特許 6642887 アルファヘリックスを模倣した大環状ペプチドミメティック

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6642887

(24)【登録日】2020年1月8日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】アルファヘリックスを模倣した大環状ペプチドミメティック

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/00 20060101AFI20200130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/00ZNA

   A61P43/00 111

   A61K38/12

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P1/04

   A61P1/18

   A61P15/00

   A61P13/08

   A61P17/00

   A61P25/00

   A61P11/00

   A61P13/10

   A61P35/02

   A61P29/00

   A61P37/06

【請求項の数】36

【全頁数】91

(21)【出願番号】特願2016-560695(P2016-560695)

(86)(22)【出願日】2015年4月1日

(65)【公表番号】特表2017-513826(P2017-513826A)

(43)【公表日】2017年6月1日

(86)【国際出願番号】US2015023883

(87)【国際公開番号】WO2015153761

(87)【国際公開日】20151008

【審査請求日】2018年3月30日

(31)【優先権主張番号】61/973,994

(32)【優先日】2014年4月2日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507245021

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ロチェスター

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】ファサン ルディ

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０３３０７７３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５３５５１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１３３１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１５１７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０３０２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０５３００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１１０７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chem. Commun.，２０１４年 ４月 ７日，Vol.50，p.5027-5030, S1-11

【文献】 PNAS，２００９年，Vol.106, No.12，p.4665-4670

【文献】 Angew. Chem. Int. Ed.，２０１１年，Vol.50，p.5075-5080

【文献】 Chem. Commun.，２０１２年，Vol.48，p.1461-1463

【文献】 ChemBioChem，２０１３年，Vol.14，p.147-160

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ ７／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

【化1】

の大環状ペプチドミメティック分子：
式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基または置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、
アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ６またはＳＰ８：

【化2】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンであって、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項2】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項3】

前記大環状ペプチドミメティック分子の二次構造が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドの二次構造よりも安定である、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項4】

前記大環状ペプチドミメティック分子の二次構造が、アルファヘリックスに対応する、請求項３に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項5】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加したタンパク分解安定性を有する、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項6】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した生物活性を有する、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項7】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して生細胞を透過する能力を有する、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項8】

前記大環状ペプチドミメティック分子が更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を共有結合によって含む、請求項１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項9】

大環状ペプチドミメティック分子の合成方法であって、
アミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡ−（ＬＧ）で表される前駆体ペプチドミメティック分子を下記のＳＰ６またはＳＰ８：

【化3】

の化合物と接触させることを含み、
アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンであり、（ＬＧ）は、末端カルボン酸のカルボニル基を求核置換に対して活性化する基であり、
ここでの接触の結果、リンカー部分を介して、前記Ｘのフェニルアセチル基とアミノ酸配列中のＡのＣ末端カルボキシ基との間に共有結合が形成され、更に該大環状ペプチドミメティック分子はαヘリックスを構成する、前記方法。

【請求項10】

求核置換に対してＣ末端カルボン酸基を活性化するＬＧ基が、酸塩化物、酸無水物、アシルアジド、Ｏ−アシルイソ尿素、ホスホニウム化合物、活性エステルまたはチオエステルである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

接触させる前に、細胞内で前駆体ペプチドミメティック分子を発現することを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記前駆体ペプチドミメティック分子のＬＧ基がインテインである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記方法が、溶液中で実施される、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記方法が、固体支持体で実施される、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

大環状ペプチドミメティック分子を含む癌または腫瘍性症状の治療に使用するための、組成物であって、前記大環状ペプチドミメティック分子が、式（ＶＩＩ）の構造：

【化4】

式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−
ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ６またはＳＰ８：

【化5】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンであって、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子を有する、前記組成物。

【請求項16】

さらに、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

非ヒト対象の癌または腫瘍性疾患の治療方法であって、
式（ＶＩＩ）の構造：

【化6】

式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ６またはＳＰ８：

【化7】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンであって、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分
子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子を治療すべき対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項18】

前記大環状ペプチドミメティック分子が更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を共有結合によって含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

式（Ｉ）：

【化8】

の大環状ペプチドミメティック分子：
式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ８またはＳＰ９：

【化9】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡまたはＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列のアミノ末端にアセチル基がついていてもよく、アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンまたはメタアセチルフェニルアラニンであり、Ｗは６ＣｌＷと置換されていてもよく、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項20】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項21】

前記大環状ペプチドミメティック分子の二次構造が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドの二次構造よりも安定である、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項22】

前記大環状ペプチドミメティック分子の二次構造が、アルファヘリックスに対応する、請求項２１に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項23】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加したタンパク分解安定性を有する、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項24】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した生物活性を有する、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項25】

前記大環状ペプチドミメティック分子が、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して生細胞を透過する能力を有する、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項26】

前記大環状ペプチドミメティック分子が更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を共有結合によって含む、請求項１９に記載の大環状ペプチドミメティック分子。

【請求項27】

大環状ペプチドミメティック分子の合成方法であって、
アミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡ−（ＬＧ）またはＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡ−（ＬＧ）で表される前駆体ペプチドミメティック分子を下記のＳＰ８またはＳＰ９：

【化10】

の化合物と接触させることを含み、
アミノ酸配列のアミノ末端にアセチル基がついていてもよく、アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンまたはメタアセチルフェニルアラニンであり、アミノ酸配列中のＷは６ＣｌＷと置換されていてもよく、（ＬＧ）は、Ｃ末端カルボン酸のカルボニル基を求核置換に対して活性化する基であり、
ここでの接触の結果、リンカー部分を介して、前記Ｘのフェニルアセチル基とアミノ酸配列中のＡのＣ末端カルボキシ基との間に共有結合が形成され、更に該大環状ペプチドミメティック分子はαヘリックスを構成する、前記方法。

【請求項28】

求核置換に対してＣ末端カルボン酸基を活性化するＬＧ基が、酸塩化物、酸無水物、アシルアジド、Ｏ−アシルイソ尿素、ホスホニウム化合物、活性エステルまたはチオエステルである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

接触させる前に、細胞内で前駆体ペプチドミメティック分子を発現することを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記前駆体ペプチドミメティック分子のＬＧ基がインテインである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記方法が、溶液中で実施される、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、固体支持体で実施される、請求項２７に記載の方法。

【請求項33】

大環状ペプチドミメティック分子を含む、癌または腫瘍性症状の治療に使用するための組成物であって、前記大環状ペプチドミメティック分子が、式（ＶＩＩ）の構造：

【化11】

式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−
ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ８またはＳＰ９：

【化12】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡまたはＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列のアミノ末端にアセチル基がついていてもよく、アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンまたはメタアセチルフェニルアラニンであり、アミノ酸配列中のＷは６ＣｌＷと置換されていてもよく、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−
Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカ
ルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子を有する、前記組成物。

【請求項34】

前記大環状ペプチドミメティック分子が更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を共有結合によって含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

非ヒト対象の癌または腫瘍性疾患の治療方法であって、
式（ＶＩＩ）の構造：

【化13】

式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステル、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］によって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、 Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）
ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、 ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]はＳＰ８またはＳＰ９：

【化14】

であり、[−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]以外の部分はアミノ酸配列ＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡまたはＧＸＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡで表され、
アミノ酸配列のアミノ末端にアセチル基がついていてもよく、アミノ酸配列中のＸはパラアセチルフェニルアラニンまたはメタアセチルフェニルアラニンであり、アミノ酸配列中のＷは６ＣｌＷと置換されていてもよく、前記Ｘのフェニルアセチル基は[−Ｚ−Ｌ_２−
Ｙ−]に結合してリンカー[−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−]を形成し、アミノ酸配列中のＡのカ
ルボキシ末端に連結されており、前記大環状ペプチドミメティック分子がアルファヘリックスを構成する、大環状ペプチドミメティック分子を治療すべき対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項36】

前記大環状ペプチドミメティック分子が更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を投与することを共有結合によって含む、請求項３５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年４月２日出願の同時係属中の米国特許仮出願第６１／９７３，９９４号、表題「ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＰＥＰＴＩＤＯＭＩＭＥＴＩＣＳ ＦＯＲ ＡＬＰＨＡ−ＨＥＬＩＸ ＭＩＭＩＣＲＹ」に対する優先利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援研究開発に関する声明
本発明は、国立科学財団によって与えられた認可番号ＣＨＥ−１１１２３４２、及び米国国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＣＡ１８７５０２の下の政府支援で行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、側鎖−Ｃ末端を結合する非ペプチドテザーによって拘束される、αヘリックス状モチーフの機能的かつ構造的模倣体として使用される大環状ペプチドに関する。本発明は、このような大員環を調製する方法、ならびにその治療的用途での使用方法にも関する。

【背景技術】

【0004】

ペプチドは、生体系の研究、生体分子（例えば、酵素、細胞受容体、抗体、キナーゼ）の結合特性及び活性特性の研究、ならびに薬理学的標的の検証に有益な手段の代表例である。ペプチド系分子は、特にタンパク質−タンパク質及びタンパク質−核酸の相互作用などの難度の高い創薬標的と関連する治療剤としても注目を増している。多くのペプチドは興味深い生物活性を呈するが、直鎖ペプチドは通常、タンパク分解性及び代謝安定性の不足、細胞透過性の制限、及び配座柔軟性の結果としての無差別な結合性といった理由により、好適な薬剤には該当しない。分子主鎖の配座自由度を制限する分子拘束性を用いることで、この限界を克服することができる。多くの場合、配座的に拘束されたペプチドは、その直鎖対応物と比較して、酵素安定性（Ｆａｉｒｌｉｅ，Ｔｙｎｄａｌｌら ２０００、Ｗａｎｇ，Ｌｉａｏら ２００５）、膜透過性（Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｋｕｎｇら ２００４、Ｒｅｚａｉ，Ｂｏｃｋら ２００６、Ｒｅｚａｉ，Ｙｕら ２００６）ならびにタンパク質の結合親和性（Ｔａｎｇ，Ｙｕａｎら １９９９、Ｄｉａｓ，Ｆａｓａｎら ２００６）及び選択性（Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｐｏｒｔｅｒら ２０１０）の強化を呈する。ペプチド分子の活性配座を固定化する拘束の結果、受容体結合時の、配座エントロピーの損失が減少するため、親和性を増加させ得る。そこで、生物活性化合物及び治療薬の開発にとって有望な分子足場として、大環状ペプチドが登場した（Ｋａｔｓａｒａ，Ｔｓｅｌｉｏｓら ２００６、Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，Ｈａｌｅら ２００８、Ｏｂｒｅｃｈｔ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら ２００９、Ｍａｒｓａｕｌｔ及びＰｅｔｅｒｓｏｎ ２０１１）。

【0005】

αヘリックスはそのタンパク質構造の豊富さを反映して、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−核酸の複合体の境界に存在する場合が多い（Ｊｏｃｈｉｍ及びＡｒｏｒａ ２００９）。タンパク質のコンテクストから一旦切断されると、これらの二次構造モチーフを包含する直鎖ペプチドは、溶液中でめったに安定なαヘリックス配座を取ることがない。したがって、生体分子の相互作用をターゲット化及び調節できる生物活性分子を生成する手段として、αヘリックスペプチドの安定化及び模倣のための多くの手法が開発されてきた（Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｊｏｃｈｉｍら ２００８）。この分野の一般的なアプローチには、側鎖間の共有結合、例えばジスルフィド結合（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋｉｎｇら １９９１）、ラクタム（Ｏｓａｐａｙ及びＴａｙｌｏｒ １９９２）、チオエーテル（Ｂｒｕｎｅｌ及びＤａｗｓｏｎ ２００５）またはトリアゾール（Ｓｃｒｉｍａ，Ｌｅ Ｃｈｅ
ｖａｌｉｅｒ−Ｉｓａａｄら ２０１０、Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｃｏｌｅｓｋａら ２０１２）の架橋、炭化水素ステープル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ及びＧｒｕｂｂｓ １９９８、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｐｏら ２０００、Ｂｅｒｎａｌ，Ｗａｄｅら ２０１０）、及びシステイン架橋部分（Ｚｈａｎｇ，Ｓａｄｏｖｓｋｉら ２００７、Ｍｕｐｐｉｄｉ，Ｗａｎｇら ２０１１、Ｊｏ，Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら ２０１２、Ｓｐｏｋｏｙｎｙ，Ｚｏｕら ２０１３）の使用を必要としてきた。別のアプローチでは、いわゆる「水素結合サロゲート」、すなわちＮ末端のｉ／ｉ＋４水素結合（Ｗａｎｇ，Ｌｉａｏら ２００５）を置換する炭化水素結合を導入にし、αヘリックスペプチドを安定化する必要があった。

【0006】

「背景技術」内または本出願のいかなる他のセクション内のいずれの文献における引用または特定も、このような参照が本発明に対する先行技術として有効であることを容認するものと見なされるべきではない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティック分子を提供する：

【化1】

（式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｚは、−ＳＣＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基または置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール
基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
更にここで大環状ペプチドミメティック分子は、アルファヘリックスを含む）。

【0008】

一実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、［Ｚ−Ｌ_２−Ｙ］を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した安定性を有する。

【0009】

別の実施形態では、末端Ｄはキャッピング基を含む。

【0010】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子の二次構造は、［Ｚ−Ｌ_２−Ｙ］を欠く、対応する非大環状ポリペプチドの二次構造よりも安定である。

【0011】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子の二次構造は、アルファヘリックスに対応する。

【0012】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、［Ｚ−Ｌ_２−Ｙ］を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加したタンパク分解安定性を有する。

【0013】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、［Ｚ−Ｌ_２−Ｙ］を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して増加した生物活性を有する。

【0014】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、［Ｚ−Ｌ_２−Ｙ］を欠く、対応する非大環状ポリペプチドと比較して生細胞の透過能力を有する。

【0015】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、アルファヘリックスは１ターン〜５ターンを含む。

【0016】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、１ターン〜５ターンのαヘリックスに及ぶ。

【0017】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、αヘリックスの１ターンにつき約４Å〜約１２Åである。

【0018】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、約１ターンのアルファヘリックスに及ぶ。

【0019】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、約５個の炭素−炭素結合〜約１１個の炭素−炭素結合の長さとほぼ等しい。

【0020】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環は、約１５原子〜２１原子の環を含む。

【0021】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、約２ターンのアルファヘリックスに及ぶ。

【0022】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、約７個の炭素−炭素結合〜約１７個の炭素−炭素結合の長さとほぼ等しい。

【0023】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環は、約２８原子〜３８原子の環を含む。

【0024】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、約３ターンのアルファヘリックスに及ぶ。

【0025】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、約１２個の炭素−炭素結合〜約２２個の炭素−炭素結合の長さとほぼ等しい。

【0026】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環は、約４３原子〜５３原子の環を含む。

【0027】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、約４ターンのアルファヘリックスに及ぶ。

【0028】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、約１７個の炭素−炭素結合〜約２８個の炭素−炭素結合の長さとほぼ等しい。

【0029】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環は、約５９原子〜７０原子の環を含む。

【0030】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、約５ターンのアルファヘリックスに及ぶ。

【0031】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、約２２個の炭素−炭素結合〜約３５個の炭素−炭素結合の長さとほぼ等しい。

【0032】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環は、約７５原子〜８８原子の環を含む。

【0033】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、Ｒ_１はメチルである。

【0034】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は更に、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0035】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、

【化2】

及び

【化3】

からなる大員環形成リンカーの群から選択され、
式中、

【化4】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３である。

【0036】

大環状ペプチドミメティック分子の合成方法も提供され、この方法には、式（ＩＶ）の前駆体ペプチドミメティック分子：

【化5】

を式（Ｖ）：
Ｑ_２−Ｌ_２−Ｙ−Ｈ （Ｖ）
の化合物と接触させることを含む：
（式中、
Ａ、Ｃ及びＤは、それぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−Ｏ−ＮＨ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｑ_１は、スルフヒドリル（−ＳＨ）基、アミノ（−ＮＨＲ_５）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_５）基及びカルボキシ（−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）基からなる基から選択され、
Ｑ_２は、ＸがＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである−ＣＨ（Ｒ_６）Ｘ、アミノ（−ＮＨＲ_６）基、オキシアミノ（−ＯＮＨ_２）基、ヒドラジノ（−ＮＲ_６ＮＨ_２）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_６）基及びカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基からなる群から選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
（ＬＧ）は、末端カルボン酸のカルボニル基を求核置換に対して活性化する基である）。ここでの接触の結果、リンカー部分を介して、式（ＩＶ）の化合物の側鎖基Ｌ_１とＣ末端カルボキシ基との間に共有結合が形成され、更に大環状ペプチドミメティック分子はαヘリックスを構成する。

【0037】

本方法の一実施形態では、求核置換に対してＣ末端カルボン酸基を活性化するＬＧ基は、酸塩化物、酸無水物、アシルアジド、Ｏ−アシルイソ尿素、ホスホニウム化合物、活性エステルまたはチオエステルである。

【0038】

本方法の別の実施形態では、末端Ｄはキャッピング基を含む。

【0039】

別の実施形態では、方法は、接触の前に細胞内で前駆体ペプチドミメティック分子を発現することを含む。

【0040】

本方法の別の実施形態では、前駆体ペプチドミメティック分子のＬＧ基はインテインである。

【0041】

本方法の別の実施形態では、方法は溶液中で実施される。

【0042】

本方法の別の実施形態では、方法は固体支持体上で実施される。

【0043】

別の実施形態では、方法は、大環状ペプチドミメティック分子のライブラリを合成することを含む。

【0044】

本方法の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物である。

【0045】

本方法の別の実施形態では、前駆体ペプチドミメティック分子は、

【化6】

からなる群から選択されるアミノ酸類似体を含み、式（Ｖ）の大員環形成リンカー試薬は、適合性のある大員環を形成するリンカー試薬からなる群から選択され、ここで、選択されたアミノ酸類似体及び大員環形成リンカー試薬において、

【化7】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ’は、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、
Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0046】

提供される大環状ペプチドミメティック分子は、対象のｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患の治療に使用するためのものでもあり、この大環状ペプチドミメティックは、式（ＶＩＩ）の構造を有し、

【化8】

式中、
Ａ、Ｃ及びＤはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり、末端Ｄはキャッピング基を含む場合があり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｚは、−ＳＣＨＲ_６−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基及び置換アリール基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
更に大環状ペプチドミメティック分子は、配列番号１〜３７のアミノ酸配列からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0047】

大環状ペプチドミメティック分子の一実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列が、配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である。

【0048】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列である。

【0049】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、少なくとも１つのα，α−二置換アミノ酸を含む。

【0050】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、少なくとも１つのＮ−メチル化アミノ酸を含む。

【0051】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0052】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、

【化9】

及び

【化10】

からなる大員環形成リンカーの群から選択され、
式中、

【化11】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３である。

【0053】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３７に対応するポリペプチド配列と少なくとも約５０％同一であり、側鎖−Ｃ末端の大環状化は、

【化12】

からなるアミノ酸類似体の群から選択されるアミノ酸類似体によって、及び

【化13】

からなる大員環形成リンカー試薬の群から選択される適合性のある大員環形成リンカー試
薬によって媒介され、
ここで、選択されたアミノ酸類似体及び大員環形成リンカー試薬において、

【化14】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、
Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、
Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0054】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、癌または新生物疾患である。

【0055】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、脳腫瘍、癌腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、白血病またはリンパ腫である。

【0056】

大環状ペプチドミメティック分子の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、炎症性、神経変性または自己免疫性疾患である。

【0057】

対象のｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患を治療（または改善）するための方法も提供し、該方法は
式（ＶＩＩ）：

【化15】

の構造を有する大環状ペプチドミメティック分子を治療すべき対象（ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患に罹患している）に投与することを含み、
式中、
Ａ、Ｃ及びＤはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり、末端Ｄはキャッピング基を含む場合があり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）
Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｚは、−ＳＣＨＲ_６−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基及び置換アリール基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数であり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
更に大環状ペプチドミメティック分子は、配列番号１〜３７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0058】

本方法の一実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列が、配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である。

【0059】

本方法の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列である。

【0060】

本方法の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、少なくとも１つのα，α−二置換アミノ酸を含む。

【0061】

本方法の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、少なくとも１つのＮ−メチル化アミノ酸を含む。

【0062】

本方法の別の実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0063】

本方法の別の実施形態では、大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、

【化16】

及び

【化17】

からなる大員環形成リンカーの群から選択され、式中、

【化18】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３である。

【0064】

本方法の別の実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３７に対応するポリペプチド配列と少なくとも約５０％同一であり、側鎖−Ｃ末端の大環状化は、

【化19】

からなるアミノ酸類似体の群から選択されるアミノ酸類似体によって、及び

【化20】

からなる大員環形成リンカー試薬の群から選択される適合性のある大員環形成リンカー試
薬によって媒介され、
ここで、選択されたアミノ酸類似体及び大員環形成リンカー試薬において、

【化21】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、
Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、
Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0065】

本方法の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、癌または腫瘍性疾患である。

【0066】

本方法の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、脳腫瘍、癌腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、白血病またはリンパ腫である。

【0067】

本方法の別の実施形態では、ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患は、炎症性、神経変性または自己免疫性疾患である。

