特許 6641179 トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6641179

(24)【登録日】2020年1月7日

(45)【発行日】2020年2月5日

(54)【発明の名称】トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20200127BHJP

   A23C 9/13 20060101ALI20200127BHJP

   A23C 9/152 20060101ALI20200127BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20200127BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 9/38 20060101ALI20200127BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20200127BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200127BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/63 Z

   A23C9/13

   A23C9/152

   A23L33/17

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N9/10ZNA

   C12N9/38

   C12P19/04

   C12P21/02 C

【請求項の数】17

【全頁数】87

(21)【出願番号】特願2015-515540(P2015-515540)

(86)(22)【出願日】2013年6月7日

(65)【公表番号】特表2015-518729(P2015-518729A)

(43)【公表日】2015年7月6日

(86)【国際出願番号】EP2013061819

(87)【国際公開番号】WO2013182686

(87)【国際公開日】20131212

【審査請求日】2016年5月31日

【審判番号】不服2018-6391(P2018-6391/J1)

【審判請求日】2018年5月9日

(31)【優先権主張番号】61/657,180

(32)【優先日】2012年6月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】12171335.8

(32)【優先日】2012年6月8日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513207806

【氏名又は名称】デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(72)【発明者】

【氏名】ラーセン、モルテン・クロッグ

(72)【発明者】

【氏名】クレーマー、ジェイコブ・フライホルム

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 松岡 徹

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 ＪＯＲＧＥＮＳＥＮ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００１），Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．６４７−６５２

【文献】 Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（５５０９ｂｐ）， ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＪ２２４４３５， （Ｏｃｔ． １９， ２００６）， ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｏｎ ２０１７−０３−１４］， Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ， ＵＲＬ， ＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＪ２２４４３５．２？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｉｒｅｖｈｉｓｔ＞

【文献】 Ｍφｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００１， Ｖｏｌ．６７， ｐ．２２７６−２２８３

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90

Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。

【請求項2】

配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１のポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１のポリペプチド。

【請求項4】

配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記ポリペプチドが１００％より高いトランスガラクトシル化活性の比を有する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が少なくとも１．５である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

請求項１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。

【請求項8】

請求項７の核酸を含むか、または請求項１乃至６のいずれか１項のポリペプチドを発現することができる、発現ベクター。

【請求項9】

請求項１乃至６のいずれか１項のポリペプチドを発現することができる細胞。

【請求項10】

請求項１乃至６のいずれか１項のポリペプチドを発現する方法であって、前記方法が、請求項９の細胞を入手する工程、および
この細胞から前記ポリペプチドを発現する工程を含む、方法。

【請求項11】

更に、前記ポリペプチドを精製する工程を含む、請求項１０の方法。

【請求項12】

請求項１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド及びラクトースを含む、組成物。

【請求項13】

前記組成物が食品組成物である、請求項１２の組成物。

【請求項14】

前記食品組成物が乳製品である、請求項１３の組成物。

【請求項15】

ラクトースを含む基質をポリペプチドで処理することによる、食品を製造する方法であって、
前記ポリペプチドは、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、および
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９２％の配列同一性を有するとともに、９７５個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
からなる群より選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである、食品を製造する方法。

【請求項16】

請求項１５の食品を製造する方法であって、前記ラクトースを含む基質が、ラクトースを含む全乳、低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳粉、コンデンスミルク、乾燥ミルク、ＵＨＴミルク、ホエイ、ホエイ透過物、酸性ホエイ、又はクリームの溶液又は懸濁液であり、前記食品が乳製品である、食品を製造する方法。

【請求項17】

ａ．配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、および
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９２％の配列同一性を有するとともに、９７５個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
からなる群より選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドを発現することができる細胞にラクトースを含む基質を接触させる工程を含む、ガラクトオリゴサッカライドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はポリペプチド、特にトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド、これをコードする核酸、およびそれらの利用、例えば乳製品中への使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ガラクトオッリゴサッカライド（ＧＯＳ）は、グリコシド結合により結合された、通常９つまでの、１つまたはそれ以上のガラクトース分子を含む、ヒトおよび動物において非消化性の炭水化物である。ＧＯＳは１つ以上のグルコース分子も含む。ＧＯＳの有利な効果の一つはバクテリアのような有効な細菌性微生物の増殖を選択的に刺激することにより、プロバイオティック化合物として作用し、消費者に身体的な利益を提供するそれらの能力である。確立された健康効果は各種食品について食品添加物としてＧＯＳにおける関心が高まる結果となっている。

【0003】

β−ガラクトシダーゼ酵素（ＥＣ３．２．１．２３）は通常ラクトースを単糖、Ｄ−グルコース、およびＤ−ガラクトースに加水分解する。β―ガラクトシダーゼの通常酵素反応において、この酵素はラクトースを加水分解し、および過渡的にガラクトースを輸送するガラクトース酵素複合体のガラクトースモノサッカライドを水の水酸基に結合して、その結果、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−グルコースを生じる。しかしながら、高いラクトース濃度において、いくつかのβ―ガラクトシダーゼはトランスガラクトシル化と呼ばれるプロセスにおいて、Ｄ−ガラクトースまたはＤ−グルコースの水酸基にガラクトースを移すことができる。それによって、ガラクト−オリゴサッカライドが生産される。また、高いラクトース濃度において、いくつかのβ−ガラクトシダーゼはガラクトースをラクトースまたはより高次のオリゴサッカライドの水酸基に移すことができる。

【0004】

ビフィドバクテリウム属は各種乳製品の発酵のための酪農工業においてバクテリアの培養に通常用いられている。更に、ビフィドバクテリウム含有製品の経口摂取は健康促進効果がある。この効果は腸内容物の低められたｐＨにより達成されるだけでなく、例えば抗生物質の摂取により腸内菌叢が分散されてしまった個体における腸内菌叢を再構築させることができるビフィドバクテリウム属の能力にもよる。ビフィドバクテリウムは更に有害な腸内微生物と競争して（これらを）負かす能力を有している。

【0005】

ガラクトオリゴサッカライドはビフィドバクテリウムの成長を促進することが知られている。この効果は炭素源としてガラクト−オリゴサッカライドを利用するビフィドバクテリウムの独特の能力により達成されるようである。ガラクト−オリゴサッカライドの食品サプリメントは更にかなりの長期間病気を予防する効果があるとも考えられている。例えば、ガラクトオリゴサッカライドの摂取はラットにおいて大腸癌の進行に対して高い予防効果があることが示されている。それゆえ、（健康）補助食品および乳製品の改良のために、工業において用いるためのガラクト−オリゴサッカライドの製造について安価で効果的な方法の開発に大きな興味が注がれている。

【0006】

約５８０番目のアミノ酸で切断されたビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＭＳ２０２１５（ＢＩＦ３−ｄ３）は水中に可溶化されたラクトースを含む溶液においてトランスガラクトシル化酵素として説明されている（Ｊoｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：６４７−６５２）。ＷＯ０１／９０３１７はトランスガラクトシル化酵素としての切断変異体（ＯＬＧＡ３４７）を記載している。ＷＯ２０１２／０１０５９７においてＯＬＧＡ３４７はガラクトース部分をＤ−フルクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、およびキシロースに転移することが示されている。

【0007】

ＷＯ２００９／０７１５３９において、ＢＩＦ３−ｄ３とは違ったやり方で切断されたフラグメントがミルク中で試験した時に、効率的な加水分解能を有し、ＧＯＳの生産が非常に低いという結果が開示されている。

【0008】

前述のビフィドバクテリウム・ビフィダムのラクターゼ酵素はＧＯＳを生産するために１０％（ｗ／ｗ）のような高いラクトース濃度を必要とするかまたはヘテロオリゴサッカライドを精製するために非常に多くの他のアクセプター分子を必要とするという欠点があった。更に、この分子は主にベータガラクトシダーゼ（加水分解）活性を有することが開示されている。

【0009】

ミルクのような低いラクトース基質レベルの製品においてＧＯＳを性相するのに効率的である酵素を開発する必要性がある。

【発明の概要】

【0010】

トランスガラクトシル化活性と加水分解活性との有用な比を有して、従ってミルクベース製品等の低いラクトースレベルにおいてインキュベートしたときにさえ効率的にＧＯＳを生成するポリペプチドを提供することが本発明の態様の目的である。本発明の態様の更なる目的は乳製品中においてその場でガラクトオリゴサッカライド（ＧＯＳ）を生成する方法を提供することである。本発明の態様の更なる目的は工業において用いるためのガラクトオリゴサッカライド（ＧＯＳ）のより安価でより効率的な方法を開発する方法を提供することである。本発明の態様の更なる目的は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）ＢＧ３５９４株等の好適な微生物において生成したときに、タンパク質分解等の更なる切断に対して耐性のあるポリペプチドを提供することである。本発明の態様の更なる目的は、最終的に製剤化された後の保存の間に更なる切断に耐性のあるポリペプチドを提供することである。

【0011】

本発明者らは、本明細書において開示されるポリペプチドが例えばミルク等のラクターゼ含有組成物中でインキュベートした時にその場でガラクト−オリゴサッカライドの有効な生産者となる驚くべき発見をした。それらは、ラクトースを効率的にＧＯＳへ変換してその結果遊離ラクトースの濃度が低くなった。乳製品または他の食料品においてガラクト−オリゴサッカライドが存在することは、それらの製品自体においておよび／またはこれらの製品を消費するヒトあるいは動物において、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の健康促進等の有利な微生物株（プロバイオティクス）の成長を高めるという利点をもたらす。

【0012】

１つの側面において、本明細書において開示されるのは、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１に少なくとも９０％同一な配列を有するアミノ酸配列を含む、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである。ここにおいて、このポリペプチドはこのポリペプチドをコードする核酸配列のバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株において発現された生成物であるとき、トランスガラクトシル化活性を有するこの核酸配列の唯一のポリペプチド発現生成物である。

【0013】

１つの側面において、本明細書に開示されるのは以下の群より選択されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである。
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有し、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の配列同一性を有し、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有し、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド
ｄ．少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖に、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも７０％の同一性を有する核酸または成熟ポリペプチドをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列を含む、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の１つ以上のアミノ酸残基において欠失、挿入、および／または保存置換を含むポリペプチド。

【0014】

他の側面において、本明細書で開示されるのは、以下の群から選択されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドである。
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有し、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有し、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列またはｉ）の相補鎖に、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも７０％の同一性を有する核酸または成熟ポリペプチドをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列を含む、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の１つ以上のアミノ酸残基において欠失、挿入、および／または保存置換を含むポリペプチド。

【0015】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、トランスガラクトシル化活性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のＣ末端切断フラグメントであって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株等の有用な微生物において生産された場合、タンパク質分解等の更なる切断に耐性がある、および／または最終製剤化された後の貯蔵の間の更なる切断に対して耐性のある、ポリペプチドである。

【0016】

１つ側面において、本明細書で開示されるのは、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチドである。

【0017】

１つ側面において、本明細書で開示されるのは、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチドである。
１つの側面において、本明細書で開示されるのは、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチドである。

【0018】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは本明細書で開示されているポリペプチドをコードすることができる核酸である。

【0019】

１つの側面において、本明細書は本明細書で開示された核酸を含む、または本明細書で開示されたポリペプチドを発現することができる、発現ベクターおよび／またはプラスミドである。

【0020】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、本明細書で開示されたポリペプチドを発現することができる細胞である。

【0021】

１つの側面において、本明細書で開示されるのはポリペプチドを発現する方法である。この方法は本明細書に記載の細胞を得る工程およびこの細胞にポリペプチドを発現させる工程を含み、任意でこのポリペプチドを精製する工程を含む。

【0022】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物であり、好ましくは食品組成物であり、より好ましくは乳製品である。

【0023】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは本明細書に記載のポリペプチドでラクトースを含むミルクベース基質を処理して、乳製品のような食品を製造する方法である。

【0024】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、本明細書に記載のポリペプチドでラクトースを含む基質を処理して得られた、ガラクト−オリゴサッカライドまたはそれらの組成物である。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における組み換え発現のためのＢＩＦ＿１３２６変異体のプラスミドマップを示す。

【図2】図２はＮａＣｌ濃度勾配を用いて溶出されたＨｙｐｅｒＱカラムを用いて精製された切断変異体を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図3】図３はトランスガラクトシル化活性の比を示す。この比はアクセプターがあるＡｂｓ４２０をアクセプターの無いＡｂｓ４２０で割って１００を掛けて計算した。

【図4】図４はヨーグルト基質中で３０℃で３時間での選択された変異体のガラクト−オリゴサッカライド（ＧＯＳ）精製効率を示す。

【図5】図５は表２からの異なる変異体が発現されていることと検出されたフラグメントの分解とを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。下のパネルは分解物バンドの程度と同定を示す。

【配列リスト】

【0026】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（本明細書では（ＢＩＦ＿９１７）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の８８７個の切断アミノ酸フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（本明細書では（ＢＩＦ＿９９５）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９６５個の切断アミノ酸フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（本明細書では（ＢＩＦ＿１０６８）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の１０３８ アミノ酸切断フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（本明細書では（ＢＩＦ＿１１７２）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の１１４２個の切断アミノ酸フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（本明細書では（ＢＩＦ＿１２４１）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の１２１１個の切断アミノ酸フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（本明細書では（ＢＩＦ＿１３２６）とも言う）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の１２９６個の切断アミノ酸フラグメントである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）グリコシドヒドロラーゼ触媒コアである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼをコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はＢＩＦ＿９１７をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はＢＩＦ＿９９５をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はＢＩＦ １０６８をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はＢＩＦ＿１１７２ をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はＢＩＦ＿１２４１をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はＢＩＦ＿１３２６ をコードしている塩基配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は上記ＢＩＦ変異体を生成するためのフォワードプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はＢＩＦ９１７のリバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はＢＩＦ９９５のリバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８はＢＩＦ１０６８のリバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９はＢＩＦ１２４１のリバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０は ＢＩＦ１３２６のリバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１はＢＩＦ１４７８の リバースプライマーである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３はビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列である。

【発明の詳細な説明】

【0027】

定義
この詳細な説明に従って、以下の略語および定義が用いられる。本明細書において用いられるように、単数形“ａ、”“ａｎ、”および“ｔｈｅ”は、別途明確に定義しない限り複数形も含まれる。従って、例えば、“（１つの）（ａ）ポリペプチド”はそのようなポリペプチドの複数も意味する。“（この）製剤”は１つ以上の製剤の参照も含み、および当業者に知られている均等物なども含む。

【0028】

別途定義しない限り、本明細書で用いられている全ての技術的および科学的用語は当業者に通常理解されている意味と同じ意味に用いられる。以下に用語の定義を記載する。

【0029】

「トランスガラクトシラーゼ」は、数あるなかでも、ガラクトースをＤ−ガラクトースまたはＤ−グルコースの水酸基に輸送して、ガラクト−オリゴサッカライドを生成することができる酵素を意味する。１つの側面において、トランスガラクトシラーゼは生成されたガラクトースの量が所与の時間において生成されたグルコースの量よりも少ない、ラクトースにおける酵素の反応により定義される。

【0030】

本文脈において、「トランスガラクトシル活性」の語はガラクトース部分を水以外の分子に輸送することを意味する。この活性は反応の間の所与の時間に生成された［グルコース］−［ガラクトース］として測定されるか、あるいは反応の間の所与の時間に生成されたＧＯＳの定量により測定することができる。この測定は実施例に示されているようなＨＰＬＣ法のようないくつかの方法で行うことができる。トランスガラクトシル化活性を比較したとき、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０％（Ｗ／Ｗ）のような、所与の初期のラクトース濃度で行われてきた。

【0031】

本文脈において、「β−ガラクトシダーゼ活性」の語は、β−ガラクトシドを加水分解して、例えばラクトースをグルコースおよびガラクトースのような単糖へ分解する酵素の能力を意味する。

【0032】

トランスガラクトシル化活性：β―ガラクトシダーゼ活性の計算に関する文脈において、β−ガラクトシダーゼ活性は反応の間の所与の時間において生成された［ガラクトース］として計算される。この測定は実施例で示されるように、ＨＰＬＣ法のようないくつかの方法により行うことができる。

【0033】

本文脈において、オルト−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＯＮＰＧ）を用いる「トランスガラクトシル化活性の比」の語は以下のように計算された。割合は受容体が存在するＡｂｓ４２０を受容体が存在しないＡｂｓ４２０で割って１００を掛けた。指数が１００以下の変異体は純粋な加水分解変異体であって、その一方で１００より高い指数は比較上のトランスガラクトシル化活性を示す。

【0034】

トランスガラクトシル化活性の比＝（Ａｂｓ４２０^{＋セロビオース}／Ａｂｓ４２０^{−セロビオース}）＊１００
式中、Ａｂｓ４２０^{＋セロビオース}は反応中にセロビオースを含む以下で説明する方法３を用いて４２０ｎｍの吸光度であり、Ａｂｓ４２０^{−セロビオース}は反応中にセロビオースを含まない、以下で説明する方法３を用いて４２０ｎｍの吸光度である。上記の式は吸光度が０．５乃至１．０の間になるように希釈された場合に有効である。

【0035】

１つの側面において、この活性は反応後１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分で測定された。従って、１つの側面において、例として、相対的なトランスガラクトシル活性は、酵素を添加して１５分後、酵素を添加して３０分後、酵素を添加して６０分後、酵素を添加して９０分後、酵素を添加して１２０分後、酵素を添加して１８０分後、に測定される。

【0036】

本文脈において、「ガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比」は（［グルコース］−［ガラクトース］／［ガラクトース］）を意味する。
本文脈において、［グルコース］の記載はＨＰＬＣ法で測定され、重量により、％で示されるグルコースの濃度を意味する。

【0037】

本文脈において、［ガラクトース］の記載はＨＰＬＣ法で測定され、重量により％で示されるガラクトースの濃度を意味する。

【0038】

本文脈において、「ラクトースがガラクトシル化される」の記載は、ガラクトース分子が共役結合的にラクトース分子に結合される、例えば、ラクトース分子中の遊離水酸基のいずれかに共役結合した、または、例えばアラビノース形成のような内部トランスガラクトシル化により生成された、ラクトース分子に共役結合している。

