特許 6641397 核酸酵素基質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6641397

(24)【登録日】2020年1月7日

(45)【発行日】2020年2月5日

(54)【発明の名称】核酸酵素基質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20200127BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20200127BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200127BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 ZZNA

   C12Q1/68

   G01N33/53 M

【請求項の数】14

【外国語出願】

【全頁数】101

(21)【出願番号】特願2018-11601(P2018-11601)

(22)【出願日】2018年1月26日

(62)【分割の表示】特願2014-528802(P2014-528802)の分割

【原出願日】2012年9月10日

(65)【公開番号】特開2018-78910(P2018-78910A)

(43)【公開日】2018年5月24日

【審査請求日】2018年2月23日

(31)【優先権主張番号】2011903686

(32)【優先日】2011年9月9日

(33)【優先権主張国】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】513119015

【氏名又は名称】スピーデクス ピーティーワイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】アリソン・ヴェリアン・トッド

(72)【発明者】

【氏名】エリサ・モカニー

(72)【発明者】

【氏名】エヴェリン・メイリア・リナディ

(72)【発明者】

【氏名】ディナ・ロネガン

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０９５５１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５−Ｎ_６−Ｎ_７−Ｎ_８−ｒＲ−ｒＹ−Ｎ_９−Ｎ_１０−Ｎ_１１−Ｎ_１２−Ｎ_１３−Ｎ_１４−Ｎ_１５
（式中、
ｒＲは、プリンリボヌクレオチドであり、
ｒＹは、ウラシルであり、
Ｎ_１〜Ｎ_１５のそれぞれは、ヌクレオチドであり、
Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち６個以上は、シトシンヌクレオチドであり、
Ｎ_９は、シトシンヌクレオチドであり、かつ
Ｎ_９〜Ｎ_１５のうち３個未満は、グアニンヌクレオチドである）
を含む、１０−２３ＤＮＡザイムまたは１０−２３ＤＮＡザイムに基づくＭＮＡザイムに対する単離されたポリヌクレオチド基質であって、
配列番号２９、３０、７２〜７４、７６〜８５、８７〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含む、またはその配列からなる、単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項2】

Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち７個以上が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号２９、７３、７６〜８０、８２〜８３、８５、８７〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項3】

Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち８個が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号７６、７７、８０、８３または８７のいずれか１つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項4】

Ｎ_４〜Ｎ_１３のうち７個以上が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号２９、７３、７６〜８３、８５、８７〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項5】

Ｎ_８が、シトシンヌクレオチドであり、Ｎ_９が、シトシンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号７３、７６、７７、７９、８３、または８７のいずれか１つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項6】

Ｎ_９〜Ｎ_１５のうち１または０個が、グアニンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、配列番号２９、３０、７２〜７４、７７〜７９、８１〜８５、８７〜９０、１７４、または１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項7】

Ｎ_１〜Ｎ_１５のうち１１個、１２個、または１２個超が、ピリミジンヌクレオチドであり、かつ前記ポリヌクレオチド基質が、いずれか１つの配列番号２９、７２〜７４、７６〜８５、８７〜９０、１７４、または１７５により定義される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項8】

前記プリンリボヌクレオチドがグアニンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチド基質を検出するための検出可能標識をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質。

【請求項10】

（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを提供する工程であって、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第２のオリゴヌクレオチドパートザイムが、標的の存在下で自己集合して少なくとも第１の触媒活性多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成する、工程、
（ｂ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチド基質が、前記第１のＭＮＡザイムによる修飾が可能であり、前記ＭＮＡザイムによる前記ポリヌクレオチド基質の修飾が、検出可能作用を提供する、工程、
（ｃ）（１）前記少なくとも第１のＭＮＡザイムの自己集合と、
（２）前記少なくとも第１のＭＮＡザイムの触媒活性と、
を可能にする条件下で、前記２つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムと前記標的を推定上含有するサンプルとを接触させる工程、
（ｄ）前記検出可能作用を検出する工程
を含む、少なくとも１つの標的の存在を検出する方法であって、前記検出可能作用が、前記基質の切断である、方法。

【請求項11】

前記第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムが、
配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１６および配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５、配列番号４６および配列番号４５、配列番号４７および配列番号６３、配列番号４８および配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１、配列番号５２および配列番号５１、配列番号３８および配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７、配列番号５８および配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５、配列番号６６および配列番号６７、配列番号６２および配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０、配列番号４６および配列番号５５、配列番号４６および配列番号５９、配列番号３８および配列番号４５、配列番号５８および配列番号４５、配列番号６２および配列番号４５、配列番号４６および配列番号６３、配列番号７１および配列番号６８、配列番号９８および配列番号９９、配列番号１００および配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５、配列番号１０６および配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９、配列番号１１０および配列番号１１１、配列番号１１２および配列番号１１３、配列番号１１６および配列番号１１７、配列番号１１８および配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１、配列番号１２２および配列番号１１９、配列番号１５５および配列番号１５６、配列番号１５７および配列番号１５８、配列番号１５９および配列番号１６０、配列番号１６８および配列番号１６９、配列番号１７９および配列番号１８０、配列番号１８１および配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４、または配列番号１８５および配列番号１８６
により定義されるそれぞれの配列を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｄ）での前記検出が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、電気化学的方法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、ＵＶ、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せの使用を含む、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド基質と、切断によって前記ポリヌクレオチド基質を触媒修飾することができる触媒核酸酵素を含むキット。

【請求項14】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド基質に結合された固体担体を含む集合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照による組込み
本出願は、２０１１年９月９日出願の豪州仮特許出願第２０１１９０３６８６号（その全内容が相互参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。

【0002】

本発明は、一般的には、核酸酵素の分野に関する。より特定的には、本発明は、核酸酵素の基質およびこの基質の利用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

過去２０年間、酵素活性または触媒活性を有する多種多様な核酸分子が発見されてきた。ＲＮＡ酵素（「リボザイム」）は、天然に存在するが、標的ＲＮＡ基質を特異的に認識および修飾するように工学操作することが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化技術により、「デオキシリボザイム」、「ＤＮＡ酵素」、または「ＤＮＡザイム」として参照されることが多いデオキシリボ核酸を含めて、多くのより触媒性の核酸の発見および開発が促進されてきた。核酸の切断、核酸のライゲーション、ポルフィリンのメタル化、および炭素−炭素結合、エステル結合、またはアミド結合の形成を含めて、広範にわたる反応系を触媒する能力を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ進化したＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムが発見されてきた。

【0004】

特定的には、ワトソン・クリック塩基対合によりハイブリダイズした後に識別可能な核酸配列を特異的に切断するＤＮＡザイムおよびリボザイムが特徴付けられてきた。ＤＮＡザイムは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子のいずれかを切断可能である。また、リボザイムは、ＲＮＡ標的配列およびＤＮＡ標的配列の両方を切断可能である。「１０−２３」および「８−１７」ＤＮＡザイムは、核酸基質の特異的ＲＮＡホスホジエステル結合を切断して、２’，３’−環状リン酸を有する反応産物と５’−ヒドロキシル基を有する反応産物とを形成可能である。２’，３’−環状リン酸産物と５’−ヒドロキシル産物とをライゲート可能なデオキシリボザイム（ＤＮＡザイム）の例としては、「７Ｚ８１」および「７Ｚ４８」リガーゼが挙げられる。

【0005】

より最近になって、ＭＮＡザイム集合促進剤（たとえば、検出される標的分子）の存在下で２つ以上のオリゴヌクレオチド成分（本明細書では「パートザイム」としても参照される）から自己集合する能力を有する多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）が記載されてきた。

【0006】

触媒核酸の汎用性により、多種多様な適用でその使用が促進されてきた。触媒核酸をうまく使用する鍵となる要素は、適切な基質を修飾するその能力である。一般的には、基質は、触媒核酸のハイブリダイジングアームに実質的に相補的であり、特異的な配列または配列モチーフを触媒作用部位に含有する。所与の触媒核酸とその基質との相互作用の性質は、酵素がいかに効率的にその基質に結合しかつ／またはその基質を触媒修飾するかを決定する因子であるので、触媒核酸を利用するいずれの系を設計するうえでも、基本的要件である。

【0007】

触媒核酸は、核酸、タンパク質、および小分子の検出でｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用途を有する。この用途では、多くの場合、標的またはシグナルのいずれかを増幅して、対象のアナライトのロバスト検出に十分なシグナルを発生することが必要である。

【0008】

触媒核酸を利用する方法は、触媒活性によりバックグラウンドノイズを上回る効果的な識別を可能にする十分な速度で修飾される基質を必要とする。異なる方法では、異なる反応温度の使用が必要となりうるので、所要の温度で効率的に修飾（たとえば切断）される基質の必要性が存在する。ＭＮＡザイムおよびＤＮＡザイムを利用するような方法では、単一反応で多くの標的を同時に多重分析することが可能であるが、多重化して複数の標的を区別する能力は、好適な一連の基質、通常、標的１つあたり少なくとも１つの基質の存在に依存する。高効率で修飾（たとえば切断）される当技術分野で公知の基質の数は、現在のところ、多数の多重化を行うには不十分である。

【0009】

当技術分野ですでに公知のＤＮＡザイムおよびＭＮＡザイムの基質は、可能性のある複数の基質をスクリーニングして最も効率的に切断されるものを経験的に決定することにより誘導された。多くの場合、このスクリーニングは、全長ｍＲＮＡ内の理論上可能性のある切断部位を切断することを目標とした多数のＤＮＡザイムを用いて行われた。このスクリーニングは、通常、生理学的条件下（温度ならびにイオン強度、組成、および緩衝液のｐＨ）で行われた。これには、生理学的条件でｍＲＮＡの切断配列を効率的に見いだすことへの偏りが存在する。なぜなら、そのような研究は、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ発現の阻害剤としてＤＮＡザイムを治療に使用することに重点がおかれていたからである。そのような研究は、多数の推定基質を経験的に測定してより効率的に切断される少数の基質を見いだすべく、一連の労力のかかるプロトコルを提供する（たとえば、Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：４８０−４８６を参照されたい）。これらの研究は、効率的に切断される基質を選択するための限られた一群の設計ガイドラインをもたらし、多くの場合、ＤＮＡザイムは容易に調整可能でありｍＲＮＡはそうではないので、基質ではなくＤＮＡザイムの設計に重点をおいたガイドラインをもたらした。これらの研究から作成された１つの共通したガイドラインでは、基質の切断部位のＲ−Ｙリボヌクレオチドモチーフの正確な配列が重要であり、切断効率は、次の順：ＧＵ≧ＡＵ＞ＧＣ＞＞＞ＡＣである。

【0010】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下での全長ｍＲＮＡの切断効率は、細胞環境内での切断効率の絶対的尺度ではない。なぜなら、後者には、リボ核タンパク質およびｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に模倣できない他の交絡因子が含まれるからである。

【0011】

ＤＮＡザイムおよびＭＮＡザイムにより生理学的条件下で効率的に切断されうる長いｍＲＮＡ分子内の部位を選択するうえで、過去に作成された設計ガイドラインが役立つこともあるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用途での有用性に十分な効率でどの基質が切断されるかを予測する能力は、限られている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用途では、当技術分野に存在する限られた基質設計ガイドラインを確立するために一般的にスクリーニングおよび使用される生理学的条件とは非常に異なる条件が必要になることもある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用途に好適な条件でＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイムにより基質が効率的に切断されるかをより強い確信をもって予測する、基質配列に対する一群のガイドラインまたは配列モチーフの必要性が存在する。また、触媒核酸機能の改善を促進する性質を備えた触媒核酸基質の必要性も存在する。これらの性質としては、たとえば、一連の条件にわたり触媒核酸機能の改善を促進する能力および／または多重反応系で同時に検出可能な標的の数を拡大する能力が挙げられうる。

【課題を解決するための手段】

【0013】

効率的な基質配列を一貫して生成する配列モチーフまたは一群の設計ガイドラインを確立すべく多くの試みがなされてきたが、これまでのところ、効果的な配列または一群のガイドラインは、特定されていない。本発明は、新しい効率的に切断される基質の開発を促進した一連の原理を提供する。したがって、本発明は、触媒核酸機能を促進する性質を備えた触媒核酸酵素基質を提供することにより、当技術分野に存在する必要性に対処する。

【0014】

第１の態様では、本発明は、触媒核酸酵素に対する単離されたポリヌクレオチド基質を提供する。前記ポリヌクレオチド基質は、配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５−Ｎ_６−Ｎ_７−Ｎ_８−ｒＲ−ｒＹ−Ｎ_９−Ｎ_１０−Ｎ_１１−Ｎ_１２−Ｎ_１３−Ｎ_１４−Ｎ_１５
（式中、
ｒＲは、プリンリボヌクレオチドであり、
ｒＹは、ピリミジンリボヌクレオチドであり、
Ｎ_１〜Ｎ_１５のそれぞれは、ヌクレオチドであり、
Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち６個以上は、シトシンヌクレオチドであり、かつ
Ｎ_９〜Ｎ_１５のうち３個未満は、グアニンヌクレオチドがある）
を含む。

【0015】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２５〜２７、２９〜３０、３３、７２〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0016】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち７個以上または８個以上は、シトシンヌクレオチドである。

【0017】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_５〜Ｎ_１３のうち７個以上は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２９、７３、７６〜８０、８２〜８３、８５〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0018】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ５〜Ｎ１３のうち８個以上は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号７６、７７、８０、８３、または８７のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0019】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１３のうち７個以上または８個以上は、シトシンヌクレオチドである。

【0020】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１３のうち７個以上は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２７、２９、７３、７６〜８３、８５〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含む。

【0021】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１３のうち８個は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号７６、７７、７９〜８０、８２〜８３、８７、８８、または９０のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0022】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１２のうち６個以上、７個以上、または８個以上は、シトシンヌクレオチドである。

【0023】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１２のうち７個以上は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２７、２９、７３、７６、７７、７９〜８３、８５〜８８、９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0024】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_４〜Ｎ_１２のうち８個は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号７６、７７、８０、８３、８７、または８８のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0025】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_５〜Ｎ_１２のうち６個以上、７個以上、または８個以上は、シトシンヌクレオチドである。

【0026】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_５〜Ｎ_１２のうち７個以上は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２９、７３、７６、７７、８０、８３、８５〜８８、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0027】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_５〜Ｎ_１２のうち８個は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号７６、７７、８０、８３、または８７のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0028】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１、Ｎ_２、Ｎ_８、および／またはＮ_９のいずれか１つ以上は、シトシンヌクレオチドである。

【0029】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_８およびＮ_９は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２５〜２６、２９〜３０、７２〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0030】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_９〜Ｎ_１５のうち２個、１個、または０個は、グアニンヌクレオチドである。

【0031】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_９〜Ｎ_１５のうち１個または０個は、グアニンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２５〜２７、２９〜３０、３３、７２〜８０、８２〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0032】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ９〜Ｎ１５はいずれも、グアニンヌクレオチドではなく、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２５、２６、３０、３３、７２、７５、７７〜８０、８４〜８５、または８９のいずれか１つにより定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0033】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５のうち１０個超、１１個超、１２個超、または１３個超は、ピリミジンヌクレオチドである。

【0034】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５のうち１１個、１２個、または１２超は、ピリミジンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、いずれか１つの配列番号２５〜２７、２９、３３、７３〜９０、または１７３〜１７５により定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0035】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５のうち１３個または１４個は、ピリミジンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、いずれか１つの配列番号７５、７７〜８０、８２〜８５、または８８〜８９により定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0036】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１４のうち８個超、９個超、１０個超、または１１個は、シトシンヌクレオチドである。

【0037】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１４のうち１０個または１１個は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、いずれか１つの配列番号３３、７６〜８０、８２〜８３、８５、８７、８８、または８９により定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0038】

第１の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１４のうち１１個は、シトシンヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド基質は、いずれか１つの配列番号７７〜７９により定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0039】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、ポリヌクレオチド基質を検出するための検出可能標識をさらに含む。

【0040】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、検出可能部分とクエンチャー部分とをさらに含み、検出可能部分により提供される検出可能作用は、前記触媒核酸酵素によるポリヌクレオチド基質の修飾により増大または低減される。

【0041】

第１の態様の一実施形態では、プリンリボヌクレオチドは、グアニンを含む。

【0042】

第１の態様の一実施形態では、ピリミジンリボヌクレオチドは、ウラシルを含む。

【0043】

第１の態様の一実施形態では、前記触媒核酸酵素に結合するポリヌクレオチド基質の部分は、５０℃〜９０℃、５０℃〜６５℃、５０℃〜６０℃、５２℃〜５８℃、６６℃〜７６℃、６８℃〜７６℃、６４℃〜７０℃、７０℃〜７６℃、７０℃〜７５℃、７２℃〜７６℃、５２℃、５８℃、６４℃、６６℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７６℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。

【0044】

第１の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、
（ｉ）多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）、ここで、前記部分は、前記ＭＮＡザイムの少なくとも１つの基質アームに結合する、または
（ｉｉ）ＤＮＡザイム
である。

【0045】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、ＭＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。

【0046】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、ＤＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。

【0047】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、電気化学的方法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、ＵＶ、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せによる検出で検出可能な標識を含む。

【0048】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、蛍光分光法による検出で検出可能な標識を含む。

【0049】

第１の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法による検出で検出可能な標識を含む。

【0050】

第２の態様では、本発明は、触媒核酸酵素に対する単離されたポリヌクレオチド基質を提供する。前記ポリヌクレオチド基質は、配列番号２８により定義される配列を含むかまたはその配列で構成される。

【0051】

第２の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、一対のオリゴヌクレオチドパートザイムを含むＭＮＡザイムであり、前記対は、配列番号１５および８、配列番号９３および９４、または配列番号１１４および１１５を含むかまたはそれらの配列で構成される。

【0052】

第２の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、配列番号１３８により定義される配列を含むまたはその配列で構成されるＤＮＡザイムである。

【0053】

第３の態様では、本発明は、
（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを提供することと、ただし、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第２のオリゴヌクレオチドパートザイムは、前記標的の存在下で自己集合して少なくとも第１の触媒活性多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成する、
（ｂ）第１または第２の態様の単離されたポリヌクレオチド基質を提供することと、ただし、前記ポリヌクレオチド基質は、前記第１のＭＮＡザイムによる修飾が可能であり、前記ＭＮＡザイムによる前記ポリヌクレオチド基質の修飾は、検出可能作用を提供する、
（ｃ）（１）前記少なくとも第１のＭＮＡザイムの自己集合と、
（２）前記少なくとも第１のＭＮＡザイムの触媒活性と、
を可能にする条件下で、前記２つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムと前記標的を推定上含有するサンプルとを接触させることと、
（ｄ）前記検出可能作用を検出することと、
を含む、少なくとも１つの標的の存在を検出する方法を提供する。

【0054】

第３の態様の一実施形態では、標的は、ＭＮＡザイム集合促進剤である。

【0055】

第３の態様の一実施形態では、標的は、核酸である。

【0056】

第３の態様の一実施形態では、標的は、塩基対相補性により前記ＭＮＡザイムの１つ以上のセンサーアームにハイブリダイズする核酸である。

【0057】

第３の態様の一実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレもしくはプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0058】

第３の態様の一実施形態では、核酸は、増幅される。

【0059】

第３の態様の一実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうち１つ以上を含む。

【0060】

第３の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、５０℃〜９０℃、５０℃〜６５℃、５０℃〜６０℃、５２℃〜５８℃、６６℃〜７６℃、６８℃〜７６℃、６４℃〜７０℃、７０℃〜７６℃、７０℃〜７５℃、７２℃〜７６℃、５２℃、５８℃、６４℃、６６℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７６℃の温度で前記ＭＮＡザイムの基質アームにハイブリダイズする。

【0061】

第３の態様の一実施形態では、本方法は、
（ａ）異なる標的の存在下で自己集合して第２の触媒活性ＭＮＡザイムを形成可能な２つ以上の追加のオリゴヌクレオチドパートザイムと、
（ｂ）少なくとも１つの追加のポリヌクレオチド基質と、
を提供することをさらに含む。ただし、前記追加のポリヌクレオチド基質は、前記異なる標的の存在下で前記第２のＭＮＡザイムによる修飾が可能である。

【0062】

第３の態様の一実施形態では、追加のポリヌクレオチド基質は、前記第１のＭＮＡザイムによる修飾が可能でない。

【0063】

第３の態様の一実施形態では、パート（ｄ）での検出は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、電気化学的方法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、ＵＶ、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せの使用を含む。

【0064】

第３の態様の一実施形態では、パート（ｄ）での検出は、蛍光分光法の使用を含む。

【0065】

第３の態様の一実施形態では、パート（ｄ）での検出は、ＦＲＥＴ検出可能作用の検出を含む。

【0066】

第３の態様の一実施形態では、前記ＭＮＡザイムの触媒コアは、ＤＮＡまたはそのアナログを含む。

【0067】

第４の態様では、本発明は、触媒核酸酵素に対する基質として第１または第２の態様の単離されたポリヌクレオチド基質の使用を提供する。

【0068】

第４の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）であり、
前記ＭＮＡザイムは、少なくとも２つ以上のオリゴヌクレオチドパートザイムを含み、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドパートザイムおよび第２のオリゴヌクレオチドパートザイムは、ＭＮＡザイム集合促進剤の存在下で自己集合して触媒活性多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成し、前記少なくとも第１および前記第２のオリゴヌクレオチドパートザイムのそれぞれは、基質アーム部分と、触媒コア部分と、センサーアーム部分と、を含み、
自己集合すると、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムのセンサーアーム部分は、ＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムの基質アーム部分は、ＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムの触媒コア部分は、ＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームは、第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムを近接して維持してそれらのそれぞれの触媒コア部分の会合によりＭＮＡザイムの触媒コアを形成するように、前記ＭＮＡザイム集合促進剤と相互作用し、前記触媒コアは、前記ポリヌクレオチド基質の修飾が可能であり、前記ＭＮＡザイムの前記基質アームは、前記ＭＮＡザイムの前記触媒コアが前記ポリヌクレオチド基質を修飾できるように、前記ポリヌクレオチド基質に結合する。

【0069】

第３または第４の態様の一実施形態では、それぞれの前記オリゴヌクレオチドパートザイムの触媒コア部分は、ＤＮＡまたはそのアナログを含む。

【0070】

第４の態様の一実施形態では、集合促進剤は、同定、検出、または定量される標的である。

【0071】

第３または第４の態様の一実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムは、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１６および配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５、配列番号４６および配列番号４５、配列番号４７および配列番号６３、配列番号４８および配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１、配列番号５２および配列番号５１、配列番号３８および配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７、配列番号５８および配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１、配列番号６２および配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５、配列番号６６および配列番号６７、配列番号６２および配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０、配列番号４６および配列番号５５、配列番号４６および配列番号５９、配列番号３８および配列番号４５、配列番号５８および配列番号４５、配列番号６２および配列番号４５、配列番号４６および配列番号６３、配列番号７１および配列番号６８、配列番号９８および配列番号９９、配列番号１００および配列番号１０３、配列番号１０４および配列番号１０５、配列番号１０６および配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９、配列番号１１０および配列番号１１１、配列番号１１２および配列番号１１３、配列番号１１６および配列番号１１７、配列番号１１８および配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１、配列番号１２２および配列番号１１９、配列番号１５５および配列番号１５６、配列番号１５７および配列番号１５８、配列番号１５９および配列番号１６０、配列番号１６８および配列番号１６９、配列番号１７９および配列番号１８０、配列番号１８１および配列番号１８２、配列番号１８３および配列番号１８４、または配列番号１８５および配列番号１８６により定義されるそれぞれの配列を含む。

【0072】

第３または第４の態様の一実施形態では、前記オリゴヌクレオチド基質ならびに前記第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムは、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される配列の組合せにより定義される。

【0073】

第４の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、ＤＮＡザイムであり、ＤＮＡザイムおよびオリゴヌクレオチド基質は、表１５に示される配列の組合せにより定義される。

【0074】

第４の態様の一実施形態では、標的は、塩基対相補性により前記ＭＮＡザイムの１つ以上のセンサーアームにハイブリダイズする核酸である。

【0075】

第４の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、５０℃〜９０℃、５０℃〜６５℃、５０℃〜６０℃、５２℃〜５８℃、６６℃〜７６℃、６８℃〜７６℃、６４℃〜７０℃、７０℃〜７６℃、７０℃〜７５℃、７２℃〜７６℃、５２℃、５８℃、６４℃、６６℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７６℃の温度で前記触媒核酸酵素にハイブリダイズする。