【図面の簡単な説明】

【0068】

図面の簡単な説明において下記の記号をそれぞれ結合記号及び環記号と呼ぶ。

【化22】

【化23】

【図1】本明細書に記載する方法によるαヘリックス状モチーフの大環状ペプチドミメティックの設計及び調製を示す一般的なスキーム。例えば、目的とするタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ペプチド複合体に関する結晶構造に基づいて、標的とするαヘリックス状の識別モチーフを最初に特定する。次に、このようなαヘリックス状の結合モチーフから誘導されるポリペプチド配列の側鎖−Ｃ末端の環化によって、大環状ペプチドミメティック分子を生成する。アミノ酸配列、リンカー構造及び側鎖−Ｃ末端結合性を変化させることで、タンパク質パートナーとの結合親和性、阻害力価、αヘリックス性、タンパク分解安定性及び／または細胞透過性に関して、ペプチドミメティック分子の最適化を達成することができる。ＦＧ_１及びＦＧ_２は、互いに反応可能な官能基であり、ＮｕＨ：求核基、Ａｃｔ：求核置換活性化基の共有結合を形成する。

【図2】本明細書で開示される大環状ペプチドミメティック分子の代表的な構造。具体的に図は、Ｌ−α−アミノ酸を含むポリペプチド配列を含み、側鎖−Ｃ末端の結合性を有する代表的な大環状ペプチドミメティックを、ｉ／ｉ＋３（ＣＯ）（すなわち、残基「ｉ」が大員環形成リンカーを介して、残基「ｉ＋３」のカルボニル基と結合している）からｉ／ｉ＋８（ＣＯ）まで示している。本明細書に記載する方法に従って、これらの分子の複数の変異体を構想し、調製することができる。

【図3】このスキームは、本明細書で開示される大環状ペプチドミメティック分子を調製するための代表的な合成方法を示している。この例では、３−アミノ−Ｎ−（３−（アミノオキシ）プロピル）−４−（メルカプトメチル）ベンズアミド（ＳＰ８）は大員環形成リンカー試薬の役割を果たし、Ｌ−パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）は一般式（ＶＩ）のアミノ酸類似体の役割を果たす。簡潔には、非環式の前駆体ペプチドミメティック分子は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により調製される。安全キャッチ（safety catch）リンカーのアルキル化の後、大員環形成リンカー試薬と、樹脂に固定された前駆体分子とが反応して大環化が得られる（「樹脂上環化」）。あるいは、非環式の前駆体分子を、最初にチオエステルとして樹脂から切り出し、その後、溶液中で大員環形成リンカー試薬と反応させて環化する（「溶液中環化（in-solution cyclization）」）。この具体例において、大員環形成リンカー内に含まれるチオール基は、Ｃ末端のライゲーション反応を促進する、及び大員環の固定化または蛍光色素、アフィニティータグまたは他の分子との更なる官能化のための利便なハンドルを付与するという二重の役割を果たしている。

【図4】本明細書で開示される大環状ペプチドミメティック分子の調製のための代替的な化学生合成方法。この場合、非環式の前駆体ポリペプチド分子は宿主（例えば、大腸菌）のリボソーム発現によって生じる。ここでは、Ｌ−パラ−アセチル−フェニルアラニンなどの一般式（ＶＩ）のアミノ酸類似体は、アンバー終止コドンの抑制により導入され、ポリペプチドのＣ末端はインテインタンパク質の融合により活性化される。前駆体ポリペプチドと、適切な大員環形成リンカー試薬（例えば、３−アミノ−Ｎ−（３−（アミノオキシ）プロピル）−４−（メルカプトメチル）ベンズアミド）（ＳＰ８））との反応によって環化が形成され、所望の大環状ペプチドミメティック分子が得られる。

【図5A-5B】アミノ酸類似体の合成。（Ａ）エナンチオピュアのＮ−Ｆｍｏｃ保護されたＬ−及びＤ−パラ−アセチル−フェニルアラニンを調製するための合成ルート。（Ｂ）アルキン官能化アミノ酸であるＯ−プロパルギル−チロシンを調製するための合成ルート。

【図5C】アミノ酸類似体の合成。（Ｃ）チオール官能化アミノ酸であるＡｍｍＦを調製するための合成ルート。

【図5D】アミノ酸類似体の合成。（Ｄ）チオール官能化アミノ酸であるＭｅＦを調製するための合成ルート。

【図6】エナンチオピュアのＮ−Ｆｍｏｃ保護された６−クロロ−トリプトファン（６Ｃｌ−Ｔｒｐ）を調製するための合成ルート。

【図7】大員環形成試薬ＳＰ４、ＳＰ５、ＳＰ６及びＳＰ７を調製するための合成ルート。試薬及び条件：ａ）ＬｉＡｌＨ_４、ＴＨＦ；９５％、ｂ）Ｍｓ−Ｃｌ、ＤＩＰＥＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；８８％、ｃ）ＮａＮ_３、ＤＭＦ；１００％、ｄ）ＬｉＡｌＨ_４、ＴＨＦ；９５％、ｅ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ；１００％、ｆ）１１、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；２６％、ｇ）ＴＩＰＳ、ＴＦＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；１００％、ｈ）ＨＯＮＨＢｏｃ、ＤＢＵ、ＤＭＦ；８９％、ｉ）ＴＩＰＳ、ＴＦＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；１００％、ｊ）１２、ＣｕＳＯ_４、ＮａＡｓｃ、ＣＨ_２Ｃｌ_２：Ｈ_２Ｏ；７２％、ｋ）ＴＩＰＳ、ＴＦＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；１００％、ｌ）１３、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；５５％、ｍ）ＴＩＰＳ、ＴＦＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；１００％。

【図8】本明細書に記載する方法に使用される大員環形成リンカー試薬の代表的な構造。

【図9A-9B】（Ａ）ｐ５３関連のペプチドＰＭＩ（ｐｄｂ ３ＥＱＳ）と結合したＨＤＭ２の結晶構造。（Ｂ）ｐ５３大環状ペプチドミメティックＰ８（図１０）のモデル。

【図10】選択されたｐ５３大環状ペプチドミメティック及び基準となる直鎖ペプチドのアミノ酸配列、構造及び阻害活性。阻害活性とは、表面プラズモン共鳴による阻害アッセイを使用して測定された、ｐ５３_{（１５−２９）}−ＨＤＭ２の相互作用またはｐ５３_{（１５−２９）}−ＨＤＭＸの相互作用の妨害に関するＩＣ_５０値を指す。

【図11A-11C】パラ−アセチル−フェニルアラニン（＝４−エチル−アセトフェノン部分による模倣）と大員環形成リンカー試薬ＳＰ４（Ａ）、ＳＰ８（Ｂ）及びＳＰ６（Ｃ）との反応から生成される大員環形成リンカーを示す最小限のエネルギーモデル。側鎖とＣ末端のライゲーション位置間の近似最大点間距離を示す。

【図12A-12B】選択されたｐ５３大環状ペプチドミメティック及び基準となる直鎖ペプチドによる、（Ａ）ｐ５３−ＨＤＭ２相互作用及び（Ｂ）ｐ５３−ＨＤＭＸ相互作用の阻害に関する濃度依存曲線。データは、表面プラズモン共鳴による阻害アッセイを使用して得た。この場合、可溶性のＨＤＭ２／Ｘと、固定化ビオチンをコンジュゲートしたｐ５３ペプチド（ｂｉｏｔ−ｐ５３_{１５−２９}）との結合が、化合物の量が増加するにつれて阻害される。

【図13A-13B】αヘリックス性及びタンパク質分解安定性（Ａ）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び４０％のＴＦＥ中で測定された、代表的なｐ５３大環状ペプチドミメティック（Ｐ７及びＰ８）及び基準となる直鎖ペプチド（Ｐ６）の円二色性スペクトル。（Ｂ）キモトリプシン（１．０μｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃での同一化合物のタンパク質分解安定性試験。グラフは、キモトリプシンと共に培養した後の、種々の時点での化合物の残留量を示す。

【図14A】（Ａ）フルオレセインで標識した直鎖ｐ５３誘導ペプチドＰ１及び（Ｂ）フルオレセインで標識したｐ５３大環状ペプチドミメティック化合物Ｐ８で処理したＨＥＫ２９３細胞の共焦点蛍光顕微鏡の画像。青＝ＤＡＰＩ核染色、緑＝フルオレセインでコンジュゲートした化合物。

【図14B】（Ａ）フルオレセインで標識した直鎖ｐ５３誘導ペプチドＰ１及び（Ｂ）フルオレセインで標識したｐ５３大環状ペプチドミメティック化合物Ｐ８で処理したＨＥＫ２９３細胞の共焦点蛍光顕微鏡の画像。青＝ＤＡＰＩ核染色、緑＝フルオレセインでコンジュゲートした化合物。

【図15】ｐ５３大環状ペプチドミメティックＰ１３及び対応するアシルペプチドＰ１０で治療後のＳＪＳＡ−１細胞（ＨＤＭ２を過剰発現している骨肉腫細胞）の細胞生存性。既知の小分子ＨＤＭ２阻害剤ｎｕｔｌｉｎ−３の用量反応曲線も示す。

【図16】本明細書で記載する方法に使用できる、式［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の大員環形成リンカーの構造。結合記号は、単結合または二重結合を示す。環記号は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。Ｒ′は、−Ｈまたは−ＣＨ_３である。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。

【図17】本明細書で記載する方法に使用できる、式［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の追加の大員環形成リンカーの構造。環記号は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。

【図18】本明細書に記載する方法に使用できる、アミノ酸類似体（左パネル）及び適合性のある大員環形成リンカー試薬（矢でつながれた右パネル）の構造。環記号は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。Ｒ′は、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【図19】本明細書に記載する方法に使用できる、追加のアミノ酸類似体（左パネル）及び適合性のある大員環形成リンカー試薬（矢でつながれた右パネル）の構造。環記号は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。Ｒ′は、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【発明を実施するための形態】

【0069】

本開示は、配座安定性、生物活性、代謝安定性及び／または細胞透過性の増加を呈するαヘリックスペプチドミメティックの産生に関する。

【0070】

発明を実施するための形態は、限定目的としてではなく、開示を明確化するために、以下に定めるサブセクションに分類される。

【0071】

定義

【0072】

本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。

【0073】

本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象物を包含する。

【0074】

用語「複数」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、２以上の指示対象を含む。

【0075】

本明細書で使用される場合、用語「官能基」は、特定の反応条件下で共に化学反応を受け得る隣接する原子団を指す。官能基の例は、多数ある中でも特に、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＳＨ、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｎ_３、−Ｃ≡ＣＨである。

【0076】

本明細書で使用される場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、完全に飽和された、若しくは１つ以上の（すなわち、少なくとも１単位）の不飽和単位を含有する、直鎖若しくは分枝鎖のＣ_１−１５炭化水素鎖、または単環式Ｃ_３−８炭化水素、または完全に飽和された、若しくは１つ以上の不飽和単位を含有するが、それが芳香族（「シクロアルキル」とも称する）でない二環式Ｃ_８−１２炭化水素を意味する。例えば、好適な脂肪族基として、直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基またはそのハイブリッド、例えば（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキニル）アルキルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、直鎖状でも分枝状でも環状でも良く、最大１５、最大８、または最大５の炭素原子を含むことができる。アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基及びシクロペンチル基を含むが、これらに限定されない。アルケニル基は、プロペニル基、ブテニル基及びペンテニル基を含むが、これらに限定されない。アルキニル基は、プロピニル基、ブチニル基及びペンチニル基を含むが、これらに限定されない。

【0077】

本明細書で使用される場合、用語「アリール」及び「アリール基」は、共に融合される、直接的に結合される、または間接的に結合される（例えば、メチレン部分またはエチレン部分によって結合される）、単一の芳香族環または複数の芳香環を含有する芳香族置換基を指す。アリール基は、５〜２４の炭素原子、５〜１８の炭素原子または５〜１４の炭素原子を含み得る。

【0078】

用語「ヘテロ原子」は、窒素、酸素または硫黄を意味し、窒素及び硫黄の何らかの酸化形態及び任意の塩基性窒素の四級化形態を含む。ヘテロ原子は更に、Ｓｅ、Ｓｉ及びＰを含む。

【0079】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子と置換されたアリール基を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、酸素、硫黄及び窒素原子を含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、５〜１８員、５〜１４員、または５〜１０員の芳香環系である。ヘテロアリール基は、ピリジル基、ピロリル基、フリル基、チエニル基、インドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、イミダゾリル基、ピリドニル基、ピリミジル基、ピラジニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、プリニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、ベンゾフラニル基及びベンゾオキサゾリル基を含むが、これらに限定されない。

【0080】

複素環基は、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する単環式系または多環式系であって良く、不飽和であっても、または部分的若しくは完全に飽和されていても良い。したがって、用語「複素環式」には、上記のようなヘテロアリール基に加え、非芳香族複素環基も含む。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、酸素、硫黄及び窒素原子を含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、３〜１８員、３〜１４員、または３〜１０員の環系である。複素環基は、上記に挙げた具体的なヘテロアリール基に加えて、ピラニル基、ピペリジニル基、ピロリジニル基、ジオキサニル基、ピペラジニル基、マクロサイクロリニル（ｍａｃｒｏｃｙｌｅｏｌｉｎｙｌ）基、チオマクロサイクロリニル（ｔｈｉｏｍａｃｒｏｃｙｌｅｏｌｉｎｙｌ）基、マクロサイクロリノスルフォニル（ｍａｃｒｏｃｙｌｅｏｌｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）基、テトラヒドロイソキノリニ基及びテトラヒドロフラニル基を含むが、これらに限定されない。

【0081】

ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子であり得る。

【0082】

「場合により置換された」は、上記に挙げたいずれかの化学基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、トリアゾリル基）において、１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）水素原子が水素以外の原子または化学基で場合により置換されていることを意味する。このような置換基の具体例としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ（−ＯＨ）基、スルフヒドリル（−ＳＨ）基、置換スルフヒドリル基、カルボニル（−ＣＯ−）基、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）基、アミノ（−ＮＨ_２）基、ニトロ（−ＮＯ_２）基、スルホ（−ＳＯ_２−ＯＨ）基、シアノ（−Ｃ≡Ｎ）基、チオシアネート（−Ｓ−Ｃ≡Ｎ）基、ホスホノ（−Ｐ（Ｏ）ＯＨ_２）基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、アルキルチオール基、アルキルオキシ基、アルキルアミノ基、アリールチオール基、アリールオキシ基またはアリールアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。「場合により置換された」が、読点で区切られた一連の群を修飾する場合（例えば、「場合により置換されたＡＡ、ＢＢまたはＣＣ」、または「〜で、場合により置換されたＡＡ、ＢＢまたはＣＣ」）、群のそれぞれ（例えば、ＡＡ、ＢＢまたはＣＣ）が場合により置換されることを意味する。

【0083】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子を含む脂肪族」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、セレニウム、リンまたはケイ素、通常は酸素、窒素または硫黄で置換される脂肪族部分を指す。

【0084】

本明細書で使用される場合、用語「アルキル」及び「アルキル基」は、通常１〜２４の炭素原子または１〜１２の炭素原子を含む直鎖状、分枝状または環状の飽和炭化水素、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシルなどを指す。

【0085】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子を含むアルキル」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンまたはケイ素、通常は酸素、窒素または硫黄で置換されるアルキル部分を指す。

【0086】

本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」及び「アルケニル基」は、２〜２４の炭素原子または２〜１２の炭素原子からなり、少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状、分枝状または環状の炭化水素基、例えばエテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニルなどを指す。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子を含むアルケニル」は、少なくとも一つの炭素原子がヘテロ原子で置換されているアルケニル部分を指す。

【0088】

本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」及び「アルキニル基」は、２〜２４の炭素原子または２〜１２の炭素原子からなり、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖状、分枝状または環状の炭化水素基、例えばエチニル、ｎ−プロピニルなどを指す。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子を含むアルキニル」は、少なくとも一つの炭素原子がヘテロ原子で置換されているアルキニル部分を指す。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ原子を含むアリール」は、少なくとも一つの炭素原子がヘテロ原子で置換されているアリール部分を指す。

【0091】

本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」及び「アルコキシ基」は、単一の末端エーテル結合によって結合された、脂肪族基またはヘテロ原子を含む脂肪族基を指す。いくつかの実施形態では、アリールアルコキシ基は１〜２４の炭素原子を含み、他の実施例では、アルコキシ基は１〜１４の炭素原子を含む。

【0092】

本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」及び「アリールオキシ基」は、単一の末端エーテル結合によって結合された、アリール基またはヘテロ原子を含むアリール基を指す。いくつかの実施形態では、アリールオキシ基は５〜２４の炭素原子を含み、他の実施例では、アリールオキシ基は５〜１４の炭素原子を含む。

【0093】

用語「置換基」は、隣接する原子団を指す。「置換基」の例としては、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、ヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、ヘテロ原子を含むアルケニル、アルキニル、ヘテロ原子を含むアルキニル、アリール、ヘテロ原子を含むアリール、アルコキシ、ヘテロ原子を含むアルコキシ、アリールオキシ、ヘテロ原子を含むアリールオキシ、ハロ、ヒドロキシ（−ＯＨ）、スルフヒドリル（−ＳＨ）、置換スルフヒドリル、カルボニル（−ＣＯ−）、チオカルボニル（−ＣＳ−）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、アミノ（−ＮＨ_２）、置換アミノ、ニトロ（−ＮＯ_２）、ニトロソ（−ＮＯ）、スルホ（−ＳＯ_２−ＯＨ）、シアノ（−Ｃ≡Ｎ）、シアナト（−Ｏ−Ｃ≡Ｎ）、チオシアナト（−Ｓ−Ｃ≡Ｎ）、ホルミル（−ＣＯ−Ｈ）、チオホルミル（−ＣＳ−Ｈ）、ホスホノ（−Ｐ（Ｏ）ＯＨ_２）、置換ホスホノ及びホスホ（−ＰＯ_２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0094】

本明細書中で使用される場合、用語「大員環」は、少なくとも９つの共有結合原子によって形成される環またはサイクルを含む化学構造を有する分子を指す。

【0095】

本明細書で使用される場合、用語「環状」及び「大環状」は、環を形成する構成原子を有することを指す。したがって、「大環状ペプチドを含む分子」は、分子に含まれる原子によって形成される１つ以上の環（すなわち、少なくとも１つの環）を含む、ペプチドを
含む分子である。本明細書中で使用される場合、「環化」または「大環状化」は、それによって環状分子が形成される、または形成されるべく作製されるプロセスまたは反応を指す。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド主鎖」は、天然タンパク質の主鎖に相当する一連の原子を指す。本明細書で使用される場合、「非ペプチド主鎖」は、ペプチド主鎖に相当しない一連の原子を指す。

【0096】

本明細書で使用される場合、用語「大環状ペプチドミメティック」及び「大環状ペプチドミメティック分子」は、複数のペプチド結合及び少なくとも１つの大員環形成リンカーによって連結された複数のアミノ酸残基を含む化合物を指し、大員環形成リンカーは、１つの天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基若しくはアミノ酸類似体残基の炭素と、別の天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基若しくはアミノ酸類似体残基のＣ末端カルボニル基（−Ｃ（Ｏ）−）との間で大員環を形成する。大環状ペプチドミメティックは、１つ以上のアミノ酸残基間及び／またはアミノ酸類似体残基間に１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）非ペプチド結合を含む場合もあれば、大員環を形成するものに加えて、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸残基またはアミノ酸類似体残基を含む場合もある。

【0097】

用語「α−アミノ酸」または単に「アミノ酸」は、α炭素と称される炭素と結合したアミノ基及びカルボキシ基の両方を含む分子を指す。好適なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸のＤ型及びＬ型異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製される天然に存在しないアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。文脈上、別途具体的な指示のない限り、本発明で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アミノ酸類似体を含むことを意図する。

【0098】

用語「天然に存在するアミノ酸」は、自然合成されたペプチドに一般に見られ、１文字の略称、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶによって知られている、２０のアミノ酸のうちいずれか１つを指す。

【0099】

用語「アミノ酸類似体」は、アミノ酸と構造的に類似し、ペプチドまたは大環状ペプチドミメティック分子の形成時にアミノ酸と置換され得る分子を指す。アミノ酸類似体には、アミノ基とカルボキシ基との間に１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）追加のメチレン基を包含すること（例えばα−アミノβ−カルボキシ酸）を除いて、または類似した反応性基によってアミノ基若しくはカルボキシ基が置換されること（例えば第二級若しくは第三級アミンによる第一級アミンの置換またはエステルによるカルボキシ基の置換）を除いて、本明細書において規定されるアミノ酸と構造的に同一である化合物を含む。

【0100】

用語「キャッピング基」は、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるポリペプチド鎖のアミノ末端に存在する化学的部分を指す。アミノ末端のキャッピング基には、非修飾アミン（すなわち、−ＮＨ_２）または置換基を有するアミンが含まれる。例えば、アミノ末端をアシル基で置換して、Ｎ末端においてカルボキサミドを生成することができる。多様な置換基には、Ｃ_１〜Ｃ_６カルボニル、Ｃ_７〜Ｃ_３０カルボニル、及びＰＥＧ化したカルバメートを含む、置換アシル基が含まれるが、これらに限定されない。Ｎ末端に対する代表的なキャッピング基には、アセチル基、プロピオニル基、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル基、アダマンチルカルボニル基、１−ナフチルメチルカルボニル基、イソニコチニルカルボニル基、デカノイルカルボニル基、パルミチルカルボニル基またはポリエチレングリコール−カルボニル基を含むが、これらに限定されない。

【0101】

本明細書で大員環または大員環形成リンカーと関連して使用される場合、用語「員」は、大員環を形成している、または形成することができる原子を指し、置換基または側鎖原子を除外する。類推から、シクロデカン、１，２−ジフルオロ−デカン及び１，３−ジメ
チルシクロデカンは、水素若しくはフルオロ置換基またはメチル側鎖が大員環の形成に関与していないため、全て１０員の大員環と見なされる。

