伸長である。

【0077】

用語「ＡｇＲＰポリペプチド」は、自然に存在するＡｇＲＰポリペプチド配列が修飾を受けたＡｇＲＰポリペプチドである、「ＡｇＲＰ突然変異体ポリペプチド」も包含する。そのような修飾は、参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ出願番号、国際公開第２０１３／００６６５６号パンフレットに記載されている。

【0078】

用語「ＧＤＦ１５ペプチド」、「ＧＤＦ１５ポリペプチド」および「ＧＤＦ１５タンパク質」は、互換的に使用され、ヒトやマウスなどの哺乳動物において発現される、自然に存在する野生型ポリペプチドを意味する。この開示の目的では、用語「ＧＤＦ１５タンパク質」は、２９アミノ酸のシグナルペプチド（アミノ酸１〜２９）、１６７アミノ酸のプロドメイン（アミノ酸３０〜１９６）、およびプロドメインからフューリン様プロテアーゼによって切除される１１２アミノ酸（アミノ酸１９７〜３０８）の成熟ドメインを含んでいる、３０８アミノ酸残基からなるいずれかの全長ＧＤＦ１５ポリペプチド（ＮＣＩ参考配列ＮＰ＿００４８５５．２）を指すのに互換的に使用してよい。３０８アミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチドを「全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと呼び、１１２アミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチド（たとえば、アミノ酸１９７〜３０８）を「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドと呼ぶ。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ＴＧＦ〜スーパーファミリーの仲間に典型的である、（３つの鎖内ジスルフィド結合を有する）システインノットモチーフおよび単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要となる７つの保存されたシステイン残基を含んでいる。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、４番目の鎖内ジスルフィド結合を形成する２つの追加のシステイン残基も含んでいる。したがって、生物学的に活性のあるＧＤＦ１５は、１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合連結されている、成熟ペプチドのホモ二量体である。したがって、ＧＤＦ１５タンパク質またはポリペプチドには、このタンパク質の多量体、より詳細には二量体も含まれる。ホモ二量体ＧＤＦ１５を構成する各モノマー単位を、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の脂肪酸に連結することができる。

【0079】

本明細書で使用する「ＧＤＦ１５」または「ＧＤＦ１５タンパク質」はまた、ヒトＧＤＦ１５、またはヒトＧＤＦ１５の少なくとも１つの活性を保持するその相同体、変異体、突然変異体、断片、もしくは修飾形態も意味する。

【0080】

用語「ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド」または「ＧＤＦ１５変異体ポリペプチド」は、自然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチド配列が修飾されたものである、ＧＤＦ１５ポリペプチドを包含する。そのような修飾には、限定はしないが、自然に存在しないアミノ酸、自然に存在しないアミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣物での置換を含めた、１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれる。

【0081】

一態様では、用語「ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質」または「ＧＤＦ１５変異体ポリペプチド」は、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見られる少なくとも１つの残基が欠失し、または未変性ＧＤＦ１５配列中のその位置に通常は見られない残基で置き換えられたものである、ＧＤＦ１５タンパク質配列を指す。一部の場合では、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見られる単一の残基を、その位置に通常は見られない２つ以上の残基で置き換えることが望ましくなり、さらに他の場合では、未変性ＧＤＦ１５ポリペプチド配列を保持し、タンパク質中の所与の位置に１つまたは複数の残基を挿入することが望ましい場合もあり、さらに他の場合では、所与の残基を完全に欠失させることが望ましい場合もあり、これらの構築物はすべて、用語「ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質」または「ＧＤＦ１５変異体タンパク質」に包含される。本発明の一態様では、ＧＤＦ１５突然変異体タンパク質または「ＧＤＦ１５変異体タンパク質」は、配列番号１〜配列番号７のいずれか１つから選択される配列を有する。本発明はまた、このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチド配列またはＧＤＦ１５変異体ポリペプチド配列をコードする核酸分子も包含する。

【0082】

ＧＤＦ１５などの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒトＧＤＦ１５に類似しているが同一でないものの、ヒトＧＤＦ１５の少なくとも１つの活性を保持する、ポリペプチドを意味する。

【0083】

ＧＤＦ１５の「修飾形態」とは、ＧＤＦ１５の配列と同様または同一の配列を含むが、１つまたは複数の修飾を含み、ヒトＧＤＦ１５の少なくとも１つの活性を保持するＧＤＦ１５を意味する。このような修飾には、非限定的な例として、翻訳後修飾（リン酸化、メチル化、もしくは炭水化物の付加）を含めることができる。

【0084】

ＧＤＦ１５の「相同体」とは、ヒトＧＤＦ１５に相当するが、哺乳動物、たとえば、カニクイザル、マウス、ラットなどの異なる供給源由来であり、それでもなおヒトＧＤＦ１５の少なくとも１つの機能を保持する、ポリペプチドを意味する。一部の例では、ＧＤＦ１５相同体は、対象において代謝障害を治療し、または改善させるのに、対象と同じ種由来である、成熟型のＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドとして使用することができる。

【0085】

種々の実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、その相同体、変異体、突然変異体、断片、または修飾形態は、自然に存在するＧＤＦ１５タンパク質に対する同一性が少なくとも約８５パーセントであるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、自然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチドアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセントであるアミノ酸配列を含む。このようなＧＤＦ１５ポリペプチド、その相同体、変異体、突然変異体、断片、または修飾形態は、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善する能力などの、野生型ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。

【0086】

種々のそれぞれの実施形態において、ＧＤＦ１５ポリペプチド、またはその相同体、変異体、突然変異体、断片、もしくは修飾形態は、自然に存在する形態の成熟ＧＤＦ１５タンパク質の生物学的活性と同等である、それを超える、またはそれ未満である生物学的活性を有する。生物学的活性の例としては、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力；尿中グルコースおよびタンパク質排出を減少させる能力が挙げられる。

【0087】

ポリペプチドまたはタンパク質の構造に関連して本明細書で使用するとき、用語「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）とは、それぞれ、ポリペプチドの最も端のアミノ末端およびカルボキシル末端を指す。

【0088】

本明細書で使用する用語「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」とは、治療に使用するために開発されている、または治療に使用するために開発されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【0089】

リンカーは、生体分子と、脂肪酸部分とを隔てる。リンカーは、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は肝要でない。

【0090】

リンカーは、一方が生体分子、他方が脂肪酸部分と反応しうる、２つの反応性基／官能基を含んでいる化学的部分である。リンカーの２つの反応性基／官能基は、連結部分またはスペーサーを介して連結され、連結部分またはスペーサーの構造は、リンカーの、生体分子、および式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の脂肪酸部分とのリンカーの結合の妨げとならない限り、肝要でない。

【0091】

リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結しているアミノ酸で構成されたものでよい。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０種の自然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、アラニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンやアラニンなどの、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）など）、またはグリシンとセリンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）など）である。一部の実施形態では、リンカーは、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから選択されるアミノ酸で大多数が構成されている。一部の実施形態では、リンカーは、ポリヒスチジン部分を含んでいる。

【0092】

一部の実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される１〜２０のアミノ酸を含む。脂肪酸部分とのコンジュゲーションには、１〜１０アミノ酸残基のリンカーが好ましいが、本発明は、いずれの長さまたは組成のリンカーも企図する。非天然アミノ酸リンカーの一例は、次式：

【0093】

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

を有する８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸またはその反復単位である。

【0094】

本明細書に記載のリンカーは、例示的なものであり、はるかに長い、また他の残基を含むリンカーが、本発明によって企図される。非ペプチドリンカーも、本発明によって企図される。

【0095】

他の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、および／または１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により合体および連結し合っており、または生体分子および／もしくは脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している。

【0096】

アルキルスペーサーを含んでいるリンカーは、たとえば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−ＮＨ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−などであり、ｚは、２〜２０である。こうしたアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル（たとえば、Ｃ_１〜Ｃ_６）、低級アシル、ハロゲン（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルを含めた、いずれかの非立体障害性基でさらに置換されていてもよい。

【0097】

リンカーは、ポリマーの性質のものでもよい。リンカーは、生物学的に安定または生分解性であるポリマー鎖または単位を含んでよい。連結が繰り返されているポリマーは、結合不安定性に応じて、生理的条件下で様々な程度の安定性を備えうる。ポリマーは、ポリカルボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）などの結合を含んでいてよい。こうした結合は、例として示しており、本発明のポリマー鎖またはリンカーにおいて用いることのできる結合のタイプを限定するものではない。適切なポリマーとしては、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテルなど、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧリンカーは、線状または分枝状である場合がある。本発明におけるＰＥＧリンカーの分子量は、特定のいずれかの大きさに限定されないが、ある特定の実施形態は、１００〜５０００ダルトン、たとえば、５００〜１５００ダルトンの間の分子量を有する。

【0098】

リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質のアミノ基と脂肪酸部分上の官能基／反応性基（たとえば、式Ａ１、Ａ２、およびＡ３の脂肪酸部分のカルボン酸官能基）との間に架橋を形成する適切な官能基−反応性基を、両方の末端に含んでいる。

【0099】

リンカーは、性質の異なるいくつかの連結部分（またはスペーサー）（たとえば、アミノ酸、ヘテロシクリル部分、ＰＥＧ、および／またはアルキル部分の組合せ）を含んでもよい。この例において、各連結部分は、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質のアミノ基と、性質の異なる次の連結部分との間に架橋を形成する適切な官能基反応性基を両方の末端に含んでおり、かつ／または性質の異なる前の連結部分と脂肪酸部分との間に架橋を形成する適切な官能基−反応性基を含んでいる。

【0100】

修飾されたペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはペプチド−ポリペプチド部分構築物（すなわち、部分的なリンカーに付着しているペプチド／ポリペプチド）は、脂肪酸部分（または修飾された脂肪酸部分、すなわち、部分的なリンカーにすでに付着しているもの）上の利用可能な反応性官能基と反応して共有結合を形成しうる反応性基を含む。反応性基は、共有結合を形成しうる化学基である。反応性基は、コンジュゲーションの一方の部位に配置され、一般に、それによってコンジュゲーションの他方の部位にあるアミノ基、ヒドロキシル基、アルケン基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミン基、アジド基、またはチオール基のような官能基と共有結合を形成することのできる、カルボキシ、ホスホリル、アシル基、エステルまたは混合無水物、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、テトラジン、アルキン、イミデート、ピリジン−２−イル−ジスルファニルでよい。

【0101】

生体分子または修飾された生体分子をリンカーにコンジュゲートさせる、および／またはリンカーを脂肪酸部分にコンジュゲートさせる、および／または性質の異なる種々の連結部分を互いにコンジュゲートさせるための、特に重要な反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アルキン（より詳細にはシクロオクチン）である。

【0102】

官能基としては、１．マレイミド、トシルスルホン、またはピリジン−２−イルジスルファニルと反応させるためのチオール基；２．カルボン酸もしくは活性化型カルボン酸（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド化学によるアミド結合形成）、ホスホリル基、アシル基、または混合無水物に結合させるためのアミノ基（たとえば、アミノ酸のアミノ官能基）；３．末端アルキン、より詳細にはシクロオクチンとのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化（より一般的にはクリックケミストリーとして知られる）にかけるためのアジド；４．ヒドロキシルアミンまたはヒドラジンと反応させて、それぞれオキシムまたはヒドラジンを生成するためのカルボニル基；５．アザ［４＋２］付加においてテトラジンと反応させるためのアルケン、より詳細には歪みアルケンが挙げられる。リンカーおよび官能基／反応性基のいくつかの例を本明細書で述べてはいるが、本発明は、リンカーまたはいずれの長さおよび組成を企図する。

【0103】

実施形態
本発明の種々の実施形態をここに記載する。各実施形態で明細に述べられた特色は、明細に述べられた他の特色と組み合わせて、さらなる実施形態を実現してもよいと認識される。

【0104】

実施形態１において、本発明は、リンカーを介して脂肪酸部分に連結している生体分子を含み、前記脂肪酸部分は、次式Ａ１、Ａ２、またはＡ３：

【0105】

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

［Ｒ^１は、ＣＯ_２Ｈ、Ｈであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分枝状Ｃ_６〜Ｃ_３０アルキレンであり、
ｎ、ｍ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］
である、コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩に関する。

【0106】

実施形態１のさらなる態様では、実施形態１に従うコンジュゲートは、上述のとおりの式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の脂肪酸をさらに含んでもよい。選択的なコンジュゲーションおよび／または脂肪酸の生体分子への一価コンジュゲーションを実現することの難しさを考慮して、本発明のコンジュゲートは、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の１つまたは複数の脂肪酸部分に連結している生体分子を含んでもよい。加えて、一部のタンパク質の多重結合性の性質を考慮すると、多量体タンパク質を構成する各モノマー単位が脂肪酸部分に連結しうるが、モノマー単位の少なくとも１つが脂肪酸部分に連結している限り、必ずしもすべてのモノマー単位が脂肪酸部分に連結する必要はない。さらなる態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートの混合物に関する。たとえば、混合物は、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の１つの脂肪酸部分に連結している生体分子、たとえば、多量体生体分子、たとえば二量体生体分子と、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の２つ以上の脂肪酸部分に連結している生体分子、たとえば、多量体生体分子、たとえば二量体生体分子とを含む場合がある。以下の本発明の実施例では、脂肪酸のタンパク質またはポリペプチドへの選択的または非選択的な多重コンジュゲーションに関するこの態様をさらに強調する。

【0107】

実施形態１Ａにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が式Ａ１である、実施形態１に従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記コンジュゲートは、ｎおよびｍが、独立して、８〜２０、好ましくは１０〜１６である、式Ａ１の脂肪酸部分を含む。この実施形態の別の態様では、本発明は、前記脂肪酸部分が式Ａ１であり、Ｒ^２およびＲ^３の少なくとも一方がＣＯ_２Ｈである、実施形態１または１Ａに従うコンジュゲートに関する。

【0108】

実施形態２において、本発明は、前記脂肪酸部分が次式：

【0109】

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ａｋ^３、Ａｋ^４、Ａｋ^５、Ａｋ^６、およびＡｋ^７は、独立して、（Ｃ_８〜２０）アルキレンであり、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、（Ｃ_８〜２０）アルキルである］から選択される、実施形態１または１Ａに従うコンジュゲートに関する。

【0110】

実施形態３において、本発明は、前記脂肪酸部分が次式：

【0111】

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される、実施形態１、１Ａ、または２に従うコンジュゲートに関する。

【0112】

実施形態３Ａにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が次式：

【0113】

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される、実施形態１、１Ａ、または２に従うコンジュゲートに関する。

【0114】

実施形態３Ｂにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が式Ａ２またはＡ３である、実施形態１に従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記コンジュゲートは、ｐが８〜２０である式Ａ２の脂肪酸部分、またはＡｋがＣ_８〜２０アルキレンである式Ａ３の脂肪酸部分を含む。

【0115】

実施形態３Ｃにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が次式：

【0116】

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ａｋ_２は、Ｃ_８〜２０アルキレンである］から選択される、実施形態１または３Ｂに従うコンジュゲートに関する。

【0117】

実施形態４において、本発明は、前記リンカーが、１つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および／もしくは前記脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0118】

実施形態５において、本発明は、前記リンカーが、式：

【0119】

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｙは、０〜３４である］の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、前述の実施形態のいずれかに従うコンジュゲートに関する。

【0120】

実施形態６において、本発明は、前記リンカーが、次式：

【0121】

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

から選択されるヘテロ環部分を含む（またはさらに含む）、前述の実施形態のいずれかに従うコンジュゲートに関する。

【0122】

このようなヘテロシクリルを含んだリンカーは、たとえば、より一般的にはクリックケミストリーとして知られる、アジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化によって得られる。より詳細には、上で示したヘテロシクリルのいくつかは、シクロアルキンを含アジド部分と反応させた結果として得られる。

【0123】

シクロアルキンは、市販品供給元から容易に入手可能であり、したがって、アジド官能基を含んでいる部分（たとえば、末端アジド官能基を含んでいるリンカー）との付加環化によって機能付与することができる。タンパク質標識における環状アルキンクリックケミストリーの使用の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第２００９／００６８７３８号明細書に記載されている。

【0124】

Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化において使用することのできるシクロアルキン剤の非限定的な例は、

【0125】

【化10-1】

[この文献は図面を表示できません]

【0126】

【化10-2】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0127】

実施形態６Ａにおいて、本発明は、前記リンカーが、次式：

【0128】

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｒは、０〜２の整数であり、ｓは、０〜３の整数である］から選択されるヘテロシクリルを含む（またはさらに含む）、実施形態１〜５のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0129】

このようなヘテロ環式リンカーは、アルケン、または好ましくは歪みアルケン、たとえばシクロアルカンの、次の部分：

【0130】

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒｆは、たとえば、−ＣＨ_２ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ、−（Ｏ−ＣＨ_２）_４−６−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、または

【0131】

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

である］とのアザ［４＋２］付加環化によって得ることができる。

【0132】

このようなテトラジン部分は、市販品供給元から容易に入手可能であり、アルケンを含んでいる部分、たとえば、末端アルケン官能基を含んでいるリンカーと反応させることができる。

【0133】

実施形態６Ｂにおいて、本発明は、前記リンカーが、次式：

【0134】

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

のヘテロシクリルを含む（またはさらに含む）、実施形態１〜５のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0135】

このようなヘテロ環部分は、マレイミドを、チオールを含んでいる部分、たとえば、末端チオール官能基を含んでいるリンカーと反応させることにより取得できる。

【0136】

容易に入手可能である、および／または市販品として入手可能である、こうした試薬は、直接、または上述のとおりのリンカーを介して、対象となるペプチドまたはポリペプチドに付着させる。アルキン、マレイミド、またはテトラジン反応性基は、脂肪酸部分またはリンカー−脂肪酸構築物（たとえば、ＰＥＧ−脂肪酸構築）上に存在する官能基（それぞれ、アジド、チオール、およびアルケン）と反応する。

【0137】

実施形態７において、本発明は、前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される１つまたは複数のアミノ酸を含むまたはさらに含む、前述の実施形態のいずれかに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の一態様では、前記リンカーは、ヒスチジン、アラニン、およびメチオニンから選択される１〜６つのアミノ酸を含む。

【0138】

実施形態８において、本発明は、前記生体分子がペプチドまたはポリペプチドである、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。実施形態８の特定の一態様では、本発明は、前記ペプチドまたはポリペプチドが、１）ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態、２）ＡＰＪアゴニストペプチド、３）オキシトシン受容体アゴニストペプチド、４）セレラキシン、５）ＮＰＦＦ、６）ＰＩＰペプチド、７）ＦＧＦ２３ペプチド ８）ＡｇＲＰペプチド、または９）ｓｉＲＮＡである、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0139】

実施形態８Ａにおいて、本発明は、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態、またはこれらの二量体である、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の一態様では、前記生体分子は、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）突然変異体または変異体である。好ましい実施形態では、前記生体分子は、ＧＤＦ１５またはその変異体もしくは突然変異体の二量体である。ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはその突然変異体もしくは変異体のホモ二量体の性質を考慮すると、ホモ二量体を構成する２本のポリペプチド鎖（すなわち、各モノマー単位）のそれぞれが、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３の脂肪酸分子にリンカーを介して連結しうる。したがって、ＧＤＦ１５ホモ二量体は、１つまたは２つの脂肪酸にリンカーを介して連結される場合もある。リンカーを介して脂肪酸部分に連結しているＧＤＦ１５の構造は、以下のように表すことができる。

【0140】

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＦＡは、脂肪酸部分、Ｌは、リンカーを表し、ＧＤＦ１５モノマー単位１およびモノマー単位２は、両方とも、リンカーを介して脂肪酸部分に連結している］または

【0141】

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＦＡは、脂肪酸部分、Ｌは、リンカーであり、モノマー単位の一方だけが、リンカーを介して脂肪酸部分に連結しており、２つのモノマー単位間の線は、ジスルフィド結合を表す］。さらに、本発明はまた、構造Ａのコンジュゲートと構造Ｂのコンジュゲートとを含む混合物に関する。

【0142】

実施形態８Ｂにおいて、本発明は、前記ヒトＧＤＦ１５突然変異体が、成熟ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基を別の残基で置き換えることにより得たものである、実施形態８Ａに従うコンジュゲートを企図する。この実施形態の特定の一態様では、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端における最後の２つのアミノ酸残基（すなわち、アルギニン１９８およびアラニン１９７）が、アミノ酸配列ＸＨ−［Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘは、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから選択されるアミノ酸である］で置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、前記ｈＧＤＦ１５突然変異体は、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５またはＡＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５である。

【0143】

実施形態８Ｃでは、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端における最後の３つのアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン１９９、アルギニン１９８、およびアラニン１９７）が、アミノ酸配列ＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘ’およびＸは、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択されるアミノ酸である］で置き換えられている。この実施形態の別の態様では、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端における最後の３つのアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン１９９、アルギニン１９８、およびアラニン１９７）が、アミノ酸配列ＡＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘ’は、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択されるアミノ酸である］で置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、修飾ＧＤＦ１５タンパク質は、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５またはＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５である。

【0144】

未変性ＧＤＦ１５タンパク質に比べて、ＧＤＦ１５突然変異体では、タンパク質のＮ末端における選択的な標識（すなわち、ＧＤＦ１５の好ましいＮ末端における脂肪酸のコンジュゲーション）が可能になる。ペプチドおよびタンパク質の選択的な標識については、同時出願された米国特許出願公開第６２／０１５，８５８号明細書（代理人案件整理ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ）および米国特許出願公開第６２／０８２，３３７号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ０２）にさらに詳細に記載されている。

【0145】

実施形態８Ｄにおいて、本発明は、前記生体分子がＡＰＪアゴニストペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記ＡＰＪアゴニストペプチドは、参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ特許出願番号、国際公開第２０１３／１１１１１０号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１７０２号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６８号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６５号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３１６７号パンフレット、および国際公開第２０１５／０１３１６９号パンフレットに記載されているペプチドある。

【0146】

実施形態８Ｅにおいて、本発明は、前記生体分子がオキシトシン受容体アゴニストペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記オキシトシン受容体アゴニストペプチドは、参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ特許出願番号、国際公開第２００９／１２２２８５号パンフレット（Ｆｅｒｒｉｎｇ Ｂ．Ｖ．）および国際公開第２０１４／０９５７７３号パンフレット（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）に記載されているペプチドである。

【0147】

実施形態８Ｆにおいて、本発明は、前記生体分子がＡｇＲＰペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記ＡｇＲＰペプチドは、Ｃ末端が遊離−ＣＯ_２Ｈまたはそのアミド（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）の形である、ＡｇＲＰ（８３−１３２）である。

【0148】

実施形態８Ｇにおいて、本発明は、前記生体分子がＦＧＦ２３ペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記ＦＧＦ２３ペプチドは、Ｒ１７９における突然変異と、場合によりＹ１５４、Ｑ１５６、Ｒ１７６、Ｒ１７９、Ｃ２０６、およびＣ２４４における１つまたは複数の追加の突然変異とを有する配列番号８であるＦＧＦ２３変異体である。この実施形態の別の特定の態様では、ＦＧＦ２３ペプチドは、Ｒ１７９、Ｑ１５６、Ｃ２０６、およびＣ２４４における突然変異を有する配列番号８であるＦＧＦ２３変異体である。

【0149】

実施形態８Ｈにおいて、本発明は、前記生体分子がセレラキシンである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0150】

実施形態８Ｉにおいて、本発明は、前記生体分子がＮＰＦＦペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0151】

実施形態８Ｊにおいて、本発明は、前記生体分子がＰＩＰペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記ＰＩＰペプチドは、ｈｉｓでタグ付けされたタンパク質ＭＨＨＨＨＨＨＨ−ＰＩＰであり、ＰＩＰは、配列番号１２のものである。

【0152】

実施形態８Ｋにおいて、本発明は、前記生体分子がｓｉＲＮＡである、実施形態１〜８のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0153】

実施形態８Ｌにおいて、本発明は、前記生体分子にリンカーを介して連結された第２の脂肪酸部分をさらに含む、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。２つの脂肪酸−リンカー部分は、同じ構造のものであることが好ましい。

【0154】

実施形態９において、本発明は、次の構造：

【0155】

【化17】

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を有する、実施形態１、２、８、８Ａ、８Ｂ、または８Ｃに従うコンジュゲートに関する。式中、ｈＧＤＦ１５＊は、Ｎ末端にある２または３つのアミノ酸がアミノ酸配列ＸＨ−またはＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、ＭおよびＡから独立して選択される］でそれぞれ置き換えられているｈＧＤＦ１５またはその二量体であり、
ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５は、１〜６つのヒスチジンアミノ酸と、場合により１または２つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのＮ末端に付加されているｈＧＤＦ１５またはその二量体であり、
ｓは、２０〜３０の間の整数である。

【0156】

この実施形態の一態様では、前記タグは、ヒスチジンアミノ酸と、１つまたは２つの近接しないメチオニンアミノ酸とを含む。この実施形態の別の態様では、ヒスチジンおよびメチオニンアミノ酸の取り合わせは、Ｎ末端アミノ酸に近接する位置にあるアミノ酸がヒスチジンになるようになっている。この実施形態のさらなる態様では、前記タグは、ＭＨＨＨＨＨＨＭ−およびＭＨＨＨＨＨＨ−から選択されたものである。

【0157】

実施形態９の特定の態様では、ｈＧＤＦ１５＊およびｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５のホモ二量体の性質を考慮すると、ホモ二量体を構成する１または２本のポリペプチド鎖（モノマー単位）が、脂肪酸分子にリンカーを介して連結しうる。結果として、ホモ二量体は、Ｎ末端において、１つまたは２つの脂肪酸分子にリンカーを介して連結する場合がある。このような実施形態は、以下の式を有する、脂肪酸にリンカーを介して連結しているＧＤＦ１５生体分子によって表すことができる。

【0158】

【化18】

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［式中、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊（上で規定したとおり）の両方のモノマー単位は、両方のＮ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］、または

【0159】

【化19】

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［式中、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊（上で規定したとおり）のモノマー単位の一方だけが、Ｎ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］。さらに、本発明はまた、本発明のコンジュゲートの混合物、たとえば、式Ｃのコンジュゲートと式Ｅのコンジュゲートとを含む混合物、または式Ｄのコンジュゲートと式Ｆのコンジュゲートとを含む混合物も企図する。

【0160】

実施形態１０において、本発明は、式Ｃのコンジュゲートと式Ｅのコンジュゲートの混合物を含む組成物に関する。実施形態１０Ａにおいて、本発明は、式Ｄのコンジュゲートと式Ｆのコンジュゲートの混合物を含む組成物に関する。

【0161】

したがって、実施形態１０Ｂにおいて、本発明は、
１．Ｎ末端にある２または３つのアミノ酸がアミノ酸配列ＸＨ−またはＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、ＭおよびＡから独立して選択される］でそれぞれ置き換えられている、ホモ二量体ｈＧＤＦ１５の変異体、または
１〜６つのヒスチジンアミノ酸と、場合により１または２つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのＮ末端に付加されているホモ二量体ｈＧＤＦ１５と、
２．式：

【0162】

【化20】

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の１または２つの脂肪酸と
を含み、前記脂肪酸は、前記ポリペプチド鎖のＮ末端にリンカーを介して連結している、請求項１、２、９、または１０に従うコンジュゲート、またはコンジュゲートの混合物に関する。

【0163】

実施形態１０Ｃにおいて、本発明は、
ｈＧＤＦ１５＊が、Ｎ末端にある２または３つのアミノ酸がアミノ酸配列ＸＨ−またはＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、ＭおよびＡから独立して選択される］でそれぞれ置き換えられているｈＧＤＦ１５またはその二量体であり、
ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５が、４〜６つのヒスチジンアミノ酸と、１または２つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのＮ末端に付加されているｈＧＤＦ１５またはその二量体であり、
ｓが、２２〜２８の間の整数である、実施形態９、１０、１０Ａ、または１０Ｂのコンジュゲートに関する。この実施形態の一態様では、前記タグは、ヒスチジンアミノ酸と、１つまたは２つの近接しないメチオニンアミノ酸とを含む。この実施形態の別の態様では、ヒスチジンおよびメチオニンアミノ酸の取り合わせは、Ｎ末端アミノ酸に近接する位置にあるアミノ酸がヒスチジンになるようになっている。この実施形態のさらなる態様では、前記タグは、ＭＨＨＨＨＨＨＭ−およびＭＨＨＨＨＨＨ−から選択されたものである。

【0164】

実施形態１１において、本発明は、前記生体分子が、Ｍ−（Ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５（配列番号１）、Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（配列番号２）、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号４）、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号６）、ＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号７）、およびＡＨ（１９９−３０８）ＧＤＦ１５（配列番号５）、またはこれらの二量体から選択されたものである、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0165】

実施形態１１Ａにおいて、本発明は、前記生体分子が、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号４）、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号６）、ＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号７）、およびＡＨ（１９９−３０８）ＧＤＦ１５（配列番号５）、またはこれらの二量体から選択されたものである、実施形態１１に従うコンジュゲートに関する。

【0166】

実施形態１１Ｂにおいて、本発明は、前記生体分子がＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５（配列番号７）またはその二量体から選択されたものである、実施形態１１に従うコンジュゲートに関する。

【0167】

実施形態１２において、本発明は、前記脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生体分子が、式Ｇまたは式Ｈのものである、実施形態１１Ｂに従うコンジュゲートに関する。

【0168】

【化21】

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式中、ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５は、配列番号７であり、脂肪酸は、２つのモノマー単位の一方または両方のＮ末端において連結している。さらに、本発明は、式Ｇのコンジュゲートと式Ｈのコンジュゲートとを含む混合物を企図する。

【0169】

実施形態１３において、本発明は、式Ｇを有する実施形態１２に従うコンジュゲートと、式Ｈを有する実施形態１２に従うコンジュゲートの混合物を含む組成物に関する。この実施形態の特定の態様では、前記混合物は、１：１のモル比の式Ｇのコンジュゲートと式Ｈのコンジュゲートである。

【0170】

ＡＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５（配列番号７）は、未変性タンパク質内に認められるクリッピング部位、ならびに潜在的なメチオニン（Ｍ１）ホルミル化部位およびＮ−１９９アミド分解部位が除去されるように設計した。ＡＨＡの優れた質および均一性は、ｈＧＤＦ１５未変性配列内に認められたクリッピング、アミド分解、またはメチオニン酸化が、材料品質検査によって示されなかったことにより確認された。

【0171】

【表1】

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【0172】

実施形態１４において、本発明は、前記脂肪酸残基が、前記ペプチドまたはタンパク質のＮ末端にリンカーを介して付着している、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。実施形態１５において、本発明は、血漿安定性半減期が５時間を超える、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の一態様では、前記コンジュゲートは、１０時間を超える血漿安定性半減期を有する。この実施形態の別の態様では、前記コンジュゲートは、２０時間を超えるまたは３０時間を超える血漿安定性半減期を有する。この実施形態のさらに別の態様では、前記コンジュゲートは、４０時間を超えるまたは５０時間を超える血漿安定性半減期を有する。

【0173】

実施形態１６において、本発明は、コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性半減期の向上が、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または７５倍である、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートに関する。

【0174】

別の実施形態では、前記生体分子、前記リンカー、および前記脂肪酸部分（Ｒ^１〜Ｒ^４、ｎ、ｍ ｐ、およびＡｋ）は、以下の実施例の部において定めるものである。

【0175】

一実施形態では、本発明は、式：

【0176】

【化22】

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［Ｒ^１は、ＣＯ_２ＨまたはＨであり、
Ｒ^２およびＲ^３は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２、または−Ｃ≡ＣＨであり、但し、Ｒ^２およびＲ^３は、同一でなく、
Ｒ^４は、ＣＯ_２Ｈであり、
ｎおよびｍは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］の化合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩に関する。この実施形態の別の態様では、本発明は、Ｒ^２およびＲ^３の少なくとも一方がＣＯ_２Ｈである、式Ａ１の化合物に関する。この実施形態のさらに別の態様では、本発明は、

【0177】

【化23】

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からなる群から選択される化合物に関する。

【0178】

ペプチド／ポリペプチドおよび／またはその修飾形態の合成
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれかによって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質構築物は、全長として生成してもよいし、または全長でない断片として合成し、つないでもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド合成のための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質を構成しうる部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献（１）〜（５）に記載の手順が挙げられる。
（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966、
（２）Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
（３）Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975、
（４）Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977、および
（５）Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten

【0179】

反応後、ペプチドまたはポリペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、サイズ排斥クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述のように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によってペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。

【0180】

ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得ることができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂、塩化２−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。このような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチドを得る。

【0181】

上述の保護されたアミノ酸の縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、またはたとえばカルボジイミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイミドとしては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、ＨＯＢｔまたはＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、ＨＯＢｔエステル、またはＨＯＯＢｔエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわかっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。反応温度は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択することができ、普通は、約−２０℃〜５０℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、一般に、１．５〜４倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せずに、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでアセチル化することができる。

【0182】

出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｚ、Ｂｏｃ、第三級アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはＦｍｏｃが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、上述のＣ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜８シクロアルキル、およびＣ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜２アルキル、ならびに２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキシカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。

【0183】

セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、および第三級ブチルが挙げられる。

【0184】

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリエチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、およびＦｍｏｃが挙げられる。

【0185】

出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔなどのアルコールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホスホルアミドが挙げられる。

【0186】

保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、硫化ジメチル、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒスチジンのイミダゾール基の保護に使用した２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノールでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理、ならびに１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール存在下での上述の酸処理によって脱離させることができる。

【0187】

出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の基および方法の中から公正に選択することができる。

【0188】

アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、Ｃ末端アミノ酸の−カルボキシル基を最初にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までＮ側に伸長し、次いで、Ｃ末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるアミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている２つの断片を、上で挙げたものなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によってすべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、Ｃ末端アミノ酸のａ−カルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド生成について上述した手順に従う。

【0189】

別法として、組換え発現法が特に有用である。宿主細胞（ペプチドの配列をコードする核酸を含むように人工的に操作されており、転写および翻訳を行い、場合によりペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞）を使用する組換えタンパク質発現は、当業界で日常的に使用される。組換え生成法については、通常、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸が、従来の方法によって合成され、発現ベクターに組み込まれることになる。このような方法は、追加のペプチド配列または他のタンパク質もしくはタンパク質断片もしくはドメインに融合したペプチドを含むポリペプチド組成物の製造に特に好ましい。宿主細胞は、場合により、大腸菌（E.Coli）、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＴ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ｈｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは植物細胞、またはこれらのいずれかの派生、不死化、もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも１種でよい。

【0190】

本発明はまた、ＲＮＡの形でも、またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含めたＤＮＡの形でもよい、上述の変異体をコードするポリヌクレオチドも包含する。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖でもよい。本発明の組成物をコードするコード配列は、遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として様々となりうる。

【0191】

本発明の組成物をコードするポリヌクレオチドには、次のもの、すなわち、変異体のコード配列のみ；変異体のコード配列と、機能ポリペプチドやリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列などの追加のコード配列；変異体のコード配列と、変異体のコード配列の５’および／または３’側のイントロンや非コード配列などの非コード配列を含めることができる。したがって、用語「変異体をコードするポリヌクレオチド」は、変異体のコード配列だけでなく、追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含みうる、ポリヌクレオチドを包含する。

【0192】

本発明はさらに、示された置換を含んでいる、ポリペプチドの断片、類似体、および誘導体をコードする、記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、上述のとおり、ヒトＧＤＦ１５配列の自然に存在するアレル変異体、自然に存在しない変異体、または切断型変異体でよい。したがって、本発明は、上述の変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに開示された変異体の断片、誘導体、または類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体も包含する。このようなヌクレオチド変異体には、第１または第２の実施形態の、示されたアミノ酸置換の少なくとも１つが存在しさえすれば、欠失変異体、置換変異体、切断型変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。

【0193】

本発明のポリヌクレオチドは、配列を発現制御配列に作動可能に連結（すなわち、それが確実に機能するように配置）した後、宿主中で発現させることができる。こうした発現ベクターは、通常、宿主生物中で、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体部分として複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、たとえば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含む。ＧＤＦ１５変異体は、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌細胞、または他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から得られたＲＮＡを使用する、無細胞翻訳系を用いて、このようなタンパク質を生成することもできる。

【0194】

大腸菌（Escherichia Coli）（E. coli）は、特に本発明のポリヌクレオチドのクローン化に有用な、原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主として、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにセラチア属（Serratia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、連鎖球菌属（Streptococcus）、およびブドウ球菌属（Staphylococcus）の種々の種が挙げられるが、選択できるものとして、他の微生物宿主を用いてもよい。こうした原核生物宿主では、宿主細胞と適合しうる発現制御配列（たとえば、複製開始点）を通常含んでいる発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλもしくはＴ７からのプロモーター系などの、よく知られたいくつかのプロモーターのいずれかが存在してもよい。プロモーターは通常、転写および翻訳を開始し、完了するために、場合によりオペレーター配列と共に発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを備えている。

【0195】

タンパク質発現の分野の技術者なら、大腸菌（E. coli）中での発現については、成熟配列のＮ末端に、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が導入される場合があり、本発明の文脈の範囲内で予期されることを認識されよう。したがって、別段注釈を加えない限り、大腸菌（E. coli）中で発現させた本発明の組成物は、Ｎ末端に導入されたメチオニン配列を有する。

【0196】

酵母や真菌などの他の微生物も、発現に使用してよい。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）が、好ましい酵母宿主の例であり、適切なベクターは、望み通りに、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を始めとするプロモーターや複製開始点などの発現制御配列、停止配列などを有する。クロコウジカビ（Aspergillus niger）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、およびスエヒロタケ（Schizophyllum commune）が真菌宿主の例ではあるが、選択できるものとして、他の真菌宿主も用いてよい。

【0197】

哺乳動物組織細胞培養も、本発明のポリペプチドの発現および生成に使用することができる。無傷の変異体を分泌しうるいくつかの適切な宿主細胞系が当業界で開発されており、ＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＮＳＯ細胞、シリアンハムスター卵巣細胞系、ＨｅＬａ細胞、またはヒト胎児由来腎臓細胞系（すなわち、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ）が挙げられる。

【0198】

哺乳動物細胞用の発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位などの必要なプロセシング情報部位、および転写停止配列を含む場合がある。好ましい発現制御配列は、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位としては、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモン由来の配列が挙げられる。

【0199】

対象となる（たとえば、本発明の組成物および発現制御配列をコードする）ポリヌクレオチドを含んでいるベクターは、細胞宿主の種類に応じて様々となる、よく知られた方法によって、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。たとえば、原核細胞には、塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるのに対し、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理または電気穿孔法を使用することができる。

【0200】

種々のタンパク質精製法を用いることができ、そのような方法は、当業界で知られており、たとえば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)に記載されている。選択される精製ステップは、たとえば、本発明の組成物に使用された生成方法の性質に応じて決まる。

【0201】

ポリペプチドは、（たとえば、他のポリペプチドを含まない）実質的に純粋または単離された形で調製することができる。ポリペプチドは、存在しうる他の成分（たとえば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に比べてポリペプチドが富化されている組成物として存在する場合もある。たとえば、他の発現タンパク質を実質的に含まない、たとえば、他の発現タンパク質が組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満しか占めていない組成物としてポリペプチドが存在するような、精製ポリペプチドを提供することができる。

