特許 6641357 ノンカロリー甘味料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6641357

(24)【登録日】2020年1月7日

(45)【発行日】2020年2月5日

(54)【発明の名称】ノンカロリー甘味料

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/56 20060101AFI20200127BHJP

   C07H 15/256 20060101ALI20200127BHJP

   A23L 27/30 20160101ALI20200127BHJP

   A23L 2/60 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20200127BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20200127BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/56ZNA

   C07H15/256 ACSP

   A23L27/30 Z

   A23L2/00 C

   C12N9/10

   !C12N15/62 Z

【請求項の数】18

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2017-511156(P2017-511156)

(86)(22)【出願日】2015年5月5日

(65)【公表番号】特表2017-519812(P2017-519812A)

(43)【公表日】2017年7月20日

(86)【国際出願番号】US2015029163

(87)【国際公開番号】WO2015171555

(87)【国際公開日】20151112

【審査請求日】2018年4月13日

(31)【優先権主張番号】14/269,435

(32)【優先日】2014年5月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516131979

【氏名又は名称】コナゲン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】マオ グオホン

(72)【発明者】

【氏名】チャトゥルヴェデュラ ヴェンカタ サイ プラカシュ

(72)【発明者】

【氏名】ユ オリヴァー

【審査官】 星 功介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０２２９８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１２２２２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１９３９３４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １９／００−１９／６４

Ａ２３Ｌ ２／００− ２／８４

Ｃ０７Ｈ １５／２５６

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学構造から成る合成レバウディオサイド。

【請求項2】

レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジン二リン酸(UDP)-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。

【請求項3】

前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。

【請求項7】

SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。

【請求項8】

前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、請求項６に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。

【請求項9】

甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費できる製品から成る群より選択される経口消費できる製品。

【請求項10】

約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、請求項９に記載の経口消費できる製品。

【請求項11】

甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品。

【請求項12】

前記飲料製品が、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品から成る群より選択される、請求項１１に記載の飲料製品。

【請求項13】

前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクから成る群より選択される、請求項１１に記載の飲料製品。

【請求項14】

製品の甘味を増強する方法であって、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を、飲料製品及び消費できる製品から成る群より選択される製品に添加する工程を含み、この添加されたレバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３を欠いている対応製品に比べて、前記製品の甘味を増強する、前記方法。

【請求項15】

追加の甘味料を添加する工程を更に含む請求項１４に記載の方法であって、前記製品が、約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記方法。

【請求項16】

甘くした製品の調製方法であって、飲料製品及び消費できる製品から成る群より選択される製品を準備する工程、及び約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含む前記方法。

【請求項17】

少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含み、前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Lアラニン、グリシン、ロハングオ、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

少なくとも1種の添加物を前記製品に添加する工程を更に含み、前記少なくとも1種の添加物が、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この開示は、表題が「ノンカロリー甘味料」のPCT出願である。本出願は、参照することによりその内容全体が本明細書に組み込まれる2014年5月5日に出願された米国特許出願第14/269,435号に対する優先権を主張する。

【0002】

配列表の提出を支持する声明
配列表の書面原稿及びサイズが32,670バイト(MICROSOFT WINDOWS(登録商標) EXPLORERで測定した場合)であり、名称が「32559-1 l_ST25.txt」のファイルを含有するコンピューター可読形式の配列表が本明細書に提供され、参照することにより本明細書に組み込まれる。この配列表は、SEQ ID NO:1〜6から成る。

【背景技術】

【0003】

開示の背景
本開示は、一般的に天然甘味料に関する。更に詳細には、本開示は、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー甘味料の合成方法に関する。
ステビオールグリコシドは、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)葉から単離された天然物である。ステビオールグリコシドは、高強度で低カロリーの甘味料として広く使用され、スクロースより著しく甘い。天然に存在するステビオールグリコシドは、同一の基本ステビオール構造を共有するが、C13及びC19位の炭水化物残基(例えば、グルコース、ラムノース及びキシロース残基)が異なる。構造が既知のステビオールグリコシドとしては、ステビオール、ステビオシド、レバウディオサイド(rebaudioside)A、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF及びズルコサイドAが挙げられる(例えば、表1参照)。

【0004】

表1. ステビオールグリコシド

【0005】

乾燥質量ベースに、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドC、及びズルコサイドAは、それぞれ葉中のステビオールグリコシドの総量の9.1、3.8、0.6、及び0.3%を占めるが、他のステビオールグルコシドはずっと少ない量で存在する。ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)植物由来エキス（extract）は商業的に入手可能であり、典型的にステビオシド及びレバウディオサイドAを主化合物として含有する。他のステビオールグリコシドは典型的にステビアエキスに微量成分として存在する。例えば、市販製剤中のレバウディオサイドAの量は、総ステビオールグリコシド含量の約20%から90%超えに変動し得るが、総ステビオールグリコシドのレバウディオサイドBの量は約1〜2%、レバウディオサイドCの量は約7〜15%、レバウディオサイドDの量は約2%であり得る。
ステビオールグリコシドは、分子構造によってのみならず、それらの味覚特性によっても互いに異なる。例えば、異なるステビオールグリコシドは、異なる甘味度及び後味を有する。例えば、ステビオシドはスクロースの100〜150倍甘いが、より苦い後味を有する。例えば、バウジオシドA及びレバウディオサイドEはスクロースの250〜450倍甘く、ステビオシドより後味が少ない。レバウディオサイドCはスクロースの40〜60倍甘い。ズルコサイドAはスクロースの約30倍甘い。

【0006】

ステビオールグリコシドの大部分は、典型的に糖部分の供与体としてウリジン5'-ジホスホグルコース(UDP-グルコース)を用いてUDP-グリコシルトランスフェラーゼ(UGTs)により触媒されるステビオールのいくつかのグリコシル化反応によって形成される。植物中のUGTsは、グルコース残基をUDP-グルコースからステビオールへ移す非常に多様の酵素群を構成する。例えば、ステビオシドのC-13-O-グルコースのC-3'のグリコシル化はレバウディオサイドAをもたらし；ステビオシドの19-O-グルコースのC-2'のグリコシル化はレバウディオサイドEをもたらす。レバウディオサイドA(C-19-O-グルコースで)又はレバウディオサイドE(C-13-O-グルコースで)のさらなるグリコシル化はレバウディオサイドDを生成する。(図1)。
代替甘味料は、高糖質食品及び飲料の消費と関連する多くの疾患への意識のため関心が高まりつつある。人工甘味料は入手可能であるが、ズルシン、サイクラミン酸ナトリウム及びサッカリン等の多くの人工甘味料は、それらの安全性に関する懸念のため国によっては禁止又は制限されている。従って、天然起源のノンカロリー甘味料が人気になりつつある。ステビア甘味料の広範な使用への主な障害の1つは、それらの望ましくない風味特質である。従って、代替甘味料及びそれらの製造方法を開発して、甘味効力と香味プロファイルの最良の組み合わせを提供する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

発明の概要
本開示は、一般的に天然甘味料に関する。更に詳細には、本開示は、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー甘味料の合成方法に関する。本開示は、ノンカロリー甘味料を調製するために使用できる酵素にも関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

ステビオールグリコシド−合成レバウディオサイドD３。一態様では、本開示は、下記化学構造から成る合成レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)に関する。

【0009】

【化1】

【0010】

レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法。別の態様では、本開示は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ(UDP-グリコシルトランスフェラーゼ)とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。

【0011】

ステビオシドからレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を生成する方法。別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ(UDP-グリコシルトランスフェラーゼ)とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースがレバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドE及びレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(「EUS」)。別の態様では、本開示はUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」と称する)に関する。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、1,2-βグリコシド結合及び1,6-βグリコシド結合酵素活性並びにスクロースシンターゼ活性を示す。

【0012】

レバウディオサイドAからレバウディオサイドDを生成する方法。別の態様では、本開示は、レバウディオサイドAからレバウディオサイドDを合成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドAと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの時間反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分なインキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程を含む。

【0013】

別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品に関する。
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品に関する。レバウディオサイドD３は、飲料製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する。一部の実施形態では、例えば100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。
別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品に関する。レバウディオサイドD３は、消費製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する。一部の実施形態では、例えば100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。
別の態様では、本開示は、下記化学構造から成る甘味料に関する。

【0014】

【化2】

【0015】

先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、かつ製品は約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、経口消費できる製品は更に追加の甘味料を含み、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシド(siamenoside)I、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン(hernandulcin)、フィロズルチン(phyllodulcin)、トリロブタイン(trilobtain)、及びその組み合わせから成る群より選択される1種以上の甘味料を含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、飲料製品及び消費製品は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される1種以上の添加物を更に含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３多形又は非晶質レバウディオサイドD３である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３立体異性体である。

【0016】

本開示の他の態様は、精製レバウディオサイドD３を製品又は飲料製品及び消費製品を製造するための成分に含めることによって、レバウディオサイドD３が製品中に約5ppm〜約100ppmの濃度で存在する飲料製品及び消費製品を調製する方法に関する。本開示の他の態様は、約5ppm〜約100ppmの精製レバウディオサイドD３を飲料製品及び消費製品に添加し、この添加されたレバウディオサイドD３が、精製レバウディオサイドD３を欠いている対応飲料製品及び消費製品に比べて飲料製品及び消費製品の甘味を増強することによって、飲料製品及び消費製品の甘味を増強する方法に関する。
先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、本方法は、追加の甘味料を添加する工程を更に含み、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。
本開示の他の態様は、a)1種以上の甘味料を含有する飲料製品又は消費製品を準備する工程、及びb)約5ppm〜約100ppmの精製レバウディオサイドD３を飲料製品又は消費製品に添加する工程によって、甘くした飲料製品又は甘くした消費製品を調製する方法に関する。

【0017】

先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、本方法は、飲料製品又は消費製品に1種以上の添加物を添加する工程を更に含む。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、経口消費できる製品は、1種以上の添加物を更に含有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、1種以上の添加物は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから選択される。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のあらゆる甘味成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択される。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせが可能な特定実施形態では、製品中のレバウディオサイドD３はレバウディオサイドD３多形又は非晶質レバウディオサイドD３である。
本開示の下記詳細な説明を考慮すると、本開示がよりよく理解され、上述したもの以外の特徴、態様及び利点が明らかになるであろう。該詳細な説明は以下の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。