【0102】

用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸中のα炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンの場合のアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンの場合のアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインの場合のアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸の場合のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンの場合のアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルであるなどである。他の天然に存在しないアミノ酸側鎖には、例えば自然に発生するもの（例えば、アミノ酸代謝産物）または合成により作製されるもの（例えば、α，α二置換アミノ酸）も含まれる。

【0103】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）により連結された２個以上の天然に存在するまたは存在しないアミノ酸からなる何らかの鎖を指す。本明細書で記載されるポリペプチドには、完全長タンパク質（例えば、完全にプロセシングされたタンパク質）ならびにより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質の断片または合成ポリペプチド断片）が含まれる。

【0104】

本明細書で使用される場合、用語「安定性」は、円二色性、ＮＭＲまたは別の生物物理学的な測定法により測定した際の、本明細書で開示するペプチドまたは大環状ペプチドミメティック分子による溶液中での規定の二次構造の維持、またはインビトロ若しくはインビボでのタンパク質分解性に対する耐性を指す。本開示で検討される二次構造の非限定的例は、αヘリックス、αターン、３_１０ヘリックス及びπヘリックスである。

【0105】

本明細書で使用される場合、用語「ヘリックス安定性」は、円二色性、ＮＭＲまたは別の生物物理学的方法により測定した際の、本明細書で開示するペプチドまたは大環状ペプチドミメティック分子によるαヘリックス状構造の維持を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子は、円二色性により決定した際に、対応する非大環状ポリペプチドと比較して、αヘリックス性が少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍または２倍の増大を示す。

【0106】

本明細書で使用される場合、用語「タンパク分解安定性」は、１つ以上（すなわち、少なくとも１つの）プロテアーゼの存在下で、ＨＰＬＣまたは別の分析法により測定した際の、本明細書で開示するペプチドまたは大環状ペプチドミメティック分子による完全体構造の維持を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子は、ＨＰＬＣによって測定した際の、１つ以上のプロテアーゼ存在下での半減期が、対応する非大環状ポリペプチドと比較して、少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍または２倍の増大を示す。

【0107】

本明細書で使用される場合、化学的単位の相互作用に関する用語「接触」は、化学的単位の相互作用を支配する短距離の非共有相互作用（例えばファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、双極子相互作用）が可能である距離に化学的単位があることを示す。例えば、タンパク質が化学種と「接触される」とき、タンパク質は化学種と相互作用することが可能になり、それによってタンパク質と化学種との間に反応が発生し得る。

【0108】

本発明で使用される場合、用語「親和性標識」または「親和性タグ」は、物理的な方法によって、それに共有結合した別の分子（例えば、標的ポリペプチド）の分離を可能にする分子を指す。親和性標識の非限定的例は、ビオチン及びグルタチオンである。親和性標識分子を分離するための有用な物理的方法の例として、アフィニティークロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルパーミエーションクロマト
グラフィ及び関連した技術を含むが、これらに限定されない。

【0109】

本発明で使用される場合、用語「蛍光分子」は、励起時に光子を放出し、それにより蛍光性となる分子を指す。蛍光分子の非限定的例として、クマリン、ナフタレン、ピレン、フルオレセイン、ローダミン、ナフトキサンテン、フェナントリジン、二フッ化ホウ素ジプロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、シアニン、フタロシアニン、オキサジン及び種々に官能化されたそれらの誘導体が挙げられる。

【0110】

本発明で使用される場合、用語「放射性同位体標識」は、その原子核が、例えばアルファ若しくはベータ粒子またはガンマ放射線などの核放射線を自発的に放射する群を含む分子を指す。

【0111】

本発明で使用される場合、用語「標的薬剤」は、別の分子と、特定の生命体、組織、細胞または細胞内区画との共有性または非共有性の会合を誘導できる分子構造である。標的薬剤の非限定的例として、抗体、短ペプチド（例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）及び葉酸などの小分子が挙げられる。

【0112】

本明細書中で使用される場合、用語「治療薬」は、ヒト疾患の治療への使用を法的に認可された何らかの分子を指す。

【0113】

大環状ペプチドミメティック

【0114】

式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティックを提供する：

【化24】

（式中、
Ａ、Ｃ及びＤはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり、末端Ｄはキャッピング基を含む場合があり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｚは、−ＳＣＨＲ_６−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数である）。

【0115】

いくつかの実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは、３、４、５、６、７、８、９または１０である。大員環または大員環前駆体のＡ、Ｂ、ＣまたはＤの存在はそれぞれ独立して選択される。例えば、式［Ａ］_ｘで表される配列は、ｘが３であるとき、アミノ酸が同一でない実施形態、例えばＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、ならびにアミノ酸が同一である実施形態、例えばＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを包含する。これは、指定された範囲内であれば、ｘ、ｙ、ｚまたはｗがどの値であっても当てはまる。

【0116】

いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、二次構造状モチーフとしてαヘリックスを含む。一般に、αヘリックスは、ターン当たり３〜４のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるαヘリックスは、１〜５ターンを含み、その結果、３〜２０のアミノ酸残基を含む。具体的な実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるαヘリックスは、１ターン、２ターン、３ターン、４ターンまたは５ターンを含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、Ｌ_１と結合したアミノ酸α炭素からＹ基までを測定した際の、大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、ポリペプチドまたはペプチドミメティック配列［Ａ］_ｘ−［Ｂ］_ｙ−［Ｃ］_ｚに包含されるアミノ酸残基によって形成されるαヘリックスの安定性を増加するように選択される。いくつかの実施形態では、［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］として定義される大員環形成リンカーは、αヘリックスの１ターン〜５ターンに及ぶ。いくつかの実施形態では、大員環形成リンカーは、αヘリックスの約１ターン、２ターン、３ターン、４ターンまたは５ターンに及ぶ。

【0118】

いくつかの実施形態では、大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の長さは、αヘリックスの１ターンにつき４Å〜１２Åである。他の実施形態では、大員環形成リンカーの長さは、αヘリックスの１ターンにつき５Å〜９Åである。

【0119】

いくつかの実施形態では、大員環形成リンカーは約１ターンのαヘリックスに及び、その長さは約５個の炭素−炭素結合〜約１１個の炭素−炭素結合にほぼ等しく、リンカーは少なくとも４原子〜１０原子を含む。この場合、得られる大員環は、１５員〜２１員を有する環を形成する。

【0120】

他の実施形態では、大員環形成リンカーは約２ターンのαヘリックスに及び、その長さは約７個の炭素−炭素結合〜約１７個の炭素−炭素結合にほぼ等しく、リンカーは少なくとも６原子〜１６原子を含む。この場合、得られる大員環は、２８員〜３８員を有する環を形成する。

【0121】

他の実施形態では、大員環形成リンカーは約３ターンのαヘリックスに及び、その長さは約１２個の炭素−炭素結合〜約２２個の炭素−炭素結合にほぼ等しく、リンカーは少なくとも１１原子〜２１原子を含む。この場合、得られる大員環は、４３員〜５３員を有する環を形成する。

【0122】

他の実施形態では、大員環形成リンカーは約４ターンのαヘリックスに及び、その長さは約１７個の炭素−炭素結合〜約２８個の炭素−炭素結合にほぼ等しく、リンカーは少なくとも１６原子〜２７原子を含む。この場合、得られる大員環は、５９員〜７０員を有する環を形成する。

【0123】

他の実施形態では、大員環形成リンカーは約５ターンのαヘリックスに及び、その長さは約２２個の炭素−炭素結合〜約３５個の炭素−炭素結合にほぼ等しく、リンカーは少なくとも２１原子〜３４原子を含む。この場合、得られる大員環は、７５員〜８８員を有する環を形成する。

【0124】

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティック分子は、非大環状ポリペプチドまたはペプチドミメティック分子相対物と比較して、構造安定性の増加、標的に対する親和性の増加、タンパク質分解への耐性の増加及び／または細胞透過性の増加などの、改善された生物学的性質を呈する。一般式（Ｉ）の化合物に対する、基準となる非大環状相対物は一般式（ＩＩ）の化合物である：

【化25】

（式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、ｘ、ｙ、ｚ及びｗは全て、上記の式（Ｉ）に定める通りである）。あるいは、一般式（Ｉ）の化合物に対する、基準となる非大環状相対物は一般式（ＩＩＩ）の化合物である：

【化26】

（式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｒ_１、Ｒ_２、ｘ、ｙ、ｚ及びｗは全て、上記の式（Ｉ）に定める通りである）。

【0125】

いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は水溶液中でαヘリックスを含み、上記に定義される非大環状相対物と比較した場合に、αヘリックス性の程度の増加を呈する。いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、円二色性により測定した際に、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の基準となる非大環状相対物と比較して、αヘリックス性が少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍または少なくとも４倍の増加を有する。

【0126】

いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は一般式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティック分子に対応し、この場合、ペプチドミメティック分子の主鎖及びカルボキシ末端に結合する大員環形成リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、

【化27】

及び

【化28】

を含むが、これらに限定されない：
（式中、

【化29】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３である）。

【0127】

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティック分子は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0128】

別の生体分子（すなわち、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴ糖、脂質）との相互作用を媒介し、それによりある種の生物学的活性を媒介すると考えられるαヘリックスを含む既知の一次アミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドはいずれも、本開示の対象である。例えば、図１に概略的に示すように、標的のαヘリックス状モチーフを包含するペプチド配列の分析によって、このようなモチーフを模倣するための適切な大環状ペプチドミメティック分子を、（ａ）標的のポリペプチド配列内の適切なアミノ酸残基を、側鎖基Ｌ_１を持つアミノ酸類似体で置換し、次に（ｂ）Ｚ−Ｌ_２−Ｙリンカー部分を介して、ポリペプチド配列のカルボキシ末端に、側鎖基Ｌ_１をテザリングすることにより生成
することができる。最も好都合には、Ｌ_１基とＺ−Ｌ_２−Ｙリンカー部分との間の連結は、適切な反応条件下で互いに選択的、かつ効率的に反応する２つの官能基（例えば−Ｑ_１及び−Ｑ_２）によって達成される。最も好都合には、Ｚ−Ｌ_２−Ｙリンカー部分とポリペプチドのカルボキシ末端との間の連結は、求核基−ＹＨ及び活性形態のＣ末端カルボキシ基によって達成される。

【0129】

この方法を使用して、図２に構造を例示したような、種類の異なる側鎖−Ｃ末端の大環状αヘリックスペプチドミメティックを得ることができる。側鎖−Ｃ末端のテザリングに最適な位置は、生物活性に必要とされるαヘリックスの分子表面を確認し、それによって、生物活性に必要とされる表面を立体的にブロックすることなく、大環状分子を生成するために、大員環形成リンカーを導入できるそれ以外の表面を確認することにより決定される。図９Ａ〜９Ｂに例示したように、このような決定は、標的となるαヘリックス状モチーフまたは独立したαヘリックスを含むタンパク質と、天然の結合相手との間の複合体に関して、Ｘ線結晶学などの方法を使用して、活性化に関与するαヘリックスの残基及び表面を視覚化することにより行うことができる。あるいは、部位特異的突然変異を用いて、生物活性に関連するαヘリックス状モチーフの残基を特定することができる。この情報に基づいて、アミノ酸類似体及び大員環形成リンカーによって、標的のαヘリックス状モチーフを拘束するための適切な側鎖及びＣ末端結合部位を選択することができる。例えば、αヘリックス状二次構造では、生物活性のために、ヘリックスの一表面（例えば、ヘリックス軸に沿って長手方向に伸び、かつヘリックス軸周り４５〜１３５°の半径方向に伸びる分子表面）が、別の生体分子とインビボまたはインビトロで接触することが必要となり得る。このような場合、大員環形成リンカーは、活性に直接必要でないその表面の一部のヘリックス表面に沿って長手方向に伸びつつ、ヘリックスのα炭素とカルボキシ末端を連結するように設計される。

【0130】

大環状ペプチドミメティックの合成

【0131】

一般に、本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子の合成は、（ａ）適切に官能化された側鎖基Ｌ_１及び活性化Ｃ末端カルボキシ基を含む前駆体ポリペプチドを合成すること、（ｂ）次に前駆体ポリペプチドを、適切に官能化されたリンカー試薬と接触させ、側鎖基Ｌ_１がポリペプチドのＣ末端カルボキシ基に共有結合された大環状ペプチドミメティックを生成することを伴う。この一般的な方法により、前駆体ペプチドの側鎖−Ｃ末端の環状化が可能となり、構造安定性、標的に対する親和性、タンパク質分解に対する耐性、及び／または細胞透過性などの生物学的性質の改善を示す新規な化合物を生成する。更に、この一般的な方法により、大環状ペプチドミメティック分子への多種多用なリンカー部分の迅速かつ選択的な導入が可能となり、関連する大員環のライブラリを作製することが可能となる。この一般的な方法はまた、これらの大環状化合物への標識（例えば、放射性同位体標識、化学発光標識または蛍光標識）または治療薬の容易な導入も可能にする。

【0132】

したがって、大環状ペプチドミメティック分子の合成のための方法が提供され、本方法は、式（ＩＶ）：

【化30】

の前駆体ペプチドミメティック分子を式（Ｖ）：
Ｑ_２−Ｌ_２−Ｙ−Ｈ （Ｖ）
の化合物と接触させることを含む：
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｙ、ｘ、ｙ、ｚ及びｗは全て、式（Ｉ）の化合物について上記に定めた通りであり、
ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３であり、
Ｑ_１及びＱ_２は、式（Ｉ）の化合物について上記に定めたようにＺ基を形成する、互いに反応し得る２つの反応性官能基であり、
（ＬＧ）は、式（Ｖ）のリンカー試薬中の求核基−ＹＨによって、末端カルボン酸のカルボニル基を求核置換に対して活性化し、それによって共有結合−Ｃ（Ｏ）−Ｙ−を形成する基であり、
ここでの接触の結果、リンカー部分−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−を介して、側鎖基Ｌ_１とＣ末端カルボキシ基との間に共有結合が形成され、式（Ｉ）の化合物が得られる）。

【0133】

いくつかの実施形態では、官能基Ｑ_１は、スルフヒドリル（−ＳＨ）基、アミノ（−ＮＨＲ_５）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_５−）基及びカルボキシ（−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）基（式中、Ｒ_５は−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基）を含むが、これらに限定されない。

【0134】

それぞれの事例において、官能基Ｑ_２は、共有結合を形成する反応がＱ_１とＱ_２との間に発生し得るように選択される。当業者であれば、特定のＱ_１基の場合に、この目的に好適であるＱ_２を容易に特定できるだろう。いくつかの実施形態では、官能基Ｑ_２は、−ＣＨ（Ｒ_６）Ｘ（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、アミノ（−ＮＨＲ_６）基、オキシアミノ（−ＯＮＨ_２）基、ヒドラジノ（−ＮＲ_６ＮＨ_２）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_６−）基またはカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基（式中、Ｒ_６は−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基）を含むが、これらに限定されない。

【0135】

求核置換に対するＣ末端カルボン酸基の活性化は、当該技術分野で周知の方法によって実施できる。例えば、Ｃ末端カルボン酸基は、ＰＣｌ_５またはＳＯＣｌ_２を使用したアシルクロリドへの変換によって、保護されたアミノ酸またはペプチドエステルのヒドラジン分解に続く、水性酸中のＮａＮＯ_２での処理によるアシルアジドへの変換によって、ジシクロヘキシルカルボジイミドとの反応によるＯ−アシルイソ尿素への変換によって、カルボキシレートアニオンとホスホニウムまたはウロニウムカチオン（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰまたはＨＢＴＵ）との反応によるアシルオキシホスホニウムまたはウロニウム種への変換によって、または前述の活性化酸誘導体のいずれかとチオールまたはアルコールそ
れぞれとの反応による、チオエステル（例えばフェニルチオエステル）若しくは活性化エステル（例えば、ペンタフルオロフェノールエステル）への変換によって、それぞれに活性化することができる。いくつかの実施形態では、求核置換に対してＣ末端カルボン酸基を活性化する（ＬＧ）基は、酸塩化物、酸無水物、アシルアジド、Ｏ−アシルイソ尿素、ホスホニウム化合物、活性エステルまたはチオエステルである。具体的な実施形態では、活性化Ｃ末端カルボン酸はチオエステルの形態であり、このとき（ＬＧ）基はアリールメルカプタン（例えば、チオフェノール、ベンジルメルカプタンなど）、アルキルメルカプタン（例えば、β−メルカプトエタノール、ＭＥＳＮＡなど）またはインテインタンパク質である。

【0136】

前駆体ペプチドミメティック分子及び大環状ペプチドミメティック分子は、液相法または固相法によって合成することができる。更に、前駆体ペプチドミメティック分子及び大環状ペプチドミメティック分子は、天然に存在する、天然に存在しないアミノ酸及び／またはアミノ酸類似体を含み得る。代替的であるが等価の保護基、脱離基または試薬は置き換え可能であり、合成工程によっては、所望の化合物を生成するために代替的なシーケンスまたは順序で実行できる。本明細書に記載された化合物の合成に有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）には、例えば、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９８９）、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９１）、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９４）、ならびにＰａｑｕｅｔｔｅ編，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９５）及びその続版に記載されたようなものを含む。

【0137】

大環状ペプチドミメティック分子は、例えば、Ｆｉｅｌｄｓら，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ版の第３章．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７に記載の化学法によって作製することができる。したがって、例えば、ペプチドは、側鎖保護されたアミノ酸を用いるｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学合成法のいずれかによって保護されたアミンを用いて、例えば自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｍｏｄｅｌ４３０Ａ，４３１または４３３）上で、メリフィールド自動固相合成技術を使用して合成される。

【0138】

本明細書に記載された前駆体ペプチド及びペプチドミメティックを生成する１つの様式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用する。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合される。この樹脂は合成に用いる溶媒に不溶性であるため、比較的簡単かつ迅速に過剰剤及び副生成物を洗い流せる。Ｎ末端は、酸中では安定だが塩基によって除去可能なＦｍｏｃ基で保護される。側鎖官能基は、必要に応じて塩基安定な酸不安定基で保護する。長い前駆体ペプチドは、例えば、ネイティブな化学ライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを結合することによって生成される。

【0139】

前駆体ペプチド及びペプチドミメティックは、例えば、ハイスループットコンビナトリアル形式で、例えば、ハイスループット多チャンネルコンビナトリアル合成装置（例えば、ＡＡＰＰＴＥＣ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ製のＭｏｄｅｌ Ａｐｅｘ３９６多チャンネルペプチド合成装置）を使用して作製される。

【0140】

以下のセクションは、本明細書で開示する化合物の調製に使用される、利用可能な種々
の方法を例示するために示される。しかしながら、本開示は、本明細書で開示する化合物の調製に有用な反応または反応シーケンスの範囲を限定することを意図しない。

【0141】

図３及び４の合成スキームは、一部の実施形態を例示するために提供され、本明細書で開示する化合物及び方法の範囲を限定することを意図しない。簡潔には、図示したスキームにおいて、（ａ）アミノ酸パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）は、官能化された側鎖基−Ｌ_１−Ｑ_１を持つアミノ酸類似体の例として記述され、この場合のリンカー基Ｌ_１は−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−であり、反応性官能基Ｑ_１は−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３であり；また（ｂ）化合物３−アミノ−Ｎ−（３−（アミノオキシ）プロピル）−４−（メルカプトメチル）ベンズアミド）（ＳＰ８）は一般式（Ｖ）Ｑ_２−Ｚ−Ｌ_２−ＹＨの官能化されたリンカー試薬の例として記述され、この場合のＱ_２基は−ＯＮＨ_２であり、−ＹＨ基は−ＮＨ_２であり、Ｌ_２基は−（ＣＨ_２）_３−ＮＨＣＯ−（４−（ＣＨ_２ＳＨ））Ｃ_６Ｈ_３−である。記号「［−ＮＨＣＨ（Ｒ）ＣＯ］_ｎ」は、一連のアミド結合で連結さされた部分、例えば天然または非天然のアミノ酸からなるポリペプチド配列を表す。前述したように、「［−ＮＨＣＨ（Ｒ）ＣＯ−］_ｎ」のような式は、例えば、同一でないアミノ酸の配列ならびに同一のアミノ酸の配列を包含する。

【0142】

図３で例示された第１の一般的な方法では、前駆体ペプチドミメティック分子は、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃアミノ酸及び安全キャッチリンカー樹脂を使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：１９９８）により合成される。この例では、大環化を媒介するための適切に官能化された側鎖基−Ｌ_１−Ｑ_１を持つアミノ酸類似体（例えばｐＡｃＦ）は、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）である。図５Ａ〜５Ｄに示したように、既知の方法（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）を使用したラセミ体の形成、続いて酵素分解及び適切に保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ−ｐＡｃＦへの変換により、ｐＡｃＦを合成することができる。ＳＰＰＳによって非環式の前駆体ペプチドミメティック分子をアセンブリした後、ヨードアセトニトリルを有するスルホンアミドアンカー基のアルキル化により、側鎖保護された前駆体ペプチドミメティック分子を樹脂から切り出し、続いてチオールにより処理する。この工程により、前駆体ペプチドミメティック分子のＣ末端カルボキシ基も活性化され、チオエステル形態となる。次に、前駆体ペプチドミメティック分子を粗製混合物として、または精製後に、適切な大員環形成リンカー試薬（すなわち、この例のオキシアミノ／アミノチオール試薬ＳＰ８）と反応させ、部分的にまたは完全に保護された形態の大環状ペプチドミメティック分子を得る（溶液中環化、図３）。次に、この生成物を標準条件（例えば、９５％のＴＦＡなどの強酸）によって脱保護し、所望の大環状ペプチドミメティック分子を得る。いくつかの実施形態では、環化反応は、ｐＨ８の水溶液中で実施される。他の実施形態では、アルキル化反応に使用する溶媒は、ＤＭＦまたはメタノールである。他の実施形態では、ヨードアセトニトリルにてスルホンアミドのアンカー基がアルキル化された後、樹脂と結合した前駆体ペプチドミメティック分子は、大員環形成リンカー試薬と直に反応を起こし、それにより部分的にまたは完全に保護された形態の大環状生成物が形成され、それに伴って樹脂から切り出される（樹脂上環化、図３）。次に、切り出した生成物の脱保護により、所望の最終的な大環状生成物を得る。