【0076】

第５の態様では、本発明は、第１または第２の態様の単離されたポリヌクレオチド基質を含むキットを提供する。

【0077】

第５の態様の一実施形態では、キットは、前記ポリヌクレオチド基質の触媒修飾が可能な触媒核酸酵素をさらに含む。

【0078】

第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）である。

【0079】

第６の態様では、本発明は、第１または第２の態様の単離されたポリヌクレオチド基質と、少なくとも１つの標的の検出が可能な多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を集合するように設計された複数のオリゴヌクレオチドパートザイムと、を含むキットを提供する。ただし、前記ＭＮＡザイムは、ポリヌクレオチド基質の触媒修飾が可能である。

【0080】

第６の態様の一実施形態では、前記オリゴヌクレオチド基質および前記複数のオリゴヌクレオチドパートザイムは、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される配列の組合せにより定義される。

【0081】

第７の態様では、本発明は、第１または第２の態様のポリヌクレオチド基質に結合された固体担体を含む集合体を提供する。

【0082】

第１または第３〜第７の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５のうちいずれか１個以上は、デオキシリボヌクレオチドである。

【0083】

第１または第３〜第７の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５のうちいずれか１個以上は、リボヌクレオチドである。

【0084】

第１または第３〜第７の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５はすべて、デオキシリボヌクレオチドである。

【0085】

第１または第３〜第７の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５はすべて、リボヌクレオチドである。

【0086】

第１または第３〜第７の態様の一実施形態では、Ｎ_１〜Ｎ_１５は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物を含む。

【0087】

第７の態様の一実施形態では、集合体は、複数の異なるポリヌクレオチド基質に結合された複数の異なる固体担体を含む。

【0088】

第１、第２、第４、または第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、ＤＮＡザイムである。

【0089】

第１、第２、第４、または第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、リボザイムである。

【0090】

第１、第２、第４、または第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）である。

【0091】

以上の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、切断によるポリヌクレオチド基質の修飾が可能である。

【0092】

第１、第２、または第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムを含むＭＮＡザイムであり、前記オリゴヌクレオチド基質および前記第１および第２のオリゴヌクレオチドパートザイムは、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される配列の組合せにより定義される。

【0093】

第１、第２、または第５の態様の一実施形態では、触媒核酸酵素は、ＤＮＡザイムであり、ＤＮＡザイムおよびオリゴヌクレオチド基質は、表１５に示される配列の組合せにより定義される。

【0094】

第１、第２、または第５の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、相補的塩基対合により前記触媒核酸酵素にハイブリダイズすることが可能である。

【0095】

第４の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、相補的塩基対合により前記触媒核酸酵素にハイブリダイズする。

【0096】

第３および第４の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、相補的塩基対合により前記ＭＮＡザイムにハイブリダイズする。

【0097】

第１、第２、第５、および第６の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質ポリヌクレオチド基質は、相補的塩基対合により前記ＭＮＡザイムにハイブリダイズすることが可能である。

【0098】

以上の態様の一実施形態では、単離されたポリヌクレオチド基質の部分は、前記ＭＮＡザイムの少なくとも１つの基質アームに結合する。

【0099】

以上の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、１つ超の異なるタイプの触媒核酸酵素による結合および触媒修飾が可能なユニバーサル基質である。

【0100】

以上の態様の一実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、１つ超の異なるタイプの多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）による結合および触媒修飾が可能なユニバーサル基質である。

【0101】

以上の態様の一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドパートザイム、集合促進剤、または基質の少なくとも１つは、ＤＮＡまたはそのアナログを含む。

【0102】

第３および第６の態様の一実施形態では、修飾は、ＭＮＡザイムによるポリヌクレオチド基質の切断である。

【0103】

次に、単なる例にすぎないが、添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を説明する。

【図面の簡単な説明】

【0104】

【図1】図１は、多成分核酸（ＭＮＡザイム）の例示的設計を示す図である。例示的開示によれば、ＭＮＡザイムは、２つのオリゴヌクレオチド成分（パートザイムＡおよびパートザイムＢ）を含み、これらは、集合促進剤の存在下で自己集合する。集合促進剤の存在下で２つのパートザイムが集合した時、基質の修飾（たとえば切断またはライゲーション）が可能な触媒活性ＭＮＡザイムを形成する。二成分パートザイムは、（ｉ）集合促進剤に結合するセンサーアームと、（ｉｉ）基質に結合する基質アームと、（ｉｉｉ）部分的触媒コア配列と、を有する。集合促進剤分子（たとえば標的核酸配列）の存在は、変調に適したきわめて特異的な方式でパートザイム成分の集合を誘導する「入力」シグナルを提供する。いくつかの実施形態では、集合促進剤は、たとえば、試験サンプル中に存在する標的核酸配列でありうる。他の実施形態では、集合促進剤は、たとえば、検出可能な要素またはイベントの存在下でパートザイム成分の自己集合を誘導するように環境中に組み込まれた合成オリゴヌクレオチドでありうる。集合ＭＮＡザイムによる基質の修飾により、検出および／または定量されうる「検出可能作用」を提供可能である。たとえば、基質をフルオロフォア（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）で二重標識した場合、この「レポーター基質」が活性ＭＮＡザイムにより切断されると、フルオロフォアとクエンチャーとが分離され、それに付随して蛍光の増加がもたらされる。

【図2】図２は、ＭＮＡザイムを用いた標的検出方法の例示的用途を示すフロー図を提供する。ＭＮＡザイムは、（１）直接的検出、（２）標的増幅中または標的増幅後のいずれかで、たとえば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、またはＮＡＳＢＡにより産生されたアンプリコンの検出、および（３）シグナル増幅カスケードの開始に使用可能である。

【図3】図３は、例示的ＭＮＡザイムの描画図および担体にテザー連結された基質を切断するＭＮＡザイムを用いた標的検出方法を提供する。この実施形態では、ＭＮＡザイムは、集合促進剤（標的）の存在下でのみ形成される。ＭＮＡザイムがフルオロフォアとクエンチャーとの間のテザー連結基質を切断した時、シグナルが発生される。ここに示されるように、フルオロフォアＦとクエンチャーＱとの間で切断すると、蛍光増加が得られる。一般的には、本方法は、切断が起こった後でフルオロフォアＦまたはクエンチャーＱのいずれかが担体に装着された状態を維持しうるように設計されうる。パネル（ｉ）：示された担体は、それにテザー連結された１つの基質タイプ（基質１）のみを有する。パネル（ｉｉ）：異なる位置でテザー連結された複数の基質タイプが存在しうる。各基質は、特異的ＭＮＡザイム集合促進剤分子の存在下で形成されるＭＮＡザイムによってのみ切断可能であり、ここでは、標的１および２は、それぞれ、ＭＮＡザイム１および２の自己集合を促進する。したがって、この例では、標的１の存在下でＭＮＡザイム１のみが自己集合して基質１のみを切断する。同様に、標的２の存在下でＭＮＡザイム２のみが自己集合して基質２のみを切断する。表面上に基質を配置することによりシグナルを局在化することが可能であるので、異なる集合促進剤の特異的検出が可能になる。パネル（ｉｉ）の例示的アッセイは、２つの識別可能な基質配列を必要とする。

【図4】図４は、ＭＮＡザイム集合促進剤成分として触媒修飾基質産物を使用する例示的アッセイを示している。この戦略では、開始ＭＮＡザイム（Ｍｔ）は、標的（Ｔ）の存在下で形成される。開始ＭＮＡザイム（Ｍｔ）は、第１の基質（Ｓ１）を切断して第１の集合促進剤成分（Ｓ１ｆ）を形成し、これは、第１のカスケードＭＮＡザイム（カスケードＭＮＡザイムＭｃ１）の形成を誘導する。この例では、第１のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ１）は、２つのパートザイムと、Ｆ１、Ｆ２、およびＳ１ｆと称される３つの集合促進剤成分と、を含む。Ｍｃ１は、追加の基質（Ｓ２）を切断可能であるので、追加の集合促進剤成分（Ｓ２ｆ）を遊離し、これは、第２のカスケードＭＮＡザイム（カスケードＭＮＡザイムＭｃ２）の形成を誘導する。この例では、第２のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ２）は、２つのパートザイムと、Ｆ３、Ｆ４、およびＳ２ｆと称される３つの集合促進剤成分と、を含む。次いで、Ｍｃ２は、第１の基質（Ｓ１）をさらに切断可能であるので、第１の集合促進剤成分（Ｓ１ｆ）がさらに形成される。これは、さらなる第１のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ１）の形成をもたらすことにより、増幅カスケードを形成する。この例示的アッセイは、２つの識別可能な基質配列を必要とする。

【図5】図５は、ヒトＴＦＲＣ遺伝子の検出のために一連の異なるユニバーサル基質を用いてＭＮＡザイムｑＰＣＲにより生成されたＣｔ値を示すグラフを提供する。反応に使用したユニバーサル基質が何であるかは、ｘ軸上に示される（ここで、「２」はＳｕｂ２を意味し、「３」はＳｕｂ３を意味し、以下同様である）。すべての反応に対して同一のプライマーセットおよびゲノムＤＮＡを使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的センサー領域および触媒ドメインを有していた。反応間で唯一の異なる点は、パートザイムの基質センサーアームおよび蛍光標識ユニバーサル基質であった。したがって、反応間のＣｔ値の差は、ユニバーサル基質の切断効率に相関付けられる。より低いＣｔ値は、より少ないサイクル数で蛍光の閾値レベルに達することを示すので、より効率的に切断されるユニバーサル基質であることを示す。

【図6】図６は、等温方式で一連のユニバーサル基質のＭＮＡザイム媒介切断から得られるシグナル対ノイズ比を示すグラフを提供する。標的は、合成オリゴヌクレオチドであった。シグナル対ノイズ比は、一連の反応温度で切断反応中に収集された規格化蛍光データから計算した。反応に使用したユニバーサル基質が何であるかは、ｘ軸上に示される（ここで、「２」はＳｕｂ２を意味し、「３」はＳｕｂ３を意味し、以下同様である）。図６（ｉ）では、異なる棒のデータは、異なる反応温度（凡例に５２℃、５４℃、５６℃、および５８℃で示される）での結果を意味する。図６（ｉ）は、ｙ軸上にシグナル対ノイズ比を示す。図６（ｉｉ）は、試験したすべての４つの温度からのシグナル対ノイズ比の平均の標準偏差を示し、異なるシリーズの基質は、異なるシェーディングの棒により示される。

【図7A】図７は、一連のヒト遺伝子の検出のために一連の異なるユニバーサル基質を用いてＭＮＡザイムｑＰＣＲにより生成された線形増幅プロットを示すグラフを提供する。基質と標的との各組合せをａ）５２℃またはｂ）５８℃のアニーリング温度で試験した。各遺伝子を用いて試験したユニバーサル基質は、各プロットの左上に位置する記号により示されており、（ｉ）ＣＹＰ２Ｃ９を用いてＳｕｂ３およびＳｕｂ６１、（ｉｉ）ＴＰ５３を用いてＳｕｂ６、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、およびＳｕｂ７９、（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍを用いてＳｕｂ６０、Ｓｕｂ６１、およびＳｕｂ７９、（ｉｖ）ＨＭＢＳを用いてＳｕｂ４９およびＳｕｂ７５、（ｖ）ＴＦＲＣを用いてＳｕｂ２、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ８０、ならびに（ｉｖ）ＲＰＬ１３ａを用いてＳｕｂ５５、Ｓｕｂ８０、およびＳｕｂ８８であった。それぞれ異なる遺伝子を用いたすべての反応に対して同一のプライマーセットおよびゲノムＤＮＡを使用した。また、すべてのパートザイムは、特定の遺伝子にマッチした同一の触媒ドメインおよび標的センサー領域を有していた。反応間で唯一の異なる点は、パートザイムの基質センサーアームおよび蛍光標識ユニバーサル基質であった。したがって、同一の遺伝子に対する反応間の増幅プロットの形状およびＣｔ値の差は、ユニバーサル基質の切断効率に相関付けられる。より急勾配の曲線およびより早期のＣｔ値は、より少ないサイクル数で閾値蛍光に達することを示すので、より効率的に切断されるユニバーサル基質であることを示す。

【図7B】図７Ａ参照。

【図8】図８は、等温方式で一連のユニバーサル基質のＤＮＡザイム媒介切断から得られるシグナル対ノイズ比を示すグラフを提供する。シグナル対ノイズ比は、一連の反応温度で切断反応中に収集された規格化蛍光データから計算した。反応に使用したユニバーサル基質が何であるかは、ｘ軸上に示される（ここで、「２」はＳｕｂ２を意味し、「３」はＳｕｂ３を意味し、以下同様である）。図８（ｉ）では、異なる棒のデータは、異なる反応温度（凡例に５０℃〜６０℃で示される）での結果を意味し、ｙ軸上にシグナル対ノイズ比が示される。図８（ｉｉ）では、データの棒は、試験したすべての６つの温度からのシグナル対ノイズ比の平均の標準偏差を意味し、異なるシリーズの基質は、異なるシェーディングの棒により示される。

【図9A】図９は、ヒトＲＰＬ１３ａ遺伝子の検出のためにサブセットのパートザイム（基質センサーアームがＳｕｂ４４、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ７４に相補的になるように設計された）を用いて非特異的切断活性を調べるべく一連の異なるユニバーサル基質（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ７４）を用いて行われたＭＮＡザイムｑＰＣＲからの線形増幅プロットを示すグラフを提供する。他の基質に十分な相補性で結合するように設計されたパートザイム対を用いて各ユニバーサル基質を個別に試験し、シグナルが検出可能であるかを調べた。（ｉ）Ｓｕｂ７２、（ｉｉ）Ｓｕｂ７４、（ｉｉｉ）Ｓｕｂ５５、および（ｉｖ）Ｓｕｂ４４に相補的なパートザイムをすべての基質で試験した。パネル（ａ）では、表の下端の行は、実験でパートザイムが十分な相補性を呈する基質を示す。表の他の行は、各実験で試験した他の基質の配列のアライメントを示し、下端の基質と他の基質との配列差は、灰色および下線付きの文字により示される。パネル（ｂ）では、線形増幅プロットが示される。サイクル数（ｘ軸）に対して規格化蛍光（ｙ軸）がプロットされる。増幅曲線が各基質に対応することを示すために、個々の増幅曲線には、プロットの右側に表示が付されている。閾値蛍光は、ｘ軸の上の水平実線により示される。閾値蛍光を超えて増大するシグナルは、ユニバーサル基質の切断を示す。

【図9B】図９Ａ参照。

【図10】図１０は、等温方式で他の基質に十分な相補性で結合するように設計されたＤＮＡザイムを用いて各ユニバーサル基質のＤＮＡザイム媒介切断から得られるシグナル対ノイズ比を個別に示すグラフを提供する。規格化シグナル対ノイズ比は、（ｉ）５２℃または（ｉｉ）５８℃の反応温度で収集された規格化蛍光データから計算した。反応に使用したユニバーサル基質が何であるかは、ｘ軸上に示される。異なる棒のデータは、凡例に示される各ＤＮＡザイムでの切断結果を意味し、ｙ軸上にシグナル対ノイズ比が示される。

【図11】図１１は、２つの多重ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応、すなわち、シリーズ１の基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、Ｓｕｂ４、Ｓｕｂ６、およびＳｕｂ７）を用いた多重方式１と、シリーズ２および３の基質（Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７９、およびＳｕｂ８０）を用いた多重方式２と、に対して、５２℃（パネル（ｉ））または５８℃（パネル（ｉｉ））のいずれかで増幅により生成された指数関数的増幅プロットを示している。両方の多重方式により、単一の反応槽内でヒト遺伝子ＴＦＲＣ、ＨＰＲＴ、ＴＰ５３、ＲＰＬ１３ａ、およびＣＹＰ２Ｃ９を測定した。２つの多重方式で測定されるそれぞれの異なる遺伝子に対して、両方の温度でかつすべてのユニバーサル基質で同一のプライマーセットおよびゲノムＤＮＡを使用した。また、すべてのパートザイムは、特定の遺伝子にマッチした同一の触媒ドメインおよび標的センサー領域を有していた。反応間の唯一の差は、パートザイムの基質センサーアームおよび蛍光標識ユニバーサル基質であった。各遺伝子を用いて試験したユニバーサル基質は、各プロットの左上に示される。２つの異なるＤＮＡ濃度、すなわち、１００ｎｇ（左側の×印および○印のプロット）および３９１ｐｇ（右側の×印および○印のプロット）で、２つの多重方式間の直接比較を可能にするために、多重方式１（×印）および多重方式２（○印）の増幅プロットを重ね合わせた。増幅プロットの形状の差は、ユニバーサル基質の切断効率に相関付けられた。より急勾配の曲線およびより早期のＣｔ値は、より少ないサイクル数で閾値蛍光に達することを示すので、より効率的に切断されるユニバーサル基質であることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0105】

定義
本明細書では、以下に示される意味を有するものとする特定の用語が用いられる。

【0106】

本明細書で用いられる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、複数形の参照語を包含する。たとえば、「ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ポリヌクレオチド基質）」という用語は、複数のポリヌクレオチド基質をも包含する。

【0107】

「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という用語は、「必ずしも〜のみを含むというわけではなく、主に〜を含む」ということを意味する。さらに、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という単語の変化形、たとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を含む）」などは、変化形に対応する意味を有する。

【0108】

挙げられた数値に関して本明細書での「約」という用語の使用は、挙げられた１つおよび複数の数値が挙げられた値の±１０パーセント以内にあるものを包含する。

【0109】

数値の範囲を参照する場合の本明細書での「〜」という用語の使用は、範囲の各端点の数値を包含する。たとえば、１０ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドは、１０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドと２０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドとを包含する。

【0110】

「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド塩基および／もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖のポリマー、および／またはそれらのアナログ、誘導体、変異体、断片、もしくは組合せを意味し、限定されるものではないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレもしくはプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組合せを包含する。限定されるものではないが、例として、核酸源は、合成源、哺乳動物源、ヒト源、動物源、植物源、菌類源、細菌源、ウイルス源、古細菌源、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。

【0111】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、ＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有核酸分子、またはＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ含有分子、またはそれらの組合せのセグメントを意味する。したがって、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基および／もしくはリボヌクレオチド塩基、あるいは／またはそれらのアナログ、誘導体、変異体、断片、もしくは組合せを含むかまたはそれらで構成されうるし、限定されるものではないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレもしくはプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組合せを包含しうる。オリゴヌクレオチドの例としては、核酸標的、基質、たとえば、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有するＤＮＡザイムまたはＭＮＡザイムにより修飾可能なもの、プライマー、たとえば、ＰＣＲなどの方法によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標的増幅に使用されるもの、およびＭＮＡザイムの成分、たとえば、限定されるものではないが、パートザイム、ならびに集合促進剤が挙げられる。

【0112】

「ピリミジンヌクレオチド」という用語は、限定されるものではないが、シトシン、チミン、およびウラシルをはじめとするピリミジン塩基を含む任意のヌクレオチドを包含する。ピリミジンヌクレオチドは、リボース糖分子（つまり「ピリミジンリボヌクレオチド」）またはデオキシリボース糖分子（つまり「ピリミジンデオキシリボヌクレオチド」）を含みうる。

【0113】

「プリンヌクレオチド」という用語は、限定されるものではないが、アデニンおよびグアニンをはじめとするプリン塩基を含む任意のヌクレオチドを包含する。プリンヌクレオチドは、リボース糖分子（つまり「プリンリボヌクレオチド」）またはデオキシリボース糖分子（つまり「プリンデオキシリボヌクレオチド」）を含みうる。

【0114】

「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、少なくとも１つの基質に結合して少なくとも１つの基質の修飾（たとえばライゲーションまたは切断）を触媒しうる、ＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有の分子もしくは複合体、あるいはＲＮＡ分子またはＲＮＡ含有の分子もしくは複合体、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの分子または複合体であるそれらの組合せを意味するものとする。触媒核酸中のヌクレオチド残基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、さらにはそれらの誘導体およびアナログを含みうる。以上の用語は、少なくとも１つの基質を認識して少なくとも１つ基質の修飾（たとえばライゲーションまたは切断）を触媒しうる、単一のＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有分子（当技術分野では、「ＤＮＡ酵素」、「デオキシリボザイム」、もしくは「ＤＮＡザイム」としても知られる）、またはＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ含有分子（当技術分野では、「ＲＮＡ酵素」もしくは「リボザイム」としても知られる）、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子であるそれらの組合せを含みうる単分子核酸酵素を包含する。以上の用語は、少なくとも１つの基質を認識して少なくとも１つ基質の修飾（たとえばライゲーションまたは切断）を触媒しうる、ＤＮＡ複合体もしくはＤＮＡ含有複合体、またはＲＮＡ複合体もしくはＲＮＡ含有複合体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体であるそれらの組合せを含む核酸酵素を包含する。「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、および「触媒核酸酵素」という用語は、それらの意味の範囲内にＭＮＡザイムを包含する。

【0115】

本明細書で用いられる「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語は、同一の意味を有し、ＭＮＡザイム集合促進剤（たとえば標的）の存在下でのみ基質の触媒修飾が可能な活性核酸酵素を形成する２つ以上のオリゴヌクレオチド配列（たとえばパートザイム）を意味する。ＭＮＡザイムは、基質の切断、基質のライゲーション、および１つまたは複数の基質の他の酵素修飾をはじめとするある範囲内の反応を触媒可能である。切断活性を有するパートザイムＡとパートザイムＢとを含む例示的ＭＮＡザイムを図１に示す。エンドヌクレアーゼ活性または切断活性を有するＭＮＡザイムはまた、「ＭＮＡザイムクリーバー」としても知られる。図１を参照して、パートザイムＡおよびＢは、それぞれ、ワトソン・クリック塩基対合により集合促進剤（たとえば、標的のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）に結合する。パートザイムＡおよびＢのセンサーアームが集合促進剤上で互いに近接してハイブリダイズした時のみ、ＭＮＡザイムが形成される。ＭＮＡザイムの基質アームは、基質に結合し、その修飾（たとえば切断）は、パートザイムＡおよびＢの触媒ドメインの相互作用により形成されるＭＮＡザイムの触媒コアにより触媒される。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラレポーター基質の切断を図に示す。ＭＮＡザイムは、フルオロフォアとクエンチャーとの色素対間で基質を切断するので、シグナルを発生する。「多成分核酸酵素」および「ＭＮＡザイム」という用語は、２つの分子を含むバイパータイト構造、または３つの核酸分子を含むトリパータイト構造、または他のマルチパータイト構造、たとえば、４つ以上の核酸分子により形成されるものを包含する。

【0116】

本明細書で用いられる「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語が、ＰＣＴ国際公開第２００７／０４１７７４号パンフレット、国際公開第２００８／０４００９５号パンフレット、国際公開第２００８／１２２０８４号パンフレット、または関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号明細書、同第２０１０−０１３６５３６号明細書、および同第２０１１−０１４３３３８号明細書（これらの各文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つ以上に開示されるものを含めて、すべての公知のＭＮＡザイムおよび修飾ＭＮＡザイムを包含することは、理解されよう。「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語に包含されるＭＮＡザイムおよび修飾ＭＮＡザイムの例としては、切断触媒活性を有するＭＮＡザイム（本明細書に例示される）、１つ以上の集合阻害剤を含む脱集合ＭＮＡザイムまたは部分集合ＭＮＡザイム、１つ以上のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタＭＮＡザイム」）、１つ以上のトランケートセンサーアームと任意選択で１つ以上の安定化オリゴヌクレオチドとを含むＭＮＡザイム、１つ以上の活性阻害剤を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）、およびリガーゼ触媒活性を有するＭＮＡザイム（「ＭＮＡザイムリガーゼ」）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは、それぞれ、国際公開第２００７／０４１７７４号パンフレット、国際公開第２００８／０４００９５号パンフレット、国際公開第２００８／１２２０８４号パンフレット、米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号明細書、米国特許出願公開第２０１０−０１３６５３６号明細書、および／または米国特許出願公開第２０１１−０１４３３３８号明細書の１つ以上に詳細に記載されている。