【図1B】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。

【図1C】ステビオシドからのステビオールグリコシド生合成経路を示す模式図である。

【図2A】実施例1で論じるように、精製組換えUDP-グリコシルトランスフェラーゼ酵素(EUGT11)のSDS-PAGE解析を示す。

【図2B】実施例1で論じるように、精製組換えUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)のSDS-PAGE解析を示す。

【図3】実施例2で論じるように、ステビオシド(「Ste」)、レバウディオサイドA(「Reb A」)及びレバウディオサイドD(「Reb D」)標準物質(図3A)；14時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3B)；14時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3C)；14時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3D)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3E)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3F)；及び24時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図3G)のHPLC保持時間を示すグラフである。

【図4】実施例3で論じるように、ステビオシド(「Ste」)、レバウディオサイドA(「Reb A」)及びレバウディオサイドD(「Reb D」)標準物質(図4A)；14時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図4B)；14時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドE(「Reb E」)(図4C)；14時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図4D)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図4E)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドE(「Reb E」)(図4F)；及び24時間でUGT-SUS(EUGT11-AtSUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図4G)のHPLC保持時間を示すグラフである。

【図5】実施例4で論じるように、レバウディオサイドD(「Reb-D」)標準物質(図5A)；レバウディオサイドE(「Reb-E」)標準物質(図5B)；12時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(「Reb D３」)(図5C)；12時間でのUGT-SUS(EUGT11-SUSl)カップリング系(図5D)及び12時間でのEUS(図5E)；12時間でUGT76G1-AtSUSlカップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(「Reb D」)(図5F)；24時間でEUGT11により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5G)；24時間でUGT-SUS(EUGT11-SUSl)カップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5H)；24時間でEUSにより酵素的に生成されたレバウディオサイドD３(図5I)；及び24時間でUGT76G1-AtSUSlカップリング系により酵素的に生成されたレバウディオサイドD(図5J)のHPLC保持時間を示すグラフである。

【図6A】実施例5で論じるように、レバウディオサイドD３の化学構造を示す。

【図6B】実施例5で論じるように、レバウディオサイドEの化学構造を示す。

【図7】実施例5で論じるように、主要なTOCSYとHMBCの相関を示すレバウディオサイドD３の化学構造である。

【図8A】実施例5で論じるように、レバウディオサイドD３の化学構造を示す。

【図8B】実施例5で論じるように、レバウディオサイドEの化学構造を示す。

【図8C】実施例5で論じるように、レバウディオサイドDの化学構造を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本開示は、種々の変更及び代替形態を受け入れる余地があるが、図面にはその具体的実施形態を例として示した。それらについて以下に詳細に述べる。しかしながら、添付の特許請求の範囲により規定される本開示の精神及び範囲内に入る全ての変更形態、等価物及び代替物を包含するため、具体的実施形態の説明は本開示を限定する意図でないことを理解すべきである。

【0020】

詳細な説明
特に指定のない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に解釈するのと同じ意味を有する。本開示の実施又は試験では、本明細書で開示するものと類似又は同等のいずれの方法及び材料をも使用できるが、好ましい材料及び方法について以下に述べる。
用語「相補的」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を限定せずに描写するために用いられる。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。従って、対象技術は、添付の配列表に報告した全配列と相補的な単離核酸断片並びに実質的に同様の核酸配列をも包含する。
用語「核酸」及び「ヌクレオチド」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びその一本鎖若しくは二本鎖形のポリマーを限定せずに表すために用いられる。特に限定しない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに似た様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知類似体を含有する核酸を包含する。特に指定のない限り、特定の核酸配列は、暗にその保存的修飾又は縮重バリアント(例えば縮重コドン置換)及び相補配列、並びに明確に指示した配列をも包含する。
用語「単離された」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、単離核酸又は単離ポリペプチドの文脈で用られるときは、その天然環境から引き離す人の手が存在するので、天然物でない核酸又はポリペプチドを限定せずに表すために用いられる。単離核酸又はポリペプチドは、精製形で存在することができ、或いは非天然環境内で、例えば、トランスジェニック宿主細胞内で存在することができる。

【0021】

本明細書で使用する用語「インキュベートする」及び「インキュベーション」は、2種以上の化学的又は生物学的実体(例えば化合物及び酵素)を混合し、それらをステビオールグリコシド組成物の生成に好ましい条件下で相互作用させるプロセスを指す。
用語「縮重バリアント」は、1つ以上の縮重コドン置換によって基準核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、1つ以上の選択(又は全ての)コドンの第3位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される生成配列によって達成可能である。核酸配列及びその全ての縮重バリアントは同一のアミノ酸又はポリペプチドを発現する。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ；これらの3つの用語は互換的に使用されることもあり、アミノ酸、又はアミノ酸類似体のポリマーをそのサイズ又は機能にかかわらず限定せずに表すために用いられる。「タンパク質」は相対的に大きいポリペプチドに関して用いられることが多いが、「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して用いられることが多く、当技術分野でのこれらの用語の用法は重複し、多様である。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、特に指定のない限り、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、ポリヌクレオチド産物を指すときは互換的に使用される。従って、典型的なポリペプチドには、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、及び前述のものの類似体が含まれる。
基準ポリペプチドに関して用いられるときの用語「ポリペプチド断片」及び「断片」は、当業者にとってそれらの通常又は慣例の意味に準じて用いられ、基準ポリペプチド自体に比べてアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が通常は基準ポリペプチドの対応位置で同一であるポリペプチドを限定せずに表すために用いられる。該欠失は、基準ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端、或いは両方で起こり得る。
ポリペプチド又はタンパク質の用語「機能性断片」は、全長ポリペプチド又はタンパク質の一部分であり、かつ全長ポリペプチド又はタンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するか、又は全長ポリペプチド又はタンパク質と実質的に同一の機能を遂行する(例えば同一の酵素反応を遂行する)ペプチド断片を指す。

【0022】

互換的に用いられる用語「バリアントポリペプチド」、「修飾アミノ酸配列」又は「修飾ポリペプチド」は、1つ以上のアミノ酸、例えば1つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加によって基準ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を意味する。ある態様では、バリアントは、基準ポリペプチドの能力の一部又は全てを保持する「機能性バリアント」である。
用語「機能性バリアント」には、保存的に置換されたバリアントが更に含まれる。用語「保存的に置換されたバリアント」は、1つ以上の保存的アミノ酸置換によって基準ペプチドと異なり、かつ基準ペプチドの活性の一部又は全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に同様の残基とのアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の非極性(疎水性)残基の一つと別の残基との置換；荷電又は極性(親水性)残基の一つと別の残基との置換、例えばアルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、スレオニンとセリンの置換；リジン又はアルギニン等の塩基性残基の一つと別の残基との置換；或いはアスパラギン酸又はグルタミン酸等の酸性残基の一つと別の残基との置換；或いはフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン等の芳香族残基の一つと別の残基との置換が挙げられる。該置換は、タンパク質又はポリペプチドの見掛けの分子量又は等電点にほとんど又は全く影響を及ぼさないと予想される。フレーズ「保存的に置換されたバリアント」には、結果として生じるペプチドが、ここに記載の基準ペプチドの活性の一部又は全てを維持することを条件に、残基が化学的誘導体化残基と置き換わっているペプチドも含まれる。
対象技術のポリペプチドに関連する用語「バリアント」には、基準ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえ同一のアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドが更に含まれる。

【0023】

全てのその文法形式及び異なるスペルの用語「相同的」は、「共通の進化起源」を有するポリヌクレオチド又はポリペプチド間の関係を表し、スーパーファミリー由来のポリヌクレオチド又はポリペプチド及び異なる種由来の相同ポリヌクレオチド又はタンパク質が含まれる(Reeck et al, Cell 50:667, 1987)。該ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、同一性パーセントの観点であろうと保存位置に特異的アミノ酸若しくはモチーフが存在することであろうと、それらの配列類似性に反映されるように、配列相同性を有する。例えば、2つの相同ポリペプチドは、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえ同一であるアミノ酸配列を有し得る。
対象技術のバリアントポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、必要ならば、配列アラインメントを行ない、ギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、かつ配列同一性の一部としていずれの保存的置換をも考慮せずに、候補配列における基準ポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:6等)のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率を意味する。

【0024】

アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野のスキルの範囲内である種々の方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれのアルゴリズムをも含め、アラインメントの測定に適したパラメーターを決定することができる。例えば、アミノ酸配列同一性%は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2を用いて決定可能である。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、ncbi.nlm.nih.govからダウンロードすることができる。NCBI BLAST2は、いくつかの検索パラメーターを使用し、それらの検索パラメーターの全てをデフォルト値に設定する。例えば、アンマスクはイエス、ストランド＝全て、期待発生頻度10、最小低複雑度長さ＝15/5、マルチパスe値＝0.01、マルチパスの定数＝25、最後の間隙をつくるアラインメントのためのドロップオフ(dropoff)＝25及びスコア化行列(scoring matrix)＝BLOSUM62等である。NCBI-BLAST2をアミノ酸配列比較に利用する状況では、所与のアミノ酸配列Bに対する所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性%(代わりに、所与のアミノ酸配列Bに対して、ある一定のアミノ酸配列同一性%を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Aと表現することができる)を以下のように計算する：分数X/Yを100倍する。ここで、Xは、配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によってプログラムのA及びBのアラインメントにおいて完全な一致とスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。当然のことながら、アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合は、Bに対するAのアミノ酸配列同一性%はAに対するBのアミノ酸配列同一性%と等しくないであろう。

【0025】

この意味で、アミノ酸配列「類似性」を決定する手法は当技術分野で周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか或いは同様の化学的及び／又は物理的特性、例えば電荷又は疎水性等を有する、適切な場所にある2つ以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸の正確な類似を意味する。そして比較したポリペプチド配列間で、いわゆる「同一性パーセント」を決定することができる。核酸及びアミノ酸配列同一性を決定するための手法も当技術分野で周知であり、例えば当該遺伝子についてmRNAのヌクレオチド配列を決定する手法(通常はcDNA中間体によって)及びそこにコードされているアミノ酸配列を決定し、これを第2のアミノ酸配列と比較する手法がある。一般に、「同一性」は、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドとヌクレオチド又はアミノ酸とアミノ酸の正確な一致を意味する。2つ以上のポリヌクレオチド配列は、2つ以上のアミノ酸配列と同様に、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することができる。Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8(Genetics Computer Group, Madison, Wis.から入手可能)で利用できるプログラム、例えば、GAPプログラムは、2つのポリヌクレオチド間の同一性と、2つのポリペプチド配列間の同一性及び類似性を両方ともそれぞれ計算することができる。配列間の同一性又は類似性を計算するための他のプログラムは当業者に知られている。
基準位置に「対応する」アミノ酸位置は、アミノ酸配列をアラインメントすることによって同定する場合に、基準配列でアラインメントする位置を表す。該アラインメントは、手で又は周知の配列アラインメントプログラム、例えばClustalW2、Blast 2等を用いて行なうことができる。
特に指定のない限り、2つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の同一性パーセントは、それらの2つの配列のより短い全長にわたる同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率を表す。