【0143】

他の実施形態では、最初に非環式の前駆体ペプチドミメティックをＳＰＰＳによりアセンブリし、次に遊離Ｃ末端カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有する側鎖保護された形態で樹脂から切り出した後、Ｃ末端チオエステルへ（例えば、Ｃ末端カルボキシ基の活性化、続いてチオールとの反応により）変換する。次に、Ｃ末端チオエステル前駆体ペプチドミメティックを、適切な大員環形成リンカー試薬によって環化する。

【0144】

図４で例示された第２の一般的な方法では、前駆体ポリペプチドを生細胞の組換え発現
によって、または既知のインビトロ無細胞発現方法によって生成する。この場合、大環化を媒介するための適切に官能化された側鎖基−Ｌ_１−Ｑ_１を持つアミノ酸類似体（例えばｐＡｃＦ）を、当該技術分野で既知の方法、例えば、所望の非天然アミノ酸のリボソームを取り込むための操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡの存在下でのアンバー終止コドンの抑制（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）などによって組換えポリペプチドに導入する。更に、組換えポリペプチドをインテインタンパク質に遺伝子的に融合することで、ペプチドのＣ末端に反応性チオエステル基を生成でき、それによりポリペプチドのＣ末端と大員環形成リンカーとのライゲーションが可能になる。次に、大環状ペプチドミメティックを、組換え生成されたインテイン融合前駆体ポリペプチドと、大員環形成リンカー試薬（例えば、この例ではＳＰ８）水溶液との反応により生成する。いくつかの実施形態では、チオール触媒（例えば、チオフェノールまたはＭＥＳＮＡ）の添加によって大環化反応を促進する。

【0145】

アミノ酸類似体

【0146】

本開示は、上記の大環状ペプチドミメティック分子の合成における天然に存在する及び天然に存在しないアミノ酸の両方ならびにアミノ酸類似体の使用を企図する。安定な側鎖−Ｃ末端架橋された大環状ペプチド及びペプチドミメティック分子の合成に用いられる合成方法に従った任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を使用することができる。使用時に特に有用なアミノ酸は、反応性側鎖官能基、例えば、スルフヒドリル（−ＳＨ）基、アミノ（−ＮＨ_２）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）−）基またはカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基を含むアミノ酸であり、それにより側鎖とポリペプチドまたはペプチドミメティックのＣ末端との間の共有結合を、好適な反応条件下で適切なリンカー試薬との反応によって形成することができる。例えば、スルフヒドリル基を含むアミノ酸、例えば、システイン、ホモシステイン、ｏ−、ｍ−及びｐ−メルカプト−フェニルアラニン、ｏ−、ｍ−及びｐ−メルカプトメチル−フェニルアラニンは、本開示の有用なアミノ酸であると考えられる。同様に、アミノ基を含むアミノ酸、例えば、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、オルニチン、リシン、ｏ−、ｍ−及びｐ−アミノ−フェニルアラニン、ｏ−、ｍ−及びｐ−アミノメチル−フェニルアラニン；ケト基を含むアミノ酸、例えば、ｏ−、ｍ−及びｐ−アセチル−フェニルアラニン、２−アミノ−５−オキソヘキサン酸、２−アミノ−６−オキソヘプタン酸、２−アミノ−７−オキソオクタン酸、２−アミノ−２−オキソプロパン酸、２−アミノ−８−オキソノナン酸；アルケニル基を含むアミノ酸、例えば、２−（２′−プロペニル）グリシン、２−（３′−ブテニル）グリシン、２−（４′−ペンテニル）グリシン、２−（５′−ヘキセニル）グリシン、２−（６′−ヘプテニル）グリシン、２−（７′−オクテニル）グリシン）；アジド基を含むアミノ酸、例えば、ｏ−、ｍ−及びｐ−アジド−フェニルアラニン、２−アミノ−３−アジドプロパン酸、２−アミノ−４−アジドブタン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、２−アミノ−６−アジドヘキサン酸ならびにアルキニル基を含むアミノ酸、例えば、２−アミノペント−４−イン酸、２−アミノヘキス−５−イン酸、２−アミノヘプト−６−イン酸、２−アミノオクト−７−イン酸、２−アミノノン−８−イン酸、ｏ−、ｍ−及びｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、ｏ−、ｍ−及びｐ−エチニル−フェニルアラニンは、本開示に有用なアミノ酸であると考えられる。

【0147】

いくつかの実施形態では、アミノ酸及びアミノ酸類似体のアルファ炭素の構成単位はＳである。他の実施態様では、アミノ酸及びアミノ酸類似体のアルファ炭素の構成単位はＲである。いくつかの実施形態では、ペプチドミメティックに含まれるアミノ酸及びアミノ酸類似体は、Ｓ構成単位にアルファ炭素原子を有するものもあれば、アミノ酸及びアミノ酸類似体によっては、Ｒ構成単位にアルファ炭素原子を有するものもある。いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体はα，α二基置換、例えばα−メチル−（Ｓ）−システイン
及びα−メチル−（Ｒ）−システインである。いくつかの実施形態では、アミノ酸類似体はＮアルキル化された、例えば、Ｎ−メチル−（Ｓ）−システイン及びＮ−メチル−（Ｒ）−システインである。

【0148】

本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子の形成に有用な他のアミノ酸類似体は、式（ＶＩ）の化合物である：

【化31】

（式中、
Ｌ_１は、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基、アルコキシ基及びアリールオキシル基を含むが、これらに限定されないリンカー基であり、
Ｒ_１及びＲ_２は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基及び置換アリール基であり、
Ｑ_１は、スルフヒドリル（−ＳＨ）基、アミノ（−ＮＨＲ_５）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_５−）基及びカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基（式中、Ｒ_５は−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基）を含むが、これらに限定されない反応性官能基である）。

【0149】

いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）のアミノ酸類似体のＬ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルケニル基、Ｃ_５〜Ｃ_２４アリール基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換アルキル基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアリール基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアリール基、Ｃ_１〜Ｃ_２４アルコキシ基及びＣ_５〜Ｃ_２４アリールオキシ基を含むが、これらに限定されない。

【0150】

いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）のアミノ酸類似体は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0151】

大員環形成リンカー試薬

【0152】

前駆体ペプチドミメティック分子の側鎖とＣ末端とを連結して、本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子を形成するために使用する大員環形成リンカー試薬を提供する。上記のように、大員環形成リンカーは、配座剛性、代謝安定性の増加及び／または
細胞浸透性の増加をもたらす。更に、いくつかの実施形態では、大員環を形成する連結は、大環状ペプチドミメティック分子のαヘリックス状二次構造を安定化させる。

【0153】

いくつかの実施形態では、大員環形成リンカー試薬は、式（Ｖ）の化合物である：
Ｑ_２−Ｌ_２−Ｙ−Ｈ （Ｖ）
（式中、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−（式中、Ｒ_４は−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基）であり、
Ｌ_２は、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７（Ｒ_７は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、置換アリール基）で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｑ_２は、−ＣＨ（Ｒ_６）Ｘ（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、アミノ（−ＮＨＲ_６）基、オキシアミノ（−ＯＮＨ_２）基、ヒドラジノ（−ＮＲ_６ＮＨ_２）基、アルケニル（−Ｃ＝ＣＨ_２）基、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）基、アジド（−Ｎ_３）基、ケト（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_６−）基及びカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基（式中、Ｒ_６は−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基）を含むが、これらに限定されない）。

【0154】

いくつかの実施形態では、Ｌ_２は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0155】

上記のように、大員環形成リンカー試薬のＱ_２の選択は、前駆体ペプチドミメティック分子に存在するＱ_１基の選択に依存し、その選択によって当該技術分野で周知の手順に従った好適な反応条件下にて、これら２つの官能基間に結合を形成する反応が起こり得る。例えば、Ｑ_１がアルキニル基（−Ｃ≡ＣＨ）である場合、Ｑ_２はアジド基（−Ｎ_３）であり得、これら基間の結合を形成する反応は、触媒であるＣｕ（Ｉ）の存在下でアジド−アルキンの１，３−双極子付加環化を経て、Ｌ_１とＬ_２との側鎖結合をトリアゾール基（Ｚ＝トリアゾール）の形態で得ることで実施できる。別の例として、Ｑ_１がアルケニル基（−Ｃ＝ＣＨ_２）である場合、Ｑ_２はアルケニル基（−Ｃ＝ＣＨ_２）であり得、これら基間の結合を形成する反応は、Ｒｕ触媒（例えば、Ｇｒｕｂｂｓ触媒）の存在下でオレフィンメタセシス反応を経て、Ｌ_１とＬ_２との側鎖結合をオレフィン基（Ｚ＝−ＣＨ＝ＣＨ−）の形態で得ることで実施できる。別の例として、Ｑ_１がケトン（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３）である場合、Ｑ_２はオキシアミノ基（−ＯＮＨ_２）であり得、酸性条件（例えばｐＨ５．０の水性溶媒中）でオキシムライゲーションを経て、Ｌ_１とＬ_２との側鎖結合をオキシム基（Ｚ＝−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−Ｏ−）の形態で得ることで実施できる。別の例として、Ｑ_１がスルフヒドリル基（−ＳＨ）である場合、Ｑ_２はアルキル臭化物（−ＣＨ_２Ｂｒ）であり得、これらの基間の結合を形成する反応は、アルカリ条件（例えばｐＨ８．０の水性溶媒中）下で求核置換を経て、Ｌ_１とＬ_２との側鎖結合をチオエーテル基（Ｚ＝−ＣＨ_２Ｓ）の形態で形成することで実施できる。別の例として、Ｑ_１がカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）である場合、Ｑ_２はアミノ基（−ＮＨ_２）であり得、これら基間の結合を形成する反応は、標準的なアミドカップリング条件下で（例えば、ＤＭＦ中のカルボジイミドカップリング試薬を用いて）、Ｌ_１とＬ_２との側鎖結合をアミド基（Ｚ＝−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）の形態で形成することで実施できる。当業者は、Ｑ_１及びＱ_２の好適な組み合わせ、ならびにＱ_１及びＱ_２を共に反応させて側鎖共有結合を形成し、大環状ペプチドミメティックを形成するための好適な反応条件を容易に特定できるであろう。

【0156】

−ＹＨは、前駆体ペプチドミメティック分子の活性化Ｃ末端カルボキシ基と反応し得る求核基であり、それによってＹ基とこのようなＣ末端カルボキシ基との間に共有結合が形成される。−ＹＨ基の性質に応じて、ペプチドミメティック分子のＣ末端と大員環形成リ
ンカーとの間の共有結合は、一級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−）基、二級アミド（−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）−）基、ヒドラジド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮ（Ｒ）−）基、オキシアミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｏ−）基、エステル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）基またはチオエステル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ）基を含む。

【0157】

上記のように、活性化Ｃ末端カルボン酸基は、酸塩化物、酸無水物、アシルアジド、Ｏ−アシルイソ尿素、ホスホニウム化合物、活性エステルまたはチオエステルの形態であり得る。

【0158】

いくつかの実施形態では、「Ｃ末端カップリング反応」、すなわち前駆体ポリペプチドまたはペプチドミメティック分子での−ＹＨ基と活性化Ｃ末端カルボキシ基との結合を形成する反応は、「側鎖カップリング反応」、すなわち前駆体分子のＱ_１と大員環形成リンカー試薬のＱ_２基との結合を形成する反応の前に実施される。他の実施形態では、側鎖カップリング反応は、Ｃ末端カップリング反応の前に実施される。他の実施形態では、側鎖カップリング反応及びＣ末端カップリング反応は同時に、すなわち単独の反応で実施される。活性化Ｃ末端カルボキシ基、−ＹＨ基、Ｑ_１基及びＱ_２基の性質に応じて、当業者は、本明細書で開示する大環状分子の生成に最適な反応シーケンスを特定できるであろう。

【0159】

いくつかの実施形態では、大員環形成リンカー試薬の−ＹＨ基は、一級または二級アミノ基（−ＮＨ_２または−ＮＨＲ）であり、Ｌ_２成分は、３個または４個の結合によって−ＹＨ基から切り離されるスルフヒドリル基（−ＳＨ）を含む。１，２−または１，３−アミノチオール部分は、活性化Ｃ末端カルボキシ基が、アルキル−、アリール−、またはインテイン−チオエステル形態である、Ｃ末端カップリング反応に特に有用である。特に、大員環形成リンカー試薬のチオール基は、ネイティブの化学ライゲーション様のチオエステル交換反応での、Ｃ末端アルキル−、アリール−、またはインテイン−チオエステルとの反応、それに続くＳ−Ｎアシル転位により、ペプチドミメティック分子のＣ末端と大員環形成リンカー試薬から誘導される部分との間で安定なアミド結合を得ることにより、Ｃ末端カップリング反応を促進することができる。

【0160】

いくつかの実施形態では、式（Ｖ）の大員環形成リンカーのＬ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換アルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルケニル基、Ｃ_２〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアルケニル基、Ｃ_５〜Ｃ_２４アリール基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換アリール基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアリール基、Ｃ_５〜Ｃ_２４置換ヘテロ原子を含むアリール基、Ｃ_１〜Ｃ_２４アルコキシ基及びＣ_５〜Ｃ_２４アリールオキシ基を含むが、これらに限定されない。

【0161】

大員環形成リンカー試薬、Ｑ_２−Ｌ_２−ＹＨのＬ_２成分は、特に、側鎖結合に使用さるアミノ酸類似体のアルファ炭素と、所望の大環状ペプチドミメティック分子に連結されるべきＣ末端カルボキシ基との間の距離に応じて、長さが変化し得る。更に、大員環形成リンカー試薬のＬ_２成分の長さの変化に応じて、Ｌ_１の長さも変化することにより、上記のような適切な全長のリンカーを作成することができる。例えば、追加のメチレン単位をＬ_１成分に付加することにより、使用するアミノ酸類似体が変化した場合、Ｌ_２の長さは、Ｌ_１の増加した長さを相殺するために、１つのメチレン単位分の長さが減少する。

【0162】

いくつかの実施形態では、大員環形成リンカー試薬のＬ_２は、式―（ＣＨ_２）_ｎ−のアルキル基であり、この場合のｎは１〜２０の整数である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０である。他の実施形態では、Ｌ_２は、アルケニル基、アリール基または１，２，３−トリアゾリル基である。

【0163】

いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）のアミノ酸類似体は、以下を含むが、これらに限定されないアミノ酸類似体からなる群から選択される化合物である：

【化32】

（式中、「ｎ」は１〜１０の範囲の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数であり、「Ｒ′」は−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、「Ｒ″」は−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨである）。また、式（Ｖ）の大員環形成リンカー試薬は、以下を含むが、これらに限定されない適合性のある大員環形成リンカー試薬の群である：

【化33】

（式中、

【化34】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、
Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、
Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである）。

【0164】

図１６は、本明細書で記載する方法に使用できる、式［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の大員環形成リンカーの構造を示す。

【化35】

は、単結合または二重結合を示す。

【化36】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。Ｒ′は、−Ｈまたは−ＣＨ_３である。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。

【0165】

図１７は、本明細書で記載する方法に使用できる、式［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］の追加の大員環形成リンカーの構造を示す。

【化37】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。

【0166】

図１８は、本明細書で記載する方法に使用できる、アミノ酸類似体（左パネル）の構造及び適合性のある大員環形成リンカー試薬の構造（矢でつながれた右パネル）を示す。

【化38】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。Ｒ′は−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0167】

図１９は、本明細書で記載する方法に使用できる、追加のアミノ酸類似体（左パネル）の構造及び適合性のある大員環形成リンカー試薬の構造（矢でつながれた右パネル）を示す。

【化39】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示す。記号「ｍ」及び「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｑ」は０〜５の整数である。Ｒ′は−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0168】

アッセイ

【0169】

本明細書で開示する大環状ペプチドミメティックの特性は、例えば、以下に記載する方法を用いることによって分析される。いくつかの実施形態では、大員環は、対応する非大環状ポリペプチドと比較して特性が増強されている。対応する非大環状ポリペプチドは、例えば、大環状ペプチドミメティック分子の非環式の前駆体であり、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物などである。あるいは、対応する非大環状ポリペプチドは、大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列と実質的に配列が重複する天然ポリペプチド配列などのポリペプチド配列である。本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列と実質的に重複する非大環状ポリペプチドの例は、図１０のＰ１、Ｐ２、及びＰ１０である。

【0170】

一般に、対応する非大環状ポリペプチドは、標識した天然ポリペプチドまたはペプチドミメティック前駆体であっても良い。例えば蛍光標識または放射性標識によるこのような標識化は、必要に応じて以下に記載するアッセイのいくつかにおいて使用される。このようなアッセイでは、大員環及び対応する非大環状ポリペプチドはいずれも、通常は、類似したまたは機能的に等価な方法によって標識される。

【0171】

αヘリックス性のアッセイ。本明細書で開示する大環状ペプチドミメティック分子及び基準となる非大環状化合物のアルファヘリックス含有量を円二色性（ＣＤ）分光法により測定することができる。ＣＤスペクトルは、分光偏光計（例えば、ＪＡＳＣＯ Ｊ−７１０）上で、以下の標準的な測定パラメータを用いて２０℃で記録される：波長１９５〜２
５０ｎｍ；工程分解能０．５ｎｍ；速度１０ｎｍ／秒；積算回数３；反応１秒；バンド幅２ｎｍ；経路長０．１ｃｍ。これらの分析では、大環状分子及び基準となる非大環状化合物は通常、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、２０〜５０μＭの最終濃度を得る。平均残基楕円率は波長に対してプロットでき、各ペプチドのヘリックス含有量は以下の式に基づいて導出できる：ｎをペプチド結合数とした場合、［θ］_２２２／［４００００ｘ（ｎ−４）／ｎ］（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．及びＴｉｎｏｃｏ，Ｉ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９７２，９４，４３８９）。

【0172】

タンパク分解安定性の分析。直鎖ペプチドはプロテアーゼによる加水分解に対して感受性があり、その結果、インビボで急速な分解を受けやすくなる。本明細書で開示される方法によるペプチド系分子の大環状化により、タンパク質分解性に対する耐性強化などの改善された特性の付与が期待される。この特性は、精製されたプロテアーゼ、または代わりにヒト血清の存在下で、大環状ペプチドミメティック分子及び対応する基準となる非大環状ポリペプチドを培養することによって評価することができる。次に、化合物のインビトロタンパク質分解性は、紫外線検出器を備えるＨＰＬＣによって経時的にモニターすることができる。結果として生じる時間依存的曲線から、化合物の半減期を測定できる。一例として、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中の化合物（１０μＭ）を室温にてキモトリプシン（１．０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養することにより、大員環のインビトロタンパク分解安定性を測定した。種々の時点（例えば、０、３０、６０、１２０、１８０、２４０分）で、反応混合物のアリコート（５０μＬ）を除去し、ＴＦＡ（５μＬ）を添加してクエンチした後、ＨＰＬＣ分析を行った。完全体のペプチドと比較したピーク面積の減少に基づいて、ペプチドの切断をモニターした。

【0173】

インビトロタンパク質結合アッセイ。本明細書で開示される大環状ペプチドミメティック分子の、目的タンパク質への結合能は、例えば、インビトロ蛍光偏光（ＦＰ）アッセイによって評価することができる。例えば、これらの化合物と、腫瘍性タンパク質ＨＤＭ２及び／またはＨＤＭＸとの結合能は、大環状ペプチドミメティック分子の蛍光標識された（例えば、フルオレセインをコンジュゲートした）誘導体をタンパク質を増量しながら培養し、更に増加したタンパク質濃度での蛍光偏光の増加を測定することにより確定することができる。蛍光偏光法の原理は確立されており、このアッセイは蛍光標識したペプチドとタンパク質との間の複合体形成の結果として生じる蛍光偏光の増強を利用している。更に、タンパク質濃度に応じた分子のＦＰ変化を分析して、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を基準にして、タンパク質に対する化合物の結合親和性を測定することができる。

【0174】

インビトロ阻害アッセイ。大環状ペプチドミメティック分子の、目的タンパク質への結合能、及び標的タンパク質−タンパク質の相互作用の阻害能は、例えば、インビトロで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による阻害アッセイによって評価することができる。例えば、ｐ５３と腫瘍性タンパク質ＨＤＭ２及びＨＤＭＸとの相互作用に対する、これらの化合物の阻害能は、溶液中での阻害アッセイにより測定できる。このアッセイでは、ビオチン化ｐ５３から誘導したペプチド（例えば、ビオチン−ＳＧＳＧ−ｐ５３_{１５−２９}）が、ストレプトアビジンをコーティングしたバイオセンサーチップに最初に固定される。次に、可溶性ＨＤＭ２（またはＨＤＭＸ）を種々の濃度の大員環と共に培養し、次いでその混合物を官能化された表面に注入する。阻害剤の濃度の増加に応じて、ＨＤＭ２（またはＨＤＭＸ）と表面との結合が阻害され、それに伴いバイオセンサーでの反応は減少する。更に、濃度反応曲線を分析して、最大半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を基準にして、化合物の阻害能を測定することができる。