【0039】

本文脈において、ガラクトオリゴサッカライド（ＧＯＳ）生成における本明細書に開示されているポリペプチドの性能の評価は「ミルクベースアッセイ（偽ヨーグルト製品）」において試験された。１００μｌの容量でのバッチ試験を、９８．６０％（Ｗ／ｖ）の新鮮な低温殺菌された低脂肪ミルク（Ａｒｌａ Ｍｉｎｉ−ｍａｅｌｋ）および１．４％（ｗ／ｖ）Ｎｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５ホエイ成分（Ａｒｌａ）からなる、ヨーグルトミックスを用いて９６ウェルＭＴＰプレートで行った。Ｎｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５ホエイ成分を完全に加水分解するための、この混合物を２０時間混合したままにして、そのあと２０ｍＭＮａフォスターゼ ｐＨ６．５を添加して、ｐＨを６．５にした。このヨーグルトベースはプレーンで、または追加的なラクトース、フコース、マルトース、キシロース、または塩等の各種サプリメントと共のいずれかで用いられる。ヨーグルトの９０μｌを１０μｌの生成された酵素または粗発酵生成物と混合し、テープで密封し、４３℃で３時間インキュベートした。この反応は１００μｌの１０％ＮａＣＯ３で停止した。サンプルは−２０℃で貯蔵した。ガラクトオリゴサカライド（ＧＯＳ）、ラクトース、およびガラクトースの定量はＨＰＬＣで行った。サンプルの分析はＤｉｎｏｎｅｘＩＣＳ ３０００で行われた。ＩＣパラメータは以下のようであった：移動相：１５０ｍＭ ＮａＯＨ、フロー：Ｉｓｏｃｈｒａｔｉｃ、０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム：Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１、カラム温度：ＲＴ、注：１０μｌ、検出器：ＰＡＤ、注入器：マニュアル、サンプル調整：ミリＱ水で１００倍希釈（０．１ｍｌサンプル＋９．９ｍｌ水）および０．４５ｉｍシリンジフィルターでろ過、定量：標準物質のピーク面積における百分率でのピーク面積。ＧＯＳシロップ（ＶｉａｎａｌＧＯＳ、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｃａｍｐｉｎａ）をＧＯＳの定量のための標準物質として用いた。そのような評価の結果は図４に示し更に実施例２に記載する。

【0040】

本文脈において、用語「ポリペプチドが凍結乾燥されたもの（凍結乾燥されたポリペプチド）」の語は、このポリペプチドの溶液が敵切な圧力で適切な時間水を除去する凍結乾燥により得られたことを意味する。

【0041】

本文脈において、「ポリペプチドが溶液中にある」の語は、溶液に沈殿していない溶媒中に可溶化しているポリペプチドに関する。本目的のための溶媒は水溶性緩衝液または円溶液、発酵ブロス、または発現宿主細胞の細胞質等のポリペプチドが生じる任意の環境（ｍｉｌｌｉｅｕ）を含む。

【0042】

本文脈において、「安定剤」の語はポリペプチドを安定化させる任意の安定化剤を意味し、例えば、グリセロールまたはプロピレングリコール、糖または糖アルコール、酪酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）がある。１つの側面において安定化剤はグリセロールである。

【0043】

本文脈において、「炭水化物基質」の語は、一般式Ｃｍ（Ｈ_２Ｏ）ｎを有する、即ちジサッカライドのような炭素、水素、および酸素のみからなる、少なくとも2の水素対酸素の１：２の原子比を有する、有機化合物で意味する。

【0044】

本文脈において、「ジサッカライド」の語は、１つの単糖からの水素原子と他の単糖からの水酸基が欠失する、脱水反応を介する、グリコシド結合として知られている共役結合により結合された２つの単糖単位を意味する。未修飾ジサッカライドの式はＣ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１である。１つの側面において、このジサッカライドはラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、フコース、およびセロビオースである。更なる側面において、このジサッカライドはラクトースである。

【0045】

「単離された」の語は、天然に関係しておよび天然に見られるような自然の配列を備える少なくとも１つの他の成分から、この配列が少なくとも実質的に遊離していることを意味する。１つの側面において、本明細書で用いる「単離されたポリペプチド」はＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したときに、少なくとも３０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋であるポリペプチドを意味する。

【0046】

用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書において最大で１０％、より好ましくは最大で８％、より好ましくは最大で６％、より好ましくは最大で５％、より好ましくは最大で４％、最大で３％、さらにより好ましくは最大で２％、最も好ましくは最大で１％、および最も好ましくは最大で０．５％天然に存在している他のポリペプチド物質を重量により含むポリペプチド調整物を意味する。それは、従って、実質的に純粋なポリペプチドは調製物中に存在する総ポリペプチド物質の重量により、少なくとも９２％純粋、好ましくは少なくとも９４％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは「少なくとも９６％純粋、より好ましくは少なくとも９７％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９％純粋、最も好ましくは９９．５％純粋、さらに最も好ましくは１００％純粋である。本明細書において開示されているポリペプチドは好ましくは実質的に純粋な形態である。特に、このポリペプチドは本質的に純粋な形態であることがこのましい。即ち、自然において関連している他のポリペプチド物質が本質的にない、ポリペプチド調製物であることが好ましい。このことは、例えば、既知の組み換え法により、または従来の精製方法によりポリペプチドを調製することにより達成することができる。「実質的に純粋なポリペプチド」の語は「単離されたポリペプチド」および「単離された状態のポリペプチド」と同義である。

【0047】

「精製された」または「精製」の語は所与の成分が高いレベルで存在する、例えば、少なくとも約５１％純粋、少なくとも５１％純粋のような、または少なくとも７５％純粋、少なくとも７５％純粋のような、または少なくとも８０％純粋、少なくとも８０％純粋のような、または少なくとも約９５％純粋、少なくとも９５％純粋のような、または少なくとも９８％純粋、少なくとも９８％純粋のような。この成分は組成物中に存在する主要で活性成分であることが好ましい。

【0048】

本願発明に関する「微生物」の語は、本発明の塩基配列を含むことができる、または本明細書で定義される特定の性質を有するポリペプチドをコードする塩基配列、および／またはそれらから得られた生成物を含むことができる任意の「微生物」を含む。本文脈において、「微生物」の語はミルク基質を発酵させることができる任意のバクテリアまたは細菌を含む。

【0049】

本発明に関して用いる「宿主細胞」の語は、本明細書で定義する特定の性質を有するポリペプチドをコードしている核酸配列または上で定義され、本明細書で定義される特定の性質を有するポリペプチドの生成に用いられる発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞を含む。１つの側面において、この生成物は組み換え生成物である。

【0050】

本発明の文脈における「ミルク」の語は、牛、羊、ヤギ、バファロー、またはラクダ等の任意の哺乳動物から得られた乳分泌物であると理解される。本文脈において、「ミルクベース基質」の語は任意の生のおよび／または加工された乳物質またはミルク成分由来の物質を意味する。有用なミルクベース基質はラクトースを含む任意のミルクまたはミルク様生成物の溶液／懸濁液を含むがこれらに限定されず、全乳または低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳粉、コンデンスミルク、乾燥ミルクの溶液、ＵＨＴミルク、ホエイ、ホエイ透過物、酸性ホエイ、またはクリーム等がある。好ましくは、このミルクベース基質はミルクまたはスキムミルクパウダーの水溶液である。このミルクベース基質は生乳よりも濃縮されている。１つの態様において、このミルクベース基質はラクトースに対するタンパク質の割合が、少なくとも０．２、好ましくは少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．７である。このミルクベース基質は既知の方法で均質化および／または低温殺菌されていてもよい。

【0051】

本明細書で用いる「均質化する」の語は可溶性懸濁液または乳液を得るための徹底的
な混合を意味する。均質化は乳脂肪のサイズをより小さく壊してミルクと分離しないようにするために行われる。均質化は小さい開口部にミルクを高圧で通すことにより行われる。

【0052】

本明細書で用いる「低温殺菌」はミルクベース基質中に、微生物等の生菌の存在を減らすまたは排除することを意味する。好ましくは、低温殺菌は所与の時間所与の温度を維持することにより行われる。この特定の温度は通常、加熱により維持される。温度および期間有害なバクテリア等の特定のバクテリアを殺すまたは減らすため、および／またはミルク中の酵素を失活させるために選択される。急速冷蔵工程が続く。本発明の文脈における「食品」または「食品組成物」の語は動物またはヒトによる消費に適した食料品または飼料製品でよい。

【0053】

本発明の文脈において「乳製品」の語は主要成分に一つがミルクベースである任意の食品である。好ましくは、この主要な成分はミルクベースである。より好ましくは、この主要成分はトランスガラクトシル化活性を有する酵素で処理されたミルクベース基質である。

【0054】

本文脈において、「主要成分の一つ」は乳製品の総乾燥重量の２０％以上、より好ましくは３０％以上、または４０％以上を構成する乾燥物質を有する成分を意味する。一方で「主要成分」の語は、乳製品の総乾燥重量の、５０％以上、好ましくは６０％以上、またはより好ましくは７０％以上を構成する乾燥物質を有する成分を意味する。

【0055】

本文脈における「発酵させた乳製品」の語は任意のタイプの発酵がこの製品を生成するための一部となっている任意の乳製品であると理解される。発酵乳製品の例としては、ヨーグルト、バターミルク、クレームフレーシュ、クオークおよびフロマージュフライスがある。発酵乳製品の他の例はチーズである。発酵乳製品は既知の方法で製造される。

【0056】

用語「発酵」の語は、開始培地などの微生物の作用を通じて炭水化物をアルコールまたは酸に転換することである。１つの側面において、発酵はラクトースを乳酸に転換することを含む。

【0057】

本文脈において、「微生物」の語は、ミルク基質を発酵させることができる任意のバクテリアまたは細菌を含む。

【0058】

本文脈において、用語「ピーファム（Ｐｆａｍ）ドメイン」の語は、複数配列のアラインメントおよびＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｔｉｆｓ（“Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ． Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ．Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８：Ｄ２１１−２２２）の存在に基づいて、Ｐｆａｍ−ＡまたはＰｆａｍ−Ｂのいずれかとして同定されるタンパク質配列内の領域を意味する。ピーファムドメインの例としては、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）およびバクテリア Ｉｇ様ドメイン（グループ４）（ＰＦ０７５３２）がある。

【0059】

本明細書で用いるように「位置に対応する位置」の語は特定の意図するポリペプチドと参照ポリペプチドとの間でなされる本明細書で開示するようなアラインメントを意味する。参照ポリペプチド中の特定の位置に対応する位置が高い配列同一性を有するアラインメントにおいて対応するアミノ酸として同定される。

【0060】

「変異体」または「変異体（複数）」の語は、ポリペプチドまたは核酸のいずれかを意味する。「変異体」の語は、「突然変異体」の語と互換的に用いられる。変異体は、アミノ酸または塩基配列のそれぞれにおいて、１つ以上の位置での挿入、置換、塩基転換、切断、および／または転化を含む。「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」、「ポリペプチド」、「変異体」、および「変異酵素」の語はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のような、選択されたアミノ酸配列を備えるかあるいはからなるか、あるいは選択されたアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質を意味する。

【0061】

本明細書において用いるように、「参照酵素」、「参照配列」、「参照ポリペプチド」の語は、変異ポリペプチドのいずれかが例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５に基づく変異ポリペプチドである酵素およびポリペプチドであることを意味する。「参照核酸」は参照ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。

【0062】

本明細書で用いるように、用語「参照配列」および「主題の配列」の語は互換的に使用される。

【0063】

本明細書で用いるように、「疑義の配列」の語は、本発明の範囲内にあるかどうかを調べるために参照配列とアラインメントされた外来配列を意味する。すなわち、そのような疑義の配列は例えば、従来における配列または第三者的配列である。

【0064】

本明細書において、用語「配列」は文脈に依存して、ポリペプチド配列または核酸配列のいずれかを意味することができる。

【0065】

本明細書で用いるように、用語「ポリペプチド配列」および「アミノ酸配列」の語は、互換的に使用される。

【0066】

「変異体」のシグナル配列は野生型バチルスシグナルペプチドのシグナル配列またはこのポリペプチドを分泌する任意のシグナル配列と同じかまたは違っていてもよい。

【0067】

本明細書により包含されると考えられる各種変異体を説明するために、以下の専門用語が参照を用意にするために用いられる。置換が数と位置を含む場合、例えば５９２Ｐは、｛ナンバリングシステムに基づく位置／置換されたアミノ酸｝を意味する。すなわち、位置５９２におけるプロリンへのアミノ酸置換が５９２Ｐとして記載される。置換が文字、位置、文字、例えば、Ｄ５９２Ｐで記載される場合、この記載は｛もとのアミノ酸／ナンバリングシステムに基づく位置／置換されたアミノ酸｝を意味する。

【0068】

即ち、例えば、位置５９２でアラニンがプロリンに置換された場合Ａ５９２Ｐと記載する。

【0069】

特定の１つの場所において、２つ以上の置換が可能となる場合、このような置換は、連続する文字であらわされるか、任意でスラッシュマーク“／”で分離されて記載される。例えば、Ｇ３０３ＥＤまたはＧ３０３Ｅ／Ｄ。

【0070】

位置と置換は例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のいずれかを参照して列挙される。例えば、他の配列における等しい位置は、この配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のいずれかとのアラインメントにより、高い配列同一性を有するものを見つけ、その後にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のいずれかに特定の位置のアミノ酸に対応するアミノ酸配置を決定することにより行われる。そのようなアラインメントおよび１つの配列を第一配列として用いることは当業者にとって通常行われることにすぎない。

【0071】

本明細書で用いるように、用語「発現」の語は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産される工程を意味する。この工程は転写と翻訳が含まれる。

【0072】

本明細書において用いるように、「ポリペプチド」の語は「アミノ酸配列」、「酵素」、「ペプチド」、および／または「タンパク質」と互換的に用いられる。本明細書で用いるように、「塩基配列」または「核酸配列」はオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、それらの変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を意味する。ヌクレオチド配列はゲノム中の、合成された、または組み換え体のものでよく、１本鎖でも２本鎖でもよい、ここにおいて、センスまたはアンチセンス配列が存在していてもよい。本明細書で用いるように、「塩基配列」の語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。

【0073】

「相同体」は主題のアミノ酸配列および主題の核酸配列に特定の程度の配列同一性または「ホモロジー」を有するものを意味する。１つの側面において、主題のアミノ酸配列はＳＱＥ ＩＤＮＯ：１、２、３、４、または５であり、主題の塩基配列は好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３である。

【0074】

「相同配列」は他の配列に特定のパーセンテージ、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。同一性のパーセンテージは、アラインメントさせたときに、塩基またはアミノ酸残基が、２つの配列を比較したときに同じである程度を示す。主題の配列にアミノ酸が置換、欠失、または追加された場合、アミノ酸配列は同一とはならない。配列同一性のパーセンテージは通常主題のタンパク質の成熟配列即ち、例えばシグナル配列が除去された後の配列を参照して測定される。通常、相同体は主題のアミノ酸配列と同じ活性部位残基を含む。相同体は野生型とは異なる酵素の性質を有するけれども、酵素活性も保持している。

【0075】

本明細書で用いるように、「ハイブリダイゼーション」はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅プロセスの他に、核酸の鎖がベースペアリングを通じて相補鎖と結合する工程を含む。変異核酸は１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーとして存在してもよい。本明細書で用いるように、「コポリマー」の語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方からなる１本の核酸鎖を意味する。この変異体はコドン最適化してさら発現を高めることができる。

【0076】

本明細書で用いるように、「合成の」化合物はインビトロケミカルまたは酵素的合成により生産される。それは、酵母や他の選択された発現宿主等の宿主微生物のためにコドン最適化された変異核酸を含むがこれらに限定されない。

【0077】

本明細書で用いるように、「形質転換細胞」は組み換えＤＮＡ技術を用いるもとにより形質転換されたバクテリア細胞および細菌細胞を含む細胞を含む。形質転換は、通常細胞に１つ以上の核酸配列を挿入することにより起こる。挿入された核酸配列は異種核酸配列で、即ち、融合タンパク質等の、形質転換される細胞の天然の形態ではない配列である。

【0078】

本明細書で用いるように、「作動可能に結合している」の語は、記載の成分が意図する方法で機能することができる関係にあることを意味する。例えば、コード配列に作動可能に結合している制御配列はコントロール配列と競合する条件下でコード配列の発現が達成できるように結合されている。

【0079】

本明細書で用いるように、用語「フラグメント」は活性を有しており、アミノ末端および／またはカルボキシ末端から切り取られた１つ以上の（いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドとして定義される。

【0080】

１つの側面において、用語「フラグメント」は、トランスガラクトシル化活性を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から切り取られた１つ以上の（いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドとして定義される。

【0081】

用語「ガラクトース結合ドメイン様」の語は本明細書において「ＧＢＤ」と略され、同じ意味に用いる。

【0082】

同一性の程度
２つのアミノ酸配列または２つの塩基配列の間の関連性は「同一性」というパラメータで説明される。

【0084】

１つの態様において、疑義の配列および参照配列との間の配列同一性の程度は１）デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルトギャップペナルティーを用いる任意の好適なアラインメントプログラムによる２つの配列のアラインメント工程、２）正確に一致した数を同定する工程、ここにおいて、正確に一致とはこのアラインメントにおける所与の位置における２つの整列させられた配列においてアミノ酸または塩基が同一であるとアラインメントプログラムが同定したことを意味する、および３）２つの配列のうちの長い方の配列の長さで正確に一致した数を割る。

【0085】

他の態様において、疑義の配列および参照配列との間の配列同一性の程度は１）デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルトギャップペナルティーを用いる任意の好適なアラインメントプログラムによる２つの配列のアラインメント工程、２）正確に一致した数を同定する工程、ここにおいて、正確に一致とはこのアラインメントにおける所与の位置における２つの整列させられた配列においてアミノ酸または塩基が同一であるとアラインメントプログラムが同定したことを意味する、および３）「整列させた配列の長さ」で正確に一致した数を割る。ここにおいて、「整列させた配列の長さ」はギャップおよび配列のオーバーハンギング部位を含むアラインメント全体の長さである。

【0086】

配列同一性比較は目で、より一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムで行うことが出来る。これらの通常利用可能なコンピュータープログラムは複合比較アルゴリズムを使用して、２つまたはそれ以上の配列間の違いを導くであろう進化的イベントを最もよく反映している２つ以上の配列を整列させる。それゆえ、これらのアルゴリズムは同一または類似のアミノ酸には報酬を与え、ギャップの挿入、ギャップの延伸、および類似ではないアミノ酸のアラインメントには罰を与えるようなスコアリングシステムで操作される。比較アラインメントのスコアリングシステムは以下を含む。
ｉ）ギャップが挿入されたそれぞれの時間にペナルティーを割り当てる（ギャプペナルティースコア）
ｉｉ）追加的な位置に存在するギャップが延伸された各時間におけるペナルティースコアの割り当て（延伸ペナルティースコア）
ｉｉｉ）同一アミノ酸のアラインメントにおけるハイスコアの割り当て、および
ｉｖ）同一ではないアミノ酸のアラインメントにおける変動スコアの割り当て。
大部分のアラインメントプログラムはギャップペナルティーにより修飾される。しかしながら、配列の比較のためのそのようなソフトウェアを用いる時には、デフォルト値を用いることが好ましい。
非同一アミノ酸のアラインメントのための所与のスコアは置換マトリックスとも呼ばれている、スコアリングマトリックスの従って割り当てられる。そのような置換マトリックスにおいて提供されたスコアは、進化の間に他で置換される１つのアミノ酸が置換されるべきアミノ酸の物理的／化学的性質を変えるおよび依存する可能性を反映している。例えば、１つの極性アミノ酸が他の極性アミノ酸で置換される可能性は、疎水性アミノ酸と置換されることに比べてより高くなる。従って、スコアリングマトリックスは同一アミノ酸については最も高いスコアを割り当て、非同一ではあるが類似のアミノ酸にはより低いスコアを割り当て、非同一で非類似のアミノ酸には更に低いスコアを割り当てるであろう。最も頻繁に使用されるスコアリングマトリックスはＰＡＭマトリックスである（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８），Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）），ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ ｍａｔｒｉｃｅｓ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）） ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｏｎｎｅｔ ｍａｔｒｉｘ（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２））。

