特許 6643347 標的遺伝子検出用微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6643347

(24)【登録日】2020年1月8日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】標的遺伝子検出用微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20200130BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20200130BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALI20200130BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20200130BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 AZNA

   C12Q1/6844 Z

   C12Q1/6853 Z

   !C12N15/11 Z

【請求項の数】15

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2017-543687(P2017-543687)

(86)(22)【出願日】2015年10月30日

(65)【公表番号】特表2018-500927(P2018-500927A)

(43)【公表日】2018年1月18日

(86)【国際出願番号】KR2015011605

(87)【国際公開番号】WO2016068663

(87)【国際公開日】20160506

【審査請求日】2017年6月20日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0149495

(32)【優先日】2014年10月30日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514252784

【氏名又は名称】イファ ユニバーシティ−インダストリー コラボレーション ファウンデーション

(73)【特許権者】

【識別番号】517151073

【氏名又は名称】コリア・アドバンスト・インスティチュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100110423

【弁理士】

【氏名又は名称】曾我 道治

(74)【代理人】

【識別番号】100111648

【弁理士】

【氏名又は名称】梶並 順

(74)【代理人】

【識別番号】100122437

【弁理士】

【氏名又は名称】大宅 一宏

(72)【発明者】

【氏名】リー、ヒュクジン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ヘシン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ホヨン

(72)【発明者】

【氏名】ジュン、イル・ヨン

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 Anal. Bioanal. Chem., 2006, 386(7-8), pp.1975-1984

【文献】 Nucleic Acids Res., 2010, 38(15), e156

【文献】 Lab Chip, 2010, 10(10), pp.1262-1266

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｑ １／６８−１／６８９７

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板と、
前記基板上に形成された試料溶液が外部から流入する流入口と、
前記試料流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路と、
前記第１流路と連結された第２流路と、
前記第２流路と連結された排出口と、
前記第２流路上のコーティングと、
前記第２流路のコーティング上に固定されたプライマーと、
前記プライマーに相補的に結合されたテンプレートとを含み、
前記テンプレートは標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含み、
前記標的遺伝子と相補的に結合する結合部位はテンプレートの両末端に分離されて形成され、前記プライマーに相補的に結合する結合部位は分離されて形成された前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成された、標的遺伝子検出用微細流動装置であって、
前記第２流路は２乃至２０個であり、前記第１流路の末端で各々の第２流路が分岐され、
各々の第２流路上に固定されたプライマーに結合された標的遺伝子検出用テンプレートは互いに同一または相異する遺伝子に結合する、標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項2】

前記第２流路は５−ヒドロキシドーパミン塩酸、ノルエピネフリン、エピネフリン、ピロガロールアミン、ＤＯＰＡ（3,4-Dihydroxyphenylalanine）、カテキン、タンニン類、ピロガロール、ピロカテコール、ヘパリン−カテコール、キトサン−カテコール、ポリエチレングリコール−カテコール、ポリエチレンイミン−カテコール、ポリメチルメタクリレート−カテコール、ヒアルロン酸−カテコール、ポリライシン−カテコール（Polylysine-catechol）、及びポリライシン（Polylysine）からなる群から選択された１以上でコーティングされた、請求項１に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項3】

前記プライマーは、チオール（thiol）、アミン（amine）、ヒドロキシル（hydroxyl）、カーボキシル（carboxyl）、イソチオシアネート（isothiocyanate）、ＮＨＳエステル、アルデヒド（aldehyde）、エポキシド（epoxide）、カーボネート（Carbonate）、ＨＯＢｔエステル、グルタルアルデヒド（Glutaraldehyde）、カーバメート（carbamate）、イミダゾールカーバメート（imidazole carbamate）、マレイミド（maleimide）、アジリジン（aziridine）、スルホン（sulfone）、ビニルスルホン（vinylsulfone）、ヒドラジン（hydrazine）、フェニルアザイド（Phenyl azide）、ベンゾフェノン（benzophenone）、アントラキノン（anthraquinone）、及びジエン（Diene）基からなる群から選択された１以上に末端が変形されたものである、請求項１に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項4】

前記コーティングは５−ヒドロキシドーパミン塩酸であり、前記プライマーは末端がチオールまたはアミン基に変形されたものである、請求項１に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項5】

前記標的遺伝子は、大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７（Escherichia coli O157：Ｈ７）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumonia）、サルモネラ（Salmonella）、肝炎ウィルス Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ（Hepatitis A、B、C、DまたはE virus）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、エルシニアエンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）及びエボラウィルス（Ebola virus）、及びメルスコロナウイルス（MERS-Cov virus）からなる群から選択された１以上から由来した標的遺伝子である、請求項１に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項6】

前記テンプレートは、配列番号１乃至４、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１６からなる群から選択された、請求項１に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置。