【0026】

「コード配列」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、特異的アミノ酸配列をコードするDNA配列を限定せずに表すために用いられる。
「適切な制御配列」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、コード配列の上流(5'非コード配列)にあるか、コード配列内にあるか、又はコード配列の下流(3'非コード配列)にあり、かつ転写、RNAプロセシング若しくは安定性、又は関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を限定せずに表すために用いられる。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列が挙げられる。
「プロモーター」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、コード配列又は機能性RNAの発現を調節できるDNA配列を限定せずに表すために用いられる。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して3'位にある。プロモーターは、それらの完全さで天然遺伝子から誘導されるか、又は自然に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素で構成されるか、又は合成DNAセグメントを含むことさえある。当業者には当然のことながら、異なるプロモーターは、異なる細胞型の遺伝子の発現、又は発生の異なる段階での発現、又は異なる環境条件に応じた発現を指揮することができる。遺伝子をほとんどの細胞型においてほとんどの時に発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。更に、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には定義されておらず、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有することがある。

【0027】

用語「作動可能に連結される」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように単一核酸断片に核酸配列を関連づけることを表す。例えば、プロモーターは、それが当該コード配列の発現に影響を与えることができる(すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある)とき、作動可能にコード配列と連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス配向性で作動可能に制御配列に連結されている。
本明細書で使用する用語「発現」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、対象技術の核酸断片から誘導されたセンス(mRNA)又はアンチセンスRNAの転写及び安定蓄積を限定せずに表すために用いられる。「過剰発現」は、正常又は非形質転換生物における産生レベルを超える、トランスジェニック又は組換え生物における遺伝子産物の産生を意味する。
「形質転換」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、ポリヌクレオチドの標的細胞への転移を限定せずに表すために用いられる。転移したポリヌクレオチドを標的細胞のゲノム又は染色体DNAに組み入れることができ、結果として遺伝子学的に安定した遺伝となるか、或いは宿主染色体と無関係にそれが複製することができる。形質転換した核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」生物と呼ばれる。
本明細書で宿主細胞に関連して使用する用語「形質転換」、「トランスジェニック」、及び「組換え」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、異種核酸分子が中に導入された宿主生物の細胞、例えば植物又は微生物の細胞を限定せずに表すために用いられる。核酸分子を安定的に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、或いは核酸分子は、染色体外分子として存在することができる。該染色体外分子は、自己複製していることがある。形質転換細胞、組織、又は対象は形質転換プロセスの最終産物のみならず、そのトランスジェニック子孫をも包含するものと解釈される。

【0028】

ポリヌクレオチドと関連して本明細書で使用する用語「組換え」、「異種」、及び「外因的」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、特定の宿主細胞に外来性の起源をもつか、又は同起源の場合、その本来の形態から修飾されているポリヌクレオチド(例えば、DNA配列又は遺伝子)を限定せずに表すために用いられる。従って、宿主細胞内の異種遺伝子としては、特定の宿主細胞に外因的であるが、例えば、部位特異的変異誘発又は他の組換え技術の使用によって修飾されている遺伝子がある。これらの用語には、天然に存在するDNA配列の天然に存在しない複数コピーも含まれる。従って、これらの用語は、細胞に外来性又は異種であるDNAセグメント、或いは細胞に相同性であるが、該要素が通常は見られない位置にあるか又は該要素が通常は見られない宿主細胞内に生じるDNAセグメントを意味する。
同様に、本明細書でポリペプチド又はアミノ酸配列と関連して使用する用語「組換え」、「異種」、及び「外因的」は、特定の宿主細胞に外来性の起源をもつか、又は同起源の場合、その本来の形態から修飾されているポリペプチド又はアミノ酸配列を意味する。従って、組換えDNAセグメントを宿主細胞内で発現させて組換えてポリペプチドを生成することができる。
用語「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」は、当業者が理解するその通常及び慣例の意味に準じて用いられ、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖DNA分子の形態の染色体外要素を限定せずに表すために用いられる。該要素は、選択遺伝子産物のためにプロモーター断片及びDNA配列を適切な3'非翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成にいくつかのヌクレオチド配列が連結又は組み込まれた、いずれの起源由来の自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線形若しくは環状の一本鎖若しくは二本鎖DNA又はRNAでもあり得る。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、この外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを表す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、この外来遺伝子に加えて外来宿主内で当該遺伝子の発現を増強できる要素を有する特異的ベクターを表す。

【0029】

本明細書で使用する標準的な組換えDNA及び分子クローニング手法は技術上周知であり、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F.及びManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N. Y., 1989(以降「Maniatis」)；並びにSilhavy, T. J., Bennan, M. L.及びEnquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984；並びにAusubel, F. M. et al, In Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing and Wiley-Interscience出版, 1987)によって記載されており、これらはそれぞれその内容全体を参照することにより本開示と一致する限度において本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「合成の」又は「有機合成した」又は「化学合成した」又は「有機合成すること」又は「化学合成すること」又は「有機合成」又は「化学合成」は、一連の化学反応を通じて化合物を調製することを表すために用いられ；これには化合物を例えば、天然源から抽出することは含まれない。
本明細書で使用する用語「経口消費できる製品」は、人又は動物の口と接触するいずれの飲料、食品、健康補助食品、栄養補助食品、医薬組成物、歯科衛生組成物及び化粧品をも表し、口の中に取り入れた後に口から排出される物質及び飲み、食べ、咀嚼し、又は他のやり方で摂取され、かつ一般的に許容できる濃度範囲で使用したときにヒト又は動物に安全な物質が含まれる。

【0030】

本明細書で使用する用語「食品」は、果物、野菜、ジュース、肉製品、例えばハム、ベーコン及びソーセージ；卵製品、果実ジュース、果実濃縮物、ゼラチン及びゼラチン様製品、例えばジャム、ゼリー、保存食等；乳製品、例えばアイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、及びシャーベット；糖蜜を含むアイシング、シロップ；トウモロコシ、小麦粉、ライムギ、大豆、オート麦、米及び大麦製品、シリアル製品、ナッツミート及びナッツ製品、ケーキ、クッキー、菓子類、例えばキャンディー、ガム、フルーツ味のドロップ、及びチョコレート、チューインガム、ミント、クリーム、アイシング、アイスクリーム、パイ及びパンを表す。「食品」は、香辛料、例えばハーブ、スパイス及び調味料、風味向上剤、例えばグルタミン酸一ナトリウム等をも表す。「食品」には更に、調製済みの包装された製品、例えばダイエット甘味料、液体甘味料、卓上香味料、水で再構成すると非炭酸ドリンクを与える顆粒香料ミックス、インスタントプディングミックス、インスタントコーヒー及びティー、コーヒー用クリーム、麦芽乳ミックス、ペットフード、家畜の餌、タバコ、及びベーキング用途の材料、例えばパン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツ等の調製用の粉末ベーキングミックスも含まれる。「食品」は、スクロースを少ししか又は全く含まないダイエット又は低カロリー食品及び飲料をも表す。

【0031】

本明細書で使用する場合、用語「立体異性体」は、個々の分子の空間におけるそれらの原子の配向のみが異なる全ての異性体の総称である。「立体異性体」には、エナンチオマー並びに互いに鏡像でない、1つより多くのキラル中心を有する化合物の異性体(ジアステレオマー)が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「非晶質レバウディオサイドD３」は、非結晶性固形のレバウディオサイドD３を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「甘味強度」は、個体、例えば、ヒトによって観察又は経験される甘い感覚の相対的強度、或いはテイスター、例えばBrixスケールで検出される甘味の程度又は量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「甘味を増強する」は、本開示の飲料製品又は消費製品の1つ以上の甘味特性の知覚を、レバウディオサイドD３を含有しない対応する経口消費できる製品に比べて、その性質又は品質を変えずに増加、増大、強化、強調、拡大、及び／又は増強する際のレバウディオサイドD３の効果を指す。
本明細書で使用する場合、用語「オフテースト(off-taste)」は、本開示の飲料製品又は消費製品で特徴的又は普通に見られない味の量又は程度を意味する。例えば、オフテーストは、甘くした消費製品の消費者にとって望ましくない味、例えば、苦味、甘草様味、金属味、嫌悪味、渋味、甘味発生遅延、なかなか消えない甘い後味等である。
本明細書で使用する場合、用語「w/v-%」は、糖等の化合物の、該化合物を含有する本開示の液体の経口消費できる製品100ml毎の質量(グラムで)を表す。本明細書で使用する場合、用語「w/w-%」は、糖等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1グラム毎の質量(グラムで)を表す。
本明細書で使用する場合、用語「ppm」は、質量百万分率、例えば、レバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1キログラム当たりの質量(ミリグラムで)(すなわち、mg/kg)又はレバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1リットル当たりの質量(ミリグラムで)(すなわち、mg/L)を表し；或いは体積百万分率、例えば、レバウディオサイドD３等の化合物の、該化合物を含有する本開示の経口消費できる製品1リットル当たりの体積(ミリリットルで)(すなわち、ml/L)を表す。
本開示により、ノンカロリー甘味料及びノンカロリー甘味料の合成方法を開示する。また、本開示によりノンカロリー甘味料を調製するための酵素及び該酵素の使用方法を開示する。

【0032】

合成ノンカロリー甘味料：合成レバウディオサイドD３
一態様では、本開示は合成ノンカロリー甘味料に関する。合成ノンカロリー甘味料は、合成レバウディオサイド型ステビオールグリコシドであり、名称「レバウディオサイドD３」が与えられている。下記化学構造(I)に示すように、レバウディオサイドD３(「Reb D３」)は、ステビオールグリコシド、レバウディオサイドDの5つのグリコシド残基と同様の5つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシドである。