【0175】

細胞透過性の分析。いくつかの実施形態では、本明細書で記載する大環状ペプチドミメティックは、対応する非大環状相対物よりも細胞透過性が高い。最適化された側鎖−Ｃ末端テザーを有する大環状ペプチドミメティック分子は、対応する非大環状相対物よりも、
例えば、少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍または３倍大きいまたはそれ以上の細胞透過性を有する。これらの化合物の細胞透過性を測定するためには、無傷の細胞を、蛍光標識した（例えばフルオレセインをコンジュゲートした）大環状ペプチドミメティック分子または対応する非大環状相対物（１０μＭ）と共に、血清を含まない培地中で３７℃にて４時間培養する。次に、細胞を培地で２回洗浄し、トリプシンで培養した後（例えば０．２５％トリプシン、１０分、３７℃）、再度洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁する。細胞蛍光は、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用することにより分析する。あるいは、蛍光標識した化合物の細胞透過能を、共焦点蛍光顕微鏡によって評価することができる。

【0176】

細胞有効性の分析。大環状ペプチドミメティック分子の細胞毒性活性は、例えば、腫瘍形成性及び非腫瘍形成性細胞株、ならびにヒトまたはマウスの細胞集団に由来する一次細胞を使用して、細胞ベースのアッセイにて測定する。細胞生存性は、例えば、大環状ペプチドミメティック分子（例えば０．１〜１００μＭ）と共に培養する２４〜９６時間にわたってモニターし、１００μＭ未満のＥＣ_５０で細胞生存性が減少するものを特定する。細胞生存性を測定するいくつかの標準的なアッセイ、例えば、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイなどが市販されている。このようなアッセイを使用して、腫瘍形成性及び非腫瘍形成性の細胞の生存性を低減させる大環状ペプチドミメティック分子の有効性を評価することができる。加えて、場合により、アネシンＶ及びカスパーゼ活性化を測定するアッセイを使用して、大環状ペプチドミメティック分子の細胞毒性が、ｐ５３活性の再活性化に起因すると予測される、アポトーシス機構の活性化に依存するかどうかを評価することができる。

【0177】

使用方法

【0178】

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の大環状ペプチドミメティック分子に含まれるペプチド配列は、腫瘍抑制因子ｐ５３タンパク質のＨＤＭ２結合ドメインから誘導される。ヒト転写因子ｐ５３は、ＤＮＡ損傷及び細胞ストレスに応答して細胞周期停止及びアポトーシスを誘発し、それにより細胞を悪性形質転換から保護する役割を果たす。Ｅ３ユビキチンリガーゼＨＤＭ２は、直接的な結合相互作用によって、ｐ５３依存的なトランス活性化活性の中和、核からのｐ５３輸送の媒介、及びユビキチン−プロテアソーム経路による分解対象となるｐ５３の標的化を行い、ｐ５３の機能を負に調節する。ＨＤＭＸ（ＨＤＭ４とも称する）は、ＨＭＤ２の構造同族体であり、これは主にｐ５３トランス活性化因子ドメインとの結合によって、ｐ５３の負の調節因子としても作用する。ＨＭＤ２またはＨＭＤＸいずれかの過剰発現は、いくつかの悪性腫瘍と関連付けられてきた（Ｍａｒｉｎｅ，Ｄｙｅｒら．２００７、Ｗａｈｌ及びＷａｄｅ ２００９）。

【0179】

ＨＤＭ２及びＨＤＭＸとの結合を担うｐ５３の領域は、ヒトｐ５３タンパク質（ｐ５３_{１５−２９}）のＮ末端トランス活性化ドメインに認められた。このドメインは、１５残基配列（ＨＤＭ２（またはＨＤＭＸ）との結合時に、約２．５ターンの両親媒性αヘリックスを形成する、ＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号１））を包含する（Ｋｕｓｓｉｅ，Ｇｏｒｉｎａら １９９６、Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｃｚａｒｎａら ２００８）。悪性腫瘍研究に基づいて立証されたように、このＨＤＭ２／Ｘと結合するｐ５３のドメイン内の３つの残基、詳細には、Ｆ１９、Ｗ２３、及びＬ２６は、ＨＤＭ２及びＨＤＭＸとの相互作用に関わる（Ｋｕｓｓｉｅ，Ｇｏｒｉｎａら １９９６、Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｃｚａｒｎａら ２００８）。ｐ５３とＨＤＭ２／Ｘとの相互作用に関与することが知られている、対面型（ｃｏｆａｃｉａｌ）ｉ／ｉ＋４／ｉ＋７アミノ酸残基のトライアドを持つ他の多数の直鎖ｐ５３関連ペプチドが、ファージディスプレイによって特定され、これには、Ｐａｚｇｉｅｒらが報告した、直鎖ペプチドＰＭＩ（Ｔ^１ＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ^１２、配列番号２）及び直鎖ペプチドＰＤＩ（Ｌ^１ＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ^１２、配列番号
３）が含まれる（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）。

【0180】

ｐ５３遺伝子の欠失若しくは変異、またはＨＤＭ２若しくはＨＭＤＸの過剰発現の結果として生じるｐ５３活性の減少または喪失は、いくつかのヒト悪性腫瘍の発生及び進行の根源となる因子として特定された（Ｍａｒｉｎｅ，Ｄｙｅｒら ２００７、Ｗａｈｌ及びＷａｄｅ ２００９）。野生型ｐ５３を発現する腫瘍は、活性なｐ５３の濃度を安定化または増加させる薬理剤に対する感受性を存続する。したがって、ｐ５３−ＨＤＭ２の相互作用の化学的阻害によるｐ５３活性の再活性化は、インビトロ及びインビボの両方で、癌細胞のアポトーシスを促進する有効なアプローチと認められた（Ｍａｒｉｎｅ，Ｄｙｅｒら ２００７、Ｗａｈｌ及びＷａｄｅ ２００９）。更に、ＨＤＭ２及びＨＭＤＸはいずれもｐ５３活性の負の調節に関与しているため、ＨＤＭ２／Ｘの二重阻害は特に抗癌治療の魅力的な方法として注目されている（Ｈｕ，Ｇｉｌｋｅｓら ２００６、Ｗａｄｅ，Ｗｏｎｇら ２００６）。更に、これらのタンパク質同族体のｐ５３結合間隙には微細な差があるため、ＨＤＭ２の小分子阻害剤の大半は、ｐ５３対ＨＤＭＸの相互作用を強力に阻害できないことから（Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｃｚａｒｎａら ２００７）、ＨＤＭ２／Ｘの二重阻害ができる化合物は有望な抗癌剤として非常に興味深い（Ｂｅｒｎａｌ，Ｗａｄｅら ２０１０、Ｂｒｏｗｎ，Ｑｕａｈら ２０１３）。

【0181】

いくつかの実施形態では、新規の大環状αヘリックス状ペプチドミメティックは、ｐ５３−ＨＤＭ２及びｐ５３−ＨＤＭＸのタンパク質−タンパク相互作用を効果的に阻害できる化合物を生成するために、本明細書で開示される方法に従って調製される。本明細書では、これらの化合物を「ｐ５３大環状ペプチドミメティック」と称する。これら新規のＨＤＭ２／Ｘ阻害剤は、多くの用途に有用であり、例えば、ＨＤＭ２若しくはＨＤＭＸの過剰発現によって、またはｐ５３活性の減少によって生じる悪性腫瘍の治療的処置を含むが、これに限定されない。

【0182】

一実施形態では、ｐ５３とＨＤＭ２間、ｐ５３とＨＤＭＸ間、またはｐ５３とＨＤＭ２及びＨＤＭＸ両方のタンパク質とのタンパク質−タンパク相互作用を阻害できるｐ５３大環状ペプチドミメティックを提供する。これらのｐ５３大環状ペプチドミメティックを治療用途に使用すると、例えば、ヒト及びヒト以外の哺乳動物での癌及び他の疾患を治療することができ、ここでの癌及び他の疾患は、ｐ５３が不所望に低濃度または低活性であることを特徴とし、及び／またはＨＤＭ２またはＨＤＭＸの活性レベルが不所望に高いことを特徴とする癌及び他の疾患を治療することができる。これらのｐ５３大環状ペプチドミメティックは、癌及び自己免疫などの過剰な細胞生存及び増殖の症状に加えて、神経変性及び免疫不全などの不適切な細胞周期停止及びアポトーシスの症状を引き起こす、ｐ５３転写経路の調節阻害と関連したヒトまたはヒト以外の哺乳動物でのいかなる疾患に対しても有用であり得る。いくつかの実施形態では、これらのｐ５３大環状ペプチドミメティックは、ＨＤＭ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：２２８９５２；ＧＬ２２８９５２）及び／またはＨＤＭＸ（別称：ＨＤＭ４；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：８８７０２７９１；ＧＬ８８７０２７９１）と結合する。

【0183】

本明細書で使用される場合、用語「ｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連の疾患」は、少なくとも部分的に、ヒトタンパク質ｐ５３、ＨＤＭ２またはＨＭＤＸの異常な（すなわち、異常に高い、または異常に低い）活性または発現レベルによって引き起こされる、何らかのヒト疾患または障害を指す。

【0184】

本明細書で使用される場合、用語「治療」は、患者（ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含むが、これらに限定されない）に対する治療薬の適用または投与、あるいは、疾患、疾患の症状または疾患素因の治療、治癒、緩和、軽減、変化、回復、寛解、改善または作用を目的として、疾患、疾患の症状または疾患の素因を有する患者からの単離組織または細
胞株に対する治療薬の適用または投与と定義される。

【0185】

したがって、式（ＶＩＩ）：

【化40】

のｐ５３大環状ペプチドミメティックは、ヒト（またはヒト以外の哺乳動物）対象でのｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連の疾患の治療に使用するために提供される
（式中、
Ａ、Ｃ及びＤはそれぞれ独立して、天然または非天然アミノ酸であり、末端Ｄはキャッピング基を含む場合があり、
Ｂは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ基とカルボキシ基間に少なくとも１つの付加的なメチレン基を含むアミノ酸、二級アミンまたは三級アミンであるアミノ基を含むアミノ酸、エステルによって置換されたカルボキシ基を含むアミノ酸、［−ＮＨＮ（Ｒ_３）Ｃ（Ｏ）−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり、
Ｙは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−ＮＨＮ（Ｒ_４）−、−ＮＨ−Ｏ−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
Ｚは、−ＳＣＨＲ_６−、−ＣＨＲ_６Ｓ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ（Ｒ_５）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ（Ｒ_６）−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_５）＝Ｎ−ＮＨ（Ｒ_６）−、−ＣＨ（Ｒ_５）−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ_６）−またはトリアゾール基であり、
Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、独立して、それぞれが非置換であるか、またはＲ_７で置換された、脂肪族基、アリール基、置換脂肪族基、置換アリール基、ヘテロ原子を含む脂肪族基、ヘテロ原子を含むアリール基、置換ヘテロ原子を含む脂肪族基、置換ヘテロ原子を含むアリール基であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５及びＲ_６は、独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基または置換アリール基であり、
Ｒ_７は、それぞれ独立して、−Ｈ、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基及び置換アリール基であり、
ｘは、０〜１０の整数であり、
ｙは、０〜１０の整数であり、
ｚは、０〜１０の整数であり、
ｗは、１〜１０００の整数である）。

【0186】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子に含まれるペプチド配列は、ｐ５３タンパク質のトランス活性化ドメイン（配列番号１）から誘導される。他の実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子に含まれるペプチド配列は、配列番号２及び配列番号３のｐ５３関連ポリペプチドから誘導される。

【0187】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、配列番号１、２及び３に対応するポリペプチド配列と、少なくとも約５０％、６０％、８０％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0188】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、表１、２、３及び／または４に記載されたアミノ酸配列を含む。

【0189】

【表1】

【0190】

【表2】

【0191】

【表3】

【0192】

【表4】

【0193】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、配列番号４〜３７のポリペプチド配列のいずれかと、少なくとも約５０％、６０％、８０％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0194】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、一般式（ＶＩＩ）の大環状ペプチドミメティック分子に対応する。この場合のアミノ酸配列は表１、２、３及び／または４に記載されるアミノ酸配列であり、これらのアミノ酸配列の残基

【化41】

とカルボキシ末端とを結合する大環状形成性リンカー［−Ｌ_１−Ｚ−Ｌ_２−Ｙ−］は、

【化42】

及び

【化43】

を含む大環状形成性リンカーの群から選択されるが、これらに限定されない（式中、

【化44】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、それぞれ独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３である）。

【0195】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、一般式（ＶＩＩ）の化合物に対応し、この場合、
ｉ）ｐ５３大環状のペプチドミメティック分子に含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３７に対応するポリペプチド配列と、少なくとも少なくとも約５０％、６０％、８０％、９０％または９５％同一であり、
ｉｉ）側鎖−Ｃ末端の大環状化は、

【化45】

を含むがこれらに限定されない、アミノ酸類似体の群から選択されるアミノ酸類似体によって、及び

【化46】

を含むがこれらに限定されない、大員環形成リンカーの群から選択される、適合性のある大員環形成リンカーによって媒介され、
ここで、選択されたアミノ酸類似体及び大員環形成リンカー試薬において、

【化47】

は、オルト、メタ、またはパラ二置換フェニル環を示し、
「ｍ」及び「ｎ」は、独立して、１〜１０の範囲内の整数であり、
「ｑ」は、０〜５の整数であり、
Ｒ′は、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＣＨ_３であり、
Ｒ″は、−Ｈ、−ＣＨ_３または−ＯＨであり、
Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＴｓ、−ＯＭｓまたは−ＯＴｆである。

【0196】

いくつかの実施形態では、式（ＶＩＩ）のｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、蛍光標識、親和性標識、放射性同位体標識、標的薬剤または治療薬を含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、タンパク質ｐ５３、ＨＭＤ２またはＨＤＭＸの異常な発現または活性と関連した障害に感受性である、または障害を有している対象の予防的または治療的両方の処置に使用できる、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子を提供する。いくつかの実施形態では、この障害は、少なくとも部分的に、ｐ５３またはＨＭＤ２またはＨＤＭＸの異常なレベル（例えば、過剰発現または過小発現）によって、あるいは異常な活性を有するｐ５３またはＨＭＤ２またはＨＤＭＸの存在によって引き起こされる。したがって、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子によって引き起こされる、ｐ５３またはＨＤＭ２またはＨＤＭＸのレベル及び／若しくは活性の低減、またはｐ５３またはＨＤＭ２またはＨＤＭＸのレベル及び／若しくは活性の増強は、障害の有害症状の改善または低減に有用であり得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、ｐ５３大環状ペプチドミメティック分子は、癌及び腫瘍症状の治療、予防及び／または診断に使用される。本明細書で使用される場合、用語「癌」、「過剰増殖性」及び「腫瘍性」は、自律的増殖能、すなわち、細胞成長の急速な増殖を特徴とする異常な状態または症状を有する細胞を指す。過剰増殖性及び腫瘍性の疾患状態は、病理的異常、すなわち疾患状態の特徴または性質を有するものとして分類することも、非病理的異常、すなわち疾患状態を伴わないが正常からの逸脱として分類することもできる。この用語は、侵襲性の組織病理的なタイプまたはステージを問わず、全ての種類の癌性増殖または腫瘍形成のプロセス、転移性組織、または悪性形質転換性の細胞、組織若しくは器官を含むこと意味する。転移性腫瘍は、多数の原発腫瘍タイプから生じ得、胸部、肺、肝臓、結腸及び卵巣由来のものを含むが、これらに限定されない。「病理的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖を特徴とする疾患状態で発生する。非病理学過剰増殖性細胞の例は、損傷修復と関連した細胞増殖を含むが、これらに限定されない。細胞増殖及び／または分化障害の例は、癌、例えば、癌腫、肉腫または転移性の障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、大環状ペプチドミメティック分子は、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、このような癌の転移などを抑制するための新規治療薬である。

【0199】

癌または腫瘍性病状の例として、繊維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立
腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、またはカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0200】

増殖障害の例として、造血腫瘍性障害が挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「造血腫瘍性障害」は、例えば骨髄、リンパ系統若しくは赤血球系統、またはその前駆細胞に起因する、造血系由来の過形成性／腫瘍性細胞を含む疾患を含むが、これらに限定されない。未分化型急性白血病から生じる疾患として、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的な骨髄性障害には、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含むが、これらに限定されず、リンパ性悪性腫瘍には、Ｂ系ＡＬＬ及びＴ系ＡＬＬを含むが、これに限定されない急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞白血病（ＨＬＬ）、及びワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含むが、これらに限定されない。悪性リンパ腫の追加の形態は、非ホジキンリンパ腫及びその変異体、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病及びリード‐スタンバーグ病を含むが、これらに限定されない。

【0201】

乳房の細胞増殖性及び／または分化障害の例は、上皮過形成、硬化性腺症、及び小管乳頭腫を含む増殖性乳房疾患；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍及び肉腫などの間質性腫瘍、ならびに大管乳頭腫などの上皮腫瘍；上皮内腺管癌（パジェット病を含む）及び上皮内小葉癌を含む上皮内（非侵襲性）癌などの乳癌、ならびに侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液）癌、管状癌、及び侵襲性乳頭癌を含むがこれらに限定されない侵襲性（浸潤性）癌、ならびに混合型悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。男性乳房における障害は、女性化乳房及び癌を含むが、これらに限定されない。

【0202】

肺の細胞増殖及び／または分化障害の例は、腫瘍随伴症候群を含む気管支原性癌、細気管支肺胞上皮がん、気管支カルチノイドなどの神経内分泌腫瘍、混合型腫瘍、及び転移性腫瘍；炎症性胸水、非炎症性胸水、気胸を含む胸膜の病理的異常、ならびに単発性線維性腫瘍（胸膜線維腫）及び悪性中皮腫を含む胸膜腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0203】

結腸の細胞増殖及び／または分化障害の例は、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、及びカルチノイド腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0204】

肝臓の細胞増殖及び／または分化障害の例は、結節性過形成、腺腫、ならびに肝臓の原発性癌及び転移性腫瘍を含む悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0205】

卵巣の細胞増殖及び／または分化障害の例は、体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍などの卵巣腫瘍；成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未熟悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌などの胚細胞腫瘍；顆粒膜細胞腫瘍、莢膜細胞線維腫、男性ホルモン産生細胞腫、ヒル（ｈｉｌｌ）細胞腫瘍及び性腺芽腫などの性索間質腫瘍；ならびにクルケンベルグ腫瘍などの転移性腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0206】

他の実施形態では、本明細書に記載する大環状ペプチドミメティックは、過活性細胞死または生理的傷害などによる細胞死を特徴とする病状の治療、予防または診断に使用され
る。早発性若しくは望ましくない細胞死、またはその代わりに望ましくない若しくは過度の細胞増殖を特徴とする病状のいくつかの例は、細胞過少／低形成性、無細胞／無形成性、または細胞過多／過形成の病状を含むが、これらに限定されない。例の一部は、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症及び骨髄形成異常を含むが、これらに限定されない血液疾患を含む。

【0207】

他の実施形態では、アポトーシスの減少に作用する本明細書で開示する大環状ペプチドミメティックを使用して、望ましくないレベルの細胞死を伴う障害を治療することができる。したがって、いくつかの実施形態では、抗アポトーシス大環状ペプチドミメティックを使用して、ウイルス感染症に伴う細胞死に至るもののような障害、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に伴う感染症、及び細胞アポトーシスに伴う神経疾患を治療することができる。このような障害として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症及び脳変性の種々の形態が挙げられる。これらの疾患における神経単位の漸進的喪失は、炎症反応を引き起こさず、アポトーシスレベルの異常な増加と関連して出現する。

【0208】

別の実施形態では、本明細書に記載するｐ５３大環状ペプチドミメティックは、自動免疫疾患を含むがこれに限定されない炎症性障害の治療、予防または診断に使用される。本明細書に記載するｐ５３ペプチドミメティック大員環を用いて治療される自己免疫疾患の例は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、チャーグ−ストラウス症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、皮膚筋炎、Ｉ型真正糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸炎（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、紅班性狼瘡、限局性強皮症、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、尋常天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（別名「巨細胞性動脈炎」）、高安動脈炎、血管炎、白斑及びウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。

【0209】

本明細書に記載するｐ５３大環状ペプチドミメティックを用いて治療できる他の種類の炎症性疾患の例は、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー（蕁麻疹／発疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎）、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギー、及び肥満細胞症、喘息を含む希少アレルギー傷害を含むアレルギー、骨関節炎、リウマチ様関節炎及び脊椎関節症を含む関節炎、中枢神経限局性血管炎、サルコイドーシス、臓器移植拒絶反応、線維筋痛、繊維症、膵炎及び骨盤炎症性疾患を含むが、これらに限定されない。

【0210】

本明細書に記載するｐ５３大環状ペプチドミメティックを用いて治療または予防できる心臓血管系障害（例えば、炎症性障害）の例は、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、心臓発作、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患；細動脈硬化症、小血管疾患、腎臓病、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、気腫及び慢性肺疾患などの非冠状動脈疾患；または、介入的手技を伴う心臓血管系の病状（「手技による血管外傷」）、例えば血管形成術後の、シャント、ステント、合成若しくは天然の切除移植片、留置カテーテル、バルブ若しくは他の埋込み可能な用具の留置後の再狭窄を含むが、これらに限定されるものではない。