【0087】

このようなアラインメントを行うために好適なコンピュータープログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）およびＣｌｕｓｔａｌＶ， ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）， Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）を含むがこれらに限定されない。別なアラインメントツールの選択はｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ．のｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙプッロテエオミックスサーバ−により可能となる。配列アラインメントを行うことが出来る他のソフトウェアの例としては、ナショナル・センター・バイオテクノロジー・インフォメーションのウェブページから利用可能でありｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０により開示された、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）がある。

【0088】

本発明の好適な態様において、アラインメントプログラムは完全長配列全体に対してアラインメントを最適化するグローバルアラインメントプログラムを実施している。更なる好適な態様において、このグローバルアラインメントプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓａｕｌ Ｂ．； ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｄ．（１９７０），”Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（３）：４４３−５３）に基づいている。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズムを用いるグローバルアラインメントを実施する近年のプログラムの例としてはＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムがあり、両者はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／において利用可能である。

【0089】

ＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列の全体の長さの最適なアラインメントを見つけて（ギャップを含む）最適なグローバル配列アラインメントを実施する。

【0090】

ＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒは全体的に整列させたよりおおきな配列を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントの修飾を使用する。

【0091】

１つの態様において、配列がグローバルアラインメントを用いて整列させられて、配列同一性はプログラムにより同定された正確な一致の数を「アラインメント長さ」で割って計算される。ここにおいて、アラインメント長さとは配列のギャップおよびオーバーハンギングギャップを含むアラインメント全体の長さである。

【0092】

更に好適な態様において、グローバルアラインメントはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用い、配列同一性はプログラムにより同定された正確な一致の数を「アラインメント長さ」で割って計算される。ここにおいて、アラインメント長さとは配列のギャップおよびオーバーハンギングギャップを含むアラインメント全体の長さである。

【0093】

更なる態様において、グローバルアラインメントプログラムはＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒからなる群より選択されて、配列同一性はプログラムにより同定された正確な一致の数を「アラインメント長さ」で割って計算される。ここにおいて、アラインメント長さとは配列のギャップおよびオーバーハンギングギャップを含むアラインメント全体の長さである。

【0094】

一端ソフトウェアがアラインメントを作製すると、類似性パーセンテージおよび配列同一性のパーセンテージを計算することができる。このソフトウェアは通常配列の比較の一部としてこれを行って、数値結果を生成する。

【0095】

１つの態様において、配列アラインメントを行うためにＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いることが好ましい。好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷでのアラインメントは対になるアラインメントのために以下のパラメータで実施される。
表１

【0096】

ＣｌｕｓｔａｌＷ２はＥＭＢＬ−ＥＢＩ ウェブページ、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのヨーロピアン・バイオインフォマティックス・インスティチュート（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のツール（ｕｎｄｅｒ ｔｏｏｌｓ ）−配列解析（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）− ＣｌｕｓｔａｌＷ２において利用することができる。近年のＣｌｕｓｔａｌＷ２ツールの正確なアドレスはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２である。

【0097】

他の態様において、配列アラインメントの実施にあたっては、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ （インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のプログラムＡｌｉｇｎ Ｘを用いることが好ましい。１つの態様において、Ｅｘｐ１０は以下のデフォルトセッティングで使用された：
ギャップ・オープン・ペナルティー：１０
ギャップ・エクステンション・ペナルティー：０．０５
ギャップ・セパレーション・ペナルティー・レンジ：８
他の態様において、１つのアミノ酸配列を他のアミノ酸配列と、または他のアミノ酸配列へのアラインメントは、以下のようにセッティングされたスコアマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２およびＶｅｃｔｏｒＮＴＩペアワイズアラインメントに使用により決定される：

【0098】

１つの態様において、１つのアミノ酸配列を他のアミノ酸配列と、または他のアミノ酸配列への同一のパーセンテージは、ワードサイズが３で置換マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ ６２を用いるＢｌａｓｔの使用により決定することができる。
ポリペプチド
１つの側面において、本明細書で開示されるものは、トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が、３％ｗ／ｗ以上の開始ラクトース濃度において、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２であるポリペプチドである。

【0099】

１つの側面において、本明細書で開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するグリコシド加水分解触媒コアを有するポリペプチドである。

【0100】

１つの側面において、本明細書で開示されるものは、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）および／またはＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含むポリペプチドである。

【0101】

１つの側面において、本明細書で開示されるものはバクテリアＩｇ様ドメイン（グループ４）（ＰＦ０７５３２）を含むポリペプチドである。

【0102】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、以下のからなる群より選択されるトランスガラクトシル活性を有するポリペプチドである：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが９８０個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが９７５個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１３００個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
ｄ．ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列あるいはｉｉ）ｉ）に相補的な配列に、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードする塩基配列に少なくとも７０％同一な塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは成熟ポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる塩基配列を含むポリヌクレオチドにより、コードされるポリペプチド、および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の１つ以上のアミノ酸残基に欠失、挿入、および／または保存的置換を含むポリペプチド。

【0103】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、以下のからなる群より選択されるトランスガラクトシル活性を有するポリペプチドである：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１３００個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが９８０個以下のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド
ｃ．ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる核酸配列あるいはｉｉ）ｉ）に相補的な配列に、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｄ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドをコードする塩基配列に少なくとも７０％同一な塩基配列を含むポリヌクレオチドあるいは成熟ポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に含まれる塩基配列を含むポリヌクレオチドにより、コードされるポリペプチド、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の１つ以上のアミノ酸残基に欠失、挿入、および／または保存的置換を含むポリペプチド。

【0104】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の成熟アミノ酸配列に少なくとも６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、 ９７％、９８％、または９９％配列同一性を有するアミノ酸からなるポリペプチド。

【0105】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の成熟アアミノ酸配列に９０％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0106】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に９０％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0107】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0108】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0109】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドである。

【0110】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドである。

【0111】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）由来のポリペプチドである。

【0112】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、至適ｐＨが６．５乃至７．５のポリペプチドである。

【0113】

１つの側面において、本明細書にて開示されるものは、至適温度が摂氏３０乃至６０、例えば、摂氏４２乃至６０のポリペプチドである。

【0114】

炭水化物に活性を有するポリペプチドはそれらの基質特異性に基づく分類のＩＵＢＭＢシステムまたは近年１２５グリコシドヒドロラーゼファミリーの１つ以上の態様において、に割り当てられたＣａＺｙのいずれかを用いて分類される。ＣａＺｙデータベースにおいて、アサインメントは基質および生成物の立体化学の知識と組み合わされた配列および構造的情報の両方に基づいている。

【0115】

本明細書にて開示されるのは、このポリペプチドをコードしている核酸配列のバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株における発現生成物であるポリペプチドである。これは、トランスガラクトシル化活性を有する核酸配列のポリペプチド発現生成物にすぎない。これは、当業者に知られている既知の技術を用いて評価される。評価されるサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられて、Ｂｉｏ−Ｒａｄのクリテリオンシステム（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）等のタンパク質の定量化に好適な染料を用いて可視化される。ゲルをＢｉｏ−Ｒａｄのクリテリオンシステム（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）の例のような好適なデンシトメトリックスキャナーを用いてスキャンして得られた写真ダイナミックレンジで確実にする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来の変異体／フラグメントに対応するバンドを定量化して、ポリペプチドのパーセンテージを以下のように計算する：試験されたポリペプチドのパーセンテージ＝試験されたポリペプチド／（トランスガラクトシル活性を有する全てのポリペプチドの合計）＊１００。
組成物中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来のポリペプチド変異体／フラグメントの総数は当業者により知られている方法により、ポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット法によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来のフラグメントを検出することにより決定することができる。

【0116】

本明細書で開示されるポリペプチドは１つの酵素内に少なくとも２つの分離した機能ドメインを含む。第一に、このポリペプチドは、以下で説明するようなグリコシドヒドロラーゼ触媒コアを含む。この触媒コアは関連するグリコシドヒドロラーゼファミリーのＧＨ−Ａ ｃｌａｎに属する。ＧＨ−Ａ ｃｌａｎは維持メカニズムをグリコシド結合を切断することにより特徴づけられ、ＴＩＭバレルホールドに基づく触媒ドメインを有する（Ｗｉｅｒｅｎｇａ，２００１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４９２（３），ｐ１９３−８）。この触媒ドメインはプロトン供与体と求核剤として働き、バレルドメインのストランド４および７から放出される２つのグルタミン酸残基を含む（Ｊｅｎｋｉｎｓ，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６２（３），ｐ２８１−５）。

【0117】

ＴＩＭバレルの全体構造は８つのβストランドと８つのαヘリックスからなる（β／α）８フォールドである。１つの側面において、本明細書で開示されるグルコシドヒドロラーゼ触媒コアはグルコシドヒドロラーゼファミリーＧＨ−２および３５のいずれかに属し、これらの全てのＴＩＭバレル酵素はＧＨ−Ａ ｃｌａｎに属している。更なる側面において、このガラクトシルヒドロラーゼ触媒コアは、ＧＨ−２またはＧＨ−３５のファミリーに属している。更なる側面において、このグルコシドヒドロラーゼ触媒コアはＧＨ−２にファミリーに属している。共通の因子はこれらの酵素は保持型酵素と呼ばれており、基質の構造が生成物に転換される（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，７（５），６３７−４４）。

【0118】

１つの側面において、本明細書において記載するポリペプチドは、β（１→４）構造を有する炭化水素結結合に活性を有する。これは実際には酵素をβ−ガラクトシダーゼのＩＵＢＭＢ ＥＣ３．２．１．２３クラスに分類する。この活性は、おそらくパラ−ニトロフェノール−β−Ｄガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）、オルトーニトロフェノール−β−Ｄガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、色素生成アグリコンを有するβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ）等の合成基質を用いて決定されるが、これらに限定されない。ある酵素がβ−ガラクトシダーゼのＥＣ３．２．１．２３クラスに属するかどうかを決定する代替的な方法はラクトース等の基質と一緒にインキュベートして、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、または当業者に知られている他の方法によるグルコースの放出を測定する。

【0119】

ポリペプチドの機能の実態を予測するために、いくつかの公知事実の蓄積を用いることができ、例えば、Ｐｆａｍ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）３８（ｓｕｐｐｌ １）：Ｄ２１１−Ｄ２２２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ９８５）およびＩｎｔｅｒｐｒｏ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００９）３７（ｓｕｐｐｌ １）：Ｄ２１１−Ｄ２１５． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ７８５）がある。そのような分析を行うときには、この分析は公に蓄積されたデータベースから利用可能なポリペプチドの完全長配列において実施されるべきであることを特定すべきである。

【0120】

更なる側面において、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｇ様ドメイン（グループ４）（ＰＦ０７５３２）から選択されるＰｆａｍドメインの１つ以上を含むポリペプチドが提供される。更なる側面において、ＰｆａｍドメインであるＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ（グループ４）（ＰＦ０７５３２）を含むポリペプチドが提供される。更なる側面において、このポリペプチドの触媒ドメインがＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、およびＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）で構成されるポリペプチドが提供される。

【0121】

更なる側面において、本明細書で開示され、３７℃、５ｗ／ｗ％ラクトースにおいて、ミルクベース基質中１００ｐｐｍの濃度で、１５分、３０分、または１８０分あとに測定したトランスガラクトシル化活性対β−ガラクトシダーゼ活性の割合が少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２であるポリペプチドが提供される。更なる側面において、このポリペプチドはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）由来である。

【0122】

１つの側面において、本明細書で開示されるポリペプチドは３７℃、５ｗ／ｗ％ラクトースにおいて、ミルクベース基質中１００ｐｐｍの濃度で、１５分、３０分、または１８０分あとに測定して初期ラクトースの２０％より多い、３０％より多い、４０％より多い、５０％までがガラクトシル化されている。

【0123】

更なる側面において、本明細書で開示されたポリペプチドは３７℃、５ｗ／ｗ％ラクトースにおいて、ミルクベース基質中１００ｐｐｍの濃度で、１５分、３０分、または１８０分あとに測定して、ラクトースの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０５未満、２０％未満が加水分解されるようなβ−ガラクトシル化活性を有する。

【0124】

１つの側面において、このβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性は方法４において特定されるように２．１３ＬＡＵに相当する１００ｐｐｍの濃度で測定される。

【0125】

更なる側面において、本明細書に記載のポリペプチドは以下の性質の１つ以上を有する：
ｉ）３７℃、５ｗ／ｗ％ラクトースにおいて、ミルクベース基質中１００ｐｐｍの濃度で、１５分、３０分、または１８０分あとに測定したトランスガラクトシル化活性対β−ガラクトシダーゼ活性の割合が少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２および／または
ｉｉ）３７℃、５ｗ／ｗ％ラクトースにおいて、ミルクベース基質中１００ｐｐｍの濃度で、１５分、３０分、または１８０分あとに測定して初期ラクトースの２０％より多い、３０％より多い、４０％より多い、５０％までがガラクトシル化されている。

【0126】

１つの側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１３００個までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、９８０個までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、９８０個までのアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。他の側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９６．５％の配列同一性を有し、例えば、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、のような少なくとも９７％の配列同一性を有するが提供される。１つの側面において、最大で９７５個のアミノ酸残基、例えば、最大で９７０個までのアミノ酸残基、最大で９５０個までのアミノ酸残基、最大で９４０個までのアミノ酸残基、最大で９３０個までのアミノ酸残基、最大で９２０個までのアミノ酸残基、最大で９１０個までのアミノ酸残基、最大で９００個までのアミノ酸残基、最大で８９５個までのアミノ酸残基、または最大で８９０個までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の、例えば、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最大で９７５個までのアミノ酸残基、例えば最大で９７０個までのアミノ酸残基、または少なくとも９６５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の配列同一性を有し、最大で９７５個までのアミノ酸からなるポリペプチドが提供される。

【0127】

更なる好適な側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５を含むポリペプチドが提供される。更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５からなるポリペプチド、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。

【0128】

更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。

【0129】

更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％等の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの側面において、最大で１２９０個までのアミノ酸残基、例えば最大で１２８０個までの、最大で１２７０個までの、最大で１２６０個までの、最大で１２５０個までの、最大で１２４０個までの、最大で１２３０個までの、最大で１２２０個までの、または最大で１２１５個までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの好適な側面において、１２１１個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。

【0130】

更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％、または９９％のような少なくとも９７％のような配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの側面において、最大で１２１０個まのでアミノ酸残基、例えば、最大で１２００個までの、最大で１１９０個までの、最大で１１８０個まので、最大で１１７０個までの、最大で１１６０個までの、最大で１１５０個までの、最大で１１４５個までの、最大で１１４２個までのアミノ酸残基からなるポリペプチが提供される。

【0131】

更なる側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも９６．５％、例えば、少なくとも９８％または９９％のような、少なくとも９７％等の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの側面において、最大で１１３０個までの、例えば最大で１１２０個、最大で１１１０個、最大で１１００個、最大で１０９０個、最大で１０８０個、最大で１０７０個、最大で１０６０個、最大で１０５０個、最大で１０５５個または最大で１０４０個までのアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。好適な側面において、１０３８個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。

【0132】

更なる側面において、本明細書で開示されるポリペプチドは１００％より高い、１５０％、１７５％または２００％より高い、トランスガラクトシル化活性の割合を有する。

【0133】

タンパク質は通常、ドメインと呼ばれる１つ以上の機能領域からなる。異なるタンパク質における各種組み合わせにおける別々のドメインの存在は天然にみられるタンパク質の多様なレパートリーを形成している。ドメインを説明する１つの方法は、“Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ， Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ． Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８：Ｄ２１１−２２２に記載されているようなタンパク質ドメインファミリー大規模なコレクションであるＰｆａｍデータベースによるものである。各ファミリーは複数配列アラインメントにより表され、Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭｓ）が隠されている。更なる側面において、本発明者はＰｆａｍドメイン、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ（グループ ４）（ＰＦ０７５３２）の１つ以上からなるポリパプチドを発見した。１つの側面において、本明細書において提供されるポリペプチドはＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）およびＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ（グループ ４）（ＰＦ０７５３２）を含む。

【0134】

１つの側面において、ｐＨ４−９の範囲、５−８のような、５．５−７．５のような、６．５−７．５のような範囲全体にわたり有用なトランスガラクトシル化活性を有する。

【0135】

本発明は、本明細書で定義されるアミノ酸配列にまたは本明細書で定義される特定の性質を有するポリペプチドに特定の程度の配列同一性または配列相同性を有するポリペプチドを包含する。本願発明は、特に、以下で定義されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のいずれか１つの配列またはこれらの相同体にある配列同一性を有するペプチドを包含する。

【0136】

１つの側面において、相同なアミノ酸配列／塩基配列は、機能的なトランスガラクトシル化活性を有し、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドと比較してトランスガラクトシル化活性が高いポリペプチドを提供および／またはコードする。

【0137】

本文脈において、相同配列は主題の配列に少なくとも６５％、７０％、７５％、７８％、少なくとも８０１５、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むと考えられる。通常、この相同体は主題のアミノ酸配列と同じ活性部位を含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の語に考えられることができるが、本発明の文脈において、それは配列同一性の語における相同性を表現することが好まれる。

【0138】

従って、本発明は、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドの任意のアミノ酸配列、特に以下で説明するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の、変異体、相同体、および誘導体を含む。

【0139】

配列、特に以下で定義されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の変異体、相同体、および誘導体の配列はわずかな変更を生み、機能的には等価物となるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換も備える。故意のアミノ酸置換は、基質への二次的結合活性が維持されている限り、極性、電荷、可溶性、親水性、疎水性、および／または両親媒性における類似性を根拠になされる。例えば、負電荷アミノ酸はアスパラギン酸、およびグルタミンさんを含むが、正電荷のアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む類似の親水性の値を有する電荷のない極性頭基を有するアミノ酸は、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。

【0140】

本発明は、すなわち、塩基性を塩基性に、酸性を酸性に、極性を極性のように、あるアミノ酸から類似のアミノ酸へ置換される、保存的置換を含む（置換および置き換えが既存のアミノ酸残基が代替的な残基で交換されることを意味する）。非保存的置換は１つのクラスの残基が、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、（以下、Ｏと称する）、ノルロイシンオルニチン、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンのような非天然のアミノ酸を含む他のまたは代替的なアミノ酸への置換が起こることを意味する。

【0141】

保存置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸、およびアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ヒドロキシ基を含むアミノ酸（セリン、スレオニン）、ラージアミノ酸（フェニルアラニンおよびトリプトファン）およびスモールアミノ酸（グリシン、アラニン）のグループ内により行われる。

【0142】

１つの側面において、本発明で用いるポリペプチド配列は精製された状態である。１つの側面において、本発明に用いられるポリペプチドまたはタンパク質は単離された状態である。

【0143】

１つの側面において、本発明のポリペプチドは組み換え技術を用いて生産される。

【0144】

変異ポリペプチドは例えば、少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２の配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0145】

変異ポリペプチドは例えば、少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、または５の配列に対して９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0146】