【請求項7】

請求項１の標的遺伝子検出用微細流動装置と、
ｄＮＴＰと、
リガーゼと、
等温核酸重合酵素と、を含む、標的遺伝子検出用微細流動装置キット。

【請求項8】

前記リガーゼはＤＮＡリガーゼであり、前記等温核酸重合酵素はｐｈｉ２９ポリメラーゼである、請求項７に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置キット。

【請求項9】

染色試薬、高塩溶液（high salt solution）、または蛍光試薬をさらに含む、請求項７に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置キット。

【請求項10】

請求項１の標的遺伝子検出用微細流動装置の前記テンプレートは、配列番号１乃至４、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１６からなる群から選択された、請求項７に記載の標的遺伝子検出用微細流動装置キット。

【請求項11】

標的遺伝子検出用微細流動装置を製造する方法であって、
（Ｓ１）基板、前記基板上に形成された外部から流入する流入口、前記流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路、前記第１流路と連結された第２流路、及び前記第２流路と連結された排出口を含む微細流動装置を提供するステップ、
（Ｓ２）前記微細流動装置の第２流路をコーティングするステップ、
（Ｓ３）前記コーティングされた第２流路上にテンプレートと結合できるプライマーを固定化するステップ、及び
（Ｓ４）標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、及びダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含むテンプレートを前記プライマーに結合させるステップを含み、
前記標的遺伝子と相補的に結合する結合部位はテンプレートの両末端に分離されて形成され、前記プライマーに相補的に結合する結合部位は分離されて形成された前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成される、標的遺伝子検出用微細流動装置を製造する方法であって、
前記第２流路は２乃至２０個であり、前記第１流路の末端で各々の第２流路が分岐され、
各々の第２流路上に固定されたプライマーに結合された標的遺伝子検出用テンプレートは互いに同一または相異する遺伝子に結合する、標的遺伝子検出用微細流動装置を製造する方法。

【請求項12】

請求項１の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法であって、
（Ｓ１）請求項１の標的遺伝子検出用微細流動装置を提供するステップ、
（Ｓ２）第１流路に試料溶液を流入させるステップ、
（Ｓ３）前記標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路にｄＮＴＰ、リガーゼ、及び等温核酸重合酵素を添加するステップ、及び
（Ｓ４）増幅された遺伝子産物が凝集してハイドロゲルが前記第２流路及び前記排出口に形成され、該第２流路及び該排出口を塞ぐステップ、を含む、標的遺伝子を検出する方法。

【請求項13】

前記ハイドロゲルの直径が５０μｍ〜５ｍｍである、請求項１２に記載の標的遺伝子を検出する方法。

【請求項14】

（Ｓ５）染色試薬、高塩溶液（high salt solution）、または蛍光試薬を注入するステップをさらに含む、請求項１２に記載の標的遺伝子を検出する方法。

【請求項15】

請求項１の標的遺伝子検出用微細流動装置の前記テンプレートは、配列番号１乃至４、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１６からなる群から選択された、請求項１２に記載の標的遺伝子を検出する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的遺伝子検出用装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法に関するものである。具体的に、本発明は遺伝子検出を通じての多様な病原菌を検出するための標的遺伝子検出用微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法に関するものである。

【0002】

より詳しくは、本発明は標的遺伝子を増幅させて微細流動装置の流路を選択的に塞ぐことによって標的遺伝子検出が肉眼で識別可能な標的遺伝子検出用微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた標的遺伝子を検出する方法に関するものである。

【0003】

本研究は、大韓民国未来創造科学部の財政支援を受けた韓国研究財団のバイオ医療技術開発事業及び跳躍研究者支援事業、保健福祉部の財政支援を受けた韓国保健産業振興院の保健医療技術研究開発事業の支援を受けて遂行された。

【背景技術】

【0004】

今まで遺伝子を検出する技術はＰＣＲ方法を基礎にする方法が報告されてきた。直接ＰＣＲを用いたＳＤＴ／ＲＴ−ＰＣＲ（simple-direct tube RT-PCR）方法及びＰＣＲ反応を阻害させる要素を除去し、敏感度を高めるために免疫学的方法を結合したＩＣ／ＲＴ−ＰＣＲ（Immunocapture RT-PCR）などが開発されて遺伝子検出に用いられてきた。

【0005】

特に、病原菌感染による疾病に初期対処及び疾病の進行、拡散を防ぐためには、病原菌の感染の有無を迅速で、かつ正確に診断することが必要である。感染後、症状が表れる前である潜伏期の時、病原菌を診断できれば、伝染病の拡散を効果的に予防して大きい被害を止めることができる。

【0006】

現在まで開発された方法は病原菌の診断のための培養と検出に多い時間と人力が消耗され、感染有無判断の正確度が落ちる問題点があるだけでなく、熱循環器（Thermal cycler）装置をはじめとして外部から電源供給が要求される機械または装置を必要とし、同時に多数の病原菌に対する検出が困難であるという問題点がある。

