特許 6640818 イエダニアレルギーの処置のための連続したオーバーラップペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6640818

(24)【登録日】2020年1月7日

(45)【発行日】2020年2月5日

(54)【発明の名称】イエダニアレルギーの処置のための連続したオーバーラップペプチド

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/35 20060101AFI20200127BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20200127BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20200127BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/35ZNA

   A61P37/08

   C07K14/435

【請求項の数】6

【外国語出願】

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2017-214471(P2017-214471)

(22)【出願日】2017年11月7日

(62)【分割の表示】特願2016-517701(P2016-517701)の分割

【原出願日】2014年6月6日

(65)【公開番号】特開2018-58856(P2018-58856A)

(43)【公開日】2018年4月12日

【審査請求日】2017年12月6日

(31)【優先権主張番号】61/831,961

(32)【優先日】2013年6月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506129315

【氏名又は名称】アネルギ エスアー

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】特許業務法人 有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ケトナー， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】レーモン， クリストフ

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０７−５０２８９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２０３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２１６１８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３５

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ｃ０７Ｋ １４／４３５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１８の配列からなる第一のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のペプチドと、
配列番号１９の配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２４の配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２５の配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
を含む複数のペプチドフラグメントを含む組成物。

【請求項2】

（ｉ）前記第一のペプチドと第二のペプチドが、４アミノ酸により互いにオーバーラップしており；
（ｉｉ）前記第二のペプチドと第三のペプチドが、２１アミノ酸により互いにオーバーラップしており；及び／又は
（ｉｉｉ）前記第三のペプチドと第四のペプチドが、５アミノ酸により互いにオーバーラップしている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

配列番号１９の配列からなる、ペプチド。

【請求項4】

配列番号２４の配列からなる、ペプチド。

【請求項5】

配列番号２５の配列からなる、ペプチド。

【請求項6】

複数の連続したオーバーラップペプチドフラグメントを含む組成物であって、
配列番号１８の配列からなる第一のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のペプチドと、
配列番号１９の配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２４の配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
を含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、開示が全体として本明細書に取り込まれる、２０１３年６月６日出願の米国特許仮出願第６１／８３１，９６１号に基づくものである。

【0002】

電子データとして提出された材料の参照による取り込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り同定された、コンピュータ可読のアミノ酸配列リストが、全体として参照により取り込まれる：ファイル名：47712A_SeqListing.txtのASCIIテキストファイル；サイズ：２０，１０３バイト；作成日：２０１４年６月５日。

【0003】

本発明は、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２イエダニ主要アレルゲン由来の連続したオーバーラップペプチド（ＣＯＰ）、並びに薬品中でのそのような化合物の使用に関する。本発明の化合物及び処置方法は、イエダニアレルギーを処置すること、及びその処置を広範囲で促進することに有用であることが企図される。

【背景技術】

【0004】

ＩｇＥ依存性アレルギー疾患は、特に工業国において非常に一般的のようであり、人口の最大１／４がアレルギー性鼻炎に罹患している（非特許文献１］。さらに、アレルギー性鼻炎に罹患した人は、健常者よりも低いクオリティー・オブ・ライフを示し（非特許文献２］、自然寛解に至る人は極わずかである。

【0005】

イエダニアレルギーは、世界全体に広く分布しており、米国及び欧州のアレルギー人口の約５０％が、イエダニへのアレルギーに罹患している（非特許文献３）。イエダニ（ＨＤＭ）は、主に２つの種Dermatophagoides pteronyssinus、及びDermatophagoides farinaeに属する。D. pteronyssinus及びD. farinaeの主要ＨＤＭアレルゲンであるＤｅｒ ｐ１／ Ｄｅｒ ｆ１及びＤｅｒ ｐ２／Ｄｅｒ ｆ２は、８０％を超える配列同一性を有
するため、ＨＤＭアレルギーの処置は、この２種のうちの一方の主要アレルゲンを基剤とすることが可能である。Ｄｅｒ ｐ１は、Ｄｅｒ ｆ１と８３％の配列同一性を有し、これらの２種の間の交叉反応性が高いヒトＩｇＥ抗体及びＴ細胞応答を誘導する。特に、アレルギー患者の血清をＤｅｒ ｆ１とプレインキュベートすると、異なる結合親和性が報告されているにもかかわらずＨＤＭ ＩｇＥ抗体へのＤｅｒ ｐ１の結合が防止されることが見出されている。Ｄｅｒ ｐ２及びＤｅｒ ｆ２（８８％配列同一性）は、それらの相対物への結合を非常に効果的に防止することが見出されている。Ｔ細胞増殖もまた、D.
pteronyssinus及びD. farinaeペプチドにより等しく誘導されることが見出された。しかし、例えばＤｅｒ ｐ１よりもＤｅｒ ｆ１からのペプチドの方が、より少ない数でＴ細胞増殖を刺激し得るため、この２種から得られたアレルゲンは、完全に互換性があるわけではない。

【0006】

感作種がD. farinaeであるイタリアの地方でD. pteronyssinusを用いて実施された試験の免疫療法結果が、D. pteronyssinus感作に関してD. pteronyssinusを用いて英国で実施された結果又はD. farinae感作に関してD. farinaeを用いて韓国で実施された結果と著しく異ならないことにより、異なる種から得られたアレルゲンの可能な互換的使用が示された。イタリアの結果は、Thomasによりレビューされた通り（非特許文献３］、抽出物の混合物で実施された結果とも異ならなかった。つまりD. pteronyssinusから得られた主要アレルゲンが、少なくともD. pteronyssinus、D. farinaeの両方、そして場合により他のイエダニ種に対する有効な製品の基剤として考慮され得る。

【0007】

複数のアレルゲン配列は、ＮＣＢＩのヌクレオチド及びタンパク質データベースに見出される通り、ＨＤＭアレルギーにおいて記載されている。このアレルゲンは、既知タンパク質と配列が関係する少なくとも７群、即ち：
Ｄｅｒ ｐ１、システインプロテアーゼ（ペプチダーゼＣ１Ａファミリー）
Ｄｅｒ ｐ２、ＴＬＲ４が結合したＭＤ２様脂質結合タンパク質
Ｄｅｒ ｐ３、トリプシン様セリンプロテアーゼ
Ｄｅｒ ｐ４、α−アミラーゼ
Ｄｅｒ ｐ５、Ｂｌｏ ｔ５（Blomia tropicalis、貯蔵庫ダニ）
Ｄｅｒ ｐ６、キモトリプシン様（Ｓ１ペプチダーゼドメイン）
Ｄｅｒ ｐ７、分泌された糖タンパク質、
に割り付けることができる。

【0008】

欧州では、ＨＤＭにアレルギーのある対象の９７％は、Ｄｅｒ ｐ１とＤｅｒ ｐ２のミックスを用いて診断することができるが、該患者の５０％は、Ｄｅｒ ｐファミリーのさらに別のアレルゲンとも反応する（非特許文献４）。ブラジルでは、アレルギー性鼻炎の陽性患者を刺したＨＤＭの約８７％は、Ｄｅｒ ｐ１、Ｄｅｒ ｐ２又はその両アレルゲンを認識するＩｇＥを含むことが見出された（非特許文献５）。オーストラリアにおける試験（非特許文献６）から、抗ＨＤＭ ＩｇＥ抗体の約５０％が、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２に結合し、さらに３０％が、Ｄｅｒ ｐ４、５及び７によって等しく寄与されたことが示される。つまりＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２への反応性が、明らかにアレルギー人口の優位を占めているため、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２アレルゲンを基剤とする製品が、患者の極めて大部分を処置し得ることが示される。

【0009】

Ｄｅｒ ｐ１配列及びＩｇＥエピトープ
Ｄｅｒ ｐ１変異体は、幾つかの多型を示すことが非特許文献７に記載されている。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ配列Ｐ０８１７６．２を用いたＢＬＡＳＴ検索から、ＮＣＢＩデータベース内の多数のタンパク質配列が明らかとなった。ほとんどの変異が、Ｄｅｒ ｆ１配列内で見出され、５つの主な位置、即ち１２３、１３２、１５０、１５２及び２０４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８１７６．２で参照される座標）に配置されていた。多型は、バンコクの住居で単離されたD. pteronyssinus及びD. farinaeの両方から得られた１群及び２群アレルゲンの配列パネルに使用されたＲＴ−ＰＣＲにも現れている（非特許文献８）。これらの結果を総括すると、最も優位を占めるＤｅｒ ｐ１がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ
Ｐ０８１７６．２で参照される配列であり、Ｄｅｒ ｐ１．０１０５とも同一であることが示される（非特許文献８）。

【0010】

Ｄｅｒ ｐ１タンパク質は、３２０のアミノ酸のシステインプロテアーゼ（Ｃ１スーパーファミリーのペプチダーゼ）である。最初の１８のアミノ酸は、シグナルペプチドの性質を有するが、次のＲ１９〜Ｅ９８のアミノ酸は、プロタンパク質内に存在し、プロテアーゼインヒビタードメインＩ２９を含む。成熟したＤｅｒ ｐ１は、２２２のアミノ酸（Ｔ９９〜Ｌ３２０）で構成され、３つの結晶構造が決定されている（ＰＤＢ １ＸＫＧ、２ＡＳ８及び３Ｆ５Ｖ）。