１つの側面において、本明細書で開示されるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５に含まれるトランスガラクトシラーゼをコードする核酸配列によりコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の用語について議論される配列同一性および機能性に関係しているすべての考察および限定はこれらのポリペプチドおよび塩基の配列同一性および機能性に読み替えて準用する。

【0147】

１つの側面において、主題のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５であり、主題の塩基配列は好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３である。

【0148】

１つの側面において、このポリペプチドはＳＥＱ ＤＩ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端から欠失された１つ以上の（いくつかの）アミノ酸があるフラグメントである。

【0149】

１つの側面において、少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００アミノ酸残基を含む。

【0150】

更なる側面において、ポリペプチド変異体の長さは５００から１３００である。更なる側面において、ポリペプチド変異体の長さは６００から１３００である。更なる側面において、ポリペプチド変異体の長さは７００から１３００である。更なる側面において、ポリペプチド変異体の長さは８００乃至１３００である。更なる側面において、ポリペプチド変異体の長さは８００乃至１３００アミノ酸である。

【0151】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチド変異体
１つの側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５に対して、改善されたトランスガラクトシル化のような修飾された性質に影響を与える１つ以上の位置において置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の変異体が提供される。そのような変異ポリペプチドは本明細書において都合により、「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」、または「変異体」と呼ばれる。１つの側面において、本明細書で定義されるこのポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドと比較して、改善されたトランスガラクトシル化活性を有する。他の側面において、本明細書において定義されるポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドと比較して、改善された反応速度を示す。

【0152】

１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドおよび変異体は酵素活性を有する。１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドおよび変異体はトランスグルシル化活性を有する。

【0153】

１つの側面において、トランスコシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比は３％ｗ／ｗ初期ラクトース濃度のような濃度で、反応後３０分で、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも１．５または少なくとも２になる。

【0154】

１つの側面において、トランスコシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比は３％ｗ／ｗ初期ラクトース濃度のような濃度で、反応後３０分で、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２になる。

【0155】

１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドおよび変異体は微生物源、特に糸状菌または酵母、または細菌由来である。酵素は例えば、アグリカス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、例えば、アグリカス・ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）；アスコバギノスポラ（Ａｓｃｏｖａｇｉｎｏｓｐｏｒａ）；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）；ケトトマスティア（Ｃｈａｅｔｏｔｏｍａｓｔｉａ）；ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、例えばディクチオステリウム・ディスコデウム（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；クルベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、グルベロマイセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、例えば、ムコール・ジャバニクス（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ムセド（Ｍ．ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・スブチリシウム（Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）；リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、例えばリゾムコール・プシラス（Ｒ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）；リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、例えばリゾプス・アルヒザス（Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・ジャピニクス（Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）；スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、例えばスクレロティニア・リベルティアナ（Ｓ．ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ）；トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）；トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）；トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、例えばトリコフィトン・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）； フェトゼリニア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ），例えば、フェトゼリニア・スクレロティロウム（Ｗ． ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），例えば、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ノバリス（Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロセレモフィルスルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ツリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．Ｉｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）；クロセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、例えば、シトロバクター・フレン（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、例えばクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）； ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、例えば、ディプロディア・ポシピナ（Ｄ．ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）；エｂｂテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、例えば、エンテロバクター・アエロゲンス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ），エンテトバクター・クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）；エルウィナ（Ｅｒｗｉｎｉａ）、例えば、エルウィナ・ヘルビコラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、例えば、クレブシエラ・プネウモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ミリオカム（Ｍｉｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）；ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｓｉｕｍ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）；プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えば、プロテウス・バルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）；プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、例えば、プロビデンシア・スツアリチ（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ）；ピノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、例えば、ピノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピノポラス・サングイネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）；ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、ルミノコッカス・トルケス（Ｒ．ｔｏｒｑｕｅｓ）；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・タイプヒムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセスセンス（Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、例えば、シゲラ・フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトマイセス・アンチバイオティクス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス（Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ストレプトマイセス・ヴィオルセオルバ（Ｓ．ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ）；トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）；トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えば、トリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ），トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）；エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、例えば、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）がある。

【0156】

本明細書において定義されるポリペプチドまたは変異ポリペプチドを含む単離されたおよび／または生成されたポリペプチドが提供される。１つの態様において、この変異ポリペプチドはポリペプチドの成熟形態である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５）。１つの側面において、この変異体はＣ−末端ドメインを含む。

【0157】

１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１、２、３、４、または５の配列に対して１つから約２５個の間のアミノ酸残基が、置換され、追加されまたは欠失されている 変異体を含む。１つの側面において、本明細書で定義されているような変異ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１、２、３、４、または５の配列に対して１つから２５この間のアミノ酸残基が、置換され、追加されまたは欠失されている変異体を含む。１つの側面において、この変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のアミノ酸配列を有し、１つから約２５個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。更なる側面において、この変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のアミノ酸配列を有し、３つから１２個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。更なる側面において、この変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のアミノ酸配列を有し、５つから９個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。

【0158】

１つの側面において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の少なくとも２つ、他の側面では、少なくとも３つ、および更なる側面では少なくとも５つのアミノ酸が置換されている。
１つの側面において、本明細書で開示されるポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の．を備える。１つの側面において、本明細書で開示されているポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の配列を有し、Ｎ末端の１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸が置換および／または欠失されている。

【0159】

酵素およびそれらの酵素の変異体は核酸および一次ポリペプチド配列により、三次元折り畳み構造、および／またはそれらの比活性により特徴づけられる。本明細書で定義されるように、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体の追加的な特徴は、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性、および熱安定性を含む。発現および酵素活性のレベルは当業者に知られているアッセイを用いて評価することができる。他の側面において、変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドに対して、例えば６５℃乃至８５℃のような高温での改善された安定性のような、改善された性能特徴を示す。

【0160】

ポリペプチド変異体は本明細書で定義されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の配列に、少なくとも６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％。９８％、９９％、１００％の配列同一性を有する。

【0161】

ヌクレオチド
１つの側面において、本発明は上で説明したようなトランスガラクトシル活性を有する単離されたポリペプチドに関し、各ポリペプチドは、非常に低いストリンジェント条件で、好ましくは低いストリンジェント条件で、より好ましくは中程度のストリンジェント条件で、より好ましくは中−高い程度のストリンジェント条件で、さらに好ましくは高いストリンジェント条件で、最も好ましくは非常に高いストリンジェント条件で、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５の成熟配列をコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３の核酸配列と、ｉｉ）ｉ）のｃＤＮＡ配列と、またはｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３のサブ配列は、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを、好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチドを含む。さらに、このサブ配列はラクターゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしている。

【0162】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のアミノ酸配列またはそれらのフラグメント並びに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３のヌクレオチド配列または、それらのサブ配列は当業者によく知られている方法に従って別の属または種の株からトランスガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡを同定してクローンするための核酸プローブを設計するために用いられる。特に、そのようなプローブは所望の属または種のゲノムまたはｃＤＮＡとハイブリダイズさせて、サザンブロッティング法によりそこにある対応する遺伝子を同定し、単離する。そのようなプローブは全配列よりもかなり短くて、少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、および最も好ましくは少なくとも７０個のヌクレオチド長である。しかしながら、このヌクレオチドプローブ長は少なくとも１００個の長さであることが好ましい。例えば、この核酸プローブは少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも３００個、より好ましくは少なくとも４００個、または最も好ましくは少なくとも５００核酸長さである。より長いうプローブも用いられ、例えば、少なくとも６００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも７００個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００個のヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも９００個の長さのプローブが用いられる。ＤＮＡとＲＮＡとの両方を用いることができる。プローブは通常、対応する遺伝子を検出するために（例えば、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ、プロトン、またはアビジンで）標識化される。そのようなプローブは本発明に包含される。

【0163】

そのような有機体から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーは、それゆえ前述のプローブにハイブリダイズして、ラクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡについてスクリーニングされる。そのような微生物由来ゲノムまたは他のＤＮＡはアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、または他の分離法により分離される。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡはニトロセルロースまたは他の好適な担持物質上に輸送されて固定化される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３またはそれらのサブ配列に相同なクローンまたはＤＮＡを同定するために、この担持物質はサザンブロット法に用いられる。

【0164】

本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３で示されるヌクレオチド配列、その相補配列、またはそれらのサブ配列に対応する標識された核酸プローブに、非常に高いストリンジェント条件下でヌクレオチド配列がハイブリダイズすることを示している。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子はＸ線フィルムを用いて検出することができる。

【0165】

他の好適な側面において、この核酸プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３の成熟ポリペプチドコード領域である。

【0166】

少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、非常に低いストリンジェント条件から非常に高いストリンジェント条件が４２℃で、５倍のＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および非常に低いおよび低いストリンジェンシーは２５％ホルムアミド、中程度および中程度から高ストリンジェンシーは３５％ホルムアミド、高いおよび非常に高いストリンジェンシーは５０％ホルムアミドのいずれか、次に２１乃至任意で２４時間のサザンブトット法が行われる、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。

【0167】

少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、担体物質は最終的に、２倍のＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは４５℃で（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは５０℃（低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、および最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、洗浄される。

【0168】

特定の態様において、この洗浄は、０．２倍ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、および最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で行われる。他の特定の態様において、この洗浄は、０．１倍ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、および最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で行われる。

【0169】

約１５ヌクレオチド長乃至約７０ヌクレオチド長である短いプローブについて、ストリンジェンシー条件は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ１ミリリットル当たり、０．９ Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５％ ＮＰ−４０、１倍デンハード溶液、１ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ 一リン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および０．２ｍｇ酵母、を含む溶液において、ボルトンおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ４８：１３９０）の計算を用いて計算されたＴｍより約５乃至１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション後洗浄と定義され、後に標準的なサウザンブロティング法が行われる。

【0170】

約１５ヌクレオチド長乃至約７０ヌクレオチド長である短いプローブについて、担体物質は１回６倍ＳＳＣプラス０．１％ＳＤＳで１５分行い、２回、１５分ずつ、計算されてＴｍより５℃乃至１０℃低い温度で、６倍ＳＳＣを用いて洗浄される。

【0171】

塩含有ハイブリダイゼーション条件下で、有効なＴｍは、成功したハイブリダイゼーションについてのプローブとフィルターに結合したＤＮＡの間に必要とされる同一性の程度をコントロースするものである。以下の式を用いて、各ストリンジェント条件下でハイブリダイズする２つのＤＮＡに必要とされる同一性の程度を決定する。

【0172】

有効Ｔ_ｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ホルムアミド）
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍ参照）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＧ＋Ｃ含量は４２％であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のＧ＋Ｃ含量は４４％である。中程度のスチトリンジェンシーでは、ホルムアミドは３５％で、５倍ＳＳＰＥのＮａ＋濃度は０．７５Ｍである。

【0173】

他の関連する関係は、２つのＤＮＡの１％ミスマッチはＴｍを１．４℃低くすることである。４２℃における中程度のストリンジェント条件でハイブリダイズする２つのＤＮＡに必要とされる同一性の程度を決定するために、以下の式が用いられる：
％同一性＝１００−［（効果的Ｔｍ−ハイブリダイゼーション温度／１．４）］
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍ参照。）
変異核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５をコードしている核酸と、例えば６０％、６５％、７５％、８０５、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性のような、特定のパーセンテージを有するポリヌクレオチドを含む。１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドをコードすることができる核酸が提供される。更なる側面において、本明細書で開示している核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一な核酸配列を有する。

【0174】

１つの側面において、本明細書で記載されているような核酸を含むプラスミドが提供される。１つの側面において、本明細書で開示される核酸を含むまたは発現ベクターが提供される。１つの側面において、本明細書で定義する核酸を含むまたは本明細書で定義されるポリペプチドを発現することができる発現ベクターが提供される。

【0175】

本明細書で定義されるような任意のポリペプチド変異体をコードしている核酸に相補的な核酸が提供される。
すなわち、相補体にハイブリダイズすることができる核酸が提供される。他の態様において、本明細書で開示される方法および組成物に用いる配列は合成配列である。酵母のような宿主微生物の発現のためのコドン使用を最適化した配列が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で提供されるポリペプチド変異体は当業者に知られているように、合成的に製造されるかまたは宿主細胞組み換え発現により製造される。１つの側面において、本明細書に開示されているポリペプチドは組み換えポリペプチドである。本明細書で定義される発現されたポリペプチド変異体は任意で使用の前に単離される。他の地用において、本明細書で定義されるポリペプチド変異体は発現された後に生成される。ポリペプチド変異体の遺伝的修飾および組み換え生成の方法は例えば、米国特許Ｎｏｓ．７，３７１，５５２；７，１６６，４５３；６，８９０，５７２；および６，６６７，０６５； 並びに米国特許出願公報Ｎｏｓ．２００７／０１４１６９３；２００７／００７２２７０；２００７／００２０７３１；２００７／００２０７２７；２００６／００７３５８３；２００６／００１９３４７；２００６／００１８９９７；２００６／０００８８９０；２００６／０００８８８８；および２００５／０１３７１１１に記載されている。ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、プライマー、ベクター、選択方法、宿主細胞、発現されたポリペプチド変異体の精製および再構築、および酵素アッセイの、有用な緩衝液、ｐＨ範囲、Ｃａ２＋濃度、基質濃度、および酵素濃度を含む本明細書のポリペプチドの特徴づけを含む、これらの文献に記載の関連する記載は参照により本明細書に引用される。

【0176】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のタンパク質をコードしているまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のタンパク質をコードしている核酸に少なくとも６０％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列が提供される。

【0177】

ベクター
１つの側面において、本発明はポリヌクレオチドを含むベクターに関する。１つの側面において、バクテリア細胞がこのベクターを含む。いくつかのの態様において、変異体をコードしている核酸を含むＤＮＡ構築物はコード配列に作動可能に結合した調節配列を含む発現ベクターにおける宿主細胞に輸送される。このベクターは宿主細胞へ導入されたときに、糸状菌宿主細胞のゲノムに組み込まれ複製されることができる任意のベクターでよい。Ｔｈｅ ＦＧＳＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉは好適なベクターを列挙している。追加的な好適な発現および／または組み込みベクターの追加的な例はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３^ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９１），ｐｐ．３９６−４２８；および米国特許Ｎｏ．５，８７４，２７６がある。例示的なベクターはｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００ およびｐＥＮＴＲ／Ｄ、ｐＤＯＮ^ＴＭ２０１、ｐＤＯＮＲ^ＴＭ２２１、ｐＥＮＴＲ^ＴＭ、ｐＧＥＭ^R３Ｚ ａｎｄ ｐＧＥＭ^R４Ｚに記載されている。バクテリア細胞において用いるための例としては、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ２９があり、これらはエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製される、また、ｐＥ１９４は、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において複製される。

【0178】

いくつかの態様において、変異体をコードしている核酸は好適なプロモーターに作動可能に結合して、宿主細胞内で転写される。このプロモーターは宿主細胞に対して相同であるか異種であるかのいずれかのタンパク質をコードしている遺伝子由来である。プロモーターの好適な非限定的な例としてはｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、およびｅｇｌ２プロモーターがある。１つの態様において、このプロモーターは宿主細胞に対して天然であるものである。例えば、シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）が宿主細胞のとき、このプロモーターは天然シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）プロモーターである。「誘発プロモーター」は環境的または発育調節したにおいて活性であるプロモーターである。他の態様において、プロモーターは宿主細胞に対して異種であるものである。

【0179】

いくつかの態様において、コード配列はシグナル配列をコードしているＤＮＡ配列に作動可能に結合している。他の態様において、代表的なシグナルペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７である。代表的なシグナルペプチドはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプレカーサーの天然シグナル配列である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。他の態様において、シグナル配列をコードしているＤＮＡは他の細胞外バチルス・スブチリスプレカーサーからのシグナル配列をコードしているヌクレオチド配列で複製される。１つの態様において、このシグナル配列をコードしているＤＮＡは直ちに上向き調節されて、このポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのインフレームにある。このシグナル配列は宿主細胞と同じ種から選択される。追加的態様において、糸状菌宿主細胞へ導入されるＤＮＡ構築体またはベクターを含むシグナル配列およびプロモーター配列は同じ源由来である。いくつかの態様において、発現ベクターは停止配列も含む。１つの態様において、この停止配列とプロモーター配列は同じ起源である。他の態様において、このターミネータ配列は宿主細胞と相同である。

【0180】

いくつかの態様において、発現ベクターは選択マーカーを含む。好適な選択マーカーの例としては、ハイグロマイシンやフレオマイシンのような抗生物質に耐性を付与するものがある。栄養選択マーカーも好適であり、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、およびｐｙｒ４を含む。１つの態様において、選択マーカーはａｍｄＳ遺伝子であり、これはアセトアミド酵素をコードしていて、アセトアミドを栄養源として形質転換させた細胞を成長させる。選択マーカーとしてアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の使用はＫｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）およびＰｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６１：１５５−１６４（１９８７）に記載されている。変異体をコードしているポリヌクレオチドを有するＤＮＡ構築体を含む好適な発現ベクターは所与の宿主細胞中で自己複製ができて、宿主細胞のＤＮＡに取り込まれる任意のベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、遺伝子の発現を得るための２つのタイプの発現ベクターが含まれる。第一の発現ベクター発現されるべき遺伝子由来のプロモーター、コード領域、およびターミネータを含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、好ましくないＤＮＡ配列を欠失させて、それ自身の転写および翻訳調節配列の制御下で発現されたドメインを除去して、遺伝子切断体が得られる。発現ベクターの第二のタイプは高いレベルの転写および選択マーカーを必要とする配列を予め構築して含むようにした発現ベクターである。いくつかの態様において、遺伝子またはその一部のコード領域は一般的な目的の発現ベクターに挿入され、発現構築プロモーターおよびターミネータ配列の制御下にあるようにする。いくつかの態様において、遺伝子またはその一部はストロングｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。

【0181】

発現宿主／宿主細胞
更なる側面において、本明細書で記載するようなプラスミドまたは本明細書で記載する発現ベクターを含むまたは好ましくはこれらで形質転換された、宿主細胞が提供される。
更なる側面において、本明細書に記載するポリペプチドの発現することができる細胞が提供される。
１つの側面において、本明細書に記載のような宿主細胞、または本明細書に記載のような細胞は、バクテリア、糸状菌、または酵母細胞である。
更なる側面において、この宿主細胞はルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓiｓ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からなる群より選択される。
更なる側面において、この宿主細胞はルミノコッカス・ハンセンイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からなる群より選択される。

【0182】

他の態様において、好適な宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロセレモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ． ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・ツリンゲネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、またはストレプトマイセス・ムリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群より選択されるグラム陽性バクテリア、あるいはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）であるグラム陰性バクテリアを含む。

【0183】

いくつかの態様において、宿主細胞はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のポリペプチドに少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性を有するアミノ酸配列を有する本明細書で定義されるポリペプチド変異体を発現するために改変される。いくつかの態様において、本明細書で定義されるポリペプチド変異体をコードしているポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のタンパク質をコードしている核酸配列あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５のタンパク質をコードしている核酸配列に少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する核酸配列を含む。１つの態様において、この核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３の核酸に少なくとも約６０％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。