【0007】

ＰＣＲキットを用いた診断方法の場合、熱循環器（Thermal cycler）装置を必須的に必要とするだけでなく、ＰＣＲを行う場合、各々のサイクリング温度、時間、緩衝液の条件などを一致させ難いので、多数の病原菌を一度に検出することが困難であるという問題点がある。

【0008】

ここに、検出費用と時間を低減しながらも簡便で、かつ正確に病原菌などの標的遺伝子を検出することができる方法の開発が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国内公開特許第２０１０−００５３８３１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は外部から電源供給や熱循環器（thermal cycler）装置をはじめとする特別な装置無しで、如何なる環境でも簡便で、かつ正確に標的遺伝子を検出することができる標的遺伝子検出微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記課題を解決するために、本発明は標的遺伝子検出微細流動装置、その製造方法、及びこれを用いた検出方法を提供する。以下、各々の発明に対して詳細に説明する。

【0012】

標的遺伝子検出のための微細流動装置
本発明の一具体例によれば、
基板；
前記基板上に形成された試料溶液が外部から流入する流入口；
前記試料流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路；
前記第１流路と連結された第２流路；
前記第２流路と連結された排出口；
前記第２流路上のコーティング；
前記第２流路のコーティング上に固定されたプライマー；及び
前記プライマーに相補的に結合されたテンプレートを含み、
前記テンプレートは標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含み、
前記標的遺伝子と相補的に結合する結合部位はテンプレートの両末端に分離されて形成され、前記プライマーに相補的に結合する結合部位は分離されて形成された前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成された標的遺伝子検出用微細流動装置を提供する。

【0013】

即ち、言い換えると、本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置は、基板、流入口、第１流路、第２流路と連結された排出口を含む装置である。前記装置の第２流路はコーティングされており、コーティング上にはプライマーが固定されており、前記固定されたプライマーにはテンプレート（標的遺伝子検出用テンプレート）が結合されている。前記テンプレートの線形構造は‘第１標的遺伝子結合部位’−‘（ダンベル形態を形成するための）第１テンプレート内の相補的な結合部位’−‘プライマー結合部’−‘（ダンベル形態を形成するための）第２テンプレート内の相補的な結合部位’−‘第２標的遺伝子結合部位’構造である。即ち、前記装置に固定されたプライマーに、テンプレートのプライマー結合部が結合されており、前記プライマー結合部の１末端には‘第１標的遺伝子結合部位’−‘（ダンベル形態を形成するための）第１テンプレート内の相補的な結合部位’が存在し、他の末端には‘（ダンベル形態を形成するための）第２テンプレート内の相補的な結合部位’−‘第２標的遺伝子結合部位’が存在する構造である。

【0014】

試料内に標的遺伝子が存在する場合、標的遺伝子はテンプレートの第１標的遺伝子結合部位と第２標的遺伝子結合部位に同時に結合する。すると、第１テンプレート内の相補的な結合部位と第２テンプレート内の相補的な結合部位が互いに近くなって相補的な結合を形成するようになる。したがって、テンプレートが図２Ｂで観察されるような、第１標的遺伝子結合部位と第２標的遺伝子結合部位との間にネッキ（nick）が存在するダンベル（dumbbell）形態になるものである。

【0015】

即ち、本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置は、
基板；
前記基板上に形成された、試料溶液が外部から流入する流入口；
前記試料流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路；
前記第１流路と連結された第２流路；
前記第２流路と連結された排出口を含む標的遺伝子検出用微細流動装置であって、
前記第２流路の表面はコーティングされており；
前記コーティング上にプライマーが固定され；
前記固定されたプライマーには標的遺伝子検出用テンプレートが結合されており、
前記標的遺伝子検出用テンプレートは、前記プライマーに相補的に結合するプライマー結合部、前記プライマー結合部の一末端に結合された第１テンプレート内の相補的な結合部位−第１標的遺伝子結合部位、及び前記プライマー結合部の他の末端に結合された第２テンプレート内の相補的な結合部位−第２標的遺伝子結合部位を含む、標的遺伝子検出用微細流動装置である。

【0016】

本発明の一具体例によれば、前記第２流路は第１流路と連結されて２つ以上、好ましくは２つ乃至２０個に分岐される形状を有することができる。前記第２流路の分岐は検出対象である標的遺伝子に対するテンプレートの数によって変わることができる。例えば、標的遺伝子テンプレートが２であれば、これに対応して第２流路の分岐の数が２または標的遺伝子テンプレート及び対照群を含んで３でありうる。例えば、標的遺伝子テンプレートが１であれば、これに対応して第２流路の分岐の数が１または標的遺伝子テンプレート及び対照群を含んで２でありうる。