【0117】

本明細書で用いられる場合、「パートザイム」、「成分パートザイム」、「パートザイム成分」、「成分オリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド成分」、および「オリゴヌクレオチドパートザイム」という用語は、ＤＮＡ含有またはＲＮＡ含有またはＤＮＡ−ＲＮＡ含有のオリゴヌクレオチドであって、その２つ以上が、本明細書に定義されるＭＮＡザイム集合促進剤の存在下でのみ、一緒になって「ＭＮＡザイム」を形成可能なものを意味する。特定の好ましい実施形態では、１つ以上、好ましくは少なくとも２つの成分パートザイムは、３つの領域またはドメイン、すなわち、修飾を触媒する触媒コアの部分を形成する「触媒」ドメインと、集合促進剤に会合および／または結合しうる「センサーアーム」ドメインと、基質に会合および／または結合しうる「基質アーム」ドメインと、を含みうる。これらの領域またはドメインの説明図を図１に示す。パートザイムは、限定されるものではないが、アプタマーをはじめとする少なくとも１つの追加成分を含みうる。本明細書では、「アプタパートザイム」として参照される。パートザイムは、限定されるものではないが、トランケートセンサーアームを有するパートザイム成分、および集合促進剤または基質のいずれかと相互作用することによるＭＮＡザイム構造を安定化する安定化アーム成分を含めて、複数の成分を含みうる。

【0118】

本明細書で用いられる「集合促進剤分子」、「集合促進剤」、「ＭＮＡザイム集合促進剤分子」、および「ＭＮＡザイム集合促進剤」という用語は、ＭＮＡザイムのセンサーアームとの相互作用により成分パートザイムの自己集合を促進して触媒活性ＭＮＡザイムを形成可能な要素を意味する。本明細書で用いられる場合、集合促進剤は、切断活性、リガーゼ活性、または他の酵素活性を有するＭＮＡザイムの集合体を促進しうる。好ましい実施形態では、集合促進剤は、ＭＮＡザイムの自己集合に必要とされる。集合促進剤は、１つの分子を含みうるか、または１つ以上のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームに対合もしくは結合しうる２つ以上の「集合促進剤成分」を含みうる。集合促進剤は、標的でありうる。標的は、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレもしくはプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸でありうる。核酸は、増幅されうる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅、ループ媒介等温増幅、ローリングサークル増幅、転写媒介増幅、自己保持配列複製、リガーゼ連鎖反応、核酸配列ベース増幅、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の１つ以上を含みうる。

【0119】

「集合促進剤成分」は、活性ＭＮＡザイムの集合の制御または不活性ＭＮＡザイム成分から活性ＭＮＡザイムへの遷移の促進に使用可能な分子である。

【0120】

本明細書で用いられる「標的」という用語は、追加の増幅工程および／またはカスケードを用いてまたは用いずに、ＭＮＡザイムなどの特定の核酸酵素を使用する方法により、検出、同定、または定量される対象となる任意の天然または合成の要素、成分、またはアナライトを包含する。したがって、標的は、高感度の検出、同定、および／または定量の方法が望まれる、最も広範囲の検出可能な要素、成分、またはアナライトを含む。いくつかの例示的標的としては、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、生物体、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、酵母、菌類、抗体、代謝物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の標的もまた、ここで使用されると考えられる。また、標的が集合促進剤または集合促進剤成分でありうることは、理解されよう。

【0121】

「検出可能作用」とは、基質の修飾が起こった指標として検出または定量が可能な作用のことである。作用の大きさは、集合促進剤（たとえば標的）などの入力の量の指標となりうる。検出可能作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、ＵＶ、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せを含めて、さまざまな方法により検出されうる。

【0122】

本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド基質」および「基質」という用語は、触媒核酸酵素をはじめとする酵素による認識、作用、または修飾が可能な、デオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の任意の一本鎖もしくは二本鎖のポリマー、またはそれらのアナログ、誘導体、変異体、断片、もしくは組合せを包含し、限定されるものではないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレもしくはプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、またはそれらの任意の組合せ（デオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との混合ポリマーを含む）を包含する。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」は、限定されるものではないが、切断またはライゲーションを含めて、種々の酵素活性により修飾されうる。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」の修飾は、酵素の触媒活性をモニターすべく「検出可能作用」を提供しうる。

【0123】

本明細書で用いられる「レポーター基質」とは、触媒反応に関連する基質の消失または産物の出現のいずれかの測定を促進するようにとくに適合化された基質のことである。
レポーター基質は、溶解状態で遊離しうるか、またはたとえば、表面もしくは他の分子に結合（または「テザー連結」）されうる。レポーター基質は、たとえば、フルオロフォア（クエンチャーなどの１つ以上の追加成分を含むかまたは含まない）、放射性標識、ビオチン（たとえばビオチン化）、または化学発光標識を含めて、多種多様な手段のいずれかにより標識可能である。

【0124】

本明細書で用いられる場合、「ジェネリック基質」または「ユニバーサル基質」とは、それぞれ異なる集合促進剤を認識可能な複数のＭＮＡザイムにより認識されて触媒作用を受ける基質たとえばレポーター基質のことである。そのような基質の使用は、すべてユニバーサル基質を認識する構造的に関連付けられたＭＮＡザイムを用いて多種多様な集合促進剤の検出、同定、または定量を行う個別のアッセイの開発を促進する。これらのユニバーサル基質は、それぞれ独立して、１つ以上の標識で標識可能である。好ましい実施形態では、独立して検出可能な標識を用いて１つ以上のユニバーサル基質を標識することにより、ＭＮＡザイムを用いてさまざまな集合促進剤を独立してまたは同時に検出するのに便利な系の作製が可能になる。いくつかの実施形態では、ＭＮＡザイムリガーゼまたはＤＮＡザイムリガーゼを用いて、ＭＮＡザイムにより切断された基質を再構成することにより、再使用することが可能である。いくつかの実施形態では、ＭＮＡザイムにより切断またはライゲートされた基質を、追加のＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイムの成分または変調剤としてさらに使用することが可能である。

【0125】

いくつかの実施形態では、「ユニバーサル基質」を固体担体の異なる位置にテザー連結して、基質アレイを提供しうる。そのような実施形態では、テザー連結ユニバーサル基質はすべて、同一のフルオロフォアで標識されうる。特定の場合には、特異的ＭＮＡザイム集合促進剤分子の存在下で形成されたＭＮＡザイムによってのみ、各ユニバーサル基質を切断することが可能であり、表面上に基質を配置することによりシグナルを局在化させることが可能であるので、異なる集合促進剤の特異的検出が可能になる。

【0126】

「産物」という用語は、基質の酵素修飾の結果として産生される１つまたは複数の新しい分子を意味する。本明細書で用いられる場合、「切断産物」という用語は、酵素により切断活性またはエンドヌクレアーゼ活性の結果として産生される新しい分子を意味する。「ライゲーション産物」という用語は、酵素により基質のライゲーションの結果として産生される新しい分子を意味する。

【0127】

本明細書で用いられる場合、本発明に係るポリヌクレオチド基質に関連する「融解温度」および「Ｔｍ」という用語の使用は、とくに別段の指示がないかぎり、ウォーレス則すなわちＴｍ＝２℃（Ａ＋Ｔ）＋４℃（Ｇ＋Ｃ）を用いて計算される融解温度（Ｔｍ）を意味すると理解されるものとする（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６（１１）：３５４３−３５５８を参照されたい）。

【0128】

本明細書で用いられる場合、「塩基」という用語は、塩基が装着されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドをすべて包含すると理解されるものとする。

【0129】

略号
ここではおよび本明細書全体を通じて、以下の略号が用いられる。
ＭＮＡザイム：多成分核酸酵素またはマルチパータイト核酸酵素、
ＤＮＡザイム：デオキシリボ核酸酵素、
リボザイム：リボ核酸酵素、
パートザイム：オリゴヌクレオチドを含有する部分酵素、
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、
ｑＰＣＲ：リアルタイム定量ＰＣＲ、
ＮＦ−Ｈ_２Ｏ：ヌクレアーゼフリー水、
ＬＮＡ：ロックド核酸、
Ｆ：フルオロフォア、
Ｑ：クエンチャー、
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ／Ｕ、Ｇ、またはそれらの任意のアナログ、
Ｎ’＝Ｎに相補的なまたはＮに塩基対合可能な任意のヌクレオチド、
（Ｎ）ｘ：任意の数のＮ、
（Ｎ’）ｘ：任意の数のＮ’、
Ｗ：ＡまたはＴ、
Ｒ：Ａ、Ｇ、またはＡＡ、
ｒＮ：任意のリボヌクレオチド、
（ｒＮ）ｘ：任意の数のｒＮ、
ｒＲ：ＡまたはＧのリボヌクレオチド、
ｒＹ：ＣまたはＵのリボヌクレオチド、
Ｍ：ＡまたはＣ、
Ｈ：Ａ、Ｃ、またはＴ／Ｕ、
Ｄ：Ｇ、Ａ、またはＴ／Ｕ、
ＪＯＥまたは６−ＪＯＥ：６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、
ＦＡＭまたは６−ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン、
ＢＨＱ１：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１
ＢＨＱ２：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）２
ＩＢ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ
ＩＢＲ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ
ｓｈＲＮＡ：低分子ヘアピンＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ
ｓｎｏＲＮＡ：低分子核小体ＲＮＡ
ｓｔＲＮＡ：低分子一時的ＲＮＡ
ｓｍＲＮＡ：低分子変調ＲＮＡ
プレマイクロＲＮＡ：前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡ
プリマイクロＲＮＡ：初期マイクロＲＮＡ
ＵＶ：紫外

【0130】

例示的実施形態の詳細な説明
最初に、本明細書に提供される図面および実施例は、本発明およびその種々の実施形態を限定するものではなく例示するものであることを理解すべきである。

【0131】

触媒核酸機能の改善を促進する性質を備えた触媒核酸基質の必要性が存在する。特定的には、同一のまたは識別可能な標的特異性を有するさまざまなＭＮＡザイムによる触媒修飾の能力が増大された新しいユニバーサル基質ファミリーが提供されれば、ＭＮＡザイムおよびＤＮＡザイムを含む多くの用途にかなり有益であろう。たとえば、これらの基質ファミリーは、ＭＮＡザイムを含む多重アッセイの効率および／または確度を増大させるうえで有利であろう。追加されるユニバーサル基質は、基質を固体担体にテザー連結することにより基質アレイを作製する用途にとくに有用である。

【0132】

本発明は、高温で改善された性能を有して広い温度範囲にわたり効率的に触媒修飾（たとえば切断）される可能性がより高いユニバーサルオリゴヌクレオチド基質を産生するための一群のガイドラインを提供する。これらのガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）２個の中心リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）２個の中心リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ_８およびＮ_９）がシトシンである、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド基質の全ピリミジン含有率が６４％超である、（ｉｖ）オリゴヌクレオチド基質の全Ｔｍが６６℃以上であり、核酸酵素によるオリゴヌクレオチド基質の触媒修飾（たとえば切断）の反応温度が５０℃超であれば適用可能である、および／または（ｖ）２個の中心リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基中に少数個（たとえば、３、２、１、または０個）のグアニンヌクレオチド、のいずれか１つ以上を含む。

【0133】

これらのガイドラインの開発により、触媒核酸機能を拡張する特徴を有する触媒核酸酵素基質の開発が促進された。触媒修飾される部分に近接する特定の特異的ヌクレオチドの存在により、所与の核酸酵素の標的となる基質内のヌクレオチドの触媒修飾を促進可能であることが確認された。

【0134】

したがって、本発明の特定の態様は、触媒核酸酵素に対するポリヌクレオチド基質に関する。ポリヌクレオチド基質は、基質を標的とする核酸酵素により触媒修飾されるヌクレオチドの５’側（すなわち上流側）および／または３’側（すなわち下流側）に一連のピリミジンヌクレオチドを含みうる。ピリミジンヌクレオチドは、シトシンヌクレオチドでありうる。

【0135】

本発明の他の態様は、核酸酵素（たとえば、ＤＮＡザイム、リボザイム、またはＭＮＡザイム）に対する基質としての本明細書に記載のポリヌクレオチド基質の使用に関する。特定の実施形態では、基質は、ＭＮＡザイムに対する基質として使用される。特定の実施形態では、基質は、ＤＮＡザイムに対する基質として使用される。

【0136】

本発明のさらなる態様は、標的分子を検出する方法に関する。この方法は、検出可能作用を提供するように本明細書に記載のポリヌクレオチド基質を修飾することを含む。特定の実施形態では、この方法は、標的の検出が可能なＭＮＡザイムを用いてポリヌクレオチド基質を修飾することを含む。

【0137】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド基質を含むキットに関する。キットは、基質の触媒修飾が可能な核酸酵素を含みうる。特定の実施形態では、核酸酵素は、ＭＮＡザイムでありうる。

【0138】

１．触媒核酸酵素基質
本発明は、触媒核酸酵素に対するポリヌクレオチド基質を提供する。本発明はまた、同一のまたは識別可能な標的特異性を有するさまざまな核酸（たとえばＭＮＡザイム）による触媒修飾の能力が増大されたメンバーを含む基質ファミリーを提供する。

【0139】

ポリヌクレオチド基質は、触媒核酸酵素により修飾可能な少なくとも１つの配列モチーフを含む。本発明に係るポリヌクレオチド基質を修飾しうる触媒核酸酵素の特定のタイプに関して、限定条件は存在しない。配列モチーフは、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド、少なくとも１つのＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチドの少なくとも１つのアナログ、およびＲＮＡヌクレオチドの少なくとも１つのアナログのいずれか１つ以上を含みうる。

【0140】

好適な配列モチーフの例としては、ＤＮＡザイム（たとえば、１０−２３ＤＮＡザイム、８−１７ＤＮＡザイム、「７Ｚ８１」、「７Ｚ４８」、および「７Ｑ１０」ＤＮＡザイムリガーゼ、「ＵＶ１Ｃ」チミン二量体光転換ＤＮＡザイム、「ＤＡＢ２２」炭素−炭素結合形成ＤＮＡザイム、およびそれらの誘導体）、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッドリボザイム、ホモ二量体リボザイム、ヘテロ二量体リボザイム、およびそれらの誘導体）、およびＭＮＡザイム（たとえば、ＰＣＴ国際公開第２００７／０４１７７４号パンフレット、国際公開第２００８／０４００９５号パンフレット、および国際公開第２００８／１２２０８４号パンフレット、ならびに関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号明細書、同第２０１０−０１３６５３６号明細書、および同第２０１１−０１４３３３８号明細書（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＭＮＡザイムを参照されたい）により認識および修飾されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0141】

好適な配列モチーフの例としては、以下の表１に明記されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0142】

【表1】

【0143】

触媒核酸は、触媒コアを形成する領域の特定の修飾のみが許容されることが示されている（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４（６２６６）：５６５−７．、Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１６）：４０２０−５、Ｚａｂｏｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（４３）：２４０６１７−２２、Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．Ｊａｎ；１１（１）：５７−６、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，２００４ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．Ｊａｎ；１１（１）：７−８）。ＤＮＡザイムの触媒活性に関与する配列の例を表２に列挙する。

【0144】

【表2】

【0145】

ポリヌクレオチド基質は、複数の配列モチーフを含みうる。モチーフは、一タイプの触媒核酸酵素により認識および修飾されうる。他の選択肢として、異なるタイプの触媒核酸酵素により、基質内の異なる配列モチーフが認識および修飾されうる。

【0146】

以上に述べたように、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、触媒核酸酵素による修飾が可能な少なくとも１つの配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、配列モチーフに近接するヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドである。たとえば、配列モチーフに先行および／または後続する（すなわち続く）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドでありうる。ピリミジンヌクレオチドのいずれか１つ以上は、シトシンヌクレオチドでありうる。

【0147】

他の実施形態では、１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、配列モチーフに直接（すなわち連続配列で）先行および／または後続する（すなわち続く）。たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドの配列が、配列モチーフに直接先行および／または後続しうる。ピリミジンヌクレオチドのいずれか１つ以上は、シトシンヌクレオチドでありうる。

【0148】

さらなる実施形態では、配列モチーフの５’側（すなわち上流側）の１０個のヌクレオチド内および／または３’側（すなわち下流側）の１０個のヌクレオチド内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれ以上のヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドである。ピリミジンヌクレオチドのいずれか１つ以上は、シトシンヌクレオチドでありうる。

【0149】

そのほかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド基質の９個超、１０個超、または１１個超のヌクレオチドは、シトシンヌクレオチドでありうる。たとえば、基質は、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、または１５個超のヌクレオチドを含みうるかまたはこれらのヌクレオチドで構成されうるし、これらのヌクレオチドのうち９、１０、１１個、または１１個超は、シトシンヌクレオチドでありうる。

【0150】

追加としてまたは他の選択肢として、ポリヌクレオチド基質の５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドでありうる。たとえば、基質は、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、または１５個超のヌクレオチドを含みうるかまたはこれらのヌクレオチドで構成されうるし、これらのヌクレオチドのうち３、２、１、または０個は、グアニンヌクレオチドでありうる。

【0151】

本発明に係るポリヌクレオチド基質の長さに関して、特定の限定条件は存在しない。たとえば、基質は、１００、７５、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５ヌクレオチド長よりも短くてもよい。たとえば、基質は、５〜３０、１０〜１５、１０および２０、１０〜２５、１０〜３０、１６〜２３、１６〜２１、１６〜１８、１８〜２１、１８〜２３、または２１〜２３ヌクレオチド長でありうる。

【0152】

本発明に係るポリヌクレオチド基質は、ウォーレス則すなわちＴｍ＝２℃（Ａ＋Ｔ）＋４℃（Ｇ＋Ｃ）を用いて計算される特異的融解温度（Ｔｍ）を有するように設計されうる（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６（１１）：３５４３−３５５８を参照されたい）。特定の実施形態では、基質は、ＭＮＡザイムにより認識および触媒修飾されうるし、ＭＮＡザイムのパートザイム基質アームが結合する塩基のＴｍは、約５２℃〜約７６℃、約５５℃〜約７５℃、約６０℃〜約７０℃、約６５℃〜約７０℃、約６４℃〜６８℃、または６４℃〜７０℃でありうる（ウォーレス則を用いて計算した場合）。

【0153】

他の実施形態では、基質は、ＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイムにより認識および触媒修飾されうるし、ＭＮＡザイムのパートザイム基質アームが結合する塩基のＴｍは、６８℃〜９０℃の、６６℃〜７６℃、６８℃〜７６℃、６４℃〜７０℃、７０℃〜７６℃、７０℃〜７５℃、７２℃〜７６℃、５２℃、５８℃、６４℃、６６℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７６℃でありうる。

【0154】

限定されるものではなく単なる例として、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、配列番号２５〜２７、２９〜３０、７２〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つ以上で定義される配列を含みうる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２５〜２７、２９〜３０、７２〜９０、または１７２〜１７５のいずれか１つ以上で定義される配列で構成されうる。

【0155】

いくつかの実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、配列番号２８により定義される配列を含みうる。他の実施形態では、ポリヌクレオチド基質は、配列番号２８により定義される配列で構成されうる。

【0156】

いくつかの実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、２つのオリゴヌクレオチドパートザイムを含むＭＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。ポリヌクレオチド基質およびオリゴヌクレオチドパートザイムの配列は、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される３つの配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的組合せでありうる。

【0157】

他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド基質は、ＤＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。ポリヌクレオチド基質およびＤＮＡザイムの配列は、表１５に示される配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的対でありうる。

【0158】

本発明に係るポリヌクレオチド基質は、１つ以上の置換、たとえば、アナログ、誘導体、修飾または改変された塩基、リボヌクレオチドなど、糖またはリン酸骨格の改変、当業者に周知の種々の欠失、挿入、置換、複製、もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組合せを含有しうる。

【0159】

付加または置換の例としては、ＬＮＡホスホロアミダイト、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、βＤ−ガラクトシルクエオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、βＤ−マンノシルメチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（９−β−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）（カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（９−β−リボフラノシルプリン−６−イル）（Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、クエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）（カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、βＤ−アラビノシルウリジン、およびβＤ−アラビノシルチミジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0160】

誘導体の例としては、一体化して産生された（たとえば組換え手段により）または合成後に付加された（たとえば化学的手段により）任意の融合分子を含めて、機能的に等価な核酸またはヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような融合体は、ＲＮＡまたはＤＮＡが付加された、あるいはポリペプチド（たとえば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド）、小分子（たとえば、ソラレン）、マイクロ担体もしくはナノ担体、または抗体にコンジュゲートされた、本発明に係るオリゴヌクレオチドを含みうる。

【0161】

アナログの例としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの分子もしくは残基に関連付けられる、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの残基もしくはそれらのアナログと水素結合を形成可能でありうる（すなわち、ＤＮＡもしくはＲＮＡの残基もしくはそれらのアナログにアニールして塩基対を形成可能である）、物理構造を有する化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ただし、前記化合物が「アナログ」という用語の範囲内に包含されるうえで、そのような結合は、それほど必要とされない。そのようなアナログは、構造的に関連付けられるリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基と異なる化学的および生物学的性質を有しうる。メチル化、ヨウ素化、臭素化、または、ビオチン化された残基は、アナログの例である。デオキシイノシン、Ｃ−５−イミダゾールデオキシウリジン、３−（アミノプロピニル）−７−デアザ−ｄＡＴＰ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’Ｏ−メチルキャップを含めて、ヌクレオチドアナログを含有する活性ＤＮＡザイムが記載されてきた。他のアナログもまた、ＤＮＡザイムおよびＭＮＡザイムの触媒活性に適合可能でありうる。触媒活性を有する核酸の改変、たとえば、１つの塩基による他の塩基の置換、アナログによる塩基の置換、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変は、当業者には容易でありうる。たとえば、改変は、合成中に行いうるか、または合成後に特異的塩基の修飾により行いうる。塩基変化や塩基アナログなどの改変を組み込む触媒核酸の経験的試験により、触媒活性に及ぼす改変配列または特異的アナログを影響の評価することが可能である。塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵのアナログは、当技術分野で公知であり、サブセットは、表３に列挙される。

【0162】

【表3】

【0163】

【表4】

【0164】

本発明に係るポリヌクレオチド基質には、標識核酸、ナノ粒子、マイクロ粒子、タンパク質、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸アナログ、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド−核酸キメラ、それらの任意の組合せなどの追加の要素を組み込みうる。ナノ粒子は、金ナノ粒子でありうる。

【0165】

本発明に係るポリヌクレオチド基質は、触媒核酸酵素により触媒修飾されうる。可能性のある触媒修飾の例としては、核酸切断、核酸ライゲーション、核酸リン酸化、核酸キャッピング、アミノ酸アデニル化、補因子合成、ＲＮＡ重合、鋳型指向重合、ＲＮＡ−タンパク質コンジュゲーション、アルドール反応、アルコール酸化、アルデヒド還元、プリンおよびピリミジンのヌクレオチド合成、アルキル化、アミド合成、尿素合成、ペプチド結合形成、ペプチジルＲＮＡ合成、アシル転移、アミノアシル化、カーボネート加水分解、ホスホロチオエートアルキル化、ポルフィリンメタル化、炭素−炭素結合形成、Ｐｄナノ粒子形成、ビフェニル異性化、エステル結合形成アミド結合形成、ＤＮＡ脱グリコシル化、チミン二量体光転換、およびホスホロアミデート切断が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0166】

特定の用途では、本発明に係るポリヌクレオチド基質の触媒修飾から生じる産物を検出することが望ましいこともある。これは、当技術分野で公知の任意の数の標準的技術を用いて達成可能である。

【0167】

たとえば、基質は、検出可能部分とクエンチャー部分とを含みうる。この場合、触媒核酸により前記基質が修飾されると、前記検出可能部分により提供される検出可能作用は、増大または低減される。検出可能作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ法、電子スピン共鳴法、偏光蛍光分光法、円二色性法、免疫アッセイ法、クロマトグラフィー法、放射測定法、電気化学的方法、測光法、シンチグラフィー法、電子的方法、ＵＶ、可視光、もしくは赤外の分光法、酵素法、またはそれらの任意の組合せにより検出されうる。

【0168】

追加としてまたは他の選択肢として、本発明に係るポリヌクレオチド基質の触媒修飾から生じる産物は、サイズ法（たとえば、標準的電気泳動法による）、核酸配列決定法、蛍光共鳴エネルギー移動法、化学発光法、電位差測定法、質量分析法、プラズモン共鳴法、比色法、旋光測定法、フローサイトメトリー法、走査測定法、およびＤＮＡ配列決定法、またはそれらの任意の組合せに基づいて検出されうる。

【0169】

本発明に係るポリヌクレオチド基質の触媒修飾から生じる核酸産物は、検出を支援するために、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの技術を用いて増幅されうる。