【0184】

ポリペプチドの製造方法
更なる側面において、本明細書で開示するポリペプチドを発現する方法は、本明細書で開示される宿主細胞または細胞を入手する工程、およびこの宿主細胞または細胞からポリペプチドを発現する工程、並びに任意でこのポリペプチドを精製する工程からなる。

【0185】

発現性質は、変異体が特定の宿主細胞で製造されたときの変異体の改変された発現レベルを意味する。発現は、所与の時間に対する、当業者に知られている標準的な方法を用いる発酵ブロスから回収可能な活性変異体の量に関係する。発現は宿主細胞によりこの宿主細胞または細胞内で生成された変異体の量または割合にも関係する。発現は変異体ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの翻訳速度にも関係する。

【0186】

宿主細胞の形質転換、発現、および培養
宿主細胞へのＤＮＡ構築体またはベクターの導入は、トランスフォーメーション、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション、例えば、リポフェクション仲介およびＤＥＡＥ−デキストリン仲介トランスフェクションを媒介、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタとの高速ボンバードメント、およびプロトプラスト融合を含む。一般的な形質転換技術は知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７），ｓｕｐｒａ，ｃｈａｐｔｅｒ ９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１），ｓｕｐｒａ；およびＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）参照。トリコデルマにおける異種タンパク質の発現は開示されており、例えば、米国特許Ｎｏ．６，０２２，７２５；米国特許Ｎｏ．６，２６８，３２８；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３： ２２７−２３３（１９９１）；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３（１９８９）；ＥＰ ２４４，２３４；およびＥＰ ２１５，５９４に記載されている。１つの態様において、一般的に安定な形質転換体は変異体をコードしている核酸が安定して宿主細胞染色体に組み込まれるようなベクターシステムで構築される。形質転換体は基地の技術によってその後精製される。

【0187】

１つの非限定的な例において、ａｍｄＳマーカーを含む安定な形質転換体は、成長速度およびアセトアミドを含む固形培地上の、ギザギザしたアウトラインよりもむしろスムースな円形コロニーの形成により不安定な形質転換体から区別される。さらに、いくつかのケースにおいて、安定性の更なる試験はアセトアミドのない培地のような固形非選択培地上での形質転換体の成長、培養培地から胞子の収穫、およびこれらの胞子のアセトアミドを含む選択培地上での出芽および成長のパーセンテージを決定することにより行われる。当業者に知られている他の方法も形質転換体を選択するために用いることができる。

【0188】

活性の同定
宿主細胞中での変異体の発現を評価するために、アッセイ法は発現されたタンパク質、対応しているｍＲＮＡ、またはガラクトシダーゼ活性を測定することができる。例えば、好適アッセイは好適に標識されたプローブを用いる、ノザンおよびサザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ転写反応）、およびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。好適なアッセイはサンプル中の活性を測定することも含む。変異体の活性の好適なアッセイ法は、本明細書で記載する方法および実施例に記載されているような、ＯＮＰＧベースアッセイまたは反応混合物中のグルコースを測定することを含むがこれらに限定されない。

【0189】

本明細書で開示されるポリペプチドの精製法
一般的に、細胞培養において生成された変異体は培地中で分泌され、例えば、細胞培養培地から望まれない成分を除去して、精製または単離される。いくつかのケースにおいて、変異体は細胞溶解物質から回収される。そのようなケースにおいて、酵素は当業者により日常的に用いられている技術により生成された細胞の中から精製される。例としては、親和クロマトグラフィー、高解像度イオン交換を含むイオン交換クロマトグラフィー法、疎水相互クロマトグラフィー、二層分割、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥのようなシリカまたはカチオン交換樹脂状のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えばＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いたゲルろ過法を含むがこれらに限定されない。使用態様により、本明細書で開示されるポリペプチドは例えば、凍結乾燥されるかまたは溶液中で調製される。１つの側面において、本明細書で開示されているポリペプチドは凍結乾燥状態である。他の態様において、本明細書で開示されるポリペプチドは溶液中にある。

【0190】

組成物、製品および使用
本明細書で開示されるポリペプチドの固定および製剤化のための方法
ポリペプチド組成物は、当業者に既知の方法で調製され、液体または乾燥組成物の状態である。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒または微顆粒の状態である。組成物中に含められるポリペプチドは当業者に知られている方法に従って安定化される。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物の好適な使用の例は以下の説明にある。

【0191】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、本明細書で開示されるようなポリペプチドでラクトースを含む基質を処理して食料品を生成するための方法である。

【0192】

１つの側面において、本明細書で開示されるのは、本明細書で開示されるポリペプチドで、ラクトースを含むミルクベース基質を処理して乳製品を製造するための方法である。

【0193】

１つの側面において、ラクトースを含む基質は加水分解ベータガラクトシダーゼで更に処理される。

【0194】

本発明に従って調製された食品成分の形態等である、酵素調製物は、使用および／または利用のモードおよび／または投与の方法に依り、溶液または固形物の状態である。固形物状態は乾燥された酵素粉末または顆粒酵素のいずれかであることができる。乾燥酵素製剤の例としてはスプレードライ製品、混合顆粒製品、流動床で製造された顆粒、押出成形またはペレット化により製造された顆粒、小球状生成物、凍結乾燥生成物等の層状製品がある。

【0195】

本発明に従って調製された食品成分の形態等である、酵素調製物は、使用および／または利用のモードおよび／または投与の方法に依り、溶液または固形物の状態である。固形物状態は乾燥された酵素粉末または顆粒酵素のいずれかであることができる。

【0196】

１つの側面において、好ましくは食品組成物であり、より好ましくは本明細書で開示される細胞またはポリペプチドを含む乳製品である組成物が提供される。

【0197】

更に、本明細書で開示されるのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に７２％、７４％、７４％、７８％、 ８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％のような少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを組成物の総量に基づいて、本明細書で開示される１つ以上のポリペプチドを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％ｗ／ｗのような少なくとも５％含む組成物である。これは当業者に知られている以下の方法を用いて評価される。評価されるサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられて、Ｂｉｏ−Ｒａｄクリテリオンシステムのようなタンパク質の定量化に適したダイを用いて可視化される。このゲルはその後、Ｂｉｏ−Ｒａｄクリテリオンシステムのような適したデンシトメトリックスキャナーを用いてスキャニングされ、得られた写真がダイナミックレンジであることが保証される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来の任意の変異体／フラグメントに対応するバンドが定量化され、ポリペプチドのパーセンテージが以下のように計算される：意図するポリペプチドのパーセンテージ＝意図するポリペプチド／（トランスガラクトシル化活性を有するすべてのポリペプチドの合計）＊１００。ポリペプチド変異体の総数／組成物中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来フラグメントは、当業者に知られている方法により、ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８由来のフラグメントを検出することにより決定できる。

【0198】

１つの側面において、本発明の組成物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、または５からなるポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドを含む。
更なる側面において、この組成物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２からなるポリペプチドからなる群より選択される１つ以上のポリペプチドを含む。

【0199】

１つの側面において、本発明は本発明の酵素複合体、酵素担体、および任意で安定化剤および／または防腐剤を含む酵素複合体調製物を提供する。

【0200】

本発明の更なる側面において、酵素担体はグリセロールまたは水からなる群より選択される。

【0201】

更なる側面において、調製物／組成物は安定化剤を含む。１つの側面において、安定化剤は無機塩、ポリオール、糖、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。１つの側面において、ポリオールはグリセロール、プロピレングリコール、またはソルビトールである。更なる他の側面において、糖は低分子炭化水素で、特にグルコース、ガラクトース、フルクトース、およびサッカロース等の甘味物質である。

【0202】

更なる側面において、調製物は防腐剤を含む。１つの側面において、防腐剤はメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ソルビン、または他の食品用防腐剤またはこれらの混合物である。

【0203】

本発明の方法は固定化された酵素、例えば、固定化されたラクターゼまたはたのがガラクトオリゴサッカライド生成酵素を用いて行われる。この酵素は任意の有機または無機担体上に固定化されることができる。例示的な無機担体はアルミナ、セライト、Ｄｏｗｅｘ−１−クロライド、ガラスビーズおよびシリカゲルがある。例示的な有機担体はＤＥＡＥセルロース、アルギン酸ヒドロゲル、またはアルギン酸ビーズまたは均等物を含む。本発明の様々な側面において、ラクターゼの固定化は無機担体へ物理的に吸着させることにより最適化することができる。本発明の実施に用いる酵素は水、トリスＨＣｌ緩衝液、およびリン酸緩衝液を含む、別の媒体で固定化されることができる。酵素は、例えば、フィルター、繊維、カラム、ビーズ、コロイド、ゲル、ヒドロゲル、メッシュのような任意のタイプの基質に固定することができる。

【0204】

１つの側面において、本発明のポリペプチドでラクトースを含むミルクベース基質を処理することにより乳製品を製造するための方法が提供される。更なる側面において、１５分の反応の後に、６０％以上、７０％以上、７５％以上の相対的トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドでラクトースを含むミルクベース基質を処理して乳製品を製造する方法が提供される。１つの側面において、相対的トランスガラクトシル化活性は３０分の反応の後に３以上である。更なる側面において、相対的トランスガラクトシル化活性は３０分の反応の後６以上である。更なる側面において、相対的トランスガラクトシル化活性は３０分の反応の後１２以上である。１つの側面において、ある方法が提供される。ここにおいて、本明細書で開示するポリペプチドでの処理は酵素の活性のための最適な温度で行われる。更なる側面において、ポリペプチドは０．０１−１０００ｐｐｍの濃度でミルクベース基質に添加される。更なる側面において、ポリペプチドは０．１−１００ｐｐｍの濃度でミルクベース基質に添加される。更なる側面において、ポリペプチドは１−１０ｐｐｍの濃度でミルクベース基質に添加される。１つの側面において、微生物で乳製品のような基質を発酵させる工程を更に含む方法が提供される。更なる側面において、この乳製品はヨーグルトである。更なる側面において、ポリペプチドおよび微生物での処理は必ず同時に行われる。１つの側面において、このポリペプチドおよび微生物は同時にミルクベース基質に添加される。１つの側面において、本明細書に記載のような細胞またはポリペプチドを含む乳製品が提供される。１つの側面において、本明細書で定義されるポリペプチドは０．０１−１０００ｐｐｍの濃度で添加される。１つの側面において、本明細書で記載するような不活性化されたポリペプチドを含む乳製品が提供される。１つの側面において、０．０１−１０００ｐｐｍの濃度で本明細書で記載する不活性化ポリペプチドを含む乳製品が提供される。１つの側面において、本明細書で定義されるようなポリペプチドによりその場で形成されたＧＯＳを含む乳製品が提供される。１つの側面において、本明細書で記載する細胞を含む乳製品が提供される。本明細書で記載する乳製品は例えば、スキムミルク、低脂肪乳、全乳、クリーム、ＵＨＴミルク、長期保存用ミルク、発酵ミルク生成物、チーズ、ヨーグルト、バター、デイリースプレッド、バターミルク、酸性ミルクドリンク、サワークリーム、ホエイベースドリンク、アイスクリーム、コンデンスミルク、ドゥルセ・デ・レチェまたはフレーバーミルクドリンクのようなものでよい。乳製品は当業者に既知の任意の方法で製造される。

【0205】

乳製品は追加的に非ミルク成分、例えば、ベジタブルオイル、ベジタブルタンパク質、および／またはベジタブル炭水化物等のベジタブル成分、を含んでいてもよい。乳製品はまた、酵素、香料、プロバイオ培地等の微生物培地、塩、甘味料、糖、酸、フルーツ、フルーツジュース、または乳製品の成分または乳製品に添加すると当業者に知られている任意の他の成分等の更なる添加物も含んでいてよい。

【0206】

本発明の１つの態様において、１つ以上のミルク成分および／またはミルク分画は乳製品の少なくとも７０％等の、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％等の、少なくとも５０％（重量／重量）を占める。

【0207】

本発明の１つの態様において、トランスガラクトシル化活性を有する本明細書で定義される酵素で処理された１つ以上のミルクベース基質は乳製品の少なくとも７０％等の、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％等の、少なくとも５０％（重量／重量）を占める。

【0208】

本発明の１つの態様において、この乳製品は予め生産されたガラクト−オリゴサッカライドの添加により濃度が高くならない乳製品である。

【0209】

本発明の１つの態様において、ポリペプチドで処理したミルクベース基質は乳製品中の成分として用いられる前には乾燥させない。

【0210】

本発明の１つの態様において、乳製品はアイスクリームである。この文脈において、アイスクリームは全脂肪アイスクリーム、低脂肪アイスクリーム、またはヨーグルトまたは他の発酵乳製品に基づくアイスクリームのような任意の種類のアイスクリームでよい。アイスクリームは当業者に既知の方法で製造される。

【0211】

本発明の１つの側面において、乳製品はミルクまたはコンデンスミルクである。本発明の１つの態様において、乳製品はＵＨＴミルクである。本発明の文脈におけるＵＨＴミルクはバクテリアの胞子を含むすべての微生物を殺すことをいとした殺菌工程を経たミルクである。ＵＨＴ（超高音）処理温度は１３０℃で３０秒、または１４５℃で１秒のような処理温度である。

【0212】

本発明の１つの好適な態様において、乳製品はＥＳＬミルクである。本発明の文脈におけるＥＳＬミルクは、ろ過および／または熱処理されて、製品寿命が延長され、２−５℃での貯蔵で、少なくとも１５日、好ましくは、少なくとも２０日、新鮮なままであることのできるミルクである。

【0213】

本発明の他の好適な態様において、乳製品は、例えばヨーグルトのような発酵した乳製品である。

【0214】

大部分の発酵された乳製品のために用いられる微生物は通常乳酸バクテリアとして参照されるバクテリアのグループから選択される。本明細書で用いるように、「乳酸バクテリア」の語は乳酸をおもに生成された酸として生産し、酢酸およびプロピオン酸を含む酸の生成で、糖を発酵する、グラム陽性、微嫌気性または好気性バクテリアを意図する。工業的に最も有用な乳酸バクテリアは、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、シュードロイコノストック属（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）およびプロピオバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）を含む「ラクトバシラス」のオーダーでみられる。追加的に、乳酸生成バクテリアは、嫌気性バクテリア、ビフィドバクテリア、すなわち、単独でまたは乳酸バクテリアと組み合わせて食品培養物として頻繁に用いられるビフォドバクテリウ属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）が乳酸バクテリアのグループの中に通常含まれる。乳酸バクテリアはバルク開始繁殖のための冷凍または凍結乾燥培地または発酵管または発酵された乳製品の生成のためのバットへの職直接接種のための”ダイレクト・バット・セット（Ｄｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ）”（ＤＶＳ）と呼ばれている培地、のいずれかとして乳製品工業に通常供給される。そのような培地は一般的に「開始培地」または「スターター」と呼ばれている。

【0215】

一般的に用いられている乳酸バクテリアの開始培地株は、通常約３０℃の至適成長温度を有する中温性微生物と約４０乃至４５℃の範囲の至適成長温度を有する好熱性微生物とに分けられる。中温性グループに属する典型的な微生物はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、プレセウドロイコノコッカスメセンテロイデス亜種クレモリス（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスバイオバラエティー・ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒ． ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）を含む。
好熱性乳酸バクテリア種は例として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバチルスデルブリッキー亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルスデルブリッキー亜種ブルガリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、およびラクトバチルス・アシドフィリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）がある。ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマルズ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を含むビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する嫌気性バクテリアも乳製品の開始培地に通常用いられ、乳酸バクテリアのグループに含まれる。追加的に、プロピオンバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）の種は、特にチーズの製造における乳製品開始培地として用いられる。追加的に、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は食品の開始培地として通常用いられる。
微生物開始培地の他のグループは、酵母培地および糸状菌の培地を含む糸状菌培地があり、これは特定のタイプのチーズおよび飲み物の製造に特に用いられる。例示的な糸状菌は、ペニシリウム・ロケフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カンジダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクムカンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トルラケフィア（Ｔｏｒｕｌａ ｋｅｆｉｒ）、サッカロミセスケフィア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｅｆｉｒ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がある。

【0216】

本発明の１つの態様において、ミルクベース基質の発酵に用いる微生物はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）またはストレプトコッカス・セレモフィリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびラクトバチルスデルブリッキー亜種ブルガリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合物である。

【0217】

本発明の方法において用いられている発酵プロセスはよく知られていて、当業者は温度、酸素、微生物の量および性質、炭化水素、香料、ミネラル、酵素等の添加材、および処理時間等の好適なプロセス条件をどのように選択するのかを知っている。明らかに、発酵条件は本発明の達成をサポートするために選択される。発酵の結果、ミルクベース基質のｐＨは低くなる。本発明の発酵された乳製品のｐＨは３．５−５の範囲のような、好ましくは３．８−４．８のような、３．５−６の範囲でよい。

【0218】

１つの側面において、ポリペプチドを用いて、または１つ以上のオリゴサッカライドを生成するための細胞タイプを使用する方法が提供される。このオリゴサッカライドはフルクト−オリゴサッカライド、ガラクト−オリゴサッカライド、イソマルト−オリゴサッカライド、マルト−オリゴサッカライド、ラクトスクロス、およびキシローオリゴサッカライドを含むげがこれらに限定されない。

【0219】

本発明の１つの態様において、オリゴサッカライドはラクトース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトースまたはセロビオース等の二糖を含む培地におけるポリペプチドを発現している細胞のインキュベーションにより生成される。インキュベーションはオリゴサッカライドが生成される条件下で実施される。細胞はヨーグルト、チーズ、発酵ミルク製品、食品サプリメント、およびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品の一部である。代替的にオリゴサッカライドが回収され、引き続きその調製の前または後に所望の製品に添加される。

【0220】

１つの側面において、ヨーグルト、チーズ、発酵ミルク製品、食品サプリメント、およびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品の生成のための本明細書に開示される細胞の使用が提供される。

【0221】

１つの側面において、本明細書で開示しているポリペプチドはチーズ製品を調製するためおよびこのチーズ製品の製造のための方法に用いられる。チーズ製品は、例えば、クリームチーズ、カッテージチーズ、およびプロセスチーズからなる群より選択される。ポリペプチドを添加することにより、チーズはガラクト−オリゴサッカライドのレベルが優位に高くなり、ラクトースのレベルが下がる。１つの側面において、最終的なチーズ製品中のラクトースのレベルは少なくとも２５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、およびより好ましくは少なくとも７５パーセントまで低くなる。ポリペプチドは、サービング当り約１グラム未満に減らされて、この量は最も乳糖不耐性の個体によって許容され得る量のチーズ製品中のラクトースの量である。

【0222】

本明細書で提供されるチーズ製品は可溶性繊維が高くなり、カロリーが抑えられ、優れた官能的性質、改善されたテクスチャー、および香りを有する栄養学的に改善されたチーズである。さらに、本明細書で開示するポリペプチドは、ＧＯＳがラクトースまたはその加水分解物よりもゆっくり吸収されることから、このチーズ製品の血糖指数を減らす。最終的に、このポリペプチドは、ＧＯＳはクリームチーズに驚くべきことに改善されたテクスチャーを提供して安定剤の使用を減らし、またはシネレシスなしに水分含量を高めることにより、チーズ製品、特にクリームチーズの製造コストを減らす。