【0017】

前記試料排出口は第２流路の分岐数と同一でありうる。例えば、前記試料排出口は第２流路の分岐数のように２つ以上、好ましくは２つ乃至２０個でありうる。

【0018】

本発明の一具体例によれば、第２流路上にプライマーの固定を容易にするために、第２流路はプライマーと互いに結合できる官能基を有するようにコーティングできる。前記プライマーやはり第２流路上の官能基と結合できる官能基を有するように変形できる。

【0019】

本発明の一具体例によれば、本発明の微細流動装置の第２流路はピロガロールアミン（Pyrogallol amine）、例えば５−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（5-hydroxydopamine HCl）によりコーティングできる。

【0020】

１つの前記プライマーの末端は多様な官能基を有するように変形できるが、例えば、チオール（thiol）、アミン（amine）、ヒドロキシル（hydroxyl）、カーボキシル（carboxyl）、イソチオシアネート（isothiocyanate）、ＮＨＳエステル、アルデヒド（aldehyde）、エポキシド（epoxide）、カーボネート（Carbonate）、ＨＯＢｔエステル、グルタルアルデヒド（Glutaraldehyde）、カーバメート（carbamate）、イミダゾールカーバメート（imidazole carbamate）、マレイミド（maleimide）、アジリジン（aziridine）、スルホン（sulfone）、ビニルスルホン（vinylsulfone）、ヒドラジン（hydrazine）、フェニルアザイド（Phenyl azide）、ベンゾフェノン（benzophenone）、アントラキノン（anthraquinone）、及びジエン（Diene）基からなる群から選択された１以上に末端が変形できる。

【0021】

本発明の一具現例として、前記第２流路のコーティングが５−ヒドロキシドーパミン塩酸であり、前記プライマーは末端がチオールまたはアミン基に変形されたものでありうる。

【0022】

本発明の一具体例によれば、前記テンプレートは標的遺伝子、例えば、病原菌遺伝子の長さ、プライマーの長さなどを考慮して、多様に長さと配列をデザインすることができる。本発明の一具体例によれば、前記テンプレートの長さは４０乃至１６０ｍｅｒでありうる。本発明で、前記テンプレートの長さがあまり短ければ不安定で、あまり長ければＲＣＡ効率が減少することがある。

【0023】

本発明の一具体例によれば、前記テンプレートは病原菌遺伝子と相補的に結合する結合部位（complementary to pathogen）がテンプレートの両末端に分離されて形成され、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位（complementary region to make dumbbell shape）が前記両末端の病原菌遺伝子と相補的結合する結合部位に隣接して分離されて形成され、プライマーに相補的に結合する結合部位（Primer binding region）は前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成される（図２のＡ参照）。

【0024】

本発明の一具体例によれば、テンプレートは１０乃至４０ｍｅｒ長さの標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、１０乃至４０ｍｅｒ長さのプライマーに相補的に結合する結合部位、２０乃至８０ｍｅｒ長さのダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含む総４０乃至１６０ｍｅｒ長さのテンプレートでありうる。

【0025】

本発明の一具体例によれば、標的遺伝子検出用微細流動装置に注入される試料溶液は血液、唾液、小便などの生体試料、食物、または水供給源であって、水質汚染、土壌汚染などを分析するための水や土壌試料など、多様な試料溶液になることができる。

【0026】

また、多様な試料溶液から核酸成分のみを抽出した溶液を標的遺伝子検出用微細流動装置に注入することもできる。この際、抽出は特定の方法に限定されず、フェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、抽出はプロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼ Ｋ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、アルカリ−ＳＤＳ法、または溶菌酵素法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（QIAGEN社、ドイツ）などを用いることも可能である。例えば、フェノール、フェノール／クロロホルム混合物を用いることができる。

【0027】

本発明で標的遺伝子、例えば核酸配列または分子は単一または二重鎖であって、センスまたはアンチセンス鎖を示すことができるＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。したがって、核酸配列はｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、混合ｓｓＤＮＡ、混合ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ（例えば、融解、変性、ヘリカーゼなどにより）で作られたｄｓＤＮＡ、Ａ−、Ｂ−、またはＺ−ＤＮＡ、三重−鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、混ざったｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ（例えば、融解、変性、ヘリカーゼなどを通じて）で作られたｄｓＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、伝達ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、または蛋白質核酸（ＰＮＡ）でありうる。

【0028】

本発明は使われた標的遺伝子、例えば、核酸（例えば、配列または分子（例えば、標的配列及び／又はオリゴヌクレオチド））の類型または供給源により制限されない。核酸配列と関連して使われる時、本明細書で異に表現されない限り、用語 “ヌクレオチド”及び“塩基”は互換的に使われる。