【0033】

【化3】

【0034】

レバウディオサイドD３は、分子式C₅₀H₈₀O₂₈及びIUPAC名、13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-6-D-グルコピラノシル)オキシ]ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステルを有する。
レバウディオサイドD３、レバウディオサイドE及びレバウディオサイドDの化学構造に示すように、レバウディオサイドD３及びレバウディオサイドDは、該構造中のアグリコンステビオールに結合した5つのβ-D-グリコシル単位を有するが、レバウディオサイドEは4つのD-グリコシド残基を含有する(例えば、表1及び図8参照)。合成レバウディオサイドD３は、ステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含む。
比較すると、レバウディオサイドDも5つのグリコシド残基を含み；アグリコンステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含む。レバウディオサイドD３の第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,6-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-6'に位置するが、レバウディオサイドDの第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,3-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に位置している(図8参照)。しかしながら、レバウディオサイドEは、C19位に2つのグリコシド残基及びC13位に2つのグリコシド残基を含む。理論によって拘束されるものではないが、5つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシド(レバウディオサイドD)及び4つのグリコシド残基を有するステビオールグリコシド(レバウディオサイドA及びレバウディオサイドE)は、グリコシド残基が少ないステビオールグリコシド(ステビオシド及びルブソサイド)より顕著に良い味質を有すると考えられる。

【0035】

レバウディオサイドD３の製造方法
別の態様では、本開示は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。一実施形態では、本方法は、レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジン-ジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)から選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なウリジンジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、EUGT11(WO 2013022989に記載どおり)であり得る。EUGT11は、1,2-19-O-グルコース及び1,2-13-O-グルコースグリコシル化活性を有するウリジン5'-二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ(「UGT」)である。EUGT11は、ステビオシドからレバウディオサイドEの生産及びレバウディオサイドAからレバウディオサイドDの生産を触媒することが知られている。しかしながら、驚くべきことにかつ予想外に、ウリジンジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼをインビトロで用いてレバウディオサイドEをレバウディオサイドD３に変換できることを発見した。
適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼは、例えばイネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11であり得る。特に適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する。

【0036】

本方法は、ウリジンジホスホ(UDP)グリコシルトランスフェラーゼを含有する反応混合物にスクロースシンターゼを添加する工程を更に含むことができる。ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物にスクロースシンターゼを添加すると、「UGT-SUSカップリング系」を生じさせる。UGT-SUSカップリング系においては、UDP-グルコースがUDP及びスクロースから再生可能であり、これにより反応混合物への余分なUDP-グルコースの添加を省くか又は反応混合物内のUDPを使用できるようになる。
適切なスクロースシンターゼドメインは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1；アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼであり得る。特に適切なスクロースシンターゼドメインは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1である。特に適切なアラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1(AtSUSl)であり得る。特に適切なスクロースシンターゼ1は、例えば、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有するスクロースシンターゼ1であり得る。

【0037】

別の実施形態では、UDP-グリコシルトランスフェラーゼは、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」とも称する)であってよい。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素については更に詳細に後述する。
反応において、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、EUGT11及びEUS)は1,6-13-O-グルコースグリコシル化活性を有し、一実施形態では、グルコース分子をレバウディオサイドEに移してレバウディオサイドD３を形成することができる。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、EUGT11及びEUS)も1,2-19-O-グルコース及び1,2-13-O-グルコースグリコシル化活性を有する。別の実施形態では、UDP-グリコシルトランスフェラーゼがグルコース分子をステビオシドに移してレバウディオサイドEを形成することができ、グルコース分子をレバウディオサイドAに移してレバウディオサイドDを形成することもできる。更に、EUS融合酵素はスクロースシンターゼ活性を有するので、UDP及びスクロースからUDP-グルコースを再生することができる。

【0038】

特に適切な実施形態は、UGT-SUSカップリング系を用いてレバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドEと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼと、スクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
この実施形態の方法で用いるのに適したUDPグリコシルトランスフェラーゼは上記と同一である。この実施形態の方法で用いるのに適したスクロースシンターゼは上記と同一である。
別の特に適切な実施形態は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を用いてレバウディオサイドEからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。
この方法は、レバウディオサイドEと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素については更に詳細に後述する。

【0039】

別の態様では、本開示は、ステビオシドからレバウディオサイドD３を合成する方法に関する。ステビオシドからレバウディオサイドD３を合成する方法は、ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
最初に、この実施形態の方法で用いるUDPグリコシルトランスフェラーゼは上記と同一である。上述したように、この方法は、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼを含有する反応混合物にスクロースシンターゼを添加してUGT-SUSカップリング系を生じさせる工程を更に含むことができる。

【0040】

特に適切な実施形態は、UGT-SUSカップリング系を用いてステビオシドからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼと、スクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
この実施形態の方法で用いるのに適したUDPグリコシルトランスフェラーゼは、上記と同じである。この実施形態の方法で用いるのに適したスクロースシンターゼは、上記と同じである。
別の特に適切な実施形態は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を用いてステビオシドからレバウディオサイドD３を生成する方法に関する。この方法は、ステビオシドと、スクロースから成る群より選択される基質と、ウリジン二リン酸(UDP)と、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素とを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが該レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するの十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程を含む。
特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素について以下に更に詳細に述べる。

【0041】

UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素
別の態様では、本開示は、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(本明細書では「EUS」とも称する)に関する。特に、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含む。EUS融合酵素は、1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性を有する。驚くべきことにかつ予想外に、EUS融合酵素は、グルコース分子をレバウディオサイドEに移してレバウディオサイドD３を生成することができる1,6-13-O-グルコースグリコシル化活性をも有する。更に、EUS融合酵素はスクロースシンターゼ活性を有するので、UDP及びスクロースからUDP-グルコースを再生することができる。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえ同一のポリペプチド配列を有し得る。好適には、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:5と少なくとも80%の同一性を有する。更に好適には、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%さえのアミノ酸配列同一性を有する。

【0042】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸に関する。例えば、単離核酸は、SEQ ID NO:6に示す核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえの配列相同性を有する核酸配列を有するUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。好適には、単離核酸は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性であるアミノ酸配列を有するUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。更に好適には、単離核酸は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえの配列同一性を有するアミノ酸配列を有するUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。従って単離核酸は、SEQ ID NO:5の機能性断片、SEQ ID NO:5の機能性バリアント、又は例えば、SEQ ID NO:5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%でさえの配列同一性を有する他の相同ポリペプチドをコードする当該ヌクレオチド配列を含む。当業者には分かるように、UDP-グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、例えば、細菌及び酵母菌等の適切な宿主生物における発現のために最適化されたコドンであり得る。

【0043】

適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインはイネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGTll(GenBank登録番号AC133334)であり得る。特に適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11は、例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11ドメインであり得る。
適切なスクロースシンターゼドメインは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1；アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼであり得る。特に適切なスクロースシンターゼドメインは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1であり得る。特に適切なアラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1(AtSUSl)であり得る。特に適切なスクロースシンターゼ1ドメインは、例えば、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有するスクロースシンターゼ1であり得る。
スクロースシンターゼは、NDP及びスクロースを生成するためのNDP-グルコースとD-フルクトースとの間の化学反応を触媒する。スクロースシンターゼはグリコシルトランスフェラーゼである。この酵素分類の系統名は、NDP-グルコース:D-フルクトース2-α-D-グルコシルトランスフェラーゼである。一般的に使用されている他の名称としては、UDP-グルコース-フルクトースグルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、スクロース-UDPグルコシルトランスフェラーゼ、スクロース-ウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、及びウリジンジホスホグルコース-フルクトースグルコシルトランスフェラーゼがある。

【0044】

レバウディオサイドDの生成方法
別の態様では、本開示はレバウディオサイドDの合成方法に関する。本方法は、レバウディオサイドAと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程を含む。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼがウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼである実施形態では、適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼはイネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ EUGT11(GenBank登録番号AC133334)であり得る。特に適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼは、例えばSEQ ID NO:lのアミノ酸配列を有するウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼであり得る。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼがウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼである実施形態では、本方法は、スクロースシンターゼを反応混合物に添加する工程を更に含むことができる。適切なスクロースシンターゼは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼであり得る。特に適切なスクロースシンターゼは、例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1であり得る。特に適切なアラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1(AtSUSl)であり得る。特に適切なスクロースシンターゼ1は、例えば、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有するスクロースシンターゼ1であり得る。
UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、上述したようにスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)である実施形態では、適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインはイネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ EUGT11(GenBank登録番号AC133334)であり得る。特に適切なウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインは、例えば、SEQ ID NO:lのアミノ酸配列を有するウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインであり得る。特に適切なスクロースシンターゼ1ドメインは、例えば、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有し得る。特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)は、例えば、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有し得る。

【0045】

特に適切な実施形態は、UGT-SUSカップリング系を用いてレバウディオサイドDを合成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドAと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、UDP-グリコシルトランスフェラーゼと、スクロースシンターゼとを含む反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程を含む。
この実施形態の方法で用いるのに適したUDP-グリコシルトランスフェラーゼは上記と同一である。この実施形態の方法で用いるのに適したスクロースシンターゼは上記と同一である。
特に適切な実施形態は、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素を用いてレバウディオサイドDを合成する方法に関する。この方法は、レバウディオサイドAと、スクロースと、ウリジン二リン酸(UDP)と、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)との反応混合物を調製する工程、及びこの反応混合物を、グルコースがレバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程を含む。
特に適切なUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素については更に詳細に上述してある。

【0046】

経口消費できる製品
一態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を有する、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品に関する。
経口消費できる製品は、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有し得る。
経口消費できる製品は、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を有することができる。
レバウジオシドD３は、経口消費できる製品中の唯一の甘味料であってよい。
経口消費できる製品は、少なくとも1種の追加の甘味料を有してもよい。少なくとも1種の追加甘味料は、例えば、天然の高甘味度甘味料であり得る。追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソシド、モグロシド IV、シアメノシドI、モグロシド V、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択可能である。

【0047】

経口消費できる製品は、少なくとも1種の添加物を有してもよい。添加物は、例えば、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、 糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、渋味化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせであってよい。
一態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品に関する。
飲料製品は、例えば、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品であり得る。飲料製品は、例えば、ソフトドリンク、ファウンテン(fountain)飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクであってもよい。
一部の実施形態では、本開示の飲料製品は、1種以上の飲料成分、例えば、酸味料、果実ジュース及び／又は野菜ジュース、果肉等、香味料、着色料、保存料、ビタミン、ミネラル、電解質、エリスリトール、タガトース、グリセリン、及び二酸化炭素を含むことができる。該飲料製品は、例えば飲料濃縮物及びすぐに飲める炭酸飲料等のいずれの適切な形態も提供可能である。