【0223】

更なる側面において、本明細書で開示されるポリペプチドおよび炭水化物基質を含む組成物が提供される。更なる側面において、炭水化物基質は二糖である。更なる側面において、二糖は例えば、ラクトース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、またはセロビオースである。更なる側面において、炭化水素基質はラクトースである。この組成物はオリゴサッカライドが生成されるように調製される。本明細書で開示するポリペプチドはヨーグルト、チーズ、発酵されたミルク製品、食品サプリメント、およびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品の一部である。１つの側面において、本明細書で開示するポリペプチドおよび安定剤を含む組成物が提供される。例示的な安定剤は、例えば、グリセロールまたはプロピレングリコール等のポリオール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体（例えば芳香族ホウ酸エステル）である。

【0224】

１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは本明細書で開示する細胞の、ガラクト−オリゴサッカライドの生成のための使用が提供される。１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは本明細書で開示する細胞の、ヨーグルト、チーズ、発酵されたミルク製品、食品サプリメント、およびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品の一部であるオリゴサッカライドの生成のための、使用が提供される。１つの側面において、この製品はヨーグルト、チーズ、または発酵乳製品である。１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは本明細書で開示する細胞の、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの成長を高めるためのガラクト−オリゴサッカライドの使用が提供される。１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは本明細書で開示する細胞の、混合された培地の発酵におけるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の成長を高めるためのガラクト−オリゴサッカライドの使用が提供される。

【0225】

１つの側面において、ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で好適な培地中で本明細書で開示するポリペプチドを培養する工程および培地から得られたポリペプチドを回収工程を含む、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドの製造のための方法が提供される。ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で好適な培地中で本明細書で開示するポリペプチドを培養する工程および培地から得られたポリペプチドを回収工程を含む、ガラクト−オリゴサッカライドの製造方法が提供される。

【0226】

オリゴサッカライドの添加はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）だけ、あるいは混合物中のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれかの成長を高める。

【0227】

単糖またはＧＯＳへラクトースを転換する酵素でミルクを処理することはいくつかの利点がある。第一は、この乳製品が、鼓腸や下痢などの症状を示すであろう乳糖不耐症を持つ人々にも消費できるようになる。第二に、ラクターゼで処理された乳製品は、乳糖に比べてグルコースとガラクトースのより高い甘味感知に起因して、類似の未処理品よりも高い甘さを有する。この効果は、最終製品の高甘味度が望まれるようなヨーグルト、アイスクリームなどの用途に特に興味深く、これは製品中の正味の糖質を低減させることができる。第三に、アイスクリーム製造において、ラクトース分子が結晶化して乳糖の相対溶解度が低くなることによる、砂感とよばれる現象が、しばしば見られている。ラクトースは、単糖またはＧＯＳに変換すると、非処理物よりもアイスクリームの口の感じは非常に改善される。ラクトース結晶化砂感の存在を排除することができ、ホエイ粉末によって脱脂粉乳を置換することによって原料コストを減少させることができる。酵素処理の主な効果は、甘さの増加である。

【0228】

１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドはキモシンまたはレニン等のプロテアーゼ、フォスフォリパーゼ等のリパーゼ、アミラーゼ、トランスフェラーゼ、およびラクターゼ等の他の酵素と一緒に用いることができる。１つの側面において、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドはラクターゼと一緒に使用される。本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドで処理した後にラクトースを減らすことが望ましい場合、ときに低いラクトースレベルが好ましい場合に、有用である。本発明の文脈におけるラクターゼは、二糖ラクトースをガラクトースとグルコース単糖成分に加水分解する能力を有する任意のグリコ志度ヒドロラーゼである。ラクトースのグループはサブクラスＥＣ３．２．１．１０８に割り当てられている酵素を含むがこれらに限定されない。ＥＣ３．２．１．２３等に割り当てられている他のサブクラスも本発明の文脈におけるラクターゼである。本発明の文脈におけるラクターゼはトランスガラクトシル化活性糖のラクトース加水分解活性の他の活性を有していてもよい。
本発明の文脈において、ラクターゼのラクトース加水分解活性はそのラクターゼ活性またはそのベータ−ガラクトシダーゼ活性を意味する。本発明の方法において用いられるラクターゼ活性を有する酵素は動物、植物、または微生物由来のものでよい。好適な酵素は微生物源、特に、糸状菌または酵母、あるいはバクテリアから得られたものである。酵素は例えば、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、例えばアガリクス・ポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）；アスコバギノスポラ（Ａｓｃｏｖａｇｉｎｏｓｐｏｒａ）； アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）；カエトトマスチア（Ｃｈａｅｔｏｔｏｍａｓｔｉａ）；ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、例えばディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；クルベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）例えばクルベロマイセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、例えばムコール・ジャバニカス（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ムセド（Ｍ． ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・スブチリスイムス（Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、例えばニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）；リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）例えば、リゾムコール・プシラス（Ｒ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ）；リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、例えば（リゾプス・アルヒザス（Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・ジャポニカス（Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）； スクレロティニファ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、例えばスクレロティニファ・リバティアナ（Ｓ．ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ）；トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）；トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）；トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、例えばトリコフィトン・ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）； ウェツェリア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ）、例えばウェツェリア・スクレロチウム（Ｗ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ノバリス（Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロセレモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマルズ（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）；クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、例えばシトロバクター・フレンジ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、例えばクロストリジウム・ペルフリンゲス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；ディプロイア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、例えばディプロイア・ゴシピナ（Ｄ．ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、例えばエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・コロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）；エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、例えばエドワージエラ・トラダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）；エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、例えばエルウィニア・ハルビコラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えばエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ミリオコッカム（Ｍｉｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）；マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｓｉｕｍ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、例えばニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）；プロテアス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えばプロテアス・ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）；プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、例えばプロビデンシア・スチュアティー（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ）； ピノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、例えばピノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピノポラス・サングイエンス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）；ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、例えばルミノコッカス・トルケス（Ｒ． ｔｏｒｑｕｅｓ）；サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・チフリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；セラチナ（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチナ・リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ）、セラチナ・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）；シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、例えばシゲラ・フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えばストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・カスタレログロビスポラス（Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ストレプトマイセス・ビオレセオルバー（Ｓ．ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ）；トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）；トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えばトリコデルマ・レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）；エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、例えばエルシニア・エンテロコリチア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ） 由来である。

【0229】

１つの態様において、ラクターゼはクルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のような微生物の細胞内成分である。クルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、特にクルベロマイセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびクルベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、並びにカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）等の他の糸状菌は糸状菌ラクターゼの一般的な供給源であり、一方 バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）およびバチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）はバクテリアラッカーゼのよく知られた源である。これらの微生物由来の市販のいくつかのラクターゼ調製物は、例えば、Ｌａｃｔｏｚｙｍ．ＲＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋより入手可能）、ＨＡ−Ｌａｃｔａｓｅ（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ， Ｄｅｎｍａｒｋより入手可能）およびＭａｘｉｌａｃｔ．ＲＴＭ（ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ＤＳＭ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）等がある（すべてクルベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））。これらのラッカーゼのすべてはｐＨ６乃至８の至適ｐＨを有する中性ラッカーゼと呼ばれている。そのようなラッカーゼが例えば、低ラクトースヨーグルトの生成に使用された場合、酵素処理は発酵前の別の工程において、またはむしろ高い酵素投与量を用いて、のいずれかで行われなければならない。なぜなら、それらの活性は発酵の間にｐＨが低くなると低下するからである。これらのラクターゼは、いくつかのケースにおいて微生物の数を少なくして、よいミルクの品質を確実にするために有用であろう高い温度で行うミルク中のラクトースの加水分解のためには好ましくない。１つの態様において、この酵素は、バクテリア、例えばＷＯ２００９／０７１５３９に記載のようなラクターゼ等のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のような、ビフィドバクテリアカエ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ファミリー由来のラクターゼである。

【0230】

本発明の更なる側面
側面１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが該ポリペプチドをコードしているバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株の核酸配列における発現生成物である場合、前記ポリペプチドはトランスガラクトシル化活性を有する前記核酸配列の単なるポリペプチド発現生成物である、ポリペプチド。
側面２
以下の群より選択されるトランスガラクトシル活性を有するポリペプチド：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド、
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９７５個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド、
ｃ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で１３００個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド、
ｄ．ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４または５のポリペプチドをコードしている
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３からなる核酸またはｉｉ）ｉ）の相補鎖に、少なくとも低いストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、
ｅ．ＳＥＱ ＤＩ ＮＯ：１、２、３、４または５のポリペプチドをコードしている核酸配列または成熟ポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３からなる核酸配列に少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
ｆ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４または５の１つ以上のアミノ酸残基に欠失、挿入および／または置換を含むポリペプチド。
側面３
以下の群より選択されるトランスガラクトシル活性を有するポリペプチド：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド、
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で１３００個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド、
ｃ．ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４または５のポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３からなる核酸またはｉｉ）ｉ）の相補鎖に、少なくとも低いストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、
ｄ．ＳＥＱ ＤＩ ＮＯ：１、２、３、４または５のポリペプチドをコードしている核酸配列または成熟ポリペプチドをコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３からなる核酸配列に少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
ｅ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４または５の１つ以上のアミノ酸残基に欠失、挿入および／または置換を含むポリペプチド。
側面４
前述の側面にいずれかに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが該ポリペプチドをコードしているバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株の核酸配列における発現生成物である場合、前記ポリペプチドはトランスガラクトシル化活性を有する前記核酸配列の単なるポリペプチド発現生成物である、ポリペプチド。
側面５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で１３００個のアミノ酸残基からなる、前述の側面にいずれかに記載のポリペプチド。
側面６
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、前述の側面にいずれかに記載のポリペプチド。
側面７
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、側面１、２、および４のいずれかに記載のポリペプチド。
側面８
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは最大で９８０個のアミノ酸残基からなる、前述の側面にいずれかに記載のポリペプチド。
側面９
前記ポリペプチドがトランスガラクトシル化活性を有する、側面８のポリペプチド。
側面１０
前記ポリペプチドが該ポリペプチドをコードしているバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株の核酸配列における発現生成物である場合、前記ポリペプチドはトランスガラクトシル化活性を有する前記核酸配列の単なるポリペプチド発現生成物である、側面８および９のいずれか１つの側面に記載のポリペプチド。
側面１１
前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、前記配列同一性が、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のような、少なくとも９５％である、ポリペプチド。
側面１２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％の配列同一性を有する、ポリペプチド。
側面１３
トランスガラクトシル化活性を有する、側面１２に記載のポリペプチド。
側面１４
前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、前記配列同一性が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、のような、少なくとも９０％の配列同一性を有する、ポリペプチド。
側面１６
側面１乃至１５のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、疑義の配列と参照配列との間の配列同一性の程度は１）デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルトギャップペナルティーを用いる任意の好適なアラインメントプログラムによる２つの配列のアラインメント工程、２）正確に一致した数を同定する工程、ここにおいて、正確に一致とはこのアラインメントにおける所与の位置における２つの整列させられた配列においてアミノ酸または塩基が同一であるとアラインメントプログラムが同定したことを意味する、および３）３）２つの配列のうちの長い方の配列の長さで正確に一致した数を割る工程により決定される、ポリペプチド。
側面１７
側面１乃至１６のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、１）デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルトギャップペナルティーを用いる任意の好適なアラインメントプログラムによる２つの配列のアラインメント工程、２）正確に一致した数を同定する工程において、正確に一致とはこのアラインメントにおける所与の位置における２つの整列させられた配列においてアミノ酸または塩基が同一であるとアラインメントプログラムが同定したことを意味する、および３）「整列させた配列の長さ」で正確に一致した数を割る。ここにおいて、「整列させた配列の長さ」はギャップおよび配列のオーバーハンギング部位を含むアラインメント全体の長さである工程である、ポリペプチド。
側面１８
好適なアラインメントプログラムがグローバルアラインメントプログラムである、側面１５、１６、および１７のいずれか１つの側面に記載のポリペプチド。
側面１９
前記グローバルアラインメントプログラムがＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる、側面１８のポリペプチド。
側面２０
前記グローバルアラインメントプログラムがＥＭＢＯＳＳ ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ ストレッチャーからなる群より選択される、側面１８および１９のいずれか１つの側面に記載のポリペプチド。
側面２１
前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、最大で９７０個アミノ酸残基、最大で９５０個アミノ酸残基、最大で９４０個アミノ酸残基、最大で９３０個アミノ酸残基、最大で９２０個アミノ酸残基、最大で９１０個アミノ酸残基、最大で９００個アミノ酸残基、最大で８９５個アミノ酸残基、最大で８９０個アミノ酸残基等の最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面２２
前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、８８７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面２３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からなる、前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチド。
側面２４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列からなる、前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチド。
側面２５
前述の側面のいずれか１つの側面に記載のポリペプチドであって、９６５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面２６
側面１乃至２３および２５のいずれかに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９６．５％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面２７
側面１乃至２３、２５、および２６のいずれかに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも９８％、少なくとも９９％等の少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面２８
側面１乃至２３、２５、２６、および２７のいずれかに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２からなるポリペプチド。
側面２９
側面１乃至２３および２５乃至２８のいずれかに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
側面３０
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが最大で１３００個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド。
側面３１
前記ポリペプチドがトランスガラクトシル化活性を有する、側面３０のポリペプチド。
側面３２
側面３０および３１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが該ポリペプチドをコードしているバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株の核酸配列における発現生成物である場合、前記ポリペプチドはトランスガラクトシル化活性を有する前記核酸配列の単なるポリペプチド発現生成物であ
る、ポリペプチド。
側面３３
側面１乃至１５、１５乃至２０、および３０乃至３２のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、前記配列同一性が、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％等の少なくとも９７％の配列同一性である、ポリペプチド。
側面３４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からなる、側面１乃至１５、１５乃至２０、および３０乃至３３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面３５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列からなる、側面１乃至１５、１５乃至２０、および３０乃至３４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面３６
側面１乃至１５、１５乃至２０、および３０乃至３５のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、最大で１２８０個、最大で１２７０個、最大で１２６０個、最大で１２５０個、最大で１２４０個、最大で１２３０個、最大で１２２０個、最大で１２１５個のアミノ酸残基等の、最大で１２９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面３７
１２１１個のアミノ酸残基からなる側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、および３６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面３８
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６、および３７のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に少なくとも９８．５％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面３９
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６、３７、および３８のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面４０
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、および３６乃至３９のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５からなるポリペプチド。
側面４１
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、および３６乃至３９のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
側面４２
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、および３６乃至４０のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、最大で１２００個、最大で１１９０個、最大で１１８０個、最大で１１７０個、最大で１１６０個、最大で１１５０個、最大で１１４５個のアミノ酸残基等の、最大で１２１０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面４３
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、および４２のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、１１４２個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面４４
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２、および４３のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面４５
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２、４３、および４４のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性のような、少なくとも９７％の配列同一
性を有するポリペプチド。
側面４６
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、および４２乃至４５のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなるポリペプチド。
側面４７
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、および４２乃至４６のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
側面４８
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、および４２乃至４６のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、最大で１１２０個、最大で１１１０個、最大で１１００個、最大で１０９０個、最大で１０８０個、最大で１０７０個、最大で１０６０個、最大で１０５０個、最大で１０５５個、最大で１０４０個のアミノ酸残基等の、最大で１１３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面４９
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２乃至４６、および４８のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、１０３８個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
側面５０
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２乃至４６、４８、および４９のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９６．５％配列同一性を有する、ポリペプチド。
側面５１
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２乃至４６、４８、４９、および５０のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性のような、少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチド。
側面５２
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２乃至４６、および４８乃至５１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からなるポリペプチド。
側面５３
側面１乃至１５、１５乃至２０、３０乃至３４、３６乃至４０、４２乃至４６、および４８乃至５１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
側面５４
前述の側面のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、初期ラクトース濃度が３％（ｗ／ｗ）以上で３０分反応させた後のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が少なくとも１、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２のような、少なくとも０．５である、ポリペプチド。
側面５５
前述の側面のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、初期ラクトース濃度が３％（ｗ／ｗ）以上で３０分反応させた後のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２のような、少なくとも２．５である、ポリペプチド。
側面５６
側面５４および５５のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、前記初期ラクトース濃度が３％ｗ／ｗである、ポリペプチド。
側面５７
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、単離および／または精製されている、ポリペプチド。
側面５８
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、組み換え的に生産されたポリペプチド。
側面５９
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１００％以上のトランスガラクトシル化活性の比を有する、ポリペプチド。
側面６０
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１５０％、１７５％、または２００％以上のトランスガラクトシル化活性の比を有する、ポリペプチド。
側面６１
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなる群より選択されるアミノ酸配列でグリコシドヒドロラーゼ触媒コアを有する、ポリペプチド。
側面６２
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ （ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）および／またはＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含むポリペプチド。
側面６３
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｇ様ドメイン（グループ４）（ＰＦ０７５３２）を含むポリペプチド。
側面６４
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであってビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）由来である、ポリペプチド。
側面６５
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、至適ｐＨが６．７−７．５である、ポリペプチド。
側面６６
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、４０−６０℃のような、３０−６０℃の至適温度を有するポリペプチド。
側面６７
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、１つのアミノ酸配列に対する他のアミノ酸配列の配列同一性が置換マトリックスとしてワードサイズ３でＢＬＯＳＵＭ６２を用いるＢｌａｓｔの使用により決定される、ポリペプチド。
側面６８
組み換えポリペプチドである、前述のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面６９
凍結乾燥された、前述のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面７０
溶液中にある、前述のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面７１
単離されたポリペプチドである、前述のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面７２
精製されたポリペプチドである、前述のいずれか１つに記載のポリペプチド。
側面７３
前述のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
側面７４
側面７３の核酸または側面１乃至７２のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現するこ
とができる、発現ベクター。
側面７５
側面１乃至７２のいずれか１つのポリペプチドを発現することができる細胞。
側面７６
ポリペプチドを発現する方法であって、該方法が側面７５の細胞を入手する工程およびこの細胞から前記ポリペプチドを発現させる工程、および任意でこのポリペプチドを精製する工程からなる、方法。
側面７７
側面１乃至７２のいずれか１つに記載されたポリペプチドを含む組成物であって、好ましくは食品組成物、更に好ましくは乳製品である、組成物。
側面７８
側面７７の組成物であって、側面１乃至７２のいずれか１つに記載の１つ以上のポリペプチドを組成物の総重量に基づいて少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％ｗ／ｗ等の少なくとも５％含み、前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して、７２％、７４％、７４％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％のような少なくとも７０％の配列同一性を有している、組成物。
側面７９
側面７７および７８のいずれか１つに記載の組成物であって、１つ以上のポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、および５からなる群より選択される、組成物。
側面８０
側面７７、７８、および７９のいずれか１つに記載の組成物であって、１つ以上のポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、および３からなる群より選択される、組成物。
側面８１
側面７７乃至８０のいずれか１つに記載の組成物であって、１つ以上のポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２から選択される、組成物。
側面８２
ラクトースを含む基質を側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドで処理することりよる食品の製造方法。
側面８３
ラクトースを含むミルクベース基質を側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドで処理することによる乳製品の製造方法。
側面８４
側面８２および８３のいずれか１つに記載の方法であって、更に基質を加水分解β−ガラクトシダーゼで処理する工程を含む方法。
側面８５
側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドでラクトースを含む基質を処理する工程により得られた、ガラクト−オリゴサッカライドまたはそれらの組成物。
側面８６
側面１乃至７２のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
側面８７
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、または１３に少なくとも６０％同一な核酸配列を有する側面８６の核酸。
側面８８
側面８６および８７の１つの記載の核酸を含むプラスミド。
側面８９
側面８６および８７のいずれか１つに記載の核酸を含むまたは、側面１乃至７２のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現することができる、発現ベクター。
側面９０
側面８８のプラスミドまたは側面８９の発現ベクターで、好ましくは形質転換された宿主
細胞。
側面９１
側面１乃至７２のいずれか１つに記載されたポリペプチドを発現することができる細胞。
側面９２
バクテリア、糸状菌、または酵母細胞である、側面９０の宿主細胞、または側面９１の細胞。
側面９３
側面９２に記載の細胞であって、前記細胞がルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ），エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓiｓ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からなる群より選択される、細胞。
側面９４
側面９３の細胞であって、前記細胞がルミノコッカス・ハンセンイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からなる群より選択される、細胞。
側面９５
ポリペプチドを発現する方法であって、前記方法が側面９１乃至９４のいずれか１つに記載の宿主細胞または細胞を得る工程、およびこの宿主細胞または細胞からポリペプチドを発現させる工程、および任意でポリペプチドを精製する工程を含む、方法。
側面９６
側面１乃至７２のいずれかで定義されるポリペプチドおよび安定剤を含む組成物。
側面９７
側面１乃至７２のいずれかで定義されるポリペプチドおよび炭水化物基質を含む組成物。
側面９８
側面９７の方法であって、前記炭水化物基質がニ糖である、方法。
側面９９
前記ニ糖がラクトースである、側面９８に記載の方法。
側面１００
側面１乃至７２のいずれか１つに記載のポリペプチドでラクトースを含むミルクベース基質を処理する工程を含む乳製品を製造する方法。
側面１０１
側面９０の方法であって、ポリペプチドが前述のトランスガラクトシル化活性の比を有する、方法。
側面１０２
側面１００および１０１のいずれか１つに記載の方法であって、前記ミルクベース基質がヨーグルト、チーズ、または発酵乳製品である、方法。
側面１０３
側面１００、１０１、および１０２のいずれか１つに記載の方法であって、更に前記基質を発酵させることができる微生物で前記基質を発酵させる工程を更に含む、方法。
側面１０４
前記ミルクベース基質がヨーグルトである、側面１０３に記載の方法。
側面１０５
側面１００乃至１０４のいずれか１つに記載の方法であって、ポリペプチドと微生物との処理が同時に行われる、方法。
側面１０６
側面１００乃至１０５のいずれか１つに記載の方法であって、前記ポリペプチドと微生物とが必ず同時にミルクベース基質に添加される、方法。
側面１０７
ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食品サプリメントおよびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品を製造するための上記側面のいずれかの細胞の使用。
側面１０８
上記側面のいずれかに記載の細胞を含む乳製品。
側面１０９
側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドを含む乳製品。
側面１１０
０．０１−１０００ｐｐｍの濃度で側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドを含む乳製品。
側面１１１
側面１乃至７２のいずれか１つで定義される不活性化されたポリペプチドを含む乳製品。
側面１１２
０．０１−１０００ｐｐｍの濃度で側面１乃至７２のいずれか１つで定義される不活性化されたポリペプチドを含む乳製品。
側面１１３
側面１乃至７２のいずれか１つで定義されるポリペプチドによりその場で形成されたＧＯＳを含む乳製品。
側面１１４
ガラクト−オリゴサッカライドを生成するための、側面１乃至７２のいずれか１つのトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは上記側面のいずれか１つの細胞の使用。
側面１１５
ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食品サプリメント、およびプロバイオティック食品からなる群より選択される製品の一部となるガラクト−オリゴサッカライドを生成するための、側面１乃至７２のいずれか１つのトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは上記側面のいずれか１つの細胞の使用。
側面１１６
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の成長を高めるためのガラクト−オリゴサッカライドを生成するための、側面１乃至７２のいずれか１つのトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは上記側面のいずれか１つの細胞の使用。
側面１１７
混合培養発酵物中のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の成長を高めるためのガラクト−オリゴサッカライドを生成するための、側面１乃至７２のいずれか１つのトランスガラクトシル化ポリペプチドまたは上記側面のいずれか１つの細胞の使用。
側面１１８
側面１乃至７２のいずれか１つのトランスガラクトシル化ポリペプチドを製造する方法において、前記ポリペプチドを発現させる条件下で好適な培養培地において上記側面の１つに記載の細胞を培養する工程およびこの培地から得られたポリペプチドを回収する工程を含む、方法。
側面１１９
ガラクト−オリゴサッカライドを生成する方法であって、側面１乃至７２のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記側面のいずれかの細胞をラクトースを含むミルクベース溶液
と接触させる工程を含む、方法。
側面１２０
トランスガラクトシル化活性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のＣ末端切断フラグメントであり、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株等のバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物中で生成されたときに、タンパク質分解による更なる切断に耐性があり、および／または最終的に製剤化した後の貯蔵の間の更なる切断にも安定である、ポリペプチド。
側面１２１
側面１２０のポリペプチドであって、側面１乃至７２のいずれか１つで更に定義されるポリペプチド。