【0029】

また、本発明は前記標的遺伝子検出用微細流動装置；
ｄＮＴＰ；
リガーゼ；
及び等温核酸重合酵素を含む、標的遺伝子検出用微細流動装置キットを提供する。

【0030】

前記キットにおいて、ｄＮＴＰ、リガーゼ、及び等温核酸重合酵素は、遺伝子産物（核酸）を増幅させるための増幅用組成物に含まれることができる。前記増幅用組成物は核酸を増幅するために必要な成分を全て含む混合物を意味し、核酸重合酵素（ポリメラーゼ）、その活性または反応に必要な緩衝液、４種類のｄＮＴＰ、補助因子、及び／又は基質をさらに含むことができる。前記核酸重合酵素は、ＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ重合酵素、逆転写酵素（reverse transcriptase）、及びこれらの組み合せでありうる。

【0031】

本発明の一具体例によれば、前記増幅用組成物はＤＮＡ重合酵素、反応緩衝溶液、ｄＮＴＰｓを含む核酸増幅用組成物を提供する。

【0032】

本発明の一具体例によれば、前記ＤＮＡ重合酵素は、大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉ、クレノウ断片、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ重合酵素、ｖｅｎｔ ＤＮＡ重合酵素、Ｔ４、Ｔ７ ＤＮＡ重合酵素、及びＴａｑ重合酵素からなる群から選択されるものでありうる。

【0033】

本発明の一具体例によれば、前記緩衝溶液（バッファ）はＮＥＢ（New England Biolab）緩衝溶液系列、例えば、ＮＥＢ緩衝溶液４、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ重合酵素緩衝溶液、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝溶液、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ緩衝溶液などが使用できるが、これに制限されるものではない。

【0034】

本発明の一具体例によれば、標的遺伝子検出用微細流動装置は、微細流動装置により検出される増幅された遺伝子産物のハイドロゲルの形成または濁度の変化を検出させることができる検出用組成物をさらに含むことができる。

【0035】

また、前記検出用組成物は増幅された遺伝子産物の肉眼識別を助けるための染色試薬として色を帯びる染色試薬であって、例えばゲルレッド（Gel-red）、ストレプタアビジンビード（Streptavidin bead）、トリパンブルーダイ（trypane blue dye）、エバンスブルーダイ（Evans Blue dye）、ヘマトキシリン−エオシン染色（hematoxylin-eosin stain）、クリスタルバイオレット（crystal violet）、またはメチレンブルー（methylene blue）を含むが、これに制限されるものではない。

【0036】

また、前記検出用組成物は増幅された遺伝子産物の凝集を増大させて濁度変化または沈殿を起こして肉眼識別を助けるためのものであって、高塩溶液（high salt solution）でありうる。前記高塩溶液は、無機塩容液、例えば、塩化マグネシウム （ＭｇＣｌ_２）水溶液、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）水溶液、アセト酸アンモニウム水溶液（ＮＨ_４ＯＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）水溶液、または中性アミノ酸溶液を含有する水溶液でありうるが、これに制限されるものではない。

【0037】

また、前記検出用組成物は蛍光試薬でありうる。

【0038】

本発明の一具体例によれば、前記装置の第２流路の直径は増幅された遺伝子産物（塊り）が凝集して塞ぐことができる大きさでありうる。一具体例 で、前記第２流路の直径は１μｍ〜５ｍｍの大きさで、他の一具体例で、前記第２流路の直径は５０μｍ〜５ｍｍの大きさでありうる。また、一具体例で第２流路の直径は０．２５ ｍｍ〜２ｍｍの大きさで、他の一具体例で０．５ｍｍ〜１．５ｍｍの大きさでありうる。

【0039】

本発明の一具体例によれば、前記増幅された遺伝子産物（塊り）は直径が約０．５μｍ〜約５０μｍの大きさを有することができる。また、本発明の一具体例で、前記増幅された遺伝子産物（塊り）は互いに凝集してハイドロゲルを形成して直径が約５０μｍ〜５ｍｍの大きさを有することができる。本発明の他の一具体例で、前記 増幅された遺伝子は互いに凝集して直径が約０．２５ｍｍ〜２ｍｍの大きさでありうる。

【0040】

本発明の一具体例によれば、本発明の微細流動装置の第２流路の表面は、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane）、金（Ａｕ）、金属酸化物（metal oxide）（ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、酸化インジウム−スズ（Indium-Tin Oxide））、セラミック（ceramic）、合成ポリマー（synthetic polymer）（ポリカーボネート、ポリウレタン、環状オレフィン共重合体（cyclic olefin copolymer）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリエチレン）のうち、いずれか１つからなることができる。