【0202】

脂肪酸部分の合成
スキーム１に、式Ａ２の脂肪酸部分の合成について記載する。

【0203】

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｐ^１およびＰ^２は、カルボン酸保護基、たとえば、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシベンジル、ベンジル、ベンジルオキシ、メトキシメチル、メチルチオメチル、テトラヒドロピラニル、フェナシル、Ｎ−フタルイミド、シンナミル、トリフェニルメチル、９−アントリルメチル、ピペロニル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、または２−アルキル１，３オキサゾリンであり、ＬＧは、脱離基、たとえば、ハロ（たとえば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）またはトリフルオロメタンスルホニルオキシであり、Ｒ^４およびｐは、実施形態１に記載のとおりである。

【0204】

ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジメチルアセトアミドなどの溶媒中にて、塩基（たとえば、水素化ナトリウム、炭酸カリウムもしくは炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、リチウムテトラメチルピペリジド、１，８−ジアアザシクロウンデカ−７−エン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、または２，６−ジｔ−ブチルプトリジン）の存在下、保護されたマロン酸（１Ａ）をアルキル化剤（１Ｂ）でアルキル化すると、保護された脂肪酸部分（１Ｃ）が生成される。Ｒ^４がＯＨまたはＣＯ_２Ｈであるとき、アルキル化ステップの前に、これらの官能基の保護が必要となる場合もある。ヒドロキシルのための保護基は、当業界で知られており、たとえば、１．メチルエーテル、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテル、ベンジルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、イソプロピルジメチルシリルエーテル、トリフェニルメチルエーテル、ニトロベンジルエーテルなどの、エーテル、２．酢酸エステル、ギ酸エステル、トリクロロ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、ピバル酸エステル、安息香酸エステル、メチルカーボネート、ベンジルカーボネート、アリルカーボネート、硝酸エステル、アダマン酸エステル（adamanoate ester）、ニトロフェニルカーボネートなどの、エステルおよびカーボネートである。

【0205】

式Ａ２の脂肪酸部分は、適切な脱保護法を使用して脱保護することにより得られる。限定はしないが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、もしくはＬｉＯＨから選択される塩基、または限定はしないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、もしくはＢＣｌ_３から選択される酸を使用する、中間体（１Ｃ）の加水分解には、標準の方法を適用することができる。Ｐ^１またはＰ^２が、ベンジルまたはメトキシベンジルであるとき、好ましい脱保護方法は、限定はしないがパラジウム炭素などの、触媒存在下での水素化である。

【0206】

スキーム２に、Ｒ^１がＣ（Ｏ）_２Ｈである式Ａ^１の脂肪酸部分の合成を図示する。

【0207】

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｐ^１およびＰ^２、ＬＧは、上で規定したとおりであり、Ｒ^２、Ｒ^３、ｎ、およびｍは、実施形態１で規定したとおりである。

【0208】

保護されたマロン酸（１Ａ）は、スキーム１において上述した適切な方法を使用する脱保護の前に、アルキル化剤（２Ａ）および（２Ｃ）による２つのアルキル化に続けてかけられるが、この順序は逆にすることもできる。Ｒ^２およびＲ^３がＯＨまたはＣＯ_２Ｈであるとき、アルキル化ステップの前に、これらの官能基の保護が必要となる場合もある。

【0209】

Ｒ^１がＨである式Ａ^１の脂肪酸部分は、Ｒ１がＣＯ２Ｈである、対応する式Ａ^１の脂肪酸部分の脱炭酸によって調製することができる。塩基性条件（たとえば、水酸化アンモニウム）下での脱炭酸などの脱炭酸条件が、当業界でよく知られている。

【0210】

生体分子−リンカー構築物の合成

【0211】

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｂは、生体分子またはその修飾形態であり、Ｚ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキレンリンカーであり、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、１つまたは複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられており、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている、単環式、二環式、もしくは三環式の炭素環またはヘテロ環系である。

【0212】

標準のアミドカップリング法を使用して、シクロアルキン（３Ｂ）を、生体分子（３Ａ）のアミノ残基（たとえば、Ｎ末端またはリシン側鎖のアミノ官能基）に、そのカルボン酸反応性基を介して付着させる。限定はしないが、中間体（３Ｂ）をその活性化型に変換［たとえば、（標準のＮ−ヒドロスクシンイミド化学を使用して）対応するピロリジン−２，５−ジオンに変換、トリホスゲン、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸４−ニトロフェニル、またはジスクシンイミジルカーボネートなどの試薬を使用して酸（３Ｂ）を変換、塩化チオニルや塩化オキサリルなどの試薬を使用して酸（３Ｂ）を対応する酸ハロゲン化物に変換、またはＣｌＣ（Ｏ）Ｏ−イソブチル、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、プロピルホスホン酸無水物環状三量体（Ｔ３Ｐ）などの試薬を使用して酸（３Ｂ）を対応する混合無水物に変換した後、オキサゾリジン２，５−ジオン、酸ハロゲン化物、または混合無水物を］、第三級アミン（たとえば、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）やＫ_２ＣＯ_３などの塩基の存在下または非存在下で生体分子（３Ａ）と反応させることを含めて、既知のカップリング方法を適用することができる。別法として、限定はしないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）を始めとするペプチド縮合試薬を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、ジメチルアミノピリジンなどの試薬の存在下または非存在下で使用して、生体分子３Ａを酸３Ｂと結合させることもできる。シクロアルキン／酸中間体（３Ｂ）は、ＮＨＳ化学を使用してその活性化型に変換してから、生体分子上のアミノ官能基と反応させることが好ましい。

【0213】

生体分子のＮ末端にあるアミノ官能基の選択的なアシル化は、同時出願された米国特許出願公開第６２／０１５，８５８号明細書（代理人案件整理ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ）および国特許出願公開第６２／０８２，３３７号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ０２）において、開発および報告がなされている。

【0214】

選択的なアシル化は、ＮＨＳによって活性化されたシクロオクチン類似体（（３Ｂ）のＮＨＳ誘導体）を、Ｎ末端アミノ酸に近接するヒスチジンアミノ酸を含むようにＮ末端が修飾されている生体分子と反応させるものである。反応は、ｐＨ４で実施すると、ヒスチジンアミノ酸の隣接効果の存在によって、Ｎ末端にあるアミノ官能基に高度に選択的になる。

【0215】

脂肪酸残基リンカー構築物の合成
クリックケミストリーのための脂肪酸−リンカー構築物
スキーム４に、末端アジド官能基を用いた脂肪酸ＰＥＧリンカー構築物の合成を記載する。

【0216】

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｙは、０〜３４であり、ＦＡは、そのカルボン酸官能基の１つを介してＰＥＧリンカーに付着している、式Ａ１、Ａ２、またはＡ３に記載のとおりの脂肪酸部分であり、ＦＡは、次式を有する。

【0217】

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

【0218】

アミドカップリング反応によって、脂肪酸部分（４Ｂ）を、ＰＥＧを含んでいるリンカー（４Ａ）に付着させる。既知のカップリング法については、上でスキーム３において詳述している。脂肪酸部分上の酸官能基は、ＮＨＳ化学を使用して活性化させることが好ましい。

【0219】

Ｒ^１がＣＯ_２Ｈであり、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４が、ＣＯ_２ＨまたはＯＨである場合、反応性部位を制御するために、カップリング反応の前に、保護基を導入する必要があることもある。カルボン酸およびヒドロキシ基のための保護基は、上でスキーム１に記載している。別法として、カルボン酸の選択的な活性化は、ＮＨＳ化学を使用して実現することもできる。

【0220】

対象となる生体分子に直接付着させるための脂肪酸−リンカー
スキーム５に、末端ＣＯ２Ｈ官能基を用いた脂肪酸ＰＥＧリンカー構築物の合成を記載する。

【0221】

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ＦＡは、上でスキーム４において規定したとおりであり、ｙは、０〜３４である。

【0222】

上述のアミドカップリングを使用して、脂肪酸（４Ｂ）を、ＰＥＧを含んでいるリンカー（５Ａ）に付着させることができる。

【0223】

対象となる生体分子に、トランスグルタミナーゼ酵素を使用して付着させるための脂肪酸−リンカー構築物
スキーム５Ａに、トランスグルタミナーゼ酵素を使用するとリシンの部位選択的修飾が可能になる、グルタミン酸アミノ酸を含んでいる脂肪酸−リンカー構築物の調製を記載する。

【0224】

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｙおよびＦＡは、予め規定したとおりである。このような構築物では、リシン側鎖上のアミノ基の選択的な部位修飾が可能になる。タンパク質のこのトランスグルタミナーゼ選択的部位修飾は、２０１３年７月１１日出願の米国特許出願公開第６１／８４５，２７３号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５５６４１−ＵＳ−ＰＳＰ）に記載されている。

【0225】

本発明のコンジュゲートの合成
クリックケミストリーを使用するコンジュゲーション

【0226】

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｂは、対象となる生体分子またはその修飾形態（たとえば、突然変異体、またはヒスチジンタグを含んでいる生体分子）であり、ｙ、Ｃ１、Ｚ_１、ＦＡ、およびｙは、上で規定している。

【0227】

シクロアルキン構築物（３Ｃ）は、一般的にはクリックケミストリーとして知られている、脂肪酸−リンカー構築物（４Ｃ）の末端アジドとのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化を経る。クリックケミストリーの例は、ＵＳ２００９／００６８７３８に記載されている。

【0228】

カップリング条件を使用して直接付着させることによるコンジュゲーション

【0229】

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｂは、対象となる生体分子またはその修飾形態（たとえば、突然変異体、および／またはヒスチジンタグを含んでいる生体分子）であり、脂肪酸−リンカー構築物は、生体分子のＮ末端に付着している。

【0230】

標準のアミドカップリング法を使用して、脂肪酸−リンカー構築物（５Ｂ）を、生体分子（３Ａ）のアミノ残基（たとえば、Ｎ末端またはリシン側鎖のアミノ官能基）に、そのカルボン酸反応性基を介して付着させる。既知のカップリング法については、上でスキーム３において詳述している。脂肪酸−リンカー構築物上の酸官能基は、ＮＨＳ化学を使用して活性化させることが好ましい。

【0231】

生体分子のＮ末端にあるアミノ官能基の選択的なアシル化は、同時出願された米国特許出願公開第６２／０１５，８５８号明細書（代理人案件整理ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ）および米国特許出願公開第６２／０８２，３３７号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ０２）において、開発および報告がなされている。選択的なアシル化は、ＮＨＳによって活性化された化合物（（５Ｂ）のＮＨＳ誘導体）を、Ｎ末端アミノ酸に近接するヒスチジンアミノ酸を含むようにＮ末端が修飾されている生体分子と反応させるものである。反応は、ｐＨ４で実施すると、ヒスチジンアミノ酸の隣接効果の存在によって、Ｎ末端にあるアミノ官能基に高度に選択的になる。

【0232】

トランスグルタミナーゼ酵素を使用するコンジュゲーション

【0233】

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

生体分子のそのリシン側鎖における選択的な修飾は、トランスグルタミナーゼ酵素を使用して実現することができる。このような修飾は、２０１３年７月１１日出願の米国特許出願公開第６１／８４５，２７３号明細書（代理人案件整理番号ＰＡＴ０５５６４１−ＵＳ−ＰＳＰ）または国際公開第２０１５／００６７２８号パンフレット（この出願の実施例２５）で報告されている。

【0234】

医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入、鼻腔内、経口などを始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩の連続的な静脈内投与を用いる。本発明におけるコンジュゲートは、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用してもよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を、１日〜数日間（たとえば、２〜３日間以上）またはより長期間、たとえば、数週間、数か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約３日間、好ましくは少なくとも約６日間施す。別の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約１週間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約２週間施す。投与中または複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿コンジュゲート濃度を維持することが望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度などに基づき決定することができる。そのような望ましい値（複数可）は、標準の臨床試験を実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、ＦｃＲｎ機序によって、経口的に送達することができるはずである（Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013）。

【0235】

別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定はせず、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、凍結乾燥剤、粉末、または坐剤を含める）、または液体形態（限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含める）に仕立てることができる。医薬組成物は、無菌製造、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ／または、従来の不活性希釈剤、膜形成剤、等張化剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。

【0236】

注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と滅菌粉末を含む。

【0237】

静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであり、容易な注射適用性（syringability）が存在する程度に流動的にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に含めることにより実現できる。一部の実施形態では、コンジュゲート生成物の分解または凝集に対する安定化を促進し、可溶性を改善し、投与および活性化合物の放出を支援するために、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤を製剤工程に織り込んでもよい（BioPharm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44）。

【0238】

ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法に従って調製され、それぞれ、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。

【0239】

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せを含有する適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。

【0240】

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療的経口投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と混ぜ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、含嗽液として使用するために流動性担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／または佐剤材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプンやラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースやサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの着香剤のいずれか、または同様の性質の化合物を含有してよい。経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を向上させ、かつ／または吸収を強化するための薬剤が組み込まれていると有利な場合もある。

【0241】

吸入による投与について、発明治療薬は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器もしくは計量分配装置、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で送達することが好ましい。治療薬の全身送達のために、肺が広い表面積を備えていることは注目される。

【0242】

薬剤は、たとえば、米国特許出願公開第２００４／００９６４０３号明細書に記載のものなどのポリマー系微小粒子に、または当業界で知られている他の広範な薬物送達ビヒクルのいずれかと共同して、カプセル封入することができる。本発明の他の実施形態では、たとえば、米国特許出願公開第２００４／００６２７１８号明細書に記載されているように、薬剤を荷電脂質と共同して送達する。後者の系は、治療用ポリペプチドであるインスリンの投与に使用されており、ペプチド剤の投与についてこの系の実益を示していることが注目される。

【0243】

全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。

【0244】

経皮的適用に適する組成物は、有効量の本発明のコンジュゲートを適切な担体と共に含む。経皮送達に適する担体として、ホストの皮膚を介した透過を手助けする薬理学的に許容される被吸収性溶媒が挙げられる。経皮的デバイスは、たとえば、裏部材と、化合物を場合により担体と共に含有するレザバーと、場合により、ホストの皮膚の化合物を、長期間にわたって、制御され、予め決められた速度で送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定するための手段とを備えた絆創膏の形態である。

【0245】

たとえば皮膚および眼への局所適用に適する組成物には、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、または、たとえばエアロゾルなどによる送達のためのスプレー製剤が含まれる。このような局所送達系は、特に、皮膚への適用に相応しくなる。すなわち、こうした局所送達系は、当業界でよく知られている美容製剤を含めた局所的使用に特に適する。このような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤（tonicity enhancing agent）、緩衝剤、および保存剤を含有してもよい。

【0246】

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用である。ポリペプチド治療薬（たとえば、抗体、融合タンパク質など）の皮下投与に適する製剤成分および方法は、当業界で知られている。たとえば、米国特許出願公開第２０１１／００４４９７７号明細書、米国特許第８，４６５，７３９号明細書、および米国特許第８，４７６，２３９号明細書を参照されたい。通常、皮下投与用の医薬組成物は、適切な安定剤（たとえば、メチオニンなどのアミノ酸、およびまたはスクロースなどの糖）、緩衝剤、および等張化剤（tonicifying agent）を含有する。

【0247】

本明細書で使用するとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連することがある。こうした適用は、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独、混合物、たとえばラクトースとの乾燥ブレンドとして、またはたとえばリン脂質との混合型要素粒子としてのいずれか）の形で、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾルスプレー体裁の形で、適切な噴射剤を使用しまたは使用せずに、好都合に送達することができる。

【0248】

本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液、組換えアルブミンが挙げられる。

【0249】

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のコンジュゲートの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を指す。多くの場合、本発明のコンジュゲートは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。

【0250】

薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸に対して生成することができる。

【0251】

塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。
塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に対して生成することができる。

【0252】

塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表のＩ〜ＸＩＩ列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。

【0253】

塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。

【0254】

本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。

【0255】

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているであろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤など、およびこれらの組合せを包含する（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。

【0256】

本発明の方法
ＧＤＦ１５循環レベルは、いくつもの病的および生理的状態において、最も顕著な例としては、妊娠（Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788）、β−サラセミア（Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101）（Zimmermann MB, 2008 Am J Clin Nutr 88:1026-31）、および先天性赤血球異形成貧血（Tamary H 2008, Blood. 112:5241-4）において、上昇することが報告されている。ＧＤＦ１５は、文献の報告において、いくつもの生物学的活性と関連付けられている。ＧＤＦ１５ノックアウトおよびトランスジェニックマウスの研究では、ＧＤＦ１５が、虚血／再潅流または過負荷によって誘発された心臓損傷に対しては保護的に（Kempf T, 2006, Circ Res.98:351-60）（Xu J, 2006, Circ Res. 98:342-50）、加齢と関連する運動ニューロンおよび感覚ニューロン減少に対しては保護的に（Strelau J, 2009, J Neurosci. 29 : 13640-8）、腎臓における代謝性アシドーシスに対しては穏やかに保護的になる場合があり、がん患者においては悪液質を引き起こす場合がある（Johnen H 2007 Nat Med. 11: 1333-40）ことが示唆された。多くのグループによって、細胞アポトーシスおよび増殖におけるＧＤＦ１５の役割も研究されており、異なる細胞培養および異種移植片モデルが使用されて、議論を呼ぶ結果が報告された。トランスジェニックマウスでの研究では、ＧＤＦ１５が、発癌物質またはＡｐｅ突然変異によって誘発された、腸および肺における新形成に対して保護的であることが示された（Baek SJ 2006, Gastroenterology. 131: 1553-60、Cekanova M 2009, Cancer Prev Res 2:450-8）。

【0257】

ＧＤＦ１５は、炎症、がん、および代謝においても役割を果たすことが報告されている（Samule Breit et al. Growth Factors, October 2011; 29(5): 187-195）。ＧＤＦ１５はさらに、生理的食欲および体重の調節との関連も示唆されている（Vicky Wang-Wei Tsai et al. Public Library of Science: PLOS ONE 2013, Vol. 8, Issue 2, e55174）。

【0258】

本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、糖尿病、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を、それを必要とする対象において治療または予防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはコンジュゲートの混合物を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、方法を提供する。

【0259】

このような方法は、たとえば、投与頻度を減らすなどの有利な効果をもたらす場合もある。

【0260】

したがって、さらなる実施形態として、本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を治療するための、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、本明細書に記載のとおりのコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または本明細書に記載のコンジュゲートの混合物の使用を提供する。

【0261】

したがって、さらなる実施形態として、本発明は、コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、またはコンジュゲートの混合物の、治療における使用を提供する。

【0262】

治療に用いる本発明の医薬組成物または併用品の有効量は、たとえば、治療の状況および目的に応じて決まる。当業者なら、治療に適した投与量レベルは、したがって、ある程度、得られた分子、コンジュゲートを使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢および総体的な健康）に応じて様々となることは理解されよう。それに応じて、臨床家は、最適な治療効果が得られるように、投与量を漸増し、投与経路を修正することができる。典型的な投与量は、上で言及した要素に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲となりうる。他の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲となりうる。この実施形態のさらなる態様では、投与量は、５μｇ／ｋｇ〜２５μｇ／ｋｇの範囲となりうる。この実施形態のさらに別の態様では、投与量は、１０μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇの範囲となりうる。

【0263】

投与の頻度は、使用される製剤中の二重機能タンパク質の薬動学パラメーターに応じて決まる。通常、臨床家は、組成物を、所望の効果が実現される投与量に達するまで投与する。したがって、組成物は、一用量として、（所望の分子を同じ量含有する場合もあれば、そうでない場合もある）２回分以上の用量として徐々に、または埋め込み装置もしくはカテーテルによる継続的な注入として、投与される場合がある。適切な投与量のさらなる改善は、当業者によって型通りになされ、当業者が日常行う職務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量−反応データを使用して突き止めることができる。

【0264】

本明細書で使用する用語「治療有効用量」および「治療有効量」とは、研究者、医師、または他の臨床家の探究の対象である組織系、動物、またはヒトにおいて、治療される疾患または障害の症状の緩和または改善を含む生物学的または薬用反応を誘発するコンジュゲートの量、すなわち、１つまたは複数の所望の生物学的または薬用反応、たとえば、血糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを低下させる、体重を減少させる、食物摂取を減らす、または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善することを観察可能なレベルで支持する、ＧＤＦ１５（またはＧＤＦ１５突然変異体）ポリペプチドコンジュゲートの量を意味する。

【0265】

用語「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物（たとえば哺乳動物）を指すのに、互換的に使用される。

【0266】

本明細書で使用するとき、いずれかの疾患または障害の「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、またはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善する（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの進展を緩慢にし、阻止し、または軽減する）ことを指す。別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、またはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、患者によって認識可能でなくてよいものを含めて、少なくとも１つの身体的パラメーターを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、またはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または障害を、身体的に（たとえば、認識可能な症状の安定化）、生理学的に（たとえば、身体的パラメーターの安定化）、または両方において、調節することを指す。したがって、治療は、活動性の疾患を（たとえば、ＧＤＦ１５コンジュゲートの場合では、体重が減少するように、食物摂取を減らすために、血流中のインスリンおよび／もしくはグルコースのレベルを低下させるために、耐糖能を向上させるためにグルコースレベルの変動が最小限に抑えられるように、かつ／またはグルコース恒常性の混乱によって引き起こされる疾患から保護されるように）抑制する（すなわち、疾患、障害、もしくは状態、またはそれに伴う臨床症状の発症またはそれ以上の進展を阻止する）ことを包含する。

【0267】

さらに別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、またはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または障害の発症、進展、または進行を予防するまたは遅らせることを指す。

【0268】

本明細書で使用する用語「治療を必要とする」とは、医師または他の医療従事者（caregiver）によってなされる、対象にとって治療が必要であるまたは恩恵となるかどうかの判断を指す。この判断は、医師または医療従事者の専門知識の範囲内にある様々な要素に基づいてなされる。

【0269】

用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ、ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ、ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」などは、（たとえば、臨床症状の存在によって明らかにされるような）対象が疾患、障害、状態などになるリスクを一時的もしくは永続的に予防、抑制、抑止、もしくは低減し、または、一般に、特定の疾患、障害、もしくは状態になる素因のある対象に関して、その発症を遅らせるような形で（たとえば、疾患、障害、状態、またはその症状の発症の前に）開始される、（本発明のコンジュゲートまたはコンジュゲートを含む医薬組成物を投与するなどの）行動の過程を指す。ある特定の例では、この用語は、疾患、障害、もしくは状態の進行を緩慢にする、またはそれが有害もしくは別な形で望ましくない状態へと進行するのを阻止することも指す。

【0270】

用語「代謝性疾患または障害」とは、限定はしないが、高インスリン血症、異常な耐糖能、肥満、腹部または上部身体区画への脂肪の再分布、高血圧；高トリグリセリド、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、および高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を特徴とする異脂肪血症を含む、関連性のある体質群を指す。代謝性疾患または障害を有する対象は、２型糖尿病、および、たとえばアテローム性動脈硬化症になるリスクがある。

【0271】

語句「グルコース代謝障害」は、対象において、グルコースレベルおよび／またはインスリンレベルが健康な個体に比べて上昇していることと関連する臨床症状または臨床症状の組合せを特徴とする、いずれかの障害を包含する。グルコースおよび／またはインスリンレベルの上昇は、特に、次の疾患、障害、および状態、すなわち、高血糖、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、Ｉ型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能の障害、高インスリン血症、グルコース代謝障害、糖尿病前症、代謝性障害（シンドロームＸとも呼ばれる代謝性疾患または障害など）、および肥満において現れる場合がある。本開示のＧＤＦ１５コンジュゲート、およびその組成物を使用すると、たとえば、グルコース恒常性を実現および／または維持して、たとえば、血流中のグルコースレベルを低下させ、かつ／または健康な対象において見られる範囲までインスリンレベルを低下させることができる。

【0272】

本明細書で使用する用語「インスリン抵抗性」とは、正常な量のインスリンによって、正常な生理学的反応または分子反応を引き起こすことができない状態を指す。一部の場合では、内因的に産生または外因的に投与される生理学的超過量のインスリンによって、全体または一部においてインスリン抵抗性を克服し、生体反応を引き起こすことができる。

【0273】

本明細書で使用する語句「耐糖能」とは、グルコース摂取が変動するときに血漿グルコースおよび／または血漿インスリンのレベルを制御しうる対象の能力を指す。たとえば、耐糖能は、約１２０分以内に、血漿グルコースのレベルを低下させてグルコース摂取前に求められたレベルに戻す、対象の能力を包含する。

【0274】

用語「耐糖能障害」または耐糖能の障害（ＩＧＴ）は、心血管病態のリスクの増大と関連付けられる、前糖尿病性の血糖異常（dysglycemia）の状態である。前糖尿病性の状態によって、対象が、グルコースを細胞に効率よく移動させ、それを効率的な燃料源として利用することができなくなる結果、血糖レベルが上昇し、ある程度のインスリン抵抗性が生じる。

【0275】

用語「２型真性糖尿病」とは、過剰なグルコース産生と、グルコースクリアランスが不十分であり、膵臓が十分なインスリンを産生できない結果として過度に高いままとなる循環グルコースレベルとを特徴とする状態である。

【0276】

本明細書で使用する用語「高血糖」とは、対象の血漿中を循環するグルコースの量が健康な個体に比べて増加している状態を指す。高血糖は、本明細書に記載するとおりの空腹時血糖レベルの測定を始めとする、当業界で知られている方法を使用して診断することができる。

【0277】

用語「低血糖（Hypoglycemia）」は、低血糖（low blood sugar）とも呼ばれ、血糖レベルが下がりすぎるあまり、身体活動に十分なエネルギーが提供されないときに起こる。

【0278】

本明細書で使用する用語「高インスリン血症」とは、循環インスリンのレベルが上昇しており、同時に、血糖レベルが上昇しているまたは正常である状態を指す。高インスリン血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの異脂肪血症、高い尿酸レベル、多嚢胞性卵巣症候群、ＩＩ型糖尿病、および肥満と関連するインスリン抵抗性によって引き起こされる場合がある。高インスリン血症は、血漿インスリンレベルが約２ｐＵ／ｍＬより高いときに診断することができる。

【0279】

用語「膵炎」とは、膵臓の炎症である。

【0280】

用語「異脂肪血症」とは、リポタンパク質過剰産生または欠乏を含めた、リポタンパク質代謝の障害である。異脂肪血症は、血液中の、総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、およびトリグリセリド濃度の上昇と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下とによって顕在化しうる。

【0281】

用語「脂肪性肝疾患（ＦＬＤ）」は、脂肪肝としても知られ、トリグリセリド脂肪の大きな液胞が、脂肪症（すなわち、細胞内における脂質の異常滞留）の過程を経て、肝臓細胞に蓄積する状態である。原因が多岐にわたるにもかかわらず、脂肪肝は、世界中で過度のアルコール摂取および（インスリン抵抗性の影響を伴うまたは伴わない）肥満のある者に起こる、単一疾患とみなすことができる。この脂肪代謝過程が混乱すると、脂肪が過剰な量で肝臓に蓄積し、その結果、脂肪肝になる場合がある。脂肪の蓄積には、脂肪性肝炎と呼ばれる、肝臓の進行性の炎症（肝炎）が伴うこともある。アルコールの寄与を考慮に入れることにより、脂肪肝は、アルコール性脂肪症または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、より重症の形態を、アルコール性脂肪性肝炎および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と称することもできる。

【0282】

用語「脂肪性肝炎」とは、小葉内の炎症および線維症を伴った肝細胞の脂肪化を特徴とするタイプの肝疾患である。過度のアルコール摂取との関連がないとき、脂肪性肝炎は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。

【0283】

用語「進行性肝疾患」とは、肝脂肪症のような比較的良性の状態から、肝炎、線維症、硬変、および肝細胞癌を始めとするより重症の状態へと進行する、広範囲の肝臓病理によって引き起こされる肝疾患である。ＰＮＰＬＡ３は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、ＡＦＬＤ／ＡＳＨ、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、原発性硬化性胆管炎などの進行性肝疾患と明確に関連付けられている（Paola Dongiovanni et al. World Journal of Gastroenterology, 2013, 19(41), 6969-6978）。

【0284】

用語「肥満」とは、ヒト対象に関して、体型指数（ＢＭＩ）が３０以上の成人であると定義することができる（疾病管理センター）。

【0285】

「メタボリック症候群」は、心疾患、および糖尿病や卒中のような他の疾患のリスクを高める危険因子群であると定義することができる。こうした危険因子には、高血糖（絶食後に１デシリットルあたり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ））、高トリグリセリド（血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ）、低ＨＤＬ（４０ｍｇ／ｄｌ未満）、および１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧が含まれる（世界保健機関）。

【0286】

用語「心血管疾患」とは、心臓および血管に関係した疾患である。

【0287】

用語「アテローム性動脈硬化症」とは、太い動脈および中型サイズの動脈の内膜に不規則に分布した脂質沈着を特徴とする血管疾患であり、時として動脈の管腔を狭小化させ、最終的には線維化および石灰化へと進行する。病変は、普通は限局的であり、ゆっくりかつ断続的に進行する。血流の制限が、大部分の臨床症状発現の原因であるが、病変の分布および重症度によっていろいろである。

【0288】

冠動脈疾患とも呼ばれる用語「冠動脈心疾患」とは、心臓に血液および酸素を供給する細い血管の狭小化である。

【0289】

「糖尿病合併症」とは、高い血糖レベルによって引き起こされる、腎臓、神経（ニューロパシー）、足（足部潰瘍および循環不良）、眼（たとえば、網膜症）などの、他の身体機能の問題である。糖尿病は、心疾患ならびに骨および関節障害のリスクも高める。他の長期的な糖尿病合併症としては、皮膚の問題、消化の問題、性機能不全、ならびに歯と歯肉の問題が挙げられる。

【0290】

本明細書で使用するとき、語句「体重障害」とは、体重過多および／または食欲亢進と関連する状態を指す。対象の年齢、身長、性別、および健康状態を含めた、種々のパラメーターを使用して、対象が、基準の健康な個体に比べて過体重であるかどうかが判定される。たとえば、対象の体重（キログラム）を対象の身長（平方メートル）で割ることにより算出される、対象の体型指数（ＢＭＩ）を評価することで、対象を過体重または肥満であるとみなすことができる。ＢＭＩが−１８．５〜−２４．９ｋｇ／ｍの範囲にある成人は、正常な体重であるとみなされ、ＢＭＩが−２５ｋｇ／ｍ〜−２９．９ｋｇ／ｍの間である成人は、過体重（肥満予備軍）とみなすことができ、ＢＭＩが−３０ｋｇ／ｍ以上である成人は、肥満であるとみなすことができる。食欲亢進は、往々にして体重過多の一因となる。たとえば、多くの場合不眠を伴う朝の食欲不振と晩の多食を特徴とするが、視床下部の傷害と関係がない場合もある、夜間食行動異常症候群を始めとして、食欲亢進と関連するいくつかの状態が存在する。

【0291】

本明細書に記載するすべての方法は、本明細書において別段指摘しない限り、または文脈からそうでないと否定されない限り、適切などの順序で実施してもよい。本明細書で示される、ありとあらゆる例の使用、または例示的な言い回し（たとえば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）は、単に本発明をよりよく理解させるためのものであり、別途請求項に記載する本発明の範囲に限定を設けてはいない。

【0292】

本発明によるコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次の方法によって評価することができる。

【0293】

アッセイおよびデータ
本発明に従う実施例１および１９ＢのＧＤＦ１５コンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0294】

動物研究の方法
本文書に記載するすべての動物研究は、地域および連邦政府の規制および指針に従うＮｏｖａｒｔｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。食餌性肥満の雄のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ）をＴａｃｏｎｉｃから購入し、６週齢以後は６０％脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４９２ｉ）を与えた。到着後、マウスは、１２時間：１２時間の逆の明−暗サイクル下で、１ケージあたり１匹の動物として収容した。動物はすべて、いかなる使用の前にも、最低１週間は順化させた。通常、月齢３〜４か月の間のマウスを研究対象とした。研究の１日前に、各群が同様の平均体重を有するように、マウスを体重に基づきランダム化した。研究当日、マウスを新たなケージに入れ、古い食物を取り除いた。およそ１時間後、暗サイクルの直前に、マウスに、媒体（３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４）または脂質にコンジュゲートさせたＧＤＦ１５類似体（０．５ｍｇ／ｋｇ）いずれかの一用量を皮下投与した。すべての注射が完了した後、マウスの体重を計り直し、定められた量の食物を戻した（マウス１匹あたり約５０ｇ）。約２週間にわたり、図に示した時点の食物摂取および体重を測定した。上述のとおりに処置した代理動物において、示した時点で血漿を採取し、ＥＬＩＳＡによって、製造者の指示通りにＧＤＦ１５レベルを測定した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ１５ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＤＧＤ１５０）。

【0295】

ＤＩＯマウス０．５ｍｇ／ｋｇ皮下一用量
本発明のコンジュゲートの活性および半減期を上述のアッセイにおいて試験した。

【0296】

【表2】

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【0297】

表１のデータは、本発明のコンジュゲートが、コンジュゲートしていないｈＧＤＦ１５および／またはｐｅｇ化ｈＧＤＦ１５に比べて有意に長い作用持続時間を有することを示している。

【0298】

固形飼料を与えたイヌにおけるＧＤＦ１５−コンジュゲートの有効性：ＧＤＦ１５−脂肪酸コンジュゲート
研究目的：０．０５ｍｇ／ｋｇの本発明によるＧＤＦ１５−脂肪酸部分コンジュゲートまたは媒体対照の皮下投与が食物摂取に与える効果を、ビーグル犬において、急性の設定（６時間）および９６時間の期間で評価すること。この化合物のＰＫプロファイルを評価するために、投与後１４日間にかけての異なる時点で、血漿サンプルを採取した。研究の間終始体重を測定した。

【0299】

動物：ベースライン体重および処置

【0300】

【表3】

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【0301】

投与手順：ベースライン体重および血液サンプルを収集した後に、媒体またはＧＤＦ１５の投与を行った。ＧＤＦ１５−脂肪酸部分コンジュゲートを０．９７ｍｇ／ｍｌの溶液として供給し、希釈せずに皮下注射によって０．０５ｍｇ／ｋｇで投与した。媒体動物には、等体積の３０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムｐＨ４媒体（５２μｌ／ｋｇ）を皮下注射によって与えた。

【0302】

採血：橈側皮静脈または頚静脈から血液サンプルを採取し（ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤のＤｉｐｒｏｔｉｎ Ａおよびアプロチニンを含有する管に３ｍｌ）、４℃で２０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離するまで氷上に置いた。血漿を等分に分配し、分析まで−７０℃で保管した。０、６．７５、２４．７５、４８．７５、７２．７５、および９６．７５時間の時点で採取した。７、１０、および１４日目に追加のサンプルを採取した。

【0303】

食物摂取測定：制約なしの食物摂取の測定を、投与から４５分後に始めた。この食物摂取測定は、急性測定（０〜６時間）と亜慢性測定（０〜９６時間）の２つの相からなる。

【0304】

０〜２時間に、イヌに５００ｇの通常固形飼料（Ｈｉｌｌ’ｓ Ｊ／Ｄ食）を与えた。２時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、２〜４時間にかけて別の５００ｇの固形飼料を与えておいた。４時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、４〜６時間にかけて別の３００ｇの固形飼料を与えておいた。６時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計った。この時点（６．７５時間）で血液サンプルを採取した。次いで、イヌに、５００ｇの固形飼料を一晩与えておいた。１〜４日目の朝に、残っている食物を取り除き、重量を計り、各動物から血液サンプルを採取した。１〜３日目には、次いでイヌに５００ｇの固形飼料を２４時間にかけて与えておいた。４日目に、イヌをその通常の固形飼料割当て（２６０ｇ）に戻した。

【0305】

追加の食物摂取測定：７、１４、および２８日目に、研究動物に６時間を与えてその日用固形飼料（２６０ｇ）を消費させた。この期間の終わりに、残っている食物を集め、重量を計った。

【0306】

体重測定：ベースライン時ならびに２、４、７、１０、１４、１８、および２８日目に、体重を測定した。ベースライン体重は、絶食状態で収集した。２および４日目に収集した体重は、絶食後のものでなかった。媒体処置動物については、他のすべての体重を絶食状態で収集した。ＧＤＦ１５処置動物について、７〜２８日目に求められた体重は、食欲を刺激し、重量を回復するために動物に食物が継続的に与えられていたので、絶食後のものでなかった。

【0307】

固形飼料を与えたイヌにおける本発明のＧＤＦ１５−脂肪酸アッセイコンジュゲートの有効性
研究目的：媒体対照および０．０１５ｍｇ／ｋｇまたは０．００５ｍｇ／ｋｇの本発明のＧＤＦ１５−脂肪酸部分コンジュゲートの皮下投与が食物摂取に与える効果を、ビーグル犬において、急性の設定（６時間）および９６時間の期間で評価すること（この研究では、すべてのイヌにおいて、媒体群が処置群より前に実施される）。この化合物のＰＫプロファイルを評価するために、投与後１４日間にかけての異なる時点で、血漿サンプルを採取する。研究の間終始体重を測定した。

【0308】

動物：ベースライン体重および処置

【0309】

【表4】

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【0310】

投与手順：ベースライン体重および血液サンプルを収集した後に、媒体の投与を行った。媒体動物に、５２μｌ／ｋｇの３０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウムｐＨ４媒体（５２μｌ／ｋｇ）を皮下注射によって与えた。ベースライン体重および血液サンプルを収集した後に、ＧＤＦ１５の投与を行った。ＧＤＦ１５−脂肪酸部分コンジュゲートを１．２０ｍｇ／ｍｌの溶液として供給し、希釈後に皮下注射によって０．０１５ｍｇ／ｋｇおよび０．００５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＧＤＦ１５保存液は、先行する研究で送達された５２μｌ／ｋｇを維持するために希釈した。

【0311】

採血：研究の媒体群および処置群について血液サンプルを採取した。橈側皮静脈または頚静脈からサンプルを採取し（ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤のＤｉｐｒｏｔｉｎ Ａおよびアプロチニンを含有する管に３ｍｌ）、４℃で２０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離するまで氷上に置いた。血漿を等分に分配し、分析まで−７０℃で保管した。０、６．７５、２４．７５、４８．７５、７２．７５、および９６．７５時間の時点で採取した。７、１０、および１４日目に追加のサンプルを採取した。

【0312】

食物摂取測定：研究の媒体群および処置群両方について、食物摂取を測定した。制約なしの食物摂取の測定を、投与から４５分後に始めた。この食物摂取測定は、急性測定（０〜６時間）と亜慢性測定（０〜９６時間）の２つの相からなる。