【0170】

本発明に係るポリヌクレオチド基質は、酵素により修飾される基質と異なる標的を検出するように設計された触媒核酸酵素（たとえばＭＮＡザイム）により認識および修飾されうる。したがって、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、それぞれ異なる標的を認識可能な複数の触媒核酸酵素（たとえば複数のＭＮＡザイム）により認識されて触媒作用を受ける「ジェネリック」基質または「ユニバーサル」基質でありうる。そのような基質の使用は、ユニバーサル基質を認識する触媒核酸酵素を用いて多種多様な標的の検出、同定、または定量を行う個別のアッセイの開発を促進しうる。ユニバーサル基質は、それぞれ独立して、１つ以上の標識で標識される。特定の実施形態では、独立して検出可能な標識を用いて１つ以上のユニバーサル基質を標識することにより、ＭＮＡザイムを用いてさまざまな標的を独立してまたは同時に検出することが可能である。たとえば、一連のユニバーサル基質を多重反応に使用して、複数の標的を同時に検出することが可能である。

【0171】

本発明に係るポリヌクレオチド基質は、種々の用途（たとえば、酵素カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケード）に使用される不溶性または固体の担体に結合、装着、またはテザー連結された状態で、提供されうる。担体は、不溶性材料でありうるか、または基質を保持して反応混合物のバルク中を自由に移動しないようにするマトリックスでありうる。そのような担体は、核酸標的を含めて基質の固定化または局在化を行う当技術分野で公知である。マイクロアッセイに使用するのに便利なビーズさらには反応条件に適合可能な他の材料を含めて、さまざまな形態の多種多様なマトリックス、ポリマーなどから担体を選択することが可能であることは、当業者であればわかるであろう。特定の好ましい実施形態では、担体は、プラスチック材料、たとえば、プラスチックのビーズもしくはウエハまたは特定のアッセイが行われるウェルもしくはチューブのプラスチック材料でありうる。特定の実施形態では、担体は、マイクロ担体またはナノ担体でありうる。触媒核酸（たとえばＭＮＡザイム）により基質が修飾（たとえば切断）された後、修飾基質の一部分は、担体に装着された状態を維持し、一方、他方の部分は、遊離されて、装着された状態を維持する部分から離れて、反応混合物のバルク中を移動するように、担体への基質の装着を設計しうる。

【0172】

２．例示的方法
本発明に係るポリヌクレオチド基質は、基質を認識／修飾する触媒核酸を利用する任意の数の潜在用途に使用されうる。

【0173】

たとえば、基質は、ＤＮＡザイム（たとえば、１０−２３ＤＮＡザイム、８−１７ＤＮＡザイム、「７Ｚ８１」、「７Ｚ４８」、および「７Ｑ１０」ＤＮＡザイムリガーゼ、「ＵＶ１Ｃ」チミン二量体光転換ＤＮＡザイム、「ＤＡＢ２２」炭素−炭素結合形成ＤＮＡザイム、ならびにそれらの誘導体））、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッドリボザイム、ホモ二量体リボザイム、ヘテロ二量体リボザイム、およびそれらの誘導体）、および／またはＭＮＡザイムを必要とする用途で使用されうる。

【0174】

本発明の特定の実施形態では、基質は、ＭＮＡザイムに対する基質として使用されうる。ＭＮＡザイムの特徴およびＭＮＡザイムを用いる種々の用途は、ＰＣＴ国際公開第２００７／０４１７７４号パンフレット、国際公開第２００８／０４００９５号パンフレット、および国際公開第２００８／１２２０８４号パンフレット、ならびに関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号明細書、同第２０１０−０１３６５３６号明細書、および同第２０１１−０１４３３３８号明細書（これらの各文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。

【0175】

ＭＮＡザイムは、本明細書ではパートザイムとしても参照される２つ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己集合可能である。パートザイムオリゴヌクレオチドは、ＭＮＡザイム自己集合促進剤の存在下で自己集合してＭＮＡザイムを形成する。したがって、ＭＮＡザイムは触媒活性核酸酵素である。いくつかの実施形態では、ＭＮＡザイムの存在は、検出可能であり、標的が集合促進剤を含む場合、標的の存在下でのみＭＮＡザイムが形成されるので、標的の存在の指標となる。

【0176】

好ましい実施形態では、ＭＮＡザイム構造は、１つ以上のＤＮＡザイムおよび／またはリボザイムをベースとする。より好ましいのは、特定のＤＮＡザイム構造をベースとするＭＮＡザイム構造である。現時点で好ましい構造は、１０−２３および８−１７ＤＮＡザイムを含むＤＮＡザイムをベースとする。種々の実施形態では、ＭＮＡザイムは、リボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい実施形態では、ＭＮＡザイム構造は、少なくとも部分的には、ＤＮＡザイムの構造をベースとする。他の好ましい実施形態では、ＭＮＡザイムは、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログを含む。より好ましい実施形態では、ＭＮＡザイムの触媒コアは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログを含む。さらにより好ましい実施形態では、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログは、基質の触媒作用に関与する。他の実施形態では、触媒コア中の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログは、触媒活性を改善する。さらに他の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない同等のＭＮＡザイムと対比して、測定可能な速度で触媒作用を起こすために、ＭＮＡザイムの触媒コア中の少なくとも１つデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログに課される厳密な要件が存在する。

【0177】

ＭＮＡザイムは、１つ以上の置換、たとえば、アナログ、誘導体、修飾または改変された塩基、リボヌクレオチドなど、糖またはリン酸骨格の改変、当業者に周知の種々の欠失、挿入、置換、複製、もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組合せを含有しうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などは、分子が触媒活性を維持するように、センサーアームおよび／または基質アームおよび／または触媒コア部分で行いうる。基質または集合促進剤に結合するアームに対する置換および修飾は、十分に許容されうるし、実際上、さまざまな基質／集合促進剤に対して分子の調整を可能にする基礎となる。たとえば、センサーアームの修飾は、さまざまな集合促進剤に対する調整を可能にするであろう。一方、基質アームの修飾は、さまざまな基質に対する調整を可能にするであろう。

【0178】

ＭＮＡザイムは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか一方さらには両方を含みうる。少なくとも１つ、より好ましくはすべてデオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイムが好ましい。同様に好ましいのは、ＭＮＡザイムの触媒コア内に少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはそのアナログを含むＭＮＡザイムである。さらにより好ましいのは、そのような塩基が触媒活性に必要とされる実施形態である。

【0179】

また、ＭＮＡザイムの集合および脱集合は、マイクロ環境を変化させることにより制御されうる。そのような変化の例としては、温度、二価カチオンのタイプおよび濃度、塩濃度、ｐＨ、添加剤、ならびに活性ＭＮＡザイムの集合および／または活性に不可欠な重要成分の存在または不在が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、脱集合または部分集合されたＭＮＡザイムは、マイクロ環境を変調することにより集合促進剤の存在下で触媒活性ＭＮＡザイムに集合するのを阻止しうるので、「分子スイッチ」を提供しうる。

【0180】

ＭＮＡザイム構造の基本的な例を図１に示す。示された構造は、パートザイムＡとパートザイムＢとを含み、そのセンサーアーム（ｉ）は、ＭＮＡザイム集合促進剤分子、たとえば、標的のＤＮＡまたはＲＮＡと塩基対合している。パートザイムＡおよびＢは、集合促進剤と相互作用することにより、部分触媒コア（ｉｉｉ）をごく近接した状態にして、単一の触媒コアを形成している。ＭＮＡザイムの基質アーム（ｉｉ）は、ここではレポーター基質として示された基質と相互作用している。したがって、ＭＮＡザイムは、自己集合しており、このプロセスは、ＭＮＡザイム集合促進剤分子の存在により促進される。集合促進剤の不在下では、ＭＮＡザイムは形成されない。本発明に係るポリヌクレオチド基質の修飾（この場合は切断）は、ＭＮＡザイムの触媒コアによりＭＮＡザイム修飾部位（たとえば、×印（Ｘ）により表された基質内の切断部位）で触媒される。この特定の実施形態のポリヌクレオチド基質は、検出可能シグナルたとえばフルオロフォアＦを有する検出可能部分と、クエンチャーＱの作用により検出可能シグナルＦに対してクエンチング作用を有するクエンチャー部分Ｑと、を含む。ＭＮＡザイム切断部位が切断されると、所望により容易に検出および定量が可能な検出可能シグナル（ここでは蛍光）が実質的に増加する。

【0181】

図１はさらに、いくつかの実施形態では集合促進剤を含む標的を検出するためにＭＮＡザイムを使用する基本的方法の例を示すものとして理解することが可能である。より特定的には、それぞれ基質アーム部分（ｉｉ）と触媒コア部分（ｉｉｉ）とセンサーアーム部分（ｉ）とを含むパートザイムＡおよびパートザイムＢが図１に示される。標的の存在下では、パートザイムＡおよびパートザイムＢのセンサーアーム部分は、ハイブリダイズし始めて、標的たとえばＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の相補的部分と塩基対合することが可能である。このようにして標的に接触すると、ＭＮＡザイムは、自己集合して、基質アームにより結合された基質を修飾可能な触媒コアを形成する。好ましくは、ＭＮＡザイムの存在は、その触媒活性の検出または測定により検出される。このように集合されたＭＮＡザイムの基質アームは、基質アーム上の相補的配列と基質との相互作用により本発明に係るポリヌクレオチド基質に結合可能である。基質がそのように基質アームに結合すると、触媒コアは、基質の修飾（たとえば切断）を促進することが可能であり、その結果、直接的または間接的に測定または検出を行うことが可能になる。

【0182】

ＭＮＡザイム触媒の活性前、活性中、または活性後、本明細書に記載の方法が標的の増幅を必要としうることは、当業者であればわかるであろう。そのような標的増幅は、検出、同定、または定量される対象となる標的の量が、他の方法では検出できない可能性のあるシグナルを提供するような量である場合、本発明の実施形態で特定の用途に役立つ。そのような増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の１つ以上を含みうる。

【0183】

図２は、ＭＮＡザイムを用いた標的検出方法の例示的用途を提供する。戦略１は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を含む標的の検出に適合化されたＭＮＡザイムを例示する。以上に記載したように（図１の説明を参照されたい）、標的および基質の両方に対する認識配列を有する２つの個別のオリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイムは、オリゴヌクレオチドが標的を認識してそれに結合した時に形成される。基質たとえばレポーター基質は、ＭＮＡザイムの触媒作用により修飾されて、直接（戦略１）、標的増幅中もしくは標的増幅後（戦略２）、またはシグナルカスケード（戦略３）のいずれかで、検出可能シグナルの発生を引き起こす。いくつかの実施形態では、標的およびシグナルの増幅は両方とも、同時にまたは逐次的に行われる。

【0184】

図２に示される戦略２は、核酸標的のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅中または増幅後にアンプリコンの蓄積をモニターするように適合化されたＭＮＡザイムの使用を例示している。核酸配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技術は、当技術分野で公知である。こうしたものとしては、ＤＮＡポリメラーゼにより媒介される技術、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）（たとえば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，８００，１５９号明細書、米国特許第４，９６５，１８８号明細書、米国特許第５，１７６，９９５号明細書を参照されたい）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）、ローリングサークル増幅（「ＲＣＡ」）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびループ媒介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）が挙げられる。他の標的増幅技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるものであり、たとえば、転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）、自己保持配列複製（「３ＳＲ」）、核酸配列複製ベース増幅（「ＮＡＳＢＡ」）である。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、およびＬＡＭＰにより産生される増幅産物（「アンプリコン」）は、ＤＮＡを含み、一方、ＴＭＡ、３ＳＲ、およびＮＡＳＢＡでは、ＲＮＡアンプリコンが産生される。

【0185】

図２に示される戦略２をさらに参照して、本発明に係るポリヌクレオチド基質を認識および修飾するＭＮＡザイムは、たとえば以上に挙げたＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＬＡＭＰ、ＴＭＡ、３ＳＲ、およびＮＡＳＢＡをはじめとする標的増幅方法と組み合わせて、使用可能である。非対称プライマー比または対称プライマー比のいずれかを用いてＰＣＲにより産生されたアンプリコンの蓄積は、ＭＮＡザイムを用いてモニター可能である。本明細書の実施例１、２、４、６、８、および９では、本発明に係る種々のポリヌクレオチド基質を触媒修飾するＭＮＡザイムを利用してリアルタイムでＰＣＲアンプリコンが検出されることを実証する。

【0186】

再度、図２に示される戦略２を参照して、標的核酸は、その核酸（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅するための手順に従って増幅されうる。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅の標準的方法が使用される。増幅中に産生されるアンプリコンは、ＭＮＡザイムに対する標的集合促進剤として役立ちうる。ＭＮＡザイムによる本発明に係るポリヌクレオチド基質の修飾により検出可能になるＭＮＡザイム活性は、標的の存在の指標となる。標的核酸の増幅とＭＮＡザイムの集合および触媒活性との両方を可能にする条件下で単一の槽内でこの性質のアッセイを実施可能であることは、当業者であればわかるであろう。追加としてまたは他の選択肢として、増幅反応終了時または増幅反応中にサンプルを取り出すことにより、標的核酸増幅に続いてまたは全体を通じた時間点で、実施可能である。

【0187】

図２の戦略３は、シグナルカスケードの使用によりシグナルの増幅を開始するためにＭＮＡザイムを使用する方法の概要を示している。本明細書の実施例３では、シグナルカスケードを開始するために使用可能な、本発明に係る種々のポリヌクレオチド基質を触媒修飾するＭＮＡザイムを利用して、標的の等温直接検出が行われることを実証する。

【0188】

標的増幅と触媒核酸活性とを組み合わせた方法またはプロトコルが、特異的反応条件（たとえば、本明細書の実施例１、２、４、６、８、および９に記載のもの）を必要としうることは、当業者であればわかるであろう。好ましくは、反応条件は、ポリメラーゼ活性（増幅用）および基質の触媒核酸修飾（検出用）の両方に適合可能であるである。ＰＣＲ中などに高温で同時に触媒活性およびポリメラーゼ活性を得るための条件を決定するプロトコルは、ＤＮＡザイムに関して記載されてきた。ＤＮＡザイムアーム長、緩衝液、温度、二価イオン濃度、および添加剤作用をはじめとする因子の影響は、当技術分野で公知である。ＤＮＡ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅戦略と組み合わせて使用するのに適している。たとえば、それは、増幅中に高温への暴露により不可逆的に変性されない。

【0189】

特定の実施形態では、ＭＮＡザイムによる認識および修飾が可能な本発明に係るポリヌクレオチド基質は、不溶性または固体の担体に結合、装着、またはテザー連結されうる。たとえば、図３のパネル（ｉ）を参照して、ＭＮＡザイムと、担体に固定された本発明に係るポリヌクレオチド基質と、を用いて標的を検出する例示的方法が示されている。この実施形態では、基質は、好ましくは、検出可能シグナルたとえばフルオロフォアを含む検出可能部分と、検出可能シグナルを減少または排除するクエンチャー部分と、を有するとともに、たとえば基質が修飾されるまで（たとえば切断により）、基質の検出可能部分およびクエンチャー部分がごく近接した状態を維持する、基質である。基質は、担体に装着される。好ましくは、担体は、不溶性材料であるか、または基質を保持して反応混合物のバルク中を自由に移動しないようにするマトリックスである。ＭＮＡザイムにより基質が修飾（たとえば切断）された後、検出可能部分またはクエンチャー部分の一方（ただし、両方ではない）は、担体に装着された状態を維持し、他方は、遊離されて、装着された状態を維持する部分から離れて、反応混合物のバルク中を移動するように、担体への基質の装着を設計しうる。したがって、切断の実施例では、クエンチャー部分および検出可能部分が切断後に分離されるにつれて、検出可能シグナルは、大幅に増大する。図３のパネル（ｉ）に示される実施形態では、フルオロフォアを含有する検出可能部分は、切断後、装着された状態を維持する。これは、担体上へのシグナルの局在化を可能にするという利点を有するが、特定の場合には、フルオロフォア／ｓは、溶解状態で放出されうる。たとえば、ライゲーションが行われるさらなる実施形態では、クエンチャーは、フルオロフォアにライゲートされて、検出可能シグナルを低減しうる。

【0190】

特定の実施形態では、基質アレイを提供するために、複数のユニバーサル基質を固体担体中の異なる位置にテザー連結しうる。図３のパネル（ｉｉ）を参照して、２つの基質を固体表面上の規定位置に装着しうる。各ユニバーサル基質は、特異的ＭＮＡザイム集合促進剤分子（たとえば、標的１または標的２）の存在下で形成されたＭＮＡザイムによってのみ切断可能であり、シグナルは、表面上に基質を配置することにより局在化可能であるので（位置１または位置２）、さまざまな集合促進剤の特異的検出が可能になる。そのような実施形態では、テザー連結ユニバーサル基質はすべて、同一のフルオロフォアで標識されうる。他の実施形態では、テザー連結ユニバーサル基質は、さまざまなフルオロフォアで標識されうる。図３（ｉｉ）に示される戦略は、固体表面上の規定位置に装着された多種多様なユニバーサル基質を有するユニバーサル基質アレイを形成するように拡張可能である。そのような実施形態では、アレイに使用するために利用可能なユニバーサル基質の数を増大させることにより、より複雑なアレイの形成を可能にするという利点を提供しうる。ユニバーサル基質のそのようなユニバーサルアレイは、標的アナライトの高多重化分析に使用するのに有用でありうる。本発明は、触媒活性機能を拡張しうるという特徴を有する追加のユニバーサル基質を提供する。これは、ＭＮＡザイムを用いて一層複雑な分析を行えるように能力を改善するのに有用と思われる。

【0191】

特定の実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド基質は、ＭＮＡザイムにより認識および修飾されて、第２の異なるＭＮＡザイム用の集合促進剤、集合促進剤成分、またはパートザイムを提供しうる。

【0192】

図４を参照して、開始ＭＮＡザイム（Ｍｔ）は、標的（Ｔ）の存在下で形成されうる。
開始ＭＮＡザイム（Ｍｔ）は、本発明に係る（第１の）ポリヌクレオチド基質（Ｓ１）を切断して、第１の集合促進剤成分（Ｓ１ｆ）を形成し、これは、第１のカスケードＭＮＡザイム（カスケードＭＮＡザイムＭｃ１）の形成を誘導する。この例では、第１のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ１）は、２つのパートザイムと、Ｆ１、Ｆ２、およびＳ１ｆと称される３つの集合促進剤成分と、を含む。Ｍｃ１は、追加の基質（Ｓ２）を切断可能であるので、追加の集合促進剤成分（Ｓ２ｆ）を遊離し、これは、第２のカスケードＭＮＡザイム（カスケードＭＮＡザイムＭｃ２）の形成を誘導する。この例では、第２のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ２）は、２つのパートザイムと、Ｆ３、Ｆ４、およびＳ２ｆと称される３つの集合促進剤成分と、を含む。次いで、Ｍｃ２は、第１の基質（Ｓ１）をさらに切断可能であるので、第１の集合促進剤成分（Ｓ１ｆ）がさらに形成される。これは、さらなる第１のカスケードＭＮＡザイム（Ｍｃ１）の形成をもたらすことにより、増幅カスケードを形成する。活性ＭＮＡザイム集合を促進するために３つの集合促進剤成分が必要とされることが図４に示されていることは、当業者であればわかるであろう。多かれ少なかれ、類似のスキーマで集合促進剤成分を利用可能である。

【0193】

標的の検出、同定、および／もしくは定量、ならびに／または触媒核酸（たとえば、ＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイム）による本発明に係るポリヌクレオチド基質の認識および触媒修飾を最適化するために、さまざまな実験パラメーターを用いて本明細書に記載の方法を最適化しうることは、当業者であれば容易に理解されよう。最適化される特定の実験パラメーターおよびそのような最適化のレベルは、利用される特定の方法ならびに関与する特定の標的および／または基質に依存するであろう。そのようなパラメーターとしては、時間、温度、塩、洗浄剤、カチオン、および限定されるものではないがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をはじめとする他の試薬の濃度、ならびに核酸の長さ、相補性、ＧＣ含有率、および融点（Ｔｍ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0194】

いくつかの実施形態では、たとえば、配列変異の検出および／またはメチル化ＤＮＡの検出を必要とする方法では、それぞれ配列変異またはメチル化ヌクレオチドを含むまたは含まない標的核酸へのＭＮＡザイム成分核酸の結合を識別するために、好ましくは、本方法が行われる温度を含めて、実験パラメーターを最適化しうる。そのような方法が行われうる温度は、約２０℃〜約９６℃、約２０℃〜約７５℃、２０℃〜約６０℃、または約２０〜約５５℃の範囲内でありうる。

【0195】

いくつかの実施形態では、ＭＮＡザイムおよびＤＮＡザイムの使用方法を実施するための最適化反応を本明細書に提供する。そのような最適化反応では、触媒活性は、非最適化反応によりも最大１０、２０、または３０％増大される。より好ましい反応条件では、触媒活性は、少なくとも３５％または４０％、好ましくは最大５０％改善される。さらにより好ましい実施形態では、最適化反応は、触媒活性を５０％超、最大６６％、７５％、さらには１００％増大させる。さらにより好ましい実施形態では、完全最適化反応方法は、１００、２００、さらには３００％以上の触媒活性の増加を提供するであろう。他の好ましい反応条件では、非最適化反応条件で実施された方法よりも触媒活性を最大１，０００％以上改善することが可能である。本明細書に提供される方法の最適化にきわめて好ましい反応条件は、特定の二価カチオンの組込みである。ほとんどの核酸酵素の触媒活性は、二価カチオンの濃度により濃度依存的な影響を受けうる。好ましい最適化反応は、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｚｎ^２＋、およびＰｂ^２＋の１つ以上に対して、最適化される。

【0196】

いくつかの実施形態では、核酸酵素（たとえば、ＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイム）を用いたアッセイで本発明に係るポリヌクレオチド基質を使用することにより、同一の条件下で同一のアッセイで公知の基質を用いて得られる検出可能作用を上回って、酵素による基質の触媒修飾から生じる検出可能作用を増大させうる（たとえば、蛍光シグナルの増加または減少）。たとえば、検出可能作用は、公知の基質と比較して、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％超増大されうる。
特定の実施形態では、検出可能作用は、蛍光シグナルである。

【0197】

いくつかの実施形態では、本発明に係る方法は、２つのオリゴヌクレオチドパートザイムを含むＭＮＡザイムと組み合わせて、ＭＮＡザイムに対するポリヌクレオチド基質を使用することを必要とする。ポリヌクレオチド基質およびオリゴヌクレオチドパートザイムの配列は、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される３つの配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的組合せでありうる。

【0198】

いくつかの実施形態では、本発明に係る方法は、ＤＮＡザイムと組み合わせてポリヌクレオチド基質を使用することを必要とする。ポリヌクレオチド基質およびＤＮＡザイムの配列は、表１５に示される配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的対でありうる。

【0199】

３．キット
また、本発明に係る１つ以上のポリヌクレオチド基質を含むキットも、本明細書に提供される。

【0200】

キットは、本明細書に開示される方法を実施するための追加の試薬を含みうる。たとえば、キットは、基質の認識および修飾が可能な１つ以上の触媒核酸を含みうる。好適な触媒核酸の例としては、ＤＮＡザイム（たとえば、１０−２３ＤＮＡザイム、８−１７ＤＮＡザイム、「７Ｚ８１」、「７Ｚ４８」および「７Ｑ１０」ＤＮＡザイムリガーゼ、「ＵＶ１Ｃ」チミン二量体光転換ＤＮＡザイム、「ＤＡＢ２２」炭素−炭素結合形成ＤＮＡザイム、ならびにそれらの誘導体）、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッドリボザイム、ホモ二量体リボザイム、ヘテロ二量体リボザイム、およびそれらの誘導体）、およびＭＮＡザイムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0201】

本発明に係るキットは、「区画化」キットでありうる。区画化キットは、個別の容器、たとえば、小さいガラス容器、プラスチック製容器、またはプラスチックもしくは紙のストリップなどに試薬が提供される任意のキットを包含する。そのような容器は、サンプルおよび試薬の相互汚染を回避しつつ、一方の区画から他方の区画への試薬の効率的な移動を可能しうるし、かつ／または一方の区画から他方の区画への各容器の作用剤または溶液の定量的添加を可能にしうる。また、そのようなキットは、試験されるサンプルを収容する容器、アッセイで使用される試薬を含有する容器、洗浄試薬を含有する容器、および検出試薬を含有する容器を含みうる。

【0202】

特定の実施形態では、キットは、本発明に係る１つ以上のポリヌクレオチド基質と、標的の存在下でポリヌクレオチド基質の認識および触媒修飾が可能なＭＮＡザイムを集合するように設計された複数のオリゴヌクレオチドパートザイムと、を含む。標的は、オリゴヌクレオチドパートザイムの集合を引き起こす集合促進剤として作用して、ポリヌクレオチド基質の認識および修飾が可能な触媒活性ＭＮＡザイムをもたらしうる。