【0048】

特定実施形態では、本開示の飲料製品は、多数の異なる特異的処方又は構成のいずれを有してもよい。本開示の飲料製品の処方は、該製品の意図した市場区分、その所望の栄養上の特性、風味プロファイル等の因子に応じて、ある程度まで変動し得る。例えば、ある特定の実施形態では、特定飲料製品の処方にさらなる成分を添加することは一般的にオプションである。例えば、追加の(すなわち、更に及び／又は他の)甘味料、香味料、電解質、ビタミン、果実ジュース又は他の果実製品、味覚剤(tastent)、マスキング剤等を添加することができ、風味向上剤、及び／又は炭酸化作用は、典型的にいずれの該処方に加えても、味覚、口当たり、栄養特性等を変えることができる。実施形態においては、飲料製品は、水と、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３と、酸味料と、香味料とを含有するコーラ飲料であり得る。典型的な香味料は、例えば、コーラ香味料、柑橘類香味料、及びスパイス香味料であり得る。一部の実施形態では、二酸化炭素の形態の炭酸化作用を泡立ちのために加えることができる。他の実施形態では、他の成分、生産技術、所望の貯蔵寿命等に応じて保存料を添加することができる。ある特定の実施形態では、カフェインを添加することができる。一部の実施形態では、飲料製品は、特徴的に炭酸水、甘味料、コーラナッツエキス及び／又は他の香味料、カラメル着色料、1種以上の酸、及び任意で他の成分を含有するコーラ風味の炭酸飲料であり得る。

【0049】

飲料製品中に存在するレバウディオサイドD３の適切な量は、例えば、約5ppm〜約100ppmであり得る。一部の実施形態では、低濃度、例えば、100ppm未満のレバウディオサイドD３は、10,000ppm〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。最終濃度は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲である。或いは、レバウディオサイドD３は、本開示の飲料製品中に約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で存在してよい。

【0050】

別の態様では、本開示は、甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品に関する。消費製品は、例えば、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料であり得る。
本明細書で使用する場合、「健康補助食品(dietary supplement)」は、食事を補助し、食事に欠けているか又は食事で十分に消費できない可能性があるビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸等の栄養素を与えることを意図した化合物を指す。技術上周知のいずれの適切な健康補助食品も使用可能である。適切な健康補助食品の例は、例えば、栄養素、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、ハーブ、植物、アミノ酸、及び代謝物であり得る。
本明細書で使用する場合、「栄養補助食品(nutraceutical)」は、疾患若しくは障害(例えば、疲労、不眠症、老化作用、記憶喪失、気分障害、心血管疾患及び高レベルの血中コレステロール、糖尿病、骨粗しょう症、炎症、自己免疫障害等)の予防及び／又は治療を含めた医学上又は健康上の利益を与え得るいずれの食品又は食品の一部をも含む化合物を指す。技術上周知のいずれの適切な栄養補助食品をも使用可能である。一部の実施形態では、栄養補助食品を食品及び飲料のサプリメントとして並びにカプセル剤若しくは錠剤等の固形剤、又は溶液若しくは懸濁液等の液剤であってよい経腸又は非経口用途のための医薬製剤として使用することができる。
一部の実施形態では、健康補助食品及び栄養補助食品は、保護親水コロイド(例えばガム、タンパク質、加工デンプン)、結合剤、膜形成剤、被包剤／材、壁／殻材、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤(油、脂肪、蝋、レシチン等)、吸着剤、担体、充填剤、共化合物(co-compound)、分散剤、湿潤剤、加工助剤(溶媒)、流動剤、味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤(jellyfying agent)、ゲル形成剤、抗酸化剤及び抗菌剤を更に含有することができる。

【0051】

本明細書で使用する場合、「ゲル」は、粒子の網目構造が液状媒体の体積に広がるコロイド系を指す。ゲルは主に液体で構成され、ひいては液体と同様の密度を示すが、ゲルは、液状媒体の体積に広がる粒子の網目構造のため固体の構造的統一性を有する。このため、ゲルは一般的に固形のゼリー様物質であるように見える。ゲルは多くの用途に使用可能である。例えば、食品、塗料、及び接着剤にゲルを使用することができる。食べることができるゲルは、「食用ゲル組成物」と呼ばれる。「食用ゲル組成物」は典型的にスナックとして、デザートとして、主食の一部として、又は主食と共に食べられる。適切な食用ゲルの例は、例えば、ゲル状デザート、プディング、ジャム、ゼリー、ペースト、トライフル、アスピック、マシュマロ、グミ等であり得る。一部の実施形態では、食用ゲルミックスは一般的に、液体を加えて食用ゲル組成物を形成できる粉末化又は顆粒状固体である。適切な液体の例は、例えば、水、乳製品液、乳製品類似液、ジュース、アルコール、アルコール飲料、及びその組み合わせであり得る。適切な乳製品液は、例えば、乳、発酵乳、クリーム、液体乳清、及びその混合物であり得る。適切な乳製品類似液の例は、例えば、豆乳及び乳製品でないコーヒー用クリームであり得る。

【0052】

本明細書で使用する場合、用語「ゲル化成分」は、液状媒体内にコロイド系を形成できるいずれの材料をも指す。適切なゲル化成分は、例えば、ゼラチン、アルギナート、カラギーナン、ガム、ペクチン、コンニャク、寒天、食用酸、レンネット、デンプン、デンプン誘導体、及びその組み合わせであり得る。食用ゲルミックス又は食用ゲル組成物に用いるゲル化成分の量は、例えば、使用する特定のゲル化成分、使用する特定の液体ベース、及びゲルの所望特性等のいくつかの因子に応じてかなり異なり得ることは当業者に周知である。
本開示のゲルミックス及びゲル組成物は、技術上周知のいずれの適切な方法によっても調製可能である。一部の実施形態では、本開示の食用ゲルミックス及び食用ゲル組成物は、レバウディオサイドD３とゲル化剤に加えて他の成分を用いて調製可能である。他の適切な成分の例は、例えば、食用酸、食用酸の塩、緩衝系、嵩高剤、捕捉剤、架橋剤、1種以上の香料、1種以上の着色料、及びその組み合わせであり得る。
技術上周知のいずれの適切な医薬組成物を使用してもよい。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３、及び1種以上の医薬的に許容できる賦形剤を含有することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物を用いて、生物学的効果を発揮する1種以上の活性薬を含有する医薬を処方することができる。従って、一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、生物学的効果を発揮する1種以上の活性薬を含有することができる。適切な活性薬は、技術上周知である(例えば、The Physician's Desk Reference)。該組成物は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USAに記載されているように、技術上周知の手順に従って調製可能である。

【0053】

レバウディオサイドD３は、技術上周知のいずれの適切な歯科及び口腔衛生組成物と共に使用することもできる。適切な歯科及び口腔衛生組成物の例は、例えば、練り歯磨き、歯磨き粉、デンタルフロス、うがい薬、洗口液、歯磨き剤(dentrifice)、マウススプレー、マウスリフレッシャー、歯垢リンス、歯痛緩和薬等であり得る。
消費製品中に存在するレバウディオサイドD３の適量は、例えば、約5百万分率(ppm)〜約100百万分率(ppm)であり得る。一部の実施形態では、例えば、100ppm未満の低濃度のレバウディオサイドD３は、10,000ppm〜30,000ppmの濃度を有するスクロース溶液と同等の甘味を有する。最終濃度は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲である。或いは、レバウディオサイドD３は、本開示の消費製品中に約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で存在し得る。
ある特定の実施形態では、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３が食品組成物中に存在する。本明細書で使用する場合、「食品組成物」は、栄養価を有し得るが、これが必要なわではなく、かつヒト及び動物による消費を意図し得るいずれの固体又は液体の摂取可能物質をも表す。

【0054】

適切な食品組成物の例は、例えば、菓子組成物、例えばキャンディー、ミント、フルーツ風味ドロップ、ココア製品、チョコレート等；香辛料、例えばケチャップ、マスタード、マヨネーズ等；チューインガム；シリアル組成物；焼いた食品、例えばパン、ケーキ、パイ、クッキー等；乳製品、例えば乳、チーズ、クリーム、アイスクリーム、サワークリーム、ヨーグルト、シャーベット等；タブレット甘味料組成物；スープ；シチュー；コンビニエンスフード；肉、例えばハム、ベーコン、ソーセージ、ジャーキー等；ゼラチン及びゼラチン様製品、例えばジャム、ゼリー、保存食等；果物；野菜；卵製品；アイシング；モラレスを含め、シロップ；スナック；ナッツミート及びナッツ製品；及び動物用餌であり得る。
食品組成物は、ハーブ、スパイス及び調味料、天然及び合成香料、並びに風味向上剤、例えばグルタミン酸一ナトリウム等であってもよい。一部の実施形態では、食品組成物は、例えば、調理済み包装製品、例えばダイエット甘味料、液体甘味料、顆粒化フレーバーミックス、ペットフード、家畜用餌、タバコ、及びベーキング用途の材料、例えばパン、クッキー、ケーキ、パンケーキ、ドーナツ等の調製用の粉末化ベーキングミックスであり得る。他の実施形態では、食品組成物は、スクロースをほとんど又は全く含まないダイエット及び低カロリー食品及び飲料であってもよい。

【0055】

先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、レバウディオサイドD３が唯一の甘味料であり、製品は約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、消費製品及び飲料製品は、更に追加の甘味料を含むことができ、製品は約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、製品中のあらゆる甘くする成分が高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、製品中のあらゆる甘くする成分が天然の高甘味度甘味料である。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、追加の甘味料は、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから選択される1種以上の甘味料を含有する。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、消費製品及び飲料製品は、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから選択される1種以上の添加物を更に含むことができる。先行する実施形態のいずれとも組み合わせることができる特定実施形態では、レバウディオサイドD３は、それを製品に添加する前に約50質量%〜約100質量%の純度を有する。