【0313】

０〜２時間に、イヌに５００ｇの通常固形飼料（Ｈｉｌｌ’ｓ Ｊ／Ｄ食）を与えた。２時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、２〜４時間にかけて別の５００ｇの固形飼料を与えておいた。４時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、４〜６時間にかけて別の３００ｇの固形飼料を与えておいた。６時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計った。この時点（６．７５時間）で血液サンプルを採取した。次いで、イヌに、５００ｇの固形飼料を一晩与えておいた。１〜４日目の朝に、残っている食物を取り除き、重量を計り、各動物から血液サンプルを採取した。１〜３日目には、次いでイヌに５００ｇの固形飼料を２４時間にかけて与えておいた。４日目に、イヌをその通常の固形飼料割当て（２６０ｇ）に戻した。

【0314】

追加の食物摂取測定：媒体群では７日目〜１４日目の間、処置群では７日目〜２８日目の間の異なる日々に、研究動物に６時間を与えてその日用固形飼料（２６０ｇ）を消費させた。この期間の終わりに、残っている食物を集め、重量を計った。１週間に１回、定期的に食物消費を測定した。給餌から１、２、４、および６時間後に２２５ｇの固形飼料の消費を測定して、各イヌの摂食パターンが正常に戻っているかどうかを判定した。

【0315】

体重測定：研究の媒体群および処置群両方について、体重を測定した。媒体群については、ベースライン時ならびに２、４、７、１０、および１４日目に体重を測定した。処置群については、ベースライン時ならびに２、４、７、１０、１４、１７、２１、２４、および２８日目に体重を測定した。２および４日目に収集した体重は、絶食後のものでなかった。他のすべての体重は、絶食状態で求めた。

【0316】

実施例２のコンジュゲートを上記アッセイにおいて試験した。

【0317】

【表5】

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【0318】

ＧＤＦ１５−コンジュゲートは、肥満マウスにおける糖尿病および脂肪性肝疾患を含めた代謝性疾患の測定値を改善する
食餌性肥満マウスに、媒体または実施例１９Ｂｍ（０．５ｍｇ／ｋｇ／皮下）を１週間に１回４週間投与した。最初の投与から２週間後に非絶食後グルコースおよびインスリンを測定し、最初の投与から４週間後に、終夜絶食後の血中グルコースおよびインスリンを測定した。実施例１９Ｂｍは、非絶食後グルコースを２３％低下させた（媒体処置の２０７．１ｍｇ／ｄｌに対して実施例１９Ｂｍは１６０．４ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０５）。実施例１９Ｂｍは、非絶食後インスリンレベルを媒体処置マウスに比べて７５％低下させた（２．１対８．７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）。初回投与から４週間後に、実施例１９Ｂｍは、空腹時血中グルコースを２８％（１４２．７対１９９．５ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０５）、空腹時インスリンを７８％（０．７７対３．５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）低下させた。脂肪性肝疾患のマーカーも、実施例１９Ｂｍを１週間に１回、４回投与することにより改善された。実施例１９Ｂｍは、肝脂肪症を５７．５％（肝臓脂肪１１．３６対２６．７３％、ｐ＜０．０５）減少させ、肝細胞損傷のマーカーであるアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の血漿レベルを５８％（４６．２対１１０．５Ｕ／Ｌ、ｐ＜０．０５）低下させた。加えて、実施例１９Ｂｍは、進行性肝疾患の原因遺伝子であるＰＮＰＬＡ３の肝臓での発現を７７％（ｐ＜０．０５）低減させた。

【0319】

本発明に従う実施例２０および２１のＡＰＪアゴニストコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0320】

ｈＡＰＪカルシウムフラックスアッセイ：
Ｃｈｅｍ−５ ＡＰＪ安定細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＨＴＳ０６８Ｃ）を、２５ｕｌの増殖培地中に１０，０００細胞／ウェルで３８４ウェルフォーマットに播き、次いで、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて２４時間増殖させた。アッセイの１時間前に、２．５ｍＭのプロベネシドを含有する２５ｕｌ／ウェルのＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ ４色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｒ８１４２）を加え、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて細胞を１時間インキュベートした。ペプチドを、ＨＢＳＳ、０．１％ＢＳＡ添加ＨＥＰＥＳ緩衝液に可溶化し、５０ｕＭから５ｐＭへと、三通りに１０倍連続希釈した。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａを使用して、色素を含んだ細胞にペプチドを加えた（１：５、１０ｕＭ〜１ｐＭの範囲の最終ペプチド濃度とする）。細胞内部にあるＦＬＩＰＲ色素は、カルシウムに結合後に蛍光を発したが、細胞の外側からの蛍光は遮蔽された。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａにおいて４７０〜４９５の励起波長および５１５〜５７５の発光波長を使用して、蛍光を測定した。読み取りは、ペプチドを加える１０秒前に開始して合計３分間行った。最大−最小値を算出し、各ペプチド濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ペプチドによるカルシウムフラックス刺激について、曲線変曲点におけるＥＣ_５０値を算出した。

【0321】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：
コンジュゲートをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解させて濃度を１ｍｇ／ｍｌとして、投与溶液を生成した。投与溶液は、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍｇ／ｋｇの用量に相当する１ｍｌ／体重ｋｇの体積で、側方尾静脈から静脈内投与した。投与後の定められた時間に頚静脈カテーテルから静脈血サンプルを取得し、直ちに氷上に置いた。こうしたサンプルを４Ｃで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した。

【0322】

生体分析：
検量線の作製：ペプチドコンジュゲートを水に溶解させて１ｍｇ／ｍｌとすることにより、保存溶液を調製した。１０ｕＬの保存液を９９０ｕＬのラット血漿と混合して、血漿中に１０，０００ｎｇ／ｍｌの作業保存液を生成した。これを血漿中に連続希釈して、５０００、１０００、５００、１００、５０、１０、５、および１ｎｇ／ｍｌの標準とした。

【0323】

サンプルおよび標準物質の調製：２５ｕＬの血漿サンプルまたは標準物質を清浄なプレートに移した。内部標準としての１００ｎｇ／ｍｌのグリブリドを含有する１５０ｕＬのアセトニトリル：ＭｅＯＨ（１：１）を各バイアルに加え、プレートをボルテックス撹拌して中身を混合した。プレートを４Ｃにて４０００ｒｐｍで遠心分離した。１２５ｕＬの上清を清浄なプレートに移し、５０ｕＬの水と混合し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。

【0324】

ＬＣ／ＭＳ分析：
ＨＰＬＣ：オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣ
カラム：ＭＡＣ−ＭＯＤ ＡＣＥ Ｃ１８、３μｍ、３０ｍｍ×内径２．１ｍｍ
移動相Ａ：０．１％のアセトニトリル中ギ酸
移動相Ｂ：０．１％の水中ギ酸
勾配プログラム：

【0325】

【表6】

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質量分析計：ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ６５００
ＭＳ条件：Ｑ１（ｍ／ｚ＋）８０９．３；Ｑ３（ｍ／ｚ＋）９２３．７；ＤＰ：６０；ＣＥ：２５
データ解析：ＭＳデータを取り込み、ＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ ｖ７．４ソフトウェアを使用して解析した。

【0326】

上述のアッセイを使用しての本発明のＡＰＪアゴニスト−コンジュゲートの活性および安定性

【0327】

【表7】

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【0328】

本発明に従う実施例２６Ａおよび２６Ｂのオキシトシンコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0329】

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの説明：
材料および方法
化合物プレートの調製
調達した化合物をＤＭＳＯ中に調製し、最終的にはＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ中に調製して、最終アッセイ濃度の３倍の濃度とした。同様に、媒体対照および陽性対照を調製して、すべてのアッセイが確実に適正に対照されるようにした。

【0330】

【表8】

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【0331】

ウェルはすべて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを使用して調製した。ＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２．５ｍＭのプロベネシドを含有するようにＨＢＳＳが補足されている、ｐＨ７．４の改良されたハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）であった。

【0332】

カルシウムフラックスアッセイ
アゴニストアッセイ
調達した化合物を、分析する各濃度について二通りにプレーティングした。参考アゴニストであるオキシトシンも同様にして調製して、アッセイ対照として利用した。参考アゴニストであるオキシトシンは、（参考アゴニストが最大の反応を誘発した濃度）で含めた。

【0333】

アゴニストアッセイは、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ機器において行い、そこで、蛍光／発光ベースラインが確立された後、試験化合物、媒体対照、および参考アゴニストをアッセイプレートに加えた。アゴニストアッセイは、合計１８０秒とし、これを使用して、分析する各ＧＰＣＲを活性化させる各化合物の能力を評価した。３分のアゴニストアッセイが終了した後、アッセイプレートを２５℃でさらに７分間インキュベートした。

【0334】

データ処理
すべてのプレートについて、適正なベースライン補正を行った。ベースライン補正の処理がなされたなら、最大蛍光／発光値をエクスポートし、データを処理して、活性化百分率および阻害百分率を計算した。０〜−３０％のマイナスの値は、生物学的な変動性の結果である場合もある。データ処理計算は、次のとおりである：（（最大ＲＬＵ）−（ベースライン平均））／（（陽性平均）−（ベースライン平均））

【0335】

Ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの説明：
コンジュゲートをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解させて濃度を３ｍｇ／ｍｌとして、投与溶液を生成した。投与溶液は、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、３ｍｇ／ｋｇの用量に相当する１ｍｌ／体重ｋｇの体積で、側方尾静脈から静脈内投与した。投与後の定められた時間に頚静脈カテーテルから静脈血サンプルを取得し、直ちに氷上に置いた。こうしたサンプルを４Ｃで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した。

【0336】

生体分析：
検量線の作製：ペプチドコンジュゲートおよびペプチドを、別個の２本のバイアルにおいて、ジメチルスルホキシドに溶解させて１ｍｇ／ｍｌとすることにより、保存溶液を調製した。１０ｕＬの各保存液を９８０ｕＬのラット血漿と混合して、血漿中に１０，０００ｎｇ／ｍｌの作業保存液を生成した。これを血漿中に連続希釈して、５０００、１０００、５００、１００、５０、１０、５、１、０．５、および０．１ｎｇ／ｍｌの標準とした。

【0337】

サンプルおよび標準物質調製：２５ｕＬの血漿サンプルまたは標準物質を清浄なプレートに移した。内部標準としての１００ｎｇ／ｍｌのグリブリドを含有する１５０ｕＬのアセトニトリルを各バイアルに加え、プレートをボルテックス撹拌して中身を混合した。プレートを４Ｃにて４０００ｒｐｍで遠心分離した。１２５ｕＬの上清を清浄なプレートに移し、１５０ｕＬの水と混合し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。

【0338】

ＬＣ／ＭＳ分析：
ＨＰＬＣ：オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣ
カラム：ＭＡＣ−ＭＯＤ ＡＣＥ Ｃ１８、３μｍ、３０ｍｍ×内径２．１ｍｍ
移動相Ａ：０．１％のアセトニトリル中ギ酸
移動相Ｂ：０．１％の水中ギ酸
勾配プログラム：

【0339】

【表9】

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質量分析計：ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ６５００
ペプチドＭＳ条件：Ｑ１（ｍ／ｚ＋）９４５．２０；Ｑ３（ｍ／ｚ＋）６８７．２７；ＤＰ：１４０；ＣＥ：３９
ペプチドコンジュゲートＭＳ条件：Ｑ１（ｍ／ｚ＋）１２７０．８５；Ｑ３（ｍ／ｚ＋）４６８．３０；ＤＰ：１４０；ＣＥ：７７
データ解析：ＭＳデータを取り込み、ＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ ｖ７．４ソフトウェアを使用して解析した。

【0340】

上述のアッセイに従う、本発明のオキシトシン脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性

【0341】

【表10】

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【0342】

国際公開第２０１４／０９５７７３号パンフレットの実施例１３を以下に示す。

【0343】

【化34】

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本発明のオキシトシン−脂肪酸コンジュゲートは、コンジュゲートしていないオキシトシン類似体に比べて、半減期の７５倍の延長を示した。

【0344】

本発明に従う実施例２７Ａおよび２７ＢのＡｇＲＰコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0345】

Ａ）ＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイプロトコール：
ＨＥＫ２９３／ＭＣ４Ｒ細胞の継代
細胞：ＨＥＫ２９３／ＭＣ４Ｒ安定細胞系
完全培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０３９、アッセイ用、無フェノールレッド培地 カタログ番号２１０４１）
１０％ＦＢＳ（熱不活化されたもの、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００８２）
２００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１３１）
１５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５６３０）
２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５０３０）
フラスコ：１５０ｃｍ^２の組織培養処理されたフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０８２５）
− 条件培地を吸引する。
− ２５ｍＬのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）で洗浄し、次いでそれを吸引する。
＊ＦＢＳによって、トリプシン−ＥＤＴＡ処理が抑制される
− ２．５ｍＬの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５３００）を加える。
− 数分放置し、次いでフラスコを数回軽く叩いて、細胞を引き離す。
− ２５ｍＬの完全培地を加えて、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を停止させる。
＊アッセイ用の細胞調製物、無フェノールレッド完全培地を使用する必要がある。
− 数回の穏やかなピペット操作によって、凝集した細胞を再懸濁する。
− 懸濁液を５０ｍＬの遠心管に移す。
− １２００ｒｐｍで３分間遠心沈殿する。
− 上清を吸引する。
− 底をやさしく叩くことにより細胞を分散させる。
− ５〜１０ｍＬの完全培地を加え、次いで穏やかなピペット操作によって再懸濁する。
＊アッセイ用の細胞調製物、無フェノールレッド完全培地を使用する必要がある。
− ０．５ｍＬの懸濁液をＶｉ−ｃｅｌｌ用のサンプルバイアルに移す。
− Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用して細胞数をカウントする。＊細胞密度および生存度を毎回記録する。
− １〜３×１０^６個の細胞を新しい１５０ｃｍフラスコに移す。
３日間：３×１０^６細胞／フラスコ
４日間：１×１０^６細胞／フラスコ
− ３７Ｃ、５％ＣＯ_２でインキュベートする。

【0346】

ＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイに向けた細胞播種（アッセイの１日前）
・ 継代の部にあるとおりに細胞懸濁液を調製する。
・ 懸濁液を２．３４×１０５細胞／ｍＬに希釈する。
＊１枚の３８４ウェルプレートに対して１３ｍＬで十分である。
・ ３０μＬの細胞懸濁液を、Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ ＢＩＯＣＯＡＴ ３８４ウェル透明プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５４６６０）の各ウェルに分注する：７０００細胞／ウェル
＊ポリ−Ｄ−リシンでコーティングされたプレートは、このアッセイにおいて不可欠である。
＊ｃＡＭＰ標準物質のウェルについては細胞なし
・ ３７Ｃ、５％ＣＯ_２で終夜インキュベートする。

【0347】

ＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイ
１．試薬の調製
・ １Ｍ ＩＢＭＸ
ＩＢＭＸ（ＭＷ２２２．２５ｇ／ｍｏｌ、ＡＣＲＯＳ カタログ番号２２８４２００１０） １１１ｍｇ
ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ２６５０） ５００ｕＬ
４℃で保管する。
・ ４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａ７０３０−５０Ｇ） ２００ｍｇ
ｄＨ_２Ｏ ５ｍＬ
４℃で保管する。
・ １ｍｇ／ｍＬ（１７６ｕＭ）のＡｇＲＰマスター溶液（ＨＢＳＳ／２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中）
Ｒ＆ＤヒトＡｇＲＰ Ｃ末端（カタログ番号３７２６−ＡＧ−１００） １００ｕｇ／バイアル
１×ハンクス液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０６５、ＣａおよびＭｇ含有） ９５ｕＬ
４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液 ５ｕＬ
４℃で保管する。
・ ２ｍＭのＮＤＰ−ａＭＳＨマスター溶液
ＮＤＰ−ａＭＳＨ（ＭＷ１６４６．９、Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ１１００） １ｍｇ／バイアル
ｄＨ_２Ｏ ３０４ｕＬ
＊溶解させたなら、１０ｕＬずつのアリコートを２００ｕＬの管に分注し、次いで−２０Ｃで保管した。
・ アッセイ緩衝液１
ＨＢＳＳ １０ｍＬ
１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３０） ０．２ｍＬ
１Ｍ ＩＢＭＸ ２０ｕＬ
＊ＩＢＭＸの沈殿を回避するために、完全に溶解するまで緩衝液をボルテックス撹拌してください。
・ アッセイ緩衝液２
ＨＢＳＳ ２０ｍＬ
１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３０） ０．４ｍＬ
１Ｍ ＩＢＭＸ ４０ｕＬ
４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液 ０．２５ｍＬ
＊ＩＢＭＸの沈殿を回避するために、完全に溶解するまで緩衝液をボルテックス撹拌してください。
・ ＩｇＧ滴定およびＡｇＲＰ滴定のための６ｎＭのＮＤＰ−ａＭＳＨ
２ｕＭのＮＤＰ−ａＭＳＨ（マスター溶液の１０００倍希釈液） １０．８ｕＬ
アッセイ緩衝液１ ３６００ｕＬ
＊１回の３８４ウェルアッセイについての例
・ ＩｇＧ滴定のための１２０ｎＭのＡｇＲＰ
１０倍希釈したマスター溶液（１７．６ｕＭ） ２６ｕＬ
アッセイ緩衝液２ ３８００ｕＬ
＊１枚の３８４ウェルプレートについての例
・ 滴定用のＮＤＰ−ａＭＳＨ作業溶液（試薬を参照のこと）
・ 滴定用のＡｇＲＰ作業溶液（試薬を参照のこと）
・ 滴定用のＩｇＧ作業溶液（試薬を参照のこと）
・ ｃＡＭＰ標準溶液（試薬を参照のこと）

【0348】

２．アッセイ（２ステッププロトコール）
アッセイキット：Ｃｉｓｂｉｏ ｃＡＭＰ ＨｉＲａｎｇｅ ＨＴＲＦキット（カタログ番号６２ＡＭ６ＰＥＢ）
− ＩｇＧ／ＡｇＲＰ混合物（１：１）の調製
・ １５ｕＬのＩｇＧ作業溶液と１５ｕＬの１２０ｎＭ ＡｇＲＰを混合し、次いで周囲温度で１時間インキュベートする。
− アッセイプレートの調製
・ 細胞を含有する３８４ウェルアッセイプレートをＷｉｐｅａｌｌの上で逆さにして培地を捨て、次いで軽く叩いて培地を取り除いた。
・ 各ウェルに１００μＬのＤＰＢＳを加え、同じようにして捨てた。
＊ＰＢＳを捨てたなら、できる限りすぐに次に進んで、乾き切らないようにする。
・ 次の試薬１０μＬを、使用者のサンプルの並べ方に従って各ウェルに移す。
ｃＡＭＰ標準：ｃＡＭＰ標準物質
ｃＡＭＰ滴定についての陰性対照：ＨＴＲＦキットの中の希釈剤
陽性対照：ＨＴＲＦキットの中のｃＡＭＰ陽性対照
ＭＳＨ滴定：アッセイ緩衝液２
ＡｇＲＰ滴定：ＡｇＲＰ作業溶液
ＩｇＧ滴定：ＩｇＧ／ＡｇＲＰ混合物
細胞アッセイ用の陰性対照：アッセイ緩衝液２
− ３８４ウェルプレートを１２００ＲＰＭでフラッシュ遠心沈殿する。
− 細胞を周囲温度で１５分間インキュベートする。
− 次の試薬１０μＬを、使用者のサンプルの並べ方に従って各ウェルに加える。
ｃＡＭＰ標準：アッセイ緩衝液１
ｃＡＭＰ滴定についての陰性対照：アッセイ緩衝液１
陽性対照：アッセイ緩衝液１
ＭＳＨ滴定：ＭＳＨ作業溶液
ＡｇＲＰ滴定：６ｎＭ ＭＳＨ溶液
ＩｇＧ滴定：６ｎＭ ＭＳＨ溶液
細胞アッセイ用の陰性対照：アッセイ緩衝液１
− ３８４ウェルプレートを１２００ＲＰＭでフラッシュ遠心沈殿する。
− 細胞を周囲温度でさらに３０分間インキュベートする。
＊このインキュベート時間はそれほど厳格でない。アッセイ開発データによれば、＋／−５分は可となるはずである。
− １０μＬのｃＡＭＰ−ｄ２（キットの中に支給されている溶解緩衝液に１：４希釈したもの）を加える。
＊重要！！ 陰性対照については、ｃＡＭＰ−ｄ２でなく、溶解緩衝液だけとする。
− １０μＬの抗ｃＡＭＰクリプテート（キットの中に支給されている溶解緩衝液に１：４希釈したもの）を加える。
− １２００ＲＰＭでフラッシュ遠心沈殿する。
− アッセイプレートを周囲温度で４５〜６０分間インキュベートする。
− 各サンプル３０μＬを、組織培養処理された３８４ウェル白色ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５７２）に移す。
− １２００ＲＰＭでフラッシュ遠心沈殿する。
− 次の設定のＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ Ｍ５またはＭ５ｅを用いて蛍光を測定する。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ Ｍ５／Ｍ５ｅの設定

【0349】

【表11】

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【0350】

Ｂ）ＭＣ３ ｃＡＭＰアッセイ
材料：
細胞：ＨＥＫ２９３／ＭＣ３Ｒ安定細胞系
完全培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０３９）
１０％ＦＢＳ（熱不活化されたもの、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００８２）×
２００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１３１）
２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５０３０）
フラスコ：１５０ｃｍ^２の組織培養処理されたフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０８２５）
アッセイ緩衝液
ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ−１４１７５−０９５） １０ｍＬ
１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＢＰ２９９−１） ０．２ｍＬ
５００ｍＭ ＩＢＭＸ（ＭＷ２２２．２５ｇ／ｍｏｌ、ＡＣＲＯＳ カタログ番号２２８４２００１０） ４０ｕｌ
ＢＳＡ ０．２５％
プレート
３８４ウェルべた底、Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ（カタログ番号−７８１０８０）

【0351】

アッセイプロトコール（アンタゴニストプロトコール）：
Ｉ．条件培地を吸引する。
ＩＩ． ２．５ｍＬのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０）で洗浄する
ＩＩＩ． ２ｍＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００−０５６）を加える。
ＩＶ．フラスコをインキュベーターに入れて数分間放置し、フラスコを数回軽く叩いて、細胞を引き離す。
Ｖ． １０ｍＬの完全培地を加えて、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を停止させ、数回の穏やかなピペット操作によってこれをよく混合して、凝集した細胞を再懸濁する。
ＶＩ． １．５ｍｌの細胞を、２０ｍｌの完全培地を含有する新しい１５０ｃｍのフラスコに移す。
ＶＩＩ．残りの懸濁液を５０ｍＬの遠心管に移す。
ＶＩＩＩ． １２００ｒｐｍで４分間遠心沈殿する。上清を吸引する。
ＩＸ． ６ｍＬのアッセイ緩衝液を管に加え、穏やかなピペット操作によって細胞を再懸濁する。
Ｘ． ０．５ｍＬの懸濁液をＶｉ−ｃｅｌｌ用のサンプルバイアルに移し、別の０．５ｍｌのＰＢＳを加える。
ＸＩ． Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用して細胞数をカウントする。＊細胞密度および生存度を毎回記録する。
ｉ． ＩＢＭＸを含有する１０ｕｌ／ウェルのアッセイ緩衝液に、４Ｋ／ウェルで細胞を播く。
ｉｉ．プレートをインキュベーターに入れて約３０分間放置した後、浮遊細胞に対してアッセイを開始する。

【0352】

ｃＡＭＰ定量については、２ステップｃＡＭＰプロトコールに従う。
手順
Ｉ．アンタゴニストウェルに対してのみ、１０ｕｌ／ウェルの細胞に、アッセイ緩衝液中に３倍に調製された５ｕｌのＡｇＲＰを加える。
ＩＩ．陽性対照ウェル（ＮＤＰ−α−ＭＳＨを含有することになるウェル）には、５ｕｌの緩衝剤を加える。
ＩＩＩ．プレートを３７℃で約２０分間インキュベートする。
ＩＶ． ＡｇＲＰ ＤＲＣを含有するウェルに、５ｕｌ／ウェルの、４倍に調製されたアゴニストＥＣ８０（ＮＤＰ−α−ＭＳＨ）を加える。
Ｖ． ＮＤＰ−α−ＭＳＨ ＥＣ５０を算出するために、５ｕｌ／ウェルの、４倍に調製されたアゴニスト（ＮＤＰ−α−ＭＳＨ）ＤＲＣ（プレートにおける最終最高濃度は１００ｎＭである）を加える。
ＶＩ．陰性対照だけに緩衝液を加える。
ＶＩＩ． ３８４ウェルプレートをパルス回転させ、細胞をインキュベーターにおいて３０分間インキュベートする。
ＶＩＩＩ．次の試薬１０μＬを各ウェルに加える。
ａ． １０μＬのｃＡＭＰ−ｄ２
ｂ． ＊重要！！ 陰性対照については、ｃＡＭＰ−ｄ２を加えず、溶解緩衝液および１０ｕｌ／ウェルのＴｂ−クリプテートだけを加える。
ｃ． １０μＬの抗ｃＡＭＰクリプテート
ｄ．プレートをパルス回転させ、室温で６０分間インキュベートする。

【0353】

Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの説明：
１０ナノモルのコンジュゲートを３００μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）に溶解させて、投与溶液を生成した。投与溶液（３００μＭ）を、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに側方尾静脈から静脈内投与した（ラット１匹あたり１０ナノモルの用量に相当する）。投与後の定められた時間に、尾の断片から血液を採取し、直ちに氷上に置いた。こうしたサンプルを４Ｃで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した。

【0354】

生体分析：
検量線の作製：実施例２７Ａおよび２７Ｂの２種の脂肪酸コンジュゲートならびに１種の成熟ヒトＡｇＲＰペプチドを使用して標準物質を作製した。保存標識ペプチドを、カゼインを含有するＥＬＩＳＡサンプル希釈剤に希釈して１００ｕｇ／ｍｌとすることにより、各ＡｇＲＰの中間保存溶液を調製した。アッセイに向けて、中間液を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＥＬＩＳＡサンプル希釈剤に希釈して２５００ｐｇ／ｍＬの先頭標準濃度とし、次いで２倍連続希釈して、ゼロ用量標準を含めた１６段階とした。

【0355】

サンプル希釈：血漿サンプルを、ＢＳＡを含有するＥＬＩＳＡサンプル希釈剤に１０倍希釈し、次いで、３１，２５０倍まで５倍連続希釈した。

【0356】

５Ｂ１ヒトＡｇＲＰ ＥＬＩＳＡ法：３８４ウェルのマイクロプレートを、室温（ＲＴ）において、１×ＰＢＳ中に３０ｕＬ／ウェルの抗ヒトＡｇＲＰクローン５Ｂ１で終夜コーティングした。プレートを吸引し、室温において９０ｕＬ／ウェルの乳系遮断剤で２時間ブロックした。これ以降のインキュベートはすべて、３０ｕＬ／ウェルで実施した。プレートを再び吸引し、サンプルおよび標準物質を室温で２時間ウェルに加えておいた。次いで、プレートを、ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸系洗浄緩衝液で３回洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＡｇＲＰポリクローナル抗体をウェルに加えて、結合したＡｇＲＰを室温で２時間かけて検出した。プレートを再び洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン試薬を室温で３０分間ウェルに加えておいた。プレートを最後にもう１回洗浄し、化学発光基質をすべてのウェルに加え、プレートの光出力をＳｐｅｃｔｒａｍｘ Ｍ５で直ちに読み取った。

【0357】

データ解析：生データを整理し、基礎ＰＫパラメーターについて分析した。

【0358】

上述のアッセイに従う、本発明のＡｇＲＰ脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性：

【0359】

【表12】

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【0360】

実施例２８Ａ、２８Ｂ、および２８ＣのＦＧＦ２３コンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。

【0361】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼ：精製ｈＦＧＦ２３−ＦＡコンジュゲートの生物学的活性を、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験した。ｈＦＧＦ２３−ＦＡコンジュゲートがＦＧＦ２３受容体に結合した結果、Ｅｇｒ−１の下流が活性化され、Ｅｇｒ−１プロモーターによって調節されるルシフェラーゼレポーターが発現された。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、Urakawa et al. (Nature, 2006, Vol 444, 770-774)が報告したことに基づき構築した。４８ウェルポリ−Ｄ−リシンプレートに播いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子、全長膜貫通型のＫｌｏｔｈｏ、およびトランスフェクション正常化レポーター遺伝子（ウミシイタケルシフェラーゼ）をトランスフェクトした。トランスフェクションから５時間後、トランスフェクション混合物を、段階的な濃度の試験タンパク質を含有する３ｍｌの１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭと差し替えた。２０時間後に細胞をｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１９４Ａ）に溶解させ、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２９４０）を使用して、ルシフェラーゼ活性を求めた。

【0362】

【表13】

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【0363】

本発明に従う実施例２９Ａおよび２９Ｂのセレラキシン脂肪酸コンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0364】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ＃１：
材料：
ＤＭＥＭ： Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３２０）
ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５８７９）
３８４べた底白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号７８１９４５）
２０，０００ ｄｙｎａｍｉｃ−２ ｃＡＭＰキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）
アデノシン３’，５’−環状一リン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９５０１）
Ｍａｔｒｉｘ−ｐｌａｔｅ ｍａｔｅ ｐｌｕｓ（５μｌのアッセイ試薬を加えるのに使用した）
ＰＢＳ−Ｇｉｂｃｏ（カタログ番号１００１０−０２３）

【0365】

【表14】

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【0366】

プロトコール：
１日目：べた底ＰＤＬコーティッド白色プレートにおいて、１０μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に、ＲＸＦＰ１−ＨＥＫ２９３／親ＨＥＫ２９３細胞を８０００個播いた。
２日目：化合物を用いてアッセイを実施した。

【0367】

アゴニストモード（概要）：
・ ３７℃で終夜１０μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中に細胞
・ 細胞に２０００μＭ（４ｘ）のＩＢＭＸ ５μｌを３７℃で３０分間
・ 上記に５μｌの４ｘ化合物／セレラキシンを３７℃で３０分間
（ステップ３の化合物希釈４００ｎＭから−最終は先頭１００ｎＭ）
・ １０μｌのｃＡＭＰ−ｄ２コンジュゲート
・ １０μｌの抗ｃＡＭＰクリプテートコンジュゲート
・ 室温で１時間インキュベートする。
・ ＦＲＥＴシグナルを読む−Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ６６５ｎｍ／６２０ｎｍ

【0368】

化合物の調製
セレラキシン：
１）保存液を、１５μｌの化合物を３０μｌ（最終は４０μＭ）に変えることによりＰＢＳに３倍希釈した、６８３．３μＭ、すなわち、１８８．３のＰＢＳ ｐＨ７．４中１１．７μｌに、手作業で希釈した。
２）１：１０、すなわち、６μｌの上記を５４μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２（最終は４μＭ）に、手作業で希釈した。
３）１：１０、すなわち、１０μｌの上記を９０μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２（最終は４００ｎＭ）に、手作業で希釈した。
セレラキシン−ＦＡコンジュゲート
１）保存液を、１５μｌの化合物を３０μに変えることによりＰＢＳに３倍希釈した、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４０μＭに希釈した。
２）１：１０、すなわち、６μｌの上記を５４μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２に、手作業で希釈した。
３）１：１０、すなわち、１０μｌの上記を９０μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１００希釈）に、手作業で希釈した。
脂肪酸
１）保存液を、１５μｌの化合物を３０μに変えることによりＰＢＳに３倍希釈した、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４０μＭに希釈した。
２）１：１０、すなわち、６μｌの上記を５４μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２に、手作業で希釈した。
３）１：１０、すなわち、１０μｌの上記を９０μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１００希釈）に、手作業で希釈した。

【0369】

ｃＡＭＰ検量線希釈：
１． ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に希釈した１５０μｌのｃＡＭＰ標準を最初の列に（２８００ｎＭ）。
２． １００μｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２培地をその後の１０までの列に（１〜１１）
３． ５０μｌを１００μｌに変えることによる３倍希釈
４．ステップ３からの２０μｌを検量線プレートの適切なウェルに
５． １０μｌの抗ｄ２および抗ｃＡＭＰクリプテートコンジュゲート
６．室温で１時間インキュベートする。
７． ＦＲＥＴシグナルを読む−Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ６６５ｎｍ／６２０ｎｍ

【0370】

分析：
Ｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して、ｃＡＭＰのｎＭ濃度をＬｏｇ（ｘ）変換した。
４パラメーター非線形回帰を使用して、検量線からｃＡＭＰ量を内挿した。
内挿された値を、１０＾Ｙ変換を使用してｎＭに変換した。
計算されたｃＡＭＰ量を、４パラメーター非線形回帰を使用して、化合物濃度に対してプロットした。

【0371】

【表15】

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【0372】

ウシ血清アルブミンおよびヒト血清存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性＃２：
材料：
ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３２０）
ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５８７９）
３８４べた底白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号７８１９４５）
２０，０００ ｄｙｎａｍｉｃ−２ ｃＡＭＰキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＣ）
アデノシン３’，５’−環状一リン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９５０１）
Ｍａｔｒｉｘ−ｐｌａｔｅ ｍａｔｅ ｐｌｕｓ（５μｌのアッセイ試薬を加えるのに使用した）
ＰＢＳ−Ｇｉｂｃｏ（カタログ番号１００１０−０２３）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｇｉｂｃｏ（カタログ−１５６３０−０８０）
１×ＨＢＳＳ Ｇｉｂｃｏ（カタログ−１４１７５−０９５）
アッセイ緩衝液−１×ＨＢＳＳ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ウシ血清アルブミン カタログ番号Ａ２１５３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｈ４５２２（ヒト血清）

【0373】

条件：
・ ６００μＭのＢＳＡ
・ ４％のヒト血清
・ １０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ−Ｈ４５２２）
・ アッセイ緩衝液

【0374】

試験する化合物：
・ セレラキシン
・ セレラキシン−ＦＡ（実施例２９Ａ）

【0375】

化合物の取扱い：
セレラキシン−：保存液は（７９６．５７ｕＭ）、すなわち４．７５ｍｇ／ｍｌ ＭＷは５９６３ダルトンである。
セレラキシン１０ｕｌ保存液を１９０ｕｌのＰＢＳに溶解させ、最終濃度を４０μＭとし、これを３０ｕｌを６０ｕｌのアッセイ緩衝液に変えることにより３倍希釈し、１１点曲線（Ａ２〜Ａ１２）１２番目を０とする。
セレラキシン−ＦＡコンジュゲート：保存液は（２８７．７９ｕＭ）、すなわち２．６１ｍｇ／ｍｌ ＭＷは９０６９ダルトンである。
セレラキシン２７．７９８ｕｌ保存液を１７２．２ｕｌのＰＢＳに溶解させ、最終濃度を４０μＭとし、これを３０ｕｌを６０ｕｌのアッセイ緩衝液に変えることにより３倍希釈し、１１点曲線（Ａ２〜Ａ１２）１２番目を０とする。

【0376】

ＢＳＡ保存溶液の調製：
６６６．６６ｕＭのＢＳＡについて：アッセイ緩衝液３０ｍｌを、１．３２グラムのＢＳＡを溶解させることにより作製した。
６００ｕＭのＢＳＡについて：アッセイ緩衝液３０ｍｌを、１．１８グラムのＢＳＡを溶解させることにより作製した。
ＢＳＡなしは、アッセイ緩衝液だけを含有する。

【0377】

ヒト血清
４．４４％のＨＳについて：２８．６６ｍｌのアッセイ緩衝液中１．３４ｍｌ
４％のＨＳについて：２８．８ｍｌのアッセイ緩衝液中１．２ｍｌ
１１．１１％のＨＳについて：２６．６７ｍｌのアッセイ緩衝液中３．３３ｍｌ
１０％のＨＳについて：２７ｍｌのアッセイ緩衝液中３ｍｌ

【0378】

手順：
１日目：８，０００細胞／ウェルのＲＸＦＰ１−ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３（親）細胞を、ベタ底プレート上の基本ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に、１０μｌ／ウェルの体積で播く。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートする。

【0379】

２日目：
１．細胞を５０ｕｌのアッセイ緩衝液で２回洗浄し、１回目および２回目の洗浄後に、ペーパータオルの上でやさしく叩いて、アッセイ緩衝液を取り除いた。
２．ＩＢＭＸ（６６６．６６ｕＭ）を含有するそれぞれの培地（６００ｕＭのＢＳＡ、４％のＢＳＡ、１０％のヒト血清、およびアッセイ緩衝液単独）である１５ｕｌの培地で、細胞を３７℃で３０分間前処理した。
３．化合物を３倍連続希釈する、１１点曲線−先のウェルから１５ｕｌの化合物を３０ｕｌのＰＢＳを含有する後続のウェルに移す、ウェル１１はＰＢＳのみ
４．ステップ３からのアッセイ緩衝液に（１：１０）希釈する（すなわち、１０ｕｌから９０ｕｌのアッセイ緩衝液）。
５．ステップ４からそれぞれの培地（６６６．６６μＭのＢＳＡ、４．４４％および１１．１１％のヒト血清、アッセイ緩衝液）に再び希釈（１：１０）し、ＢＳＡの最終濃度を６００μＭ、ヒト血清を４％および１０％とする。
６．（＊化合物をそのそれぞれの培地において室温で１時間インキュベートした後、細胞に加える）
７．ステップ６からの５ｕｌ、すなわち、４×セレラキシン／セレラキシン−ＦＡを１５ｕｌの細胞に、３７℃で３０分以上（セレラキシンの先頭濃度は１００ｎＭである）
８． １０ｕｌのｃＡＭＰ ｄ２コンジュゲートを加える。
９． １０ｕｌの抗ｃＡＭＰ−クリプテートを加える。
１０．室温で１時間インキュベートする。
１１． ＥｎｖｉｓｉｏｎでＦＲＥＴを読む。
１２．そのそれぞれの培地においてｃＡＭＰ検量線を作成した。

【0380】

ｃＡＭＰ検量線希釈：
ｃＡＭＰ標準物質の最初の保存液は、１１２００００ｎＭとする。
１． ２０ｕｌのｃＡＭＰ保存液を６０ｕｌのアッセイ緩衝液に溶解させることにより、最初の保存液を希釈する（１：４）。
２．ステップ１のアッセイ緩衝液への（１：１０）希釈（すなわち、１８０ｕｌのアッセイ緩衝液中２０ｕｌである）
３．ステップ２の、それぞれの濃度の４．４４％および１１．１１％のＨＳ、６６６．６６ｕＭのＢＳＡ、またはＢＳＡなしへの（１：１０）希釈。最終濃度は、最終的に４％、１０％のＨＳ、および６００μＭのＢＳＡとなる。

【0381】

ｃＡＭＰ検量線
１．それぞれのｃＡＭＰ標準１５０μｌを最初の列に加える（２８００ｎＭ）。
２．それぞれの濃度のアッセイ緩衝液６００ｕＭのＢＳＡ、４％および１０％のＨＳ、０％）１００μｌを後続の１１列、すなわち（２〜１２）に加える。
３． ５０μｌを後続のウェルの１００μｌに変えることによる３倍希釈、１２番目のウェルはｃＡＭＰなしの０である。
４．ステップ３からの２０μｌを検量線プレートの適切なウェルに
５． １０μｌのｄ２コンジュゲートを加える。
６．室温で１時間インキュベートする。
７． ＨＴＲＦ− Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読む。