【0231】

材料と方法
方法１
ポリペプチドの生成
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で発現するためにコドン最適化されたビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）完全長（１７５２残基）遺伝子をコードするために設計された合成遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８）をＧｅｎｅＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。

【0232】

合成遺伝子の選択された領域を特異的に増幅させることができるリバースプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）切断変異体を構築した。
フォワードプライマー：ＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧ（ＳｐｅＩは下線）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
リバースプレイマー：

【0233】

合成遺伝子をＳｐｅＩおよびＰａｃＩ（図１）の独特の制限部位を用いてｐＢＮｓｐｅバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現ベクターへクローンし、単離されたプラスミドを（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ３５９４株内で形質転換した。形質転換体は、選択剤として１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含むＬＢプレート上で、ストリークを繰り返した。
Ｐ６４
予備培地を１０μｇ／ｍＬネオマイシンを含むＬＢ培地に用意して１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃、７時間で収穫した。この予備培地の５００μＬをネオマイシンを１０μｇ／Ｌ含むＧｒａｎｔ培地５０ｍＬへの接種に用いて、１８０ｒｐｍで振とうしながら３３℃、６８時間、成長させた。

【0234】

培地に直接、最終濃度で１ｍｇ／ｍｌのＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と１０Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を添加することにより細胞を溶解し、１８０ｐｒｍの振とうで３３℃で１時間インキュベートした。溶解物は１０，０００ｘｇで２０分延伸分離して、その後フィルターろ過して洗浄した。

【0235】

以下のようにＧｒａｎｔ修飾培地を調整した：
パート Ｉ （オートクレーブ）
ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ） １０ｇ
１リットルあたり５００ｍｇにする
パート ＩＩ
１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４ ３ｍＬ
グルコース ７５ｇ
尿素 ３．６ｇ
Ｇｒａｎｔ’ｓ １０Ｘ ＭＯＰＳ １００ｍＬ
１リットルあたり４００ｍｌにする
パートＩ（２ ｗ／ｗ ％ Ｓｏｙｔｏｎｅ）を調整して１２１℃で２５分オートクレーブにかけた。
パートＩＩを調整してパートＩと混合し、ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで７．３に調整した。容量をフル容量にして、０．２２−μｍ ＰＥＳフィルターを通して滅菌した。
１０ ｘＭＯＰＳ緩衝液を以下の手順で調整した。
８３．７２ｇ トリシン
７．１７ｇ ＫＯＨ ペレット
１２ｇ ＮａＣｌ
２９．２２ｇ ０．２７６Ｍ Ｋ_２ＳＯ_４
１０ ｍＬ ０．５２８Ｍ ＭｇＣｌ_２
１０ ｍＬ １００倍のＧｒａｎｔ微量栄養素
水で９００ｍｌにして、溶解した、ｐＨをＫＯＨで７．４に調整して、１リットルにして、この溶液を０．２２−μｍ ＰＥＳフィルターを通して滅菌した。
１００倍のＧｒａｎｔ微量栄養素は以下のように調整された：
クエン酸ナトリウム．２Ｈ_２Ｏ １．４７ｇ
ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ １．４７ｇ
ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ ０．４ｇ
ＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ
ＺｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ
ＣｕＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ ０．０５ｇ
ＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ
溶解して１リットルにメスアップ。
０．２−μｍ ＰＥＳフィルターを通して滅菌した。
暗室で４℃で保管した。

【0236】

方法２
精製および酵素調整
ろ過された酵素単離物は１０ｋＤａカットオフのＶｉｖａＳｐｉｎウルトラろ過デバイスを用いて濃縮し（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ， Ｌｏｔ＃１２ＶＳ２００４）、濃縮物をＰＤ１０脱塩カラムに導入して（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｌｏｔ＃ ６２８４６０１）、ｐＨ８．６トリス−ＨＣＬで溶出した。クロマトグラフィーはAｋｔａ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のマニュアルに従って行った。約２０ｍｇのタンパク質を含む４ｍｌの脱塩サンプルを２ｍｌのＨｙｐｅｒＱカラム（ＨｙｐｅｒＣｅｌ^ＴＭ、Ｑソルベント）に導入して、２０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、流速１ｍｌ／分で溶出した。カラムを３０倍のカラム容量の洗浄緩衝液で洗浄して結合しているβ−ガラクトシダーゼを２０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌまでの１００倍カラム容量の長さの濃度勾配で溶出した。カラム上に残っている不純物を２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．６、５００ｍＭ ＮａＣｌを用いて１段階溶出を行って除去した。流れて溶出されたタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性を解析して、ＳＤＳ−ページを行った。

【0237】

ＳＤＳ−ページゲル法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰａｇｅR Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ １．０ ｍｍ， １０ ｗｅｌｌ （Ｃａｔ＃ＮＰ０３２１ｂｏｘ）， Ｓｅｅ−ＢｌｕｅR Ｐｌｕｓ２ 予備染色スタンダード（Ｃａｔ＃ ＬＣ５９２５）およびＮｕＰＡＧＥR ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｃａｔ＃ ＮＰ０００２）を用いて、製造元の仕様書に従って行った。

【0238】

方法３
β−ガラクトシダーゼ活性の測定
酵素活性は市販の基質である、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｎ１１２７）を用いて測定した。
ＯＮＰＧアクセプター無し
１００ｍＭ ＫＰＯ_４ ｐＨ６．０
１２．３ｍＭ ＯＮＰＧ
アクセプターを補ったＯＮＰＧ
１００ｍＭ ＫＰＯ_４ ｐＨ６．０
２０ｍＭ セロビオース
１２．３ｍＭ ＯＮＰＧ
停止溶液
１０％ Ｎａ_２ＣＯ_３
精製した酵素の１０μｌ連続希釈物をアクセプターのある、またはない、 ９０μｌ ＯＮＰＧ緩衝液を含むマイロタイタープレートのウェルに添加した。サンプルを混合して３７oＣで１０分間インキュベートし、１００μｌの停止溶液を各ウェルに添加して反応を止めた。吸光度の測定はＳｏｆｔｍａｘソフトウェアパッケージによりコントロールされているＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで４２０ｎｍ（の吸光度）を測定して行った。

【0239】

希釈で吸光度が０．５乃至１．０の間になるものに対して、トランスガラクトシル化活性の比の計算は以下のようである。
トランスガラクトシル化活性の比＝（Ａｂｓ４２０^{＋セロビオース}／Ａｂｓ４２０^{−セロビオース}）＊１００
（図３）。

【0240】

方法４
ＬＡＵ活性の決定
原理：
このアッセイ方法の原理は、３７℃でラクターゼが２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を２−ｏ−ニトロフェノール（ＯＮＰ）とガラクトースとに加水分解することによる。この反応を炭酸ナトリウムで停止して、遊離したＯＮＰがスペクトロフォトメーターまたはコロニメーターにより４２０ｎｍで測定される。
試薬：
ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．４（１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．４， １０ｍＭ ＣａＣｌ_２）：１９．５２ｇ ＭＥＳ水和物 （Ｍｗ：１９５．２ ｇ／ｍｏｌ， Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｍ８２５０−２５０Ｇ）および１．４７０ｇ ＣａＣｌ_２ニ水和物（Ｍｗ：１４７．０１ｇ／ｍｏｌ， Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を１０００ ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに溶解して、１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整する。０．２μｍフィルターでろ過をする。４℃で１カ月まで保管する（保管できる）。

【0241】

ＯＮＰＧ基質ｐＨ６．４（１２．２８ｍＭ ＯＮＰＧ、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ ６．４、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２）：０．３７０ｇの２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ， Ｍｗ：３０１．５５ｇ／ｍｏｌ， Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｎ１１２７）を１００ｍｌのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．４に溶解して、４℃で７日間保管。
停止試薬（１０％ Ｎａ_２ＣＯ_３）：２０．０ｇのＮａ_２ＣＯ_３を２００ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに溶解し、０．２μｍのフィルターでろ過意して、室温で１カ月まで保管。
手順：
酵素サンプルの連続希釈をＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．４で行って、１０μＬの各サンプルの希釈物を９０μｌのＯＮＰＧ基質ｐＨ６．４を含む９６ウェルのマイクロタイタープレートへ移した、サンプルを混合して、サーモミキサー（Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて３７℃で５分インキュベートして、１００μｌの停止試薬を各ウェルに添加して反応を停止した。ブランクは酵素サンプルのかわりにＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．４を用いた。４２０ｎｍにおけるブランクに対する吸光度の増加をＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）で測定した。
活性の計算：
ｐＨ６．４におけるＭＥＳ緩衝液中の２−ｏ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ ＃３３４４４−２５Ｇ）のモル吸光係数を決定した（０．５９９８ｘ １０^−６ Ｍ^−１ ｘｃｍ^−１）。ラクターゼ活性１単位（ＬＡＵ）は１分間にＯＮＰＧの１ｎｍｏｌの加水分解に対応すると定義される。総容量２００μｌの総反応容量のマイクロタイタープレートを用いて、酵素サンプルｍｌ当たりのラクターゼ活性を以下の式を用いて計算した：

【0242】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示すＢＩＦ９１７に対する比活性計算
ＢＩＦ９１７の濃度の決定：
標的酵素（ＢＩＦ９１７）および切断生成物の定量化は、クリテリオンの無染色ＳＤＳページシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。任意のｋＤのステインフリープレキャストゲル４−２０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１８ウェル（Ｃｏｍｂ ＃３４５−０４１８）をＳｅｒｖａ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ ｃａｔ． ＃４２５２９）と一緒に用いた。ゲルは以下のパラメータで実施した：２００Ｖ、１２０ｍＡ、２５Ｗ、５０分。ＢＳＡ（１．４３ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ｃａｔ． ＃５００−０００７）をプロテインスタンダードとして用いて、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）をＩｍａｇｅ Ｌａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＲａｄ）と共に用いて、トリプトファン含量に相関しているバンドの強度を用いて定量化した。
ＢＩＦ９１７の具体的なＬＡＵ活性を（方法１で説明するような）２つの独立した発酵物で、５つの異なる希釈率の、粗発酵物（ウルトラろ過濃縮物）から決定した（表１参照）。
ＢＩＦ９１７の比活性は２１．３ＬＡＵ／ｍｇまたは０．０２１３ＬＡＵ／ｐｐｍであることが分かった。
表１：ＢＩＦ９１７比活性の決定

【0243】

実施例
実施例１
ＢＩＦ切断変異体のβ−ガラクトシダーゼ活性の決定
８個の異なる変異体：ＢＩＦ＿９１７、ＢＩＦ＿９９５、ＢＩＦ＿１０６８、ＢＩＦ＿１１７２、ＢＩＦ＿１２４１、ＢＩＦ１３２６、ＢＩＦ＿１４００およびＢＩＦ＿１４７８を方法１に記載のように構築し、方法２に記載のように精製した
（図２参照）。
上の方法３で説明するように、セロビオースの存在および不存在下で、全ての切断変異体についてβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。
結果
トランスガラクトシル化活性の比（（Ａｂｓ４２０^{＋セロビオース}／Ａｂｓ４２０^{−セロビオース}）＊１００）は各変異体について測定されたβ−ガラクトシダーゼから計算し、図３に示した。１２４１残基以下の長さの変異体が１００％以上のトランスガラクトシル化活性を示した。このことはこれらの変異体が主にトランスガラクトシル化していることを示している。１２４１残基以上の長さの変異体は１００％以下のトランスガラクトシル化活性を示した。このことはこれらの変異体は主に加水分解されていることを示している。ＢＩＦ＿９１７およびＢＩＦ＿９９５は約２５０％の最も高いトランスガラクトシル化活性を有している。

【0244】

実施例２
ヨーグルト基質中で生成されたＧＯＳ
ＢＩＦ酵素のＧＯＳ生成における評価を偽ヨーグルト製品において試験した。１００μｌの容量のバッチ試験を、９８．６０％（ｗ／ｖ）の新鮮な低温殺菌低脂肪ミルク（Ｍｉｎｉ−ｍaｌｋ， Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）および１．４％（ｗ／ｖ）のＮｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５ホエイ成分（Ａｒｌａ）からなるヨーグルト混合物を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。Ｎｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５を完全に水和するために、この混合物を２０時間撹拌してで２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５を添加して、ｐＨを６．５にした。このミルクはプレーンで、ラクトース濃度は５．５％（ｗ／ｖ）と決定された。これは溶液において５．３％（ｗ／ｗ）に相当する。以下の係数が本実施例において妥当である： １％（ｗ／ｖ）ラクトース＝０．９５８７％（ｗ／ｗ）ラクトース。ミルクベース（基質）の９０μｌを１０μｌの精製された酵素と混合して、テープで密封して４３℃で３時間インキュベートした。反応を１００μｌの１０％Ｎａ_２ＣＯ_３で停止した。サンプルを−２０℃に保管した。
ＨＰＬＣ法
ガラクトオリゴサカライド（ＧＯＳ）、ラクトース、グルコース、およびガラクトースの提供はＨＰＬＣを用いて行った。サンプルの解析はＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ ３０００を用いて行った。ＩＣパラメータは以下のようである：移動相：１５０ｍＭ ＮａＯＨ、流速：Ｉｓｏｃｈｒａｔｉｃ， ０．２５ｍｌ／分、カラム：Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１、カラム温度：室温、インジェクション容量：１０μｌ、検出器：ＰＡＤ、 積分：マニュアル、サンプル調整：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１００倍希釈（０．１ｍｌ サンプル＋９．９ｍｌ水）および４５μｍのシリンジフィルターでろ過、定量：標準物質のピーク面積におけるサンプルのピーク面積のパーセンテージ。ＧＯＳシロップ （Ｖｉｖａｎａｌ ＧＯＳ， Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｃａｍｐｉｎａ）ＧＯＳの定量のスタンダードとして用いた。この実施例において、「ＧＯＳ」の語は重合度が３以上のガラクトオリゴサッカライドであると定義される。
結果
ＢＩＦ＿９１７、ＢＩＦ＿９９５、およびＢＩＦ＿１３２６におけるミルクベース基質において生成されたＧＯＳの定量化された量を図４に示す。短鎖変異体であるＢＩＦ＿９１７およびＢＩＦ＿９９５は、ＢＩＦ１３２６が生成した０．１％（ｗ／ｖ）と比較して、約１．２％（ｗ／ｖ）の有意に高いＧＯＳ生成を有した（９５％の信頼度でのスチューデントＴテストにより決定された）。