【0011】

Ｄｅｒ ｐ１のImmune Epitope Database (ＩＥＤＢ)を検索すると、３５のエピトープが見出された。抗原競合、Westernブロット、ＥＬＩＳＡ、Ｉｇヒスタミン放出、又は放
射免疫測定法のいずれかにより決定された２４のＢ細胞エピトープが非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１又は非特許文献１２に記載されている。これらの潜在的エピトープを組み合わせることで、Ｎ１５０〜Ｈ１７０；Ｖ１８７〜Ｒ２０２；Ｃ２１５〜Ｑ２３１；Ｙ２６３〜Ｙ２９９に境界がある４つの主要領域を表示することができた。

【0012】

ＩｇＥエピトープは、大部分が高次構造であり、つまりマッピングが困難である。Ｄｅ
ｒ ｐ１又はＤｅｒ ｆ１のいずれかに対して増加したモノクローナル抗体は、大部分が種特異性である。しかしＤｅｒ ｆ１への抗体４Ｃ１は、Ｄｅｒ ｐ１にも結合し、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びヒトＩｇＥ抗体のエピトープは、その複合体の結晶構造による決定でオーバーラップしていることが見出された（非特許文献１３）。４Ｃ１とＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｆ１との共結晶化から、ＩｇＥ結合に関与する可能性がある残基Ｄ１１３、Ｒ１１５、Ｑ１１６、Ｒ１１８、Ｒ１５４、Ｉ１５６、Ｑ２７９、Ｙ２８３、Ｄ２９６、Ｙ２９９、Ｙ３０１が示された。

【0013】

ｍＡｂ Ｗ１０８が、Ｄｅｒ ｐ１とＩｇＥ抗体との結合だけでなく、システインプロテイナーゼ活性も阻害する（非特許文献１４）。３つのペプチド（ａａ２０９〜２２４; ２２７〜２４３及び２６０〜２８７）が、Ｗ１０８／ Ｄｅｒ ｐ１複合体のプロテアー
ゼ消化後にＬＣ−ＭＳにより同定されたが、それらは、ｍＡｂ Ｗ１０８に最も直接的に結合していることが見出されたＤｅｒ ｐ１の２つのペプチドセグメント(ａａ １５１〜１９７及び２８６〜３２０)とオーバーラップしていなかった。これらの結果から、モノ
クローナル抗体を用いた場合でも、ＩｇＥエピトープをマッピングすることの複雑さが実証される。

【0014】

文献のデータを要約することで、ＩｇＥに結合する可能性のあるＤｅｒ ｐ１の４つの領域、即ちＮ１５０〜Ｈ１７０、Ｖ１８７〜Ｒ２０２、Ｃ２１５〜Ｑ２３１及びＧ２７４〜Ｄ２９１を同定することができた。報告された実験から、Ｒ１４９〜Ｒ２５４のさらなる領域により残留するＩｇＥ結合が除去されると解釈されなければならないため、Ｄｅｒ
ｐ１のこれらの４つのドメインの分割が十分でなかったことが示される。

【0015】

Ｄｅｒ ｐ２配列及びＩｇＥエピトープ
Ｄｅｒ ｐ２は、最良に特徴づけられた型Ｄｅｒ ｐ２．０１０１、 ０１０３、０１
０４、０１０７及び０１０８をはじめとする１５の記載された変異体を有し、非常に多型性であると思われる（非特許文献１５）。非特許文献８によれば、Ｄｅｒ ｐ２は、アミノ酸置換のクラスターを有する多くの変異を示したが、標準的なＤｅｒ ｐ２．０１０１は、１７の配列のいずれにも見出されなかった。Ｄｅｒ ｆ２は、Ｄｅｒ ｐ２と類似した置換のクラスターを有する変異体を示したが、それは異なるアミノ酸位置の中にあり、任意の構造的一致を有さなかった。

【0016】

非特許文献１６によれば、両方の変異体Ｄｅｒ ｐ２．０１０１及びＤｅｒ ｐ２．０１０４は、Ｔ細胞刺激に関して最も活性があったが、より一般的でない他の変異体、即ち０１０７及び０１０８は、一致した差異を示しており、配列の変化がサイトカイン応答を変化させ得ることが実証される。非特許文献１５によれば、Ｄｅｒ ｐ２アイソフォーム０１０３及び０１０４は、ファージディスプレイにより得られた一連の組換えＩｇＥに対してより高い親和性で結合されるように思われる。したがって、rＩｇＥと組み合わせた
これら２つのアイソフォームは、再構成アッセイにおいて脱顆粒を惹起するためのより良好な能力を示した。しかし、Ｄｅｒ ｐ２アイソフォームは全て、アレルギー患者のポリクローナル血清の存在下で脱顆粒を惹起することができた。上記の結果、特にＴ細胞応答及び選択されたrＩｇＥクローンへの高い親和性を考慮して、Ｄｅｒ ｐ２．０１０４変
異体（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＪ６８０６７．１）を、製品の定義のために選択した。

【0017】

ＩｇＥエピトープを決定する試みにおいて、水素交換核磁気共鳴（非特許文献１７）及びミモトープ（非特許文献１８）をはじめとする異なる技術が用いられてきた。３つの主要領域、即ちＮ７１〜Ｃ７８、Ｖ９４〜Ｋ１００及びＬ１１１〜Ｇ１１５（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＪ６８０６７．１配列に従う番号付け)は、分子の表面に位置するように含まれ
ると思われる。後の２つの領域は、ＩＥＤＢデータベース内で可能なＩｇＥエピトープの一部として同定された残基を含むが（非特許文献７）、ＩｇＥの３Ｄ結合特異性のために
、決定的なエピトープマッピングは提案されなかった。

【0018】

低アレルゲン性のアレルギーワクチン
ＩｇＥ依存性アレルギーの原因に向けた唯一の処置が、特異的免疫療法（ＳＩＴ）である。この処置は、アレルゲンの用量を増加させながら長期間（３〜５年間）注射して、アレルギー患者に忍容性を導入することからなる。複数の試験から、特に長期処置において、アレルギー反応に及ぼすこの治療の利益が示された（非特許文献１９、非特許文献２０）。しかし、特に超急速療法（ultra-rush therapies）の際に複数の副作用が観察され、最大３０％の患者が治療の経過中、アレルギー症状を処置されなければならなかった（非特許文献２１）。つまり、より短期処置の形態で許容し得る安全性を有するＳＩＴの代替法に、強い医療ニーズが存在する。

【0019】

ＳＩＴの安全性及び有効性を改善するために、異なるアプローチがテストされてきた。ＴＨ１免疫応答を増加させる、ＭＰＬ（アレルギー治療、非特許文献２２）、ＤＮＡ配列（非特許文献２３）、又はＣｐＧと組み合わせたバクテリオファージ（非特許文献２４）のようなアジュバントを添加することによって、配合剤又は既存の抽出物が改善されてきており、こうしてアレルゲン抽出物の量の可能な限り減少させることができた。定義されたアレルゲンが、全抽出物の代わりに使用された。カバノキ花粉の場合、組換えＢｅｔ ｖ １を用いた治験で、全カバノキ花粉抽出物と同等の有効性が示された（非特許文献２５）。

【0020】

処置から生じるアレルギー症状の発生を減少させるため、異なるグループが、低アレルゲン能を有する製品、即ちＩｇＥ結合の低下を示す製品の使用を探索した。E. coliにお
けるＤｅｒ ｐ１の発現により、単にＩｇＥ結合低下を示す凝集タンパク質が得られ（非特許文献２６）、可能な低アレルゲン性ワクチンとして提案された。P. pastorisにおけ
るプロＤｅｒ ｐ１の発現により、アレルゲン特異性免疫療法において使用される可能性もある安定した低アレルゲン性プロエンザイムが得られた（非特許文献２７）。アレルゲンの併用、即ちＤｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２ハイブリッドタンパク質が、ＰＣＲにより作出され（非特許文献２８）、あるいはハイブリッドタンパク質が、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２フラグメントを用いて再構成されて（非特許文献２９）、E. coli内で発現され
た。ＩｇＥ反応性の低下が、両方の例で示され、同時に免疫原性が維持された。コドンを最適化された潜在的ＤＮＡワクチン候補も構築された（非特許文献３０、非特許文献３１）。しかしこれらのアプローチはいずれも、ヒトにおいては未だにテストされていない。

【0021】

さらなるアプローチは、有効性が不十分なネコのフケのアレルゲン免疫療法に使用された、限られた数のＴ細胞エピトープを含むペプチドを提供することからなった（非特許文献３２）。しかしアレルゲンは、患者のＨＬＡ型に部分的に依存する、非常に多様なＴ細胞エピトープを抱える。例えば、Ｔ細胞エピトープは、短い領域以外ではＢｅｔ ｖ １配列全体に散在することが見出された（非特許文献３３）。つまり効率的な免疫療法製品は、好ましくは選択されたＴ細胞エピトープよりもむしろアレルゲンの完全な配列を含まなければならない。

【0022】

ヒトＩｇＥが、主にアレルゲンの断片化によって分離され得る非連続エピトープを認識するという証拠に基づけば、アレルゲンフラグメントの使用は、依然として魅力的である。Ｂｅｔ ｖ １の２つの連続したフラグメント、又はＢｅｔ ｖ １の三量体形態が、ヒトにおける第Ｉ相試験でテストされ、健康状態の改善傾向を示したが、シンプトム・メディケーション・スコアにおける有意な改善はもたらされなかった（非特許文献３４）。しかしその試験において、複数の有害事象が観察され、その大半は注射の数時間後に生じた（非特許文献３５）。ハチ毒の主要アレルゲン、即ちホスホリパーゼＡ２の３つのフラグメントもまた、ヒトにおいてテストされ、ＩｇＥ結合の低下に起因する優れた安全性を
示し、その一方でＩｇＧ４及びＩＬ−１０レベルの上昇を誘導した（非特許文献３６）。アレルゲンの全アミノ酸配列を一緒になって形成し、それによりアレルゲンの全ての可能なＴ細胞エピトープを提供しながらＩｇＥ結合を低下させる、アレルギー処置用の連続したオーバーラップペプチド（ＣＯＰ）を選択する方法が考案された（特許文献１）。そのような選択されたフラグメントは、アレルゲンの本来の三次構造を再形成する能力があったとしても低く、結果として、ヒトにおいてＩｇＥと結合し、それによりアレルギー反応を誘発させる能力が低いことを示す。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0023】

【特許文献1】米国特許第７，９２３，２０９号明細書

【特許文献2】米国特許第６，２６８，４９１号明細書

【特許文献3】国際公開第２００４／０８１０２８号

【非特許文献】

【0024】

【非特許文献1】Settipane RA. Demographics and epidemiology of allergic and nonallergic rhinitis. Allergy Asthma Proc. 2001;22:185-9.