【0382】

分析：
Ｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して、ｃＡＭＰのｎＭ濃度をＬｏｇ（ｘ）変換する。
４パラメーター非線形回帰を使用して、検量線からｃＡＭＰ量を内挿した。
内挿された値を、１０＾Ｙ変換を使用してｎＭに変換した。
計算されたｃＡＭＰ量を、４パラメーター非線形回帰を使用して、化合物濃度に対してプロットした。

【0383】

結果：

【0384】

【表16】

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【0385】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：
化合物（セレラキシンおよびセレラキシンコンジュゲート）を種々のげっ歯動物モデルにおいて試験して、短期および長期の心血管反応を評価することができる。

【0386】

短期モデル−マウス（いずれの系統でもよいがＤＢＡ／２が好ましい）またはラット（いずれの系統でもよいがＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙが好ましい）を、イソフルランを吸入させて麻酔し、１００％の酸素中約２％のイソフルランによって、安定した外科的水準の麻酔を維持し、直腸温度を正常レベルに保つ。頚動脈および頚静脈（マウス）または大腿動脈および静脈（ラット）を、覆っている皮膚を切開することで露出させ、血管にカテーテルを入れる。動脈圧を継続的に測定し、心拍を呼び起こすために、動脈カテーテルを圧変換器に接続し、シグナルをデジタルデータ取得システム（たとえば、Ｐｏｎｅｍａｈ）に向ける。別法としては、皮下に挿入した針電極を通して記録された心電図シグナルによって心拍を呼び起こす。動脈圧および心拍を安定させた後、自律神経遮断剤カクテル（たとえば、２ｍｇ／ｋｇずつのアトロピンおよびプロプラノロール）を約３〜４分かけて静脈内投与する。新血管パラメーターが再び安定したとき、セレラキシンまたはセレラキシンコンジュゲートを静脈内ボーラスとして約３秒かけて注射する。リラキシンは、特徴的な遅い開始（約６分でピーク反応）を伴う心拍の上昇および作用時間の持続（時間）を誘発する。動物を同じく準備して、連続した心エコー画像を集め、それをオフラインで分析することにより、心室の心機能（たとえば、駆出率、左室径短縮率、心拍出量）を測定する。

【0387】

長期モデル−マウス（いずれの系統でもよいがＤＢＡ／２が好ましい）またはラット（いずれの系統でもよいがＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙが好ましい）を、イソフルランを吸入させて麻酔し、１００％の酸素中約２％のイソフルランによって、安定した外科的水準の麻酔を維持する。手術前後および手術後に鎮痛剤を投与する。動脈および静脈に上述のとおりにカニューレを挿入するが、但し、カテーテルを背側皮膚領域で外面化し、ヘパリン化食塩水でフラッシュし、ステンレス鋼製のピンで栓をする。マウスでは、皮下カテーテルを皮下に埋め、同様にして外面化してもよい可能性がある。ラットでは、ばねテザー／スイベルシステムによってカテーテルを振り向ける。研究当日、動脈カテーテルを圧変換器に接続し、上述のとおりに自律神経遮断を実現するが、但し、マウスでは皮下カテーテルから遮断剤を投与してもよく、どちらの種の遮断も、その後は、自律神経剤の継続的な静脈内または皮下注入によって維持する。動脈圧および心拍を、デジタルデータ取得システムで継続的にモニターする。動脈圧および心拍を安定させた後、自律神経遮断剤を約３〜４分かけて静脈内または皮下投与する。新血管パラメーターが再び安定したとき、セレラキシンまたはセレラキシンコンジュゲートを静脈内ボーラスとして約３秒かけて注射する。マウスまたはラットにおいて数週間かけて心室の心機能および心拍を評価するために、セレラキシンコンジュゲートを１週間に１〜３回皮下注射し、ベースライン時に、その後は毎週、連続した心エコー画像を収集する。

【0388】

セレラキシン供給源：
セレラキシン（組換え１本鎖ヒトリラキシン）
Ｃｏｎｎｅｔｉｃｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ロット番号００Ｌ６０５
２０ｎＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中１．０ｍｇ／ｍＬ（５ｍＬバイアル）
各用量に所望される濃度のセレラキシンとするための、保存溶液の媒体への希釈

【0389】

実施例３０のＰＩＰコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0390】

グルコース刺激によるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイ：
ＧＳＩＳ試験は、高脂肪食誘発肥満（ＤＩＯ）マウスにおける組換えヒトプロラクチン誘導タンパク質（ｈＰＩＰ）後の、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵臓β細胞機能の測定として実施した。簡潔に述べると、マウス（ｍ＝５−７／群）を終夜（５：００ＰＭ〜８：００ＡＭ）絶食させ、試験日に、ベースライン時点として示した、体重および血糖（ＢＧ、Ｅｍｂｒａｃｅグルコース計量器で測定したもの）。次に、マウスに、ｈＰＩＰ（未変性ＰＩＰおよびＦＡにコンジュゲートさせたＰＩＰ、ＰＢＳ溶液、４ｍｌ／体重ｋｇで投与）または媒体対照（ＰＢＳ）を１回静脈内（ＩＶ）投与した。ｈＰＩＰ投与から４５分後、すべてのマウスに、経口グルコース（３ｇ／ｋｇのデキストロース、ＰＢＳ溶液、４ｍｌ／体重ｋｇで投与）を投与した。グルコース負荷の直前（０分時点として示す）、ならびにグルコースから１５分および３０分後に、血糖を測定した。グルコースから０分、１５分、および３０分後に、血液サンプルを採取して血漿を単離し、血漿インスリンの測定を行った。

【0391】

薬動学（ＰＫ）アッセイ：
ｈＰＩＰの血漿暴露を、単回静脈内投与後にＤＩＯマウスにおいて測定した。簡潔に述べると、制約なく給餌されたＤＩＯマウス（ｎ＝２）に、ｈＰＩＰ（未変性ＰＩＰおよびＦＡにコンジュゲートさせたＰＩＰ、ＰＢＳ溶液、４ｍｌ／体重ｋｇで投与）を１回静脈内（ＩＶ）投与した。投与から０．２５、０．５、１、３、７、２４、および４８時間後に、血液サンプルを採取し、血漿を単離し、社内ＥＬＩＳＡアッセイによる（以下に示すプロトコール）。

【0392】

アッセイでは、次のステップによって測定を行った。
・ ３０ｕｌのｈＰＩＰ抗体（ＰＩＰ−８−ＡＢとして示す、社内で産生したたもの、ＮＢＣクローン番号８７．１９Ｇ９Ａ１１、ＰＢＳ中８ｕｇ／ｍｌ）で、プレートを終夜室温でコーティングした。
・ 吸引した後、１００ｕｌのブロッキング用試薬で２時間ブロックした。
・ 吸引し、３０ｕｌのサンプルを加えて、２時間インキュベートし、サンプルおよび標準物質を、カゼイン緩衝液（１％のカゼイン、１．７ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、８．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム七水和物、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．７％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および０．１％のアジ化ナトリウム）に希釈する。
・ プレートを１００ｕｌのＴｅｋｎｏｖａ洗浄緩衝液（０．０５％のＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。
・ ３０ｕｌのビオチン標識ＰＩＰ抗体（ＰＩＰ−６Ａｂとして示す、社内で産生したもの、ＭＢＣクローン番号８７．８Ｃ６Ｂ３、カゼイン緩衝液中１０ｕｇ／ｍｌ）、１時間インキュベートする。
・ 上記のとおりに洗浄した。
・ ３０ｕｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１１４０、ＨＲＰ緩衝液中０．４ｕｇ／ｍｌ）をＨＲＰ緩衝液（０．４％のカゼイン、１．７ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、８．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム七水和物、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、および０．１％のクロロアセトアミド）に加え、３０分インキュベートした。
・ 上記のとおりに洗浄した。
・ ３０フェムトの化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０９６）を加え、直ちに読み取る。

【0393】

上述のアッセイに従う、本発明のＰＩＰ脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性

【0394】

【表17】

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【0395】

本発明のＰＩＰ脂肪酸コンジュゲートは、暴露期間が延長されており、その結果、有効性が向上している。

【0396】

実施例３１のＮＰＦＦコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。

【0397】

Ｃｉｓｂｉｏ ｃＡＭＰキットを用いたｃＡＭＰアッセイプロトコール
本発明のＮＰＦＦ−ＦＡコンジュゲートを、以下に記載するアッセイにおいて、ホルスコリンの存在下で試験した。

【0398】

【表18】

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【0399】

１日目：「継代培養プロトコール」に従って細胞を３８４ウェルプレートに播く。
１．抗生物質なしで増殖培地を作製する（必要に応じて）。
２． ７０％のエタノールを吹き付けた後、３７℃の水浴中で、抗生物質なしの増殖培地ボトルを平衡化する。
３． Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｔ．７５フラスコあたり３ｍｌ）で細胞を引き離す。
４． １７ｍｌの増殖培地を含有する５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管に移す。
５． １５０ｇで４分遠心分離する。
６．細胞ペレットを１０ｍｌの刺激緩衝液に再懸濁する。細胞を数える。
７．抗生物質を含有する増殖培地に５’０００細胞／５０ｕｌで細胞懸濁液を調製する。
８． Ｖｉａｆｌｏｗ ３８４−１２５ｕｌピペットを使用して、５０ｕｌの細胞懸濁液を播く。
９．プレートを１５分間ＴＣフード下に置く。
１０． ３７℃、５％ＣＯ_２、および湿度９０％でインキュベートする。

【0400】

２日目：
試薬溶液の調製
１．アッセイ緩衝液：
５００ｍｌのＨＢＳＳ＋１０ｍｌのＨＥＰＥＳ。室温で保管する。
アッセイ緩衝液：２５０ｍｌのＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ＋２５０ｕｌのＩＢＭＸ １０００倍溶液＋０．１％ＢＳＡ（８２５ｕｌ）。毎日新たに作製する。

【0401】

２．ホルスコリン２倍溶液：アッセイにおける最終１ｕＭ：
化合物希釈用：４０ｕｌのＦＳＫ／１００ｍｌのアッセイ緩衝液
ＮＰＦＦ希釈用：１０ｕｌのＤＭＳＯ／１０ｍｌの２倍ＦＳＫ

【0402】

３． ＮＰＦＦ希釈：保存溶液 ｄＨ_２Ｏ中１ｍＭ−アッセイにおける最終１ｕＭ
ａ． ５ｕｌの保存液／６２５ｕｌのＦＳＫ ２倍／ＤＭＳＯ
ｂ． １００ｕｌの溶液ａ＋３００ｕｌのＦＳＫ ２倍／ＤＭＳＯ。アッセイにおける最終１ｕＭ
ｃ． １０の１／４希釈ステップを行う：ＦＳＫ ２倍／ＤＭＳＯ中１００ｕｌ＋３００ｕｌ

【0403】

４．化合物希釈：保存溶液 ＤＭＳＯ中１０ｍＭ−アッセイにおける最終４０ｕＭ
ａ． ５ｕｌの保存液／６２５ｕｌのＦＳＫ ２倍
ｂ． １１の１／４希釈ステップを行う： １００ｕｌ＋３００ｕｌ ＦＳＫ ２倍

【0404】

５． ｃＡＭＰ標準：
ａ． １０ｕｌのｃＡＭＰ標準保存液（１．１２ｍＭ）＋９０ｕｌのアッセイ緩衝液
ｂ． １０ｕｌの希釈物ａ＋９０ｕｌの刺激緩衝液
ｃ． ２０ｕｌの希釈物ｂ＋４２８ｕｌの刺激緩衝液：５００ｎＭ
ｄ． 希釈物ｃから出発して１１の１／２希釈を行う：１００ｕｌの希釈物ｃ＋１００ｕｌの刺激緩衝液

【0405】

６． ｃＡＭＰ検出試薬：
ａ． ｄ２−ｃＡＭＰ：１０００Ｕｌ／２０ｍｌの溶解緩衝液（１枚の３８４ウェルプレートについて２５０ｕｌ／５ｍｌ）
ｂ． クリプテートコンジュゲート：１０００Ｕｌ／２０ｍｌの溶解緩衝液（１枚の３８４ウェルプレートについて２５０ｕｌ／５ｍｌ）

【0406】

アッセイ手順
ステップ１：
１．刺激緩衝液を調製する。
２．Ｃｉｓｂｉｏ溶解緩衝液を室温に置く。
３．ＷｅｌｌＭａｔｅを準備する（７０％のアルコールに続いてｄＨ_２０およびＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳで洗浄する）。
４．ホルスコリンおよび化合物希釈物を調製する。

【0407】

ステップ２：ホルスコリンでの刺激
１．細胞を５０ｕｌの刺激緩衝液で洗浄する：
ａ．プレートをやさしく叩いてＯ／Ｎ培地を除去する。
ｂ．プレートの上部に白色のペーパータオルをあてがい、プレートを逆さにして、ＶＷＲ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ４４１７遠心機を使用して、３００ＲＰＭで２０秒間遠心する。
ｃ． ＷｅｌｌＭａｔｅを使用して５０ｕｌの刺激緩衝液を加える。
ｄ．プレートをやさしく叩いてＯ／Ｎ培地を除去する。
ｅ．プレートの上部に白色のペーパータオルをあてがい、プレートを逆さにして、ＶＷＲ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ４４１７遠心機を使用して、３００ＲＰＭで２０秒間遠心する。
ｆ．顕微鏡で細胞を調べる。
２． Ｖｉａｆｌｏｗ３８４を使用して、ＩＢＭＸを含有する１０ｕｌの刺激緩衝液を加える。
３． Ｖｉａｆｌｏｗ３８４を使用して、化合物を含有する１０ｕｌの２倍ホルスコリン溶液を加える（７番目の床に対して）。溶液を混合した後で細胞に加える。
４．室温で３０分間インキュベートする（温度変化を避けるためにプレートを引き出しに入れる）。
５． ｃＡＭＰ検量線を準備し、ｃＡＭＰ検出試薬を調製する。
６． ２０ｕｌ／ウェルのｃＡＭＰ検量線を検量線プレート（アッセイプレートと同じプレート）に加える。

【0408】

ステップ３：ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰアッセイ
１． Ｃｏｍｂｉ３８４を使用して、１０ｕｌのｄ２ ｃＡＭＰ／ウェルをアッセイプレートに加える。
２． １０ｕｌ／ウェルのクリプテートコンジュゲートをアッセイプレートに手作業で加える。
３．プレートにシールをする。
４．室温で最低１時間インキュベートする（プレートは、２４時間以内に読み取ってよい）。
５．プレートの底にテープを貼る。
６． Ｅｎｖｉｓｉｏｎの「Ｃｉｓｂｉｏ３８４ ｆｕｌｌ ｐｌａｔｅ」プログラムで読み取る。
７．生データがアクセサリファイルに入っているのを確かめる。
８． ＧｒａｐｈＰａｄでデータを解析する（アクセサリファイルの中のファイルを参照する）。

【0409】

【表19】

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【0410】

生体分子がｓｉＲＮＡである本発明によるコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｖｏ法によって評価することができる。

【0411】

方法
実施例２４のコンジュゲートは、ＡＰＯＣ３ ｓｉＲＮＡがＧａｌＮＡｃ（参考例３）および脂肪酸とコンジュゲートした化合物である。ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から購入した。マウスには、１２時間の明／暗サイクル下で、標準のげっ歯動物固形飼料および水を制約なく与えた。この条件下で、ＡＰＯＣ３トランスジェニックマウスは、高トリグリセリド血症を自然に発症し、血漿ＴＧ含有量が著しく増加する（Aalto-Setala K, J Clin Invest 1992）。各群の４匹のマウスに、参考例３（ＡＰＯＣ３ ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃ）または実施例２４のコンジュゲートのいずれかを、２５ｍｇ／体重Ｋｇの用量で皮下注射した。注射直前のベースライン時、ならびに注射してから２、４、７、および１４日後に、血液を採取した。血漿を使用して、ＣｉｓｂｉｏのＨＴＲＦアッセイでヒトＡＰＯＣ３タンパク質レベルを測定した。一方向ＡＮＯＶＡを使用して、群間の統計学的差異を比較した。

【0412】

結果
ベースライン血漿ＡＰＯＣ３レベルは、参考例３およびコンジュゲート２４群において、それぞれ、１７６±２１ｍｇ／ｄＬおよび１７８±９ｍｇ／ｄＬであった。参考例３は、時間依存的に、投与から５日後に、血漿ＡＰＯＣ３レベルをベースラインに対して５６％低下させた。比較すると、実施例２４のコンジュゲートは、血漿ＡＰＯＣ３をより効果的に低下させ、投与から５日後で８０％の低下であった（図１）。作用持続時間は、図１に示されるとおり、参考例３と実施例２４とで似通っている。

【0413】

本発明のコンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも２０時間、少なくとも３０時間、少なくとも４０時間、または少なくとも５０時間である。一実施形態では、コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向上は、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または７５倍である。

【0414】

併用療法
本発明のコンジュゲートは、１種または複数の他の治療薬と同時またはその前もしく後に投与することができる。本発明のコンジュゲートは、他の薬剤と同じもしくは異なる投与経路で別々に投与してもよいし、または同じ医薬組成物にして一緒に投与してもよい。

【0415】

一実施形態では、本発明は、療法において同時に、別々に、または順次使用される併用型調製物として、前述の実施形態のいずれか１つのコンジュゲートまたは実施形態１０および１３に記載のとおりのコンジュゲートの混合物と、少なくとも１種の他の治療薬とを含む製品を提供する。一実施形態では、前記療法は、それを必要とする対象における、代謝性障害または疾患、２型真性糖尿病、肥満、異脂肪血症、グルコースレベルの上昇、インスリンレベルの上昇、および糖尿病性腎症の治療であって、治療有効量の本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、治療である。

【0416】

併用型調製物として提供される製品には、前述の実施形態のいずれか１つのコンジュゲートと他の治療薬とを同じ医薬組成物中に一緒に含む組成物、または別個の形態の前述の実施形態のいずれか１つのコンジュゲートと他の治療薬とを、たとえばキットの形にしたものがある。

【0417】

一実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれか１つのコンジュゲートまたは実施形態１０もしくは１３に従うコンジュゲートの混合物と、別の治療薬とを含む医薬組成物を提供する。場合により、医薬組成物は、上述のとおりの、薬学的に許容される医薬添加剤を含んでもよい。

【0418】

一実施形態では、本発明は、２種以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも１種が、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートを含有する、キットを提供する。一実施形態では、キットは、容器、分割ボトル、分割ホイル包などの、前記組成物を別々に保持する手段を含む。そのようなキットの一例は、錠剤、カプセル剤などの包装に一般に使用されているような、ブリスターパックである。

【0419】

本発明のキットを使用すると、たとえば経口と皮下と非経口という異なる剤形を投与する、別個の組成物を異なる投与間隔で投与する、または別個の組成物の用量を互いに合わせて漸増することができる。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは通常、投与の説明書を含む。本発明の併用療法では、本発明のコンジュゲートと他の治療薬は、同じまたは異なる製造業者によって製造および／または製剤されたものでよい。さらに本発明のコンジュゲートと他の治療薬は、（ｉ）（たとえば、本発明のコンジュゲートと他の治療薬を含むキットの場合において）併用製品が医師に発売される前に、（ｉｉ）投与のすぐ前に医師自らによって（または医師の指導のもとで）、（ｉｉｉ）たとえば本発明のコンジュゲートと他の治療薬を順次投与する際に患者自らで、一緒にされて併用療法になる場合もある。

【0420】

本発明はまた、本明細書に記載する疾患または状態を治療するための、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートの使用であって、患者が別の治療薬による治療を前もって（たとえば２４時間以内に）受けている、使用を提供する。本発明はまた、本明細書に記載する疾患または状態を治療するための、別の治療薬の使用であって、患者が前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートによる治療を前もって（たとえば２４時間以内に）受けている、使用を提供する。

【0421】

第２の薬剤または治療と「組み合わせて」という用語は、本発明のコンジュゲート（たとえば、前述の実施形態のいずれか１つに従うコンジュゲートまたは本明細書に別な形で記載するコンジュゲート）の第２の薬剤または治療との共投与、最初の本発明の化合物に続いての第２の薬剤または治療の投与、および最初の第２の薬剤または治療に続いての本発明のコンジュゲートの投与を包含する。

【0422】

用語「第２の薬剤」および「共薬剤」は、互換的に使用され、本明細書に記載する疾患または障害、たとえば、代謝性障害または疾患、すなわち、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが、慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、および他の代謝障害から選択される障害または疾患の症状を治療、予防、または軽減することが当分野で知られているいずれかの薬剤を包含する。

【0423】

一実施形態では、前記療法は、代謝性障害または疾患、すなわち、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害の、それを必要とする対象における治療であって、治療有効量の本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、治療である。

【0424】

前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である本発明のコンジュゲートと組み合わせる第２の薬剤の例としては、次のものが挙げられる。
１．抗糖尿病薬、たとえば、インスリン、インスリン誘導体および模倣物；スルホニル尿素（たとえば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）などのインスリン分泌促進物質；グリブリドおよびＡｍａｒｙｌ；メグリチニド、たとえばナテグリニドやレパグリニドなどの、インスリン分泌性スルホニル尿素受容体リガンド；（たとえばインスリン感作によって）インスリン作用を強化し、したがって末梢組織におけるグルコース利用を促進する、チアゾリジンジオン（たとえば、ロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン（netoglitazone）、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン（adaglitazone）、ダルグリタゾン；ＰＴＰ−１１２などの、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害薬；トルセトラピブなどの、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬；ＳＢ−５１７９５５、ＳＢ−４１９５０５２、ＳＢ−２１６７６３、ＮＮ−５７−０５４４１、ＮＮ−５７−０５４４５などの、ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）阻害薬；ＧＷ−０７９１やＡＧＮ−１９４２０４などのＲＸＲリガンド；Ｔ−１０９５などの、ナトリウム依存的グルコース共輸送体阻害薬；ＢＡＹ Ｒ３４０１などのグリコーゲンホスホリラーゼＡ阻害薬；ビグアナイド、たとえば、メトホルミン、およびグルコース利用を促進し、肝臓のグルコース産生を低下させ、および／または腸管からのグルコース出力を低減する他の薬剤；α−グルコシダーゼ阻害薬、たとえば、アカルボース、ミギイトイ（migiitoi）、および炭水化物消化、したがって、腸からの吸収を緩慢にし、食後高血糖を減らす他の薬剤；ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）、エキセンディン４などのＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１模倣物；ならびにビルダグリプチンなどのＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬、
２．脂質低下薬、たとえば、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害薬、たとえば、ロバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン（velostatin）、フルバスタチン、ダルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、およびリバスタチン（rivastatin）；スクアレンシンターゼ阻害薬；ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）およびＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）リガンド；コレスチラミンやコレセベラムなどの胆汁酸捕捉剤；フィブラート；ニコチン酸およびアスピリン、
３．抗肥満薬、たとえば、オーリスタットまたはリモナバント、フェンテルミン、トピラメート、クネキサ（qunexa）、ロカセリン（locaserin）、
４．降圧薬、たとえば、エタクリン酸、フロセミド、トルセミドなどのループ利尿薬；ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルなどのアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬；ジゴキシンなどの、Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜ポンプの阻害薬；中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害薬；オマパトリラート、サンパトリラート（sampatrilat）、ファシドトリルなどのＡＣＥ／ＮＥＰ阻害薬；カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンなどのアンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、特にバルサルタン；ジテキレン（ditekiren）、ザンキレン（zankiren）、テルラキレン（terlakiren）、アリスキレン、ＲＯ６６−１１３２、Ｒｏ−６６−１１６８などのレニン阻害薬；アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロールなどのβ−アドレナリン受容体遮断薬；ジゴキシン、ドブタミン、ミルリノンなどの強心薬（inotropic agent）；アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニフェジピン、ニソルジピン、ベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬；アルドステロン受容体アンタゴニスト；ならびにアルドステロンシンターゼ阻害薬、
５．ペルオキシソーム増殖因子−活性化因子受容体のアゴニスト、たとえば、フェノフィブレート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、ＢＭＳ−２９８５８５、Ｌ−７９６４４９、特許出願国際公開第２００４／１０３９９５号パンフレットに詳細に記載されている化合物、すなわち、実施例１〜３５の化合物もしくは請求項２１に詳細に挙げられている化合物、または特許出願国際公開第０３／０４３９８５号パンフレットに詳細に記載されている化合物、すなわち、実施例１〜７の化合物もしくは請求項１９に詳細に挙げられている化合物、特に、（Ｒ）−１−｛４−［５−メチル−２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−オキサゾール−４−イルメトキシ］−ベンゼンスルホニル｝−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸もしくはその塩、ならびに
６．Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633、図１〜７に記載されている詳細な抗糖尿病性化合物。

【0425】

さらに、本開示は、代謝を刺激するまたは食欲を低下させる薬剤、減量を促進するための改良された食事および／または運動レジメンなどの、減量を促進する薬剤および方法との併用療法を企図する。

【0426】

本発明の実施例
略語
ＡＣＮ アセトニトリル
ＢＥＨ エチレン架橋型ハイブリッド
ＢＯＣ ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ ジチオトレイトール
ＤＯＴ ３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール
ＥＤＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＳＩ エレクトロスプレーイオン化
ＦＦＡ 蛍光フォーカスアッセイ
Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド
ＨＣＴＵ： Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルホロホスフェート
ＨＥＰ ヘプタン
ＨＦＩＰ ヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析
ＨＯＢＴ ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＳ ヒト血清
ＬＣ／ＭＳ 液体クロマトグラフィー／質量分析
ＭＳ 質量分析
ＭＷ 分子量
ＭＲＴ 平均滞留時間
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ｐＥ ピログルタミン酸
ｐｂｆ ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＧ： 保護基
ＰＫ 薬物動態
Ｐｏｌ ポリマー担体
ＱＴＯＦ： 四重極飛行時間質量分析計
Ｒｔ： 保持時間
ＲｔまたはＲＴ： 室温
Ｒｐｍ： １分当たりの回転数
Ｓｃ 皮下の
ＳＦＣ 超臨界流体
ＳＰＰＳ 固相ペプチド合成
ＴＢＭＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
Ｔｒｔ トリチル
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＥＡ トリメチルアミン
ＴＩＳ トリエチルシラン
ｔ、ｓ、ｑｕｉｎ、ｂｒ、ｍ、ｄ（三重項、一重項、五重項、ブロード、多重項）
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィー

【0427】

合成：

【0428】

【表20-1】

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【0429】

【表20-2】

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【0430】

ＨＰＬＣ−分析方法Ｆ
− カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００ Ｃ１８（１００×４．６分）、３μｍ；Ｐａｒｔ ｎ°：１８６００３６１２
− 溶離液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ／溶離液Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ
− 流れ：１．０ｍｌ／分
− 温度：４０℃
− 勾配：

【0431】

【表21】

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【0432】

ＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ−分析方法Ｇ
− Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標） ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ；Ｐａｒｔ ｎ°：１８６００２３５０
− 溶離液Ａ：水中０．０５％ＦＡ＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム；溶離液Ｂ：ＡＣＮ中０．０４％ＦＡ
− 流れ：１．０ｍｌ／分
− 温度：５０℃
− 勾配：４．４分で２〜９８％

【0433】

方法Ｈ：ＬＣ−ＭＳ法
− ＨＰＬＣ：移動相Ａ：２％ＨＦＩＰ＋０．１％ＴＥＡ；移動相Ｂ：メタノール；
− 勾配：０分間９５％のＡ、４分間：７５％のＡ、８分間１０％のＡ、８．１分間９５％のＡ、１０分間９５％のＡ；
− 流量：２５０μｌ／分；
− カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７ｕｍ、２．１×５０ｍｍ（ｗａｔｅｒｓ）；
− カラム温度：７５℃
− ＭＳ：ＱＴＯＦ（ｗａｔｅｒｓ）ネガティブモード；
− ＥＳＩ：２．９ｋｖ；昇温キャピラリー３５０℃；スプレーガス：６００ｍｌ／分；電源温度：１５０℃

【0434】

方法Ｉ：ＬＣ−ＭＳ法：
− 移動相Ａ：水＋０．１％ギ酸
− 移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸
− 勾配：０分間９８％のＡ、０．０６分間９８％のＡ、１．７６分間２％のＡ、２．０６分間２％のＡ、２．１６分間９８％；流量：１ｍｌ／分；
− カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ；
− カラム温度：５０℃
− 検出器：ＵＶ／Ｖｉｓ／ＣＡＤ（荷電したエアロゾル検出器）

【0435】

ＵＰＬＣ ＨＲＭＳ方法Ｊ：
− カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００ Ｃ４ １．７μｍ、２．１×５０ｍｍ
− 溶離液Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）
− 溶離液Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）
− 流れ：０．５ｍＬ／分
− 温度：４０℃
− 勾配：２０％で０．５分保持、１０分で８０％ＡＣＮまでの勾配

【0436】

方法Ｋ：
− カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４カラム、３００オングストローム、３．５ｕｍ、４．６×１００ｍｍ
− 移動相：Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ）Ｂ：ＡＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）
− 流れ：２ｍＬ／分
− 温度：４０℃
− 勾配：１分間２５％のＢを保持、１０分に２５〜６０％のＡＣＮの勾配、１０．５０分に９５％のＢまでの勾配および２分間の保持、次いで２５％で２分間の平衡化。通算稼働時間は１５分である。
− 質量分析計：Ｗａｔｅｒｓ ＺＱ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ
− ＵＰＬＣ：カラム：ＢＥＨ Ｃ４、３００オングストローム、１．７ｕｍ、２．１×５０ｍｍ

【0437】

方法Ｌ：
− カラム：Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ
− 移動相：Ａ：水（０．１％ギ酸）Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ギ酸）
− 流れ：１ｍＬ／分
− 温度：５０℃
− 勾配：０分間３％のＢ；２分で３〜８０％のＢ；２．１分間１０％のＢ；２．８分間９５％のＢ；２．９分間３％のＢ
− 質量分析計：Ｑｔｏｆ ＥＳＩ 走査範囲１００〜１９００；Ｍａｓｓ ＬｙｎｘソフトウェアパッケージのＭａｘ Ｅｎｔ １によりデコンボリューションした
− ＵＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ

【0438】

【表22-1】

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【0439】

【表22-2】

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【0440】

【表22-3】

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【0441】

分析方法Ｓ：
− Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、３．５μＭ、３．０×３．０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水＋５ｍＭの水酸化アンモニウム Ｂ：ＡＣＮ
− 流量：２ｍＬ／分
− 勾配：０．０分間２％のＢ；１．７０分で２％〜９５％のＢ；２．００分間９５％のＢ；２．１０分間５％のＢ；
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ
− ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ
− 温度：４０Ｃ

【0442】

分析方法Ｔ：

【0443】

【表23】

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【0444】

中間体１：ベンジル１１−ブロモウンデカノエート

【0445】

【化35】

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１１−ブロモウンデカン酸（４ｇ、１５．０８ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（１．８７５ｍＬ、１８．１０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（９２ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２中にて、室温でＤＣＭに溶解させた。ＥＤＣ−ＨＣｌ（４．３４ｇ、２２．６３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を１７時間撹拌した。反応液を濃縮し、続いてＥｔ_２Ｏ（１５０ｍＬ）で希釈した。混合物を水（３０ｍＬ）で抽出し、水性相をＥｔ_２Ｏ（１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をフラッシュカラム（シリカ１２０ｇ、０〜１０％のＥｔ_２Ｏ／石油エーテル）で精製して、中間体１を無色の液体（６．７５ｇ、定量的）として得た：ＬＣＭＳ法 方法Ａ Ｒｔ＝１．７９分、Ｍ＋Ｈ ３５５．２；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.18 - 1.36 (m, 10 H) 1.37 - 1.47 (m, 2 H) 1.64 (五重線, J=7.33 Hz, 2 H) 1.85 (dt, J=14.56, 7.06 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 3.40 (t, J=6.88 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 5 H).

【0446】

中間体２：トリベンジルウンデカン−１，１，１１−トリカルボキシレート

【0447】

【化36】

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ＮａＨ（１１３ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中にて、０℃で、ＤＭＦ（６ｍＬ）に懸濁させた。マロン酸ジベンジル（０．７０４ｍＬ、２．８２ｍｍｏｌ）を、撹拌中の懸濁液に３０分かけてゆっくり加えた。ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた中間体１（９０３ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ）を加え、反応液を０℃で２．７５時間撹拌させた後、室温に温め、終夜撹拌した。反応物をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム（シリカ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）で精製して、７０％の純度の無色の油状物（７７０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ、３４％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．４１分、Ｍ＋Ｈ ５５９．６。

【0448】

中間体３：トリベンジルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0449】

【化37】

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ＤＭＦ（２ｍＬ）中ＮａＨ（６６．１ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で、Ｎ２中にて、ＤＭＦ（４ｍＬ）中中間体２（７７０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を加えた。３５分後に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中１−ブロモウンデカン（０．３３８ｍＬ、１．５２ｍｍｏｌ）の溶液を反応液に加え、これを２５分間撹拌した後に室温に温めた。反応液を２日間撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、１０％ＬｉＣｌ（２５ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残渣のフラッシュカラム（シリカ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）による精製によって、中間体３を無色の油状物（５９０ｍｇ、０．８２７ｍｍｏｌ、３３％）として得た：ＬＣＭＳ法 方法Ｂ Ｒｔ＝１．８９分、Ｍ＋Ｎａ ７３５．５；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.87 - 0.95 (m, 3 H) 1.07 (br. s., 4 H) 1.14 - 1.36 (m, 28 H) 1.66 (五重線, J=7.43 Hz, 2 H) 1.85 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H) 7.27 (d, J=2.32 Hz, 1 H) 7.28 - 7.43 (m, 14 H).

【0450】

中間体４：ドコサン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0451】

【化38】

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ＴＨＦ（１２ｍＬ）に溶解させた中間体３（５９０ｍｇ、０．８２７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（８ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄの懸濁液と合わせた。懸濁液を撹拌し、バルーンにより水素雰囲気下に置いた。１時間後、反応液をメンブレンフィルターに通し、固体をＥｔＯＡｃですすいだ。濾液を蒸発させ、表題化合物を無色の油状物（３５３ｍｇ、０．７９８ｍｍｏｌ、９６％）として得た：ＬＣＭＳ法 方法Ｂ Ｒｔ＝１．１６分、Ｍ＋Ｈ ４４３．５；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.77 - 0.84 (m, 3 H) 1.06 - 1.33 (m, 32 H) 1.59 (五重線, J=7.18 Hz, 2 H) 1.83 - 1.92 (m, 4 H) 2.32 (t, J=7.03 Hz, 2 H).

【0452】

中間体５：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−ウンデシルトリデカン二酸

【0453】

【化39】

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ＤＣＭ（１．５７ｍＬ）中ＤＣＣ（１２６ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ_２中にて、ＤＣＭ（５ｍＬ）およびＴＨＦ（５ｍＬ）中中間体４およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に加えた。３．５時間後、溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ２−エチル−ピリジン、２０×１５０ｍｍ、２０〜３０％のＭｅＯＨ／ＣＯ_２）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（１３８ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ、５０％）として得た：ＬＣＭＳ法 Ｂ Ｒｔ＝１．２１分、Ｍ＋Ｈ ５４０．５；¹H NMR (600 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 0.91 (t, J=7.20 Hz, 3 H) 1.22 - 1.42 (m, 34 H) 1.57 (五重線, J=7.34 Hz, 2 H) 1.93 - 1.96 (m, 2 H) 2.28 (t, J=7.47 Hz, 2 H) 2.79 (br. d, J=6.30 Hz, 4 H).

【0454】

中間体６および６Ａ：２−（アジド−ＰＥＧ２３−カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸構築物（６）および１２−（アジド−ＰＥＧ２３−カルバモイル）トリコサノン酸構築物（６Ａ）

【0455】

【化40】

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中間体５（３６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびアジド−ｄＰＥＧ２３−ＮＨ_２（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：７３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）中で合わせ、シェーカープレート上で１５分間混合した後、ＤＩＰＥＡ（１７μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液をシェーカープレート上に終夜放置した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体６（３９ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、３８％）および中間体６ａ（２０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、２０％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．１１分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７６３．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.10 - 1.19 (m, 2 H) 1.20 - 1.29 (m, 23 H) 1.32 (br. s., 7 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.69 - 1.79 (m, 2 H) 1.96 - 2.10 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.15 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.57 (m, 2 H) 3.58 - 3.62 (m, 2 H) 3.62 - 3.73 (m, 90 H) 7.46 (br. s., 1 H);
ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．２３分、［Ｍ＋２］^＋２ ７４０．９；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.83 - 0.96 (m, 3 H) 1.27 (br. s., 25 H) 1.29 - 1.37 (m, 7 H) 1.37 - 1.46 (m, 2 H) 1.53 - 1.73 (m, 4 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.44 - 3.52 (m, 2 H) 3.55 - 3.60 (m, 2 H) 3.60 - 3.74 (m, 90 H) 6.19 - 6.30 (m, 1 H).

【0456】

あるいは、構築物６Ａは、以下の手順に従って得られる：ＴＨＦ（１ｍＬ）中中間体５（４８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液を、アジド−ＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ カタログ番号１０５２５）（４６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を入れたバイアルに加えた。反応液を２０分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６３ｍｍｏｌ）を加え、次いで終夜維持した。アジド−ＰＥＧ２３−アミン（２３ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５μＬ、０．０２９ｍｍｏｌ）を加え、反応液をもう１日撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、１０〜３０％のＡＣＮ／５ｍＭのＮＨ４ＯＨ）によって精製した。画分の凍結乾燥により、生成物の混合物が得られた。材料を、ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体６Ａ（３０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、４８％）を得た：ＬＣＭＳ法 Ｂ Ｒｔ＝０．８１分、［Ｍ＋Ｈ＋Ｈ_３Ｏ］^＋２ ７６４．５；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3)δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62 (m, 6 H) 2.14 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H) 3.37 - 3.43 (m, 2 H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1 H).

【0457】

中間体７：（（（１１−ブロモウンデシル）オキシ）メタントリイル）トリベンゼン

【0458】

【化41】

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トリチルクロリド（２．４９ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）、１１−ブロモウンデカン−１−オール（２．００ｇ、７．９６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２中にて、ＤＣＭ（１６ｍＬ）に溶解させた。撹拌しながら、ＤＩＰＥＡ（１．３９ｍＬ、７．９６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を７日間維持した。反応液を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）の間に分配した。有機相を水（２０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。濃縮物を、フラッシュカラム（シリカ １２０ｇ、０〜６％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、中間体７（２．５０ｇ、５．０７ｍｍｏｌ、６４％）を無色の油状物として得た：1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.19 - 1.49 (m, 14 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.79 (dt, J=14.50, 7.00 Hz, 1 H) 1.87 (dt, J=14.55, 7.03 Hz, 1 H) 3.07 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.43 (t, J=6.85 Hz, 1 H) 3.55 (t, J=6.79 Hz, 1 H) 7.18 - 7.36 (m, 10 H) 7.42 - 7.52 (m, 5 H).