【0203】

いくつかの実施形態では、キットは、本発明に係るポリヌクレオチド基質と、２つのオリゴヌクレオチドパートザイムを含むＭＮＡザイムと、を含む。ポリヌクレオチド基質およびオリゴヌクレオチドパートザイムの配列は、表６、８、１０、１３、１６、２０、２２、および／または２４に示される３つの配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的組合せでありうる。

【0204】

他の実施形態では、キットは、本発明に係るポリヌクレオチド基質とＤＮＡザイムとを含む。ポリヌクレオチド基質およびＤＮＡザイムの配列は、表１５に示される配列（配列番号により示される）のいずれかの特異的対でありうる。

【0205】

個々のオリゴヌクレオチドパートザイムは、同一の容器内に存在しうる。他の選択肢として、個々のオリゴヌクレオチドパートザイムは、個別の容器内に存在しうる。カスケード反応の一部として成分を産生しうるので、必ずしも、所与の方法で使用することが意図されるすべてのＭＮＡザイムに対してすべての成分をキットに提供する必要があるとは限らないことは、理解されよう。

【0206】

また、他の実施形態では、追加の触媒核酸、たとえば、切断活性またはリガーゼ活性のいずれかを有する触媒核酸に対する成分は、本発明に係るキットの一部を形成しうる。さらに他の実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡザイムまたはその成分を含みうる。

【0207】

本発明に係るキットは、所望の方法を行うためにキット成分を使用するための説明書を含みうる。

【0208】

本発明に係るキットおよび方法は、限定されるものではないが、リアルタイムＰＣＲ機を含めて、自動分析装置および系と組み合わせて使用可能である。

【0209】

本発明に係るキットは、たとえば、オリゴヌクレオチドプライマー、緩衝液、マグネシウムイオン、ポリメラーゼ酵素などを含めて、標的増幅反応（たとえばＰＣＲ）を行なうための追加の試薬を含みうる。

【0210】

本発明に係るキットは、１つ以上の固体担体と本発明に係る１つ以上のポリヌクレオチド基質とを含む１つ以上の集合体を含みうる。１つ以上の固体担体を１つ以上のポリヌクレオチド基質に結合しうる。特定の実施形態では、キットは、複数の異なる固体担体を含む１つ以上の集合体を含みうる。複数の異なる固体担体を本発明に係る複数の異なるポリヌクレオチド基質に結合させうる。

【実施例】

【0211】

以下の実施例では、ユニバーサル基質を効率的に切断する１０−２３ＤＮＡザイムベースのＭＮＡザイムおよび１０−２３ＤＮＡザイムの能力を試験した。試験したユニバーサル基質は、当技術分野ですでに公知のものいくつか（表４）、および本発明の設計ガイドラインのすべてまたはサブセットのいずれかに従って設計された新規な基質（表５）を含んでいた。これらの実施例では、一連の条件での効率的な切断により示唆されるように、本発明の設計ガイドラインのすべてまたはサブセットに従って設計されたユニバーサル基質のロバスト性を実証する。

【0212】

【表5】

【0213】

【表6】

【0214】

実施例１： ５２℃のアニーリング温度でのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）におけるＭＮＡザイムと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
ＭＮＡザイムｑＰＣＲとして参照されるＰＣＲなどのｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、ＭＮＡザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたＭＮＡザイム基質を用いたｑＰＣＲ中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ｃｔ（サイクル閾値）として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いＣｔ値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。発生されたＣｔ値により測定される、閾値蛍光に達するのに要する時間量は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。

【0215】

この実施例では、シリーズ１（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、Ｓｕｂ６、およびＳｕｂ７、表４参照）のすでに公知のユニバーサル基質と、本発明の対象であるシリーズ２（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４６、Ｓｕｂ４９、Ｓｕｂ５５、およびＳｕｂ６０、表５参照）の新しい改善されたユニバーサル基質と、を比較して、シリーズ２の基質が、シリーズ１の基質に対して、リアルタイムＰＣＲで同一の、より高い、またはより低い活性レベルを有するかを決定する。リアルタイムＰＣＲ中に個々の基質を含有する各反応で得られたＣｔにより、活性レベルを決定した。

【0216】

１．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
すでに公知のユニバーサル基質（表４）および新規なユニバーサル基質（表５）の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢはすべて、ヒトＲＰＬＰＯ遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチ基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号１ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／２−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号２ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／２−Ｐ：：
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号３ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／３−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号４ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／３−Ｐ：：
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号５ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／６−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号６ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／６−Ｐ：：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号７ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／７−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＴＡＡ
配列番号８ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／７−Ｐ：：
ＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号９ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／４４−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧ
配列番号１０ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／４４−Ｐ：：
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号１１ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／４５−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＧＴ
配列番号１２ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／４５−Ｐ：：
ＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号１３ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／４６−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号１４ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／４６−Ｐ：：
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ
配列番号１５ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／４９−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＡ
配列番号１６ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／５５−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号１７ パートザイムＡ ＲＰＬＰＯＡ／６０−Ｐ：
ＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
配列番号１８ パートザイムＢ ＲＰＬＰＯＢ／６０−Ｐ：：
ＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ

【0217】

１．２． レポーター基質
この実施例で試験したレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例では、Ｓｕｂ６０以外の基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分で、３’末端をクエンチャー部分で、末端標識した。クエンチャー分子は、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１（以下の基質名では「Ｂ」により表される）またはＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ（以下の基質名では「ＩＢ」により表される）のいずれかであった。Ｓｕｂ６０は、５’末端をクエンチャー部分で、３’末端をＦＡＭ部分で、末端標識した（ＦＡＭ蛍光をクエンチすることが知られている「Ｇ」である５’末端塩基に基づく）。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍの励起（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。
配列番号２１ Ｓｕｂ２−ＦＩＢ：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３−ＦＢ：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２４ Ｓｕｂ７−ＦＢ：
ＴＴＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号２５ Ｓｕｂ４４−ＦＩＢ：
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ
配列番号２６ Ｓｕｂ４５−ＦＩＢ：
ＡＣＧＧＧＴＣＣＣｇｕＣＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡ
配列番号２７ Ｓｕｂ４６−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号２８ Ｓｕｂ４９−ＦＢ：
ＴＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号３０ Ｓｕｂ６０−ＩＢＦ：
ＧＣＣＡＡＣＣＡＣｇｕＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣ

【0218】

１．３． ＲＰＬＰＯ増幅用のＰＣＲプライマー
この実施例のための標的ＰＣＲアンプリコンは、以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅により、産生した。プライマー配列は、５’→３’方向に書かれている。
配列番号３１ フォワードプライマー ５ＲＰＬＰＯ：
ＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡ
配列番号３２ リバースプライマー ３ＲＰＬＰＯ：
ＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧ

【0219】

１．４． 標的配列
この実施例のための標的配列は、Ｋ５６２細胞から抽出したヒトゲノムＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅により産生したＲＰＬＰＯ遺伝子のＰＣＲアンプリコンであった。

【0220】

１．５． 反応成分： 標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。反応はすべて、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。サイクルパラメーターは、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と６０℃で３０秒間とを１０サイクル（後者の温度に対しては１サイクルあたり−１℃）、９５℃で１５秒間と５２℃で６０秒間とを４０サイクル（５２℃の工程でデータを収集した）であった。表６のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、８０ｎＭの５ＲＰＬＰＯおよび４００ｎＭの３ＲＰＬＰＯ、各２００ｎＭのパートザイムＡおよびパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ ＲＮアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＩｍｍｏｌａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無ＤＮＡ標的（ヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏ（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ））のいずれかを含有していた。個別の反応を構成して、そのマッチパートザイムにより各基質を試験した。同一のＰＣＲプライマーをすべての反応に使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的感知部分を有していた。したがって、反応効率に差があれば、基質の切断効率の差に帰属しうるであろう。

【0221】

【表7】

【0222】

１．６． 結果： 標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有するそれぞれ異なる基質の各ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応では、ヒトゲノムＤＮＡからのＲＰＬＰＯのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての基質で、無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0223】

シリーズ１および２の基質はすべて、表７に示されているように、閾値を通過してＣｔ値を生成した。シリーズ１の基質は、１６．９（Ｓｕｂ６）〜１８．４（Ｓｕｂ３およびＳｕｂ７）の範囲内のＣｔ値を有し、シリーズ２の基質は、１７．１（Ｓｕｂ５５）〜１９．２（Ｓｕｂ４５）の範囲内のＣｔ値を有していた。このことから、シリーズ２の基質は、きわめて活性であり、試験した反応条件下でシリーズ１の基質と同等であることが示唆される。これらの結果から、平均して、最大の効率（すなわち最小のＣｔ）で切断された基質は、基質中のリボヌクレオチドを取り囲む８個の塩基（表７の下線部）中により多くのピリミジンを有するものであったことが実証される。

【0224】

【表8】

【0225】

実施例２： ５８℃のアニーリング温度におけるＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
ＰＣＲなどのｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、ＭＮＡザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたＭＮＡザイム基質を用いたｑＰＣＲ中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ｃｔ（サイクル閾値）として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いＣｔ値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。他の反応条件がすべての同一である場合、Ｃｔ値は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。当技術分野で使用されるＭＮＡザイムｑＰＣＲのアニーリング／検出温度は、５０〜５４℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ１のユニバーサル基質では５４℃が上限であるという事実により決定された。より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計するうえでより大きい柔軟が可能になるように、より高い温度で切断されるユニバーサル基質の必要性が存在する。プライマーおよびパートザイムに対するこの設計柔軟性は、特異的検出のためにより高い反応温度ひいてはより高いＴｍを有するパートザイムおよびプライマーを必要とする、配列中に高パーセントのＧ塩基およびＣ塩基を有する対象の遺伝子標的など、多くの用途にきわめて有益でありうる。

【0226】

シリーズ１および２の基質の性能に基づく基質の切断効率についての研究は、第３ラウンドの基質設計を支援するガイドラインの開発につながり、結果的に、シリーズ３の基質をもたらす。これらのガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基（Ｎ_４〜Ｎ_１３）中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ_８およびＮ_９）がシトシンである、（ｉｉｉ）基質の全含有率が＞６４％ピリミジンを有する、および（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの全Ｔｍが６６℃以上である（後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が５０℃超である場合のみ適用可能である）を含んでいた。

【0227】

この実施例では、シリーズ１のユニバーサル基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）と、シリーズ２のユニバーサル基質（Ｓｕｂ４４、サブ４５、Ｓｕｂ４６、Ｓｕｂ６０Ｔ、およびＳｕｂ５５）およびシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７７、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０）と、を比較して、５８℃のリアルタイムＰＣＲですべての基質の切断効率を比較することにより、設計ガイドラインが、高温でのＭＮＡザイムｑＰＣＲへの適用可能性が高いユニバーサル基質を生成することを確証する。切断効率レベルは、さまざまなユニバーサル基質を含有する反応に対してＣｔ値を測定することにより決定した。

【0228】

２．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
シリーズ１、２、および３のユニバーサル基質の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢはすべて、ヒトＴＦＲＣ遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチユニバーサル基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号３４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／２−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号３５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／２−Ｐ：
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号３６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号３７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／３−Ｐ：
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号３８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号３９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４４−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧ
配列番号４１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４４−Ｐ：
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＧＴ
配列番号４３ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４５−Ｐ：
ＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４６−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号４５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４６−Ｐ：
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号４８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
配列番号４９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６０−Ｐ：
ＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６１−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ
配列番号５１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６１−Ｐ：
ＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡ
配列番号５５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７２−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＡ
配列番号５７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７３−Ｐ：
ＣＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７４−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号５９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７４−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡ
配列番号６１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７５−Ｐ：
ＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７７−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧ
配列番号６３ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７７−Ｐ：
ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７９−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
配列番号６５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７９−Ｐ：
ＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／８０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴ
配列番号６７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８０−Ｐ：
ＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６８ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８２−Ｐ：
ＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６９ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／８３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡ
配列番号７０ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８３−Ｐ：
ＧＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号７１ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／９０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＴＣＧＡＧ

【0229】

２．２． レポーター基質
この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。Ｓｕｂ６０の配列は、５’末端に「Ｔ」を含むように修飾することにより、６−ＦＡＭで５’末端標識できるようにした。パートザイムＡの基質結合配列には変更を加えなかったので、切断効率は、５’末端に追加の「Ｔ」が欠如している実施例１のＳｕｂ６０配列と同等である。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍの励起（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。
配列番号２１ Ｓｕｂ２−ＦＩＢ：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３−ＦＩＢ：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２５ Ｓｕｂ４４−ＦＩＢ：
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ
配列番号２６ Ｓｕｂ４５−ＦＩＢ：
ＡＣＧＧＧＴＣＣＣｇｕＣＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡ
配列番号２７ Ｓｕｂ４６−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号７２ Ｓｕｂ６０Ｔ−ＦＩＢ：
ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣｇｕＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７４ Ｓｕｂ６５−ＦＩＢ：
ＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７６ Ｓｕｂ７３−ＦＩＢ：
ＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＧＴＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７８ Ｓｕｂ７５−ＦＩＢ：
ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡ
配列番号７９ Ｓｕｂ７７−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号８０ Ｓｕｂ７９−ＦＩＢ：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ８０−ＦＩＢ：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号８２ Ｓｕｂ８２−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡ
配列番号８３ Ｓｕｂ８３−ＦＩＢ：
ＴＣＣＧＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣ
配列番号８４ Ｓｕｂ８４−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８５ Ｓｕｂ８５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８６ Ｓｕｂ８６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８７ Ｓｕｂ８７−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８８ Ｓｕｂ８８−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８９ Ｓｕｂ８９−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号９０ Ｓｕｂ９０−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡ

【0230】

２．３． 標的配列およびＴＦＲＣ増幅用のＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ＩＭ９細胞系から抽出されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅により産生された、ＴＦＲＣ遺伝子のＰＣＲアンプリコンであった。プライマー配列中のボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのＴｍを増大させるユニバーサルタグ（Ｕ１またはＵ２）に対応する。このタグは、ＰＣＲ反応の増幅効率を改善する。プライマー配列は、５’→３’方向に列挙されている。
配列番号９１ フォワードプライマー ５ＴＦＲＣ＿Ｕ１：
ＧＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧ
配列番号９２ リバースプライマー ３ＴＦＲＣ＿Ｕ２：
ＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡ

【0231】

２．４． 反応成分： 標的配列の増幅および定量
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。反応はすべて、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。表８のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５８℃で６０秒間とを５０サイクル（５８℃の工程でデータを収集した）。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、４０ｎＭの５ＴＦＲＣ＿Ｕ１、２００ｎＭの３ＴＦＲＣ＿Ｕ２、各２００ｎＭのパートザイムＡおよびパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ ＲＮアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑＨＳ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ）のいずれかを含有していた。

【0232】

【表9】

【0233】

【表10】

【0234】

２．５． 結果： 標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有する各ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応では、ヒトゲノムＤＮＡからのＴＦＲＣのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0235】

各ユニバーサル基質のＣｔ値の比較により（図５および表９）、シリーズ１の基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）およびシリーズ２の基質（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４６、およびＳｕｂ６０Ｔ）はすべて、Ｃｔ値＞２７を有し、一方、試験した他のシリーズ２およびすべてのシリーズ３の基質（Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７７、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０）は、２７未満のＣｔ値であることが示される。このことから、試験した後者のシリーズ２のユニバーサル基質およびすべてのシリーズ３のユニバーサル基質は、ＭＮＡザイムｑＰＣＲでこれまで可能であったよりも高いアニーリング／検出温度でＭＮＡザイム切断反応の効率の増大を示したことが示唆される。この改善された切断効率により、現時点で、これまで可能であったよりも高い温度でＭＮＡザイムｑＰＣＲを用いた標的の効率的かつロバストな検出が可能である。また、これにより、より高い温度が増幅に必要とされるＤＮＡポリメラーゼ処方を用いた場合に有益であることが実証されうる。

【0236】

注目に値するのは、これらの効率的に切断される基質のヌクレオチド配列の性質および基質のリボヌクレオチドに対する特異的ヌクレオチドの近接性が重要なことである。これらの特徴は、高温で効率的に切断される可能性がより高いユニバーサル基質をもたらす一群のガイドラインの根底をなす。これらの設計ガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基（Ｎ４〜Ｎ１３）中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ８およびＮ９）がシトシンである、（ｉｉｉ）基質の全含有率が＞６４％ピリミジンを有する、（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの全Ｔｍが６６℃以上である（後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が５０℃超である場合のみ適用可能である）（表９）を含む（すべてが必要であるとは限らないこともありうる）。それに加えて、リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基中の少数個（たとえば、３、２、１、または０個）のグアニンヌクレオチドもまた、有益であることが観測された。

【0237】

５８℃のアニーリング温度でＣｔ＜２７を有していた図５のユニバーサル基質はすべて、これらの設計ガイドラインの３つ以上を満たした（表９）。

【0238】

【表11】

【0239】

【表12】

【0240】

実施例３： 核酸標的の直接検出方式でＭＮＡザイムと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
シリーズ１および２の基質の性能に基づく基質の切断効率についての研究は、第３ラウンドのシリーズ３の基質設計を支援するガイドラインの開発につながる。これらのガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基（Ｎ_４〜Ｎ_１３）中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ_８およびＮ_９）がシトシンである、（ｉｉｉ）基質の全含有率が＞６４％ピリミジンを有する、および（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの全Ｔｍが６６℃以上である（後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が５０℃超である場合のみ適用可能である）を含んでいた。

【0241】

いかなる標的増幅も用いることなく等温反応で標的核酸を直接検出するために、ＭＮＡザイムを使用することが可能である。この直接標的検出方法を用いて、基質の切断効率を評価することが可能である。一連の温度で遺伝子ＴＦＲＣの直接検出と組み合わせた時の一連のユニバーサル基質の切断効率を試験するように、パートザイムを設計した。この実施例では、すでに公知のシリーズ１のユニバーサル基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）と、シリーズ２のユニバーサル基質（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４６、Ｓｕｂ４９、Ｓｕｂ５５、およびＳｕｂ６０Ｔ）およびシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７７、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０）と、を比較して、シリーズ１および２の基質の分析から導かれた設計ガイドラインが、シリーズ１および２の基質と同一のまたはそれよりも高い活性レベルで切断されるシリーズ３の基質の開発に有用であるかを決定する。５２、５４、５６、および５８℃の温度範囲にわたり１０分後のシグナル対ノイズ比を計算することにより（鋳型含有「試験」反応および無鋳型対照反応の結果から）、切断効率レベルを決定した。また、この温度範囲にわたるシグナル対ノイズ比の標準偏差を温度に関する基質のロバスト性の尺度として計算した。

【0242】

３．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
直接標的検出を用いてシリーズ１、２、および３のユニバーサル基質の切断効率を測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢはすべて、ヒトＴＦＲＣ遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号３４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／２−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号３５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／２−Ｐ：
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号３６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号３７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／３−Ｐ：
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号３８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号３９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４４−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧ
配列番号４１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４４−Ｐ：
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＧＴ
配列番号４３ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４５−Ｐ：
ＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４６−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号４５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４６−Ｐ：
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号９３ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／４９−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＡ
配列番号９４ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／４９−Ｐ：
ＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号４８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
配列番号４９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６０−Ｐ：
ＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６１−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ
配列番号５１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／６１−Ｐ：
ＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／６５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡ
配列番号５５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７２−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＡ
配列番号５７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７３−Ｐ：
ＣＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７４−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号５９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７４−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６０ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡ
配列番号６１ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７５−Ｐ：
ＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７７−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧ
配列番号６３ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７７−Ｐ：
ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７９−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
配列番号６５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７９−Ｐ：
ＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／８０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴ
配列番号６７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８０−Ｐ：
ＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６８ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８２−Ｐ：
ＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６９ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／８３−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡ
配列番号７０ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８３−Ｐ：
ＧＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号７１ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／９０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＴＣＧＡＧ

【0243】

３．２． レポーター基質
この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍの励起（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。
配列番号２１ Ｓｕｂ２−ＦＩＢ：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３−ＦＩＢ：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２５ Ｓｕｂ４４−ＦＩＢ：
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ
配列番号２６ Ｓｕｂ４５−ＦＩＢ：
ＡＣＧＧＧＴＣＣＣｇｕＣＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡ
配列番号２７ Ｓｕｂ４６−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号２８ Ｓｕｂ４９−ＦＢ：
ＴＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号７２ Ｓｕｂ６０Ｔ−ＦＩＢ：
ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣｇｕＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７４ Ｓｕｂ６５−ＦＩＢ：
ＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７６ Ｓｕｂ７３−ＦＩＢ：
ＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＧＴＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７８ Ｓｕｂ７５−ＦＩＢ：
ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡ
配列番号７９ Ｓｕｂ７７−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号８０ Ｓｕｂ７９−ＦＩＢ：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ８０−ＦＩＢ：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号８２ Ｓｕｂ８２−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡ
配列番号８３ Ｓｕｂ８３−ＦＩＢ：
ＴＣＣＧＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣ
配列番号８４ Ｓｕｂ８４−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８５ Ｓｕｂ８５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８６ Ｓｕｂ８６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８７ Ｓｕｂ８７−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８８ Ｓｕｂ８８−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８９ Ｓｕｂ８９−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号９０ Ｓｕｂ９０−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡ

【0244】

３．３． 標的配列
この実施例の標的配列は、以下の５’→３’方向の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＡＦ−ＴＦＲＣであった。この標的配列は、ＴＦＲＣ遺伝子のセクションと同一の配列を有する。
配列番号９５ 集合促進剤 ＡＦ−ＴＦＲＣ：
ＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＣ

【0245】

３．４． 反応成分： 標的配列の直接等温検出
触媒活性ＭＮＡザイムによるレポーター基質の切断により引き起こされる蛍光シグナルの増加により、標的配列の検出を測定した。すべての反応の全体積は、２５μＬであり、すべての反応をＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢｉｏＲａｄ）で行い、パートザイムと基質との各組合せ（表１０）を５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、および６０℃で試験した。各反応の蛍光は、最初の５０サイクルでは１秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の５０サイクルでは２５秒後に読み取るようにプログラムした。すべての反応は、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μＭのパートザイムＡおよびＢ、ならびに０．２μＭの基質を含有していた（表１０のように組み合わせて試験した）。各反応は、１０ｎＭ標的配列（ＡＦ−ＴＦＲＣ）または無鋳型対照（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ）のいずれかを用いた「試験」として二重試験方式で行った。

【0246】

【表13】

【0247】

【表14】

【0248】

３．５． 結果： 標的配列の直接等温検出
各ユニバーサル基質を用いた各反応は、合成鋳型ＡＦ−ＴＦＲＣ（ＴＦＲＣ遺伝子の部分に対応する標的配列）を含有する反応で経時的に蛍光の増加を示した。すべての基質で、無鋳型対照の蛍光は、標的配列含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質が切断されたことに起因することが実証される。

【0249】

各反応に対して、最初の読みで対をなす無鋳型反応で得られた値で各データ点を割り算することにより、ＣＦＸ９６から得られた生の蛍光データ点を規格化した。次いで、これ規格化データを用いて、試験データ点を無鋳型データ点で割り算することにより、約１０分間の時点でシグナル対ノイズ値を計算した。この計算を各反応温度で各基質に対して行った。シグナル対ノイズ値は、基質の切断効率の尺度を提供し（図６（ｉ））、高いシグナル対ノイズは、効率的な切断を示す。また、温度範囲にわたり各基質に対してシグナル対ノイズ比の標準偏差を計算してプロットすることにより、試験温度範囲にわたり一貫して高い活性を有する基質を決定した（図６（ｉｉ））。この標準偏差の低い値は、温度間のシグナル対ノイズレベルの最小限の変化を示唆する。このことから、これら基質は温度に対してロバストであることが示唆される。