【非特許文献2】Bousquet J, Bullinger M, Fayol C, Marquis P, Valentin B, Burtin B. Assessment of quality of life in patients with perennial allergic rhinitis with the French version of the SF-36 Health Status Questionnaire. J Allergy Clin Immunol. 1994;94:182-8.

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【非特許文献5】Taketomi EA, Silva DA, Sopelete MC, Gervasio AM, Alves R, Sung SJ. Differential IgE reactivity to Der p 1 and Der p 2 allergens of Dermatophagoides pteronyssinus in mite-sensitized patients. Journal of investigational allergology & clinical immunology : official organ of the International Association of Asthmology. 2006;16:104-9.

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【非特許文献38】Sade et al. J Investig Allergol Clin Immunol; 17(6): 379- 385 (2007)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0025】

一態様によれば、本発明は、イエダニアレルギーの処置用組成物としての連続したオーバーラップペプチド（ＣＯＰ）を提供する。具体的にはＣＯＰＳは、イエダニの２つの主要アレルゲンＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２の配列から提供され、これらのアレルゲンの
完全配列を含み、つまり潜在的なＴ細胞エピトープの全てを提供するが、本来のアレルゲンの三次元構造を含まない。

【0026】

ＣＯＰＳは、イエダニアレルギーの特異的免疫療法で用いることができ、Ｄｅｒ ｐ１若しくはＤｅｒ ｐ２、又はこれら２種のアレルゲンの混合物を感作するマウス及び他の哺乳動物に投与することができ、アナフィラキシーショックを誘発しない。より具体的には本発明は、短期間で数回投与した後、アレルギー症状を低減することが可能な特異的免疫療法（ＳＩＴ）に関する。この治療は、イエダニへのアレルギーを生じたヒトに特異的ＣＯＰを反復投与することからなる。投与は、全身、経皮、皮内、皮下若しくは経口経路で、又は舌下及び腸管経路などの粘膜経路で実施され得る。投与は、現行のＳＩＴでの３〜５年に比較し、幾つかの実施形態において２ヶ月にわたり５回反復され得る。活性生成物（ＣＯＰ）の投与量は、３年間にわたるＳＩＴ処置で投与されるＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２の量と等しいモル量の累積値に達し得る。

【課題を解決するための手段】

【0027】

具体的には本発明は、複数の連続したオーバーラップペプチドフラグメント（ＣＯＰ）を含む組成物であって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ＣＯＰの反応性が実質的に低下又は排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された組成物を提供する。本明細書で用いられる記述「ＩｇＥ抗体への反応性が排除された」は、免疫学の当業者により、そのような反応性が３又は４又はそれを超える対数値で臨床的に無関係なレベルまで、又は通常の測定技術により検出不能なレベルまで低下されることと理解される。ＣＯＰの前記組み合わせは、Ｄｅｒ ｐ１の完全な配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８１７６．２）及びＤｅｒ ｐ２の完全な配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＪ６８０６７．１）の両方を含み、前記Ｄｅｒ ｐ１配列は、アミノ酸Ｔ９９から始まりＧ１６８を末端とする第一のペプチド（配列番号８）と、アミノ酸Ａ１６４から始まりＳ２００を末端とする第二のペプチド（配列番号１２）と、アミノ酸Ｒ１９３から始まりＥ２２７を末端とする第三のペプチド（配列番号１３）と、アミノ酸Ｐ２２０から始まりＲ２５４を末端とする第四のペプチド（配列番号１４）と、アミノ酸Ｒ２４９から始まりＤ２８２を末端とする第五のペプチド（配列番号１５）と、アミノ酸Ａ２７８から始まりＬ３２０を末端とする第六のペプチド（配列番号１１）と、の付加により得られ、前記Ｄｅｒ ｐ２配列は、アミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする第一のペプチド（配列番号１８）と、アミノ酸Ｈ２２から始まりＫ７７を末端とする第二のペプチド（配列番号１９）と、アミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第三のペプチド（配列番号２４）と、アミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とする第四のペプチド（配列番号２５）と、の付加により得られる。

【0028】

先の配列は、オーバーラップに最も好ましいペプチドを表しているが、それらの第一〜第六のＤｅｒ ｐ１ペプチド及び第一〜第四のＤｅｒ ｐ２ペプチドのそれぞれのわずかに短いタイプ及びわずかに長いタイプが企図される。このようなペプチドは、ＩｇＥ反応性三次元エピトープが再構成されないように、配列番号８、１１〜１５、１８、１９、２４及び２５の好ましいペプチドから切除又は延長された各１〜３又は１〜５又は１〜１０又は１〜１５アミノ酸である。さらに、Ｄｅｒ ｐ１及び／又はＤｅｒ ｐ２へのアレルギーがある対象のＩｇＥ抗体への該ペプチドの反応性が排除され、って、それによりイエダニへのアレルギーがある対象からのＴリンパ球との反応性が維持されるように１種以上のアミノ酸により互いにオーバーラップするペプチドのセットが生成される。。切除又は延長されたＣＯＰは、それらがＩｇＥ結合の回復を誘導しないことを前提として、配列番号８、１１〜１５、１８、１９、２４及び２５のペプチドと機能的に等しくなるであろう。本発明の一態様として、主要なイエダニアレルゲンＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２には、若干の配列変動性が存在することに留意されたい。つまりＤｅｒ ｐ２の１つの配列であるＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦＪ６８０６７．１（配列番号２８）は、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏ
ｔ Ｐ４９２７８．１（配列番号２９）における成熟タンパク質配列変異体と４アミノ酸残基が異なる。具体的に配列番号２８を参照すると、その配列は、ＡＡ４０で親水性リシン（Ｌ）を疎水性バリン（Ｖ）で、ＡＡ４７の求核性トレオニン（Ｔ）を求核性セリン（Ｓ）で、ＡＡ７０の疎水性メチオニン（Ｍ）を疎水性リシン（Ｌ）で、そしてＡＡ１１４の酸性残基アスパラギン酸（Ｄ）をアミドアスパラギン（Ｎ）で置換することにより、変動する。当業者は、本発明の特異的免疫療法を実施するのに有用なペプチドを得るために、異なるアレルゲンアイソタイプの配列から選択すること、及び類似の性質を有するアミノ酸残基を置換することが可能である。したがって本発明は、配列番号８、１１〜１５、１８、１９、２４及び２５のペプチド、並びに配列番号２６に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により延長又は切除された配列番号８及び１１〜１５のペプチド、並びに配列番号２７に沿った配列番号１８、１９、２４及び２５のペプチドに対して７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有し、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体に対するそのようなペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持されている、ＣＯＰを提供する。

【0029】

本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第二のペプチドと第三のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第三のペプチドと第四のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第四のペプチドと第五のペプチドは、１〜６アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第五のペプチドと第六のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜４アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第二のペプチドと第三のペプチドは、１〜２１アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第三のペプチドと第四のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。特に好ましい組成物は、配列番号８を有するペプチドと、配列番号１２を有するペプチドと、配列番号１３を有するペプチドと、配列番号１４を有するペプチドと、配列番号１５を有するペプチドと、配列番号１１を有するペプチドと、配列番号１８を有するペプチドと、配列番号１９を有するペプチドと、配列番号２４を有するペプチドと、配列番号２５を有するペプチドと、の組み合わせを含む。

【0030】

好ましいＣＯＰ組成物は、該ペプチドが適用経路と適合性のある水性緩衝液に可溶性である、それらの組成物を包含する。特にペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．５、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５３、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５４及びＡｌｌｅｒＤＭ１．５ａのセットが、それらの水溶性によりＡｌｌｅｒＤＭ１．２よりも好ましい。極性非プロトン性溶媒は、可溶化に必要とならないため、ＡｌｌｅｒＤＭ１．７ がＡｌｌｅｒＤＭ
１．３及びＡｌｌｅｒＤＭ１．７２ よりも好ましい。

【0031】

そのようなペプチドは、化学合成又は組換え手段をはじめとする多様な方法のいずれかにより得ることができる。

【0032】

本発明のＣＯＰ及びペプチドは、乾燥粉末形態で提供することができるが、許容し得る担体又は希釈剤と組み合わせて提供することもできる。加えて該組成物は、アジュバントをさらに含むことができ、好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムである。そのため該組成物は、ワクチン組成物として特徴づけること及び使用することができる。