【0056】

甘味料
別の態様では、本開示は、下記化学構造から成る甘味料に関する。

【0057】

【化4】

【0058】

甘味料は、充填剤、嵩高剤及び固化防止剤の少なくとも1種を更に含むことができる。
適切な充填剤、嵩高剤及び固化防止剤は技術上周知である。
ある特定の実施形態では、消費製品及び飲料製品を甘くし及び／又はその甘さを増強するのに十分な最終濃度でレバウディオサイドD３甘味料を含めることができ及び／又は添加することができる。レバウディオサイドD３の「最終濃度」は、最終消費製品及び飲料製品中に存在する(すなわち、全ての成分及び／又は化合物を添加して消費製品及び飲料製品が生成された後の)レバウディオサイドD３の濃度を指す。従って、ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品を調製するために用られる化合物又は成分に含められ及び／又は添加される。レバウディオサイドD３は、単一の化合物若しくは成分、又は複数の化合物及び成分に存在し得る。他の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品に含められ及び／又は添加される。ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、約5ppm〜約100ppm、約5ppm〜約95ppm、約5ppm〜約90ppm、約5ppm〜約85ppm、約5ppm〜約80ppm、約5ppm〜約75ppm、約5ppm〜約70ppm、約5ppm〜約65ppm、約5ppm〜約60ppm、約5ppm〜約55ppm、約5ppm〜約50ppm、約5ppm〜約45ppm、約5ppm〜約40ppm、約5ppm〜約35ppm、約5ppm〜約30ppm、約5ppm〜約25ppm、約5ppm〜約20ppm、約5ppm〜約15ppm、又は約5ppm〜約10ppmの範囲の最終濃度で含められ及び／又は添加される。或いは、レバウディオサイドD３は、約5ppm〜約100ppm、約10ppm〜約100ppm、約15ppm〜約100ppm、約20ppm〜約100ppm、約25ppm〜約100ppm、約30ppm〜約100ppm、約35ppm〜約100ppm、約40ppm〜約100ppm、約45ppm〜約100ppm、約50ppm〜約100ppm、約55ppm〜約100ppm、約60ppm〜約100ppm、約65ppm〜約100ppm、約70ppm〜約100ppm、約75ppm〜約100ppm、約80ppm〜約100ppm、約85ppm〜約100ppm、約90ppm〜約100ppm、又は約95ppm〜約100ppmの範囲の最終濃度で含められ及び／又は添加される。

【0059】

例えば、レバウディオサイドD３は、約5ppm、約10ppm、約15ppm、約20ppm、約25ppm、約30ppm、約35ppm、約40ppm、約45ppm、約50ppm、約55ppm、約60ppm、約65ppm、約70ppm、約75ppm、約80ppm、約85ppm、約90ppm、約95ppm、又は約100ppm（これらの値間のいずれの範囲をも含めて）の最終濃度で含められ及び／又は添加され得る。
ある特定の実施形態では、レバウディオサイドD３は、消費製品及び飲料製品に含められ及び／又は添加される唯一の甘味料である。該実施形態では、消費製品及び飲料製品は、約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約1%〜約3%(w/v-%)のスクロース溶液、又は約1%〜約2%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する。或いは、消費製品及び飲料製品は、約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約2%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、約3%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液、又は約4%と同等の甘味強度を有する。例えば、消費製品及び飲料製品は、約1%、約2%、約3%、又は約4%(w/v-%)（これらの値間のいずれの範囲をも含めて）のスクロース溶液と同等の甘味強度を有し得る。
本開示の消費製品及び飲料製品は、レバウディオサイドD３と本開示の1種以上の甘味料との混合物を、所望の甘味強度、栄養特性、味覚プロファイル、口当たり、又は他の感覚受容因子を達成するのに十分な比率で含むことができる。
下記非限定例を考慮すると、本開示が更に完全に理解されるであろう。

【実施例】

【0060】

実施例1
この実施例では、全ての候補UGT遺伝子の全長DNA断片を合成した。
詳細には、大腸菌発現のためにcDNAsをコドン最適化した(Genscript, Piscataway, NJ)。合成DNAを細菌発現ベクターpETite N-His SUMO Kan Vector(Lucigen)中でクローン化した。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素(EUS)(SEQ ID NO:6参照)をコードするヌクレオチド配列のため、イネ(Oryze sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ(EUGT11)ドメイン(SEQ ID NO:2参照) をコードするヌクレオチド配列と、シロイヌナズナ(A. thaliana)スクロースシンターゼ1(AtSUSl)ドメイン(SEQ ID NO:4参照)をコードするヌクレオチド配列との間のフレームにGSGリンカー(ヌクレオチド配列：ggttctggtによってコードされた)を挿入した。
表2は、タンパク質及び配列識別番号(sequence identifier number)を要約する。

【0061】

【0062】

各発現構築物を大腸菌BL21(DE3)に形質転換させ、引き続き50μg/mLのカナマイシンを含有するLB培地内で37℃にて0.8〜1.0のOD₆₀₀に達するまで成長させた。1mMのイソプロピルβ-D-l-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加してタンパク質発現を誘導し、培養を更に16℃で22時間行なった。細胞を遠心分離により採取した(3,000xg；10分；4℃)。細胞ペレットを収集し、即座に使用するか又は-80℃で貯蔵した。
細胞ペレットを溶解緩衝液(50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.2、25μg/mlのリゾチーム、5μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼI、20mMのイミダゾール、500mMのNaCl、10%のグリセロール、及び0.4%のTRITON X-100)に再懸濁させた。4℃で超音波処理により細胞を破壊し、細胞デブリを遠心分離により清澄にした(18,000xg；30分)。上清を平衡化(平衡化緩衝液：50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.2、20mMのイミダゾール、500mMのNaCl、10%のグリセロール)Ni-NTA(Qiagen)アフィニティーカラムに装填した。タンパク質サンプルの装填後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して未結合混入タンパク質を除去した。His標識されたUGT組換えポリペプチドを、250mMのイミダゾールを含有する平衡化緩衝液で溶出した。精製後、組換えEUGT11タンパク質(図2Aに矢印で示した62kDバンド)及びEUS融合酵素(図2Bに矢印で示した155kDバンド)をSDS-PAGEで分析した。分子量標準を各SDS-ゲル画像の左に示してある。

【0063】

実施例2
この実施例では、レバウディオサイドAをステビオールグリコシド基質として用いて、組換えEUGT11タンパク質及び組換えEUS融合酵素を1,2-19 O-グルコースグリコシル化活性についてアッセイした。
組換えポリペプチド(10μg)を200μLのインビトロ反応系で試験した。反応系は50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.2、3mMのMgCl₂、1mg/mlのステビオールグリコシド基質、及び1mMのUDP-グルコースを含有した。反応は30℃で行ない、200μLの1-ブタノールを添加して終わらせた。サンプルを3回200μLの1-ブタノールで抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析のため7μLの80%メタノールに溶かした。レバウディオサイドA(純度99%)を基質として用いた。レバウディオサイドAは、Blue California(Rancho Santa Margarita, CA)から得た。インビトロ反応を14時間及び24時間行なった。図3Aは、比較のためレバウディオサイドD(標識「Reb D」)のピークを示す。
UGT触媒グリコシル化反応を、スクロースシンターゼ(例えば、AtSUSl)で触媒されるUDP-グルコース産生反応(本明細書では「UGT-SUSカップリング系」と称する)と共役させた。詳細には、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1(AtSUSl)配列(Bieniawska et al., Plant J. 2007, 49: 810-828)を合成して細菌発現ベクターに挿入した。組換えAtSUSlタンパク質を発現させてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。AtSUSlタンパク質をEUGT11タンパク質に添加して、本明細書ではEUGT11-AtSUSlカップリング系と称するインビトロ反応混合物を形成した。結果として生じたUGT-SUS(例えば、EUGT11-AtSUSl)カップリング系においては、UDP-グルコースがスクロース及びUDPから産生され、その結果、余分なUDP-グルコースの添加を省いた。

【0064】

HPLC分析は、クォータナリポンプ、温度制御されたカラムコンパートメント、オートサンプラー及びUV吸光度検出器を含むDionex UPLC ultimate 3000システム(Sunnyvale, CA)を用いて行なった。ステビオールグリコシドの特徴づけにはガードカラム、150×3.0mm、3μm(100A)付きのPhenomenex Luna NH2を用いた。HPLC分析の均一濃度溶離では水中72%のアセトニトリルを用いた。
図3に示すように、全ての反応条件でEUS及びEUGT11が糖部分をレバウディオサイドAに移してレバウディオサイドDを生成した。レバウディオサイドAは、EUS融合酵素(図3B及び3E)及びUGT-SUS(すなわち、EUGT11-AtSUSl)カップリング反応系(図5D及び5G)によって14時間及び24時間のインキュベーション時間で完全にレバウディオサイドDに変換された。しかしながら、レバウディオサイドAは、EUGT11酵素のみでは14時間(図3C)及び24時間(図3F)で一部だけがレバウディオサイドDに変換された。更に、同一分子量のEUSは、EUGT11より高い酵素活性を有し、14時間(図3B)及び24時間(図3E)のインキュベーション時間で全てのレバウディオサイドAをレバウディオサイドDに変換した。これらの結果は、UGT-SUS(すなわち、EUGT11-AtSUSl)カップリング系の反応は、EUS融合酵素を用いて達成できることを実証した。更に、これらの結果は、EUGT11が、レバウディオサイドAからレバウディオサイドDを生成するための1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性を示すこと(図3C及び3F)、及びAtSUSlが、UGT-SUSカップリング系におけるEUGT11による変換効率を高めること(図3B、3D、3E及び3G)を実証した。図3Aは、比較のためにステビオシド(標識「Ste」)、レバウディオサイドA(標識「Reb A」)及びレバウディオサイドD(標識「Reb D」)のピークを示す。

【0065】

実施例3
この実施例では、実施例2で述べたように14時間及び24時間のインキュベーション時間でステビオールグリコシド基質としてステビオシドを用いて、EUGT11及びEUSを1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性についてアッセイした。
上記実施例2に記載のEUGT11によるレバウディオサイドAのレバウディオサイドDへの変換に加えて、EUGT11はステビオシドをもレバウディオサイドEに変換した(図4中、標識「Reb E」)。驚くべきことに、約7.28分のHPLC保持時間を有する予想外の化合物、レバウディオサイドD３(図4中、標識「Reb D３」)が全ての反応でEUGT11とEUSの両者により生成された。AtSUSlをEUGT11反応混合物に添加してUGT-SUSカップリング系を生じさせたとき(図4D及び4G)、及びEUSを用いたとき(図4B及び4E)、更にレバウディオサイドD３が生成された。
レバウディオサイドD３生成の増加と共に、生成されたレバウディオサイドE(図4C及び4F中の標識「Reb E」)は、レバウディオサイドD３の生成中に消費された。これらの結果は、EUGT11が、レバウディオサイドEからレバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を生成するための反応を触媒できることを示した。図4Aは、比較のためステビオシド(標識「Ste」)、レバウディオサイドA(標識「Reb A」)及びレバウディオサイドD(標識「Reb D」)のピークを示す。