【0211】

加えて、本明細書に記載するｐ５３大環状ペプチドミメティック分子を対象に投与することを含む、対象におけるｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ関連疾患の治療方法を提供する。
加えて、本明細書に記載するｐ５３大環状ペプチドミメティック分子を対象に投与することを含む、対象における癌の治療方法を提供する。

【0212】

本明細書で提供される化合物は、１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）キラル中心を含み得る。したがって、化合物は、ラセミ混合物、ジアステレオマー、エナンチオマー、または１つ以上の立体異性体が豊富な混合物であり得る。本明細書で置換基群が開示される場合、その群の個々の構成要素の全て、及びいかなる異性体、エナンチオマー及びジアステレオマーを含む全てのサブグループも本開示に含まれることを意図する。加えて、本明細書で開示する化合物の全ての同位体的形態は、本開示に含まれることを意図する。例えば、本明細書で開示される分子内の１つ以上の水素を、いずれもジウテリウムまたはトリチウムと置換できることが理解されよう。

【0213】

医薬組成物及び投与経路

【0214】

本明細書で開示するｐ５３大環状ペプチドミメティックはまた、薬学的に許容される誘導体またはそのプロドラックも含む。「薬学的に許容される誘導体」は、レシピエントへの投与時に、本明細書で開示する化合物を（直接的または間接的に）提供できるような、本明細書で開示する化合物の薬学的に許容される任意の塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグまたは他の誘導体を意味する。特に好ましい薬学的に許容される誘導体は、哺乳動物に投与された場合に、本明細書で開示する化合物のバイオアベイラビリティを増大するもの（例えば、経口投与された化合物の血中への吸収を増大することによる）、または親種と比較して、活性化合物の生物学的区画（例えば、脳またはリンパ系）への送達を増強するものである。一部の薬学的に許容される誘導体は、水への溶解度または消化管膜を通る能動輸送を増強する化学基を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示するｐ５３大環状ペプチドミメティックは、選択的な生物学的特性を増強する適切な官能基を共有結合または非共有結合することにより修飾されても良い。このような修飾は、所与の生物学的区画（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的透過性を増加させるもの、経口有効性を増加させるもの、可溶性を増加させて注射による投与を可能にするもの、代謝を変化させるもの及び排泄率を変化させるものを含む。

【0216】

本化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機及び有機の酸及び塩基に由来するものを含むが、これらに限定されない。好適な酸性塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩を含む。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩及びＮ−（アルキル）_４＋塩を含む。

【0217】

本開示の化合物から医薬組成物を調製するための、薬学的に許容される担体は固体または液体いずれかの担体を含む。固体形態の製剤は、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤及び分散性粒剤を含む。固体担体は、希釈剤、着香剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤またはカプセル化材料としても機能する１つ以上の物質であり得る。処方及び投与のための技術に関する詳細は、科学文献及び特許文献に十分に記述されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡの最新版を参照されたい。

【0218】

粉末剤において、担体は、微粉化した活性成分と混合されている微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合特性を有する担体と好適な割合で混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。

【0219】

好適な固体賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは別の植物のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；ならびにアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含むがこれらに限定されない炭水化物またはタンパク質充填剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加する。

【0220】

液体形態の製剤は、液剤、懸濁剤及び乳剤、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液を含む。非経口注射用に、液体製剤を水性ポリエチレングリコール溶液にて溶液に処方することができる。本明細書で使用される場合、用語「非経口」は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内及び皮下を含む投与様式を指す。

【0221】

本明細書で開示される組成物が、大環状ペプチドミメティック分子と１つ以上の追加の治療薬または予防薬との組み合わせを含む場合、大環状ペプチドミメティック分子及び追加の薬剤はいずれも、約１〜１００％の用量レベルで存在すべきであり、いくつかの実施形態では、単剤療法レジメンにおいて通常投与される約５〜９５％または約１０〜９０％の用量で存在すべきである。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、複数回投与レジメンの一部として、本開示の化合物とは別に投与される。あるいは、これらの薬剤は１つの剤形の一部であり、本明細書で開示される化合物と共に１つの組成物中に混合される。

【0222】

本明細書で開示するｐ５３大環状ペプチドミメティックの投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による、または耳、鼻、目若しくは皮膚への局所塗布による投与を含むが、これらに限定されない。

【0223】

本明細書で用いられる用語及び表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用され、このような用語及び表現の使用にあたり、記載及び説明される特徴及びその一部のいかなる等価物も排除することを意図しないが、本明細書で開示される及び／または特許請求の範囲に記載される主題の範囲内で、種々の改変が可能であることが理解される。したがって、実施形態及び任意の特徴を開示しているが、開示される概念の改変及び変形を当業者は用いることができ、このような改変及び変形は、本明細書で開示される及び／または特許請求の範囲に記載される主題の範囲内であると見なされることを理解すべきである。

【0224】

特段の記載のない限り、本開示は、具体的な分子構造、置換基、合成法、反応条件など、それ自体変化し得るものに限定されない。各実施形態は、当然変化し得る特定の組成物または生物系に限定されないことを理解すべきである。

【0225】

本明細書で開示される化合物及び方法の実施にあたり、具体的に例示されたもの以外の出発材料、生体物質、試薬、合成法、精製法、分析法、アッセイ法及び生物学的方法を使用できることを当業者であれば理解されよう。このような何らかの材料及び方法の当該分野で既知の機能的等価物は全て包含されることを意図する。

【実施例】

【0226】

実施例１．ｐ５３大環状ペプチドミメティックの設計。

【0227】

ＰＭＩ（Ｔ^１ＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ^１２、配列番号２）と呼ばれる直鎖１２−ｍｅｒペプチドが、近年、Ｐａｚｇｉｅｒら（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）によるバクテリオファージディスプレイによって単離された。ＰＭＩは、ｐ５３とＨＤＭ２／Ｘとの相互作用に関与することが知られている、対面型ｉ／ｉ＋４／ｉ＋７アミノ酸残基のトライアド（Ｋｕｓｓｉｅ，Ｇｏｒｉｎａら １９９６、Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｃｚａｒｎａら ２００８）（すなわち、Ｐｈｅ^３、Ｔｒｐ^７及びＬｅｕ^１０がそれぞれｐ５３のＰｈｅ^１９、Ｔｒｐ^２３及びＬｅｕ^２６に対応）を持つが、ｐ５３誘導ペプチドｐ５３_{（１５−２９）}よりも大きな親和性で、ＨＤＭ２及びＨＤＭＸのいずれとも結合する（それぞれ、ＩＣ_５０は約３０〜４０ｎＭ対２００〜３００ｎＭ）（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）。ＰＭＩ／ＨＤＭ２複合体の入手可能な結晶構造を検証すると（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）（図９Ａ）、溶媒に露出する２つの残基、すなわち、Ｔｈｒ^１及びＧｌｕ^５は、本明細書で開示される一般的な方法（図１）に従ってｐ５３大環状ペプチドミメティック（図９Ｂ）を生成するための２つの生存可能な側鎖結合点であると確認された。大環化方法に関しては、アミノ酸類似体パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）によって、及び図８に提示されたもののようなオキシアミノ／アミノチオール大員環形成リンカーによって媒介される、側鎖−Ｃ末端の大環化手順を選択した。ＰＭＩペプチド内のＰｒｏ^１２はＨＤＭ２表面と有意な接触を確立しないと思われたため（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）、ｐ５３大環状ペプチドミメティックを構築するためのＣ末端結合部位をＳｅｒ^１１の次に置くことを選択し、ペプチドミメティック分子によるαヘリックス形成を更に促進するために、これをＡｌａに変更した。

【0228】

対応するＴｈｒ１ｐＡｃＦ及びＧｌｕ５ｐＡｃＦを含む前駆体ペプチドミメティック分子のモデル分析により、ｐＡｃＦのβ炭素原子とｉ＋６またはｉ／ｉ＋１０のＡｌａ^１１残基のカルボニル原子との間の距離はそれぞれ約１３及び１７Åであることが明らかになった。この距離は、ｐＡｃＦと大員環形成リンカー試薬ＳＰ６及びＳＰ８（図８）との反応で生成される大員環形成リンカーにより得られる点間距離（約１４〜１７Å、図１１Ｂ〜１１Ｃ）と一致する。このような理由から、ｉ／ｉ＋６（ＣＯ）及びｉ／ｉ＋１０（ＣＯ）で連結された、一連のｐ５３大環状ペプチドミメティックを設計した。これには、ＳＰ６（化合物Ｐ３及びＰ７、図１０）またはＳＰ８（化合物Ｐ４及びＰ８、図１０）のいずれかが、ｐＡｃＦの側鎖とペプチド配列のＣ末端とを結合するリンカー部分の一部として組み込まれている。陰性対照として、同じアミノ配列を含むが、「距離不一致」のＳＰ４ベースのリンカー（図９Ａの目標距離１３〜１７Åに対して、１０Å（図１１Ａ））を組み込んだ大員環も調製した。結果として生じるペプチドミメティックは、図１０の化合物Ｐ５及びＰ９に対応する。

【0229】

ｉ／ｉ＋１０（ＣＯ）で連結されたｐ５３大環状ペプチドミティックＰ８を、ｐ５３−ＨＭＤ２及びｐ５３／ＨＤＭＸの相互作用の最も有望な阻害剤であると特定するにあたって（実施例６を参照）、Ｎ末端のアセチル化（Ｐ８→Ｐ１２、図１０）、ペプチド配列の短縮（Ｐ１２→Ｐ１３、図１０）、ｐＡｃＦとメタ−アセチル−フェニルアラニンとの置換（Ｐ１３→Ｐ１４、図１０）、ならびにアミノ酸配列（Ｐ１３→Ｐ１５、図１０）及び大員環形成リンカーの変異（Ｐ１３→Ｐ１７、図１０）によって、この化合物の更なる最適化を追求した。これらの最適化努力の結果、ＨＭＤ２及びＨＤＭＸに対してナノモル阻害活性を有するｐ５３大環状ペプチドミメティック分子（Ｐ１５、図１０）を得た。これは細胞による試験で抗癌活性も示した。

【0230】

本実施例では、本開示の方法をどのように適用すると、目的とする標的αヘリックス状タンパク質結合モチーフ（例えば、ｐ５３トランス活性化ドメイン）である大環状ペプチドミメティック分子の設計、開発及び最適化が可能であるかについても示す。

【0231】

実施例２．アミノ酸類似体の合成。

【0232】

本実施例は、大環状ペプチドミメティック分子の調製に使用する一般式（ＶＩ）のアミノ酸類似体の合成を示す。具体的には、本実施例は、図３及び４に例示されているもののような大環状ペプチドミメティック分子の調製に有用である、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）及びメタ−アセチル−フェニルアラニン（ｍＡｃＦ）などのラセミ体及び／またはエナンチオピュアのアミノ酸類似体を示す。加えて、本実施例は、側鎖アルキニル基（−Ｃ≡ＣＨ、例えばＯｐｇＹ）または側鎖スルフヒドリル基（−ＳＨ、例えばＡｍｍＦ及びＭｅａＦ）を含むアミノ酸類似体などの、他の種類のアミノ酸類似体の合成を示す。これは、本開示の各種実施形態に包含される代わりの種類のリンカーによって拘束される大環状ペプチドミメティック分子の調製に有用であり得る。更に本実施例は、これらの化合物（例えば、図１０の化合物Ｐ１５〜Ｐ１９）の特性を調節するために、大環状ペプチドミメティック分子のペプチド主鎖内に組み込むことができるアミノ酸類似体（例えば、６−クロロ−トリプトファン）の合成を示す。

【0233】

ｐＡｃＦ及びｍＡｃＦラセミ体の合成。ｐＡｃＦ形態の合成を、公開された手順（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）に従って実施した。ｍＡｃＦラセミ体を、３−アセチル−トルエンを出発物質とする以外は同一のプロトコルを使用して調製した。

【0234】

エナンチオピュアなＮ−Ｆｍｏｃ ｐＡｃＦ（及びｍＡｃＦ）の合成。この化合物は、図５Ａに記載されている手順に従って合成した。無水酢酸（４．５２ｍＬ、ｍｍｏｌ、１０当量）を添加した酢酸（２０ｍＬ）に、ラセミ体のｐ−アセチルフェニルアラニン（１ｇ、４．８３ｍｍｏｌ、１当量）を溶解した。反応物質を室温で２時間、撹拌した後、蒸発により溶媒を除去した。１ｍＭのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを含有するｐＨ８．０のリン酸緩衝液（５０ｍＬ）に粗生成物を再溶解させた後、アシラーゼＩ（５００ｍｇ）を添加した。随時ＬｉＯＨを用いてｐＨを８．０に調整しながら、反応物質を３７℃で２４時間、撹拌した。反応混合物を６０℃で５分間加熱して、室温まで冷却し、セライトに通して濾過した。ＨＣｌを使用して濾過液をｐＨ約３まで酸性化した後、ＥｔＯＡｃにて抽出した。水性層を凍結乾燥し、次の反応のための粗生成物（４１０ｍｇのＬ−エナンチオマー、収率約８２％）として使用した。Ｌ−ｐ−アセチル−フェニルアラニン（４１０ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ、１当量）を、ＮａＨＣＯ_３（３３２．６ｍｇ、３．９６ｍｍｏｌ、２当量）を添加した水／アセトン混合液（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解させた。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（７３５．４ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１．１当量）をアセトン中で溶解し、３時間かけて反応混合物に部分添加した。反応が完了した時点で、アセトンを蒸発により除去し、酢酸を用いて水性層をｐＨ約３まで酸性化させた後、ＥｔＯＡｃにより抽出した。有機層を混合して、硫酸ナトリウムに通して乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ及びヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＡｃＯＨ（１０：９：１）の溶媒系を用いて精製し、純粋なＦｍｏｃ−ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（８３２．７ｍｇ、９８％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）， δ２．５７ （ｓ，
３Ｈ）， ３．２２−３．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４５ （ｔ， １Ｈ）， ７．３−７．５５ （ｍ， ８Ｈ）， ７．８８ （ｄ， ２Ｈ）， ７．９８ （ｄ， ２Ｈ）．ＭＳ （ＥＳＩ） Ｃ_２６Ｈ_２３ＮＯ_５［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値： ｍ／ｚ ４２９．１６，実測値 ４２９．４。同一の手順を適用して、Ｆｍｏｃ−ｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを得た。

【0235】

Ｏ−プロパルギル−チロシン（ＯｐｇＹ）の合成。この化合物は、図５Ｂに記載されている手順に従って合成した。無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）を入れた反応フラスコに、Ｌ−Ｎ−Ｂｏｃ−チロシン（６．０ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（９．０ｇ、６３．０ｍｍｏｌ）を添加した。臭化プロパルギル（６．３ｍＬ、６３．０ｍｍｏｌ）を添加し
て、反応混合物を室温で２０時間、撹拌した。得られた二重アルキル化された生成物を、ジエチルエーテル（黄色油、６．８ｇ、９１％）を用いて抽出し、直ちに次の工程に使用した。この中間体（６．８ｇ、１９．０４ｍｍｏｌ）をメタノール（１８０ｍＬ）中の塩化アセチル混合物（２１ｍＬ）に０℃で４時間かけて添加した。次に、得られた中間体（４．９ｇ、１９．０４ｍｍｏｌ）を２ＮのＮａＯＨ（４２ｍＬ）とメタノール（３０ｍＬ）との混合物に添加し、この混合物を室温で撹拌した。ＴＬＣによって加水分解の完了を確認し（２時間）、濃ＨＣｌを用いてｐＨを７．０に調整して、この混合物を４℃で一晩撹拌した。析出沈殿を濾過して、冷水にて洗浄し、減圧下にて一晩乾燥させ、白色粉末として純度９８％のＯｐｇＹ（３．３ｇ、８０％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ２．７８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２２．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．６， ２０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．８１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １２．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ６．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２ Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ３５．４， ５６．０， ７６．６， ７８．７， １１５．６， １２８．５， １３０．６， １５６．１， １７３．９．ＭＳ （ＥＳＩ） Ｃ_１２Ｈ_１３ＮＯ_３ ［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値： ｍ／ｚ ２２０．１；実測値： ２２０．３。

【0236】

２−アミノ−３−（３−アミノ−４−（メルカプトメチル）フェニル）プロパン酸（ＡｍｍＦ）の合成。この化合物は、図５Ｃに記載されている合成スキームに従って合成した。化合物１（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）を出発物質とするこの化合物（２０．３２ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（４００ｍＬ）中に溶解させ、次いで溶液を０℃まで冷却した。ＴＨＦ中（１Ｍ、５２．８ｍＬ、５２．８ｍｍｏｌ、１．１当量）に、ＬｉＡｌＨ_４溶液を徐々に添加した。反応混合物をアルゴン下にて０℃で３時間撹拌し、低温のＨ_２Ｏ（３ｍＬ）及び４ＮのＮａＯＨ水溶液（１ｍＬ）を０℃でゆっくりと添加することにより反応物質をクエンチした後、混合物を室温で１０分間、撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ／飽和ＮａＨＣＯ_３（１０：１、３３０ｍＬ）にて懸濁し、セライトに通して濾過した。濾過液を飽和ＮａＨＣＯ_３で１回、次にブラインで１回洗浄した。無水ＭｇＳＯ_４を用いて有機層を乾燥させ、揮発物を除去し、黄色固体を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、７：３のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製し、黄色油（１８ｇ、９５％収率）としてＮ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−３−アミノ−４−（メルカプトメチル）ベンジルアルコール（２）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ ＭＨｚ）： δ ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｄ， Ｊ＝７．３ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．３４ （ｔ， Ｊ＝７．７ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．２６ （ｔ， Ｊ＝３．０ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．１３ （ｄ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｄ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７３ （ｓ， １Ｈ）， ４．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．１７ （ｓ， ２Ｈ）， １．５４ ｐｐｍ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）：Ｃ_３２Ｈ_３３ＮＯ_３Ｓの計算値： ５３４．６８ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋；実測値： ５３５．６４。２（９．３ｇ、１８．１９ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃まで冷却した。メタンスルホニルクロリド（１．８ｍＬ、２３．６６ｍｍｏｌ、１．３当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；４．２ｍＬ、２３．６６ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、反応混合物をアルゴン下にて０℃で２時間、撹拌した。次に混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解させ、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で２回、ブラインで１回洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、揮発物を除去し、黄色固体である化合物３（９．４２ｇ、８８％収率）を得た。材料を更に精製することなく、次の工程を進めた。^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ ＭＨｚ）： δ ７．８８ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｄ， Ｊ＝７．３ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．３４ （ｔ， Ｊ＝７．７ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．２６ （ｄ， Ｊ＝１４．６ Ｈｚ， ５Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ＝９．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７５ （ｓ， １Ｈ）， ５．１８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ２．９０ （ｓ， ３Ｈ）， １．５４ ｐｐｍ （ｓ， ９Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）：Ｃ_３３Ｈ_３５ＮＯ
_５Ｓ_２の計算値： ６１２．７６ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋；実測値： ６１２．０４。乾燥させるため、アルゴンを充填した丸底フラスコに化合物３（９．４２ｇ）及びジエチルアセトアミドマロネート（４．５２ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。この混合物を１００ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解させた後、０℃まで冷却した。次に、ＮａＨ（６０％鉱油分散物）（０．８４ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、反応混合物をアルゴン下にて０℃で１５時間、撹拌した。完了した時点で、反応物質を１０ｍＬまで濃縮し、３５０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２によって抽出して、フラッシュクロマトグラフィ後に白色固体として化合物５を得た（５．４ｇ、６０％収率）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ＝ ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｄ， Ｊ＝ ８ Ｈｚ， ６Ｈ）， ７．３２ （ｔ， Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ， ６Ｈ）， ７．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．０１ （ｄ， Ｊ＝ ８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６８ （ｓ， １Ｈ）， ６．６３ （ｄ， Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５７ （ｓ， １Ｈ）， ４．２６ （ｑ， Ｊ＝ ７．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．１２ （ｓ， ２Ｈ），
２．０６ （ｓ， ３Ｈ）， １．５２ （ｓ， ９Ｈ）， １．２７ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ ＝
７ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）：Ｃ_４１Ｈ_４６Ｎ_２Ｏ_７Ｓの計算値： ７３３．８９ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋；実測値： ７３３．２２。アルゴン充填した２５０ｍＬの乾燥した丸底フラスコに化合物４（５．４ｇ、７．６ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、７０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させた。この溶液に、トリイソプロピルシラン（３．８８ｍＬ、１９ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し、反応混合物を氷浴にて冷却した。ＴＦＡ（１８ｍＬ）をシリンジによって徐々に添加し、アルゴン下にて０℃で３０分間、反応物質の撹拌を続けた。完了した時点で、ＡｍｍＦをフラッシュクロマトグラフィによって反応混合物から分離した（２．２７ｇ、１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， Ｄ_２Ｏ） δ ７．５４ （ｄ， Ｊ＝ １０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４１−７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３１ （ｔ， Ｊ＝ ５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．３６−３．２７ ｐｐｍ （ｍ， ２Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， Ｄ_２Ｏ） δ＝ １７１．５７， １３５．４６， １３４．４１， １３１．４２， １３０．６０， １２８．７３， １２４．７８， ５４．２９， ３５．０１， ２３．１２ ｐｐｍ； ＭＳ （ＥＳＩ）：Ｃ_１０Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２Ｓの計算値： ２２７．０８ ［Ｍ＋Ｈ］^＋；実測値： ２２６．９８。