【0033】

本発明のＣＯＰ及びペプチドは、塩化グアニジニウムを含む変性剤及び／又はカオトロピック剤と共に提供することができる。溶液中での三次元構造形成を防ぐことによるそのような薬剤は、ＩｇＥ結合の低下に寄与する。

【0034】

Ｄｅｒ ｐ１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８１７６．２）の完全な配列及びＤｅｒ ｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＪ６８０６７．１）の完全な配列の両方を含むＣＯＰの組み合わせからなる群から選択される１種以上のアレルゲンを、必要とする患者に投与することを含む、イエダニアレルギーへの特異的免疫療法（ＳＩＴ）の方法であって、前記Ｄｅｒ ｐ１配列が、アミノ酸Ｔ９９から始まりＧ１６８を末端とする第一のペプチド（配列番号８）と、アミノ酸Ａ１６４から始まりＳ２００を末端とする第二のペプチド（配列番号１２）と、アミノ酸Ｒ１９３から始まりＥ２２７を末端とする第三のペプチド（配列番号１３）と、アミノ酸Ｐ２２０から始まりＲ２５４を末端とする第四のペプチド（配列番号１４）と、アミノ酸Ｒ２４９から始まりＤ２８２を末端とする第五のペプチド（配列番号１５）と、アミノ酸Ａ２７８から始まりＬ３２０を末端とする第六のペプチド（配列番号１１）と、の付加により得られ、前記Ｄｅｒ ｐ２配列が、アミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする第一のペプチド（配列番号１８）と、アミノ酸Ｈ２２から始まりＫ７７を末端とする第二のペプチド（配列番号１９）と、アミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第三のペプチド（配列番号２４）と、アミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とする第四のペプチド（配列番号２５）と、の付加により得られる、方法も提供される。

【0035】

該ペプチドが、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経皮、鼻内、経口、舌下、眼内、又は髄腔内技術を利用して投与される、そのような方法が実施され得る。

【0036】

１つのそのような方法によれば、患者は、Ｄｅｒ ｐ１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８１７６．２）の完全な配列及びＤｅｒ ｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦＪ６８０６７．１）の完全な配列の両方を含み、前記Ｄｅｒ ｐ１配列が、アミノ酸Ｔ９９から始まりＧ１６８を末端とする第一のペプチド（配列番号８）と、アミノ酸Ａ１６４から始まりＳ２００を末端とする第二のペプチド（配列番号１２）と、アミノ酸Ｒ１９３から始まりＥ２２７を末端とする第三のペプチド（配列番号１３）と、アミノ酸Ｐ２２０から始まりＲ２５４を末端とする第四のペプチド（配列番号１４）と、アミノ酸Ｒ２４９から始まりＤ２８２を末端とする第五のペプチド（配列番号１５）と、アミノ酸Ａ２７８から始まりＬ３２０を末端とする第六のペプチド（配列番号１１）と、の付加により得られ、前記Ｄｅｒ ｐ２配列が、アミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする第一のペプチド（配列番号１８）と、アミノ酸Ｈ２２から始まりＫ７７を末端とする第二のペプチド（配列番号１９）と、アミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第三のペプチド（配列番号２４）と、アミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とする第四のペプチド（配列番号２５）と、の付加により得られる、ＣＯＰの組み合わせで処置される。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第二のペプチドと第三のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第三のペプチドと第四のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第四のペプチドと第五のペプチドは、１〜６アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の別の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ１の第五のペプチドと第六のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜４アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第二のペプチドと第三のペプチドは、１〜２１アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の好ましい態様によれば、Ｄｅｒ ｐ２の第三のペプチドと第四のペプチ
ドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。特に好ましい組成物は、配列番号８を有するペプチドと、配列番号１２を有するペプチドと、配列番号１３を有するペプチドと、配列番号１４を有するペプチドと、配列番号１５を有するペプチドと、配列番号１１を有するペプチドと、配列番号１８を有するペプチドと、配列番号１９を有するペプチドと、配列番号２４を有するペプチドと、配列番号２５を有するペプチドと、の組み合わせを含む。

【0037】

好ましい態様によれば、本発明は、配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１０４からアミノ酸１５７〜１７７までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１５４〜１７４からアミノ酸１９０〜２１０までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１８３〜２０３からアミノ酸２１７〜２３７までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２１０〜２３０からアミノ酸２４４〜２６４までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２３９〜２５９からアミノ酸２７２〜２９２までの配列からなる第五のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第五のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２６８〜２８８からアミノ酸３１０〜３２０までの配列からなる第六のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第六のペプチドと、
を含む複数のペプチドフラグメントを含む組成物を提供する。

【0038】

本発明の更に好ましい態様によれば、第一のペプチドと第二のペプチドが１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；第二のペプチドと第三のペプチドが１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；第三のペプチドと第四のペプチドが１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；第四のペプチドと第五のペプチドが１〜６アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；又は第五のペプチドと第六のペプチドが１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている、組成物が提供される。

【0039】

本発明のさらなる態様によれば、配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１〜１５からアミノ酸１５〜３５までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反
応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１２〜３２からアミノ酸６７〜８７までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸４７〜６７からアミノ酸１０３〜１２３までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１１９からアミノ酸１１９〜１２９までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
を含む複数のペプチドフラグメントを含む組成物が提供される。

【0040】

本発明の更に好ましい態様によれば、第一のペプチドと第二のペプチドが１〜４アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；第二のペプチドと第三のペプチドが１〜２１アミノ酸により互いにオーバーラップしているか；又は第三のペプチドと第四のペプチドが１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている、組成物が提供される。

【0041】

配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１０４からアミノ酸１５７〜１７７までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１５４〜１７４からアミノ酸１９０〜２１０までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２７のアミノ酸１８３〜２０３からアミノ酸２１７〜２３７までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２１０〜２３０からアミノ酸２４４〜２６４までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２３９〜２５９からアミノ酸２７２〜２９２までの配列からなる第五のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第五のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２６８〜２８８からアミノ酸３１０〜３２０までの配列からなる第六のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イ
エダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第六のペプチドと、
を含む複数のＤｅｒ ｐ１連続オーバーラップペプチドフラグメントと；
配列番号２８のアミノ酸１〜１５からアミノ酸１５〜３５までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１２〜３２からアミノ酸６７〜８７までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸４７〜６７からアミノ酸１０３〜１２３までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１１９からアミノ酸１１９〜１２９までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
を含む複数のＤｅｒ ｐ２連続オーバーラップペプチドフラグメントと、を含む組成物も提供される。

【0042】

１つの方法によれば、イエダニアレルギーのための特異的免疫療法を必要とする患者は、（配列番号８）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｔ９９から始まりＧ１６８を末端とする第一のペプチドと、
（配列番号１２）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ａ１６４から始まりＳ２００を末端とする第二のペプチドと、
（配列番号１３）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｒ１９３から始まりＥ２２７を末端とする第三のペプチドと、
（配列番号１４）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｐ２２０から始まりＲ２５４を末端とする第四のペプチドと、
（配列番号１５）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｒ２４９から始まりＤ２８２を末端とする第五のペプチドと、
アミノ酸Ａ２７８から始まりＬ３２０を末端とする第六のペプチド（配列番号１１）と、を含み、第一〜第六のペプチドが配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている、１つ以上のＤｅｒ ｐ１連続オーバーラップペプチドと；
（配列番号１８）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする第一のペプチドと、
（配列番号１９）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｈ２２から始まりＫ７７を末端とする第二のペプチドと、
（配列番号２４）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第三のペプチドと、
（配列番号２５）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とする第四のペプチドと、
を含み、第一〜第四のペプチドが配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている複数のＤｅｒ ｐ２連続オーバ
ーラップペプチドと、の組み合わせであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、組み合わせで処置される。本発明の好ましい態様によれば、第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。第一のペプチドと第二のペプチドは、１〜１１アミノ酸により互いにオーバーラップしており；第二のペプチドと第三のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしており；第三のペプチドと第四のペプチドは、１〜８アミノ酸により互いにオーバーラップしており；第四のペプチドと第五のペプチドは、１〜６アミノ酸により互いにオーバーラップおり；第五のペプチドと第六のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしており；第七のペプチドと第八のペプチドは、１〜４アミノ酸により互いにオーバーラップしており；第八のペプチドと第九のペプチドは、１〜２１アミノ酸により互いにオーバーラップしており；そして／又は第九のペプチドと第十のペプチドは、１〜５アミノ酸により互いにオーバーラップしている。本発明の一態様によれば、必要とする患者は、前記アレルゲンの少なくとも５種又は６種又は７種又は８種又は９種又は１０種で処置される。

【0043】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号８）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｔ９９〜Ｇ１６８の配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号８のペプチドからなる配列を有する。

【0044】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１２）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ａ１６４から始まりＳ２００を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１２のペプチドからなる配列を有する。

【0045】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１３）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｒ１９３から始まりＥ２２７を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１３のペプチドからなる配列を有する。

【0046】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１４）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｐ２２０から始まりＲ２５４を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１４のペプチドからなる配列を有する。

【0047】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１５）に対して
９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｒ２４９から始まりＤ２８２を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１５のペプチドからなる配列を有する。

【0048】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２７に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１１）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ａ２７８から始まりＬ３２０を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１１のペプチドからなる配列を有する。

【0049】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１８）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１８のペプチドからなる配列を有する。