【0250】

温度範囲にわたる各基質に対するシグナル対ノイズ比の分析（図６（ｉ））から、シリーズ１の基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）は、より低い測定温度でより高いシグナル対ノイズを有していたことが示される。しかしながら、これらの基質の切断効率は、反応温度を５８℃に上昇させた場合、劇的に低下した。シリーズ２の基質のサブセット（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４６、およびＳｕｂ６０Ｔ）に対して、類似のパターンが見られた。シリーズ２の基質Ｓｕｂ４９は、より低い温度で不十分な性能を示し、より高い温度でわずかに改良されたが、全体的に他の基質よりも低いシグナル対ノイズを有していた。シリーズ２の基質Ｓｕｂ６０Ｔは、温度の増加に伴ってシグナル対ノイズの低下を示し、全体的により低い温度で他のシリーズ１および２の基質の大多数よりも低いシグナル対ノイズを示した。他のシリーズ２の基質（Ｓｕｂ５５）およびシリーズ３の基質のサブセット（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０）は、高い蛍光レベルを呈したので、試験したすべての温度にわたり効率的に切断された。シリーズ３の基質Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７５、およびＳｕｂ７７は、試験した温度にわたりほぼ同一のシグナル対ノイズ値を呈したが、全シグナル対ノイズレベルは低かった。これらの３つの基質はすべて、ＭＮＡザイムｑＰＣＲで試験した時、比較的低いＣｔ値を有する好結果を与えた（実施例２参照）。実施例２および３のこれらの基質のデータの比較から、５２〜５８℃の範囲内の一定温度を用いた場合、これらの基質の代謝回転はより低いので、切断効率に影響を及ぼすことが示唆されうる。この低下した基質の代謝回転は、切断産物の「オフ」速度に関連付けられうる。実施例２では、ＰＣＲの熱サイクルプロファイルの一部として温度を９０℃超に上昇させた時、切断産物は、少なくとも１サイクルに１回、パートザイム基質アームから解離するであろう。

【0251】

全体的に、設計ガイドラインに合致する基質（表９）は、これらガイドラインから外れる基質よりも試験した温度範囲にわたり高いシグナル対ノイズ比を示した（図６（ｉ））。より特定的には、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０を用いた反応は、試験したすべての温度で高いシグナル対ノイズ値を呈したことから、温度範囲にわたりロバストな基質であることが実証される。この改善は、各基質に対して温度にわたりシグナル対ノイズ比から標準偏差を計算した時、さらに明白であった（図６（ｉｉ））。シグナル対ノイズの絶対値と組み合わせたこの変動測定から、試験した温度範囲にわたり、シリーズ２の基質Ｓｕｂ５５ならびにシリーズ３の基質Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７ Ｓｕｂ８８、Ｓｕｂ８９、およびＳｕｂ９０は、広い温度範囲にわたりほとんど変動がない高いシグナル対ノイズ比を有していたことが示唆される。４つの設計ガイドラインのうち３つだけに一致する３つのシリーズ３の基質Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ８４が存在した。これらのうち２つのＳｕｂ７２およびＳｕｂ８４は、表９に明記される設計ガイドラインの４つすべてに一致するシリーズ３の基質よりも、シグナル対ノイズがわずかに大きい標準偏差を有していた。

【0252】

３つ以上の温度で１．６未満のシグナル対ノイズ値を有していた基質（Ｓｕｂ６０、Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７５、およびＳｕｂ７７）は、試験した温度範囲に対してロバストでないと考えられた。

【0253】

これらのデータから、これらの設計ガイドライン（表９）の４つすべてを満たせば、一般的には、温度範囲にわたり効率的かつロバストに切断される基質が得られるであろうと思われる。

【0254】

シリーズ２および３のうち最も奏功し基質の配列を調べることにより、これらの基質が共通した特徴を共有することが示される。試験した温度にわたりシグナル対ノイズ比の変動がほとんどない基質（図６（ｉ）および（ｉｉ））は、一般的には、塩基Ｎ４〜Ｎ１３内に７個以上のシトシンヌクレオチドを含有していた。このことから、コア領域、すなわち、リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基は、基質活性にかなり影響を及ぼすことが示唆される。それに加えて、リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基中の少数個（たとえば、３、２、１、または０個）のグアニンヌクレオチドもまた、有益であることが観測された。

【0255】

実施例４： ５２℃および５８℃のアニーリング温度でＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
ＰＣＲなどのｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、ＭＮＡザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたＭＮＡザイム基質を用いてｑＰＣＲ時にリアルタイムモニターすることにより、Ｃｔ値およびスティープネス（反応速度）により反応効率を示唆しうる曲線が作成される。この実施例では、増幅および検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。５２℃や５８℃（データを収集する温度）などのさまざまなアニーリング温度でのシグナル生成速度（反応曲線のＣｔおよびスティープネスにより測定される）は、ユニバーサル基質の配列により影響を受けることもがある。

【0256】

当技術分野で使用されるＭＮＡザイムｑＰＣＲのアニーリング／検出温度は、５０〜５４℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ１のユニバーサル基質では５４℃が上限であるという事実により決定された。より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計するうえでより大きい柔軟が可能になるように、より高い温度で切断されるユニバーサル基質の必要性が存在する。プライマーおよびパートザイムに対するこの設計柔軟性は、特異的検出のためにより高いＴｍを有するパートザイムおよびプライマーを必要とする、配列中に高パーセントのＧ塩基およびＣ塩基を有する対象の遺伝子標的など、多くの用途にきわめて有益であろう。５２〜５８℃の温度範囲で効率的に切断される基質が存在すれば、ユニバーサル基質の有用性は、大幅に増大されるであろう。

【0257】

この実施例では、表１１にまとめられている一連の遺伝子を標的とするように、シリーズ１、２、および３のユニバーサル基質に対応するパートザイムを設計した。本明細書に記載されるように、任意の遺伝子配列もしくは遺伝子転写物または任意の他の核酸増幅産物を標的として使用可能であることは、当業者であればわかるであろう。ｑＰＣＲにおいて５２℃および５８℃のアニーリング温度で、パートザイムとその関連ユニバーサル基質との各組合せを試験した。この比較から得られる結果から、シリーズ１、２、および３の基質が、さまざまな遺伝子を標的として、リアルタイムＰＣＲにおいてさまざまなアニーリング温度で、同一の、より高い、またはより低い切断効率レベルを可能にするか、を決定する。切断効率レベルは、さまざまなユニバーサル基質を含有する反応に対して、Ｃｔ値を測定することにより、および反応曲線のスティープネスを調べることにより、決定した。

【0258】

【表15】

【0259】

４．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
リアルタイムＰＣＲでユニバーサル基質の切断効率を測定すべく行った実験では、ヒトＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、Ｂ２Ｍ、ＨＭＢＳ、ＲＰＬ１３ａ、またはＴＦＲＣ遺伝子に相補的なセンサーアームを用いて、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢを設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号９６ パートザイムＡ ＣＹＰ２Ｃ９Ａ／３−Ｐ：
ＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号９７ パートザイムＢ ＣＹＰ２Ｃ９Ｂ／３−Ｐ：
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣ
配列番号９８ パートザイムＡ ＣＹＰ２Ｃ９Ａ／６１−Ｐ：
ＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ
配列番号９９ パートザイムＢ ＣＹＰ２Ｃ９Ｂ／６１−Ｐ：
ＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣ
配列番号１００ パートザイムＡ ＴＰ５３Ａ／６−Ｐ：
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号１０１ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／６−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号１０３ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／７２−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号１０４ パートザイムＡ ＴＰ５３Ａ／７４−Ｐ：
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号１０５ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／７４−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号１０６ パートザイムＡ ＴＰ５３Ａ／７９−Ｐ：
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
配列番号１０７ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／７９−Ｐ：
ＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号１０８ パートザイムＡ Ｂ２ＭＡ／６０−Ｐ：
ＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
配列番号１０９ パートザイムＢ Ｂ２ＭＢ／６０−Ｐ：
ＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡ
配列番号１１０ パートザイムＡ Ｂ２ＭＡ／６１−Ｐ
ＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ
配列番号１１１ パートザイムＢ Ｂ２ＭＢ／６１−Ｐ
ＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡ
配列番号１１２ パートザイムＡ Ｂ２ＭＡ／７９−Ｐ
ＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
配列番号１１３ パートザイムＢ Ｂ２ＭＢ／７９−Ｐ
ＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡ
配列番号１１４ パートザイムＡ ＨＭＢＳＡ／４９−Ｐ：
ＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＡ
配列番号１１５ パートザイムＢ ＨＭＢＳＢ／４９−Ｐ：
ＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧ
配列番号１１６ パートザイムＡ ＨＭＢＳＡ／７５−Ｐ：
ＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡ
配列番号１１７ パートザイムＢ ＨＭＢＳＢ／７５−Ｐ：
ＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧ
配列番号３４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／２−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号３５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／２−Ｐ：
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号３８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７２−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号５５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７２−Ｐ：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号６６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／８０−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴ
配列番号６７ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／８０−Ｐ：
ＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号１１８ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／５５−Ｐ
ＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号１１９ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／５５−Ｐ
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１２０ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／８０−Ｐ
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴ
配列番号１２１ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／８０−Ｐ
ＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１２２ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／８８−Ｐ
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧ

【0260】

４．２． レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端をフルオロフォアで標識し、３’末端をクエンチャー部分で標識した。表１２は、基質−フルオロフォア／クエンチャーの組合せを示している。いくつかの基質は、１つ超の特定のフルオロフォア／クエンチャーの組合せで試験した。種々の発光波長および励起波長で基質の切断をモニターした（表１２）。

【0261】

【表16】

【0262】

この実施例で試験したレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２１ Ｓｕｂ２：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２８ Ｓｕｂ４９：
ＴＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号３０ Ｓｕｂ６０：
ＧＣＣＡＡＣＣＡＣｇｕＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７８ Ｓｕｂ７５：
ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡ
配列番号８０ Ｓｕｂ７９：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ８０：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号８８ Ｓｕｂ８８：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ

【0263】

４．３． 標的配列ならびにＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、Ｂ２Ｍ、ＨＭＢＳ、ＴＦＲＣ、およびＲＰＬ１３ａ遺伝子の増幅用のＰＣＲプライマー
ＩＭ９細胞系から抽出したヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅用の鋳型として使用した。以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いてｑＰＣＲによりアンプリコンを産生した。プライマー配列は、５’→３’方向に列挙されている。プライマー配列中のボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのＴｍを増大させるユニバーサルタグ（Ｕ１、Ｕ２、またはＵ３）に対応する。このタグは、ＰＣＲ反応の増幅効率を改善する。
配列番号９１ フォワードプライマー ５ＴＦＲＣ＿Ｕ１
ＧＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧ
配列番号９２ リバースプライマー ３ＴＦＲＣ＿Ｕ２
ＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡ
配列番号１２３ フォワードプライマー ５Ｂ２Ｍ＿Ｕ１
ＧＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧ
配列番号１２４ リバースプライマー ３Ｂ２Ｍ＿Ｕ２
ＣＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＧＣＡＡＴＴＣＡＧ
配列番号１２５ フォワードプライマー ５ＴＰ５３＿Ｕ３
ＣＴＡＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣ
配列番号１２６ リバースプライマー ３ＴＰ５３＿Ｕ２
ＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣ
配列番号１２７ フォワードプライマー ５ＲＰＬ１３ａ＿Ｕ３
ＣＴＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡ
配列番号１２８ リバースプライマー ３ＲＰＬ１３ａ＿Ｕ２
ＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ
配列番号１２９ フォワードプライマー ５ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｕ３
ＣＴＡＡＣＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡ
配列番号１３０ リバースプライマー ３ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｕ２
ＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡ
配列番号１３１ フォワードプライマー ５ＨＭＢＳ＿Ｕ３
ＣＴＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＣ
配列番号１３２ リバースプライマー ３ＨＭＢＳ＿Ｕ２
ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡ

【0264】

４．４． 反応成分： 標的配列の増幅および定量
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。反応はすべて、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。表１３のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、
１）９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５２℃で６０秒間とを５０サイクル（５２℃の工程でデータを収集した）、または
２）９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５８℃で６０秒間とを５０サイクル（５８℃の工程でデータを収集した）
のいずれかであった。

【0265】

反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、４０ｎＭのフォワードプライマー、２００ｎＭのリバースプライマー、各２００ｎＭのパートザイムＡおよびパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ ＲＮアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑＨＳ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）または無標的（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ）のいずれかを含有していた。

【0266】

【表17】

【0267】

４．５． 結果： 標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有する各ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応は、５２℃および５８℃の両方のアニーリング温度で、遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、Ｂ２Ｍ、ＨＭＢＳ、ＲＰＬ１３ａ、およびＴＦＲＣのリアルタイム検出で、経時的な蛍光の増加を示した（図７）。すべてのユニバーサル基質で、無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0268】

ＣＹＰ２Ｃ９およびＴＰ５３遺伝子のＭＮＡザイムｑＰＣＲ検出の結果から、試験したユニバーサル基質はすべて、５２℃で等価な性能を呈することが示され、基質間のＣｔ差は０．５未満であり、増幅曲線の傾きは類似していた（表１４ならびにそれぞれ図７（ｉ）ａおよび（ｉｉ）ａ）。より高い５８℃の温度では、試験したシリーズ１の基質（Ｓｕｂ３およびＳｕｂ６）は、試験したシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、およびＳｕｂ７９）よりも劣った性能を呈し、基質間のＣｔ差は１超であり、Ｓｕｂ３およびＳｕｂ６は、増幅曲線の傾きがより緩やかであったことから、より低い効率の反応であることが示唆される（表１４およびそれぞれ図７（ｉ）ｂおよび（ｉｉ）ｂ）。これらのデータから、これらのシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、およびＳｕｂ７９）の改善された設計は、５８℃でより効率的な切断をもたらし、高温でのこの改善された性能は、より低温でのこれらの基質の効率的切断を阻害しないことが示される。

【0269】

Ｂ２ＭおよびＨＭＢＳ遺伝子のＭＮＡザイムｑＰＣＲ検出の結果から、試験したユニバーサル基質はすべて、５２℃で等価な性能を呈することが示され、基質間のＣｔ差はわずか約０．５であり、増幅曲線の傾きは類似していた（表１４ならびにそれぞれ図７（ｉｉｉ）ａおよび（ｉｖ）ａ）。より高い５８℃の温度では、試験したシリーズ２の基質（Ｓｕｂ６０およびＳｕｂ４９）は、試験したシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１およびＳｕｂ７５およびＳｕｂ７９）よりも劣った性能を呈し、基質間のＣｔ差は１超であり、Ｓｕｂ６０およびＳｕｂ４９は、増幅曲線の傾きがより緩やかであったことから、より低い効率の反応であることが示唆される（表１４およびそれぞれ図７（ｉｉｉ）ｂおよび（ｉｖ）ｂ）。これらのデータから、これらのシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７５、およびＳｕｂ７９）の改善された設計は、５８℃でより効率的な切断をもたらし、高温でのこの改善された性能は、より低温での基質の効率的切断を阻害しないことが示される。シリーズ２の基質と対比してシリーズ３の基質の５８℃でのより良好な性能は、シリーズ３の基質が、高活性基質の設計ガイドラインすべてを満たし、シリーズ２の基質がそうではないという事実に起因しうる（表９参照）。

【0270】

ＴＦＲＣ遺伝子のＭＮＡザイムｑＰＣＲ検出の結果から、試験したユニバーサル基質はすべて、５２℃で等価な性能を呈することが示され、基質間のＣｔ差はわずか約０．５であり、増幅曲線の傾きは類似していた（表１４および図７（ｖ）ａ）。５８℃では、試験したシリーズ３の基質（Ｓｕｂ７２およびＳｕｂ８０）は両方とも、シリーズ１の基質（Ｓｕｂ２）よりも良好な性能を呈し、基質間のＣｔ差は１超であり、Ｓｕｂ２は、増幅曲線の傾きがより緩やかであったことから、より低い効率の反応であることが示唆される（表１４および図７（ｖ）ｂ）。５８℃では、シリーズ３の基質Ｓｕｂ８０は、シリーズ３の基質Ｓｕｂ７２よりも良好な性能を呈し、基質間のＣｔ差は１超であった。Ｓｕｂ８０は、高活性基質の設計ガイドラインすべてを満たし、Ｓｕｂ７２は、そうではない（表９参照）。

【0271】

ＲＰＬ１３ａ遺伝子のＭＮＡザイムｑＰＣＲ検出の結果から、５２℃では、シリーズ２の基質Ｓｕｂ５５およびシリーズ３の基質Ｓｕｂ８８は、シリーズ３の基質Ｓｕｂ８０よりも良好にあることが示された（表１４および図７（ｖｉ）ａ）。５８℃では、シリーズ３の基質Ｓｕｂ８０およびシリーズ２のＳｕｂ５５は、同一の性能を呈し、これらの基質は両方とも、シリーズ３の基質Ｓｕｂ８８よりも良好な性能であった（表１４および図７（ｖｉ）ｂ）。シリーズ２の基質Ｓｕｂ５５は、高活性基質の設計ガイドラインの全部をすべて満たすので（表９参照）、良好な性能を呈することが期待されよう。シリーズ３のＳｕｂ８８もまた、高活性基質の設計ガイドラインのすべてを満たすが（表９）、Ｓｕｂ５５と同様な性能を示さなかった。全体的に、設計ガイドラインは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ条件下に効率的に切断される基質が得られる高い可能性を示す。

【0272】

全体的に、一連の異なる標的配列を用いて、シリーズ１、２、および３の基質は、５２℃で行ったＭＮＡザイムｑＰＣＲと同等の性能を呈した。５８℃では、シリーズ３の基質は、以上で説明したように高活性基質の設計ガイドラインのすべてにあてはまるシリーズ２の基質Ｓｕｂ５５を除いて、シリーズ１および２の基質を上回る性能を呈した。これらのデータから、設計ガイドラインは、一般的には、ｑＰＣＲに使用される熱サイクルプロトコルに関連する温度範囲でロバストであるかつ効率的に切断される基質をもたらすことが示される。

【0273】

表１４に（＾）により示されたシリーズ３の基質のいくつかが、非常に高いＴｍを有するため、より低温では切断された基質の代謝回転が不十分になる可能性があり、したがって、たとえ活性が他の基質と同等であったとしても、最終蛍光値がより低くなることは、注目に値する。

【0274】

【表18】

【0275】

実施例５： ＤＮＡザイムと組み合わせたユニバーサル基質の使用
１０−２３ＤＮＡザイムは、基質配列に直接結合してそれを修飾可能な単分子構造である。１０−２３ＤＮＡザイムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用途に有用である。触媒領域の類似性に起因して、１０−２３ＤＮＡザイムは、１０−２３ＤＮＡザイムベースのＭＮＡザイムにより切断可能な基質に結合してそれを切断することが可能である。ＭＮＡザイムと異なり、ＤＮＡザイムは、活性コアを形成するための標的配列を必要としないので、１０−２３ＤＮＡザイムによる基質の結合および後続の切断は、標的配列により影響されず、分離した触媒コアを利用しない。シリーズ１のユニバーサル基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）、シリーズ２のユニバーサル基質（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４９、Ｓｕｂ５５、およびＳｕｂ６０Ｔ）、およびシリーズ３の基質（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７３、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７７、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、およびＳｕｂ８９）を切断するマッチ１０−２３ＤＮＡザイムの能力を測定することにより、本発明の設計ガイドラインが、温度範囲にわたり高活性を有してロバストに１０−２３ＤＮＡザイムにより切断可能な基質の開発をもたらすかを決定した。

【0276】

５．１． １０−２３ＤＮＡザイムオリゴヌクレオチド
以上に記載されたならびに表４および５に列挙された基質に相補的なセンサーアームを用いて、一連の１０−２３ＤＮＡザイムを設計した。ＤＮＡザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されており、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、触媒コアを形成する。以下のいくつかのＤＮＡザイム配列は、まさしく５’および３’末端に追加のＧを含有する（たとえば、Ｄｚ５５）。これらの追加された塩基は、基質にハイブリダイズせず、ＤＮＡザイムが基質を切断する効率に影響を及ぼさない。
配列番号１３３ ＤＮＡザイム Ｄｚ２
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号１３４ ＤＮＡザイム Ｄｚ３
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号１３５ ＤＮＡザイム Ｄｚ６
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号１３６ ＤＮＡザイム Ｄｚ４４
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧ
配列番号１３７ ＤＮＡザイム Ｄｚ４５
ＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＧＴ
配列番号１３８ ＤＮＡザイム Ｄｚ４９
ＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＡ
配列番号１３９ ＤＮＡザイム Ｄｚ５５
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
配列番号１４０ ＤＮＡザイム Ｄｚ６０
ＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
配列番号１４１ ＤＮＡザイム Ｄｚ６１
ＧＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＧ
配列番号１４２ ＤＮＡザイム Ｄｚ７２
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧ
配列番号１４３ ＤＮＡザイム Ｄｚ７３
ＧＣＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＣＧＣＣＡＧ
配列番号１４４ ＤＮＡザイム Ｄｚ７４
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧ
配列番号１４５ ＤＮＡザイム Ｄｚ７５
ＧＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧ
配列番号１４６ ＤＮＡザイム Ｄｚ７７
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧ
配列番号１４７ ＤＮＡザイム Ｄｚ７９
ＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ
配列番号１４８ ＤＮＡザイム Ｄｚ８０
ＧＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴＧＧ
配列番号１４９ ＤＮＡザイム Ｄｚ８４
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
配列番号１５０ ＤＮＡザイム Ｄｚ８５
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
配列番号１５１ ＤＮＡザイム Ｄｚ８６
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧ
配列番号１５２ ＤＮＡザイム Ｄｚ８７
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧ
配列番号１５３ ＤＮＡザイム Ｄｚ８８
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧ
配列番号１５４ ＤＮＡザイム Ｄｚ８９
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ

【0277】

５．２． レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍの励起（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２１ Ｓｕｂ２−ＦＩＢ：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３−ＦＩＢ：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２５ Ｓｕｂ４４−ＦＩＢ：
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ
配列番号２６ Ｓｕｂ４５−ＦＩＢ：
ＡＣＧＧＧＴＣＣＣｇｕＣＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡ
配列番号２８ Ｓｕｂ４９−ＦＢ：
ＴＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号７２ Ｓｕｂ６０Ｔ−ＦＩＢ：
ＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣｇｕＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７６ Ｓｕｂ７３−ＦＢ：
ＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＧＴＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７８ Ｓｕｂ７５−ＦＩＢ：
ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡ
配列番号７９ Ｓｕｂ７７−ＦＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号８０ Ｓｕｂ７９−ＦＩＢ：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ８０−ＦＩＢ：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号８４ Ｓｕｂ８４−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８５ Ｓｕｂ８５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８６ Ｓｕｂ８６−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８７ Ｓｕｂ８７−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８８ Ｓｕｂ８８−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号８９ Ｓｕｂ８９−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ

【0278】

５．３． 反応成分： ５０℃〜６０℃の温度でのＤＮＡザイムによる基質の切断
マッチＤＮＡザイムによる結合および後続の切断により引き起こされる蛍光シグナルの増加により、基質の切断を測定した。マッチＤＮＡザイムによる各基質の切断を測定すべく、個別の反応を構成した（表１５のようなオリゴヌクレオチド）。反応は、２５μＬの全体積中に１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの基質、およびＮＦ−Ｈ２Ｏを含有するものであった。各反応は、「試験」（１ｎＭ ＤＮＡザイム添加）反応または「対照」（ＮＦ−Ｈ２Ｏ添加）反応のいずれかとして二重試験方式で行った。反応は、５０、５２、５４、５６、５８、および６０℃で、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。各反応の蛍光は、最初の５０サイクルでは１秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の５０サイクルでは２５秒後に読み取るようにプログラムした。

【0279】

【表19】

【0280】

５．５． 結果： 種々の温度でのＤＮＡザイムによる基質の切断
マッチ基質と共にＤＮＡザイムを含有する各試験反応は、経時的に蛍光の増加を示した。水のみの対照反応（ＤＮＡザイム無添加）の蛍光の増加はなかった。このことから、ＤＮＡザイム含有反応で生じた蛍光の増加は、ＤＮＡザイムによる結合および後続のレポーター基質の触媒切断によるものであることが実証される。

【0281】

各基質データセット（試験反応および対照反応）で、生の蛍光データ点をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にエクスポートし、二重試験値を平均し、次いで、規格化した。規格化は、各平均データ点を同一の基質を含有する反応の最初の読取り時の無ＤＮＡザイム反応の平均値で割り算することにより行った（たとえば、Ｓｕｂ６１の試験反応の平均データをＳｕｂ６１の無ＤＮＡザイム対照反応の１サイクル目の平均蛍光で割り算し、Ｓｕｂ６１の無ＤＮＡザイム対照反応の平均データをＳｕｂ６１の無ＤＮＡザイム対照反応の１サイクル目の平均蛍光で割り算した）。次いで、これら規格化データを用いて、１０分間の時点での試験反応の規格化蛍光を１０分間の時点での無ＤＮＡザイム反応の規格化蛍光で割り算することにより、反応開始の約１０分間後のシグナル対ノイズ比を計算した。シグナル対ノイズのこの計算は、ＤＮＡザイムと基質との各組合せに対して試験した各温度で行った。次いで、種々の温度でそのマッチＤＮＡザイムによる各基質の切断効率を比較するために、シグナル対ノイズ値を棒グラフ上にプロットした（図８（ｉ））。温度範囲にわたり各基質のシグナル対ノイズ比の標準偏差も計算してプロットし、試験した温度範囲にわたり一貫性のあるシグナル対ノイズを有する基質を決定した（図８（ｉｉ））。このことから、これら基質は温度に対してロバストであることが示唆される。