【0066】

実施例4
この実施例では、レバウディオサイドEのレバウディオサイドD３への変換をインビトロで確認するため、実施例2で述べたようにステビオールグリコシド基質としてレバウディオサイドEを用いてEUGT11及びEUSをアッセイした。
比較のため、別のUGT(UGT76G1)の酵素活性をもアッセイした。ステビア由来のUGT76G1は、ステビオシドのC13-O-グルコースのC-3'に糖残基を移してレバウディオサイドAを形成する酵素として同定されている。図5F及び5Jに示すように、UGT-SUSカップリング系においてUGT76G1を使用すると、糖残基がレバウディオサイドEのC13-O-グルコースのC-3'に転移してレバウディオサイドDを形成する。図5A及び5Bは、比較のため精製レバウディオサイドD(「Reb D」)及びレバウディオサイドE(「Reb-E」)を示す。
上記実施例3で論じ、図5C及び5Gに示すように、EUGT11だけが1つのグルコース分子をレバウディオサイドEに移して、レバウディオサイドD及びEと異なる(それぞれ、図5A及び図5Bのピークを比較されたい)レバウディオサイド(本明細書では「レバウディオサイドD３」と称し、図5C及び5G中の標識「Reb D３」)を形成することができた。UGT-SUSカップリング系におけるEUGT11(図5D及び5H)並びにEUS(図5E及び5I)は、レバウディオサイドEからレバウディオサイドD３への変換を増進した。
これらの結果は、EUGT11が、関連ステビオールグリコシドを生成するための1,2-19-O-グルコースグリコシル化活性を有するUGTであることを実証した。EUGT11は、基質としてのステビオシドからReb-Eを生成し、基質としてのReb-AからReb-Dを生成するための反応を触媒することができる。驚くべきことに、化合物(Reb-D３)は、基質としてのステビオシドとのインビトロ反応で予想外に合成された。さらなる実験は、Reb-D３がReb-Eから直接合成されることを確証した。Reb-D３の構造によれば、インビトロ反応において、EUGT11がD-グルコースをReb-EのC13-O-グルコースのC-6'に移してl,6-β-グリコシド結合をもたらした。

【0067】

実施例5
この実施例では、拡大インビトロ反応からレバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を精製し、液体クロマトグラフィー／質量分析(LC/MS)及び核磁気共鳴(NMR)分析用に調製した。
レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)を拡大インビトロ反応から精製した。インビトロ反応をHPLC分析によりモニターした。所望の時点で、Reb-D３化合物をカラムで精製し、真空乾燥で濃縮した。精製Reb-D３は、95%純度の白色粉末であった。収集したReb-D３化合物を高分解能質量スペクトル(HRMS)解析に使用した。LTQ Orbitrap Discovery HRMS機器で、その分解能を30kに設定してHRMSデータを生成し、正イオンエレクトロスプレーモードで、m/z 150から1500までデータをスキャンした。ニードル電圧を4kVに設定し；他のソース条件は、シースガス＝25、補助ガス(aux gas)＝0、スイープガス＝5(全てのガス流量は任意単位)、キャピラリー電圧＝30V、キャピラリー温度＝300℃、及びチューブレンズ電圧＝75であった。サンプルを2:2:1のアセトニトリル:メタノール:水(注入溶出剤と同じ)で希釈し、50マイクロリットルのサンプルを注入した。Bruker Avance DRX 500 MHz機器又はVarian INOVA 600 MHz機器を用いて標準パルスシーケンスを利用して核磁気共鳴(NMR)スペクトルを取得した。1D(¹H及び¹³C)及び2D(TOCSY、HMQC、及びHMBC)NMRスペクトル分析をピリジン-d5(C₅D₅Nとしても知られる)中で行なった。
Reb-D３の分子式を、m/zがそれぞれ1146.5169及び1151.4721で[M+NH₄]⁺及び[M+Na]⁺に対応する付加イオンを示すその正の高分解能質量スペクトル(HRMS)に基づいてC₅₀H₈₀O₂₈と推定した。この組成は¹³C NMRスペクトルデータにより支持された。Reb-D３の¹H NMRスペクトルデータは、δ 1.10及び1.44に2つのメチルの一重線、δ 5.09及び5.72に環外二重結合の一重線として2つのオレフィン性プロトン、δ 0.74〜2.80の間に9つのsp3メチレン及び2つのsp3メチンプロトンの存在を示した。これは、ステビア属から単離されたent-カウランジテルペノイドの特徴である。
ent-カウランジテルペノイドの基本骨格はTOCSY研究により支持され、重要な相関性を示した：H-l/H-2；H-2/H-3；H-5/H-6；H-6/H-7；H-9/H-11；H-11/H-12。Reb-D３の¹H NMRスペクトルもδ 5.04、5.10、5.21、5.48及び6.30で共鳴するアノマープロトンを示し；その構造内の5つの糖単位を示唆している。Reb-D３の5%H₂S0₄による酸加水分解はD-グルコースを与えた。これはTLCによって標品との直接比較により同定された。δ 5.04(d, J=7.5Hz)、5.10(d, J=7.4Hz)、5.21(d, J=7.9Hz)、5.48(d, J=7.9Hz)、及び6.30(d, J=7.9Hz)でグルコース成分の5つのアノマープロトンについて観察された大きいカップリング定数は、他のステビオールグリコシドについて報告されたようにそれらのβ-配向性を示唆している。Reb-D３についての¹H及び¹³C NMRの値をTOCSY、HMQC及びHMBCデータに基づいて割り当て、表3に要約する。

【0068】

表3. Reb-D３及びReb-Eについての¹H及び¹³C NMRの値

【0069】

広範な1D(¹H及び¹³C)、2D NMR(TOCSY、HMQC、及びHMBC)及び高分解能質量スペクトル(HRMS)データに基づいて、Reb-D３の構造を同定し、レバウディオサイドEの構造と比較した(図6参照)。
Reb-D３のNMRスペクトルデータ及び加水分解実験の結果に基づいて、アグリコンステビオールに結合したその構造中に5つのβ-D-グリコシル単位があると結論づけた。Reb-D３とレバウディオサイドEの¹H及び¹³C NMRの値の厳密な比較(表2参照)により、エーテル結合の形でC13に2-O-β-D-グルコビオシル単位及びエステル結合の形でC19位に別の2-O-β-D-グルコビオシル単位を有し、さらなるβ-D-グルコシル単位の割当が残っているステビオールアグリコン成分の存在が示唆された。更に、糖部分の5つのオキシメチンカーボンの1つがδ 69.8の低磁場に現れることを示すReb-D３の¹³C NMRスペクトルデータにより、この位置にβ-D-グルコシル単位が更に配置されることが示唆された。Reb-D３及びReb-Eの2つの糖I及びIVについての同一のプロトン及びカーボンスペクトルデータにより、糖II又は糖IIIのどちらかの6位にβ-D-グルコシル単位が配置されることが示唆された。β-D-グルコシル成分の糖IIの6位における¹H及び¹³Cの化学シフトが両方とも低磁場シフトしたことにより、さらなるβ-D-グルコシル単位がこの位置に付着していることが示唆された。この構造は、図7に示すように主要なTOCSYとHMBCの相関によって更に支持された。
NMR及び質量スペクトルデータ並びに加水分解研究の結果に基づいて、レバウディオサイドEの酵素的変換により生成されるReb-D３の構造を13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステルと推定した。
13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステル(Reb-D３)。白色粉末；¹H-NMR(600MHz, C₅D₅N, δppm)及び¹³C-NMR (150MHz, C₅D₅N, δppm)分光学的データは表2参照；HRMS (M+NH₄)⁺ m/z 1146.5169(C₅₀H₈₄O₂₈Nに対する計算値：1146.5180)、(M+Na)⁺ m/z 1151.4721(C₅₀H₈₀O₂₈Naに対する計算値：1151.4734)。

【0070】

MeOH(10ml)中のReb-D３(5mg)の溶液に3mlの5%H₂SO₄を加え、混合物を24時間還流させた。次に反応混合物を飽和炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル(EtOAc)(2×25ml)で抽出して、糖を含有する水性画分及びアグリコン部分を含有するEtOAc画分を得た。水相を濃縮し、TLC系EtOAc/n-ブタノール/水(2:7:1)及びCH₂Cl₂/MeOH/水(10:6:1)を用いて標準糖と比較し；この糖をD-グルコースと同定した。
広範な1D(¹H及び¹³C)、及び2D NMR(TOCSY、HMQC、及びHMBC)、並びに高分解能質量スペクトルデータ及び加水分解研究に基づいてReb-D３の構造を13-[(2-O-β-D-グルコピラノシル-6-O-β-D-グルコピラノシルβ-D-グルコピラノシル)オキシ]-ent-カウラ-16-エン-19-オイック酸-(2-O-β-D-グルコピラノシルβ-D-グルコピラノシル)エステルと推定した。

【0071】

実施例6
この実施例では、レバウディオサイド(レバウディオサイドD３)の構造をReb-E及びReb-Dと比較した。
ステビオールグリコシドのデータベースによれば、Reb-Dだけがその構造中にアグリコンステビオールに結合した5つのβ-D-グリコシル単位、すなわちアグリコンステビオールのC19位に2つのグリコシド残基及びC13位に3つのグリコシド残基を含有する。スレビア由来のUGT76G1は、糖残基をReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に移してレバウディオサイドDを形成する酵素と同定されている(図5F及び5J参照)。Reb-D３は、レバウディオサイドDと比較すると構造が異なるが、やはり5つのD-グリコシド残基を含有するステビオールグリコシドである(図8参照)。レバウディオサイドD３の第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,6-β-グリコシド結合によってReb-EのC-13-O-グルコースのC-6'に位置しているが、レバウディオサイドDの第5グリコシド残基(「糖V」)は、1,3-β-グリコシド結合によってReb-EのC13-O-グルコースのC-3'に位置している(図8参照)。ここで述べたように、EUGT11及びEUGは両方ともインビトロで直接Reb-EをReb-D３に変換することができる。