【0237】

２−アミノ−３−（３−（（２−メルカプトエチル）アミノ）フェニル）プロパン酸（ＭｅａＦ）の合成。この化合物は、図５Ｄに記載されている合成スキームに従って合成した。中間体７を得るために、ＮａＨ（６０％鉱油分散物）（１．１１ｇ、２７．７ｍｍｏｌ、１．２当量）を、アルゴン充填した乾燥した丸底フラスコに添加し、１５０ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解させた。フラスコを０℃まで冷却し、溶液にジエチルアセトアモミドマロネート（５．５３ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。５分後に、化合物６（５ｇ、２３．１４ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応をアルゴン下にて０℃で１６時間、続行した。抽出後、７を白色固体として得た（８ｇ、９８％収率）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ＝ ８．１２ （ｄ， Ｊ＝ ８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４６， （ｔ， Ｊ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３６ （ｄ， Ｊ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６１ （ｓ， １Ｈ）， ４．２７ （ｑ， Ｊ＝ ８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．４８ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）：Ｃ_１６Ｈ_２０Ｎ_２Ｏ_７の計算値： ３７５．３４ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋；実測値： ３７５．８５。化合物７（５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ、１当量）に、１ｇのＰｄ／Ｃをアルゴン充填したフラスコ及びフラスコ中で添加した。１１５ｍＬの脱気したメタノールを添加して、反応混合物を室温にて３時間、Ｈ_２を用いてスパージングした。抽出後、化合物８をオフホワイト色の固体として得た（４．４５ｇ、９７％収率）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ＝ ８．１２ （ｄ， Ｊ＝８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４５ （ｔ， Ｊ＝７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３６ （ｄ， Ｊ＝７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５５
（ｓ， １Ｈ）， ４．２９ （ｑ， Ｊ＝７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ２Ｈ）， ２．０６ （ｓ， １Ｈ）， １．３２ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ＝７ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）： Ｃ_１６Ｈ_２２Ｎ_２Ｏ_５の計算値： ３４５．３６ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋； 実測値： ３４５．１９。化合物８（４．５ｇ、１４ｍｍｏｌ、１当量）を丸底フラスコに添加して、９０ｍＬのエタノール中に溶解させた。ＮａＣＮＢＨ_３（０．９７ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、溶解性を補助するため混合物を超音波処理した。クロロアセトアルデヒド（２．７ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ、１．１当量）、続いて氷酢酸（０．８１ｍＬ、１４ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応は、アルゴン下にて室温で４時間、続行した。フラッシュクロマトグラフィによる精製後、黄色油として化合物９を得た（３．４６ｇ、９ｍｍｏｌ、６４．２％収率）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ＝ ６．９１ （ｔ， Ｊ＝８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４２ （ｄ， Ｊ＝８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．２１ （ｄ， Ｊ＝７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１９ （ｓ， １Ｈ）， ４．１８ − ４．０６ （ｍ，４Ｈ）， ３．５２ （ｔ， Ｊ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４１ − ３．２９ （ｍ， ４Ｈ）， １．９１ （ｓ， ３Ｈ）， １．１６ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ＝７．２ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）： Ｃ_１８Ｈ_２５ＣｌＮ_２Ｏ_５の計算値： ４０７．８６ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋；実測値： ４０７．３３。化合物９（３．４６ｇ、９ｍｍｏｌ、１当量）を８５ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解させた。これに、トリフェニルメチルメルカプタン（２．７３ｇ、９．９ｍｍｏｌ、１．１当量）、続いて炭酸カリウム（１．５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、５０℃で１２時間、撹拌した。フラッシュクロマトグラフィによりシリカゲル上で粗生成物を精製し、化合物１０を黄色油として得た（３．３８ｇ、５．４ｍｍｏｌ、６０％収率）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ＝ ７．３９ （ｄ， Ｊ＝７．５ Ｈｚ， ６Ｈ）， ７．２６ （ｔ， Ｊ＝７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．２２ （ｄ， Ｊ＝７．１ Ｈｚ， ６Ｈ）， ７．１９ （ｓ， １Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ６．３２ （ｄ， Ｊ＝７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．１３ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｐ， Ｊ＝７．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．５３ （ｓ， ２Ｈ）， ２．９８ （ｔ， Ｊ＝６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４７ （ｔ， Ｊ＝６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９６ （ｓ， ３Ｈ）， １．２７ ｐｐｍ （ｔ， Ｊ＝７．１ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＭＳ （ＥＳＩ）： Ｃ_３７Ｈ_４０Ｎ_２Ｏ_５Ｓの計算値： ６４７．８０ ［Ｍ＋Ｎａ］^＋； 実測値： ６４７．９１。化合物１０（３．３８ｇ、５．４ｍｍｏｌ、１当量）を８ｍＬのＴＦＡにて０℃で２０分間、脱保護した。乾燥した残基を３５ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ水溶液中に溶解させ、還流状態にて一晩加熱した。精製後、ＭｅａＦをモノマー及びダイマーの混合物（薄茶色固体；１．５ｇ、５．４ｍｍｏｌ、９９．９％）として得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， Ｄ_６−ＤＭＳＯ） δ＝ ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ７．４１−７．２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．１６ （ｔ， Ｊ＝ １０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３７ （ｔ， Ｊ＝ ５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１８−３．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｔ， Ｊ＝ １０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ （ｓ， １Ｈ）； ^１３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ） δ＝ １７０．８６， １３８．８７， １３６．７８， １３２．１９， １３２．１３， １２５．２１， １２３．４３， ５５．７１， ５４．７７， ３６．８６， ２０．７２ ｐｐｍ； ＭＳ （ＥＳＩ）： Ｃ_１１Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_２Ｓの計算値： ２４１．３２ ［Ｍ＋Ｈ］^＋； 実測値： ２４１．６１。

【0238】

Ｌ−６−クロロ−トリプトファンの合成。この化合物は、図６に記載されている合成スキームに従って合成した。酢酸（１０ｍＬ）中の６−クロロインドール（５００ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ、１当量）溶液に、Ｌ−セリン（６９５ｍｇ、６．６２ｍｍｏｌ、２当量）及び無水酢酸（３．１ｍＬ、３３．１ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、混合物をアルゴン下にて７３℃で４時間、撹拌した。反応混合物を半量まで濃縮し、水で希釈して、ＥｔＯＡｃを用いて抽出した。有機層を混合して硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて粗生成物Ｎ^α−アセチル−６−クロロ−Ｄ，Ｌ−トリプトファン（６８６ｍｇ、７４％収率）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） δ１．９１ （ｓ， ３Ｈ），
３．１５−３．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｔ， １Ｈ）， ６．９７ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．１０ （ｓ， １Ｈ）， ７．３３ （ｄ， １Ｈ）， ７．５３ （ｄ， １Ｈ）。Ｎ^α−アセチル−６−クロロ−Ｄ，Ｌ−トリプトファン（６８６ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を、１ｍＭのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを含有するｐＨ８．０のリン酸緩衝液（５０ｍＬ）中に溶解させた。反応混合物に、アシラーゼＩ（５００ｍｇ）を添加し、随時ＬｉＯＨを用いてｐＨを８．０に調整しながら、反応物質を３７℃で２４時間、撹拌した。反応混合物を６０℃で５分間加熱して、室温まで冷却し、セライトに通して濾過した。ＨＣｌを使用して濾過液をｐＨ約３まで酸性化して、ＥｔＯＡｃにて抽出した。水性層を凍結乾燥し、次の反応のための粗生成物として使用した。（Ｌ−エナンチオマーに対する理論収率に基づいて）収率を４３％、１２５．４ｍｇと推定した。６−クロロ−Ｌ−トリプトファン（１２５．４ｍｇ、０．５２７ｍｍｏｌ、１当量）を、ＮａＨＣＯ_３（８８．５ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、２当量）を添加した水／アセトン混合液（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解させた。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１９５．６ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．１当量）をアセトン中で溶解し、３時間かけて反応混合物に部分添加した。反応の完了に続いて、アセトンを蒸発させ、酢酸を用いて水性層をｐＨ約３まで酸性化させた後、ＥｔＯＡｃにより抽出した。有機層を混合して、硫酸ナトリウムに通して乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ及びヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＡｃＯＨ（１０：９：１）の溶媒系を用いて精製し、純粋なＦｍｏｃ−６−クロロ−Ｌ−トリプトファン（２３７ｍｇ、９８％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）， δ３．１６−３．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｔ， １Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．１２ （ｓ， １Ｈ）， ７．３−７．５５ （ｍ， ８Ｈ）， ７．７９ （ｄ， ２Ｈ）．
ＭＳ （ＥＳＩ） Ｃ_２６Ｈ_２１ＣｌＮ_２Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値： ｍ／ｚ ４６０．１２，実測値 ４６０．４。

【0239】

実施例３．大員環形成リンカー試薬の合成。

【0240】

本実施例は、本明細書で提示される方法による大環状ペプチドミメティックの調製に有用であり得る種々の大員環形成リンカー試薬の合成を示す。特に、本実施例は、図８に提示されたもののような、オキシアミノ／アミノチオール官能化された大員環形成リンカー試薬の合成について示す。これは図３及び４に記載されている代表的な方法による大環状ペプチドミメティックの調製に有用であり得る。

【0241】

ＳＰ４、ＳＰ５、ＳＰ６及びＳＰ７の合成。これらの化合物を、図７に提示され、（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）に記載されたスキームに従って調製した。

【0242】

ＳＰ８及びＳＰ９の合成。１（図５Ｃ）を出発物質として、この化合物を、対応する遊離カルボン酸誘導体（＝３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（（トリチルチオ）メチル）安息香酸）に加水分解した。０．６７７ｇのこの中間体（１．３１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）中に溶解させ、アルゴン下で溶液にｔｅｒｔ−ブチル−３−アミノプロポキシカルバメート（０．２５ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．７４５ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５５ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加した。フラッシュクロマトグラフィによる抽出及び精製後、ｔｅｒｔ−ブチル（５−（（３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）プロピル）カルバモイル）−２−（（トリチルチオ）メチル）−フェニル）カルバメートを分離した（０．６５８ｇ、７２％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）： δ １．４５ （ｓ， ９ Ｈ）， １．５２ （ｓ， ９ Ｈ）， １．８５−１．９０ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ２ Ｈ）， ３．５６−３．６１ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．９８ （ｔ， ２
Ｈ， Ｊ ＝ ５．６）， ７．１４ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０）， ７．２２−７．２６ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．３０−７．３４ （ｍ， ６ Ｈ）， ７．４８−７．５２ （ｍ， ７ Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １ Ｈ）。この中間体（０．４８ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）
をアルゴン下にて０℃でジクロロメタン（７．５ｍＬ）中に溶解させた。トリイソプロピルシラン（０．３６ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）、続いてＴＦＡ（１．６ｍＬ、滴下）を添加した。反応物質を０℃で３０分間、撹拌した。次に、揮発物を減圧下で除去し、黄色の残留物を高真空下に一晩配置した。氷冷ヘキサンを加えて生成物を粉砕し、減圧下で乾燥させ、ＳＰ８を固体で得た（０．１８ｇ、定量）。^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ｄ_４−ＭｅＯＤ）： δ １．９５−２．０１ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８， ２ Ｈ）， ３．７２ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．１１ （ｔ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．０）， ７．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０， １ Ｈ）， ７．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０， １ Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １ Ｈ）． ^１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ， ｄ４−ＭｅＯＤ）： δ ２９．１４， ３７．３４， ４０．１４， ７４．１６， １１６．３， １１６．６， １１７．８， １２６．５， １３２．７， １３５．９， １７０．５． ＭＳ （ＥＳＩ） Ｃ_１１Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ_２Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚの計算値： ２５６．３４；実測値： ２５５．９２。

【0243】

実施例４．ｐ５３大環状ペプチドミメティックの化学生合成による合成。

【0244】

本実施例は、図４に例示している代表的な方法（実施形態）による、本開示の大環状ペプチドミメティックの調製を示す。

【0245】

大腸菌での生合成前駆体の合成。簡潔には、標的ペプチド配列（ＧＴＳＦＡ（ｐＡｃＦ）ＹＷＮＬＬＡ）及び（Ｇ（ｐＡｃＦ）ＳＦＡＥＹＷＮＬＬＡ）の後ろにＭｘｅ ＧｙｒＡ（Ｎ１９８Ａ）インテイン及びＣ末端Ｈｉｓタグを含むタンパク質前駆体を以下の手順で調製した。最初に、ＧｙｒＡ遺伝子と融合された、これらのペプチド配列をコードする遺伝子（ｐＡｃＦの組み込みには、アンバー終止コドンＴＡＧが使用される）を、ｐＥＴ２２ｂベースのプラスミドｐＭＧ−Ｇ８Ｔ（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）をテンプレートとして、フォワードプライマーのＰＭＩ＿ｆｏｒ１ ５′−ｇｃｇａｔｔｇｇａａｃｃｔｇｃｔｇｇｃｇｔｇｃａｔｃａｃｇｇ−ｇａｇａｔｇｃａｃｔａｇｔ−３′及びＰＭＩ＿ｆｏｒ２ ５′−ｃｔａｇａｃａｔａｔ−ｇｇｇｃｔａｇａｇｃｔｔｃｇｃｇｇａａｔａｔｔｇｇａａｃｃｔｇｃｔｇｇｃｇｔｇｃａｔ−３′、ならびにリバースプライマーのＴ７ターミネーター５′−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣ−３′を使用してＰＣＲにより生成した。得られたＰＣＲ産物（約０．７５Ｋｂｐ）を、Ｎｄｅ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ制限酵素を使用して、ｐＥＴ２２プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、プラスミドｐＰＭＩ−２−ＧｙｒＡ及びｐＰＭＩ−３−ＧｙｒＡを作製した。これらの構造物において、生合成前駆体タンパク質のための遺伝子コード化は、ＩＰＴＧ誘導可能なＴ７プロモーターの制御下にある。ｐＰＭＩ−２−ＧｙｒＡ（またはｐＰＭＩ−３−ＧｙｒＡ）と、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）でアンバー終止コドンを抑制する報告済みのＭｊ ｔＲＮＡ_ＣＵＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対（Ｗａｎｇ，Ｚｈａｎｇら ２００３）をコードするｐＥＶＯＬベースのベクターとをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に共形質転換し、前駆体タンパク質を発現させた。タンパク質の発現は記載（Ｆｒｏｓｔ，Ｖｉｔａｌｉら ２０１３）のように実施された。発現後、上記に記載したようにＮｉアフィニティークロマトグラフィでタンパク質を精製した。単離されたタンパク質の同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＭＳ分析は、精製されたタンパク質において、最初のメチオニンが完全に切断されていることを示した。

【0246】

大環状ペプチドミメティックの合成及び単離。図１０の化合物Ｐ３〜Ｐ９を、前駆体タンパク質ＰＭＩ−２−ＧｙｒＡ（またはＰＭＩ−３−ＧｙｒＡ）と適切な合成前駆体（ＳＰ６、ＳＰ８またはＳＰ４）との間の大規模大環状化反応によって調製した。通常の反応では、タンパク質（２００μＭ、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）中）を１０ｍＭの合成前駆体及び１０ｍＭのＴＣＥＰ（総量：６ｍＬ）
と混合した。３０時間後、反応混合物のｐＨを８．５に調整し、ヨードアセトアミド（１５ｍＭ）と共に１時間培養して遊離チオール基をキャップした。反応物質を４０００ｘｇで２分間、遠心分離し、その後上清（ａ）をペレットから分離した。ペレットを２０％のアセトニトリル／Ｈ_２Ｏ中に再懸濁させ、数分間ボルテックスして大員環生成物を溶解させた後、４０００ｘｇで２分間、遠心分離して上清（ｂ）を得た。上清（ａ及びｂ）を混合して、１０カラムボリューム（ＣＶ）のＭｅＯＨ、１０ＣＶのアセトニトリル及び１０ＣＶの水にて前洗浄した固相抽出Ｃ_１８カラムに加えた。大員環生成物を１０％〜８０％のアセトニトリル水溶液の勾配を利用して溶出した。溶出した大員環を更に、２５℃に維持したＧｒａｃｅＳｍａｒｔ ＲＰ Ｃ１８カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）、流量０．９ｍＬ／分、Ａ：水＋０．１％ＴＥＡ及びＢ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡからなる二成分移動相系、ならびに１０％〜９０％の溶媒Ｂによる直線的濃度勾配（１２分）を用いてＨＰＬＣにより精製した。単離した大員環の同一性をＬＣ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによって確認した。全ての大員環生成物の質量を以下の表に列挙する。

【表4-1】

【0247】

実施例５．ｐ５３大環状ペプチドミメティックの固相合成。

【0248】

本実施例は、図３に例示している代表的な方法（実施形態）による、本開示の大環状ペプチドミメティックの調製を示す。

【0249】

大環状ペプチドミメティックの合成及び単離。図１０のＰ１２〜Ｐ１９の大員環は、最初に安全キャッチ樹脂上での標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によって、対応する非環式前駆体分子をアセンブリし、続いて対応する大員環形成リンカー試薬（すなわちＳＰ８またはＳＰ９、図８）の存在下で、樹脂上または溶液中で環化することにより調製した。簡潔には、ＳＰＰＳ工程の全てのアミノ酸カップリングは、２当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸、カップリング試薬としてＨＢＴＵ及びＨＯＢｔ（それぞれ２当量）、ならびに０．４ＭのＮＭＭ／ＤＭＦを使用して１時間で実施した。アミノ酸類似体（すなわち、Ｎ−Ｆｍｏｃ保護されたｐＡｃＦ、ｍＡｃＦまたは６Ｃｌ−Ｔｒｐ）も全て同様に、同一条件を使用してカップリングした。Ｆｍｏｃ基の除去は、２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して、２０分間で実施した。ペプチドは全て、無水酢酸及びＤＩＰＥＡを使用してＮ末端にアセチル化した。工程は全て、遊離アミン検出のためのＫａｉｓｅｒ標準プロトコルを使用してモニターした。直鎖前駆体分子の形成後、過剰（５０当量）のヨードアセトニトリルを用いて、穏やかに振盪しながら一晩処理することによりスルホンアミドリンカーを活性化した。洗浄時に、適切な大員環形成リンカー試薬（すなわち、ＳＰ８、ＳＰ９またはＳＰ４）単独で、または固体担体からのペプチド切り出し、それに続くＳ−Ｎアシル転位（ＴＨＦ、一晩）を促進するため、ベンジルメルカプタンを添加して樹脂に処理を施した。
反応は、ジスルフィド形成を阻止するためＴＣＥＰの存在下で行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳによってモニターした。環化反応の完了後、ＴＦＡ（ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水＝９５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）を用いた処理をペプチドに施して、保護基の全てを除去し、冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。粗生成物を引き続きヨードアセトアミド（１時間、２０％のＤＭＳＯ／水）で処理して、残留チオール基をアルキル化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び５〜９５％のアセトニトリル水溶液（０．１％のＴＦＡ添加）の勾配を使用して３０分にわたり精製した。精製されたペプチドの同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して確認した（表５）。

【0250】

フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識したペプチドの合成を、Ｎ末端β−Ａｌａがアセチル化の代わりにＮ末端に付加されることを除いて同様に実施した。β−ＡｌａからＦｍｏｃ保護基を除去して、ＤＭＦ中で２当量の過剰のＤＩＰＥＡを使用してＦＩＴＣをカップリングした。ペプチドを更に上記と同様に処理した。精製されたペプチドの同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して確認した（表５）。

【0251】

【表5】

【0252】

実施例６．インビトロ阻害活性。

【0253】

本実施例は、ｐ５３とＨＤＭ２またはＨＤＭＸとの間のタンパク相互作用を阻害する、実施例１に記載したｐ５３大環状ペプチドミメティック分子設計の機能を示す。

【0254】

ｐ５３とＨＤＭ２／Ｘとの相互作用を阻害するＰ１〜Ｐ１９の化合物（図１０）の能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）阻害アッセイを使用して評価した。簡潔には、最初にビオチンをコンジュゲートしたｐ５３_{（１５−２９）}ペプチドをストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーチップに固定し、一定濃度のＨＤＭ２またはＨＤＭＸに、阻害剤の濃度を増加させながら添加した。対応する用量反応曲線（図１２Ａ〜１２Ｂ）から、化合物の最大半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定し、図１０にまとめた。興味深いことに、これらの研究で、Ｐ３及びＰ４はいずれも非環式相対物Ｐ２と比較して、ＨＤＭＸ（Ｐ４）に対して、またはＨＭＤ２及びＨＤＭＸ（Ｐ３）の両方に対して約２分の１のＩＣ_５０を示し、改善された阻害活性を有することが明らかになった。加えて、ＳＰ４をベースとする大員環Ｐ５が非常に弱い阻害（ＩＣ_５０≒１０μＭ）を示したことから、予測されたように合成リンカーの長さと標的の側鎖−Ｃ末端の架橋距離との間の不一致が有害な影響を及ぼすことが示された。

【0255】

ｉ／ｉ＋１０（ＣＯ）で連結された大員環Ｐ７及びＰ８は、Ｐ３及びＰ４と比較して、ＨＭＤ２／Ｘとのｐ５３相互作用を阻害する大幅に改善された能力を示した（図１０）。対応する大員環の結合特性に対する非ペプチド性リンカー型の顕著な効果も明らかだった。特に、ＳＰ４を含むＰ９は、ＨＤＭ２またはＨＤＭＸに対してごくわずかな阻害活性しか所有しないことがわかった（ＩＣ_５０＞５０μＭ）。これにより、「距離不一致」のＳＰ４を介する環化は、組み込みＰＭＩ誘導ペプチド配列による生物活性のαヘリックス状配座との適合を強く妨げることが確認された。顕著な対照として、「距離一致」のＳＰ６の存在下では、非常に高い阻害活性が観察され、両方のタンパク質同族体に対してマイクロモル以下のＩＣ_５０値を有する化合物をもたらした。興味深いことに、Ｐ７のトリアゾール単位をＰ８のアルキル鎖に置き換えるだけで、ＨＤＭ２（ＩＣ_５０：１１０対４７５ｎＭ）及びＨＤＭＸ（ＩＣ_５０：３４０対９１０ｎＭ、図１０）の両方に対する阻害活性が更に有意に（３倍〜４倍）改善された。興味深いことに、リンカーの性質は、２つのタンパク質同族体に対する化合物の選択性にも影響を及ぼすことがわかった。実際、拘束性のないペプチドＰ６は、ＨＤＭＸよりもＨＤＭ２に対して強い選択性を有するが、大環状相対物及び特にＰ７は、むしろ等能性の二重阻害剤として挙動する（ＩＣ_{５０（ＨＤＭＸ）}／ＩＣ_{５０（ＨＤＭ２）}＝５．５対１．９）。