【0041】

本発明の一具体例によれば、前記コーティング物質はヒドロキシベンゼン類の単分子または高分子コーティングを含むことができる。また前記コーティング物質は、一例に、カテコールアミン高分子コーティングを含むことができる。ヒドロキシベンゼン類の単分子または高分子は優れる表面特性によって貴金属、金属酸化物、セラミック、及び合成高分子を含んだ広範囲な素材に容易にコーティングできる。前記ヒドロキシベンゼン類の単分子及び高分子の具体的な例は、非制限的にドーパミン（dopamine）、５−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（5-hydroxydopamine HCl）、ノ ルエピネフリン（norepinephrine）、エピネフリン（epinephrine）、ピロガロールアミン（Pyrogallol amine）、ＤＯＰＡ（3,4-Dihydroxyphenylalanine）、カテキン（catechin）、タンニン類（tannins）、ピロガロール（Pyrogallol）、ピロカテコール（Pyrocatechol）、ヘパリン−カテコール（heparin-catechol）、キトサン−カテコール（chitosan-catechol）、ポリエチレングリコール−カテコール（Poly（ethylene glycol）-catechol）、ポリエチレンイミン−カテコール（Poly（ethyleneimine）-catechol）、ポリメチルメタクリレート−カテコール（Poly（methyl methacrylate）-catechol）、ヒアルロン酸−カテコール（hyaluronic acid-catechol）などになることができる。

【0042】

また、前記コーティング物質はビニル基（vinyl group）になることができる。

【0043】

コーティング方法には制限がない。例えば、コーティング用組成物を製造し、これを第２流路に詰めることによって、第２流路の表面がコーティングされるようにすることができる。更に他の例として、ビニル基コーティングを蒸気蒸着方式により 第２流路にコーティングされるようにすることができる。

【0044】

本発明の一具体例によれば、本発明の微細流動装置は肉眼で標的遺伝子の増幅された遺伝子産物の識別が可能でありうる。本発明の一具体例で、前記検出は増幅された遺伝子産物が互いに凝集してハイドロゲルを形成するか、または濁度が変わる点から肉眼で識別可能でありうる。

【0045】

本発明の一具体例によれば、検出しようとする標的遺伝子は、動物、植物、細菌、ウイルス、または真菌から得られる。好ましくは、細菌、ウイルス、または真菌など、病原菌から得られる。

【0046】

本発明の一具体例によれば、前記検出しようとする標的遺伝子は病原菌遺伝子でありうる。前記標的遺伝子には、核酸配列を知る全ての病原菌を対象にすることができる。本発明の一具体例によれば、前記病原菌は鳥類毒感、サース（ＳＡＲＳ）、溶血性尿毒症候群（hemolytic uremic syndrome）、及び血便（bloddy diarrhea）（Escherichia coli O157:Ｈ７）、結核（Mycobacterium tuberculosis）、炭疽病（Bacillus anthracis）、肺炎（Streptococcus pneumonia）、マラリア（Plasmodium）、サルモネラ（Salmonella）、肝炎（Hepatitis A、B、C、D 及びE virus）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、エルシニアエンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）及び出血熱（Ebola virus）、メルスコロナウイルス（MERS-Cov virus）の検出に有用である。また、本発明の一具体例によれば、 前記病原菌は肺炎状球菌、腸内球菌、葡萄状球菌、熱帶熱原虫及び第３世界での結核またはマラリアバクテリアのような抗生剤抵抗を有する病原菌の検出にも有用である。

【0047】

以下の＜表１＞は、前記本発明の一具体例に従う検出可能な標的遺伝子、例えば、病原菌の種類、配列、及びこれと相補的に結合できる結合部位を含むテンプレートの配列を例示的に示す。（濃い字：標的病原菌遺伝子と相補的に結合する部分、イタリック体：テンプレート内の相補的な部分、イタリック体にアンダーライン：プライマーと相補的に結合する部分）

【0048】

【表1】

【0049】

この場合、プライマーにはテンプレート配列に相補的に結合できる形態に5’-Thiol-AAA AAA AAA GGG ACG TCG ATA CTA GCA TGC TA3’（配列番号９）を使用することができる。

【0050】

以下の＜表２＞は本発明の前記本発明の実施例３に従う検出可能な標的遺伝子、例えば、病原菌の種類、配列、及びこれと相補的に結合できる結合部位を含むテンプレートの配列を例示的に示す。

【0051】

【表2】

【0052】

以下の＜表３＞は本発明の前記本発明の実験例５に従う検出可能なメルスコロナウイルスの標的遺伝子配列及びこれと相補的に結合できる結合部位を含むテンプレートの配列を示す。

【0053】

【表3】

【0054】

本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて検出できる病原菌の種類は、前述したものに制限されるものではない。公知の病原菌の遺伝子から任意の遺伝子 配列（Pathogen sequence）を選択し、前記病原菌の遺伝子配列にネッキ（nick）を挟んで結合できる配列を２つ準備して、各々テンプレートの標的遺伝子結合部位配列（第１標的遺伝子結合部位、及び第２標的遺伝子結合部位）とすることができる。このような方法によりテンプレートの標的遺伝子結合部位配列のみを取り替えて非常に多様な病原菌の遺伝子を検出することができる標的遺伝子微細流動装置を製造することができる。