【0459】

中間体８：ジベンジル２−（１１−（トリチルオキシ）ウンデシル）マロネート

【0460】

【化42】

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ＮａＨ（１１３ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を、０℃で、Ｎ２中にて、ＤＭＦ（６ｍＬ）に懸濁させた。マロン酸ジベンジルを、撹拌した懸濁液にゆっくり加えた。３０分後、ＤＭＦ（３ｍＬ）中中間体７（１．２６ｇ、２．５４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。撹拌の１５分後、得られた混合物を室温に温めた。３日後、反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（４０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム（シリカ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（８１５ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、４１％）として得た：ＨＰＬＣ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．６８分；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.16 - 1.40 (m, 16 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.94 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.45 (t, J=7.52 Hz, 1 H) 5.16 (s, 4 H) 7.21 - 7.28 (m, 3 H) 7.28 - 7.39 (m, 16 H) 7.42 - 7.51 (m, 6 H).

【0461】

中間体９：トリベンジル２２−（トリチルオキシ）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0462】

【化43】

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ＤＭＦ（２ｍＬ）中中間体８（８１５ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ_２中にて、０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ＮａＨ（５６ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の懸濁液を加えた。混合物を１時間撹拌した。ＤＭＦ（２ｍＬ）中ベンジル１１−ブロモウンデカン酸（４５７ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を反応液に加えた。添加の２０分後に、反応液を室温に温め、終夜撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２５ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出し、有機物を合わせた。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ４０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（７８０ｍｇ、０．８０３ｍｍｏｌ、６９％）として得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.99 - 1.14 (m, 4 H) 1.15 - 1.41 (m, 26 H) 1.58 - 1.71 (m, 4 H) 1.82 - 1.96 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H) 7.28 (s, 24 H) 7.42 - 7.52 (m, 6 H).

【0463】

中間体１０：２２−（トリチルオキシ）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0464】

【化44】

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ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄ（１１ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中中間体９（２００ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。撹拌した懸濁液を、バルーンにより水素中に置いた。２．２５時間後、反応液をメンブレンフィルターに通し、固体をＥｔＯＡｃですすいだ。濾液を蒸発させ、中間体１０（１５０ｍｇ、定量的）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.04 - 1.33 (m, 30 H) 1.45 - 1.62 (m, 4 H) 1.76 - 1.91 (m, 4 H) 2.21 - 2.36 (m, 2 H) 2.97 (t, J=6.60 Hz, 2 H) 7.06 - 7.18 (m, 4 H) 7.19 - 7.24 (m, 5 H) 7.33 - 7.50 (m, 6 H).

【0465】

中間体１１：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（１１−トリチルオキシ）ウンデシル）トリデカン二酸（１１）。

【0466】

【化45】

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中間体１０（１５０ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍＬ）中で合わせた。ＤＣＭ（０．６１ｍＬ）に溶解させたＤＣＣ（４９ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で７時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ；６５〜９５％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）により、続いてＳＦＣ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ２−エチルピリジンカラム ２０×１００ｍｍ、２５〜３５％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製して、中間体１１（３４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、２０％）を無色の油状物として得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．４７分、Ｍ−ＣＯ_２Ｈ ７５２．７；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.13 - 1.42 (m, 30 H) 1.56 - 1.73 (m, 4 H) 1.94 - 2.14 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.83 (br. s., 4 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 7.15 - 7.28 (m, 3 H) 7.29 - 7.36 (m, 6 H) 7.41 - 7.50 (m, 6 H).

【0467】

中間体１２：２−（（アジド−ＰＥＧ２３）カルバモイル）−２−（１１−ヒドロキシウンデシル）トリデカン二酸構築物

【0468】

【化46】

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ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）４２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２中にて、中間体１１（３４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）と合わせた。反応液をシェーカープレート上に置き、２０分間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（７．４４μＬ、０．０４３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（４μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜維持した。溶媒を蒸発させ、残渣をＤＣＭ（３ｍＬ）およびＴＦＡ（０．５ｍＬ）中に溶かした。溶液を１時間撹拌し、この時点で、溶媒を取り除いた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体１２（４ｍｇ、１．８μｍｏｌ、４．２％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．７５分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７７１．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.05 - 1.39 (m, 30 H) 1.52 - 1.82 (m, 6 H) 1.97 - 2.09 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.63 (m, 6 H) 3.63 - 3.75 (m, 90 H) 4.36 (t, J=6.72 Hz, 1 H) 7.49 - 7.65 (m, 1 H).

【0469】

中間体１３：１３−（ベンジルオキシ）−１２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１３−オキソトリデカン酸

【0470】

【化47】

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ＤＭＦ（３ｍＬ）中マロン酸ジベンジル（０．８８ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２中にて、０℃で、ＮａＨ（２７４ｍｇ、６．８６ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくり加えた。混合物を１．５時間撹拌した後、室温に温めた。ＤＭＦ（３ｍＬ）中１１−ブロモウンデカン酸（９３３ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）を加え、反応を終夜行わせた。反応液を３時間で８０℃まで加熱した後、冷却した。反応液をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）およびＥｔ_２Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、１ＭのＨＣｌ（２５ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（Ｃ１８ ５０ｇ ３０〜１００％のＡＣＮ／水＋０．１ＴＦＡ）によって精製して、中間体１３（３１５ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ、１９％）を白色の粉末として得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．０５分、Ｍ＋Ｈ ４６９．５。

【0471】

中間体１４：２３−（ベンジルオキシ）−１２，１２−ビス（（ベンジルオキシ）カルボニル）−２３−オキソトリコサン酸

【0472】

【化48】

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ＮａＨ（５４ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を、０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（１ｍＬ）に懸濁した。混合物に、ＤＭＦ（３ｍＬ）中中間体１３（３１５ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）を液滴方式で加えた。反応液を１時間撹拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中中間体１（２３９ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を、０℃で、さらに４５分間維持した後、室温に温めた。反応液を終夜撹拌した。反応液を１：１のＥｔ_２ＯとＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で希釈し、１ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）で抽出した。水性相を１：１のＥｔ_２ＯとＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。得られた残渣のＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋５ｍＭのＮＨ４ＯＨ）による精製により、表題化合物（１３２ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、２６％）を得た：ＬＣＭＳ法 Ｂ；Ｒｔ＝１．５３分、Ｍ−Ｈ ７４１．８。

【0473】

中間体１５：１，１１，１１−トリベンジル２１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ヘニコサン−１，１１，１１，２１−テトラカルボキシレート

【0474】

【化49】

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ＤＣＭ（１ｍＬ）中ＤＣＣ（４４ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中中間体１４（１３２ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２０ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応液を、シェーカープレート上で、１７時間撹拌した。反応液を濾過し、固体をＤＣＭですすいだ。濾液を濃縮し、フラッシュカラム（シリカ １２ｇ、０〜４０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、中間体１５（１０７ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、７２％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．５３分、Ｍ＋Ｎａ ８６２．８。

【0475】

中間体１６：２２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２２−オキソドコサン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0476】

【化50】

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ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中中間体１５（１０７ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄの懸濁液を加えた。混合物を、水素雰囲気下に１．５時間置いた。反応液をメンブレンフィルターに通し、固体をＤＣＭおよびＴＨＦで洗浄した。濾液を蒸発させて、表題化合物を含有する無色の油状物（９５ｍｇ、定量的）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．６５分、Ｍ＋Ｈ ５７０．５。

【0477】

中間体１７：２−（１１−（アジド−ＰＥＧ２３−アミノ）−１１−オキソウンデシル）トリデカン二酸構築物

【0478】

【化51】

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ＴＨＦ（１ｍＬ）中中間体１６（４８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液を、アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：４６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を入れたバイアルに加えた。反応液を２０分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６３ｍｍｏｌ）を加え、次いで、終夜維持した。アジド−ＰＥＧ２３−アミン（２３ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５μＬ、０．０２９ｍｍｏｌ）を加え、反応液をもう１日撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、１０〜３０％のＡＣＮ／５ｍＭのＮＨ４ＯＨ）によって精製した。画分の凍結乾燥により、生成物の混合物が得られた。材料を、ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題の中間体１７（３０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、４８％）を得た：ＬＣＭＳ ＳＱ４ Ｒｔ＝０．８１分、［Ｍ＋Ｈ＋Ｈ_３Ｏ］^＋２ ７６４．５；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62 (m, 6 H) 2.14 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H) 3.37 - 3.43 (m, 2 H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1 H).

【0479】

中間体１８：テトラベンジルヘニコサン−１，１１，１１，２１−テトラカルボキシレート

【0480】

【化52】

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ＤＭＦ（２ｍＬ）中ＮａＨ（４８ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（２ｍＬ）中中間体２（３３７ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を１５分間撹拌した後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中中間体１（４２９ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃で２０分間撹拌した後、室温に温めた。反応液を、室温で、撹拌しながら、３日間維持した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ２４ｇ、０〜１５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物（３１５ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ、６３％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．７０分、Ｍ＋Ｎａ ８５５．８；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.95 - 1.13 (m, 4 H) 1.13 - 1.40 (m, 24 H) 1.59 - 1.72 (m, 4 H) 1.82 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 4 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 4 H) 7.14 - 7.44 (m, 20 H).

【0481】

中間体１９：ヘニコサン−１，１１，１１，２１−テトラカルボン酸

【0482】

【化53】

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ＴＨＦ（４ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄ（２０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ＴＨＦ（６ｍＬ）中中間体１８（３１５ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ）の溶液に加え、反応液を水素雰囲気下に２時間置いた。メンブレンフィルターを使用して固体を取り出し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を蒸発させて、中間体１９（１７９ｍｇ、定量的）を白色の固体として得た：ＬＣＭＳ 方法Ａ Ｒｔ＝１．２４分、Ｍ＋Ｈ ４７３．４；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.99 - 1.15 (m, 4 H) 1.24 (br. s., 24 H) 1.48 (五重線, J=6.94 Hz, 4 H) 1.62 - 1.76 (m, 4 H) 2.18 (t, J=7.34 Hz, 4 H) 12.23 (br. s, 4 H).

【0483】

中間体２０：１１−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ヘニコサン−１，１１，２１−トリカルボン酸

【0484】

【化54】

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Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２０ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）および中間体１９（９０ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３ｍＬ）およびＴＨＦ（０．３ｍＬ）に溶解させた。ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中ＤＣＣ（３９ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ；３５〜６０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物を白色の粉末（２１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ、１９％）として得た：ＬＣＭＳ（方法Ｃ Ｒｔ＝１．０１分、Ｍ＋Ｈ ５７０．３。

【0485】

中間体２１および２１ａ：１１−（（アジド−ＰＥＧ２３）カルバモイル）ヘニコサン−１，１１，２１−トリカルボン酸（２１）および１２−（（アジド−ＰＥＧ２３）カルバモイル）トリコサン二酸（２１ａ）

【0486】

【化55】

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アジド−ＰＥＧ２３−アミン（４１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）および中間体２０（２１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）中で合わせ、１０分間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（９．６６μＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、３５〜６０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体２１（２２ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、３８％）および２１ａ（４ｍｇ、２．６μｍｏｌ、７％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．６９分、Ｍ＋Ｈ １５５５．３；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.27 (br. s., 19 H) 1.29 - 1.41 (m, 9 H) 1.65 (五重線, J=7.12 Hz, 4 H) 1.78 (td, J=12.13, 4.22 Hz, 2 H) 1.95 - 2.08 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 4 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.54 (q, J=5.05 Hz, 2 H) 3.58 - 3.77 (m, 92 H) 7.60 (t, J=4.95 Hz, 1 H);
ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．７８分、Ｍ−Ｈ １５０９．３；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.18 (br. s., 19 H) 1.21 - 1.38 (m, 11 H) 1.43 - 1.63 (m, 6 H) 1.91 - 2.04 (m, 1 H) 2.26 (t, J=7.15 Hz, 4 H) 3.31 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.40 (q, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.50 (m, 2 H) 3.51 - 3.69 (m, 90 H) 6.23 (t, J=5.01 Hz, 1 H).

【0487】

中間体２２：ジベンジル２−ウンデシルマロネート

【0488】

【化56】

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ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中マロン酸ジベンジル（０．８８ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中にて、０℃で、ＤＭＦ（６ｍＬ）中ＮａＨ（１５５ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下添加した。混合物を３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中１−ブロモウンデカン（０．７８５ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）を反応液に加えた。反応液を室温に温め、５日間撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物（９７４ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ、６３％）を無色の油状物として得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．５５分、Ｍ＋Ｈ ４３９．５。

【0489】

中間体２３：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−ウンデシルトリデカン酸

【0490】

【化57】

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ＤＭＦ（１ｍＬ）中ジベンジル２−ウンデシルマロネート（中間体２２：４００ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）を、Ｎ２中にて、０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ＮａＨ（４４ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下添加した。混合物を４５分間撹拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中１−ブロモウンデカン（０．２８５ｍＬ、１．２８ｍｍｏｌ）を反応液に加えた。反応液を室温に温め、１日撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ４０ｇ、０〜５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、無色の油状物（４１２ｍｇ）を得た。油状物をＴＨＦ／ＭｅＯＨに溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを備えたＴｈａｌｅｓ Ｎａｎｏ Ｈ−Ｃｕｂｅ（１ｍＬ／分、２バール Ｈ２、２２Ｃ）を通した。流出物を集め、蒸発させて、ワックス状の固体（２７２ｍｇ）を得た。ワックス状の固体を３：１のＤＣＭ／ＴＨＦに溶解させ、油状物に濃縮した。油状物を、Ｎ_２中にて、ＤＣＭ（６ｍＬ）に再度溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６８ｍｇ）、続いてＤＣＭ（３ｍＬ）中ＤＣＣ（１３６ｍｇ）を加えた。反応物を終日撹拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム（Ｃ１８ １２ｇ、２５〜１００％のＡＣＮ／水＋０．１％ギ酸）によって精製した。得られた材料を、超臨界流体クロマトグラフィー（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ２−エチルピリジン ２０×１５０ｍｍ；５〜１５％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によってさらに精製して、中間体２３（３７ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、８％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．６７分、Ｍ＋ＮＨ_４ ５２７．６；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.80 - 0.94 (m, 6 H) 1.18 - 1.42 (m, 36 H) 1.97 - 2.14 (m, 4 H) 2.87 (br. s., 4 H).

【0491】

中間体２４：２−（（アジド−ＰＥＧ２３）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン酸

【0492】

【化58】

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ＴＨＦ（１ｍＬ）中中間体２３（３７ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の溶液を、アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：８０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を入れたバイアルに加えた。溶液をシェーカープレート上で撹拌し、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を終夜撹拌した後、ＤＩＰＥＡの追加分（１２μＬ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加え、反応を終夜行わせた。溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｍｉｎｏ ２１×１５０ｍｍ；２０〜３０％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製して、表題化合物（４５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、４１％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．５０分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７４８．１；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.85 Hz, 6 H) 1.09 - 1.38 (m, 30 H) 1.58 (br. s., 12 H) 1.64 - 1.76 (m, 2 H) 1.98 - 2.16 (m, 2 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.64 (m, 5 H) 3.64 - 3.91 (m, 83 H).

【0493】

中間体２５：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−ウンデシルマロネート

【0494】

【化59】

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ＤＭＦ（２ｍＬ）中ジ−ｔｅｒｔ−ブチルマロネート（１．０ｇ、４．６２ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２中にて、０℃で、ＤＭＦ（５ｍＬ）中ＮａＨ（２１３ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。反応液を３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中１−ブロモウンデカンを加えた。加えた後、反応液を室温に温め、２日間撹拌した。反応液をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈し、水（２５ｍＬ）で抽出した。水性相をＥｔ_２Ｏ（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。濃縮物を、フラッシュカラム（シリカ １２０ｇ、０〜４０％のＥｔ_２Ｏ／石油エーテル）によって精製して、中間体２５（０．９９８ｇ、２．６９ｍｍｏｌ、５８％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．６４分、Ｍ＋Ｎａ ３９３．５；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.85 - 0.94 (m, 3 H) 1.24 - 1.36 (m, 18 H) 1.41 - 1.52 (m, 18 H) 1.74 - 1.86 (m, 2 H) 3.13 (t, J=7.58 Hz, 1 H).

【0495】

中間体２６：１−ベンジル１１，１１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0496】

【化60】

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表題化合物を、出発材料として中間体２５を使用して、中間体９と同様の方法で合成し、無色の油状物（９８０ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、６６％）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.89 (t, J=6.91 Hz, 3 H) 1.06 - 1.20 (m, 4 H) 1.20 - 1.35 (m, 28 H) 1.45 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1.83 (m, 4 H) 2.36 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.12 (s, 2 H) 7.30 - 7.45 (m, 5 H).

【0497】

中間体２７：１２，１２−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）トリコサン酸

【0498】

【化61】

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中間体２６を使用して、表題化合物（４７２ｍｇ、０．８５１ｍｍｏｌ、１００％）を、中間体１９と同様の方法で合成した：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．７６分、Ｍ−Ｈ ５５３．６；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.95 (m, 3 H) 1.07 - 1.21 (m, 4 H) 1.21 - 1.40 (m, 28 H) 1.46 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1.84 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.46 Hz, 2 H).

【0499】

中間体２８：１１，１１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0500】

【化62】

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中間体２７（２００ｍｇ、０．３６０ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４２ｍｇ、０．３６０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解させた。ＤＣＭ（１．６ｍＬ）中ＤＣＣ（８９ｍｇ、０．４３３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応液を４．５時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム（シリカ ２４ｇ、０〜４０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（７０ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、３０％）として得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．７４分、Ｍ＋Ｎａ ６７４．７。

【0501】

中間体２９および２９Ａ：２−（１１−（（アジド−ＰＥＧ２３）−アミノ）−１１−オキソウンデシル）−２−ウンデシルマロン酸（２９）および１３−（（アジド−ＰＥＧ２３）−アミノ）−１３−オキソ−２−ウンデシルトリデカン酸（２９Ａ）

【0502】

【化63】

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ＴＨＦ（１ｍＬ）中中間体２８（３５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液を、アジド−ＰＥＧ２３−アミン（５９ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を入れたバイアルに加えた。ＤＩＰＥＡ（１４μＬ、０．０８１ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＤＣＭ（１ｍＬ）およびＴＦＡ（０．２ｍＬ）に再度溶解させた。反応液を１．２５時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣を、ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ Ｃ１８、５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、得られた材料をＤＣＭ（４ｍＬ）およびＴＦＡ（２ｍＬ）中に再度溶解させ、１．５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を、ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ Ｃ１８、５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体２９（２８ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、２９％）および中間体２９Ａ（１ｍｇ、０．６μｍｏｌ、１％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．０８分、［Ｍ＋Ｈ＋Ｈ_３Ｏ］^＋２ ７７１．５；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.72 Hz, 3 H) 1.26 (br. s., 24 H) 1.32 - 1.41 (m, 8 H) 1.62 (五重線, J=7.64 Hz, 2 H) 1.88 - 2.01 (m, 4 H) 2.31 (t, J=7.70 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.46 - 3.56 (m, 3 H) 3.57 - 3.90 (m, 91 H);
ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝１．２９分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７４１．１。

【0503】

中間体３０：２２−（（アジド−ＰＥＧ２３）アミノ）−２２−オキソドコサン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0504】

【化64】

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ＴＨＦ（１ｍＬ）中中間体１６（５８ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）の溶液を、アジド−ＰＥＧ２３−アミン（７０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を入れたバイアルに加えた。ＤＩＰＥＡ（１７μＬ、０．０９５ｍｍｏｌ）を加え、反応液をシェーカープレート上で終夜撹拌した。反応液を濃縮し、ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、３５〜６０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、中間体３０（５７ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、５７％）をワックス状の白色の固体として得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．６２分、Ｍ＋Ｈ １５５５．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.28 (br. s., 18 H) 1.30 - 1.40 (m, 10 H) 1.63 (m, J=7.10, 7.10, 7.10, 7.10, 7.10 Hz, 4 H) 1.88 - 2.02 (m, 4 H) 2.28 (t, J=8.10 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.40 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.50 (dt, J=9.20, 4.39 Hz, 2 H) 3.57 - 3.63 (m, 2 H) 3.63 - 3.73 (m, 90 H)

【0505】

中間体３１：１−ベンジル３−ｔｅｒｔ−ブチル２ウンデシルマロネート

【0506】

【化65】

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０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（８ｍＬ）中ＮａＨ（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ベンジルｔｅｒｔ−ブチルマロネート（１．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中１−ブロモウンデカンを加えた。さらに１時間撹拌した後、反応液を室温に温めた。反応液を終夜維持した。Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を反応液に分配して加えた。水性相をＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（Ｃ１８ １２ｇ、４０〜１００％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（１．１４ｇ、２．８２ｍｍｏｌ、７１％）として得た：ＬＣＭＳ方法Ａ Ｒｔ＝１．５８分、Ｍ＋Ｎａ ４２７．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.96 (m, 3 H) 1.28 (br. s, 12 H) 1.31 (m, J=3.90 Hz, 6 H) 1.41 (s, 9 H) 1.88 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.29 (t, J=7.58 Hz, 1 H) 5.19 (q, J=12.27 Hz, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 5 H).

【0507】

あるいは、ＤＭＦ中炭酸カリウム（２当量）の存在下で、１−ヨードウンデカン（１．２当量）を使用して、マロン酸ｔｅｒｔ−ブチルのアルキル化を実行させることができる。

【0508】

中間体３２：１，１１−ジベンジル１１−ｔｅｒｔ−ブチルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0509】

【化66】

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出発材料として中間体３１（６５０ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を使用して、表題化合物を、中間体９と同様の方法で合成し、無色の油状物（８２３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、７５％）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12 (m, J=6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.85 (t, J=8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H).

【0510】

中間体３３：１３−（ベンジルオキシ）−２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１３−オキソ−２−ウンデシルトリデカン酸

【0511】

【化67】

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ＤＣＭ（３ｍＬ）中中間体３２（２００ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．６ｍＬ）を加え、反応液を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ １２ｇ、０〜１５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ、９６％）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H) 1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44 (m, 10 H).

【0512】

中間体３４：１，１１−ジベンジル１１−（２，５−ジオキソシクロペンチル）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0513】

【化68】

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出発材料として中間体３３（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を使用して、表題化合物を、中間体１５と同様の方法で合成し、無色の油状物（１５３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、７５％）を得た：¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.89 - 2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H).

【0514】

中間体３５：

【0515】

【化69】

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ＴＨＦ（１．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中中間体３４（１４５ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）の溶液を、アミノ−ＰＥＧ２４−酸を入れたバイアルに加えた。ＤＩＰＥＡ（８８μＬ、０．５０４ｍｍｏｌ）を加え、反応液をシェーカープレート上で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＨＩＬＩＣ ２０×１５０ｍｍ、１５〜２５％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製して、中間体３５（１５１ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、４３％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ｄ Ｒｔ＝１．３０分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ８７６．４；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15 H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J=12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J=6.72, 2.32 Hz, 2 H) 3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J=5.26 Hz, 1 H).

【0516】

中間体３６：

【0517】

【化70】

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ＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中中間体３５（１５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に加えた。反応液を１．５時間撹拌した。さらなるＴＨＦ（０．５ｍＬ）中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）およびＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ １２、０〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、中間体３６（１５９ｍｇ、定量）を白色の固体として得た：ＬＣＭＳ方法Ｂ Ｒｔ＝１．５５分、［Ｍ＋Ｈ_３Ｏ＋Ｈ］^＋２ ９３３．９。

【0518】

中間体３７：

【0519】

【化71】

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ＴＨＦ（５ｍＬ）中中間体３６（１５９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１ｍＬ）中１０％の炭素担持Ｐｄ（４．６ｍｇ、４．３μｍｏｌ）の懸濁液を加えた。反応液を水素中に置き、４０分間撹拌した。さらに炭素担持Ｐｄ（７ｍｇ、６．５μｍｏｌ）を加え、水素中にてもう１時間撹拌した。反応液をメンブレンフィルターに通し、濾液を蒸発させた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％ ＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物（８３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、５４％）を得た：ＬＣＭＳ方法Ｂ Ｒｔ＝１．０３分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ８３５．２；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17 (br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J=4.46 Hz, 1 H)

【0520】

中間体３８：１１−ブロモウンデカ−１−イン

【0521】

【化72】

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ＤＣＭ（１０ｍＬ）中１０−ウンデシン−１−オール（２．２９ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ）および四臭化炭素（４．３４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ２中にて、０℃で、トリフェニルホスフィン（３．４３ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下添加した。添加が完了したら、反応液を室温に温めた。１．５時間後、反応液を、撹拌中のシクロヘキサン（７５ｍＬ）に注ぎ、沈殿を集めた。固体をシクロヘキサンで洗浄し、合わせた濾液を蒸発させた。残渣をフラッシュカラム（シリカ ８０ｇ、０〜１０％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）で精製して、表題化合物（１．７５ｇ、７．５７ｍｍｏｌ、６４％）を得た：1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.21 - 1.35 (m, 6 H) 1.35 - 1.48 (m, 4 H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.80 - 1.91 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.63 Hz, 1 H) 2.19 (td, J=7.09, 2.69 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=6.85 Hz, 2 H).

【0522】

中間体３９：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ウンデカ−１０−イン−１−イル）マロネート

【0523】

【化73】

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マロン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８００ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を、０℃で、Ｎ_２中にて、ＤＭＦ（９ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨ（１４８ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃で３０分撹拌し、中間体３８（７７０ｍｇ、３．３３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下添加し、黄色の溶液を得た。反応液を０℃で２時間撹拌し、次いで室温に温め、１６時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に溶かし、Ｈ_２Ｏ（２５ｍＬ）で洗浄した。水性層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過して、濃縮した。混合物を、フラッシュカラム（１２ｇのシリカカートリッジ、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン）により２回精製して、画分を濃縮し、１６２．１ｍｇの所望の生成物を無色の油状物（１２％）として得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃、溶媒名Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶媒名Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、２．２０分かけて９８％のＢ）：Ｒ_ｔ：１．３７分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］実測値：３６６．０、計算値：３６６．５３５。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.29 (s, 10 H) 1.47 (s, 18 H) 1.52 (dd, J=14.78, 7.20 Hz, 3 H) 1.48 (d, J=1.26 Hz, 1 H) 1.75 - 1.83 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td, J=7.14, 2.65 Hz, 2 H) 3.11 (t, J=7.58 Hz, 1 H).

【0524】

中間体４０：１１，１１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル１−エチルドコサ−２１−イン−１，１１，１１−トリカルボキシレート

【0525】

【化74】

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中間体３９（１６２．１ｍｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）を、０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨ（２１．２３ｍｇ、０．５３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃で１５分間撹拌し、１１−ブロモウンデカン酸エチル（１４３ｍｇ、０．４８６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下添加した。反応液を室温に温め、１６時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）で１回洗浄した。水性層をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で１回抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、透明の黄色の油状物を得た。サンプルを１ｍＬのＤＣＭに溶解させ、フラッシュカラム（１２ｇ シリカカラム、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１５分）によって精製した。画分を合わせ、濃縮して、９０．１ｍｇの所望の生成物（３５％）を得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.28 (br. s., 24 H) 1.45 (s, 18 H) 1.48 (s, 3 H) 1.53 (d, J=7.58 Hz, 3 H) 1.51 (s, 1 H) 1.64 (br. s., 1 H) 1.61 (d, J=7.33 Hz, 1 H) 1.77 (d, J=16.93 Hz, 2 H) 1.74 - 1.80 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td, J=7.07, 2.53 Hz, 2 H) 2.29 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 4.13 (q, J=7.24 Hz, 2 H).

【0526】

中間体４１：１２，１２−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）トリコス−２２−イン酸

【0527】

【化75】

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^ｔＢｕＯＨ（１ｍＬ）中中間体４０（２１．７ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の溶液に、３０℃で、Ｎ_２中にて、^ｔＢｕＯＨ（２ｍＬ）中ＫＯｔＢｕ（１１４ｍｇ、１．０１２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＫＭｎＯ_４、還流）によってモニターした。３時間後に、出発材料を消費し、反応混合物を１ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）で失活させ、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で２回抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、透明無色の油状物（１８ｍｇ、８７％）とした。材料を、さらに精製することなく次のステップに持ち越した。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.27 (br. s., 22 H) 1.44 (br. s., 18 H) 1.48 (s, 3 H) 1.52 (s, 3 H) 1.62 (br. s., 2 H) 1.77 (br. s., 4 H) 1.94 (br. s., 1 H) 2.18 (s, 2 H) 2.35 (s, 2 H).

【0528】

中間体４２：ドコサ−２１−イン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0529】

【化76】

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ＴＦＡ（２ｍＬ）を中間体４１（１２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）に加え、反応液を室温で１時間撹拌した。混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、２倍に濃縮し、褐色の油状物を得た。材料をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶かし、Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、褐色の油状物とした。未精製材料を１ｍＬのＭｅＯＨに溶解させ、ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、３．５分かけて４５〜７０％のＡＣＮ）によって精製した：Ｒ_ｔ＝３．４２分；ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］実測値：４６１．００、計算値：４６１．５９７。画分をプールし、凍結乾燥して、５．３ｍｇの表題化合物を５６％の収率で得た。

【0530】

中間体４３：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（ウンデカ−１０−イン−１−イル）トリデカン二酸

【0531】

【化77】

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ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中中間体４２（５．３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中ＤＣＣ（２．４９３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を、室温で、Ｎ_２中にて、４時間撹拌した。出発材料の変換が完了したことが、ＬＣＭＳによって観察された。混合物を濃縮し、さらに精製することなく次のステップに移行した。ＬＣＭＳ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０ｍｍ×３０ｍｍ、４０℃、酸性溶離液Ａ：水＋０．０５％のトリフルオロ酢酸、塩基性溶離液Ａ：水＋５ｍＭの水酸化アンモニウム、溶離液Ｂ：ＡＣＮ、２分かけて５〜９５％）：Ｒ_ｔ＝１．７２分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］実測値：５５８．０、計算値：５５８．６７。

【0532】

中間体４４：

【0533】

【化78】

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ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中中間体４３（３．２ｍｇ、５．９７μｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（２．０９μＬ、０．０１２ｍｍｏｌ）中アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、７．８８ｍｇ、７．１７μｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を室温で１６時間撹拌し、この時点で出発材料の変換がＬＣＭＳによって観察された。反応混合物を濃縮し、１ｍＬのＭｅＯＨに溶解させ、ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、５分で５５〜８０％のＡＣＮの勾配、Ｒ_ｔ＝１．９２分）によって精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、１．７ｍｇの表題化合物を１９％の収率で得た。ＬＣＭＳ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍ −５０℃、溶媒名Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶媒名Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、２．２０分かけて９８％のＢ）：Ｒ_ｔ＝１．８９分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ／２］実測値：７６０．０、計算値：７５９．５。

【0534】

中間体４５：ドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸

【0535】

【化79】

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１１−ブロモ−デカ−１−インの代わりに１１−ブロモ−デカ−１−エンを用いて、中間体３９〜４２の手順に従って、中間体４５を調製する。

【0536】

中間体４６：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（ウンデカ−１０−エン−１−イル）トリデカン二酸

【0537】

【化80】

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ＤＣＭ（２ｍＬ）中ＤＣＣ（１８７ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（７ｍＬ）およびＴＨＦ（０．７ｍＬ）中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９９ｍｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）およびドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸（中間体４５：４００ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応液を終夜撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ；５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物（１５５ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌ、３２％）を得た：ＬＣＭＳによる 方法Ｃ Ｒｔ＝１．５１分、Ｍ＋Ｈ ５３８．３；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.16 - 1.46 (m, 28 H) 1.60 - 1.87 (m, 3 H) 1.91 - 2.17 (m, 5 H) 2.38 (t, J=7.03 Hz, 2 H) 2.86 (br. s., 4 H) 3.68 (dd, J=11.25, 7.34 Hz, 1 H) 3.78 (dd, J=11.31, 5.20 Hz, 1 H) 3.99 - 4.10 (m, 1 H).

【0538】

中間体４７および４７Ａ：

【0539】

【化81】

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アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：１６４ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）および中間体４６（８０ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（３９μＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ；４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、化合物４７（９７ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、４１％）および４７Ａ（３２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１４％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｃ Ｒｔ＝１．３５分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７６１．９；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 1.05 - 1.18 (m, 3 H) 1.19 - 1.32 (m, 20 H) 1.36 (t, J=7.15 Hz, 1 H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.65 - 1.75 (m, 2 H) 2.01 - 2.06 (m, 2 H) 2.25 (t, J=7.46 Hz, 2 H) 3.33 - 3.39 (m, 2 H) 3.39 - 3.44 (m, 2 H) 3.50 - 3.67 (m, 98 H) 4.84 - 4.95 (m, 1 H) 4.95 - 5.06 (m, 1 H) 5.83 (ddt, J=17.07, 10.29, 6.68, 6.68 Hz, 1 H) 7.31 (t, J=5.44 Hz, 1 H);
ＬＣＭＳ 方法Ｃ Ｒｔ＝１．５０分、［Ｍ＋２Ｈ］^＋２ ７３９．９；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 1.16 - 1.42 (m, 30 H) 1.42 - 1.63 (m, 5 H) 2.00 - 2.07 (m, 2 H) 2.22 - 2.28 (m, 2 H) 2.40 - 2.52 (m, 2 H) 3.25 - 3.33 (m, 2 H) 3.33 - 3.42 (m, 2 H) 3.42 - 3.50 (m, 2 H) 3.50 - 3.68 (m, 88 H) 4.86 - 5.06 (m, 2 H) 5.83 (ddt, J=17.04, 10.26, 6.71, 6.71 Hz, 1 H) 6.40 - 6.74 (m, 1 H).

【0540】

中間体４８：２−ウンデシルマロン酸

【0541】

【化82】

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中間体２２（２９０ｍｇ、０．６６１ｍｍｏｌ）を使用して、表題化合物（１８５ｍｇ、定量的）を、中間体１９と同様の方法で合成した：ＬＣＭＳ 方法Ｂ ＬＣＭＳ Ｒｔ＝０．８２分、Ｍ−Ｈ ２５７．３。

【0542】

中間体４９：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）トリデカン酸

【0543】

【化83】

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ＤＣＣ（１２２ｍｇ、０．５９２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（６ｍＬ）およびＴＨＦ（０．５ｍＬ）中中間体４８（１７０ｍｇ、０．６５８ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６８ｍｇ、０．５９２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応液を１６時間撹拌した後、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中ＤＣＣ（３０ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）をさらに加えた。反応液をさらに２日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物を白色の粉末（４６ｍｇ、０．１２９ｍｇ、２０％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．９４分、Ｍ＋Ｈ ３５６．３；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.89 (t, J=7.00 Hz, 3 H) 1.20 - 1.40 (m, 16 H) 1.43 - 1.55 (m, 2 H) 1.99 - 2.14 (m, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 3.71 (t, J=7.46 Hz, 1 H).