【0050】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１８）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｄ１から始まりＥ２５を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１８のペプチドからなる配列を有する。

【0051】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号１９）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｈ２２から始まりＫ７７を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号１９のペプチドからなる配列を有する。

【0052】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号２４）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号２４のペプチドからなる配列を有する。

【0053】

本発明による好ましいペプチドは、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されている（配列番号２５）に対して９０％又は９５％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とする配列を含むペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象
のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、ペプチドを含み、特に好ましいペプチドは、配列番号２５のペプチドからなる配列を有する。

【0054】

本発明は、配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１０４からアミノ酸１５７〜１７７までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１５４〜１７４からアミノ酸１９０〜２１０までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１８３〜２０３からアミノ酸２１７〜２３７までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２１０〜２３０からアミノ酸２４４〜２６４までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２３９〜２５９からアミノ酸２７２〜２９２までの配列からなる第五のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第五のペプチドと、
配列番号２７に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸２６８〜２８８からアミノ酸３１０〜３２０までの配列からなる第六のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第六のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１〜１５からアミノ酸１５〜３５までの配列からなる第七のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第七のポリペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１２〜３２からアミノ酸６７〜８７までの配列からなる第八のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第八のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸４７〜６７からアミノ酸９３〜１２３までの配列からなる第九のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第九のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸９９〜１１
９からアミノ酸１１９〜１２９までの配列からなる第十のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第十のペプチドと、
からなる群から選択される１種以上のアレルゲンを、必要とする患者に投与することを含む、イエダニアレルギーへの特異的免疫療法の方法も提供する。

【0055】

複数の連続オーバーラップペプチドフラグメントを含む特異的免疫療法を実施するための組成物であって、該フラグメントが一緒になって、配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸３０〜８２までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１２〜３２からアミノ酸６７〜８７までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸４７〜６７からアミノ酸１０３〜１２３までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸８９〜１０９からアミノ酸１２９までの配列からなる第四のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第四のペプチドと、
を含むＤｅｒ ｐ２（配列番号２８）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドの全アミノ酸配列を含む、組成物も提供される。

【0056】

複数の連続したオーバーラップペプチドフラグメントを含む特異的免疫療法を実施するための組成物であって、該フラグメントが一緒になって、配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸６２〜８２までの配列からなる第一のポリペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第一のポリペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸４７〜６７からアミノ酸１０３〜１２３までの配列からなる第二のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第二のペプチドと、
配列番号２８に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドのアミノ酸８９〜１１９からアミノ酸１２９までの配列からなる第三のペプチドであって、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、第三のペプチドと、
を含むＤｅｒ ｐ２（配列番号２８）に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドの全アミノ酸配列を含む、組成物も提供される。特に好ましいのは、アミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第二のペプチド（配列番号２４）が、延長及び切除されてい
ない、組成物である。

【0057】

（配列番号１６）のアミノ酸Ｄ１から始まりＡ７２を末端とする第一のペプチドと、アミノ酸Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第二のペプチド（配列番号２４）と、（配列番号２８）のアミノ酸Ｋ８９から始まりＤ１２９を末端とするペプチド又はアミノ酸Ｋ１０９から始まりＤ１２９を末端とするペプチド（配列番号２５）からなる群から選択される第三のペプチドと、を含む複数のＤｅｒ ｐ２連続オーバーラップペプチドフラグメントを含む特異的免疫療法を実施するための組成物であって、該ペプチドが、配列番号２８に沿った１〜３、１〜５、１〜１０又は１〜１５アミノ酸により場合により延長又は切除されており、イエダニに対してアレルギーのある対象のＩｇＥ抗体への前記ペプチドの反応性が排除されて、イエダニに対してアレルギーのある対象からのＴリンパ球との反応性が保持された、組成物がさらに提供される。特に好ましいのは、Ｓ５７から始まりＤ１１３を末端とする第二のペプチド（配列番号２４）が、延長及び切除されていない、組成物である。

【0058】

本発明の組成物は、乾燥粉末形態であってもよく、医薬的に許容し得る担体若しくは希釈剤、及び／又はアジュバンをさらに含んでいてもよく、水酸化アルミニウムが特に好ましいアジュバントである。

【0059】

該ペプチド、ペプチドの組み合わせ、及びそれらを含む組成物が、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経皮、鼻内、経口、舌下、眼内、又は髄腔内技術を利用して必要とする患者に１種以上のアレルゲンを投与することを含む、イエダニアレルギーへの特異的免疫療法の方法において投与され得る。

【0060】

本発明の一態様によれば、本発明の個々のペプチド及びオーバーラップペプチドの投与により特異的免疫療法を実施することが、変性剤又はカオトロピック剤の存在下での該ペプチドの共投与により促進され得、塩化グアニジニウムが特に好ましい医薬剤であることが発見された。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】Ｄｅｒ ｐ１に比較した、２種の血清（実線及び破線）からのＩｇＥに対する選択されたＣＯＰの競合的結合を表す。パネルＡ：Ｄｅｒ ｐ１（黒い記号）と単一のペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．１、１．２及び１．３（白い記号）との対比。パネルＢ：Ｄｅｒ ｐ１（黒い記号）と単一のペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．４、１．５、１．６、及び１．７（白い記号）との対比。パネルＣ：Ｄｅｒ ｐ１（黒い記号）と単一のペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．５２、１．５３及び１．５ａ（白い記号）との対比。パネルＤ：Ｄｅｒ ｐ１（黒い記号）と単一のペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．６２、１．６３及び１．６４との対比。

【図2】２種の異なるヒト血清と共にプレインキュベートされた「ヒト化」ＲＢＬ細胞（ドイツ、LangenのPaul-Ehrlich-Institute内、Dr. Vogelから得た）の脱顆粒を誘導するＤｅｒ ｐ２及び選択されたＣＯＰの能力を表す。パネルＡ：Ｄｅｒ ｐ２（黒い記号）とＤｅｒ ｐ２＿ＳｅｔＡ（白い記号）との対比。パネルＢ：Ｄｅｒ ｐ２（黒い記号）とＤｅｒ ｐ２＿ＳｅｔＢ（白い記号）との対比。パネルＣ：Ｄｅｒ ｐ２（黒い記号）と単一のペプチドＡｌｌｅｒＤＭ２．３、２．４及び２．５（白い記号）との対比。

【図3】競合ＥＬＩＳＡにおける塩化グアニジニウムの使用から得られたＩｇＥ結合の低下を表す。パネルＡ：Ｄｅｒ ｐ１、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２及び１．６２を、１Ｍ塩化グアニジニウムとの３０分間のインキュベートを行って（ラベルＧ）又は行わずにテストした。パネルＢ：Ｄｅｒ ｐ２及びＡｌｌｅｒＤＭ２．２を、１Ｍ塩化グアニジニウムとの３０分間のインキュベートを行って又は行わずにテストした。

【図4】１０種のＣＯＰの等モル混合物で構成されている選択された製品ＡｌｌｅｒＤＭがＩｇＥ結合を有さないことを表す。欧州及び米国のＨＤＭアレルギー対象の血清２１種を、競合ＥＬＩＳＡにおいてテストした。パネルＡ：Ｄｅｒ ｐ１反応性に関するＤｅｒ ｐ１（黒い記号）対ＡｌｌｅｒＤＭ（白い記号）の競合。パネルＢ：Ｄｅｒ ｐ２反応性に関するＤｅｒ ｐ２（黒い記号）対ＡｌｌｅｒＤＭ（白い記号）の競合。

【図5】１０種のＣＯＰの等モル混合物で構成されている選択された製品ＡｌｌｅｒＤＭがＨＤＭアレルギー患者の血清１８種を負荷されたＲＢＬ細胞の脱顆粒を誘導できないことを表す。パネルＡ：Ｄｅｒ ｐ１（黒い記号）とＡｌｌｅｒＤＭ（白い記号）を対比させた脱顆粒の誘導。パネルＢ：Ｄｅｒ ｐ２（黒い記号）とＡｌｌｅｒＤＭ（白い記号）を対比させた脱顆粒の誘導。

【図6】組換え体のＤｅｒ ｐ１アレルゲンとＤｅｒ ｐ２アレルゲンとのミックスの反復皮下注射により感作されたＢａｌｂ／ｃマウスのアナフィラキシー反応を表す。低用量アレルゲンの３回目の注射後７日目に、マウスをアレルゲンの単回大量投与によりチャレンジした。１０匹からなる１セットのマウスの、ＡｌｌｅｒＤＭ（黒い丸）、ビヒクル（ＰＢＳ、白い丸）又はＤｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２ミックス（黒い四角）のいずれかによるチャレンジ後の体温の平均及び標準偏差を示す。

【図7】Freundアジュバントを用いた、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＤｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２注射に比較したＡｌｌｅｒＤＭの免疫原性を表す（パネルＡ）。ＡｌｌｅｒＤＭは、特異的ＩｇＧを誘導して、各本来のアレルゲンによる免疫化に匹敵するレベルまで、それぞれアレルゲンＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２を認識することが可能である。ＡｌｌｅｒＤＭ１．４２、ＤＭ２．４及びＤＭ２．１０は、ＡｌｌｅｒＤＭ免疫原性に最も寄与するが、各マウスは、ＡｌｌｅｒＤＭ２．９以外のＡｌｌｅｒＤＭ中に存在する他のＣＯＰと反応する（パネルＢ）。