【0245】

実施例３
切断変異体の分解パターン
ＢＩＦ１２３０およびＢＩＦ１３２５の間の領域をカバーしているライブラリーをＧｅｎｅＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）（表２参照）に発注した（から入手した）。
切断変異体は方法１に記載のように生成した。得られたペプチドをＤＳＤ−ＰＡＧＥ解析にかけ、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ＃ ＬＣ６０６０）で可視化した（図５）。
結果
驚くべきことに、発酵の最後に標的であるバンドがいろんな量で出現しており、最終ブロスにおいて、大部分の変異体はタンパク質分解的に修飾されていた。

【0246】

この変異体はいろいろな強度の３つの区別できるバントを生成した。これはマススペクトロメトリーを用いて評価された。この変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の末端に相当するＢＩＦ９１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のの末端に相当するＢＩＦ９９５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の末端に相当するＢＩＦ１０６８にＣ末端切断を有する。
ゲルから切り取られたタンパク質バンド（図５で矢印で示す）はマススペクトロメトリー解析のための調整物として３つの異なる酵素を用いて消化される。トリプシン加水分解ペプチドは特に、プロリン（Ｐ）がカルボキシル側にあるときを除いて、アルギニン（Ｒ）とリジン（Ｋ）残基のカルボキシル側に特異的に結合する。αキモトリプシン加水分解ペプチドは、プロリン（Ｐ）がカルボキシル側にあるときを除いて、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、およびロイシン（Ｌ）残基のカルボキシル側に特異的に結合する。Ｇｌｕ−Ｃは優先的に、ニカルボン酸アンモニウム緩衝液ｐＨ８において、グルタミル（Ｅ）のカルボキシル側を切断するが、加水分解がリン酸緩衝液ｐＨ８で行われた場合にはアスパラギン酸（Ｄ）のカルボキシル側を切断する。

【0247】

Ｃ末端を検出するために、４０％の^１８Ｏ水を消化緩衝液として用いる以外は我々のタンパク質の特徴付けの基本的な方法（Ａ２９６３）を用いる解析のために所望のタンパク質を調製する。タンパク質分解性による切断で、得られたペプチド中に^８Ｏ水と ^１６Ｏ水の両方を取り込まれ、１対として現れるという原理である。しかしタンパク質のＣ末端は、切断されていなく、単にタンパク質に残された「最後のペプチド」であるがために、、^１６Ｏ−水との単一ペプチドとして表れる。このようにして、Ｃ末端は、ＭＳ／ ＭＳ分析を使用してマッピングされる。
表２
変異体

【0248】

【0249】

【0250】

実施例４
ミルクベースおよびヨーグルト中でその場で酵素的に生成されたＧＯＳ
この実施例において、「ＧＯＳ］の語は重合度（ＤＰ）が３以上のガラクトオリゴサッカライドであると定義される。

【0251】

ＢＩＦ９１７およびＢＩＦ９９５により生成されたＧＯＳの評価は異なるセットスタイルヨーグルト（これらのペプチドを）その場で用いて行った。β−ガラクトシダーゼをミルクベースに添加して同時に特定のヨーグルト培地の添加も行った。このヨーグルト発酵プロセスと一緒にトランスガラクトシル化反応も行われることとなる。

【0252】

初期ヨーグルト（セットスタイル）バッチ実験を１００ｍｌミルクベース（ヨーグルトミックス）で行った。このミルクベースは９８．６０％（ｗ／ｖ）の新鮮な低温殺菌の従来の（非有機）低脂肪ミルク（Ｍｉｎｉ−ｍaｌｋ ０．５％脂肪、Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ Ａｍｂａ， Ｄｅｎｍａｒｋ）および１．４％（ｗ／ｖ）のＮｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５ ホエイ成分（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）からなり、５．３％（ｗ／ｗ）に相当する５．５ ％（ｗ／ｖ）のラクトース濃度になった（１％（ｗ／ｖ）ラクトース＝０．９５８７％（ｗ／ｗ）溶液中ラクトース）。Ｎｕｔｒｉｌａｃ ＹＱ−５０７５を完全に水和させるために、この混合物を４℃で２０時間弱く撹拌したままにした。初期実験において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒuｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびストレプトコッカス・セルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） （ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）からなる（を含む）、凍結乾燥させたＹＯ−ＭＩＸ ４８５ＬＹＯが用いられた。培地の初期希釈は１０ｇのＹＯ−ＭＩＸ ４８５ＬＹＯを４００ｍｌのＵＨＴ従来（非有機）ミルク（Ｌｅｔ−ｍaｌｋ １．５％脂肪、Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ Ａｍｂａ， Ｄｅｎｍａｒｋ）に添加して行った。１．４３ｍｌの希釈された培地をミルクベース１リットルに添加した。１００ｍｌのミルクベースを２５０ｍｌのブルーキャップボトルに入れて、酵素を各種濃度（１０、２０、および４０ｐｐｍ、方法４における０．２１３、０．４２６、および０．８５３ＬＡＵに相当する）で添加した。ヨーグルト発酵は４３℃で行い、１０時間後に氷上で急速に冷却することにより停止させた。発酵は常に２回行い、ヨーグルト糖／オリゴサッカライド組成物を発酵の翌日にＨＰＬＣで解析した（以下のＨＰＬＣ法参照）。発酵したヨーグルトサンプルは常に４℃で保存した。初期ヨーグルト実験の結果を表３に示した。ＢＩＦ９１７またはＢＩＦ９９５のいずれか一方の濃度を１０ｐｐｍから４０ｐｐｍに増やすと最終ヨーグルト中のＧＯＳ濃度が増加して、ＤＰ２（ラクトースを含む）の量が減少した。この２つの変異体の性能における違いは、ＨＰＬＣ測定の分散の範囲内であり、それはそれらが調査した投薬量内で同様に機能していると結論付けることができる。
表３
ＢＩＦ９１７およびＢＩＤ９９５の投与量を増やして処理した発酵させたヨーグルトにおけるＤＰ２サッカライド（主にラクトース）とＧＯＳ（ＤＰ３＋）の含量。すべての結果は３つの独立した実験の平均値として計算された。

【0253】

最終ヨーグルト中で達成されたＧＯＳ濃度における影響を評価するために、セットスタイルヨーグルトは７．５％ｗ／ｖのより高いラクトース濃度に設定された（１％ｗ／ｖラクトース＝０．９４２３％ｗ／ｗ溶液中なので７．１％ｗ／ｗに相当する）。 以下の手順が用いられた：
１．（表４に記載の）全粉末成分を混合し、この乾燥ブレンドを４−５℃でよく撹拌しながらミルク／水に添加し、４℃で２０時間放置して水和させた。
２．ミルクベースを６５℃で予備加熱した（Ｐ１）
３．ミルクベースを６５℃／２００ｂａｒでホモジナイズした。
４．ミルクベースを９５℃で６分間殺菌した。（Ｐ３）
５．ミルクベースを５℃で冷却した。（Ｋ２）
表４．％（ｗ／ｗ）で示すＳＥＴヨーグルト成分

【0254】

次いで、ミルクベースを４３℃（Ｋ１）に加熱する。クトバチルス・デルブルッキー亜種・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒuｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびストレプトコッカス・セルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ） からなる培地ＹＯ−ＭＩＸ ４９５の希釈は発酵温度で行われた。２５０ｍｌのミルクベースを５００ｍｌのブルーキャップボトル中に入れて、酵素を最終ヨーグルト濃度１％（ｖ／ｖ）で添加した。開始培地であるＹＯ−Ｍｉｘ ４９５を１００リットル当たり２０ＤＣＵ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｔｓ）の濃度で添加した。１ＤＣＵはコロニー形成単位として測定される１０００億個の細胞である。それぞれの試験について３つのサンプルを作成した。発酵はｐＨ４．６で４３℃で行い、次いで、５℃に急冷して停止した。ヨーグルト糖／オリゴサッカライド組成物は発酵の翌日にＨＰＬＣにより解析された（以下のＨＰＬＣ法参照）。発酵ヨーグルトサンプルは常に４℃で保管した。

【0255】

このヨーグルト実験の結果を表５に示す。表３に示すように、５．５％（ｗ／ｖ）初期ラクトースで達成されたＧＯＣと比較して、より高い初期ラクトース（７．５％ ｗ／ｖ）ではヨーグルト中において生成された総ＧＯＳが高くなっていた。ＢＩＦ９１７を５０ｐｐｍ用いて、２．９４５％の最終ＧＯＳ濃度が達成された一方で、２５ｐｐｍのＢＩＦ９１７を用いて生成されたＧＯＳは２．６６２％であった。比較として、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） （ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２，合同酒精株式会社 日本）由来の従来の加水分解性β−ガラクトシダーゼは２５ｐｐｍの投与量で０．３３５％のＧＯＳを生産した。２．１２７％のラクトース濃度における減少は酵素の代わりに同じ量の水を添加したブランクヨーグルトにおいて観察された。
表５． ＢＩＦ９１７の投与量を増加させて、およびクルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）β−ｇａｌで、処理した発酵ヨーグルトにおけるＤＰ２サッカライド（主にラクトース）およびＧＯＳ（ＤＰ３＋）の含量

【0256】

ＢＩＦ９１７におけるヨーグルト発酵における酸性度の影響を試験するために、クトバチルス・デルブルッキー亜種・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒuｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびストレプトコッカス・セルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）のからなる３つの異なるＹＯ−ｍｉｘ培地で行った。相対的に遅い発酵時間を有するＹＯ−ＭＩＸ ４９５ ；相対的に速い発酵時間を有するＹＯ−ＭＩＸ ４９５ ；比較的長い誘導期と強力な酸性発酵物であるＹＯ−ＭＩＸ ６０１。全ての発酵は同じ量のＢＩＦ９１７（２５ｐｐｍ）を用いて４３℃で行った。ＢＩＦ９１７における温度の影響を試験するほかに、ＹＯ−ＭＩＸ ４９５と ２５ｐｐｍ ＢＩＦ９１７との発酵を４３℃、４５℃、および４７℃で行った。初期ラクトース濃度が７．５％（Ｗ／ｖ）であるセットスタイルヨーグルトを生成するために以下の手順を用いた： （１％ｗ／ｖ ラクトース＝０．９４２３％ｗ／ｗ溶液中なので７．１％ｗ／ｗに相当する）。
１．（表６に記載の）全粉末成分を混合し、この乾燥ブレンドを４−５℃でよく撹拌しながらミルク／水に添加し、４℃で２０時間放置して水和させた。
２．ミルクベースを６５℃で予備加熱した（Ｐ１）
３．ミルクベースを６５℃／２００ｂａｒでホモジナイズした。
４．ミルクベースを９５℃６分間殺菌した。（Ｐ３）
５．ミルクベースを５℃で冷却した。（Ｋ２）
６．ミルクベースを４３℃に加熱する（Ｋ１）。培地ＹＯ−ＭＩＸ４９５、４８５、および６０１６０１（ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）の希釈は発酵温度で行う。
７．１００ｍｌのミルクベースを２５０ｍｌのブルーキャップボトル中に入れて、酵素を最終ヨーグルトミックスの１％（ｖ／ｖ）変動濃縮成分に添加した。
８．開始培地であるＹＯ−ＭＩＸ４９５、４８５、または６０１のいずれかに１００リットル当たり２０ＤＣＵ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｔｓ）の濃度で添加する。各トライアルについて、３つのサンプルを調製した。
９．発酵はｐＨ４．６で４３℃で行った（温度の試験については、４３℃、４５℃、および４７℃で行った）次いで、５℃に急速冷却することで停止させた。
１０．ヨーグルト糖／オリゴサッカライド組成は発酵の翌日にＨＰＬＣにより解析した（以下のＨＰＬＣ法参照）。発酵ヨーグルトサンプルは常に４℃で貯蔵した。
表６．％（ｗ／ｗ）で示すＳＥＴヨーグルト成分

【0257】

ヨーグルト実験に結果を表７に示す。異なる酸性プロファイルを有す異なるＹＯ−ＭＩＸ培地は最終的なＧＯＳ酸性には有意に影響のないことがわかる。平均で３．２２％（Ｗ／ｖ）のＧＯＳが生成され、ＹＯ−ｍｉｘ４８５で生成されたヨーグルトに見られた最も高いＧＯＳ濃度（３．３００％）は定量の変動の範囲内である。発酵温度が４３℃から４５℃に、および４７℃になることは、いずれかのヨーグルトで生成されたＧＯＳの量に有意な変化を生じさせなかった（９５％信頼度のスチューデントＴテスト）：４３℃で３．２５８％ｗ／ｖ、４５℃で３．３７５％ ｗ／ｖおよび４７℃で３．２３６％。各種培地および温度を用いたヨーグルトのＧＯＳのその場での生成について、評価された条件下でのＢＩＦ９１７の作用が強力であることが結論づけられる。
表７

ＨＰＬＣ法
用いる全ての試薬は分析グレードのものである。Ｄ−（＋）−ラクトース（ｍｉｎ ９９％， ｎｏ．１７８１４）、Ｄ−（＋）−グルコース（ｍｉｎ ９９．５％、ｎｏ Ｇ８２７０−１００Ｇ， ｂａｔｃｈ＃ ０３６Ｋ０１３７）、およびＤ−（＋）−ガラクトース（ｍｉｎ ９９％， ｎｏ Ｇ０７５０−２５Ｇ， ｂａｔｃｈ＃ ０３１Ｍ００４３Ｖ）はＳｉｇｍａより入手した（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ， ＵＳＡ）。Ｖｉｖｉｎａｌ ＧＯＳ シロップ（Ｐｒｏｄ． Ｎｏ ５０２６７５ Ｂａｔｃｈ＃６４９５６６）は、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｃａｍｐｉｎａ Ｄｏｍｏ（Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手し、乾燥重量ベース（ＤＭ）で、５７％のガラクト−オリゴサッカランド、２１％無水ラクトース、２０％無水グルコース、および０．８％の無水ガラクトースを含む。

【0258】

サンプル調製
全スタンダード：ラクトース、グルコース、ガラクトースおよびＧＯＳをダブル蒸留水（ｄｄＨ２０）で調製して、０．４５μｍのシリンジフィルターを通してろ過をした。各スタンダードのセットを、１０乃至２０００００ｐｐｍの濃度の範囲で調製した。

【0259】

ヨーグルト／ミルクマトリックスにおける糖類のセットの定量評価のために、上記スタンダードを内部コントロールとして、ミルクおよびヨーグルトサンプルに添加した。活性ガラクトースを含む全ミルクおよびヨーグルトサンプルを９５℃で１０分間加熱してサンプルを不活性化した。全ミルクサンプルを９６ウェルのＭＴＰプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）中で調製して、最少で２０倍に希釈して、解析の前に０．２０μｍの９６ウェルフィルターを通してろ過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ， ＰＶＤＦ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ， ＮＹ， ＵＳＡ）。５００００ｐｐｍ（５％ ｗ／ｖ）より多くのラクトースを含むサンプルを３０℃で加熱して、適した可溶性を得た。すべてのヨーグルトサンプルの重量を測定し、Ｕｌｔｒａ ｔｕｒｒａｘ ＴＰ１８／１０（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ Ｉｋａ−ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ， Ｂｉｅ ＆ Ｂｅｒｎｔｓｅｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて数分間サンプルをホモジナイズする前に、ｄｄＨ_２Ｏ中で１０倍に希釈した。β−ガラクトシダーゼを加熱により不活性化し、サンプルを更に９６ウェルＭＴＰプレート中で希釈して、解析の前に０．２０μｍの９６ウェルプレートを通してろ過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ， ＰＶＤＦ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ， ＮＹ， ＵＳＡ）。すべてのサンプルをテープで密封した９６ウェルＭＴＰプレート中で解析した。

【0260】

器具
ガラクトオリゴサッカライド（ＧＯＳ）、ラクトース、グルコース、およびガラクトースの定量はＨＰＬＣで行った。サンプルの解析はＤＧＰ−３６００ＳＤ デュアルグラジエント解析バンプ、ＷＰＳ−３０００ＴＳＬ サーモスタット付オートサンプラー、ＴＣＣ−３０００ＳＤサーモスタット付カラムオーブン、およびＲＩ−１０１ 反射指数検出器（Ｓｈｏｄｅｘ， ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎデータシステムソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．８０， ＤＵ１０Ａ Ｂｕｉｌｄ ２８２６， １７１９４８）を用いてデータの入手および解析を行った。

【0261】

クロマトグラフ条件
サンプルを、７０℃で解析ガードカラム（Ｃａｒｂｏ−Ａｇ^＋ ｎｅｕｔｒａｌ， ＡＪ０−４４９１， Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） を備えた、ＲＳＯオリゴサッカランドカラム、Ａｇ^＋ ４％架橋（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いるＨＰＬＣ法で解析した。このカラムは、０．３ｍｌ／分の流速で二重蒸留水で溶出させる（０．４５μＭの再生されたセルロース膜でろ過して、ヘリウムガスをパージした）。均一な０．３ｍｌ／分の流れを解析の間維持して、総操業時間は３７分でインジェクション容量は１０μＬに設定した。サンプルはサーモスタット付オートサンプラーコンパートメント３０℃に維持してラクトースの溶解を確実にする。溶出は示差屈折率検出器でモニターして、定量化は所与のスタンダードに対するピークエリアにより決定される。この製品の製造宣誓書によれば、Ｖｉｖｉｎａｌ ＧＯＳ シロップ（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｄｏｍｏ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の重合度３以上のピークをＧＯＳの定量のためのスタンダードとして使用する。

【0262】

配列リスト
＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＢＩＦ＿９１７）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＢＩＦ＿９９５）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＢＩＦ＿１０６８）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＢＩＦ＿１１７２）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＢＩＦ＿１２４１）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＢＩＦ＿１３２６）
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８完全長をコードするヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＢＩＦ＿９１７をコードしているヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ＢＩＦ＿１０６８をコードしているヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ ＢＩＦ＿１１７２をコードしているヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ ＢＩＦ＿１２４１をコードしているヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ ＢＩＦ＿１３２６をコードしているヌクレオチド配列
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ ＢＩＦ変異体の生成のためのフォワードプライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ ＢＩＦ９１７のリバースプレライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ ＢＩＦ９９５のリバースプレライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ ＢＩＦ１０６８のリバースプレライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ ＢＩＦ１２４１のリバースプレライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ ＢＩＦ１３２６のリバースプレライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡ
＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ ＢＩＦ１４７８のリバースプレライマー
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２ ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＢＩＦ１７５０
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＞ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来細胞外ラクターゼのシグナル配列
Ｖｒｓｋｋｌｗｉｓｌｌｆａｌａｌｉｆｔｍａｆｇｓｔｓｓａｑａ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]