【0544】

中間体５０および５０Ａ：

【0545】

【化84】

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表題化合物を、中間体４９（３０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）から、５０および５０Ａと同様の方法で合成し、中間体５０（１８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、１６％）および中間体５０Ａ（５ｍｇ、４μｍｏｌ、５％）を得た：ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．８５分、Ｍ＋Ｈ １３４０．３；¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.82 - 0.98 (m, 3 H) 1.20 - 1.36 (m, 16 H) 1.36 - 1.51 (m, 2 H) 1.83 - 2.02 (m, 1 H) 2.11 - 2.27 (m, 1 H) 2.33 (dd, J=11.80, 4.22 Hz, 1 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 3 H) 3.49 (d, J=5.01 Hz, 1 H) 3.56 - 3.79 (m, 92 H);
ＬＣＭＳ 方法Ｂ Ｒｔ＝０．９６分、Ｍ＋Ｈ １２９６．３。

【0546】

中間体５１〜５７：ＧＤＦ１５タンパク質の変異体。
大腸菌（E.coli）細胞中でのヒトＧＤＦ−１５タンパク質の発現
大腸菌（E.coli）株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれ５１〜５６の構築物および構築物ＭＡＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５で形質転換し、ｐＥＴ２６ｂベクターにクローニングした。形質転換した細胞を、ＯＤ６００が１．５に到達するまで、最初は３ｍｌ、次いで５０ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ）中で抗生物質選択下で増殖させた。予備培養物を使用して、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＮＨ４ＳＯ４ １．２ｇ／Ｌ、Ｈ２ＰＯ４ ０．０４１ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５２ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １２ｇ／Ｌ、酵母エキス ２４ｇ／Ｌ）で満たした２つの１Ｌ発酵槽に接種した。ｐＨが７．１を超えて上昇したときに、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の自動添加によって、培養物を誘導した。他の発酵パラメータは以下であった：温度＝３７℃；２ＮのＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４の添加によってｐＨ７．０＋／−０．２に調整された；撹拌機の速度のカスケードでｐＯ２＞３０％、空気流および酸素添加。誘導の５時間後、培養物を１０℃に冷却し、細胞を遠心分離によって回収した。

【0547】

ＧＤＦ１５変異体の精製およびリフォールディング
ａ）封入体
目的のタンパク質を発現する組換え大腸菌（coli）のペレットを、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１５０ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ／５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０、４℃に再懸濁させ（５％ｗ／ｖ）、ホモジナイズし、Ｆｒｅｎｃｈプレス（８００および８０バール）を２回通して溶解させた。封入体（ＩＢ）を、４℃にて１２，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによって単離した。

【0548】

ｂ）フォールディングされていない粗製タンパク質の精製
ＩＢを、６Ｍのグアニジン／１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭのＴｒｉｓ／２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール ｐＨ８．０中に可溶化し（５％ｗ／ｖ）、室温で２時間撹拌した。デブリを１２，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。可溶化したＩＢをＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗでさらに精製した（Ｈｉｓタグを有さない構築物は、高いヒスチジン含有量によりこの樹脂に同様に結合する）。６Ｍのグアニジン／１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭのＴｒｉｓ／５ｍＭのβ−メルカプトエタノール ｐＨ８．０でのベースライン洗浄後、結合した材料を、ｐＨ４．５に調整した同じ緩衝液で溶出させた。溶出液をｐＨ８．０に調整し、１００ｍＭのＤＴＴを加え、溶液を４℃で終夜撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、水中１０％の保存溶液）の添加によって、ｐＨを２に調整し、水中０．１％のＴＦＡで、溶液を１：１にさらに希釈した。粗製のタンパク質溶液を、５０分で０〜５０％のアセトニトリルの勾配を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｐｏｒｏｓ）によりさらに精製した。画分を含有するＧＤＦ−１５を、プールし、凍結乾燥させた。

【0549】

ｃ）タンパク質のフォールディング
方法１：凍結乾燥した材料を１００ｍＭの酢酸中に２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、フォールディング緩衝液（１００ｍＭのＣＨＥＳ／１ＭのＮａＣｌ／３０ｍＭのＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＧＳＨ／０．５ｍＭのＧＳＳＧ／２０％のＤＭＳＯ、ｐＨ９．５、４℃）中で１５〜２０倍に希釈し、溶液を４℃で３日間穏やかに撹拌した。３日後に、３体積の１００ｍＭ 酢酸を加え、溶液を限外濾過（５ｋＤａカットオフ）によって約１００〜２００ｍｌまで濃縮し、１００ｍＭの酢酸で１０倍に希釈し、再濃縮した。リフォールディングされた材料を、５０℃で作動する、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（緩衝液Ａ：水中０．１％のＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ）によってさらに精製した。ローディング後、カラムを１５％の緩衝液Ｂで洗浄し、５０分で１５％のＢ〜６５％のＢの勾配で溶出した。目的のタンパク質を含有する集めた画分を、等体積の緩衝液Ａで希釈し、凍結乾燥した。リフォールディング収率は、両方のタンパク質に対して約２５％であった。

【0550】

方法２：フォールディング緩衝液：１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．４、０．９Ｍのアルギニン、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのＧＳＨ、１ｍＭのＧＳＳＧ（最終濃度）を用いた方法１に従うプロトコール。

【0551】

以下のＧＤＦ−１５変異体を、上記手順に従って調製した。

【0552】

中間体５１：Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５
ＭＨＨＨＨ ＨＨＡＲ ＮＧＤＨＣ ＰＬＧＰＧ ＲＣＣＲＬ ＨＴＶＲＡ ＳＬＥＤＬ ＧＷＡＤＷ ＶＬＳＰＲ ＥＶＱＶＴ ＭＣＩＧＡ ＣＰＳＱＦ ＲＡＡＮＭ ＨＡＱＩＫ ＴＳＬＨＲ ＬＫＰＤＴ ＶＰＡＰＣ ＣＶＰＡＳ ＹＮＰＭＶ ＬＩＱＫＴ ＤＴＧＶＳ ＬＱＴＹＤ ＤＬＬＡＫ ＤＣＨＣＩ （配列番号１）。
ＬＣＭＳ：計算質量値：２６４６２ 実測質量値：２６４６４

【0553】

中間体５２：Ｍ−（Ｈｉｓ）_６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５
ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ （配列番号２）。
ＬＣＭＳ：計算質量値：２６７２４ 実測質量値：２６７２５

【0554】

中間体５３：Ｈｉｓ−ｄＧＤＦ１５：
ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ （配列番号３）。
ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２６３６８ 実測質量値：２６３６３

【0555】

中間体５４：ＭＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５
ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ （配列番号４）
ＬＣＭＳ：計算質量値：２４６３６ 実測質量値：２４６３８

【0556】

中間体５５：ＡＨ−（１９９−３０８）−ｈＧＤＦ１５
ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ （配列番号５）
ステップ１：構築物Ｍ−Ｈｉｓ_６−ＴＥＶ（ＥＮＬＹＦＱ／Ａ）−Ｈ−ｈｓＧＤＦ１５ ａａ１９９−３０８の調製
構築物Ｍ−Ｈｉｓ６−ＴＥＶ（ＥＮＬＹＦＱ／Ａ）−Ｈ−ｈｓＧＤＦ１５ ａａ１９９−３０８は、上記手順（ステップａ、ｂおよびｃ）に従って調製した。
ステップ２：ステップ１からのタンパク質のＴＥＶ切断
凍結乾燥したタンパク質を水中に可溶化させて、最終濃度１．７５ｍｇ／ｍｌとした。タンパク質を、６ＭのＧｕａｎ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０＋５０ｍＭのＤＴＴ中で１：１に希釈することによって再度アンフォールディングさせ、室温で１時間撹拌した。材料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって再精製し、凍結乾燥した。２６ｍｇの凍結乾燥物を、２６ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／３Ｍ ＵＲＥＡ、ｐＨ７，５＋３０００ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２５７５−０２３）中に可溶化させ、４日間インキュベートした。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、水中１０％の保存溶液）の添加によって、ｐＨをｐＨ２．０に調整し、溶液を、水中０．１％のＴＦＡで１５０ｍｌまでさらに希釈した。０．２２ｕｍの膜を介した濾過の後、材料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって再度精製して、上手く切断されたタンパク質を単離した。画分を手動で集め、標的タンパク質を含有する画分を単離し、凍結乾燥した。次いで、切断されたＧＤＦ１５タンパク質をリフォールディングさせ、リフォールディングしたタンパク質を上述のように精製した。
ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４５１６ 実測質量値：２４５１８

【0557】

以下のＧＤＦ１５変異体を、上記手順に従って調製することができる。

【0558】

中間体５６：ＭＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５
ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ （配列番号６）
ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４７５２

【0559】

以下のＧＤＦ１５変異体を、上記手順に従って調製した。

【0560】

中間体５７：ＡＨＡ−（２００−３０８）−ｈＧＤＦ１５
ＡＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ （配列番号７）
ＬＣＭＳ：計算質量値（二量体）：２４４３０；実測質量値（二量体）：２４４３２

【0561】

中間体５８：Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮコンジュゲート

【0562】

【化85】

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Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５
配列：ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ

【0563】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５（中間体５２：０．６ｍＬ、４．８ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液（５．２ｍＬ）で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（２５１μＬ）中（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＮＨＳ−ＢＣＮ）の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液をゆっくり加え、反応液を２４℃で２１時間シェーカープレートに置いた。反応液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液で３０ｍＬまで希釈し、１０ｋＤａ ＭＷＣＯアミコン遠心濾過器を使用して（４回繰り返す）、２ｍＬまで濃縮して、２．５ｍＬの濃縮物を得た。Ａ_２８０（ε＝２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、２６７３０ｇ／ｍｏｌ）に基づくと、濃度は０．９３ｍｇ／ｍＬ（２．３３ｍｇ、８０％）であった：ＬＣＭＳ ＱＴ２＿１５−６０ｋＤａ＿１５分＿極性（方法Ｅ）。得られた溶液をＭＡＬＤＩによって分析し、主要なコンジュゲーションが＋１および＋２であることを示した（単量体および二量体のＮ−末端標識化）。

【0564】

【表24】

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【0565】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イニル）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0566】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＢＣＮは、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0567】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＢＣＮは、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0568】

中間体５９：Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮコンジュゲート

【0569】

【化86】

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Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５配列：
ＭＨＨＨＨ ＨＨＡＲ ＮＧＤＨＣ ＰＬＧＰＧ ＲＣＣＲＬ ＨＴＶＲＡ ＳＬＥＤＬ ＧＷＡＤＷ ＶＬＳＰＲ ＥＶＱＶＴ ＭＣＩＧＡ ＣＰＳＱＦ ＲＡＡＮＭ ＨＡＱＩＫ ＴＳＬＨＲ ＬＫＰＤＴ ＶＰＡＰＣ ＣＶＰＡＳ ＹＮＰＭＶ ＬＩＱＫＴ ＤＴＧＶＳ ＬＱＴＹＤ ＤＬＬＡＫ ＤＣＨＣＩ

【0570】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５（中間体５１：７．０４ｍＬ、１．４２ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液（１２．９５ｍＬ）で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（０．８８ｍＬ）中（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＮＨＳ−ＢＣＮ）の１０ｍｇ／ｍＬ保存溶液をゆっくり加え、反応液を２４℃で２１時間シェーカープレートに置いた。さらに一部のＮＨＳ−ＢＣＮ保存溶液（１７６μＬ）を加え、反応液を２４℃で２４時間維持した。反応液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５緩衝液で６０ｍＬまで希釈し、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外濾過カートリッジを使用して４ｍＬまで濃縮して（４回繰り返す）、４．１ｍＬの濃縮物を得た。Ａ_２８０（ε＝２９０９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、２６７００ｇ／ｍｏｌ）に基づくと、濃度は２．１９ｍｇ／ｍＬ（８．９８ｍｇ、８９％）であった：ＬＣＭＳ ＱＴ２＿１５−６０ｋＤａ＿１５分＿極性（方法Ｅ）

【0571】

【表25】

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【0572】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イニル）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0573】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＢＣＮは、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0574】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＢＣＮは、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0575】

中間体６０：Ｈｉｓ−ｄｏｇ−ＧＤＦ１５−ＢＣＮ

【0576】

【化87】

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１００ｕＬのＨｉｓ−ｄＧＤＦ１５（０．６８ｍｇ／ｍＬ）、１００ｕＬのｐＨ４．５の緩衝液、４ｕＬの１０ｍｇ／ｍＬのＢＣＮ−ＮＨＳ溶液を合わせて、室温で２日間インキュベートした。得られた混合物を、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋで４回洗浄し、２００ｕＬの溶液を得て、これを次のステップで使用した。生成物を、コンジュゲートにさらに変換させるために、粗生成物として持ち越した。

【0577】

本発明の実施例
Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋脂肪酸−ＰＥＧ−Ｎ_３クリックのための一般手順。ＢＣＮ標識されたＧＤＦ１５を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）中で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、一方、水中ＦＡ−ＰＥＧ−Ｎ_３（脂肪酸−ＰＥＧ２３−アジド）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＧＤＦ１５溶液に、１０当量のＦＡ−ＰＥＧ−Ｎ_３を加え、反応液を、シェーカープレート上に、２４℃で、終夜置いた。反応をＬＣＭＳ（ＱＴＯＦ法 １５〜６０ｋＤａ＿１５分＿極性）によりモニターし、未反応のＢＣＮ標識されたＧＤＦ１５が観察されなくなるまで、追加のＦＡ−ＰＥＧ−Ｎ_３を必要に応じて５０当量まで加えた。次いで、反応液を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）を用いて５〜１０倍希釈し、１０ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過カートリッジを使用して、緩衝液を新しい緩衝液と交換した（濃縮とそれに続く希釈を４サイクル）。サンプルをＡ_２８０で測定して、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、定量された回収率は３４％まで定量的であった。最終のコンジュゲートは、ＬＣＭＳ（ＱＴＯＦ法 １５〜６０ｋＤａ＿１５分＿極性）またはＭａｌｄｉにより分析した。

【0578】

実施例１：中間体２１にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５９）：

【0579】

【化88】

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【0580】

【表26】

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【0581】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0582】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0583】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0584】

実施例２：中間体４４にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５９）：

【0585】

【化89】

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【0586】

【表27】

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【0587】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0588】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0589】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0590】

実施例３：中間体２９ＡにコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５９）：

【0591】

【化90】

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【0592】

【表28】

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【0593】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0594】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0595】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0596】

実施例４：中間体２４にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（中間体５８）：

【0597】

【化91】

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【0598】

【表29】

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【0599】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0600】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0601】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0602】

実施例５：中間体２９にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0603】

【化92】

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【0604】

【表30】

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【0605】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0606】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0607】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0608】

実施例６：中間体５５にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0609】

【化93】

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【0610】

【表31】

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【0611】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0612】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0613】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0614】

実施例７：中間体６ＡにコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0615】

【化94】

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【0616】

【表32】

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【0617】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0618】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の単量体単位におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0619】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0620】

実施例９：中間体３０にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0621】

【化95】

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【0622】

【表33】

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【0623】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0624】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の分子（単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0625】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0626】

実施例１０：中間体１２にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0627】

【化96】

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【0628】

【表34】

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【0629】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0630】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の分子（単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0631】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0632】

実施例１３：中間体６にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５９）：

【0633】

【化97】

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【0634】

【表35】

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【0635】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0636】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の分子（両方の単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0637】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0638】

実施例１４：中間体１７にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0639】

【化98】

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【0640】

【表36】

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【0641】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0642】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の分子（両方の単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0643】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0644】

実施例１５：
ステップ１：

【0645】

【化99】

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ＴＨＦ（５ｍＬ）中２，２，１３，１３−テトラメチルテトラデカン二酸（Ａｌｄｒｉｃｈ ＣＰＲ、注文番号ＰＨ００２３２２）（１００ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４０．３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（５ｍＬ）中ＤＣＣ（６５．６ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によって、所望の生成物への部分的な変換が観察された。混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をＤＣＭ（４０ｍＬ）に再度溶解させ、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ／ＤＣＣ（１０：１：１）で溶出するシリカクロマトグラフィーによって精製して、混合物を得た。混合物を、ＭＳ起動式酸ＨＰＬＣ［（５５〜８０％のＡＣＮ ３．５分の勾配）：室温＝２．４８分、計算質量値：３１４．４６ 実測質量値：３１４．００］によってさらに精製して、クリーンな生成物（５０ｍｇ、３８．２％の収率）を得、出発材料を回収した。

【0646】

ステップ２：

【0647】

【化100】

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ＤＣＭ（３ｍＬ）中ＮＨＳ−２，２，１３，１３−テトラメチルテトラデカン二酸（１０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液に、アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（１０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９ｕＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に再度溶解させ、ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（５５〜８０％のＡＣＮ ３．５分の勾配 室温＝２．３５分、予測質量値：５１４．７０ 実測質量値：５１４．４０）によって精製して、７ｍｇのクリーンな生成物を５８％の収率で得た。

【0648】

ステップ３：

【0649】

【化101】

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１００μＬのＢＣＮ−ｄＧＤＦ１５（Ｉ−６０：ｐＨ４．５の緩衝液中０．６８ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ｐＨ４．５の緩衝液（１００μＬ）およびアジド（ＤＭＳＯ中６μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合物を室温で終夜インキュベートした。混合物をＡｍｉｃｏｎ １０ｋで４回洗浄した。得られた溶液をＭＡＬＤＩによって分析し、主要なコンジュゲーションが＋１および＋２であることを示した。Ｍａｌｄｉ：計算質量値：２６５４６ 実測質量値：２６４８３；計算質量値：２７０６０ 実測質量値：２７１２８；計算質量値：２７５７４ 実測質量値：２７７８９。

【0650】

実施例１６：中間体４４にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：

【0651】

【化102】

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【0652】

【表37】

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【0653】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１分子（１つの単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0654】

Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方の分子（両方の単量体単位）におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0655】

実施例１７：中間体５２にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ

【0656】

【化103】

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７ｍＬのｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液中３ｍＬのシクロオクチンＧＤＦ１５（Ｉ−５８：０．４６ｍｇ／ｍＬ、０．０５１ｕｍｏｌ）の溶液に、脂肪酸ｐｅｇアジド（３５ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中１５ｕＬ、０．３６ｕｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜インキュベートした。ＭＡＬＤＩ分析によって、変換が完了したことを観察した。アミコン濾過１０ｋＤにより精製した生成物を３回洗浄して、４．３ｍｌの０．２９ｍｇ／ｍｌの所望の生成物を９０％の収率で得た。Ｍａｌｄｉ：シクロオクチン ｓｍ 約５％ 予測質量値：２６９０２ 実測質量値：２６９９７；＋１脂肪酸 約４０％ 予測質量値：２８４２１ 実測質量値：２８５２５；＋２脂肪酸 約５０％ 予測質量値：２９９４０ 実測質量値：３０１９１ ＋３脂肪酸 ５％ 予測質量値：３１４５９ 実測質量値：３１８７４。

【0657】

実施例１８：中間体３７にコンジュゲートされたＭＨ−（１９９−３０８）ＧＤＦ１５（Ｉ−５４）

【0658】

【化104】

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ＭＨ−（１９９−３０８）−ＧＤＦ１５（中間体５４：０．３９３ｍＬ、０．０２８μｍｏｌ、１．７８ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に加え、ＮＨＳ脂肪酸（４７４ｕｇ、０．２８４ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を溶液に加えた。５時間後、反応をＭＡＬＤＩにより完了した。生成物を、アミコン限外濾過１０ｋＤを使用して５回洗浄することによって精製して、５７５ｕｇのコンジュゲートを７３％の収率で得た。ＭＡＬＤＩ：ｓｍ（１８％）、予想質量値：２４６３８ 実測質量値：２４７３５；＋１脂肪酸（３８％） 予想質量値：２６１９２ 実測質量値：２６２６８；＋２脂肪酸（４０％） 予想質量値：２７７４６ 実測質量値：２７７９８；＋３脂肪酸（４％） 予想質量値：２９３００ 実測質量値：２９３３３。

【0659】

実施例１９Ａ：中間体３７にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５（Ｉ−５９）

【0660】

【化105】

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Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（０．４９３ｍＬ、０．０２６μｍｏｌ、１．４２ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４）に加え、ｎｈｓ脂肪酸（０．２２１ｍｇ、０．１３２ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を溶液に加えた。終夜反応が完了しなかったため、さらに２．５当量の脂肪酸ＮＨＳ（０．１１０ｍｇ、０．０６６ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、５時間後、Ｍａｌｄｉは主要な生成物として＋２コンジュゲートを示した。生成物を、アミコン限外濾過１０ｋＤを使用して５回洗浄することによって精製して、５６５ｕｇのコンジュゲートを７６％の収率で得た。ＭＡＬＤＩ：ｓｍ（１８％）、予想質量値：２６４６８ 実測質量値：２６５５３；＋１脂肪酸（３８％） 予想質量値：２８０２２ 実測質量値：２８０９９；＋２脂肪酸（４０％） 予想質量値：２９５７６ 実測質量値：２９６４９；＋３脂肪酸（４％） 予想質量値：３１１３０ 実測質量値：３１２０１。

【0661】

実施例１９Ｂ：中間体３７とコンジュゲートされたＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５

【0662】

【化106】

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分子生物学グレードの水中の中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中６．６７ｍｇ／ｍＬ、５．２４７ｍＬ、１．４３３μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）（許容される範囲４．５〜５．０）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体３７（１０当量、２．３９ｍＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１８時間混合した。反応バイアル中に沈殿が形成された。反応混合物を、４×１５ｍＬの１０ｋＤａアミコン遠心濾過器の中で分割して、それぞれを、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に４回緩衝液交換し、サンプルを合わせて、２５．６ｍＬの体積とし、洗浄の間に、フィルターの沈殿をピペットチップで撹拌した。沈殿が溶液中に残ったので、混合物を４℃で終夜静置した。濃度は、Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１；２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって、１．６２ｍｇ／ｍＬ（１００％）であることが測定された。ＵＰＬＣ分析により、＋１ＦＡ（保持時間：４．８８分）および＋２ＦＡ生成物（保持時間：５．８０分）の６０％の回収率が示された（方法Ｊ）。ＬＣＭＳ法Ｔは、所望の質量を示す。

【0663】

実施例１９Ｂの粗製の混合物（以下の表に表された比率）をｉｎ ｖｉｖｏで試験し、表１に報告した：

【0664】

【表38】

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【0665】

（実施形態１１Ｂ、式Ｈで表されるように）ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の（単量体単位における）ポリペプチド鎖の１つにおけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0666】

（実施形態１１Ｂ、式Ｇで表されるように）ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の両方のポリペプチド鎖におけるＮ末端アミノ官能基での反応に相当する。

【0667】

ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の一部の他の部位における非選択反応に相当する。

【0668】

精製：
粗生成物を、逆相クロマトグラフィー（緩衝液Ａ 水中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ ＡＣＮ中０．１ＭＴＦＡ 勾配；９９％〜８０％緩衝液Ａ）、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ １３０Å、３．５μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ 流量２．５ｍｌ／分によって精製した。

【0669】

画分１：未反応ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５：Ｒｔ＝１７．３３分
画分２：（１９Ｂ１）ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ：Ｒｔ＝２０．２０分（およそ１５％の収率）（式Ｈ）
画分３：（１９Ｂ２）ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ：Ｒｔ＝２１．６０分（およそ１５％の収率）（式Ｇ）
画分４：（１９Ｂ３）ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ：Ｒｔ＝２３．０分（およそ５％の収率）
１９Ｂ１と１９Ｂ２の１：１の比の混合物を調製し、試験した（１９Ｂｍ）。

【0670】

あるいは、反応は、ｐＨ４．７３で、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２Ｏおよび３０ｍＭのＮａＯＡｃ中で行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中１２．０４ｍｇ／ｍＬ、４．１５μＬ、０．００２μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ １０ｍＭのＮａ_２ＨＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ（ｐＨ４．７３）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体３７（２０当量、６．８３μＬ、０．０４１μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１８時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁った。ＵＰＬＣ分析により、５８％の＋１および＋２生成物が示された（方法Ｊ）。

【0671】

【表39】

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【0672】

反応はまた、ｐＨ４．６で、３０ｍＭのＮａＯＡｃおよび１０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４中で行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中６．２１ｍｇ／ｍＬ、５．２６１ｍＬ、１．３３７μｍｏｌ）に、３０ｍＭのＮａＯＡｃ １０ｍＭのＫ_２ＨＳＯ_４（ｐＨ４．６）（許容される範囲４．５〜５．０）を加えて、最終タンパク質濃度０．８８ｍｇ／ｍＬを得た。中間体３７（１０当量、６８．３μＬ、０．４０９μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で７時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁った。反応混合物を、１５ｍＬの１０ｋＤａアミコン遠心濾過器の中４つの９ｍＬ部分に分割して、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）に４回緩衝液交換し、各洗浄の間に、沈殿をピペットチップで撹拌した。反応混合物を７５ｍＬの体積まで濃縮した。沈殿が残ったので、材料を４℃で２日間保存した。濃度は、Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１、２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって、０．４ｍｇ／ｍＬ（９７％）であることが測定された。ＵＰＬＣ分析により、＋１および＋２生成物の６１％の回収率が示された（方法Ｊ）。

【0673】

【表40】

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【参照例１】

【0674】

中間体ＰＥＧ−ミリスチン酸構築物にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）
ステップ１：

【0675】

【化107】

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アジド−ＰＥＧ２３−アミン（３０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）およびミリスチン酸ＮＨＳエステル（Ｔｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号Ｓ６９０８０）（１２ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１３ｕＬ）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。混合物を、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（０〜１００％）、次いでＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０〜１０％）で溶出するシリカクロマトグラフィーによって精製して、およそ５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで、クリーンな生成物を得た。ＬＣＭＳ：（勾配：１．４分で４０〜９８％のＢ−流れ １ｍＬ／分 溶離液Ａ：水＋０．０５％のギ酸＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸）ＬＣＭＳ：室温＝２．２０（方法Ｃ）質量＋Ｈ 計算値：１３５４．７１ 実測質量値：１３５４．４。

【0676】

ステップ２：

【0677】

【化108】

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ＢＣＮ−ｈＧＤＦ１５（Ｉ−５２：８００ｕＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ａ（ＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｍＬ、６．３ｕＬ、１０当量）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。定量的収量で１．１ｍＬ ０．２０ｍｇ／ｍＬ。（Ｍａｌｄｉ：＋１計算質量値：２８２２３ 実測質量値：２８６４０；＋２計算質量値：２９５４３；実測質量値：２９９６２、＋３計算質量値：３０８６３ 実測質量値：３１４２６、＋４計算質量値：３２１８３ 実測質量値：３２９１１）。

【参照例２】

【0678】

ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５−ＰＥＧ２３

【0679】

【化109】

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【0680】

【表41】

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【0681】

３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）（４２７μＬ）中Ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ５９：４２７μＬ、１．１７ｍｇ／ｍＬ、０．０１９μｍｏｌ）の溶液に、アジド−ｄＰＥＧ_２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、１０４μｇ、０．０９４μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過器を使用して、サンプルを５回、希釈および濃縮して、１４０μＬの体積にすることによって、混合物を３０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中に交換した。ＭＡＬＤＩ分析によって、＋１から＋４生成物への完全な変換が示された。濃度は、Ａ_２８０によって、２．０９９ｍｇ／ｍＬ（５７％）であることが測定された（２９０９０Ｍ−１ｃｍ−１、２７６００ｇ／ｍｏｌ）。

【0682】

実施例２０：中間体４７にコンジュゲートされたアペリン環状ペプチドＢＣＮ：
ステップ１：ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ^＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ^４〜Ｃ^７）アセテートの合成

【0683】

【化110】

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− 中間体２０ａの調製
（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨを用いた２−クロロトリチルクロリド樹脂の導入、Ｆｍｏｃ除去および樹脂の導入の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（５０．０ｇ、８５．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４００ｍＬ）に懸濁させ、懸濁液を１０分間撹拌し、次いで、溶媒を排出し、樹脂をＤＣＭ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ＤＣＭ（１２０．０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨ（２４．０ｇ、６８．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９６．５ｍｌ、５５２．５ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に加え、懸濁液に窒素を流し、室温で５分間撹拌した。もう一度ＤＩＰＥＡ（２２．７ｍｌ、１２７．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。

【0684】

反応混合物を排出し、樹脂を、ＤＣＭ（３×２５０ｍＬ）で、各回２分間洗浄した。樹脂を、混合物ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７０：１５：１５）（２×２５０ｍＬ）で、各回１０分間失活させた。

【0685】

ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）（１×３００ｍＬ）で５分間樹脂を処理することによって、Ｆｍｏｃ基を切断し、次いで、樹脂を１５分間排出し（１×３００ｍＬ）、続いて、以下のステップで洗浄した：ＤＭＦ（６×２５０ｍＬ、各回２分）、イソプロパノール（２×２５０ｍＬ、各回２分）およびＴＢＭＥ（６×２５０ｍＬ、各回２分）。樹脂を、真空中で、３５℃にて、２４時間乾燥させ、中間体２０ａ（５７．８ｇ、導入＝１．０８ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。

【0686】

− 中間体２０ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体２０ａ（１８．５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を、自動ペプチド合成装置（ＣＳＢＩＯ５３６（商標））での固相ペプチド合成にかけた。カップリングサイクルを以下のとおり規定した。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（３．０当量）、ＤＩＣ（３．０当量）、ＨＯＢｔ（３．０当量）、ＤＭＦ（以下の表を参照のこと）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×１５０ｍＬ、各回２分）。
− Ｆｍｏｃ脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）（５分間で１５０ｍＬ、次いで１５分間で１５０ｍＬ）。
− 洗浄：ＤＭＦ（６×１５０ｍＬ、各回２分）。

【0687】

【表42】

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【0688】

ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（６×１５０ｍＬ、各回２分）、イソプロパノール（６×１５０ｍＬ、各回２分）およびＴＢＭＥ（６×１５０ｍＬ、各回２分）で洗浄した。ペプチド樹脂を、高真空中で、３５℃にて、終夜乾燥させて、中間体２０ｂ（５７．６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を得た。

【0689】

− 中間体２０ｃの調製
（樹脂からのＨＦＩＰの切断）
中間体２０ｂの一部（２７ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３００ｍＬ）に懸濁させ、１５分間撹拌した。樹脂を排出して、次いで、ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３：７）（３×２７０ｍＬ、各回１５分）で処理した。切断溶液を濾去して集めた。樹脂をＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断溶液および洗浄液を、真空中で濃縮乾固した。白色の粉末を、真空中で、３５℃にて、終夜乾燥させて、中間体２０ｃ−バッチ１（２３．５ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を得た。

【0690】

中間体２０ｂ（２８．０ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）をもう一度用いて、上述の手順を繰り返し、中間体２０ｃ−バッチ２（２６．１ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）を得た。

【0691】

− 中間体２０ｄの調製
（フェネチルアミンの液相カップリング）
中間体２０ｃ−バッチ２（２０．０ｇ、７．４４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＨＡＴＵ（５．２３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、１．８５当量）をＤＭＦ（４００ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＦ（６０ｍＬ）中フェネチルアミン（１．６７ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、１．８５当量）およびＤＩＰＥＡ（３．５６ｇ、２７．６ｍｍｏｌ、３．７１当量）の溶液を加えた。

【0692】

反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、０℃に冷却し、次いで、ブライン（４６０ｍＬ）を加えた。懸濁液を１０分間撹拌し、次いで、生成物を濾過によって単離した。濾過ケークをＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）で洗浄し、次いで、これを注意深く取り出し、次いでＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解させた。溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、次いで、真空中で濃縮乾固した。粗生成物を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭおよびＤＣＭ／ｉＰｒＯＨ（８：２））にかけて、中間体２０ｄ−バッチ１（１４．４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を得た。

【0693】

フラッシュクロマトグラフィーを除いて、中間体２０ｃ−バッチ１（２３．４ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を用いて同じ手順を繰り返し、中間体２０ｄ−バッチ２（２８．０ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を得た。

【0694】

− 中間体２０ｅの調製
（保護基の除去）
中間体２０ｄ−バッチ２（２８．０ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＤＣＭ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９０：５：２．５：２．５）（２９０ｍＬ）に溶解させ、反応液を室温で２時間撹拌した。

【0695】

切断溶液を濾去し、冷ＴＢＭＥ（３Ｌ）（０〜４℃）に注いだ。濁った懸濁液を氷水浴で３０分間撹拌し、次いで、細孔４のガラスフィルターを通して濾過した。このようにして得られた白色の固体をＴＢＭＥ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空中で、３５℃にて、終夜乾燥させて、中間体２０ｅ−バッチ１（８．９ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を得た。

【0696】

中間体２０ｄ−バッチ１（１４．４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を用いて、同じ手順を繰り返し、中間体２０ｅ−バッチ２（９．６ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を得た。

【0697】

− ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ^＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ^４〜Ｃ^７）アセテートの調製
１）環化
中間体２０ｅ（５．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を水（５００ｍＬ）に溶解させた。酢酸（９３ｍＬ）中ヨウ素（１．１８ｇ、４．６６ｍｍｏｌ、１．４１当量）の溶液を一度に加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌した。水（５．８ｍＬ）中アスコルビン酸（１．０３ｇ、５．８３ｍｍｏｌ、１．７７当量）の溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌し、濾過し、４℃で精製まで保存した。

【0698】

１８．３ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）の中間体２０ｅがプロセッシングされるまで、同じ環化手順を繰り返した。

【0699】

２）精製
環状ペプチドの溶液を、注入毎に０．５〜５．０ｇのペプチドずつ、分取ＨＰＬＣにかけた。９５％超の純度を有する画分をプールし、凍結乾燥させて、総量４．８９ｇ（３．２ｍｍｏｌ）の精製ペプチド（ＴＦＡ塩）を得た。

【0700】

３）イオン交換による酢酸塩の形成
そのＯＨ⁻形態で７５ｇ（１００ｍＬ）の強陰イオン交換樹脂（Ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ＩＩＩ、Ｍｅｒｃｋ）を、焼結したガラスフィルター（多孔度３）に置き、次いで、酢酸／水（１：３）（３００ｍＬ）の溶液を加え、懸濁液を手動で２分間撹拌し、次いで、樹脂を排出した。もう一度酢酸／水（１：３）（３００ｍＬ）を用いて、プロセスを繰り返した。中性のドレインが観察されるまで、樹脂を脱イオン水で洗浄した。次いで、樹脂を、焼結したガラスフィルター（多孔度３）を備える４×２０ｃｍのカラムに移した。

【0701】

４．８ｇの精製ペプチドを脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解させ、カラムに加えた。生成物を脱イオン水（２００ｍＬ）で溶出した。生成物の溶出の制御は、ＴＬＣスポッティングによって行われ、豊富な画分をプールし、凍結乾燥させて、ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ^＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ^４〜Ｃ^７）アセテート（４．１ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を得た。

【0702】

純粋な生成物を分析ＨＰＬＣ（分析方法Ｆ；ｔ_Ｒ＝８．０１分）およびＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ（分析方法Ｇ；測定値：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝６４３．３２８；計算値：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝６４３．３２４）によって分析された。酢酸含有率は７．９９〜８．２７％であり、含水率は１．９４〜１．９６％であった。

【0703】

ステップ２：ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−ＣＰ−Ｎ^６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）［ジスルフィドＣ４〜Ｃ７］の調製

【0704】

【化111】

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ＤＭＦ（１ｍＬ）中ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ^＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）トリアセテート［ジスルフィドＣ４〜Ｃ７］（１００ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（３８ｍｇ、０．４５２ｍｍｏｌ）および水（８７ｕＬ）の混合物を、室温で１０分間撹拌し、次いで、（１Ｒ，８Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｂｅｒｒｙ＆ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、２０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌した。１ｍＬの水を混合物に加え、得られた溶液を凍結乾燥して、さらに精製することなく次のステップに使用される粉末を得た。

【0705】

ステップ３：実施例２０の調製：

【0706】

【化112】

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ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ^＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ^＊−Ｎ^６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）［ジスルフィドＣ４〜Ｃ７］（１ｍＬの水中５０ｍｇのステップ２からの生成物、０．０３４ｍｍｏｌ）および中間体４７（５２ｍｇ、２６８ｕＬの水中）を室温で約３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１５〜４０％のＡＣＮ ５分の勾配）によって精製した。生成物画分を凍結乾燥させて、表題生成物をＴＦＡ塩（２４ｍｇ、２１％）として得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ ２．１×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配は５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：２．７７分、ＭＳ［Ｍ＋２］^２＋：実測値：１４９１．８８０８、計算値：１４９１．８５６０。

【0707】

実施例２１Ａ：中間体４７にコンジュゲートされたアペリン環状ペプチドＢＣＮ
ステップ１：

【0708】

【化113】

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米国特許第８，６７３８４８号明細書で調製されたとおりのｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ^＊−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ^６〜Ｃ^１２）５０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、炭酸水素ナトリウム（１８ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）および水（４０ｕＬ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に混ぜた混合物を、室温で１０分間撹拌し、次いで（１Ｒ，８Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｂｅｒｒｙ＆ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１８ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌した。＋１および＋２追加の混合物をＬＣＭＳによって観察したので、混合物を質量起動式ＨＰＬＣによって精製した（ペプチド 方法５ ２５〜５０％のＡＣＮ ５分の勾配：条件：Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分 １．５ｍｌ注入）：保持時間 ３．２分（＋１）、保持時間 ４．６５分、４．９分（＋１および＋２の混合物）。ＬＣＭＳによって、所望の＋１生成物が６１％の収率で、＋１、＋２混合物が１８％の収率で確認される。ＬＣＭＳ：（塩基性溶離液Ａ：水＋５ｍＭ水酸化アンモニウム 溶離液Ｂ：ＡＣＮ 酸性カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０×３０ｍｍ −４０℃ 塩基性カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０×３０ｍｍ −４０℃）保持時間：０．９８分；ＭＳ［Ｍ＋２］^２＋：実測値：８５６．０、計算値：８６５．０２４５。

【0709】

ステップ２：

【0710】

【化114】

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ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ^＊−Ｈ−Ｎ^６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ^＊−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ^６〜Ｃ^１２）（２１．３３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）および中間体４７（２４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で約３時間撹拌した。反応物はＬＣＭＳによって完了し、凍結乾燥させて、表題生成物（２３ｍｇ、４８％）を得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ ２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離系Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配は５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：２．２２分、ＭＳ［Ｍ＋２］^２＋：実測値：１６１６．９４６４、計算値：１６１６．９７６。

【0711】

実施例２１Ｂ：脂肪酸−リンカー構築物Ｉ−３７にコンジュゲートされたアペリン環状ペプチド
ステップ１：Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｄｎｌｅ−フェネチルアミン中間体２１Ｂ１の合成

【0712】

【化115】

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フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）で、Ａｒｇ残基に対して２倍の標準ＡｒｇとＤｎｌｅを用い、２倍の時間でカップリングさせることにより固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２ＭのＤＭＦ中溶液として調製した。標準のカップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（５当量）、ＨＡＴＵ（５当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ）
− Ｆｍｏｃ脱保護：２０％ピペリジン／０．１Ｍ ＨＯＢｔ（２×７ｍＬ）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×７ｍＬ、次いで１×５ｍＬ）

【0713】

【表43】

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【0714】

ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（２×５０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体２１Ｂ１（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を得た。

【0715】

ステップ２：中間体２１Ｂ２の調製（樹脂からのペプチドの切断）

【0716】

【化116】

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中間体２１Ｂ１（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４ｍＬのＴＦＡ溶液（３７ｍＬのＴＦＡ、１ｍＬの水、１ｍＬのＴＩＰＳ、３．０６ｇのＤＴＴ）と合わせて、室温で３時間振盪した。溶液を樹脂から除去し、４０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏ中に沈殿させた。溶液をボルテックスし、氷上に１０分間静置した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色固体を冷Ｅｔ_２Ｏ（各回４０ｍＬ）でさらに２回洗浄し、遠心分離し（各回５分）、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させ、中間体２１Ｂ２（１７．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝１．８３分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１３．５。

【0717】

【化117】

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【0718】

ステップ３：中間体２１Ｂ３の調製（システイン残基の環化）

【0719】

中間体２１Ｂ１（２９．６ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）および１０滴のＤＭＳＯに溶解させて、わずかに濁った溶液を得た。ヨウ素（ＨＯＡｃ中５０ｍＭ、０．７８３ｍＬ、０．０３９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で終夜混合した。粗製反応液のＬＣＭＳ分析により、出発材料の完全な変換が示された。色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸を滴下添加した。材料を、ＭＳ起動式ＨＰＬＣによって精製した。プールした画分の凍結乾燥により、７ｍｇの所望の生成物を白色粉末（４．６３μｍｏｌ、２４％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝０．９０分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１１．８。

【0720】

ステップ４：アペリンＡ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｄｎｌｅ−フェネチルアミンおよび中間体 Ｉ−３７を含むコンジュゲート（Ｎ末端コンジュゲーション）の調製−実施例２１Ｂ

【0721】

【化118】

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ＮＨＳ−脂肪酸の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｈ_２Ｏ中で調製した。中間体２１Ｂ３（１．５ｍｇ、０．９９３μｍｏｌ）を、３０ｍＭのｐＨ４のＮａＯＡｃ緩衝液（６７２μＬ）に溶解させ、ＮＨＳ−脂肪酸（Ｉ−３７：０．８５０ｍＬ、５．１０μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、追加の１．５ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ_２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、反応液を室温で１６時間混合した。８ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ_２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、反応液を室温で３日間混合し、１．７ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ_２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１６時間振盪し、Ｍ−起動式ＨＰＬＣにより精製して、１．７ｍｇの表題化合物を白色の粉末（０．５１０μｍｏｌ、５１％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２ 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒ_ｔ＝３．８７分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］１５３３．１；［Ｍ＋Ｈ＋３／３］１０２２．９。

【0722】

実施例２２〜２４は、脂肪酸のｓｉＲＮＡとのコンジュゲートに言及する。
ｓｉＲＮＡ合成のためのキットは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから市販されている。ｓｉＲＮＡ剤は、当業界で知られている手順を使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応（enzymatic ligation reaction）を使用して構築され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ剤は、天然に存在するヌクレオチド、またはオフターゲット効果を減少させ、および／もしくは分子の生物学的安定性を増大させ、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成され得、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」の各々は、一般に、それぞれ塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、または「ヌクレオチド」は、修飾ヌクレオチドまたは代理置換部分（surrogate replacement moiety）を指す場合もある。

【0723】

当業者は、当業界で知られている任意の従来の方法を使用して、所望のようにｓｉＲＮＡを合成および修飾することが可能であると認識している（Henschel et al. 2004 DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue):W113-W120を参照のこと）。

【0724】

実施例２２：式Ａ３の脂肪酸部分のｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション

【0725】

【化119】

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中間体２２ａの調製：
ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ［当業界で知られている従来の方法を使用して合成された、トランスサイレチン（ＴＴＲ）に対するｓｉＲＮＡ］を、標準のオリゴヌクレオチドの手順（例えば、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号：１０−１９０６）との反応）を使用して、２２ａに変換した。

【0726】

【化120】

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【0727】

ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ：
アンチセンス鎖：Ｐｕａｇａｇｃａａｇａａｃａｃｕｇｕ＊ｕ＊ｒＸ０５８ ここで、
Ｐはリン酸であり、小文字は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを示し、下線を付した文字は２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを示し、イタリック体の文字は２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを示し、ｒは非塩基リビトールであり、^＊はホスホロチオエート結合を指し、Ｘ０５８は式：