【発明を実施するための形態】

【0062】

本発明を、次の実験手順及び結果を参照しながら例として以下に記載する。

【0063】

材料及び方法
アレルゲン
精製された天然Ｄｅｒ ｐ１（ＮＡ−ＤＰ１−２）及び天然Ｄｅｒ ｐ２（ＮＡ−ＤＰ２−２）を、英国のIndoor Biotechnologies Ltdから得た。

【0064】

ペプチドの選択及び合成
この目的は、以下に示された配列番号２７（Ｄｅｒ ｐ１）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ配列Ｐ０８１７６．２及び配列番号２８（Ｄｅｒ ｐ２）ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦＪ６８０６７．１として以下に表されたＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２タンパク質配列内に存在する全てのＴ細胞エピトープを提示する共に、Ｂ細胞エピトープの安定した三次構造の形成を防止することであった。Ｄｅｒ ｐ２が、開示が参照により本明細書に取り込まれる過去の特許出願ＷＯ２００４−０８１０２８（Ａ２）に記載されたＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ４９２７８．１（配列番号２９）を有する複数のアイソタイプ中に存在することが、留意されなければならない。ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦＪ６８０６７．１と成熟タンパク質（単一ペプチドを含まない）のＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ４９２７８．１配列の間に、４アミノ酸差が存在する。配列も異なっており、１つのペプチドのＮ末端が切断されているためにＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ４９２７８．１配列の方が短い。

【0065】

配列番号２７
Ｄｅｒ ｐ１配列
ＭＫＩＶＬＡＩＡＳＬＬＡＬＳＡＶＹＡＲＰＳＳＩＫＴＦＥＥＹＫＫＡＦＮＫＳＹＡＴＦＥＤＥＥＡＡＲＫＮＦＬＥＳＶＫＹＶＱＳＮＧＧＡＩＮＨＬＳＤＬＳＬＤＥＦＫＮＲＦＬＭＳＡＥＡＦＥＨＬＫＴＱＦＤＬＮＡＥＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬ
ＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ

【0066】

配列番号２８
Ｄｅｒ ｐ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＦＪ６８０６７．１）
ＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＬＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＬＧＤＮＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0067】

配列番号２９
Ｄｅｒ ｐ２配列（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ配列Ｐ４９２７８．１）
ＭＭＹＫＩＬＣＬＳＬＬＶＡＡＶＡＲＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＴＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＭＧＤＤＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0068】

結果として、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２配列に沿ってオーバーラップする以下のＣＯＰが、選択された。

【0069】

配列番号１
ＡｌｌｅｒＤＭ１．１（８１ＡＡ）
ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥ

【0070】

配列番号２
ＡＬＬＥＲＤＭ１．２（８６ＡＡ）
ＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨ

【0071】

配列番号３
ＡＬＬＥＲＤＭ１．３（８６ＡＡ）
ＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ

【0072】

配列番号４
ＡＬＬＥＲＤＭ１．４（６６ＡＡ）
ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡ

【0073】

配列番号５
ＡＬＬＥＲＤＭ１．５（７３ＡＡ）
ＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥ

【0074】

配列番号６
ＡＬＬＥＲＤＭ１．６（７３ＡＡ）
ＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴ

【0075】

配列番号７
ＡＬＬＥＲＤＭ１．７（４０ＡＡ）
ＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ

【0076】

配列番号８
ＡＬＬＥＲＤＭ１．４２（７０ＡＡ）
ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧ

【0077】

配列番号９
ＡＬＬＥＲＤＭ１．５２（６４ＡＡ）
ＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥ

【0078】

配列番号１０
ＡＬＬＥＲＤＭ１．６２（６３ＡＡ）
ＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤ

【0079】

配列番号１１
ＡＬＬＥＲＤＭ１．７２（４３ＡＡ）
ＡＱＧＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ

【0080】

配列番号１２
ＡＬＬＥＲＤＭ１．５３（３７ＡＡ）
ＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳ

【0081】

配列番号１３
ＡｌｌｅｒＤＭ１．５４（３５ＡＡ）
ＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥ

【0082】

配列番号１４
ＡｌｌｅｒＤＭ１．６３（３５ＡＡ）
ＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲ

【0083】

配列番号１５
ＡｌｌｅｒＤＭ１．６４（３４ＡＡ）
ＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤ

【0084】

配列番号１６
ＡＬＬＥＲＤＭ２．１（７２ＡＡ）
ＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＴＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡ

【0085】

配列番号１７
ＡＬＬＥＲＤＭ２．２（７３ＡＡ）
ＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＭＧＤＤＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0086】

配列番号１８
ＡＬＬＥＲＤＭ２．３（２５ＡＡ）
ＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥ

【0087】

配列番号１９
ＡＬＬＥＲＤＭ２．４（５６ＡＡ）
ＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＬＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫ

【0088】

配列番号２０
ＡＬＬＥＲＤＭ２．５（５６ＡＡ）
ＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＬＧＤＮＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0089】

配列番号２１
ＡＬＬＥＲＤＭ２．６（３１ＡＡ）
ＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲ

【0090】

配列番号２２
ＡＬＬＥＲＤＭ２．７（７５ＡＡ）
ＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＬＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡ

【0091】

配列番号２３
ＡＬＬＥＲＤＭ２．８（４１ＡＡ）
ＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＬＧＤＮＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0092】

配列番号２４
ＡＬＬＥＲＤＭ２．１０（５７ＡＡ）
ＳＩＤＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＬＧＤ

【0093】

配列番号２５
ＡＬＬＥＲＤＭ２．９（２１ＡＡ）
ＫＶＬＧＤＮＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ

【0094】

配列番号２６
ＡＬＬＥＲＤＭ１．５ａ（３２ＡＡ）
ＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥ

【0095】

ＩｇＥ結合の決定を可能にするために、ＣＯＰの全てを研究規模で固相Ｆｍｏｃ化学作用により合成した。分取ＨＰＬＣを利用し、９０％を超える純度のペプチドを得て凍結乾燥した。ペプチドを水中で２ｍｇ／ｍｌに、又はＤＭＳＯ中で１０〜２０ｍｇ／ｍｌに再
懸濁し（表１参照）、分取したものを凍結した。

【0096】

競合ＥＬＩＳＡ
１．０μｇ／ｍｌの精製されたＤｅｒ ｐ１又はＤｅｒ ｐ２を、９６ウェルNunc Maxisorp（登録商標）イムノプレート(スイス、WohlenのThermo Fisher Scientific Inc.)に一晩コーティングした。１％ＢＳＡでブロックした後、患者の血清の２０倍、３０倍又は４０倍から２００倍までの希釈液を、特異的ＩｇＥ量に応じて添加した。その後、５μｇ／ｍｌのビオチンマウス抗ヒトｍＡｂ ＩｇＥ(CA州San DiegoのBioLegend)を添加して、Streptavidin HRP (CA州San DiegoのBD-Biosciences)及び基質ＴＭＢを用いて抗体を明らかにした。アレルギー患者の血清を米国及び欧州から得て(それぞれ米国WA州EverettのPlasmaLab International及びフランス、LyonのBiomnis)、D. pteronyssinusの陽性ＣＡＰ
及びバックグランドを超える明確なシグナルに関して選択し、ペプチドとの競合をテストするために用いた。１０^−５〜１０^−１０Ｍの範囲内の濃度のＣＯＰの各セット、即ちＤｅｒ ｐ１では Ｓｅｔ Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ、そしてＤｅｒ ｐ２ではミックスＤ、Ｅ又
はＦを、選択された血清と共に氷上で１５分間プレインキュベートした。その後、ｎＤｅｒ ｐ１又はｎＤｅｒ ｐ２をコーティングした９６ウェルプレート上で血清をインキュベートして、残留するＩｇＥ結合を先に記載された通り決定した。ｎＤｅｒ ｐ１及びｎＤｅｒ ｐ２の希釈液を、阻害の対照として用いた。

【0097】

ＲＢＬ脱顆粒
脱顆粒アッセイを、非特許文献３７に記載された通り実施した。ヒトＦｃεＲＩ受容体でトランスフェクトされたＲＢＬ−７０３／２１細胞を、９６ウェル組織培養プレート（１０５細胞／ウェル）中で一晩、平板培養した。ＲＢＬ−７０３／２１細胞の受動感作を、１：２０比のイエダニアレルギー患者の血清と共に用いて一晩実施した。翌日、細胞層をHanksバランス塩溶液（Gibco, Life technologies）で２回洗浄することにより、非結
合抗体を除去した。Tyrode緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ
ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ）で希釈された指示濃度のｎＤｅｒ ｐ１、ｎＤｅｒ ｐ２又は個々のＣＯＰ及びミックスを添加することにより、ＲＢＬ細胞の脱顆粒を３７℃で１時間誘導した。細胞上清３０μｌをクエン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ４．５）中、１．３ｍｇ／ｍｌ ４−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（Sigma）５０μ
ｌと共に３７℃で１時間インキュベートすることにより、β−ヘキソサミニダーゼ活性を分析した。グリシン緩衝液（０．２Ｍグリシン、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．７）１００μｌを添加することにより反応を停止させて、光学濃度（ＯＤ）を４０５ｎｍで測定した。

【0098】

マウスにおけるアナフィラキシー反応
１４日間隔で３回の皮下注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスに等モルのＤｅｒ ｐ１とＤｅｒ ｐ２のアレルゲンミックスを低用量（１μｇ）で反復注射して感作させた。最後の注射後７日目に、マウスを、Ｄｅｒ ｐ１と Ｄｅｒ ｐ２のミックス（３０μｇ／動物
）又はＡｌｌｅｒＤＭ ＣＯＰ（３０μｇ／動物）のいずれかの高用量でチャレンジした。非特許文献３８に適合された６段階のスケール（０：症状なし〜５：死亡）を利用して、アナフィラキシー症状をスコアリングした。デジタル温度計を用いて、直腸温度をチャレンジ後１５分間隔で６０分間、モニタリングした。ＰＢＳを、チャレンジ誘導の対照として用いた。