【0055】

本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置は肉眼でも病原菌の存在を十分に識別することができるが、使用目的によって本発明が属する技術分野の当業者は本発明の必須的特徴を変更せず、多様な具体的な形態に実施することができる。このような例に、当業者は使用目的によって本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置の検出敏感度を増加させるために、追加で、電極間の電流、電圧、電位差、抵抗変化などを測定する電気化学センサー、紫外線、可視光、蛍光、赤外線、ラマンなどの多様な光源を用いる光学センサー、金属、セラミック、高分子などの素材を活用したナノセンサー、または酵素、抗原、抗体などの生体感知物質を用いたバイオセンサーを含んで実施することもできる。

【0056】

微細流動装置を製造する方法
本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置を製造する方法は、次のステップを含むことができる：
（Ｓ１）基板、前記基板上に形成された外部から流入する流入口、前記流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路、前記第１流路と連結された第２流路、前記第２流路と連結された排出口を含む微細流動装置を提供するステップ；
（Ｓ２）前記微細流動装置の第２流路をコーティングするステップ；
（Ｓ３）前記コーティングされた第２流路上にテンプレートと結合できるプライマーを固定化するステップ；及び
（Ｓ４）標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含むテンプレートを前記プライマーに結合させるステップ、
ここで、前記標的遺伝子と相補的に結合する結合部位は、テンプレートの両末端に分離されて形成され、前記プライマーに相補的に結合する結合部位は分離されて形成された前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成される。

【0057】

本発明の一具体例によれば、本発明の微細流動装置の第２流路の表面はポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane）、金（Ａｕ）、金属酸化物（metal oxide）（ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、酸化インジウム−スズ（Indium-Tin Oxide））、セラミック（ceramic）、合成ポリマー（synthetic polymer）（ポリカーボネート、ポリウレタン、環状オレフィン共重合体（cyclic olefin copolymer）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリエチレン）のうち、いずれか１つからなることができる。

【0058】

本発明の一具体例によれば、前記（Ｓ２）前記微細流動装置の第２流路をコーティングするステップで第２流路をコーティングする物質は水液滴の移動を助けるために親水性物質でコーティングされることができ、第２流路上にプライマーを固定することができる官能基を有する多様な物質でありうる。本発明の一具体例に よれば、第２流路上にプライマーの固定を容易にするために第２流路はプライマーと互いに結合できる官能基を有するようにコーティングできる。前記プライマーやはり第２流路上の官能基と結合できる官能基を有するように変形できる。

【0059】

本発明の一具体例によれば、前記第２流路をコーティングする物質は、ヒドロキシベンゼン類の単分子または高分子コーティングを含むことができる。また、前記コーティング物質は、一例に、カテコールアミン高分子コーティングを含むことができる。ヒドロキシベンゼン類の単分子または高分子は優れる表面特性によって貴金属、金属酸化物、セラミック、及び合成高分子を含んだ広範囲な素材に容易にコーティングできる。前記ヒドロキシベンゼン類の単分子及び高分子の具体的な例は、非制限的にドーパミン（dopamine）、５−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（5-hydroxydopamine HCl）、ノルエピネフリン（norepinephrine）、エピネフ リン（epinephrine）、ピロガロールアミン（Pyrogallol amine）、ＤＯＰＡ（3,4-Dihydroxyphenylalanine）、カテキン（catechin）、タンニン類（tannins）、ピロガロール（Pyrogallol）、ピロカテコール（Pyrocatechol）、ヘパリン−カテコール（heparin-catechol）、キトサン−カテコール（chitosan-catechol）、ポリエチレングリコール−カテコール（Poly（ethylene glycol）-catechol）、ポリエチレンイミン−カテコール（Poly（ethyleneimine）-catechol）、ポリメチルメタクリレート−カテコール（Poly（methyl methacrylate）-catechol）、ヒアルロン酸−カテコール（hyaluronic acid-catechol）などになることができる。または、ビニル基やはりコーティング のために使用できる。

【0060】

本発明の一具体例によれば、本発明の微細流動装置の第２流路はピロガロールアミン（Pyrogallol amine）、例えば５−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（5-hydroxydopamine HCl）によりコーティングできる。

【0061】

微細流動装置を用いた病原菌遺伝子検出のための検出方法
本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法は、次のステップを含むことができる：
（Ｓ１）標的遺伝子検出用微細流動装置を提供するステップ；
（Ｓ２）第１流路に試料溶液を流入させるステップ；及び
（Ｓ３）前記標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路にｄＮＴＰ、リガーゼ、及び等温核酸重合酵素を添加するステップ。