【0728】

【化121】

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の非ヌクレオチド３’末端キャップである。

【0729】

センス鎖：ａａｃａｇｕｇｕｕｃｕｕｇｃｕｃｕａｒ−Ｃ６ＯＨ
−は、リン酸エステルを指し、Ｃ６ＯＨ（Ｃ６としても知られている）は式：

【0730】

【化122】

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の非ヌクレオチド３’末端キャップである。

【0731】

中間体２２ｂの調製：
０℃の０．５５６ｍｌのｓｉＲＮＡ２２ａの溶液（ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ Ｈ２Ｏ中１４．０２ｍＭ、７．７９μｍｏｌ）に０．５５６ｍｌのＤＭＦを加え、室温に温めた。次いで、２０８μｌのＴＥＡ（ＤＭＦ中０．３Ｍ、６２μｍｏｌ）を加え、２６０μｌのＢＣＮ−ＮＨＳ（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネート）（ＤＭＦ中０．１５Ｍ、３９μｍｏｌ）。得られた反応液を室温で１時間撹拌した。分析ＨＰＬＣにより、出発材料２２ａの消失が示された。反応液を、脱イオン化Ｈ_２Ｏで１０ｍｌに希釈すると、濁った。上記混合物を酢酸エチルで５回抽出し、有機低分子を除去した。水性層を分離し、凍結乾燥させた。乾燥した生成物固体（２２ｂ）をそのまま使用した。

【0732】

実施例２２の調製：
８０μｌの化合物２２ｂ（Ｈ_２Ｏ中１２．３ｍＭ、０．９６８μｍｏｌ）と６５μｌのビス脂肪酸−Ｎ_３（２２ｃ：実施例１５のステップ２：ＤＭＳＯ中４４．７ｍＭ、２．９０μｍｏｌ）を混合した。得られた混合物は濁っていたので、８０μｌの１：１ＤＭＦ／ＴＨＦを加えたが、反応液はまだ少し濁っていた。さらに８０μｌのＤＭＳＯを加え、透明の溶液を得た。反応液を室温で終夜撹拌した。反応液を脱イオン化Ｈ２Ｏで希釈し、ＨＰＬＣにかけて精製して、５．６ｍｇの化合物２２（収率６５．９％）を得た。精製のためのＨＰＬＣ条件：カラム：Ｘｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅｐフェニルヘキシル ５ｕｍ ＯＢＤ １９×５０ｍｍ；有機溶媒：１００ｍＭのＴＥＡで改変されたＡＣＮ；水性溶媒：１００ｍＭのＴＥＡ．ＨＯＡｃで改変されたＨ_２Ｏ；勾配：５〜６０％のＡｃＣＮ／Ｈ_２Ｏ；時間：１０分。ＬＣ−ＭＳ方法Ｈにより、生成物は、デコンボリューション後に、保持時間５．４４分で、所望の分子量８７７８で、単一のピークを示した。

【0733】

実施例２３：式Ａ１の脂肪酸部分のｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション 化合物４の調製

【0734】

【化123】

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実施例２３は、実施例２２と同様の手順を使用して調製された。

【0735】

２３ａの調製：
ＤＣＭ（１６ｍＬ）中ＮＨＳ−脂肪酸（２０ｍｇ）の溶液に、アジド−ｐｅｇ７−アミン（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ、カタログ番号１０５２３）（３１ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（５２ｕＬ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。変換が完了したことを、ＬＣ−ＭＳ分析により観察した。混合物を濃縮し、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に再度溶解させ、０．１％ＴＦＡを用いるＭＳ起動式ＨＰＬＣによって精製して（保持時間＝１．５９分、予測質量値（Ｍ＋１）：８１８．０６２ 実測質量値：８１７．９）、クリーンな生成物を得た。ＨＰＬＣ ＭＳシステムで設定された８００Ｄａのカットオフにより、材料の半分が失われた。５〜１０ｍｇ（１７〜３３％）のクリーンな生成物が得られた。

【0736】

８０μｌの２２ｂ（Ｈ_２Ｏ中１２．３ｍＭ、０．９６８μｍｏｌ）と６５μｌのトリス脂肪酸−Ｎ３（２３ａ：ＤＭＳＯ中４４．７ｍＭ、２．９０μｍｏｌ）を混合した。反応により、５．２ｍｇの化合物２３（収率５８．０％）が得られた。ＬＣ−ＭＳ方法Ｈにより、生成物は、デコンボリューション後に、保持時間５．８７分で、所望の分子量９２５７で、単一のピークを示した。

【0737】

実施例２４：式Ａ３の脂肪酸のＡＰＯＣＩＩＩ ｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション

【0738】

【化124-1】

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【0739】

【化124-2】

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２４ｂの調製
２５ｍｌのＤＣＭ中２４ａ（１．２４４ｇ、４．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（０．５８ｍｌ、４．１９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、Ｎ３−ペンタン酸（５００ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ）を加えた。最後に、ＥＤＣ（８０４ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で４時間撹拌した。反応液をブラインとＤＣＭの間で抽出した。合わせた全ての有機物を、乾燥させ、濃縮して、６０％の酢酸エチル／ヘプタンを用いるＳｉＯ２ゲルにより精製して、１．２０ｇの化合物２４ｂ（収率８９％）を得た。¹H NMR (クロロホルム-d, 400NHz) d: 5.88-6.37 (m, 1H), 4.60 (d, J=4.8 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.33 (t, J=6.7 Hz, 2H), 3.13 (d, J=6.5 Hz, 2H), 2.30 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.81-1.95 (m, 1H), 1.63-1.81 (m, 5H), 1.48-1.57 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.36 (d, J=6.8 Hz, 2H)

【0740】

２４ｃの調製
１２ｍｌのＴＨＦ中２４ｂ（８６０ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（５．５８ｍｌ、５．５８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で０．５時間撹拌した。反応液をブラインで希釈し、２０ｍｌのＤＣＭを加えた。１ＮのＨＣｌで、水性層のｐＨをｐＨ約５に調整し、次いで、ＤＣＭで抽出した。合わせた全ての有機物を、乾燥させ、濃縮して、粗製の固体を６ｍｌのＤＣＭに再度溶解させた。０．６ｍｌのＴＦＡを加え、反応液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物２４ｃ（４００ｍｇ、５４％）を得、これをさらに精製することなく直接使用した。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、２７２．５の質量（Ｍ＋Ｈ^＋）で、０．４３分に主要なピークを示した。

【0741】

２４ｅの調製
１０ｍｌのＤＣＭ中２４ｃ（４００ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（０．４３４ｍｌ、３．１１ｍｍｏｌ）を加え、続いて２４ｄ（５３８ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３時間撹拌した。反応液をＨ２ＯおよびＤＣＭの間で抽出した。合わせた全ての有機物を、乾燥させ、濃縮して、８％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるＳｉＯ２ゲルにより精製して、４７５ｍｇの２４ｅ（収率８２％）を得た。1H NMR (クロロホルム-d, 400MHz) d: 6.74-6.98 (m, 1H), 5.95-6.13 (m, 1H), 4.55 (dd, J=7.2, 2.4 Hz, 2H), 3.32 (t, J=6.7 Hz, 4H), 3.11 (d, J=5.8 Hz, 2H), 2.30-2.37 (m, 2H), 2.20-2.26 (m, 2H), 1.90 (br. s., 2H), 1.71-1.80 (m, 2H), 1.59-1.71 (m, 4H), 1.51-1.59 (m, 2H), 1.35-1.51 (m, 13H), 1.20-1.35 (m, 13H)

【0742】

２４ｆの調製

【0743】

【化125】

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中間体２４ｆ２の調製
ＭｅＯＨ（４０ｍｌ）中２４ｆ１（１．０ｇ、４．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（１．０４ｍｌ、７．４５ｍｍｏｌ）を加え、続いてジｔ−ブチルカーボネート（２．１７ｇ、９．９４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を６０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮して、５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるＳｉＯ２カラムにより精製して、１．２ｇの化合物２４ｆ２（収率８０％）を得た。¹H NMR (クロロホルム-d, 400MHz) d: 4.51 (br. s, 1H), 3.00-3.22 (m, 2H), 2.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.59-1.71 (m, 2H), 1.46 (s, 11H), 1.29 (br. s., 12H).

【0744】

中間体２４ｆ３の調製
ＤＣＭ（３０ｍｌ）中２４ｆ２（１．２ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥＤＣ（１．０ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮して、ＳｉＯ２カラムに直接導入して、４０％の酢酸エチル／ヘプタンで精製して、１．４６ｇの化合物２４ｆ３（収率９２％）を得た。1H NMR (クロロホルム-d, 400MHz) d: 4.49 (br. s, 1H), 3.04-3.19 (m, 2H), 2.86 (d, J=4.5 Hz, 4H), 2.62 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.70-1.82 (m, 2H), 1.37-1.53 (m, 13H), 1.30 (br. s., 10H)

【0745】

中間体２４ｆの調製
ＤＣＭ（１．５ｍｌ）中ＧａｌＮＡｃ３−ＮＨ２（３００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（０．１１ｍｌ、０．７９ｍｍｏｌ）を加え、続いて２４ｆ３（１８８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸（１．０ｍｌ）を加えた。２時間後、ＬＣ−ＭＳにより、中間体の消失が示された。反応液を濃縮して、酸性条件下で、検出としてＥＬＳＤを用いて、オープンアクセスＨＰＬＣで精製した。生成物を含有するＨＰＬＣ画分を集め、溶媒を蒸発させて、２２０ｍｇの化合物２４ｆ（収率６７％）を得た。ＬＣ−ＭＳにより、一部の生成物が１つのアセチル基を失ったことが示された。精製のためのＨＰＬＣ条件：カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×１００ｍｍ ５ｕｍカラム；有機溶媒：７．５％ＴＦＡ含有ＡＣＮ；水性溶媒：７．５％ＴＦＡ含有Ｈ_２Ｏ；流量：７５ｍｌ／分。勾配：１５〜４０％のＨ２Ｏ／ＡｃＣＮ；時間：９．５分。検出：検出としてＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出）。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、９８９．９の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、０．８３分にピークを示した。

【0746】

２４ｇの調製
３ｍｌのＤＣＭ中２４ｅ（１７２ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、２４ｆ（２５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＥＡ（０．０６９ｍｌ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。最後に、ＥＤＣ（９５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮して、５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるＳｉＯ_２カラムにより精製して、２３０ｍｇの２４ｇ（収率７４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、１２５８．２の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、１．３０分にピークを示した。

【0747】

２４ｈの調製
１ｍｌのＴＨＦ中２４ｇ（２３０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）の溶液に、０．４５７ｍｌの４ＮのＨＣｌ（ジオキサン中、１．８３ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１時間撹拌した。反応液を濃縮して、ＨＰＬＣにより精製して、糖の１つのアセチル基を失った、５０ｍｇの２４ｈ（収率２３％）を得た。精製のためのＨＰＬＣ条件：カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×１００ｍｍ ５ｕｍカラム；有機溶媒：７．５％ＴＦＡ含有ＡＣＮ；水性溶媒：７．５％ＴＦＡ含有Ｈ_２Ｏ；流量：７５ｍｌ／分。勾配：１５〜４０％のＨ２Ｏ／ＡｃＣＮ；時間：９．５分。検出：検出としてＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出）。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、１１８７．１の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、０．９５分にピークを示した。

【0748】

２４ｉの調製
２ｍｌのＤＣＭ中２，２，１３，１３−テトラメチルテトラデカン二酸（４０ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ＯＨスクシンイミド（９．８１ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を加え、続いて、追加のＥＤＣ（１６．３４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮して、ＨＰＬＣにより精製して、２０ｍｇの２４ｉ（収率３８％）を得た。精製のためのＨＰＬＣ条件：カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×１００ｍｍ ５ｕｍカラム；有機溶媒：７．５％ＴＦＡ含有ＡＣＮ；水性溶媒：７．５％ＴＦＡ含有Ｈ_２Ｏ；流量：７５ｍｌ／分。勾配：４５〜７０％のＨ２Ｏ／ＡｃＣＮ；時間：９．５分。検出：検出としてＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出）。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、４３４．３の質量（Ｍ＋Ｎａ^＋）で、１．５５分にピークを示した。

【0749】

２４ｊの調製
０．５ｍｌのＤＣＭ中２４ｈ（２０ｍｇ、８．０５μｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（４．５μｌ、３２μｍｏｌ）を加え、続いて、追加の２４ｉ（６．６２ｍｇ、１６μｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３．９３ｍｇ、３２μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した。脱保護のために、０．５ｍｌの２ＮのＭｅＮＨ_２／ＭｅＯＨを加えた。反応液を室温でもう一晩撹拌した。反応液を濃縮して、アセトンを加えて生成物を沈殿させ、過剰な試薬および脂質を除去して、１２ｍｇの２４ｊ（収率６４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、１１６６．９の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、０．６９分にピークを示した。

【0750】

２４Ｋの調製

【0751】

【化126】

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ステップ１：
ＡＰＯＣＩＩＩ ｓｉＲＮＡ［当業界で知られている従来の方法を使用して合成された、遺伝子ＡＰＯＣＩＩＩ（ＡＰＯＣ３またはＡｐｏｃ ３としても知られている）に対するｓｉＲＮＡ］：

【0752】

オリゴヌクレオチドのアニーリング
一般手順：
各オリゴヌクレオチドのペレットを、遠心分離において簡単に遠心沈殿させ、Ｄｕｐｌｅｘ緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム；３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に、高濃度（緩衝液１００ｍＬ当たり１〜１０のＯＤ２６０）で溶解させた。加熱（９４℃まで）およびボルテックスを使用して、再懸濁を促進してもよい。次いで、センス鎖およびアンチセンス鎖を、当量で一緒に加えた。次いで、混合オリゴヌクレオチドを９４℃まで加熱し、徐々に冷却した。重要な二次構造を有する配列には、より段階的な冷却／アニーリングステップが用いられてもよい。これは、オリゴ溶液を、水浴またはヒートブロックに置き、機器のプラグを抜く／スイッチをオフにすることによって容易に行われる。得られた生成物は、安定な、二本鎖形態であり、４℃または冷凍で保存できる。

【0753】

ＡＰＯＣＩＩＩ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＡＰＯＣＩＩＩの配列を含み、鎖の３’末端はリン酸で終了し、５’から３’の順に、リビトール、もう１つのリン酸、および３’末端キャップＸ０５８、式：

【0754】

【化127】

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の非ヌクレオチド３’末端キャップをさらに含む。

【0755】

センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的なＡＰＯＣＩＩＩの配列を含み、鎖の３’末端はリン酸で終了し、５’から３’の順に、リビトール、もう１つのリン酸、および３’末端キャップＣ６ＯＨ、式：

【0756】

【化128】

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の非ヌクレオチド３’末端キャップをさらに含む。

【0757】

ＡＰＯＣＩＩＩ ｓｉＲＮＡを、２−ジメトキシトリチルオキシメチル−６−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−ヘキサン−１−サクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２０−２９５７）と反応させると、生成物２４ｋ１を生じた。

【0758】

ステップ２
ＡＰＯＣＩＩＩ ｓｉＲＮＡ（２４ｋ１：４０１μＬ、Ｈ_２Ｏ中１１．２ｍＭ、４．４９μｍｏｌ）を、４０１μｌのＤＭＦと混合し、透明の溶液を得た。次いで、ＴＥＡ（１８０μｌ、ＤＭＦ中０．２５Ｍ、４５μｍｏｌ）を加え、続いて、ＢＣＮ−ＮＨＳ（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルＮ−スクシンイミジルカーボネート）（９．１６ｍｇ、３１μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１時間撹拌した。反応液を、Ｈ２Ｏで１０ｍｌまで希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。水性層を分離し、約５ｍｌまで濃縮し、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。

【0759】

２４の調製
２４ｊ（５．８ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を、１０５μｌの化合物２４ｋ（Ｈ_２Ｏ中Ａｐｏｃ３ ｓｉＲＮＡ ９．５ｍＭ、０．９９３μｍｏｌ）に加えた。１時間後、反応液は粘性になった。よって、別に６０μｌのＨ_２Ｏを加え、反応液を室温で終夜撹拌した。反応液をＨ_２Ｏで希釈し、ＨＰＬＣにより精製して、５ｍｇのコンジュゲート２４（収率５７％）を得た。精製のためのＨＰＬＣ条件：カラム：Ｘｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅｐ フェニルヘキシル ５ｕｍ ＯＢＤ １９×５０ｍｍ；有機溶媒：１００ｍＭのＴＥＡ．ＨＯＡｃで改変されたＡｃＣＮ；水性溶媒：１００ｍＭのＴＥＡ．ＨＯＡｃで改変されたＨ_２Ｏ；勾配：５〜５０％のＡｃＣＮ／Ｈ２Ｏ；時間：１０分。ＬＣ−ＭＳ方法Ｈにより、生成物は、デコンボリューション後に、所望の分子量８８９６で、５．９６分にピークを示した。

【参照例３】

【0760】

ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ

【0761】

【化129】

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参照例３は、２４ｊをＧａｌＮａｃ３−Ｎ３（以下）で置き換え、実施例２４の手段に従って調製した。

【0762】

ＧａｌＮａｃ３−Ｎ３の調製

【0763】

【化130】

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【0764】

中間体２の調製
化合物１（２．０６ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌのエタノールに溶解させた。ＴＦＡ（８２ｕｌ、１．０７ｍｍｏｌ）を加え、続いて１０％のＰｄ／Ｃ（０．１１４ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を、Ｈ_２バルーン中で６時間処理した。反応液を濾過し、エタノールで洗浄し、濃縮して、白色の固体を得て、これを次のステップに直接使用した。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、８９８．５の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、０．８１分にピークを示した。

【0765】

中間体３の調製
化合物２（４．８４８ｇ、０．４７９ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解させ、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４アジドブタノエート（０．３２５ｇ、１．４３６ｍｍｏｌ）を加え、続いて、追加のＤＩＰＥＡ（０．４１８ｍｌ、２．３９４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で終夜反応させた。反応液を、加熱せずに濃縮し、予備平衡したＳｉＯ２カラムに導入し、０〜２０％のメタノール／ＤＣＭステップ勾配で精製して、２．３８３ｇの化合物３（収率４９．２５％）を得た。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、９５３．７の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、１．２７分にピークを示した。

【0766】

中間体４の調製
化合物３（１．３３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をＭｅＮＨ２（１７．４５ｍｌ、メタノール中２．０Ｍ、３４．９ｍｍｏｌ）と混合した。反応液を室温で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより、生成物のピークのみが示された。反応液を濃縮した。次いで、固体をエタノールに再度溶解させ、アセトンを用いて沈殿させて、１．０ｇの化合物４（収率９４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ方法Ｉにより、生成物は、７６４．５の質量（Ｍ／２＋Ｈ^＋）で、０．５３分にピークを示した。

【0767】

実施例２５：キャリアタンパク質（ＣＲＭ１９７）と脂肪酸のコンジュゲーション
ステップ１：２−（（２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−５−アザテトラコンタン−４０−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（２５ａ）。

【0768】

【化131】

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ｔ−ｂｏｃ−Ｎ−アミドーｄＰＥＧ（登録商標）_１１−アミン（１００ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）および中間体５（８０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解させ、室温で、窒素中にて撹拌した。３０分後、ＤＩＰＥＡ（０．０５ｍＬ、０．２８６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。変換が完了したことをＬＣＭＳによって観察した（酸性溶離液Ａ：水＋０．０５％のトリフルオロ酢酸、溶離液Ｂ：ＡＣＮ、カラム Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０×３０ｍｍ −４０℃、２分で５〜９５％の勾配、保持時間１．９２分）。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、約１．５ｍＬのアセトニトリルに溶解させた。ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、３．５分かけて６５〜９５％のＡＣＮの勾配、保持時間３．２３分）により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、８５ｍｇのクリーンな生成物を５４％の収率で得た。透明の油状物。ＬＣＭＳ：方法Ｄ Ｒｔ＝１．１８分、Ｍ＋Ｈ １０７０．１；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d₃) δ ppm 0.82 - 1.03 (m, 1 H) 1.11 - 1.37 (m, 10 H) 1.37 - 1.51 (m, 2 H) 1.51 - 1.64 (m, 1 H) 1.69 - 1.82 (m, 1 H) 1.90 - 2.04 (m, 66 H) 2.05 - 2.21 (m, 8 H) 2.21 - 2.42 (m, 1 H) 3.17 - 3.28 (m, 1 H) 3.40 - 3.68 (m, 13 H).

【0769】

ステップ２：２−（（３５−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサぺンタトリアコンチル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（２５ｂ）。

【0770】

【化132】

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２５ａ（５ｍｇ、４．６８μｍｏｌ）をＤＣＭ（体積：２ｍＬ）に溶解させ、次いで、トリフルオロ酢酸（２５μｌ、０．３２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温で、窒素雰囲気下で、約２時間撹拌した。変換が完了したことをＬＣＭＳによって観察した（酸性溶離液Ａ：水＋０．０５％のトリフルオロ酢酸、溶離液Ｂ：ＡＣＮ、カラム Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０×３０ｍｍ −４０℃、２分で５〜９５％の勾配、保持時間１．４５分）。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、ＤＣＭですすぎ、３回再度濃縮した。アセトニトリルとＤＭＳＯの混合物に溶解させた。ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、３．５分かけて４５〜７０％のＡＣＮの勾配、保持時間２．５０分）により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、２．５ｍｇのクリーンな生成物を５５％の収率で得た。透明の油状物。
方法Ａ Ｒｔ＝１．４５分、Ｍ＋Ｈ ９６９．９；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d₃) δ ppm 0.62 - 0.91 (m, 2 H) 0.91 - 1.10 (m, 3 H) 1.10 - 1.31 (m, 18 H) 1.46 (五重線, J=7.21 Hz, 2 H) 1.59 - 1.89 (m, 35 H) 1.94 - 2.09 (m, 1 H) 2.16 (t, J=7.40 Hz, 2 H) 2.97 - 3.11 (m, 1 H) 3.24 - 3.37 (m, 1 H) 3.37 - 3.61 (m, 28 H) 3.61 - 3.89 (m, 2 H) 7.85 (br. s., 1 H).

【0771】

ステップ３：２−（（（Ｓ）−５−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−３，６−ジオキソ−１−フェニル−２，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−４，７−ジアザドテトラコンタン−４２−イル）カルバモイル）−２−ウンデシルトリデカン二酸（２５ｄ）。

【0772】

【化133】

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ＴＨＦ（体積：２ｍＬ）中２５ｂ（２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液をＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｏｓｕ ２５ｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡＳ３４０７８−８５−８、１１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）に加え、次いでＤＩＰＥＡ（７５μｌ、０．４２９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で、窒素雰囲気下にて、週末にかけて撹拌した。変換が完了したことをＬＣＭＳによって観察した（酸性溶離液Ａ：水＋０．０５％のトリフルオロ酢酸、溶離液Ｂ：ＡＣＮ、カラム Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ３．０×３０ｍｍ −４０℃、２分で５〜９５％の勾配、保持時間１．７７分）。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、アセトニトリルに溶解した。ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分 １．５ｍｌ注入、３．５分かけて５５〜８０％のＡＣＮの勾配、保持時間２．７０分）により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、１０．５ｍｇのクリーンな生成物を４６％の収率で、透明無色の油状物として得た。方法Ｃ Ｒｔ＝１．６０分、Ｍ＋Ｈ １２３２．４；¹H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d₃) δ ppm 0.67 - 0.93 (m, 2 H) 0.93 - 1.10 (m, 2 H) 1.10 - 1.32 (m, 15 H) 1.45 (五重線, J=7.24 Hz, 1 H) 1.59 - 1.69 (m, 1 H) 1.75 - 1.93 (m, 30 H) 1.94 - 2.21 (m, 20 H) 3.23 (五重線, J=5.26 Hz, 1 H) 3.28 - 3.51 (m, 23 H) 3.95 (td, J=7.73, 5.44 Hz, 1 H) 4.92 - 5.22 (m, 1 H) 5.78 (br. s., 1 H) 6.13 - 6.42 (m, 1 H) 6.88 (br. s., 1 H) 7.20 - 7.36 (m, 2 H) 7.42 (t, J=5.07 Hz, 1 H).

【0773】

ステップ４：脂肪酸を用いるＣＲＭ１９７のｍＴＧａｓｅ媒介標識化（実施例２５）：

【0774】

【化134】

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１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）中２５ｄの溶液（８ｍｇ／ｍＬ、２０３μＬ、１．３１６μｍｏｌ）に、ＣＲＭ１９７（３３ｍｇ／ｍＬ、１．５１５μＬ、０．０００８６μｍｏｌ）を加え、続いて、ＰＢＳ中のトランスグルタミナーゼ酵素（味の素）（５０ｍｇ／ｍＬ、０．４５５μＬ、０．０００６０μｍｏｌ）の溶液を加えた。反応液を室温で１６時間撹拌した。１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器を使用して、反応液を５回希釈および濃縮して、体積を１００μＬにすることによって、反応混合物を、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）に交換した。ＬＣＭＳ分析により、＋１、＋２、＋３および＋４生成物への変換が示された。ＬＣＭＳ ＱＴ２；タンパク質＿３５〜７０ｋＤａ＿３分：Ｒ_ｔ＝１．４５分；ＭＳ［Ｍ＋２５ｄ］：実測値：５９６２５、計算値：５９６２４；ＭＳ［Ｍ＋（２×２５ｄ）］：実測値：６０８３９、計算値：６０８３８；ＭＳ［Ｍ＋（３×２５ｄ）］：実測値：６２０５４、計算値：６２０５２；ＭＳ［Ｍ＋（４×２５ｄ）］：実測値：６３２７０、計算値：６３２６６。

【0775】

ＣＲＭ１９７配列：
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW
KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE
TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI
NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS
CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF
HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT
TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL
VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT
VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI
SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH

【0776】

【表44】

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【0777】

ペプチドマッピングの実験概要：
ペプチドマッピング消化：５μｇの改変ＣＲＭ１９７および陽性対照ＣＲＭ１９７サンプルを２０ｍＭのＤＴＴで還元し、１／３０（ｗ／ｗ）の酵素／タンパク質で、２６℃で、終夜、トリプシンを用いて消化した。トリプシンで消化されたタンパク質のアリコートを、ＧｌｕＣ酵素を用いて、１／２０の酵素／タンパク質比で、４時間、２６℃でさらに消化した；全ての酵素はＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（有限会社、ドイツ）から購入されたことに留意されたい。

【0778】

逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：得られた消化されたペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣａｐＬＣ（サンタクララ、カリフォルニア州）にライゲーションしたＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州）での液体クロマトグラフエレクトロスプレータンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。約１０〜１５ｐｍｏｌのＣＲＭ対照と改変ＣＲＭ１９７消化物を、カラムに４０℃で導入した（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、１×１００ｍｍ カラム）。１０μＬ／分の状態で０〜１分、４％のＢ、１．１分で７％のＢまで増加させる、５５分で４５％のＢ、次いで６３分で９５％のＢの勾配で合計８０分稼働させ、続いて、洗浄およびカラム平衡化を行った。質量分析計のパラメータは、ｍ／ｚ３００〜２０００からの３００００分解能で、３０ミリ秒間、ＦＴＭＳ分析計を使用する、フルスキャン事象を含んだ。衝突誘起解離ＭＳ／ＭＳを、イオントラップ型質量分離法における上位７つの強度のイオン（１＋イオンを除外する）で行い、５００（全ての事象について）シグナル強度閾値で３０ミリ秒間活性化した。

【0779】

データ分析およびデータベース検索：全ての質量スペクトルを、Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｖ２．０．７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。ｍａｓｃｏｔ ｇｅｎｅｒｉｃ ｆｉｌｅ（ｍｇｆ）をＭＳ Ｄｅｃｏｎ Ｔｏｏｌｓ（Ｒ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ Ｌａｂ、ＰＰＮＬ）を用いて作成し、混在タンパク質に対する社内カスタムデータベースおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（５１３，８７７配列を有するＶ５７）に加えて提供されたタンパク質配列に対するＭａｓｃｏｔ Ｖ２．３．０１（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、ボストン、マサチューセッツ州）データベース検索を使用して検索した。検索パラメータは以下を含む：酵素：セミトリプシンまたはトリプシン／Ｇｌｕ−Ｃ、３つまでのミスクリベージ（missed cleavage）を許容する；非確定的修飾（variable modification）：「ＣＲＭ Ｔｇａｓｅ＋アルキン ３６２Ｄａ ｍｏｄ（ＣＫＲ）、ＣＲＭ Ｔｇａｓｅ＋アルキン ３６２Ｄａ ｍｏｄ（Ｎ末端）、ＣＲＭ Ｔｇａｓｅ＋アジド ４６３Ｄａ ｍｏｄ（ＣＫＲ）、ＣＲＭ Ｔｇａｓｅ＋アジド ４６３Ｄａ ｍｏｄ（Ｎ末端）」と呼ばれるデータべースに対する小分子の予測付加質量（３６２．１４７７８７Ｄａおよび４６３．２０６６９８Ｄａ）；ペプチドの許容誤差（peptide tolerance）：±２０ｐｐｍ；ＭＳ／ＭＳ許容誤差（MS/MS tolerance）：±０．６Ｄａ。配列包括度および小分子修飾の評価は、＞９５％信頼区間でのイオンスコアで行われた。次いで、高スコアのペプチドイオンを、Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを使用する手動のＭＳ／ＭＳ分析のために選択した。

【0780】

リシン修飾が生じる位置を、上掲のマッピング実験に従って判定することができる。２０１４年７月１１日に出願された米国特許出願第２０１５／００１７１９２号明細書（代理人明細書番号ＰＡＴ０５５６４１−ＵＳ−ＮＰ）においてＣＲＭ１９７について記載された、同様のコンジュゲーションにより、本発明者らは、修飾が、Ｌｙｓ３７またはＬｙｓ３９、Ｌｙｓ３３およびＬｙｓ４４０で生じたと推定する。

【0781】

実施例２６Ａ：オキシトシン誘導体と脂肪酸のコンジュゲーション：

【0782】

【化135】

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ステップ１：樹脂で保護されたオキシトシンの調製

【0783】

【化136】

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オキシトシンの樹脂で保護された形態（２６ａ１）は、実施例２１Ｂのステップ１と似たようにして合成された。

【0784】

ステップ２：アリル脱保護、環化、樹脂からの切断

【0785】

【化137】

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保護された中間体（２６ａ１）（０．２ｍｍｏｌ）を、フェニルシラン（１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．０２ｍｍｏｌ）を含有する６ｍｌのＤＣＭ中に溶かした。樹脂をこの溶液中で１５分間撹拌し、次いで濾過した。ＤＣＭ溶液中のフェニルシラン／Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を用いて、この手順を２回繰り返した。最後の撹拌後、樹脂を濾過し、ＮＭＰ（３回）、ＤＣＭ（３回）、０．５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（３回）および最終はＮＭＰ（３回）で洗浄した。得られた洗浄された樹脂を真空中で乾燥させた。乾燥させた樹脂の一部（約０．１ｍｍｏｌ）を、６ｍＬのＮＭＰ中ＰｙＢＯＰ（０．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）の溶液に溶かした。この反応液を室温で２０時間撹拌した。樹脂を濾過し、ＥｔＯＡｃ（３回）およびＤＣＭ（３回）で洗浄した。樹脂を、４ｍＬの９５／２．５／２．５のＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ_２Ｏに溶かし、２時間撹拌した。次いで、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ_２Ｏ溶液を、冷（−２０℃未満）Ｅｔ_２Ｏ中に濾過し、切断されたペプチドを沈殿させた。遠心分離後、Ｅｔ_２Ｏをデカントし、オフホワイトの残渣をＥｔ_２Ｏで洗浄し、再度遠心分離した。得られたオフホワイトの固体を、Ｎ_２中にて、終夜乾燥させた。この固体を、質量起動式分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム；移動相：水中７．５〜２０％のＡＣＮ、５分の勾配、７５ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡで改変）で精製した。中間体（２６ａ２）に相当する画分を合わせ、冷凍し、凍結乾燥させて、白色の固体（１３．５ｍｇ、１４％）とした。ＨＲＭＳ−分析法Ｇ：Ｒｔ＝０．９０分、ＭＳ ｍ／ｚ ９８８．５２２５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0786】

ステップ３：脂肪酸へのコンジュゲーション
０．５ｍＬのｐＨ＝６．４０のリン酸緩衝液中中間体（２６ａ２）の溶液に、０．５ｍＬのｐＨ＝６．４０のリン酸緩衝液中Ｉ−３７（８．３９μｍｏｌ）の溶液を加えた。反応液を室温で１８時間撹拌した。次いで、反応混合物を、４．５μｍのフリットを通して濾過し、質量起動式分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム；移動相：水中４５〜７０％のＡＣＮ、５分の勾配、７５ｍｌ／分、０．１％ＴＦＡで改変）で精製した。オキシトシン−ＦＡコンジュゲート（２６Ａ）に相当する画分を合わせ、冷凍し、凍結乾燥させて、白色の固体（１．７１ｍｇ、２４％）とした。ＬＣＭＳ−分析法Ｇ：Ｒｔ＝３．０７分、ＭＳ ｍ／ｚ ２５４０．５［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0787】

【化138】

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【0788】

実施例２６Ｂ：オキシトシン誘導体と脂肪酸のコンジュゲーション

【0789】

【化139】

[この文献は図面を表示できません]

^＊ブチレート−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ^＊−Ｇｌｙ（Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２^＊＝スルフィド結合（２６ｂ１）：

【0790】

【化140】

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を中間体Ｉ−３７と反応させることによって、上記実施例２６Ａのステップ３に従って、上記実施例（２６Ｂ）を調製することができる。

【0791】

環状ペプチド（２６ｂ１）を、参照により本明細書に援用されるWisniewski et al, J. Med. Chem. (2014), 57 5306-5317に開示される実施例４１の手順を採用することによって調製した。

【0792】

ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学により、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭＳ樹脂で手動で合成した。アミノ酸に対して使用された保護基は：Ｔｙｒに対するｔ−ブチル基、ＧｌｎおよびＡｓｎに対するＴｒｔ基である。２種の珍しいアミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ_２アリル）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−［Ｎα−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ（Ｂｏｃ）］Ｇｌｙ−ＯＨを使用した。Ｆｍｏｃ保護基を繰り返し除去し、ＤＭＦ中で保護されたアミノ酸（３当量）をカップリングすることによって、ペプチド鎖を樹脂上で組み立てた。ＨＢＴＵおよびＨＯＢｔ（３当量：３当量）をカップリング試薬として使用し；Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、６当量）を塩基として使用した。ＤＭＦ中２０％のピペリジン（樹脂体積の３倍）を、ｄｅ−Ｆｍｏｃ試薬として使用した。各カップリングおよびｄｅ−Ｆｍｏｃ後に、ＤＭＦ（樹脂体積の３倍）によって樹脂を洗浄し；各カップリング後に、ニンヒドリン試験を行い、カップリング効率を確認した。最後のＦｍｏｃ保護基の除去に続いて、樹脂をエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。アリルエステル保護基の選択的な樹脂上除去を、ＤＣＭ／ＴＨＦ（１／１、樹脂体積の１０倍）中Ｐｄ（ＰＰｈ３）４／５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（１当量／１０当量）によって３時間行った。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×）、続いて、ＤＭＦ中０．５％のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで洗浄した。最後に、樹脂上での環化を、ＤＭＦ中ＨＣＴＵ／ＮＭＭ（３当量／６当量）によって行った。樹脂を洗浄して、真空中で乾燥させて、３．２グラムのペプチド樹脂を得て、これを３２ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＯＴ／Ｈ_２Ｏ（９２．５／２．５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）で、３時間、室温で処理し、側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを切断した。次いで、濾過によって集めた冷エーテルから、粗製のペプチドを沈殿させ、高圧中で乾燥させた。収量：１．１５ｇ（１１６％）。

【0793】

ペプチドの全ての粗生成物を、２インチのＣ１８カラムで、ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ａ、水中０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、アセトニトリル）を用いて精製した。純度９５％超のプールされた画分を乾燥させるために凍結乾燥した。８４ｍｇの最終ペプチドを得た（ＴＦＡ塩）。ＭＳ：９９１．６［Ｍ＋Ｈ］^＋、ＨＰＬＣ 保持時間９．４９分（方法：流量１．２ｍＬ／分；緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ；室温；カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｃ１８、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５マイクロ；勾配（直線状）２０分で１５％〜３５％の緩衝液Ｂ；注入体積０．０２ｍＬ）

【0794】

実施例２７：アグーチに関するタンパク質（ＡｇＲＰ）−脂肪酸コンジュゲート
ＡｇＲＰ（８３−１３２）−ＦＡコンジュゲート

【0795】

実施例２７Ａ：ＡｇＲＰのモノ脂肪酸コンジュゲート（ＡｇＲＰ＋１ＦＡ）、ここで、脂肪酸は、リンカー（ＰＥＧ）を介してＡｇＲＰのＮ末端に結合している。

【0796】

【化141】

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ここで、ＡｇＲＰ（８３−１３２）は以下の配列を有する：
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ；これは、Ｃ８７とＣ１０２、Ｃ９４とＣ１０８、Ｃ１０１とＣ１１９、Ｃ１０５とＣ１２９、Ｃ１１０とＣ１１７の架橋の位置に、５ジスルフィド架橋を含有する。

【0797】

実施例２７Ｂ：ＡｇＲＰ（８３−１３２）のジ脂肪酸コンジュゲート（ＡｇＲＰ＋２ＦＡ）、ここで、１つの脂肪酸は、リンカー（ＰＥＧ）を介してＡｇＲＰのＮ末端（すなわち、セリン８３）に結合しており、他方の脂肪酸は、ＰＥＧリンカーを介して位置１２１のリシンの側鎖に結合している。

【0798】

ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液（９ｍｇ、１．５８５μｍｏｌ）中０．９０ｍｌのＡｇＲＰ（８３−１３２）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）から入手可能）に、０．８０ｍｌのｐＨ＝４．４３酢酸緩衝液を加え、続いて、Ｈ_２Ｏ中１．３ｍｌのＩ−３７の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（１３ｍｇ、７．７９μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間撹拌した。ＨＲＭＳ（ＱＴ２）により、１．８９分で、ＡｇＲＰ＋１ＦＡ、ｍ／ｚ ７２２６．３［Ｍ＋Ｈ］^＋、および２．４１分で、ＡｇＲＰ＋２ＦＡ、ｍ／ｚ ８７７８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋の両方の存在が示された。反応液を、４．５μｍのフリットを通して濾過し、上記のように稼働された第２の反応液（０．８８１μｍｏｌのＡｇＲＰ、２．６４μｍｏｌ Ｉ−３７）と合わせ、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４カラム、３００オングストローム、５ｕｍ、１０×２５０ｍｍ；移動相：水中２０〜８０％のＡＣＮ、１１分の勾配、１０ｍＬ／分、０．１％ＴＦＡで改変；稼働時間：１５分；画分収集：ＵＶ ２１０ｎｍ）で精製した。ＡｇＲＰ＋１ＦＡおよびＡｇＲＰ＋２ＦＡに相当する画分を単離し、冷凍し、凍結乾燥して、ＡｇＲＰ＋１ＦＡ（２７Ａ）およびＡｇＲＰ＋２ＦＡ（２７Ｂ）のＴＦＡ塩を白色の固体（３．２４ｍｇ、１６％のＡｇＲＰ＋１ＦＡ；２．２６ｍｇ、９％のＡｇＲＰ＋２ＦＡ）を得た。ＬＣＭＳ−分析方法Ｇ：（ＡｇＲＰ＋１ＦＡ）Ｒｔ＝１．９１分、ＭＳ ｍ／ｚ ７２２６．４［Ｍ＋Ｈ］^＋；（ＡｇＲＰ＋２ＦＡ）Ｒｔ＝２．４３分、ＭＳ ｍ／ｚ ８７７８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0799】