【0099】

ＡｌｌｅｒＤＭの免疫原性
Ｄｅｒ ｐ１、Ｄｅｒ ｐ２アレルゲン及び個々のＡｌｌｅｒＤＭ ＣＯＰを、Ｂａｌｂ／ｃマウスにｉ．ｐ．注射した。 アレルゲン及びペプチドを、完全Freundアジュバン
トと共に与えた。注射を、不完全Freundアジュバントを用いて１ヶ月間隔で２回反復した
。血液を最後の注射後１５日目に後眼窩洞から採取し、血清を標準法により調製した。結果は、μｇ／ｍｌの特異的ＩｇＧとして表す。

【0100】

実験結果
ペプチドの選択
Ｄｅｒ ｐ１
ＩｇＥ結合が低下した製品について選択するために、長鎖の（３０〜９０アミノ酸）連続したオーバーラップペプチド（ＣＯＰ）の４セットを、全Ｄｅｒ ｐ１アレルゲン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８１７６．２）を含むように考案し、これにより可能なＴ細胞エピトープの全てを提供した。３種のＣＯＰの最初のセット、つまりＡｌｌｅｒＤＭ１．１、１．２及び１．３（それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３）で構成されたＤｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ａは、特許出願「Allergen peptide fragments and use thereof」ＷＯ２００４／０８１０２８（Ａ２）で既に提案されている。Ｄｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ａ ＣＯＰを合成及び精製し、競合ＥＬＩＳＡを利用してＩｇＥ結合についてアッセイした。残留するＩｇＥ結合は、イエダニに対してアレルギーのある患者からの異なる血清で、ＡｌｌｅｒＤＭ１．２及びＡｌｌｅｒＤＭ１．３に対しては観察されたが、ＡｌｌｅｒＤＭ１．１では観察されなかった。

【0101】

文献による潜在的ＩｇＥ結合領域を考慮して第二のセット（Ｄｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ｂ）を考案し、競合ＥＬＩＳＡによりＩｇＥ結合についてテストした。Ｄｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ｂ、つまりＡｌｌｅｒＤＭ１．４、１．５、１．６、１．７（それぞれ配列番号４、５、６、７）のミックスは、残留するＩｇＥ反応性を示した。ａ．個々のペプチドを用いた場合に、ＡｌｌｅｒＤＭ１．４及び１．７は、検出可能なＩｇＥ結合を示さなかったが、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５及び１．６は、これまでにＡｌｌｅｒＤＭ１．２及び１．３で又は完全なＤｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ｂで観察された反応性を担うことが見出された。

【0102】

ＡｌｌｅｒＤＭ１．５は、２つのシステイン含んでいたが、それらはジスルフィド架橋を再形成してＩｇＥエピトープを再構成する可能性がある。このためＣ−末端システインを除去して、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２（配列番号９）を誘導したが、残念なことにそれは依然としてＩｇＥに結合していた。ＡｌｌｅｒＤＭ１．６では、Ｃ−末端部分の短縮は、ＩｇＥ結合にも影響を有さなかった（ＡｌｌｅｒＤＭ１．６２、配列番号１０）。ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２のＮ−末端及びＡｌｌｅｒＤＭ１．６２のＣ末端が修飾されたため、十分なオーバーラップを提供して可能なＴ細胞末端エピトープを確実に存在させるために、ＡｌｌｅｒＤＭ１．４及び１．７の代わりとなるペプチドを考案しなければならなかった。ＡｌｌｅｒＤＭ１．４２及び１．７２は、オーバーラップ領域にさらなる４及び３アミノ酸を受け取った（それぞれ配列番号８及び１１）。残留するＩｇＥ結合を示すＡｌｌｅｒＤＭ１．５２及び１．６２を含む候補Ｄｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ｃは、このため排除された。

【0103】

Ｄｅｒ ｐ１及びこれまで合成されたペプチドの３Ｄ構造をモデリングした後、更なるセット、即ちＤｅｒｐ１＿Ｓｅｔ Ｄを調製して、ＩｇＥ結合ペプチドＡｌｌｅｒＤＭ１．５２及び１．６２のそれぞれをさらに分割した。ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２を、２つのペプチド、即ちＡｌｌｅｒＤＭ１．５３及び１．５ａ（それぞれ配列番号１２及び２６）に分割し、ＡｌｌｅｒＤＭ１．６２を、ＡｌｌｅｒＤＭ１．６３及び１．６４（それぞれ配列番号１４及び１５）に分割した（図１）。これらのペプチドは、最終的に任意の検出可能なＩｇＥ結合を示さず、全ての可能なＩｇＥエピトープが除去されていることが示された。１．５３と１．５ａは、アミノ酸５つだけがオーバーラップしていたため、８アミノ酸がオーバーラップしている長いタイプのＡｌｌｅｒＤＭ１．５４（配列番号１３）を合成し、それはＡｌｌｅｒＤＭ１．５ａと同じＩｇＥ非結合特性を示した。この知見から、３アミノ酸によるＣＯＰ末端の変化が、ＩｇＥ結合能に影響を有さないことが示される。
領域Ｒ２４８〜Ｒ２５４が潜在的に結合するＩｇＥのためにこれまで保持されていなかったため、ＡｌｌｅｒＤＭ１．６２を２つの切片に分割しなければならないというのは、現行の知識では予測されなかった（背景技術を参照）。検出可能なＩｇＥ結合を含まないＤｅｒ ｐ１から発したＣＯＰの最後のセットは、６つのペプチド、即ちＡｌｌｅｒＤＭ１．４２、１．５３、１．５４、１．６３、１．６４及び１．７２（それぞれ配列番号８、１２、１３、１４、１５及び１１）を含む。

【0104】

Ｄｅｒ ｐ２
ＣＯＰの第一のセットは、過去の特許出願ＷＯ２００４／０８１０２８（Ａ２）(Ｄｅ
ｒ ｐ２アイソタイプＰ４９２７８．１）（配列番号２９）から得られ、同じ鎖長の２種のペプチド：ＡｌｌｅｒＤＭ２．１及び２．２（配列番号１６及び１７）が含まれた。このＣＯＰのセット（Ｄｅｒｐ２＿Ｓｅｔ Ａ）は、競合ＥＬＩＳＡにおいて低くとも検出可能なＩｇＥ結合を示し、ＡｌｌｅｒＤＭ２．２が、直接的ＥＬＩＳＡにおいてＩｇＥに結合することが見出された。Ｄｅｒ ｐ２の３Ｄ構造の維持における役割を果たすことが知られた２つの短いループを担うジスルフィド架橋を防止するために、ＡｌｌｅｒＤＭ２．３、２．４及び２．５（配列番号１８、１９及び２０）で構成されたＤｅｒｐ２＿ＳｅｔＢを考案した。並行して、ジスルフィド架橋が保持された別のセット（Ｄｅｒｐ２＿ＳｅｔＣ）、即ちＡｌｌｅｒＤＭ２．６、２．７及び２．８（配列番号２１、２２及び２３）を合成した。セットＢ及びＣは両者とも、競合ＥＬＩＳＡにおいて残留するＩｇＥ結合を示した。セットＢにおいて、直接的ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡの両方により確認すると、ＩｇＥ結合は、ＡｌｌｅｒＤＭ２．５に限定された。セットＣからの個々のＣＯＰへのＩｇＥの結合は、多重であることを示した。Ｄｅｒ ｐ２の中央部分を含むＡｌｌｅｒＤＭ２．７は、競合ＥＬＩＳＡにおいて残留するＩｇＥ結合を示したが、ＡｌｌｅｒＤＭ２．８（Ｄｅｒ ｐ２のＣ末端部分）は、アレルギー及び非アレルギードナーの血清から得たＩｇＥに非特異的に結合することが見出された。加えて、Ｄｅｒｐ２＿ＳｅｔＣは、ＲＢＬ脱顆粒アッセイにおいて弱くとも検出可能な応答を誘発し、それゆえさらなるＡｌｌｅｒＤＭ生成から排除された。

【0105】

驚くべきことに、Ｄｅｒｐ２＿ＳｅｔＢ（ＡｌｌｅｒＤＭ２．３、２．４及び２．５）は、ＲＢＬアッセイにおいて好塩基球の脱顆粒を誘導することができたが、Ｄｅｒｐ２＿ＳｅｔＡ（Ａｌｌｅｒ ＤＭ２．１及び２．２）は、誘導しなかった（図２）。さらに、組み合わせでのＡｌｌｅｒＤＭ２．４及び２．５は、脱顆粒をもたらしたが、それぞれの個別のペプチドは、もたらさなかった（図２、パネルＣ）。同じ現象が、ＡｌｌｅｒＤＭ２．１とＡｌｌｅｒＤＭ２．５との組み合わせにおいても観察された。ＡｌｌｅｒＤＭ２．１及びＡｌｌｅｒＤＭ２．４は、競合ＥＬＩＳＡにおいて単独でテストした場合にＩｇＥに結合せず、脱顆粒を惹起することに加えて、２つのＩｇＥエピトープが必要となるため、これらの結果から、溶液中で２つのペプチド：ＡｌｌｅｒＤＭ２．４とＡｌｌｅｒＤＭ２．５の間に若干の相互作用が起こり、アレルゲンの本来の３Ｄ構造の部分的再構成が誘導されて、これにより第二のＩｇＥエピトープが再形成される可能性が生じた。