【0072】

実施例7
この実施例では、Reb-D３について味覚検査を行なった。
コントロールとしてスクロースを用いてReb-D３の官能評価を行なった。スクロースサンプルはSigma-Aldrichから購入し、室温で容器入り飲料水(bottled water)中1.0%、3.0%、及び6.0%(w/v)の3つの異なる濃度のスクロースでコントロールサンプルを調製した。官能評価のための300、及び600ppmのステビオールグリコシドReb-D３は、1000mLの容器入り飲料水に対応質量を添加することによって調製した。混合物を室温で撹拌し、次にステビオールグリコシドサンプルを1.0%、3.0%、及び6.0%のいくつかのコントロールスクロースサンプルに対して9名の志願者団により評価した。
盲検結果は、2つの異なる濃度(300及び600ppm)のReb-D３で9名の志願者の過半数の間で一致した結果を示し；全体的な%甘味等価(sweetness equivalence)(SE)平均は、それぞれ約2.4及び5.4であった。この結果は、レバウディオサイドD３がスクロースの約80〜90倍甘いことを示している。

【0073】

実施例8
この実施例では、Reb-D３の溶解度をReb-Dと比較した。
Reb-D３及びReb-Dを水に添加して0.25mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、5mM及び10mMのReb-D３及びReb-D溶液を調製した。Reb-D３粉末は即座に水に完全に溶解したが、0.25mMのReb-Dだけが水に全体的に溶解した。更に、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、5mM及び10mMの濃度のReb-Dの溶液は、30℃で72時間加熱しても溶解しなかった。
これらの結果は、水中でReb-D３がReb-Dより高い溶解度を有することを実証している。
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。本開示の範囲を逸脱することなく、上記方法及びシステムに種々の変更を加え得るので、上記説明に含まれ、添付図面に示される全ての事項は、例示として解釈すべきであり、限定的意味に解釈すべきでないことが意図される。
本開示又はその種々の異形、実施形態又は態様の要素を導入するときには、冠詞「a」、「an」、「the」及び「said」は、1つ以上の要素を意味するつもりである。用語「含む」、「含める」及び「有する」は、包括的であり、列挙した要素以外に更に要素があり得ることを意味するつもりである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕下記化学構造から成る合成レバウディオサイド。

〔２〕レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
レバウディオサイドEと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるウリジン二リン酸(UDP)-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドEと共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔３〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔2〕に記載の方法。
〔５〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔4〕に記載の方法。
〔６〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔4〕に記載の方法。
〔７〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔2〕に記載の方法。
〔８〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11ドメインである、前記〔2〕の方法。
〔１０〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１１〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔１２〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１３〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔2〕に記載の方法。
〔１４〕レバウディオサイドD３の合成方法であって、下記工程、
ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸及びウリジン二リン酸-グルコースから成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記ステビオシドと共有結合してレバウディオサイドE中間体を生成し、グルコースが前記レバウディオサイドE中間体と共有結合してレバウディオサイドD３を生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドD３を生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔１５〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔14〕に記載の方法。
〔１６〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔15〕に記載の方法。
〔１７〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔16〕に記載の方法。
〔１８〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔16〕に記載の方法。
〔１９〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２０〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔19〕に記載の方法。
〔２１〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔14〕の方法。
〔２２〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２３〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔14〕に記載の方法。
〔２４〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２５〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔14〕に記載の方法。
〔２６〕スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２７〕SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔26〕のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２８〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔26〕のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔２９〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３０〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３１〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔30〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３２〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔26〕に記載のUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素。
〔３３〕レバウディオサイドDの合成方法であって、下記工程：
レバウディオサイドAと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、及び
前記反応混合物を、グルコースが前記レバウディオサイドAと共有結合してレバウディオサイドDを生成するのに十分な時間インキュベートしてレバウディオサイドDを生成する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔３４〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ EUGT11である、前記〔33〕に記載の方法。
〔３５〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔34〕に記載の方法。
〔３６〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔35〕に記載の方法。
〔３７〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔35〕に記載の方法。
〔３８〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔33〕に記載の方法。
〔３９〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔38〕に記載の方法。
〔４０〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４１〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４２〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔33〕に記載の方法。
〔４３〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４４〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔33〕に記載の方法。
〔４５〕レバウディオサイドEの合成方法であって、下記工程、
ステビオシドと、スクロース、ウリジン二リン酸(UDP)及びウリジン二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)から成る群より選択される基質と、ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素から成る群より選択されるUDP-グリコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物を調製する工程、
を含み、グルコースが、前記ステビオシドと共有結合してレバウディオサイドEを生成することを特徴とする方法。
〔４６〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔45〕に記載の方法。
〔４７〕スクロースシンターゼを前記反応混合物に添加する工程を更に含む、前記〔46〕に記載の方法。
〔４８〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔47〕に記載の方法。
〔４９〕前記スクロースシンターゼが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔47〕に記載の方法。
〔５０〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼが、スクロースシンターゼドメインに結合したウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインを含むUDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５１〕前記UDP-グリコシルトランスフェラーゼ融合酵素が、SEQ ID NO:5と約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記〔50〕に記載の方法。
〔５２〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、イネ(Oryza sativa)ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼEUGT11である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５３〕前記ウリジンジホスホグリコシルトランスフェラーゼドメインが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５４〕前記スクロースシンターゼドメインが、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ1、アラビドプシス属(Arabidopsis)スクロースシンターゼ3及びヤエナリ(Vigna radiate)スクロースシンターゼから成る群より選択される、前記〔45〕に記載の方法。
〔５５〕前記スクロースシンターゼドメインが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)スクロースシンターゼ1である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５６〕前記スクロースシンターゼドメインが、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列である、前記〔45〕に記載の方法。
〔５７〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される経口消費できる製品。
〔５８〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔57〕の経口消費できる製品。
〔５９〕レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６０〕前記経口消費できる製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６１〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６２〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６３〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔61〕に記載の経口消費できる製品。
〔６５〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６６〕前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料から成る群より選択される、前記〔57〕に記載の経口消費できる製品。
〔６７〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む飲料製品。
〔６８〕前記飲料製品が、炭酸飲料製品及び非炭酸飲料製品から成る群より選択される、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔６９〕前記飲料製品が、ソフトドリンク、ファウンテン飲料、冷凍飲料；すぐに飲める飲料；冷凍したすぐに飲める飲料、コーヒー、茶、乳飲料、粉末ソフトドリンク、液体濃縮物、風味付けした水、改良水、果実ジュース、果実ジュースで風味付けしたドリンク、スポーツドリンク、及びエナジードリンクから成る群より選択される、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７０〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７２〕前記飲料製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７３〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む前記〔67〕に記載の飲料製品であって、該飲料製品が約1%(w/v-%)〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する飲料製品。
〔７４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７５〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７６〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、ロハングオ（Lo Han Guo）、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔73〕に記載の飲料製品。
〔７７〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔67〕に記載の飲料製品。
〔７８〕甘くする量のレバウディオサイドD３を含む消費製品。
〔７９〕前記消費製品が、食品、栄養補助食品、医薬品、健康補助食品、歯科衛生組成物、食用ゲル組成物、化粧品及び卓上香味料から成る群より選択される、前記〔78〕に記載の消費製品。
〔８０〕約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を含む、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料である、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８２〕前記飲料製品が、約1%(w/v-%)〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８３〕少なくとも1種の追加の甘味料を更に含む前記〔78〕に記載の飲料製品であって、該飲料製品が約1%(w/v-%)〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する飲料製品。
〔８４〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８５〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８６〕前記追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、L-アラニン、グリシン、Lo Han Guo、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔83〕に記載の飲料製品。
〔８７〕炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される少なくとも1種の添加物を更に含む、前記〔78〕に記載の飲料製品。
〔８８〕下記化学構造から成る甘味料。

〔８９〕充填剤、嵩高剤及び固化防止剤の少なくとも1つを更に含む、前記〔88〕に記載の甘味料。
〔９０〕レバウディオサイドD３を含む製品の調製方法であって、レバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含み、該製品が、飲料製品及び消費製品から成る群より選択され、かつ約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３が前記製品に添加される、前記方法。
〔９１〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料であり、かつ前記製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔90〕に記載の方法。
〔９２〕少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含む前記〔90〕に記載の方法であって、前記製品が約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する前記方法。
〔９３〕製品の甘味を増強する方法であって、約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品に添加する工程を含み、この添加されたレバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３を欠いている対応製品に比べて、前記製品の甘味を増強する、前記方法。
〔９４〕前記レバウディオサイドD３が、唯一の甘味料であり、かつ前記製品が約1%〜約4%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記〔93〕に記載の方法。
〔９５〕追加の甘味料を添加する工程を更に含む前記〔93〕に記載の方法であって、前記製品が、約1%〜約10%(w/v-%)のスクロース溶液と同等の甘味強度を有する、前記方法。
〔９６〕甘くした製品の調製方法であって、飲料製品及び消費製品から成る群より選択される製品を準備する工程、及び約5ppm〜約100ppmのレバウディオサイドD３を前記製品に添加する工程を含む前記方法。
〔９７〕少なくとも1種の添加物を前記製品に添加する工程を更に含む、前記〔96〕に記載の方法。
〔９８〕前記少なくとも1種の添加物が、炭水化物、ポリオール、アミノ酸又はその塩、ポリアミノ酸又はその塩、糖酸又はその塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機塩、有機酸塩、有機塩基塩、無機塩、苦味化合物、香料、香味成分、収斂性化合物、タンパク質、タンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔96〕に記載の方法。
〔９９〕少なくとも1種の追加の甘味料を添加する工程を更に含む、前記〔96〕に記載の方法。
〔１００〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、高甘味度甘味料である、前記〔99〕に記載の方法。
〔１０１〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、天然の高甘味度甘味料である、前記〔100〕に記載の方法。
〔１０２〕前記少なくとも1種の追加の甘味料が、ステビアエキス、ステビオールグリコシド、ステビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、ズルコサイドA、ルブソサイド、ステビオールビオシド、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、フルクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、AceK、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、ナリンギンジヒドロカルコン(NarDHC)、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン(NDHC)、ルブソサイド、モグロシドIV、シアメノシドI、モグロシドV、モナチン、タウマチン、モネリン、ブラゼイン、Lアラニン、グリシン、ロハングオ、ヘルナンズルシン、フィロズルチン、トリロブタイン、及びその組み合わせから成る群より選択される、前記〔99〕に記載の方法。
〔１０３〕前記製品中の前記レバウディオサイドD３が、レバウディオサイドD３多形、非晶質レバウディオサイドD３及びレバウディオサイドD３立体異性体から成る群より選択される、前記〔96〕に記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]