脂肪酸の結合位置を判定するための標識化実験
Ｎ末端Ｓｅｒ残基の標識化を、製造業者のプロトコルに従って、反応混合物を、Ａｓｐ−Ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化することによって確認した。全てのペプチドマッピングアッセイを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とライゲーションしたＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＬＣを使用して達成した。４０℃に保ったＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）で、分離を行った。流量は、移動相Ａとして、水中０．１％ＦＡ、移動相Ｂとして、アセトニトリル中０．１％ＦＡで０．１ｍＬ／分であった。

【0800】

Ａｓｐ−Ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ パート番号Ｖ１６２Ａ）の溶液を、２０ｕＬのＨＰＬＣ／ＭＳ水（０．１μｇ／μＬ）中で再構成した。およそ１０μｇのサンプルを、６Ｍの尿素、１０ｍＭのジチオトレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）中最終体積２５μＬまで希釈した。還元およびアルキル化後、５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）を用いて、溶液を６倍に希釈し、次いで、追加の１マイクログラムのＡｓｐ−Ｎを用いて、タンパク質分解を行った。セ氏３７度で、消化は終夜起こった。ＬＣＭＳ分析により、以下の表に示されたように、各断片に１つの追加の脂肪酸を付加することで、野生型ＡｇＲＰおよび修飾ＡｇＲＰのＮ末端Ｄ位で切断が起こったことが示された。

【0801】

【表45】

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【0802】

実施例２８（２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃ）は、ｈＦＧＦ２３変異体のコンジュゲートに関する。
使用されたＦＧＦ２３変異体
この実施例で、「ｈＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）」、「「ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９」」または単に「ｈＦＧＦ２３」として使用され、示されるヒトＦＧＦ２３変異体の配列は、配列番号１０で提供される。このＦＧＦ２３変異体は、シグナルペプチドを欠いているが、１位に修復されたＭを有し、Ｒ１７９（Ｒ１７９Ｑ）に突然変異を有する。本明細書に記載された脂肪酸を含むコンジュゲートは、このＦＧＦ２３ペプチド（実施例２８Ｃ）で調製され、表８において、少なくとも１つのＦＧＦ２３活性を保持することが示された。ヒトＦＧＦ２３の２種の他の変異体も、この実施例（実施例２８Ａおよび２８Ｂ）で使用され、本明細書で開示された脂肪酸とコンジュゲートを構築した。配列番号１０のペプチドのように、これらはＦＧＦ２３シグナルペプチドを欠き、Ｒ１７９に突然変異を有するが、１つまたは複数のさらなる突然変異を有し、少なくとも１つのＦＧＦ２３活性を保持する。これら２種のＦＧＦ２３変異体は、「ｈＦＧＦ２３−変異体」または「ＦＧＦ２３変異体」などとしてこの実施例で使用され、両方が示される。

【0803】

本明細書で記載されたコンジュゲートを生成するための方法は、ＦＧＦ２３、またはそのホモログ、変異体、断片、もしくは修飾形態を含む他のＦＧＦ２３ペプチドを用いて使用され得る。

【0804】

ＦＧＦ２３変異体生成のためのプロトコル
形質転換
ｈＦＧＦ２３（Ｒ１７９）ポリペプチドを、ｐＥＴ２８ｃ−ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９Ｑ発現プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に一過性導入し、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、ＳＯＣ培地を加え、３７℃のシェーカーで１時間細菌をインキュベートすることによって作製した。その後、細菌培養物を、カナマイシンを含有するＬＢプレートに広げ、３７℃で終夜インキュベートした。単離したコロニーを、カナマイシンを含有するＬＢ培地に移し、３７℃で振盪しながら終夜インキュベートし、２５ｍＬのアリコートを、カナマイシンを含有する新しいＬＢ培地に移し、３７℃で約２．５時間振盪した。細胞が充分な密度（ＯＤ約０．６）となったら、１ＭのＩＰＴＧを、３７℃で振盪を続けながら、各培地に加え、ポリペプチドの発現を誘導した。４時間後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、細胞をペレット化し、ペレットを−２０℃で冷凍した。次に、ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に再懸濁させ、細胞をマイクロフルイダー（microfluider）を使用して溶解させた。１００ｍＬの溶解ミックス当たり１０ｍｇのリゾチームおよび１０μＬのＤＮａｓｅ（１ｍＬ当たり１単位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、室温で３０分間インキュベートし、次いで、８０００ｒｐｍで、４℃で、２０分間遠心沈殿させ、１００ｍＬの溶解緩衝液と回転を３回変え、４回目にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００なしの溶解緩衝液で洗浄した。最終回転からのペレット（封入体の）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、６Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＤＴＴに直ちに可溶化させ、タンパク質濃度を判定し、リフォールディング前に１ｍｇ／ｍｌに調整した。

【0805】

タンパク質のリフォールディング：
タンパク質をリフォールディングするために、３６８ｍｇの還元グルタチオン（ＧＳＳＨ）と７４ｍｇの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）をそれぞれ４００ｍｌの可溶化封入体に加えた。タンパク質を、４Ｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）および２５０ｍＭのアルギニンに対して、４℃で終夜透析した。次いで、２Ｌの透析緩衝液を除去し、２Ｌの水で置き換え、もう８時間透析を継続した。次いで、透析緩衝液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのアルギニンに代えて、透析を終夜継続した。

【0806】

タンパク質の精製：
タンパク質を精製するために、透析された混合物を、１２０００ｒｐｍで３０分間回転させ、最終の透析緩衝液で平衡化されたヘパリン−セファロースカラムに導入し、カラムをベッドボリュームの２０倍の１×ＰＢＳで洗浄した。リフォールディングされたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを補充した１×ＰＢＳで溶出し、タンパク質の精製をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって評価し、タンパク質濃度を２８０ｎｍ波長におけるＯＤによって測定した。

【0807】

実施例２８Ａ：ｈＦＧＦ２３変異体と脂肪酸のコンジュゲーション

【0808】

【化142】

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ここで、ｈＦＧＦ２３変異体−ＮＨ_２−における−ＮＨ_２は、リシン残基のアミノ官能基を意味する。

【0809】

ステップ１：中間体２８ａ

【0810】

【化143】

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２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−アミノ−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．５ｇ、１．３２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（体積：９．９６ｍｌ）に溶解させ、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（０．５０３ｍｌ、２．１２０ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＩＰＥＡ（０．２７４ｇ、２．１２０ｍｍｏｌ）を混合物に加え、反応液を室温で２時間撹拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、所望の生成物の形成とＺＱ−ＮＨＳ出発材料の消費が示された（方法Ａ、Ｒ_ｔ＝０．９８分、Ｍ＋Ｈ ５１１．４）。反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に注ぎ、冷水で洗浄した（３×５０ｍＬ）。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、１．１４ｇの黄色の油状物を得た。ＬＣＭＳ分析により、所望の生成物の存在が示された（方法Ｍ、Ｒｔ＝１．８２分、Ｍ＋Ｈ ５１１．４、１．１４ｇ）。材料を、さらに精製することなく次のステップに持ち越した。

【0811】

ステップ２：中間体２８ｂ、ベンジル（５−アミノ−１−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１，５−ジオキソペンタン−２−イル）カルバメート

【0812】

【化144】

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トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ、２．２３３ｍｍｏｌ）を中間体２８ａ（１．１４ｇ、２．２３３ｍｍｏｌ）に加え、室温で約１時間撹拌した。ＬＣＭＳ分析により、出発材料の、所望の生成物への完全な変換が示された（方法Ａ、Ｒ_ｔ＝０．５６分、Ｍ＋Ｈ ４１１．３）。反応混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶かし、油状物になるまで２回濃縮した。油状物を、１ｍＬのＡＣＮおよび１ｍＬのＭｅＯＨで希釈し、ＭＳ起動式ＨＰＬＣによって精製した（方法Ｎ）。所望の質量を有する画分をプールし、冷凍し、凍結乾燥して、中間体２８ｂを白色の粉末として得た（方法Ｏ、Ｒ_ｔ＝０．２２分、Ｍ＋Ｈ ４１１．３、１６０ｍｇ、１８％）。

【0813】

ステップ３：中間体２８ｃ
中間体２８ｂ（１６．６９ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中中間体３７（５０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。３滴のＤＩＰＥＡを加え、反応液を室温で２時間撹拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、生成物への完全な変換が示された（方法Ｂ、Ｒ_ｔ＝１．２２分、Ｍ＋Ｈ＋２／２ ９８２．９）。反応混合物を、逆相クロマトグラフィー用の２０ｇのＣ−１８カラムに導入した。２０分間をかけて、１００％の水（０．１％ＴＦＡ）〜１００％のＭｅＣＮへの溶媒の勾配を使用して、画分を集め、ＬＣＭＳによって分析した。所望の質量を有する画分を合わせ、冷凍し、終夜凍結乾燥させて、中間体２８ｃを、透明無色の油状物として得た（方法Ｃ、Ｒ_ｔ＝１．２１分、Ｍ＋Ｈ＋２／２ ９８２．９、Ｍ＋Ｈ＋３／３ ６５５．５、１５．３ｍｇ、２６％）。^１Ｈ−ＮＭＲにより、６．２９ｐｐｍで形成されたアミド結合の存在（１Ｈ、ｂｒ ｍ）が示されると、暫定的に解釈される。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.52 (s, 1H), 7.35 (d, J = 3.3 Hz, 5H), 5.10 (s, 2H), 4.30 (s, 1H), 3.77 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.69 - 3.49 (m, 94H), 3.46 (s, 4H), 2.59 (s, 3H), 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 25H), 2.08 - 1.94 (m, 4H), 1.79 - 1.65 (m, 2H), 1.65 - 1.52 (m, 2H), 1.40 - 1.06 (m, 31H), 0.94 - 0.82 (m, 3H).

【0814】

【化145】

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【0815】

ステップ４：ｈＦＧＦ２３変異体＋中間体２８ｃ
このステップのために、シグナルペプチドを欠くが、配列番号８に対して１つまたは複数の突然変異を有し、少なくとも１つのＦＧＦ２３活性を保持する、ヒトＦＧＦ２３（ｈＦＧＦ２３）変異体（「ｈＦＧＦ２３変異体」を使用し、ここで「ＦＧＦ２３変異体−ＮＨ_２」における「−ＮＨ_２」は、リシン残基のアミノ官能基を示す。

【0816】

３０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）中ＴＧａｓｅの５０ｍｇ／ｍＬ溶液と、３０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中中間体２８ｃの８ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＭＥＳ（ｐＨ６）中で、脂肪酸溶液は濁った。ｈＦＧＦ２３変異体（３０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）中０．３ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｌ、０．０８８μｌ）に、中間体２８ｃ（２１７μｌ、０．８８３μｍｏｌ）、続いてＴＧａｓｅ（３３．５μｌ、０．０４４μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１８時間混合し、追加の２１７μＬの中間体２８ｃを加えた。反応液を室温で１８時間混合し、追加の２１７μＬの中間体２８ｃを加えた。反応液を室温で１８時間混合し、追加の１０８．５μＬの中間体２８ｃを加えた。反応液を室温で４時間混合し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、出発材料の完全な変換が示された（方法Ｐ、Ｒ_ｔ＝１．５５分、Ｍ＋Ｈ ２７４３２）。反応混合物を、２つの４ｍＬの１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器に分割し、緩衝液を、３回、３０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）と交換し、次いで、１．５ｍＬまで濃縮した。材料を冷蔵庫に終夜保存した。一部の固体が、チューブの底に沈降した。上清の濃縮物は、０．４３ｍｇ／ｍＬ（２７％）であることが、Ａ２８０（１８７３０ｃｍ−１Ｍ−１、２５４８５ｇ／ｍｏｌ）によって測定された。

【0817】

実施例２８Ｂ：ｈＦＧＦ２３変異体のＺＱＧ−ＰＥＧ１１−脂肪酸とのコンジュゲーション
この実施例では、脂肪酸と、シグナルペプチドを欠き、配列番号８に対して１つまたは複数の突然変異を有するが、変異体が、少なくとも１つのＦＧＦ２３活性を保持するＦＧＦ２３変異体とを含むコンジュゲートが調製された。

【0818】

【化146】

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ここで、ｈＦＧＦ２３変異体−ＮＨ_２における−ＮＨ_２は、リシン残基のアミノ官能基を意味する。

【0819】

中間体２５ｄの８ｍｇ／ｍＬ溶液を、１００ｍＭのｐＨ８のトリス緩衝液中で調製した。ＴＧａｓｅの５０ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｈ_２Ｏ中で調製した。ｈＦＧＦ２３変異体の溶液（６．５ｍＬ、０．０９０μｍｏｌ）の溶液に、中間体２５ｄ（０．２０７ｍＬ、１．３４３μｍｏｌ）、続いてＴＧａｓｅ（０．１３６ｍＬ、０．１７９μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３日間混合し、＋１種への９０％の変換が観察された（ＬＣＭＳ 方法Ｑ、Ｒ_ｔ＝７．２４分、Ｍ＋Ｈ ２６６１６）。反応混合物を、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器を使用して、反応液を、６回、希釈および２ｍＬの体積まで濃縮することによって、ＰＢＳ １×緩衝液に交換した。濃縮物は、０．１２５ｍｇ／ｍＬであることがＡ２８０（１８７３０ｃｍ−１Ｍ−１、２６６１７ｇ／ｍｏｌ）によって測定された（ＬＣＭＳ 方法Ｑ、Ｒ_ｔ＝７．２４分、Ｍ＋Ｈ ２６６１６）。

【0820】

実施例２８Ｃ：ｈ−ＦＧＦ２３ Ｒ１７９＋ＺＱＧ−ＰＥＧ１１−脂肪酸のコンジュゲーション
この実施例では、ＦＧＦ２３変異体「ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９」を使用して、コンジュゲートが調製された。これは、シグナルペプチドを欠き、Ｒ１７９に突然変異を有する。配列は、配列番号１０として提供されている。
計算質量値：２５４６３

【0821】

中間体２５ｄの８ｍｇ／ｍＬ溶液を、１００ｍＭのｐＨ８のトリス緩衝液中で調製した。ＴＧａｓｅの５０ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｈ_２Ｏ中で調製した。ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９の溶液（２．５０Ｅ＋０４μｌ、０．３９３μｍｏｌ）の溶液に、中間体２５ｄ（７５０μｌ、４．８７μｍｏｌ）、続いてＴＧａｓｅ（５９７μｌ、０．７８５μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２日間混合し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、出発材料の完全な変換が示された（方法Ｐ、Ｒ_ｔ＝１．５８分、Ｍ＋Ｈ ２６６７４）。反応混合物を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製して、＋１コンジュゲートを得た（方法Ｒ、Ｒ_ｔ＝３．８７分、Ｍ＋Ｈ ２６６７４）：

【0822】

【化147】

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ここで、ｈＦＧＦ２３ Ｒ１７９−ＮＨ_２における−ＮＨ_２は、リシン残基のアミノ官能基を意味する。

【0823】

実施例２９Ａおよび２９Ｂは、セレラキシンのコンジュゲートに関する。

【0824】

実施例２９Ａ：セレラキシン−脂肪酸コンジュゲート（＋１脂肪酸コンジュゲート）

【0825】

【化148】

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セレラキシン＋ＺＱＧ−ＰＥＧ_１１−脂肪酸（実施例２５ｄ）：
セレラキシン配列：
ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳＣＦＲＡＬＳＲＫＴＣＧＶＨＣＣＫＮＡＬＡＳＹＬＥ；
「セレラキシン−ＮＨ２」における−ＮＨ２は、以下のマッピング実験によって明らかにされたリシンＫ１７の側鎖における反応性アミノ官能基を意味する；分子量 ５９６３ｇ／ｍｏｌ。

【0826】

ＺＱＧ−ＰＥＧ_１１−脂肪酸（実施例２５ｄ）の８ｍｇ／ｍＬ溶液を、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）中で調製した。ＴＧａｓｅの５０ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｈ_２Ｏ中で調製した。１００ｍＭのトリス（ｐＨ８）中セレラキシン（２１１μＬ、０．１６８μｍｏｌ）の溶液（１．０１８ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ反応液）に、実施例２５ｄ（５１６μｌ、３．３５μｍｏｌ）、続いてｍＴＧａｓｅ（味の素、２５５μｌ、０．３３５μｍｏｌ）を加えた。反応液を３７℃で３日間混合し、次いで、追加の１００μＬのＺＱＧ−ＰＥＧ_１１−脂肪酸を加えた。反応液を３７℃で１８時間混合し、次いで、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器を使用して、反応液を、５回、希釈および０．７ｍＬの体積まで濃縮することによって、ＰＢＳ １×緩衝液に交換した。材料を、方法Ｋにより精製して、所望の材料を有する画分をプールし、冷凍し、凍結乾燥させて、白色の粉末を得た。材料を１ｍＬの３０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）に溶解させ、濃縮物は、０．２５ｍｇ／ｍＬ（２５％）であることが、Ａ２８０（５９６９ｃｍ−１Ｍ−１、７１７８ｇ／ｍｏｌ）によって測定された。ＬＣＭＳ方法Ｌ：Ｒ_ｔ＝１．６５分；ＭＳ［Ｍ＋１＋１ＦＡ］：実測値：７１８０、計算値：７１７８。

【0827】

セレラキシンマッピングのための実験手順
サンプルのタンパク質分解
およそ１０μｇのタンパク質を、最終体積２５μＬの６Ｍの尿素、１０ｍＭのジチオトレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）に溶解させ、３７℃で１時間維持して、ジスルフィド結合を還元した。ヨードアセトアミド（５００ｍＭ、１ｕＬ）を加え、遊離チオールをアルキル化し、溶液を、暗所で１時間、室温で静置させた。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）で溶液を６倍に希釈し、ＬｙｓＣ（１ｕｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｖ１０７Ａ）を加え、溶液を３７℃で終夜維持して、タンパク質を消化した。ギ酸（９８％、２ｕＬ）を加え、タンパク質分解を失活させ、得られたペプチド混合物を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。

【0828】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ペプチドマッピングを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とライゲーションしたＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＨＰＬＣを使用して行った。ＭＳは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｍｐａｓｓ ｖ．１．７およびＢｒｕｋｅｒ ｏｔｏｆＣｏｎｔｒｏｌ ｖ．３．４ソフトウェアを使用して制御し、機器パラメータは以下のように設定した：質量範囲 ３００〜２，０００Ｄａ；スプレー電圧値 ４．０ｋＶ；昇温キャピラリー ２００℃；乾燥ガス流 ５．０Ｌ／分。画分化は、４０℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を用いて行った。移動相は、それぞれ、水中０．１％ギ酸とアセトニトリルであり、流量は１００ｕＬ／分であった。使用された勾配は、０〜２分、２％のＢ；２〜３分、２％〜８％のＢ；３〜１０分、８％〜２９％のＢ；１０〜１４分、２９％〜３３％のＢ；１４〜１６分、３３％〜３７％のＢ；１６〜２０分、３７％〜７３％のＢ；２０〜２２分、７３％〜９５％のＢ；２２〜２５分、９５％のＢ；２５〜２６分、９５％〜２％のＢ；２６〜３０分、２％のＢ。データ処理は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ．４．２を使用して行った。

【0829】

マッピング実験により、セレラキシンへの脂肪酸の付加は、［ＣＣＨＶＧＣＴＫ_１７（ｆａ）ＲＳＬＡＲＦＣ−２Ｈ_２Ｏ］として割り当てられたペプチドに対してリシンＫ１７で最初に起こり、質量：３０８８．５６Ｄａ、電荷：５、Ｒｔ＝１３．４分、実測値 ｍ／ｚ ６１８．７１、予測値 ｍ／ｚ ６１８．７２であることが示された。

【0830】

実施例２９Ｂ：セレラキシン−脂肪酸コンジュゲート（以下に記載された＋１ＦＡ、＋２ＦＡおよび＋３ＦＡコンジュゲートの混合物）

【0831】

【化149】

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ここで、「セレラキシン−ＮＨ_２」における−ＮＨ_２は、リシンの側鎖における反応性アミノ官能基を意味する。

【0832】

【表46】

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配列：
ＤＳＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳＣＦＲＡＬＳＲＫＴＣＧＶＨＣＣＫＮＡＬＡＳＹＬｐＥ

【0833】

脂肪酸中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｈ_２Ｏ中で調製した。３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）（７５５μＬ）中セレラキシンの溶液（１０５μＬ、０．０８４μｍｏｌ、４．７５ｍｇ／ｍＬ）に、脂肪酸中間体３７（１４０μＬ、０．８３９μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、出発材料の９０％の変換が示された。追加の７０μＬの中間体３７を加え、反応液を室温で１６時間混合し、この時点で、ＭＡＬＤＩ分析により、９５％超の変換が示された。溶液を、３ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器を使用して、反応液を、４回、希釈および０．２ｍＬの体積まで濃縮することによって、ＰＢＳ １×緩衝液に交換した。濃縮物は、２．６１ｍｇ／ｍＬであることが、Ａ_２８０（５９６９Ｍ−１ｃｍ−１、９０６８ｇ／ｍｏｌ）によって測定された。ＬＣＭＳ 方法Ｌ：Ｒ_ｔ＝１．５６分；ＭＳ［Ｍ＋１＋１ＦＡ］：実測値：７５１６、計算値：７５１７；Ｒ_ｔ＝１．６５分；ＭＳ［Ｍ＋１＋２ＦＡ］：実測値：９０６９、計算値：９０７１；Ｒ_ｔ＝１．７４分；ＭＳ［Ｍ＋１＋３ＦＡ］：実測値：１０６２２、計算値：１０６２５。

【0834】

実施例３０：Ｍ−Ｈｉｓ−ｆＰＩＰの脂肪酸構築物（Ｉ−３７）とのコンジュゲーション−（以下に記載する＋１ＦＡコンジュゲート、および＋２ＦＡコンジュゲートの混合物）
Ｍ−Ｈｉｓ−ｈＰＩＰ（２９−１４６）配列：
ＭＨＨＨＨＨＨＱＤＮＴＲＫＩＩＩＫＮＦＤＩＰＫＳＶＲＰＮＤＥＶＴＡＶＬＡＶＱＴＥＬＫＥＣＭＶＶＫＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＫＹＴＡＣＬＣＤＤＮＰＫＴＦＹＷＤＦＹＴＮＲＴＶＱＩＡＡＶＶＤＶＩＲＥＬＧＩＣＰＤＤＡＡＶＩＰＩＫＮＮＲＦＹＴＩＥＩＬＫＶＥ （配列番号１３）

【0835】

発現形態
発現されたタンパク質の配列：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＭＨＨＨＨＨＨＱＤＮＴＲＫＩＩＩＫＮＦＤＩＰＫＳＶＲＰＮＤＥＶＴＡＶＬＡＶＱＴＥＬＫＥＣＭＶＶＫＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＫＹＴＡＣＬＣＤＤＮＰＫＴＦＹＷＤＦＹＴＮＲＴＶＱＩＡＡＶＶＤＶＩＲＥＬＧＩＣＰＤＤＡＡＶＩＰＩＫＮＮＲＦＹＴＩＥＩＬＫＶＥ

【0836】

ヌクレオチド配列：
ＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＡＣＣＧＧＴＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＧＡＴＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＡＴＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣ

【0837】

ＰＩＰ発現ベクター：
ヒトＰＩＰをコードする哺乳動物発現ベクターを、標準のクローニング方法によって生成した。マウスＩｇκ鎖シグナル配列、続いて、ＭＨＨＨＨＨ配列、次いで、５’−Ｎｈｅｌを有する成熟ＰＩＰ（続いて、Ｋｏｚａｋ配列）および３’−ＥｃｏＲＩ部位を含有する断片をコドン最適化され、合成された（ＤＮＡ２．０）。次いで、この配列は、ＣＭＶプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をベースとするベクターのユニークな５’−Ｎｈｅｌおよび３’−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。

【0838】

ＰＩＰ発現および精製：
ＰＩＰ発現プラスミドＤＮＡは、標準のポリエチレンイミン方法を使用して、１ｍｌ当たり１×１０^６個の細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、８％のＣＯ_２の湿気のある環境で、３７℃で４日間増殖させた。ＰＩＰタンパク質を、清澄な馴化培地から精製した。

【0839】

【化150】

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ここで、Ｍ−Ｈｉｓ−ＰＩＰは、配列番号１２を有し、「Ｍ−ｈｉｓ」はＭＨＨＨＨＨＨである。

【0840】

コンジュゲーション：
脂肪酸−リンカー構築物番号１の１０ｍｇ／ｍＬ溶液をＨ_２Ｏ中で調製した。Ｍ−Ｈｉｓ−ｈＰＩＰ（０．７００ｍＬ、０．０４８μｍｏｌ）を、３０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）（６１９μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ反応液）で希釈し、中間体３７（０．０８１ｍＬ、０．４８４μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１８時間混合し、この時点で、ＬＣＭＳ分析により、＋１（５０％）および＋２（２０％）生成物への７０％の変換が示された。次いで、材料を、３ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離器を使用して、反応液を、５回、希釈および３５０μＬの体積まで濃縮することによって、ＰＢＳ １×緩衝液に交換した。濃縮物は、１．７ｍｇ／ｍＬ（７０％）であることが、Ａ_２８０（１３８５０ｃｍ−１Ｍ−１、１４４７２ｇ／ｍｏｌ）によって測定された。ＬＣＭＳ 方法Ｌ：Ｒ_ｔ＝１．４６分；ＭＳ［Ｍ＋１］：実測値：１４４７２、計算値：１４４７６。Ｒ_ｔ＝１．５７分；ＭＳ［Ｍ＋１＋脱グリコシル化した１ＦＡ］：実測値：１６０２５、計算値：１６０３０。Ｒ_ｔ＝１．６９分；ＭＳ［Ｍ＋１＋脱グリコシル化した２ＦＡ］：実測値：１７５７８、計算値：１７５８４。

【0841】

【表47】

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【0842】

ＰＩＰマッピングのための実験手順
サンプルのタンパク質分解
およそ１０μｇのタンパク質を、最終体積２５μＬの６Ｍの尿素、１０ｍＭのジチオトレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）に溶解させ、３７℃で１時間維持して、ジスルフィド結合を還元した。ヨードアセトアミド（５００ｍＭ、１ｕＬ）を加え、遊離チオールをアルキル化し、溶液を、暗所で１時間、室温で静置させた。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ＿ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）で溶液を６倍に希釈し、ＬｙｓＣ（１ｕｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）またはトリプシン／Ｌｙｓ Ｃミックス（１ｕｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、溶液を３７℃で終夜維持して、タンパク質を消化した。ギ酸（９８％、２ｕＬ）を加え、タンパク質分解を失活させ、得られたペプチド混合物を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。

【0843】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ペプチドマッピングを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とライゲーションしたＴｈｅｒｍｏ Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＨＰＬＣを使用して行った。ＭＳは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｍｐａｓｓ ｖ．１．７およびＢｒｕｋｅｒ ｏｔｏｆＣｏｎｔｒｏｌ ｖ．３．４ソフトウェアを使用して制御し、機器パラメータは以下のように設定した：質量範囲 ３００〜２，０００Ｄａ；スプレー電圧値 ４．０ｋＶ；昇温キャピラリー ２００℃；乾燥ガス流 ５．０Ｌ／分。画分化は、４０℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を用いて行った。移動相は、それぞれ、水中０．１％ギ酸とアセトニトリルであり、流量は１００ｕＬ／分であった。使用された勾配は、０〜２分、２％のＢ；２〜３分、２％〜８％のＢ；３〜１０分、８％〜２９％のＢ；１０〜１４分、２９％〜３３％のＢ；１４〜１６分、３３％〜３７％のＢ；１６〜２０分、３７％〜７３％のＢ；２０〜２２分、７３％〜９５％のＢ；２２〜２５分、９５％のＢ；２５〜２６分、９５％〜２％のＢ；２６〜３０分、２％のＢであった。データ処理は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ．４．２を使用して行った。

【0844】

マッピング実験により、ＭＨ_６−ＰＩＰへの脂肪酸の付加は、［ｆａ−ＭＨＨＨＨＨＨＱＤＮＴＲＫ］によって明らかにされたように、Ｎ末端で優先的に起こり、質量：３２６５．７６Ｄａ、電荷：４、Ｒｔ＝２３．４分、実測値 ｍ／ｚ ８１７．４４、予測値 ｍ／ｚ ８１７．４５であることが示された。

【0845】

わずかな程度の脂肪酸の付加が、ペプチド断片［ＳＶＲＰＮＤＥＶＴＡＶＬＡＶＱＴＥＬＫ（ｆａ）ＥＣＭＶＶＫ］によって明らかにされたように、リシンＫ４２において起こる、質量：４３６６．４５Ｄａ、電荷：３、Ｒｔ＝２３．５分、実測値 ｍ／ｚ １４５６．４９、予測値 ｍ／ｚ １４５６．４９．Ｋ４２における脂肪酸の付加により、このリシンに近接したトリプシン切断をブロックし、付加の位置を確認させる。

【0846】

実施例３１：クリック化学を使用するＮＰＦＦの脂肪酸とのコンジュゲーション

【0847】

【化151】

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ステップ１：ＮＰＦＦクリック化学ハンドルの調製

【0848】

【化152】

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計算値 ＭＨ＋ １２５８．８
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中ＮＰＦＦ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｊ６６５０９、５ｍｇ、３．８２μｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（５．３２μｌ、０．０３８ｍｍｏｌ）、次いで（１Ｒ，８Ｓ，９ｒ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−０−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（１．３３５ｍｇ、４．５８μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。完了後、反応混合物を、次の反応ステップへの粗製物として得た。

【0849】

ステップ２：コンジュゲーション
ステップ１からの粗製反応混合物に、中間体６（Ｉ−６）を加えた。反応混合物を室温で振盪した。完了後、反応混合物を、逆相クロマトグラフィー（システム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｎｅｒｔ ＳｙｓｔｅｍＤａｔｅ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ カラム、３００オングストローム、５ｕｍ、１０×２５０ｍｍ；ＵＰＬＣ方法開発のためのカラムは、ＢＥＨ Ｃ４ｍ、３００Ａ、１．７ｕｍ、２．１×５０ｍｍ；移動相：６分で４６〜５６％のＡＣＮの勾配、０．１％ＴＦＡＡでの改変：水、Ｂ：アセトニトリル；流量：２．０ｍＬ／分；稼働時間：１５分；画分収集：ＵＶ ２１０ｎｍ）を使用して精製して、表題化合物、すなわちＴＦＡ塩としての白色の固体を得た；ＬＣＭＳ：方法Ｓ：ＥＬＳＤ：Ｒｔ １．４６分；ＭＳ ｍ／ｚ ９２８．３［（Ｍ／３）^＋Ｈ］^＋

【0850】

本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートされていない生体分子と同様の、または改良された効果を有するが、さらに、本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートされていない生体分子と比較して改良されたプラズマ安定性を有することを示すことができる。上記実施例におけるコンジュゲートは、５時間超、１０時間超、２０時間超、３０時間超、４０時間超、一部の場合には５０時間超のプラズマ安定性を有することが見出された。

【0851】

本発明の例示的実施形態でこのように記載されたことについて、当業者は、開示の範囲は例示的であるにすぎず、様々な他の代替、改変、および修飾が、本発明の範囲内でなされてもよいことに留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書に例示される特定の実施形態に限定されない。

本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］ リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、
前記脂肪酸は、次式Ａ１、Ａ２、またはＡ３：

【化153-1】

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［Ｒ¹は、ＣＯ₂ＨまたはＨであり、
Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ₂、または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分枝状Ｃ₆〜Ｃ₃₀アルキレンであり、
ｎ、ｍ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］を有する、
コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［２］ 前記脂肪酸が

【化153-2】

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［式中、Ａｋ³、Ａｋ⁴、Ａｋ⁵、Ａｋ⁶、およびＡｋ⁷は、独立して、（Ｃ₈〜₂₀）アルキレンであり、Ｒ⁵およびＲ⁶は、独立して、（Ｃ₈〜₂₀）アルキルである］から選択される、上記［１］に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［３］ 前記脂肪酸が

【化153-3】

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［式中、Ａｋ₂は、線状Ｃ₈〜Ｃ₂₀アルキレンである］から選択される、上記［１］または［２］に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［４］ 前記リンカーが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、１つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および／または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および／もしくは前記脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−、もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結している、上記［１］、［２］、または［３］に記載のコンジュゲート。
［５］ 前記リンカーが、式：

【化153-4】

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［式中、ｙは、０〜３４である］の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［６］ 前記リンカーが、次式のヘテロ環部分：

【化153-5】

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［式中、ｒは、０〜２の整数であり、ｓは、０〜３の整数である］を含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［７］ 前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［８］ 前記生体分子が、１）ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態またはその二量体、２）ＡＰＪアゴニストペプチド、３）オキシトシン受容体アゴニストペプチド、４）セレラキシン、５）ＮＰＦＦ、６）ＰＩＰペプチド、７）ＦＧＦ２３ペプチド ８）ＡｇＲＰペプチド、および９）ｓｉＲＮＡから選択される、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［９］ 前記脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生体分子が、次式：

【化153-6】

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［式ＣおよびＤにおいて、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊の両方のモノマー単位は、両方のＮ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］、または

【化153-7】

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［式ＥおよびＦにおいて、ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５またはｈＧＤＦ１５＊のモノマー単位の一方だけが、Ｎ末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている］の１つを有し、
ｈＧＤＦ１５＊は、Ｎ末端にある２または３つのアミノ酸がアミノ酸配列ＸＨ−またはＸＨＸ’−［Ｈは、ヒスチジンであり、ＸおよびＸ’は、ＭおよびＡから独立して選択される］でそれぞれ置き換えられているｈＧＤＦ１５であり、
ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５は、１〜６つのヒスチジンアミノ酸と、場合により１または２つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのＮ末端に付加されているｈＧＤＦ１５であり、
ｓは、２０〜３０の間の整数であり、
ｈｉｓ−ｈＤＧＦ１５の２つのモノマー単位間、またはｈＧＤＦ１５＊の２つのモノマー単位間の線は、ジスルフィド結合を表す、上記［１］または［２］に記載のコンジュゲート。
［１０］ 式Ｃを有する上記［９］に記載のコンジュゲートと式Ｅを有する上記［９］に記載のコンジュゲートとを含む混合物、または式Ｄを有する上記［９］に記載のコンジュゲートと式Ｆを有する上記［９］に記載のコンジュゲートとを含む混合物。
［１１］ 前記生体分子が、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、もしくはＡＨ（１９９−３０８）ＧＤＦ１５、またはその二量体である、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１２］ 脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生体分子が、式Ｇまたは式Ｈのものである、上記［９］または［１１］に記載のコンジュゲート

【化153-8】

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［式中、ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５は、配列番号７であり、前記脂肪酸は、２つのモノマー単位の一方または両方のＮ末端において、リンカーを介して連結しており、２つのＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５単位間の線は、ジスルフィド結合を表す］。
［１３］ 式Ｇを有する上記［１２］に記載のコンジュゲートと式Ｈを有する上記［１２］に記載のコンジュゲートとを含む混合物。
［１４］ 前記脂肪酸部分が、前記ペプチドまたはタンパク質のＮ末端にリンカーを介して付着している、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［１５］ １０時間を超える、２０時間を超える、または３０時間を超える血漿安定性半減期を有する、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１６］ コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向上が、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または７５倍である、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
［１７］ 代謝性障害または疾患、すなわち、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含める）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害から選択される疾患または障害を、それを必要とする対象において治療または予防する方法であって、上記［１］から［９］、［１１］、［１２］、および［１４］から［１６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記［１０］または［１３］に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、方法。
［１８］ ＧＤＦ１５突然変異体が、ＭＨ（１９９−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＭＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＡＨＡ（２００−３０８）ｈＧＤＦ１５、ＡＨ（１９９−３０８）ＧＤＦ１５、ＭＨＨＨＨＨＨＭ−ｈＧＤＦ１５、およびＭＨＨＨＨＨＨ−ｈＧＤＦ１５、またはこれらの二量体から選択される、上記［１７］に記載の方法。
［１９］ 医薬として使用するための、上記［１］から［９］、［１１］、［１２］、および［１４］から［１６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記［１０］または［１３］に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［２０］ 代謝性障害または疾患、糖尿病、２型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（限定はしないが慢性腎臓病を含む）、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害の治療または予防において使用するための、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、上記［１］から［９］、［１１］、［１２］、および［１４］から［１６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記［１０］または［１３］に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［２１］ 前記生体分子が、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、治療有効量の、上記［１］から［９］、［１１］、［１２］、および［１４］から［１６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記［１０］または［１３］に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と、治療活性のある１種または複数の共薬剤とを含む、組合せ。
［２２］ 前記共薬剤が、抗糖尿病薬、脂質低下薬、抗肥満薬、降圧薬、およびペルオキシソーム増殖因子−活性化因子受容体のアゴニストから選択されたものである、上記［２１］に記載の組合せ。
［２３］ 前記共薬剤が、インスリン、インスリン誘導体および模倣物；インスリン分泌促進物；グリブリド、Ａｍａｒｙｌ；インスリン分泌性スルホニル尿素受容体リガンド；チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン（netoglitazone）、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン（adaglitazone）、ダルグリタゾン、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）阻害薬；ＲＸＲリガンド；ナトリウム依存的グルコース共輸送体阻害薬；グリコーゲンホスホリラーゼＡ阻害薬；ビグアナイド；α−グルコシダーゼ阻害薬、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１模倣物；ＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素阻害薬；スクアレンシンターゼ阻害薬；ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）、ＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）リガンド；コレスチラミン；フィブラート；ニコチン酸、アスピリン；オーリスタットまたはリモナバント；ループ利尿薬、フロセミド、トルセミド；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬；Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜ポンプの阻害薬；中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害薬；ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害薬；アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト；レニン阻害薬；β−アドレナリン受容体遮断薬；強心薬、ドブタミン、ミルリノン；カルシウムチャネル遮断薬；アルドステロン受容体アンタゴニスト；アルドステロンシンターゼ阻害薬；フェノフィブレート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、ＢＭＳ−２９８５８５、およびＬ−７９６４４９から選択される、上記［２２］に記載の組合せ。
［２４］ 治療有効量の、上記［１］から［９］、［１１］、［１２］、および［１４］から１６］のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記［１０］または［１３］に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される１種または複数の担体とを含む医薬組成物。
［２５］ 式：

【化153-9】

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［Ｒ¹は、ＣＯ₂ＨまたはＨであり、
Ｒ²およびＲ³は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ₂、または−Ｃ≡ＣＨであり、但し、Ｒ²およびＲ³は、同一でなく、
Ｒ⁴は、ＣＯ₂Ｈであり、
ｎおよびｍは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］の化合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
［２６］ Ｒ²およびＲ³の少なくとも一方がＣＯ₂Ｈである式Ａ１の化合物である、上記［２５］に記載の化合物。
［２７］

【化153-10】

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からなる群から選択される、上記［２５］または［２６］に記載の化合物。

【図1】

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