【0106】

先の結果を考慮してＤｅｒ ｐ２結晶構造を分析することで、ＡｌｌｅｒＤＭ２．４及び２．５が逆平行βシートの存在により溶液中で部分的にリフォールディングし、一緒になって第二のＩｇＥ結合部位を再形成する可能性が提示された。Ａｌｌｅｒ ＤＭ２．１又は２．４のいずれかと組み合わせられたＡｌｌｅｒ ＤＭ２．２は、脱顆粒を誘導しなかったため、Ｓ５７〜Ｃ７３を次のＣＯＰのセットのＡｌｌｅｒＤＭ２．５のＮ末端に付加して、ＡｌｌｅｒＤＭ２．１０（配列番号２４）を誘導した。ＩｇＥ結合能力をさらに低下させるために、ＡｌｌｅｒＤＭ２．１０をＣ末端でＤ１１３まで切除した。ＡｌｌｅｒＤＭ２．１０との最小限のオーバーラップ（５アミノ酸）を維持するためには、ＡｌｌｅｒＤＭ２．９（配列番号 ２５）を、完全なＤｅｒ ｐ２配列を含むように、Ｋ１０９から始めて合成しなければならなかった。Ｄｅｒｐ２＿ＳｅｔＤ （ＡｌｌｅｒＤＭ２．
３、２．４、２．１０及び２．９）及び個々の成分は、競合ＥＬＩＳＡにおいて残留するＩｇＥ結合を示さず、好塩基球脱顆粒をもはや惹起することができなかった。こうしてＤｅｒ ｐ２から発した最後のＣＯＰのセットは、４種のペプチド、即ちＡｌｌｅｒＤＭ２．３、２．４、２．１０及び２．９（それぞれ配列番号１８、１９、２４及び２５）が含まれる。

【0107】

さらなる知見から、ＩｇＥ結合及び好塩基球脱顆粒が、変性塩の使用から起こった溶液中の本来の３Ｄ構造の部分的再構成に関係することが示された。塩化グアニジニウム又は尿素をはじめとする変性塩の添加は、ＡｌｌｅｒＤＭ１．５２、１．６２及び２．２へのＩｇＥ結合を大幅に低下させた（図３）。このことから、アレルゲンフラグメントの注射により潜在的な即時型アレルギー反応を低下させる製剤の代替物が示される。

【0108】

ＡｌｌｅｒＤＭ
ＩｇＥ結合の非存在をさらに検証するために、ここではＡｌｌｅｒＤＭと称するＤｅｒ
ｐ１及びＤｅｒ ｐ２の両方から得られたペプチド１０種、即ちＡｌｌｅｒＤＭ１．４２、１．５３、１．５４、１．６３、１．６４及び１．７２（それぞれ配列番号 ８、１２、１３、１４、１５及び１１）とＡｌｌｅｒＤＭ２．３、２．４、２．１０及び２．９（それぞれ配列番号 １８、１９、２４及び２５）の組み合わせで構成された最後のミックスを、競合ＥＬＩＳＡ及びＲＢＬ脱顆粒テストにおいて用いた。図４に認められる通り、ＡｌｌｅｒＤＭは、１０^−５Ｍ濃度まで、欧州及び米国の両方のイエダニに対してアレルギーのある患者の血清２１種との検出可能な反応性を示さなかった。Ｄｅｒ ｐ１又はＤｅｒ ｐ２のいずれかの天然アレルゲンを用いた対照は、１０^−７〜１０^−９Ｍの範囲内で予測された競合を示した。ＩｇＥ結合の低下により、ヒトにおいては、伝統的ＳＩＴ処置に比較して高用量のＣＯＰを投与するという判断が可能になる。

【0109】

ヒトＦｃε受容体ＩでトランスフェクトされたＲＢＬ細胞が、アレルゲンの存在下でヒトＩｇＥに結合し、脱顆粒することが見出された（非特許文献３７）。同じく１０^−５ＭまでのＡｌｌｅｒＤＭは、イエダニに対してアレルギーのある患者の異なるヒト血清１８種をＲＢＬ細胞に予め負荷した場合に、好塩基球脱顆粒を惹起することができなかった（図５Ａ及びＢ）。これに反して、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２は、同じ血清の組み合わせにおいて脱顆粒を誘導することができた。好塩基球の脱顆粒がないことは、ヒトへの適用の際に即時型アレルギー反応のリスクの潜在的低下を示している。

【0110】

これらの実験から、ＡｌｌｅｒＤＭと称するＣＯＰ １０種で構成された好ましい製品が、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２の両方のタンパク質から得られた可溶性ペプチドの組み合わせを含むと結論づけることができる。好ましい製品候補は、配列番号：８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号２５で構成されることになる。

【0111】

本発明のさらなる改善は、ＣＯＰを、精製及び可溶性特性が改善された部分に分割することを含む。同じく、ＨＤＭに対してアレルギーのある患者のＩｇＥ抗体に対する相同体の反応性が排除されながらＴリンパ球との反応性が依然として保持されている該相同体を生成するために、各ペプチド内のアミノ酸変化によるＣＯＰ ＡｌｌｅｒＤＭ１．４２〜１．７２及びＡｌｌｅｒＤＭ２．３〜２．１０の相同体が企図される。さらに、イエダニアレルゲンＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２内のＣＯＰの限界をシフトすることにより、ＣＯＰの相同体が企図される。そのような相同体は、非検出可能ＩｇＥ結合及びＴリンパ球活性の同等のプロファイルを有する製品をもたらすであろう。そのような製品は、ヒトにおける安全性及び有効性に関してＡｌｌｅｒＤＭと同じ能力を示し、他に断りがなければ、処置への変更に関して同等とみなされ得る。イエダニＩｇＥ抗体への反応性を有さず、同時にＴリンパ球への反応性を維持していることを特徴とする適切な相同体が、本明細書
に記載された方法により同定され得る。

【表1】

【0112】

感作及びチャレンジ
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｄｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２アレルゲンのミックス（１μｇ／ｍｌ）の反復皮下注射により感作させた。最後の注射後７日目に、マウスを単回大量投与されたアレルゲン（３０μｇ／ｍｌのＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２）又はＡｌｌｅｒＤＭ（３０μｇ／ｍｌ）でチャレンジした。アナフィラキシーショックは、体温降下を伴った。対照及びＡｌｌｅｒＤＭチャレンジにより本質的な温度降下は生じなかったが、Ｄｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２ミックスは、直腸温度の著しい低下を誘導した（図６）。これらの結果は、ＡｌｌｅｒＤＭがチャレンジ活性を有さないことで親アレルゲンと異なることを示しており、ＡｌｌｅｒＤＭがＤｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２感作マウスのアナフィラキシーショックを惹起しないことが示される。

【0113】

免疫化
ＡｌｌｅｒＤＭ及びＤｅｒ ｐ１／Ｄｅｒ ｐ２を、Freundアジュバントと共にＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。ＩｇＧレベルを、腹腔内注射の後に測定した（図７）。ＡｌｌｅｒＤＭミックスにより上昇されたＩｇＧは、天然のＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２を本来のアレルゲンそのものとほとんど同じ延長部（extend）まで認識する（図７、パネルＡ）。別の実験において、各個別のＣＯＰに対するＩｇＧの存在を、ＡｌｌｅｒＤＭで免疫化されたマウスの血清中で検出し（図７、パネルＢ）、各ＣＯＰが、異なる程度ではあるが、全体的免疫原性に寄与し得ることが示される。

【0114】

本発明の変形例
同じく、イエダニに対してアレルギーのある患者のＩｇＥ抗体に対する相同体の反応性が排除されながらＴリンパ球への反応性が依然として保持されている該相同体を生成するために、各ペプチド内のアミノ酸変化によるＡｌｌｅｒＤＭ１．４２〜ＤＭ２．１０ＣＯＰの相同体が企図される。さらに、イエダニアレルゲンＤｅｒ ｐ１及びＤｅｒ ｐ２内のＣＯＰの限界をシフトすることにより、ＣＯＰの相同体が企図される。そのような相同体は、非検出可能ＩｇＥ結合及びＴリンパ球活性の同等のプロファイルを有する生成物をもたらすであろう。そのような製品は、ヒトにおける安全性及び有効性に関してＡｌｌｅｒＤＭと同じ能力を示し、他に断りがなければ、処置への変更に関して同等とみなされ得る。イエダニＩｇＥ抗体への反応性を有さず、同時にＴリンパ球への反応性を維持していることを特徴とする適切な相同体が、本明細書に記載された方法により同定され得る。同じく、ＩｇＥの反応性が低下又は排除されてＴリンパ球反応性が保持されるが、可溶性もあり、そして／又は合成及び精製の改善を示すＣＯＰのセットが企図される。

【0115】

本発明の実践における数多くの改良及び変形は、目下好ましい実施形態を考慮する際に当業者に発案されるものと予測される。結論として、本発明の範囲に課されるべきわずかの限定は、添付の特許請求の範囲において認められるものである。

【0116】

本発明の実践における数多くの改良及び変形は、目下好ましい実施形態を考慮する際に当業者に発案されるものと予測される。結論として、本発明の範囲に課されるべきわずかの限定は、添付の特許請求の範囲において認められるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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