【0282】

実験誤差に起因して、５４℃でのＳｕｂ２のデータまたは５８℃でのＳｕｂ７９のデータは存在しないが、これがデータの全体的解釈に及ぼす影響はきわめて少ない。

【0283】

各基質に対するシグナル対ノイズ比の分析（図８（ｉ））から、シリーズ１の基質（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、およびＳｕｂ６）は、より低い測定温度で、より高いシグナル対ノイズを有していたことが示される。しかしながら、これらの基質の切断効率は、反応温度を上昇させた場合、劇的に低下した。シリーズ２の基質のサブセット（Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ４５、Ｓｕｂ４９、およびＳｕｂ６０Ｔ）に対して、類似のパターンが見られた。他のシリーズ２の基質（Ｓｕｂ５５）および試験したシリーズ３の基質の大多数（Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、およびＳｕｂ８９）は、試験したすべての温度にわたり高いシグナル対ノイズを呈した。シリーズ３の基質Ｓｕｂ７３およびＳｕｂ７７は、試験したすべての温度で一様に低いシグナル対ノイズを有していたことから、新しい設計ガイドラインは、ロバストな基質の良好な設計可能性を提供するが（本出願では８３％の成功率）、これらのガイドラインブトを満たしても、一部のＭＮＡザイムおよび／またはＤＮＡザイムの診断用途に適さない配列が、依然としていくつか存在することが示唆される。また、Ｓｕｂ７３およびＳｕｂ７７の結果から、ｑＰＣＲ用途でロバストでありＭＮＡザイムにより効率的に切断される基質の検出に関して、可能性のある基質配列の大量スクリーニングにＤＮＡザイムを利用してＭＮＡザイム診断用途に好適なものを見いだす方法は、見落としを生じる可能性があり、その逆も同様であることが明らかである（図５のＭＮＡザイムｑＰＣＲにおけるＳｕｂ７３およびＳｕｂ７７の利用の成功例については、実施例２を参照されたい）。

【0284】

全体的に、設計ガイドラインのすべてを満たす基質の大多数（表９）は、これらのガイドラインの１つ以上にあてはまらない基質よりも、試験した温度範囲にわたり大きいシグナル対ノイズ比を示した（図８（ｉ））。より特定的には、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８４、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、およびＳｕｂ８９を用いた反応は、試験したすべての温度で高いシグナル対ノイズ値を呈したことから、これらは、温度範囲にわたりロバストな基質であるであることが実証される。この改善は、各基質に対して温度にわたりシグナル対ノイズ比から標準偏差を計算した時、さらに明白であった（図８（ｉｉ））。この変動測定では、試験した温度範囲にわたり、シリーズ２の基質Ｓｕｂ５５ならびにシリーズ３の基質Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２ Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、Ｓｕｂ８２、Ｓｕｂ８３、Ｓｕｂ８５、Ｓｕｂ８６、Ｓｕｂ８７、Ｓｕｂ８８、およびＳｕｂ８９は、試験した温度範囲にわたり類似のシグナル対ノイズを有することが示されたので、広い温度範囲にわたりロバストな基質であることが実証される。Ｓｕｂ６０Ｔ、Ｓｕｂ７３、およびＳｕｂ７７は、温度範囲にわたりシグナル対ノイズの標準偏差が小さいことが実証されるが、絶対的なシグナル対ノイズがすべての温度で非常に低いので、本出願ではこれらの基質がロバストな基質から除外されることに留意されたい。

【0285】

実施例６： ＭＮＡザイムｑＰＣＲを用いたユニバーサル基質の非特異的切断に関する試験。
ＭＮＡザイムは、ＰＣＲのような、ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いて、標的核酸の増幅をリアルタイムで観察するのに使われ得る。増幅と検出はＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。個々の標的に特異的な標的センサーアームを有するパートザイムを用いて、単一の反応槽内で複数の標的を増幅および検出することが可能である。第１の標的を検出するためのパートザイムは、第１の基質に結合してそれを切断し、第２の標的を検出するためのパートザイムは、第２の基質に結合してそれを切断するであろう。標的の検出を特異的なものとするために、反応ミックス中の任意の他の基質を切断するように設計されたパートザイムによる基質の非特異的切断を存在させることはできない。

【0286】

ＭＮＡザイムパートザイムの基質センサーアームと反応時に存在する他の基質との相補度は、結合の特異性に影響を及ぼす。リボヌクレオチドに最も近い塩基の十分な相補性は、特異的切断により重要である。効率的に切断されるユニバーサル基質の形成の設計ガイドラインは、ユニバーサル基質の配列組成に関する制約を含む。すなわち、リボヌクレオチド（Ｎ４〜Ｎ１３）を取り囲む１０個の塩基中７個以上はシトシンヌクレオチドであり、リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ８およびＮ９）はシトシンであり、基質の全含有率は＞６４％ピリミジンを有する。これらの制約は、リボヌクレオチドの近くの基質の配列の類似性をもたらす可能性があり、とくに、一連のユニバーサル基質が単一の反応ミックス中にそれらの関連パートザイムと共に存在する多重方式では、部分的にマッチしたパートザイムによるユニバーサル基質の非特異的切断を引き起こす可能性がある。基質が、第２の基質を特異的に切断するように設計された部分的にマッチしたパートザイムにより非特異的に切断される場合、その特定の組合せの基質は、多重方式で使用するのに好適ではない可能性がある。

【0287】

この実施例では、Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ７４に会合するパートザイムによる非特異的切断活性に関して、ユニバーサル基質Ｓｕｂ４４、Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ６５、Ｓｕｂ７２、およびＳｕｂ７４を試験した。これは、他の基質に十分な相補性で結合するように設計されたパートザイム対を用いて各ユニバーサル基質を個別に試験して、シグナルがＭＮＡザイムｑＰＣＲ方式で検出されるかを調べることを含んでいた。それぞれの基質が３つの塩基のみ異なることから、Ｓｕｂ７２およびＳｕｂ７４のパートザイムをこの試験に選択した（図９（ｉ）ａおよび（ｉｉ）ａ）。リボヌクレオチドの周りの中心領域（Ｎ４〜Ｎ１３）が非常に類似していることから、Ｓｕｂ５５のパートザイムを選択してＳｕｂ６１およびＳｕｂ６５により試験した（図９（ｉｉｉ）ａ）。他の基質にそれほど類似していないことから、Ｓｕｂ４４のパートザイムを対照として選択した（図９（ｉｖ）ａ）。

【0288】

６．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
非相補的パートザイムによる非特異的切断に関して試験すべく行った実験では、ヒトＲＰＬ１３ａ遺伝子に相補的な標的センサーアームと以上で考察したユニバーサル基質のそれぞれに相補的な基質センサーアームとを有するパートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢを設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号１５５ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／４４−Ｐ：
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧ
配列番号１５６ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／４４−Ｐ：：
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１１８ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／５５−Ｐ
ＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号１１９ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／５５−Ｐ
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１５７ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／７２−Ｐ：
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号１５８ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／７２−Ｐ：：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１５９ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／７４−Ｐ：
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号１６０ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／７４−Ｐ：：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ

【0289】

６．２． レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）の励起を用いて５３０ｎｍ（ＦＡＭ発光波長）で基質の切断をモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２５ Ｓｕｂ４４−ＦＢ：
ＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７４ Ｓｕｂ６５−ＦＢ：
ＴＣＴＣＧＡＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２−ＦＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４−ＦＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ

【0290】

６．３． 標的配列およびＲＰＬ１３ａ増幅用のＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ＩＭ９細胞系から抽出されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ増幅により産生された、ＲＰＬ１３ａ遺伝子のＰＣＲアンプリコンであった。この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。
配列番号１６１ フォワードプライマー ５ＲＰＬ１３ａ：
ＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡ
配列番号１６２ リバースプライマー ３ＲＰＬ１３ａ：
ＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ

【0291】

６．４． 反応成分： 増幅およびユニバーサル基質の特異的および非特異的な切断の測定
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。すべての反応をＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。
サイクルパラメーターは、９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５２℃で６０秒間とを４０サイクル（５２℃でデータを収集した）。表１６の基質およびパートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で試験され、４０ｎＭの５ＲＰＬ１３ａおよび２００ｎＭの３ＲＰＬ１３ａ、２００ｎＭのパートザイムＡ、２００ｎＭのパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑＨＳ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ−Ｈ２Ｏ）のいずれかを含有していた。

【0292】

【表20】

【0293】

【表21】

【0294】

６．５． 結果： ＭＮＡザイムによる特異的切断および潜在的非特異的切断の測定
ユニバーサル基質に十分に相補的な基質センサーアームを有するパートザイムと共にゲノムＤＮＡおよびユニバーサル基質を含有するすべての反応で、蛍光の増加が見られた（すなわち、特異的切断を試験する反応）。無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、特異的切断を試験する反応での蛍光よりも少なかったことから、特異的切断を試験する反応での蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後で十分に相補的なユニバーサルレポーター基質が切断されたことに起因することが実証される。

【0295】

交差反応性を試験するいずれの反応でも、蛍光の増加はなかった（図９（ｉ）ｂ〜（ｉｖ）ｂ）。このことから、これらの近縁のユニバーサル基質を切断するように設計されたパートザイムは、十分な相補性を有する基質のみを切断したことが実証される。これらのデータから、これらのユニバーサル基質は、多重ＭＮＡザイムｑＰＣＲアッセイに適合することが示される。

【0296】

実施例７： ＤＮＡザイムによるユニバーサル基質の非特異的切断に関する試験
１０−２３ＤＮＡザイムは、基質配列に直接結合してそれを修飾可能な単分子構造である。ＭＮＡザイムと異なり、１０−２３ＤＮＡザイムは、活性コアを形成するための標的配列を必要としないので、１０−２３ＤＮＡザイムによる基質の結合および後続の切断は、標的配列により影響されず、分離した触媒コアを有していない。

【0297】

ＤＮＡザイムのセンサーアームと基質との相補度は、結合の特異性に影響を及ぼす。リボヌクレオチドに最も近い塩基の十分な相補性は、特異的切断により重要である。効率的に切断されるユニバーサル基質の形成の設計ガイドラインは、ユニバーサル基質の配列組成に関する制約を含む。すなわち、リボヌクレオチド（Ｎ４〜Ｎ１３）を取り囲む１０個の塩基中７個以上はシトシンヌクレオチドであり、リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ８およびＮ９）はシトシンであり、基質の全含有率は＞６４％ピリミジンを有する。これらの制約は、リボヌクレオチドの近くの基質の配列の類似性をもたらす可能性があり、とくに、一連のユニバーサル基質が単一の反応ミックス中にそれらの関連ＤＮＡザイムと共に存在する多重方式では、部分的にマッチしたＤＮＡザイムによるユニバーサル基質の非特異的切断を引き起こす可能性がある。基質が、第２の基質を特異的に切断するように設計された部分的にマッチしたＤＮＡザイムにより非特異的に切断される場合、その特定の組合せの基質は、多重方式で使用するのに好適ではない可能性がある。

【0298】

この実施例では、非特異的切断活性に関して、ユニバーサル基質Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７２、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７９、Ｓｕｂ８０、およびＳｕｂ８、ならびにそれらの関連１０−２３ＤＮＡザイムを試験した。これは、すべての他の基質に十分な相補性で結合するように設計されたＤＮＡザイムを用いてすべてのユニバーサル基質を個別に試験して、シグナルが等温検出方式で検出されうるかを調べることを含んでいた。基質の異なる領域に類似の配列を有することから、これらの基質を試験するように選択した。

【0299】

７．１． １０−２３ＤＮＡザイムオリゴヌクレオチド
非相補的ＤＮＡザイムによる非特異的切断を試験すべく行った実験で使用した１０−２３ＤＮＡザイムは、以下では５’→３’方向に列挙されており、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズし、イタリック体の塩基は、触媒コアを形成する。以下のいくつかのＤＮＡザイム配列は、まさしく５’および３’末端に追加のＧを含有する。これらの追加された塩基は、基質配列にハイブリダイズせず、ＤＮＡザイムが基質を切断する効率に影響を及ぼさない。
配列番号１３９ ＤＮＡザイム Ｄｚ５５
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
配列番号１４１ ＤＮＡザイム Ｄｚ６１
ＧＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＧ
配列番号１４２ ＤＮＡザイム Ｄｚ７２
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧ
配列番号１４４ ＤＮＡザイム Ｄｚ７４
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧ
配列番号１４５ ＤＮＡザイム Ｄｚ７５
ＧＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧ
配列番号１４７ ＤＮＡザイム Ｄｚ７９
ＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧ
配列番号１４８ ＤＮＡザイム Ｄｚ８０
ＧＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴＧＧ
配列番号１５０ ＤＮＡザイム Ｄｚ８５
ＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ

【0300】

７．２． レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍの励起（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７５ Ｓｕｂ７２−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７７ Ｓｕｂ７４−ＦＩＢ：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号７８ Ｓｕｂ７５−ＦＩＢ：
ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣｇｕＣＴＣＣＣＣＡＣＴＡ
配列番号８０ Ｓｕｂ７９−ＦＩＢ：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ８０−ＦＩＢ：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号８５ Ｓｕｂ８５−ＦＩＢ：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ

【0301】

７．３． 反応成分： ５２℃および５８℃でのＤＮＡザイムによるユニバーサル基質の特異的切断および潜在的非特異的切断の測定
ＤＮＡザイムによる基質の結合および後続の修飾により引き起こされる蛍光シグナルをモニターすることにより、ユニバーサル基質の切断を測定した。ＤＮＡザイムによるユニバーサル基質の切断は、フルオロフォアとクエンチャーとの分離を引き起こして蛍光の増加をもたらすであろう。表１７にまとめられている反応はすべて、２５μＬの全体積中に１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００ｎＭの基質、およびＮＦ−Ｈ_２Ｏを含有するものであった。各反応は、「試験」（１０ｎＭ ＤＮＡザイム添加）反応または「対照」（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ添加）反応のいずれかとして二重試験方式で行った。反応は、５２および５８℃で、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。各反応の蛍光は、最初の５０サイクルでは１秒後に読み取るようにプログラムし、その後、その次の５０サイクルでは２５秒後に読み取るようにプログラムした。

【0302】

【表22】

【0303】

７．５． 結果： ＤＮＡザイムによる特異的切断および潜在的非特異的切断の測定ＤＮＡザイム
ＤＮＡザイムとその十分に相補的な基質とを含有する各「試験」反応では、蛍光の増加が見られた。ＤＮＡザイムを含有していなかったいずれの反応（ＤＮＡザイム無添加）でも、蛍光の増加はなかった。このことから、ＤＮＡザイム含有「試験」反応で生じた蛍光の増加は、ＤＮＡザイムによる結合および後続のレポーター基質の触媒切断によるものであることが実証される。

【0304】

各基質データセット（試験反応および対照反応）で、生の蛍光データ点をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にエクスポートし、二重試験値を平均し、次いで、規格化した。
規格化は、各平均データ点を同一の基質を含有する反応の最初の読取り後の無ＤＮＡザイム反応の平均値で割り算することにより行った（たとえば、Ｓｕｂ６１の試験反応の平均データをＳｕｂ６１の無ＤＮＡザイム反応の１サイクル目の平均蛍光（最初の８秒間後）で割り算し、Ｓｕｂ６１の無ＤＮＡザイム対照反応の平均蛍光を無ＤＮＡザイム対照反応の１サイクル目の平均蛍光で割り算した）。次いで、これらの規格化データを用いて、１０分間の時点での試験規格化蛍光を１０分間の時点での無ＤＮＡザイム規格化蛍光で割り算することにより、１０分間の時点でのシグナル対ノイズ比を計算した。このシグナル対ノイズの計算は、各温度で行った。次いで、シグナル対ノイズ比を棒グラフ上にプロットして、試験した種々の温度で各ＤＮＡザイムによる各ユニバーサル基質の切断効率を比較した（図１０（ｉ）および（ｉｉ））。

【0305】

基質と非相補的ＤＮＡザイムとの種々の組合せを有するいくつかの反応は、対をなす無ＤＮＡザイム対照反応と比較して蛍光レベルのわずかな上昇を示した。このシグナルは、経時的に増加しなかったので、非相補的ＤＮＡザイムによるユニバーサル基質の切断の指標とならない。この水平バックグラウンド蛍光を示す検出プロットはすべて、１．２未満のシグナル対ノイズを有していた。したがって、１．２超のシグナル対ノイズを示すいずれの反応も、（ｉ）ユニバーサル基質の切断の指標となるか（特異的もしくは非特異的のいずれか）、または（ｉｉ）基質と非相補的ＤＮＡザイムとの特定の組合せが、多重方式の場合、特異的切断から識別可能でないバックグラウンドノイズレベルを生じることの指標となるか、のいずれかであるとみなされた。

【0306】

ユニバーサル基質とその十分にマッチしたＤＮＡザイムとの組合せはすべて、試験した両方の温度で高いシグナル対ノイズ比（１．２の閾値を超える）を示した（図１０（ｉ）および（ｉｉ））。

【0307】

いずれの温度でも、いかなる非相補的ＤＮＡザイムによるユニバーサル基質Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７５、Ｓｕｂ７９、およびＳｕｂ８０の非特異的切断も、なかった（図１０（ｉ）および（ｉｉ））。

【0308】

５２℃では、いくつかのユニバーサル基質は、基質に十分にマッチしなかったＤＮＡザイムにより切断された（この場合、切断は、以上に記載の１．２の閾値を超えるシグナル対ノイズ比として定義される）。非特異的切断を示す組合せは、Ｄｚ５５により非特異的に切断されたＳｕｂ８５、Ｄｚ７４およびＤｚ８５により非特異的に切断されたＳｕｂ７２、およびＤｚ８５により非特異的に切断されたＳｕｂ５５であった（図１０（ｉ））。

【0309】

Ｓｕｂ５５とＤｚ８５とは４塩基のみ異なるので、Ｄｚ８５によるＳｕｂ５５の非特異的切断が予想されうる。Ｓｕｂ５５とＤｚ８５とのアライメントから、４塩基のミスマッチは、リボヌクレオチドに近接するクリティカル領域から離れて３’基質アームの遠位端にあることが示される（表１８）。さらに、４塩基の１つは、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃマッチよりも弱いとはいえ、いくらかの親和性で結合することが当技術分野で公知のＧ／Ｔミスマッチである。Ｓｕｂ８５とＤｚ５５とは５塩基のみ異なり、この５塩基ミスマッチは、リボヌクレオチドに近接するクリティカル領域から離れて３’基質アームの遠位端に見いだされるので、Ｄｚ５５によるＳｕｂ８５の非特異的切断もまた、予想されうる（表１８）。しかしながら、以上の逆のシナリオとは異なり、Ｇ／Ｔミスマッチは存在しないので、Ｓｕｂ８５は、Ｓｕｂ５５とＤｚ８５との逆の組合せと同程度に効率的に切断されることはないと思われる。Ｓｕｂ７２とＳｕｂ７４とは３塩基のみ異なるので、Ｄｚ７４によるＳｕｂ７２の非特異的切断が予想されうる。Ｓｕｂ７２とＤｚ７４とのアライメントから、リボヌクレオチドに最も近い２つのミスマッチは、Ｇ／Ｔミスマッチであることが示される（表１８）。このことはまた、なぜＳｕｂ７４がＤｚ７２により切断されないかを説明する。つまり、２つのミスマッチはＣ／Ａであり、これはリボヌクレオチドの非常に近くに存在し、ＤＮＡザイムによる基質の切断を無効にするのに十分である（表１８）。表１８の配列のアライメントにより、Ｄｚ８５によるＳｕｂ７２の非特異的切断を説明することが可能である。これは、ミスマッチ塩基が主にＧ／Ｔであることを示すので、Ｄｚ８５をＳｕｂ７２に結合させてそれを切断するであろう。この場合も、Ｄｚ７２がＳｕｂ８５を非特異的に切断するという逆の状況は予想されないであろう。なぜなら、関連ミスマッチが、より不安定性のＣ／Ａミスマッチになるので、おそらく、ＤＮＡザイムと基質との十分に強い結合を引き起こして切断することはないであろう。

【0310】

【表23】

【0311】

反応温度を５８℃に上昇させたところ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのよりストリンジェントな条件が形成され、５２℃で見られた非特異的切断はほとんどすべての消失した（図１０（ｉｉ））。５８℃で非特異的切断を示したユニバーサル基質とＤＮＡザイムとの唯一の組合せは、Ｄｚ８５によるＳｕｂ５５の非特異的切断であった。Ｓｕｂ５５およびＤｚ８５は４塩基のみ異なり、この４塩基ミスマッチは、リボヌクレオチドに近接するクリティカル領域から離れて基質アームの遠位端に見いだされ、ミスマッチの１つはＧ／Ｔであることから、この非特異性は、予想されうる（表１８）。Ｓｕｂ７２とＳｕｂ７４とは３塩基のみ異なるだけであるが、この３塩基ミスマッチは、リボヌクレオチドの近くのクリティカル領域に生じるので、特異性にはきわめて重大であり、オリゴヌクレオチドの結合に対してよりストリンジェントな条件を形成するより高い温度では、さらに不安定化するであろう。

【0312】

これらの結果から、設計ガイドラインは、１０−２３ＤＮＡザイムを必要とする用途の温度範囲で効果的に多重化可能なユニバーサル基質を生成することが実証される。基質のいくつかの組合せに十分な結合ストリンジェンシーを提供するように、ただし、全体的に、ガイドラインが、多重化可能な基質のセットを生成するように、反応温度のいくらかの最適化の必要性が存在する。基質およびＤＮＡザイム結合アームの長さを調整することにより、より低いおよびより高い温度でよりストリンジェントな結合を形成することが可能であることは、当業者であれば理解しうる。

【0313】

実施例８： ５２℃または５８℃のアニーリング温度を用いて多重反応で５つの異なる核酸標的の定量を行う多重ＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
ｑＰＣＲなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いて、リアルタイムで複数の標的を同時に増幅および検出することが可能である。さらに、複数のユニークＭＮＡザイムを含む１つの多重化反応により、リアルタイムで標的の増幅を同時にモニターすることが可能である。１つの標的に特異的なセンサーアームと、一連のユニバーサル基質のユニークメンバーに特異的な基質アームと、を用いて、各ＭＮＡザイムを設計することが可能である。一連のユニバーサル基質のそれぞれが異なるフルオロフォアで標識されるのであれば、各標的を個別に検出することが可能である。複数の標的の増幅および検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。リアルタイムモニタリングでは、曲線の形状（スティープネスおよびプラトーに達する速度）により反応効率を表しうる増幅曲線を作成する。

【0314】

当技術分野で使用されるＭＮＡザイムｑＰＣＲのアニーリング／検出温度は、５０〜５４℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ１のユニバーサル基質の効率的な切断では５４℃が上限であるという事実により決定された。多重反応での組合せおよびより高い温度での効率的切断が可能な一群のユニバーサル基質の必要性が存在する。これにより、より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計したりＧ／Ｃリッチ鋳型を標的としたりうえでの柔軟性を高めることが可能になるだけでなく、標準的アニーリング／検出温度が６０〜６５℃の範囲内であるＴａｑＭａｎ（登録商標）など当技術分野で周知の他のリアルタイム化学を併用してＭＮＡザイムｑＰＣＲ検出を多重化することも可能になる。より広範な温度で良好に一緒に機能する基質が存在すれば、ユニバーサル基質の有用性は、大幅に増大させるであろう。

【0315】

この実施例では、２つの多重反応を行った。それらは、両方とも、５つの異なる標的、すなわち、ヒトＴＦＲＣ、ＨＰＲＴ、ＴＰ５３、ＲＰＬ１３ａ、およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を検出するように設計されたＭＮＡザイムを含むものであった。多重方式１では、シリーズ１のユニバーサル基質Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３、Ｓｕｂ４、Ｓｕｂ６、およびＳｕｂ７の１つを切断するように各標的ＭＮＡザイムを設計し、多重方式２では、改善されたシリーズ２または３のユニバーサル基質Ｓｕｂ５５、Ｓｕｂ６１、Ｓｕｂ７４、Ｓｕｂ７９、およびＳｕｂ８０の１つを切断するように各標的ＭＮＡザイムを設計した。本方法に従って任意の個数の標的を使用可能であり、当業者により任意の標的を検出するように適切なパートザイムを設計可能であることは、わかるであろう。