【0256】

最も有望な大員環Ｐ８を出発物質として、大員環に包含されるペプチド配列を更に短縮及び修飾することにより、この化合物のＨＤＭ２／Ｘ阻害活性の更なる最適化を達成した（例えば、Ｐ１５のＩＣ_５０が２分の１に低下、図１０）。代わりのリンカー（例えば、ＳＰ９対ＳＰ８）ならびに側鎖テザリングのための代わりのアミノ酸類似体（例えば、ｍＡｃＦ対ｐＡｃＦ）を有する大員環でも、ＨＤＭ２及びＨＤＭＸに対する強力な阻害剤が得られ（ＩＣ_５０＜２００ｎＭ）、基準となる直鎖ｐ５３誘導ペプチドＰ１と比較して、これらのタンパク質に５倍〜１０倍高い親和性を示した。概してこれらの結果は、標的αヘリックス媒介性のタンパク質−タンパク質相互作用の強力な阻害剤の開発に対する、本明細書に記載する方法の有用性及び多用性を示している。

【0257】

ＨＭＤ２及びＨＭＤＸタンパク質のクローニング、発現及び精製。ヒトＨＤＭ２（残基１〜１０９）及びヒトＨＤＭＸ（残基１〜１０９）のｐ５３結合ドメインをコードする遺伝子を、ｐＥＴ２２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＨＤＭ２遺伝子のＰＣＲ増幅用テンプレートは、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ ＭＤＭ２ ＷＴ（ＡｄｄＧｅｎｅ＃１６２３７）であった（Ｚｈｏｕ，Ｌｉａｏら ２００１）。最終的なプラスミド構造物（ｐＥＴ２２−ＨＤＭ２−ＹＦＰ−Ｈｉｓ及びｐＥＴ２２−ＨＤＭＸ−ＹＦＰ−Ｈ
ｉｓ）では、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）にＨＤＭ２／Ｘタンパク質をＣ末端融合した。ＹＦＰタンパク質との融合は、タンパク質構造物の溶解性及び安定性を改善することがわかった。ＨＤＭ２−ＹＦＰ及びＨＤＭＸ−ＹＦＰ融合タンパクを単離するために、ｐＥＴ２２−ＨＤＭ２−ＹＦＰ−Ｈｉｓ及びｐＥＴ２２−ＨＤＭ２−ＹＦＰ−ＨｉｓプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換させ、続いてアンピシリン（５０ｍｇＬ^−１）を含有するＬＢ培地にプレーティングし、一晩増殖させた。一晩培養物を用いて５００ｍＬのＬＢ培土（５０ｍｇＬ^−１のアンピシリン）に播種し、これをＯＤ_６００値約０．６で０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えて誘導し、２７℃で１６時間培養した。細胞を遠心分離により採取し、音波処理により溶解させた。上清の溶解液をＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム上に充填し、タンパク質を５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）を用いて溶出した。緩衝液をリン酸カリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭの緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した後、タンパク質溶液のアリコートを−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、タンパク質の一次配列に基づいて算出された吸光係数２８０ｎｍ（ε_２８０）を使用して測定した。単離されたタンパク質の同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。

【0258】

阻害アッセイ。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による阻害アッセイを、ＢＩＡｃｏｒｅ
Ｔ１００測定器を使用して実施した。最初に、ストレプトアビジンをコーティングしたバイオセンサーチップ（ＳＡチップ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、約５００ＲＵのビオチン化したｐ５３ペプチド（ビオチン−ＳＧＳＧ−ｐ５３_{１５−２９}）を固定化することにより、ＨＤＭ２／Ｘ結合表面を生成した。ランニングバッファー及びサンプルバッファーは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含む、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含有していた。阻害試験のために、一定濃度（１５０ｎＭ）の精製されたＨＤＭ２−ＹＦＰまたはＨＤＭＸ−ＹＦＰに阻害剤の濃度を増加させながら添加し、その混合物を官能化表面上に注入した。阻害剤の濃度の増加に応じて、ＨＤＭ２（またはＨＤＭＸ）と表面との結合が阻害され、それに伴いバイオセンサーの反応は減少する。阻害剤サンプルを加えたＨＤＭ２／ＨＤＭＸを、２分の解離期間及び１０ｍＭのＨＣｌを使用した１０秒の再生工程ごとに、２分間隔で速度３０ｕＬ／ｍｉｎで注入した。ｐ５３コーティング面での反応から基準面の反応を減算することにより、阻害剤の濃度ごとの特異的な結合曲線を得た。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２．５ソフトウェアを用いてデータを分析し、ある部位の競合的結合についてシグモイドプロットとヒルの式との相関からＩＣ_５０値を導出した。

【0259】

実施例７．ＨＤＭ２結合試験。

【0260】

ＨＤＭ２結合試験。選択された大員環（例えば、Ｐ８）及び基準となる直鎖ｐ５３_{（１５−２９）}ペプチド（Ｐ１）のＨＤＭ２に対する直接結合について、蛍光偏光アッセイを使用して平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。結合試験のために、β−アラニンリンカーを介して大員環またはペプチドのＮ末端にフルオレセインを取り付けることによって（すなわちＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−Ｐ８、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−Ｐ１）、各化合物の蛍光標識誘導体を調製した。このアッセイでは、２５〜２００ｎＭのフルオレセイン標識化合物、及び１０ｎＭ〜２μＭの範囲で濃度変化するＨＤＭ２を試験した。実験は、１％のＤＭＳＯを添加した、最終容量７５μＬのＰＢＳ緩衝液を入れた９６ウェル黒色プレートにて室温で実施した。４７０／５２０ｎｍでの蛍光の励起／放出を検出し、変化するタンパク質濃度に対する蛍光偏光の変化をプロットした。これらの試験は、大環状ペプチドミメティックの多数が強力にＨＤＭ２と結合することを示した。例えば、Ｐ８は６３ｎＭの推定Ｋ_ＤでＨＭＤ２と結合すると判定され、これは直鎖ｐ５３_{（１５−２９）}ペプチドと比較して（Ｋ_Ｄ約５５０ｎＭ）、１桁高い親和性に相当する。

【0261】

実施例８．大環状ペプチドミメティックのαヘリックス。

【0262】

ペプチドの配座特性に対する大環化の影響を検討するために、円二色性（ＣＤ）分析を、代表的な大環状化合物（Ｐ７及びＰ８）に対して、ならびに対照としての直鎖ペプチドＰ６に対して実施した（図１３Ａ）。ペプチドＰ６は、αヘリックス状配座の存在と一致する、２２２ｎｍ及び２０８ｎｍで最低値を示すことを見出した。ペプチドのαヘリックス含有量は約３１％であると推定された。ＳＰ６（Ｐ７）を有するこの配列の環化は、αヘリックス性の増加（４０％）をもたらし、対してＰ８は、組み込みペプチド配列においてαヘリックス含有量のわずかな減少（２１％）を示した。総合すると、これらの試験は、αヘリックス状モチーフに適応する大環状ペプチドミメティックの能力、及び特定の場合においてαヘリックス状モチーフを安定化させる大環状ペプチドミメティックの能力を示している。αヘリックス性とインビトロ阻害活性との間に厳密な相関関係がないことは驚くべきことではない。その理由は、ＨＤＭ２／Ｘ結合分子の結合特性には、リンカー部分とタンパク質表面との潜在的相互作用（Ｂｒｏｗｎ，Ｑｕａｈら ２０１３）を含む、追加の要因が影響し得るためである（Ｂｅｒｎａｌ，Ｗａｄｅら ２０１０、Ｍｕｐｐｉｄｉ，Ｗａｎｇら ２０１１）。

【0263】

円二色性試験。０．１ｃｍ経路長のキュベットを使用したＪＡＳＣＯ Ｊ−７１０ ＣＤ分光偏光計を用いて、室温にてＣＤスペクトルを記録した。精製したペプチドを、４０％トリフルオロエタノールを含有する５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解させ、最終濃度を２０〜５０μＭにした。１９５〜２５０ｎｍの波長範囲で、速度１０ｎｍ／分、応答時間１．０秒、及び解像度０．５ｎｍにて記録された２スキャンのスペクトルを平均した。帯域幅は２．０ｎｍに設定し、分光計の感度は１００ｍｄｅｇに設定した。平均残基楕円率を波長に対してプロットし、各ペプチドのヘリックス含有量を以下の式に基づいて導出した：ｎをペプチド結合数とした場合、［θ］_２２２／［４００００ｘ（ｎ−４）／ｎ］（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＴｉｎｏｃｏ １９７２）。

【0264】

実施例９．大環状ペプチドミメティックのタンパク分解安定性。

【0265】

本明細書に記載する方法によるペプチドベースの分子の大環化から想定される潜在的利点は、タンパク分解安定性の増強である。直鎖ペプチドＰＭＩは、インビトロでは力価が高いにも関わらず、急速なタンパク質分解に部分的に起因し、細胞によるアッセイで効果がないことが実際に見出された（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｌｉｕら ２００９）。ｐ５３大環状ペプチドミメティックのタンパク分解安定性を評価するために、代表的な大員環Ｐ７及びＰ８を、基準となる直鎖ペプチドＰ６と共に、キモトリプシンの存在下で培養した（図１３Ｂ）。Ｐ６は急速なタンパク質分解を受け、元のペプチドはわずか３０分後に検出不能になることがわかった。対照的に、大環状ペプチドＰ７及びＰ８は、プロテアーゼによる最大３及び４時間の培養にも生存し、それぞれ非環式相対物と比較して１０倍〜１５倍長い半減期を示した。これらのデータから、タンパク質分解に対する増加した耐性をこれらの化合物に与える、有益な分子内結合の効果が明示された。ＳＰ６ベースのリンカーがＳＰ８ベースのリンカーと比較して、αヘリックスの安定化とタンパク質分解耐性の両方に関して良好なパフォーマンスをいかに提供するかも言及すべき興味深い点であった。これは、ＳＰ８よりもＳＰ６の配座柔軟性が減少することと関連し得る。

【0266】

タンパク分解耐性の分析。１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０％のＤＭＳＯを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に、各ペプチド（１０μＭ）を溶解させた。キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度１．０μｇ／ｍＬとなるように添加して、室温で培養した。各時点で、混合物の５０μＬアリコートを除去し、ＴＦＡ（５μＬ）を添加してクエンチした後、ＨＰＬＣ分析を行った。完全体のペプチドと比較したピーク面積の減少に基づいて、ペプチドの切断をモニターした。実験は、少なくと
も２回実施した。２５℃に維持したＧｒａｃｅＳｍａｒｔ ＲＰ Ｃ１８カラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）、流量０．９ｍＬ／分、Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ及びＢ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡからなる二成分移動相系、ならびに１０％〜９０％の溶媒Ｂによる直線的濃度勾配（１２分）を用いてＨＰＬＣ分析を実施した。

【0267】

実施例１０．大環状ペプチドミメティックの細胞透過特性。

【0268】

本明細書に記載する方法によるペプチドベースの分子の大環化から想定される別の潜在的利点は、細胞透過性の増強である。この態様を検討するために、代表的なｐ５３大環状ペプチドミメティック（フルオレセインをコンジュゲートしたＰ８）及び対照のフルオレセインをコンジュゲートした直鎖ペプチドＰ１０を、ヒト細胞（ＨＥＫ−２９３）と共に培養し、続いて共焦点蛍光顕微鏡にて分析した。図１４Ａ〜１４Ｂに提示する画像が示すように、直鎖ペプチドは、検出可能なレベルの細胞取り込みを示さなかった。顕著な対照として、大環状化合物Ｐ８で処理した細胞は、細胞内レベルで拡散蛍光を示しており、それによって効率的に細胞をする大環状ペプチドミメティック分子の能力を示した。図１０に記載されている他のｐ５３大環状ペプチドミメティック分子でも同様の結果を得た。

【0269】

細胞透過性アッセイ。大環状ペプチドミメティック及び参照の直鎖ペプチドの細胞透過性特性をＨＥＫ−２９３細胞株を使用して評価した。１０％のウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地で、これらの細胞を培養した。細胞透過性評価のために、２４ウェルの組織培養用処理済みガラス底プレートに細胞を一晩留置した（１×１０４細胞／ウェル）。ＰＢＳ洗浄の後、２０μＭ濃度のフルオレセインをコンジュゲートしたＰ８または対照のフルオレセインをコンジュゲートした直鎖ペプチドＰ１０を含有する還元血清培地（ＤＭＥＭ−ＲＳ）を細胞に添加して、２時間培養した。共焦点撮影の前に、細胞をＰＢＳにて洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定して、核染色ＤＡＰＩで染色した。

【0270】

実施例１１．大環状ペプチドミメティックの抗癌活性。

【0271】

ヒト癌細胞の生存性を低減するｐ５３大環状ペプチドミメティック分子の能力を調査するために、ＨＭＤ２の異常な過剰発現によりｐ５３／ＨＤＭ２／ＨＤＭＸ経路の調節不全を呈する、ＳＪＳＡ−１骨肉腫細胞を使用して更なる活性試験を実施した。図１５に提示された生存率曲線が示すように、ＳＪＳＡ−１細胞の生存性は、基準となる直鎖ペプチドＰ１０による治療時には検出可能な減少を示さなかった。対照的に、ｐ５３大環状ペプチドミメティックＰ８によるこれらの細胞の治療時には、細胞生存性の減少をもたらした。このことは、この化合物のｐ５３依存的なアポトーシス経路の再活性化による癌細胞殺傷能力を示している。図１０に記載されている他のｐ５３大環状ペプチドミメティック分子でも同様の結果が得られ、ＬＤ_５０は低マイクロモルの範囲内であった。ｐ５３−ＨＤＭ２阻害に対する細胞応答性を、ＨＤＭ２の既知の強力な、かつ細胞透過性の小分子阻害剤であるｎｕｔｌｉｎ−３と平行した実験において確認した。

【0272】

細胞生存性アッセイ。１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、培養されたＳＪＳＡ−１細胞を維持した。生存性評価のために、９６ウェルの組織培養用処理済みプレート（２×１０４細胞／ウェル）に細胞を入れ、一晩培養した。ＰＢＳ洗浄後に、様々な濃度のｎｕｔｌｉｎ−３、大環状ペプチドミメティック化合物、または基準となる直鎖ペプチドのうちのいずれかを引き続き添加した。細胞を一晩処理し、標準的なＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイによって生存性を評価した。生存性は未処置の細胞の生存性との比率で表す。

【0273】

上記で開示された、ならびにそれ以外の特徴及び機能の変形またはそれらの代替を多くの他の異なるシステムまたは用途と組み合わせて良いことが理解されよう。現時点で予測または予期されない、本開示に関する種々の代替、改変、変形または改善を後に当業者によって行うことができるが、これらもまた以降の特許請求の範囲に包含されるものとする。

【0274】

本開示の実施形態を具体的に示し、特定の例及び特徴について説明したが、細部に対する種々の変更が、記載された説明及び図面によって立証できる特許請求の範囲によって規定される本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得ることを当業者は理解されよう。更に、一定数の要素に関して例示的実施形態が記載されている場合、一定数未満または一定数超の要素いずれを利用しても例示的実施形態を実施できることが理解されよう。

【0275】

本明細書で引用される全ての参考文献は、個別の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別にその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれた場合と同様に、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0276】

いかなる刊行物の引用も、提出日に先立つその開示のためであり、本発明が先行発明を理由としてこのような刊行物に先行する権利を与えられないことを容認するものとは見なされない。
参考文献
Ｂｅｒｎａｌ，Ｆ．，Ｍ．Ｗａｄｅら（２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８（５）：４１１−４２２．
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｇｒｕｂｂｓ（１９９８）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．版 ３７（２３）：３２８１−３２８４．
Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓ．Ｔ．Ｑｕａｈら（２０１３）．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８（３）：５０６−５１２．
Ｂｒｕｎｅｌ，Ｆ．Ｍ．及びＰ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ（２００５）．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０）：２５５２−２５５４．
Ｄｉａｓ，Ｒ．Ｌ．Ａ．，Ｒ．Ｆａｓａｎら（２００６）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８（８）：２７２６−２７３２．
Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｓ．Ｐ．Ｈａｌｅら，（２００８）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ７（７）：６０８−６２４．
Ｆａｉｒｌｉｅ，Ｄ．Ｐ．，Ｊ．Ｄ．Ａ．Ｔｙｎｄａｌｌら（２０００）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（７）：１２７１−１２８１．
Ｆｒｏｓｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｆ．Ｖｉｔａｌｉら（２０１３）．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ １４（１）：１４７−１６０．
Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｌ．Ｋ．，Ａ．Ｌ．Ｊｏｃｈｉｍら（２００８）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２（６）：６９２−６９７．
Ｈｅｎｃｈｅｙ，Ｌ．Ｋ．，Ｊ．Ｒ．Ｐｏｒｔｅｒら（２０１０）．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ １１（１５）：２１０４−２１０７．
Ｈｕ，Ｂ．，Ｄ．Ｍ．Ｇｉｌｋｅｓら（２００６）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（４４）：３３０３０−３３０３５．
Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇら（１９９１）．Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３（２４）：９３９１−９３９２．
Ｊｏ，Ｈ．，Ｎ．Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら（２０１２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（４２）：１７７０４−１７７１３．
Ｊｏｃｈｉｍ，Ａ．Ｌ．ａｎｄＰ．Ｓ．Ａｒｏｒａ（２００９）．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．５（９）：９２４−９２６．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．及びＩ．Ｔｉｎｏｃｏ，Ｊｒ．（１９７２）．Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４（１２）：４３８９−４３９２．
Ｋａｔｓａｒａ，Ｍ．，Ｔ．Ｔｓｅｌｉｏｓら（２００６）．ＣｕｒｒＭｅｄ Ｃｈｅｍ
１３（１９）：２２２１−２２３２．
Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａ．，Ａ．Ｃｏｌｅｓｋａら（２０１２）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５５（３）：１１３７−１１４６．
Ｋｕｓｓｉｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｓ．Ｇｏｒｉｎａら（１９９６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４（５２８９）：９４８−９５３．
Ｍａｒｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｍ．Ａ．Ｄｙｅｒら（２００７）．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１２０（Ｐｔ３）：３７１−３７８．
Ｍａｒｓａｕｌｔ，Ｅ．ａｎｄＭ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（２０１１）．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（７）：１９６１−２００４．Ｍｕｐｐｉｄｉ，Ａ．，Ｚ．Ｗａｎｇら（２０１１）．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４７（３３）：９３９６−９３９８．
Ｏｂｒｅｃｈｔ，Ｄ．，Ｊ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（２００９）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（１）：４２−６５．
Ｏｓａｐａｙ，Ｇ．及びＪ．Ｗ．Ｔａｙｌｏｒ（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４（１８）：６９６６−６９７３．
Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｍ．，Ｍ．Ｌｉｕら（２００９）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（１２）：４６６５−４６７０．
Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｇ．Ｍ．，Ａ．Ｃｚａｒｎａら（２００８）．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ
７（１５）：２４４１−２４４３．
Ｐｏｐｏｗｉｃｚ，Ｇ．Ｍ．，Ａ．Ｃｚａｒｎａら（２００７）．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ
６（１９）：２３８６−２３９２．
Ｒｅｚａｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｅ．Ｂｏｃｋら（２００６）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８（４３）：１４０７３−１４０８０．
Ｒｅｚａｉ，Ｔ．，Ｂ．Ｙｕら（２００６）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８（８）：２５１０−２５１１．
Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｊ．Ｐｏら（２０００）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（２４）：５８９１−５８９２．
Ｓｃｒｉｍａ，Ｍ．，Ａ．Ｌｅ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ−Ｉｓａａｄら（２０１０）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（３）：４４６−４５７．
Ｓｐｏｋｏｙｎｙ，Ａ．Ｍ．，Ｙ．Ｚｏｕら（２０１３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５（１６）：５９４６−５９４９．
Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｑ．，Ｊ．Ｙｕａｎら（１９９９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（５４３９）：４９８−５０２．
Ｗａｄｅ，Ｍ．，Ｅ．Ｔ．Ｗｏｎｇら（２００６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４４）：３３０３６−３３０４４．
Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＭ．Ｗａｄｅ（２００９）．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７（１）：１−１１．
Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．，Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇら（２００４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８９）：１４６６−１４７０．
Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｗ．Ｌｉａｏら（２００５）．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４４（４０）：６５２５−６５２９．
Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｗ．Ｌｉａｏら（２００５）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ．４４（４０）：６５２５−６５２９．
Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｚ．Ｚｈａｎｇら（２００３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（１）：５６−６１．
Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｚ．，Ｏ．Ｓａｄｏｖｓｋｉら（２００７）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（４６）：１４１５４−１４１５５．
Ｚｈｏｕ，Ｂ．Ｐ．，Ｙ．Ｌｉａｏら（２００１）．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３（１１）：９７３−９８２．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A-5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-9B】

【図10】

【図11A-11C】

【図12A-12B】

【図13A-13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】