【0316】

２つの多重反応を比較して曲線の形状（スティープネスおよびプラトーに達する速度）を調べることにより、ユニバーサル基質の各セットの切断効率を決定した。この実施例では、すべての基質に有利な５２℃の温度およびシリーズ１の基質で効率的な範囲を外れた５８℃の温度で、増幅および検出を比較する。

【0317】

８．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
各標的に対するパートザイムＡおよびＢの配列を５’→３’方向に以下に列挙する。各標的に対して、最初のシリーズ１のユニバーサル基質の１つおよびシリーズ３からの新規な改善された基質の１つと共に使用するように、パートザイムを設計した。次の配列では、下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号１５７ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／６−Ｐ
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＴＧＡＴ
配列番号１６３ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／６−Ｐ
ＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号１２０ パートザイムＡ ＲＰＬ１３ａＡ／８０−Ｐ
ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴ
配列番号１２１ パートザイムＢ ＲＰＬ１３ａＢ／８０−Ｐ
ＧＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴ
配列番号９６ パートザイムＡ ＣＹＰ２Ｃ９Ａ／３−Ｐ
ＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧ
配列番号９７ パートザイムＢ ＣＹＰ２Ｃ９Ｂ／３−Ｐ
ＣＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣ
配列番号９８ パートザイムＡ ＣＹＰ２Ｃ９Ａ／６１−Ｐ
ＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ
配列番号９９ パートザイムＢ ＣＹＰ２Ｃ９Ｂ／６１−Ｐ
ＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣ
配列番号１６４ パートザイムＡ ＴＰ５３Ａ／４−Ｐ
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＣＧＣＣＡＴＧ
配列番号１６５ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／４−Ｐ
ＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号１０６ パートザイムＡ ＴＰ５３Ａ／７９−Ｐ：
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
配列番号１０７ パートザイムＢ ＴＰ５３Ｂ／７９−Ｐ：：
ＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧ
配列番号３４ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／２−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＴ
配列番号３５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／２−Ｐ：：
ＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号５８ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７４−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴ
配列番号５９ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７４−Ｐ：：
ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号１６６ パートザイムＡ ＨＰＲＴＡ／７つのＰ
ＣＴＧＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＴＡＡ
配列番号１６７ パートザイムＢ ＨＰＲＴＢ／７つのＰ
ＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＴＴＴＴＡ
配列番号１６８ パートザイムＡ ＨＰＲＴＡ／５５のＰ
ＣＴＧＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号１６９ パートザイムＢ ＨＰＲＴＢ／５５のＰ
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＴＴＴＴＡ

【0318】

８．２． レポーター基質
この実施例では、各多重方式で、５つの異なるユニバーサル基質を１つの反応チャンバー内で一緒に使用した。各多重方式で、各ユニバーサル基質を５つの異なるフルオロフォアの１つで標識した。本実施例では、基質は、５’末端をフルオロフォアで標識し、３’末端をクエンチャー部分で標識した（表１９）。種々の発光波長および励起波長で基質の切断をモニターした（表１９）。

【0319】

【表24】

【0320】

この実施例で試験したレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２１ Ｓｕｂ２−Ｑ７０５Ｂ２：
ＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＧＧＧＣＡ
配列番号２２ Ｓｕｂ３−ＦＩＢ：
ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣｇｕＣＡＣＣＡＡＣＣＧ
配列番号２３ Ｓｕｂ６−Ｑ６７０Ｂ２：
ＡＴＣＡＣＧＣＣＴＣｇｕＴＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号２４ Ｓｕｂ７−ＪＢ：
ＴＴＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣｇｕＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡ
配列番号１７１ Ｓｕｂ４−ＴＲＢ２：
ＣＡＴＧＧＣＧＣＡＣｇｕＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡ
配列番号７３ Ｓｕｂ６１−ＦＩＢ：
ＣＴＣＧＡＣＣＣＣｇｕＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡ
配列番号７７ Ｓｕｂ−７４Ｑ７０５Ｂ２：
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ
配列番号８０ Ｓｕｂ−７９ＴＲＩＢＲ：
ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇｕＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣ
配列番号８１ Ｓｕｂ−８０Ｑ６７０Ｂ２：
ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＧＴＧＡＡＣＣ
配列番号２９ Ｓｕｂ−５５ＨＩＢ：

【0321】

８．３ 標的配列ならびにＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、ＨＰＲＴ、ＴＦＲＣ、およびＲＰＬ１３ａ遺伝子の増幅用のＰＣＲプライマー
ＩＭ９細胞系から抽出されたヒトＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅により、５つの遺伝子すべてに対して標的ＰＣＲアンプリコンを作製した。以下に５’→３’方向に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、アンプリコンを作製した。ボールド体の配列は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼすことのなくプライマーのＴｍを増大させるユニバーサルタグ（Ｕ１、Ｕ２、またはＵ３）に対応する。このタグは、ＰＣＲ反応の増幅効率を改善する。
配列番号９１ フォワードプライマー ５ＴＦＲＣ＿Ｕ１
ＧＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧ
配列番号９２ リバースプライマー ３ＴＦＲＣ＿Ｕ２
ＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡ
配列番号１２５ フォワードプライマー ５ＴＰ５３＿Ｕ３
ＣＴＡＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣ
配列番号１２６ リバースプライマー ３ＴＰ５３＿Ｕ２
ＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣ
配列番号１２７ フォワードプライマー ５ＲＰＬ１３ａ＿Ｕ３
ＣＴＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡ
配列番号１２８ リバースプライマー ３ＲＰＬ１３ａ＿Ｕ２
ＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ
配列番号１２９ フォワードプライマー ５ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｕ３
ＣＴＡＡＣＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡ
配列番号１３０ リバースプライマー ３ＣＹＰ２Ｃ９＿Ｕ２
ＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡ
配列番号１７６ フォワードプライマー ５ＨＰＲＴ＿Ｕ３
ＣＴＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡ
配列番号１７７ リバースプライマー ３ＨＰＲＴ＿Ｕ２
ＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡ

【0322】

８．４． 反応成分： 多重ＭＮＡザイムｑＰＣＲ方式での標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。反応はすべて、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。サイクルパラメーターは、１）９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５２℃で６０秒間とを４０サイクル、または２）９５℃で２分間の、９５℃で１５秒間と５８℃で６０秒間とを４０サイクルのいずれかであった。５２℃または５８℃の工程のいずれかで、蛍光データを収集した。各多重反応は、二重試験方式で行われ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏｓａｆｅ ＲＮアーゼ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑＨＳ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含んでいた。パートザイム、プライマー、および基質が何であるか、ならびにそれらのそれぞれの濃度は、表２０に列挙されている。反応は、ＤＮＡ鋳型（１００ｎｇもしくは３９１ｐｇ）または無標的対照（ＮＦ−Ｈ_２０）のいずれかを含有していた。

【0323】

表２０のように、プライマー、基質、およびそれらの関連パートザイムを用いて、多重反応を構成した（多重方式１または多重方式２）。同一のＰＣＲプライマーを両方の多重反応に使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的感知部分を有していた。したがって、同一の標的を検出する反応の効率に差があれば、基質の切断効率の差に帰属しうるであろう。

【0324】

【表25】

【0325】

８．５． 結果： 多重ＭＮＡザイムｑＰＣＲ方式での標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有する各多重反応は、遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、ＨＰＲＴ、ＲＰＬ１３ａ、およびＴＦＲＣのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0326】

５２℃でのＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、ＨＰＲＴ、ＲＰＬ１３ａ、およびＴＦＲＣ遺伝子の増幅プロットでは、新しい改善されたシリーズ２および３のユニバーサル基質を使用した多重方式２（図１１（ｉ））は、急勾配の曲線を有し、シリーズ１のユニバーサル基質を使用した多重方式１（図１１（ｉ））で観測されたよりも速くプラトーに達することが実証された。５２℃ではＳｕｂ７４と対比してＳｕｂ２を用いたＴＦＲＣの検出の増幅プロットにごくわずかな差が存在した。シリーズ２および３の基質と対比してシリーズ１を用いた多重方式１の増幅プロットはすべて、これらの標的の検出分野で容易に許容可能な十分に良好な品質であることは、当業者であればわかるであろう。

【0327】

５８℃でのＣＹＰ２Ｃ９、ＴＰ５３、ＨＰＲＴ、ＲＰＬ１３ａ、およびＴＦＲＣ遺伝子の増幅プロットでは、新しい改善されたシリーズ２および３のユニバーサル基質を使用した多重方式２（図１１（ｉｉ））は、かなり急勾配の曲線を有し、シリーズ１のユニバーサル基質を使用した多重方式１（図１１（ｉｉ））で観測されたよりも実質的に速くプラトーに達することが実証された。多重方式１でＳｕｂ２、Ｓｕｂ３、Ｓｕｂ６、およびＳｕｂ７を用いて作成された増幅曲線は、標的のロバストな検出に十分な品質でない可能性があり、従って、一般的には、当技術分野で許容できない可能性がある。

【0328】

全体的に、新しいシリーズ２および３の基質は、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応で現在使用されている温度で多重データの改善された品質ひいてはロバスト性を示し、これまで可能であったよりもかなり高い温度で多重検出を可能にする。新しい設計ガイドラインは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲに現在使用されている温度で多重化能を拡張する、かつより高い反応温度でロバストなデータを生成する、ユニバーサル基質の設計可能性を増大させる。

【0329】

実施例９： リアルタイムＰＣＲでＭＮＡザイムを用いて種々の温度で機能するように設計されたユニバーサル基質の使用。
設計ガイドラインの新規なセットを用いて、１０−２３ＤＮＡザイムまたは１０−２３ＤＮＡザイムベースのＭＮＡザイムと併用すべく、高活性基質の新しいシリーズを発明した。

【0330】

ＭＮＡザイムを調節して、種々の温度で基質の切断またはライゲーションにより検出可能作用を生成することが可能である。反応温度を変化させることにより、ＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイムの触媒活性の効率およびストリンジェンシーを操作することが可能である。触媒活性の効率およびストリンジェンシーを最適化する他の方法は、基質、マッチパートザイム、またはマッチＤＮＡザイムのＴｍおよび／または長さを修飾することである。基質配列の５’および／または３’末端にヌクレオチドを付加することにより、基質のＴｍを増大させることが可能である。これらの変更を設計ガイドライン内に行なうことが可能である。この拡張のために選択されるヌクレオチドもまた、Ｔｍに影響を及ぼしうる。３’または５’末端への追加のＧまたはＣ塩基の付加は、追加のＡまたはＴ塩基の付加よりもＴｍに大きい影響を及ぼすであろう。同様に、３’または５’末端からヌクレオチドを除去することにより、基質のＴｍを低減することが可能である。ＭＮＡザイムパートザイムおよびＤＮＡザイムをトランケートまたは伸長して基質配列にマッチさせることが可能である。

【0331】

この実施例では、シリーズ２の基質Ｓｕｂ５５の長さおよび塩基組成を修飾して、さまざまなＴｍを有する一連の誘導体基質を作製した（表２１）。修飾は、５’および３’末端のそれぞれから１〜３個のヌクレオチドを除去することにより基質をトランケートすること、５’および３’末端の両方にヌクレオチドを付加することにより基質を伸長すること、を含んでいた。５’および３’末端に追加のＡまたはＣヌクレオチドのいずれかを有する基質を設計することにより、この拡張を行うべく異なるヌクレオチドを付加する作用も、試験した。次いで、得られた基質をＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応で試験して、基質の誘導体の設計柔軟性および一連の温度でのそれらの有用性を評価した。ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで行った。いくつかのアニーリング温度で得られたＣｔ値により、基質の切断効率を測定することが可能である。より低いＣｔ値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。

【0332】

【表26】

【0333】

９．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
表２１に記載のＳｕｂ５５およびその誘導体の触媒活性の速度を測定するために行った実験では、ヒトＴＦＲＣ遺伝子に相補的標的センサーアームを用いてパートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢを設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号１７９ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５（１８）−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧ
配列番号１８０ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／５５（１８）−Ｐ：
ＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号１８１ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５（１６）−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣ
配列番号１８２ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／５５（１６）−Ｐ：
ＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号１８３ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５（２３Ａ）−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＴ
配列番号１８４ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／５５（２３Ａ）−Ｐ：
ＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号１８５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＡ／５５（２３Ｃ）−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧ
配列番号１８６ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／５５（２３Ｃ）−Ｐ：
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ
配列番号４６ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５５−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＴ
配列番号４５ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／５５−Ｐ：
ＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ

【0334】

９．２． レポーター基質
本実施例では、５’末端をＱｕａｓａｒ６７０部分で、３’末端をＢＨＱ２部分で、末端標識した。６３５ｎｍ（Ｑｕａｓａｒ６７０励起波長）の励起を用いて６６５ｎｍ（Ｑｕａｓａｒ６７０発光波長）で基質の切断をモニターした。この実施例で試験したレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
配列番号２９ Ｓｕｂ５５−Ｑ６７０Ｂ２：
ＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣ
配列番号１７２ Ｓｕｂ５５（１６）−Ｑ６７０Ｂ２：
ＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣ
配列番号１７３ Ｓｕｂ５５（１８）−Ｑ６７０Ｂ２：
ＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴ
配列番号１７４ Ｓｕｂ５５（２３Ａ）−Ｑ６７０Ｂ２：
ＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡ
配列番号１７５ Ｓｕｂ５５（２３Ｃ）−Ｑ６７０Ｂ２：
ＣＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｇｕＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣ

【0335】

９．３． 標的配列およびＴＦＲＣ増幅用のＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ＩＭ９細胞系から抽出されたヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅により産生されたＰＣＲアンプリコンであった。プライマー配列は、５’→３’方向に列挙されている。
配列番号１８７ フォワードプライマー ５ＴＦＲＣ：
ＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧ
配列番号１８８ リバースプライマー ３ＴＦＲＣ：
ＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡ

【0336】

９．４． 反応成分： 標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイム増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。すべての反応をＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）で行った。サイクルパラメーターは、アニーリング温度により変化させ（次のように下線を付す）、以下のいずれかであった。
１）９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と５５℃で３０秒間とを５サイクル、９５℃で１５秒間と５０℃で６０秒間とを５０サイクル、または
２）９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と５５℃で３０秒間とを５サイクル、９５℃で１５秒間と５２℃で６０秒間とを５０サイクル、または
３）９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と５５℃で３０秒間とを５サイクル、９５℃で１５秒間と５５℃で６０秒間とを５０サイクル、または
４）９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間と５５℃で３０秒間とを５サイクル、９５℃で１５秒間と６０℃で６０秒間とを５０サイクル。
すべての蛍光データをアニーリング温度で収集した。表２２のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、４０ｎＭの５ＴＦＲＣ、２００ｎＭの３ＴＦＲＣ、各２００ｎＭのパートザイムＡおよびパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｎａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１単位のＩｍｍｏｌａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）または無標的（ＮＦ−Ｈ_２Ｏ）のいずれかを含有していた。個別の反応を構成して、そのマッチパートザイムにより各基質を試験した。同一のＰＣＲプライマーをすべての反応に使用した。また、パートザイムはすべて、同一の標的感知部分を有していた。したがって、種々の温度で、反応効率に差があれば、基質の切断効率の差に帰属しうるであろう。

【0337】

【表27】

【0338】

９．５． 結果： 標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有する各反応は、Ｓｕｂ５５および種々の誘導体を用いたＴＦＲＣ遺伝子のリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサル基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0339】

Ｃｔにより測定された反応効率は、反応温度（アニーリング／切断温度）の適合性および反応に使用される基質のＴｍに依存した。種々のＳｕｂ５５誘導体は、異なる長さおよびヌクレオチド組成を有するので、異なる融解温度（Ｔｍ）を有し、したがって、試験した種々のアニーリング温度（５０、５２、５５および６０℃）で異なる性能を呈すると予想される。表２３の結果は、異なる反応温度での各基質のＣｔを示している。ボールド体のＣｔ値は、指定の温度で最も効率的な性能を呈した基質を表す。

【0340】

より低温では、より短い基質（Ｓｕｂ５５（１８））がより良好な性能を呈した（低いＣｔ値を有していた）。アニーリング温度を上昇させると、増大された長さしたがって増大されたＴｍを有する基質が最適な性能を呈した。当業者であれば、５’および／もしくは３’末端の基質アームの延長または短縮により、ならびに／または基質の５’および３’末端のヌクレオチド組成の変化により、選択された反応温度で効率的に切断可能な基質の誘導体を作製することが可能である。

【0341】

【表28】

【0342】

実施例１０： ５８℃のアニーリング温度におけるＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせたユニバーサル基質の使用。
ＰＣＲなどのｖｉｔｒｏ標的増幅方法を用いてリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために、ＭＮＡザイムを使用することが可能である。さらに、フルオロフォアとクエンチャーとの対で標識されたＭＮＡザイム基質を用いたｑＰＣＲ中のリアルタイムモニタリングでは、反応の対数期にわたり任意のレベルの蛍光の閾値ラインを配置して、Ｃｔ（サイクル閾値）として知られうる値を生成可能な曲線が作成される。より低いＣｔ値を生じる反応は、そのような反応がより速く閾値サイクルに達するので、特異的基質のより効率的な切断の指標となる。この実施例では、増幅および検出は、ＰＣＲ増幅およびＭＮＡザイム媒介検出が単一のチューブ内で同時に行われる一工程プロセスで実施される。他の反応条件がすべての同一である場合、Ｃｔ値は、ユニバーサル基質の配列による影響を受けることもある。当技術分野で使用されるＭＮＡザイムｑＰＣＲのアニーリング／検出温度は、５０〜５４℃である。この温度は、当技術分野で公知のユニバーサル基質が、効率的に切断される温度に課される限定条件を有し、シリーズ１のユニバーサル基質では５４℃が上限であるという事実により決定された。より高い温度でアニールするプライマーおよびパートザイムを設計するうえでより大きい柔軟が可能になるように、より高い温度で切断されるユニバーサル基質の必要性が存在する。プライマーおよびパートザイムに対するこの設計柔軟性は、特異的検出のためにより高い反応温度ひいてはより高いＴｍを有するパートザイムおよびプライマーを必要とする、配列中に高パーセントのＧ塩基およびＣ塩基を有する対象の遺伝子標的など、多くの用途にきわめて有益でありうる。

【0343】

シリーズ１および２の基質の性能に基づく基質の切断効率についての研究は、第３ラウンドの基質設計を支援するガイドラインの開発につながり、結果的に、シリーズ３の基質をもたらす。これらのガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基（Ｎ_４〜Ｎ_１３）中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ８およびＮ９）がシトシンである、（ｉｉｉ）基質の全含有率が＞６４％ピリミジンを有する、および（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの全Ｔｍが６６℃以上である（後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が５０℃超である場合のみ適用可能である）、を含んでいた。

【0344】

この実施例では、シリーズ２のユニバーサル基質Ｓｕｂ５９をシリーズ３の基質Ｓｕｂ７７と比較して、５８℃でのリアルタイムＰＣＲの切断効率を比較することにより、設計ガイドラインが、高温でのＭＮＡザイムｑＰＣＲへの高い適用可能性を有するユニバーサル基質を生成することを確証する。切断効率レベルは、さまざまなユニバーサル基質を含有する反応に対してＣｔ値を測定することにより決定した。

【0345】

１０．１． パートザイムオリゴヌクレオチド
シリーズ２およびシリーズ３のユニバーサル基質の切断効率をリアルタイムで測定すべく行った実験では、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢはすべて、ヒトＴＦＲＣ遺伝子の同一の配列に相補的なセンサーアームを用いて設計した。ＡおよびＢのパートザイムの配列は、以下では５’→３’方向に列挙されている。下線付き塩基は、それらのマッチユニバーサル基質にハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を表す。
配列番号４７ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／５９−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧ
配列番号６２ パートザイムＡ ＴＦＲＣＡ／７７−Ｐ：
ＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧ
配列番号６３ パートザイムＢ ＴＦＲＣＢ／７７−Ｐ：
ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴ

【0346】

１０．２． レポーター基質
この実施例のレポーター基質は、以下では５’→３’方向の配列で示されている。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例では、基質は、５’末端を６−ＦＡＭ部分（以下の基質名では「Ｆ」により表される）で、３’末端をＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー部分（以下の基質名で「ＩＢ」により表される）で、末端標識した。基質の切断は、４８５ｎｍの励起（Ｍｘ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくＦＡＭ励起波長領域）を用いて５３０ｎｍ（Ｍｘ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくＦＡＭ発光波長範囲）でモニターした。
配列番号３３ Ｓｕｂ５９−ＦＩＢ：
ＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号７９ Ｓｕｂ７７−ＦＩＢ：
ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣｇｕＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ

【0347】

１０．３． 標的配列およびＴＦＲＣ増幅用のＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に列挙したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて、ＩＭ９細胞系（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出されたヒトゲノムＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅により産生された、ＴＦＲＣ遺伝子のＰＣＲアンプリコンであった。プライマー配列は、５’→３’方向に列挙されている。
配列番号１８７ フォワードプライマー ５ＴＦＲＣ：
ＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧ
配列番号１８８ リバースプライマー ３ＴＦＲＣ：
ＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡ

【0348】

１０．４． 反応成分： 標的配列の増幅および定量
標的配列のリアルタイムＰＣＲ増幅および検出は、２５μＬの全反応空間内で行った。すべての反応をＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。表２４のように、基質およびその関連パートザイムを用いて反応を構成した。サイクルパラメーターは、９５℃で２分間、９５℃で１５秒間と５８℃で６０秒間とを４０サイクル（５８℃の工程でデータを収集した）。反応条件の各セットは、二重試験方式で行われ、４０ｎＭの５ＴＦＲＣ、２００ｎＭの３ＴＦＲＣ、各２００ｎＭのパートザイムＡおよびパートザイムＢ、２００ｎＭの基質、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１×Ｉｍｍｏｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑＨＳ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびゲノムＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ−Ｈ２Ｏ）のいずれかを含有していた。

【0349】

【表29】

【0350】

１０．５． 結果： 標的の増幅およびレポーター基質の切断
ヒトゲノムＤＮＡを含有する各ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応では、ヒトゲノムＤＮＡからのＴＦＲＣのリアルタイム検出で経時的に蛍光の増加を示した。すべての反応で、無ＤＮＡ標的対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応よりも少なかった。このことから、標的含有反応で生じた蛍光の増加は、触媒活性ＭＮＡザイムの標的依存集合の後でユニバーサルレポーター基質の１つが切断されたことに起因することが実証される。

【0351】

シリーズ２の基質Ｓｕｂ５９を用いた反応は、２８．５の平均Ｃｔ値を示し、一方、シリーズ３の基質Ｓｕｂ７７を用いた反応は、２６．５の平均Ｃｔ値を示した。

【0352】

Ｓｕｂ５９およびＳｕｂ７７は、同一のＴｍおよび％Ｃ／Ｔを有するが、中心領域Ｎ４〜Ｎ１３中のシトシンの数およびＮ８の組成が異なることは、注目に値する。リボヌクレオチドを取り囲む中心領域では、Ｓｕｂ７７は、位置Ｎ８にシトシンを有しており、これは、より低いＣｔ値（２６．５）により示唆されるように、Ｓｕｂ５９よりも改善された切断効率をもたらすように思われる。Ｓｕｂ５９は、位置Ｎ８にチミンを含有し、５’アームの遠位端に付加されたシトシンを有しており、これは、切断反応の減少ひいてはより高いＣｔ値（２８．５）をもたらす。

【0353】

注目に値するのは、効率的に切断される基質のヌクレオチド配列の性質および基質のリボヌクレオチドに対する特異的ヌクレオチドの近接性が重要なことである。これらの特徴は、高温で効率的に切断される可能性がより高いユニバーサル基質をもたらす一群のガイドラインの根底をなす。これらの設計ガイドラインは、限定されるものではないが、（ｉ）リボヌクレオチドを取り囲む１０個の塩基（Ｎ４〜Ｎ１３）中に７個以上のシトシンヌクレオチド、（ｉｉ）リボヌクレオチドに直接隣接した塩基（Ｎ８およびＮ９）がシトシンである、（ｉｉｉ）基質の全含有率が＞６４％ピリミジンを有する、（ｉｖ）オリゴヌクレオチドの全Ｔｍが６６℃以上である（後者のガイドラインは、基質切断の反応温度が５０℃超である場合のみ適用可能である）を含む（すべてが必要であるとは限らないこともありうる）（表２５）。シリーズ３の基質Ｓｕｂ７７のＣｔ値がより早期にあるので、この基質は、これらの設計ガイドラインのすべてを満たすと予想され、一方、Ｓｕｂ５９は、これらの設計ガイドラインの２つのみを満たす（表２５）。

【0354】

【表30】

【0355】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【配列表】

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