【0062】

本発明の一具体例によれば、前記方法は、（Ｓ４）増幅された遺伝子産物が凝集して直径５０μｍ〜５ｍｍの大きさを有するハイドロゲルが第２流路及び排出口に形成されるステップをさらに含むことができる。

【0063】

本発明の一具体例によれば、前記テンプレートは病原菌遺伝子の長さ、プライマーの長さなどを考慮して多様に長さと配列をデザインすることができる。本発明の一具体例によれば、前記テンプレートの長さは４０乃至１６０ｍｅｒでありうる。本発明で、前記テンプレートの長さがあまり短ければ不安定で、あまり長ければＲＣＡ効率が減少することがある。

【0064】

本発明で、プライマーは第２流路上にテンプレートを固定するプライマーであって、意味と遺伝子を増幅させるための開始物質としてプライマーを全て意味する。

【0065】

本発明の一具体例によれば、前記標的遺伝子検出用微細流動装置のテンプレートがダンベル型（dumbbell shape）を形成することができる。

【0066】

本発明の一具体例によれば、前記（Ｓ３）ステップで、ｄＮＴＰ、リガーゼ、及び等温核酸重合酵素を添加すれば、試料溶液内に標的遺伝子が存在する場合、回転環増幅が起こる。即ち、テンプレートに標的遺伝子と相補的に結合する結合部位に標的遺伝子が結合すれば、テンプレートがダンベル形態を形成し、等温核酸重合酵素（Polymerase）による増幅が起こることができる。前記ＲＣＡ方法は室温、例えば、１５℃〜３５℃、好ましくは、２５℃〜３５℃の温度で増幅されることができ、一具体例で３０℃で起こることができる。

【0067】

本発明の一具体例によれば、前記回転環増幅により増幅された産物は、３個の脚を有する丸い形態の凝集した単一鎖のＲＣＡ産物を作ることができる。

【0068】

本発明の一具体例によれば、前記増幅された遺伝子は凝集した単一鎖の遺伝子産物を形成することができる。図２を参照すると、増幅された標的遺伝 子産物はフック（hook）形態の丸い部分と一定の長さを有するベルクロ（velcro）が連続した形態の凝集した単一鎖を形成することができる。前記一定の長さは０．５μｍ〜５０μｍ大きさでありうる。前記全体的に増幅された標的遺伝子産物は丸い円形と一定の長さを有する脚を有する三脚形態でありうる。

【0069】

また、本発明の一具体例によれば、前記凝集した単一鎖の産物はハイドロゲルを形成することができる。

【0070】

また、前記ＲＣＡ方法による増幅及びハイドロゲル形成の反応は３時間以上で起こることができ、一具体例で反応時間は３時間でありうる。

【0071】

本発明の他の具体例によれば、前記方法は、（Ｓ５）染色試薬、高塩溶液（high salt solution）、または蛍光試薬を注入するステップをさらに含むことができる。

【0072】

本発明の一具体例によれば、前記染色試薬、高塩溶液、または蛍光試薬は検出をより容易にする作用をし、ゲルレッド（Gel-red）、ストレプタアビジンビード（Streptavidin bead）、トリパンブルーダイ（trypane blue dye）、エバンスブルーダイ（Evans Blue dye）、ヘマトキシリン−エオシン染色（hematoxylin-eosin stain）、クリスタルバイオレット（crystal violet）、メチレンブルー（methylene blue）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）水溶液、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）水溶液、アセト酸アンモニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）水溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）水溶液、または中性アミノ酸溶液のうち、いずれか１つでありうる。例えば、染色試薬であるゲルレッド（Gel Red）またはビオチンと強く結合するストレプタアビジンビード（Streptavidin bead）でありうる。また、前記検出用組成物はＭｇＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌのような高塩溶液 （high salt solution）でありうる。

【0073】

本発明の一具体例によれば、前記試料流入口に検出対象である試料溶液がローディングされて、これは第１流路及び第２流路を通じて流れることができる。

【発明の効果】

【0074】

本発明は外部から光源、電気エネルギーなどに影響を受けず、室温で特別な装置無しで単一標的遺伝子、例えば単一病原菌または同時に多数の標的遺伝子、例えば多数の病原菌を簡便に検出することができる。

【0075】

したがって、本発明は病原菌検出のための装置の製造にかかる時間、費用が経済的で、携帯が可能で、高価の検出装備無しでも迅速な診断が可能である。

【0076】

したがって、本発明は第３世界で結核またはマラリアなどの病原菌の診断、または世界を威嚇する多様な伝染性疾病（例えば、エボラウイルス、メルスウイルス）の診断だけでなく、生物学武器テロ及び環境汚染と関連した病原菌に対しても迅速で、かつ簡便な検出が可能であるので、現業で利用可能性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置の平面図（左）及び斜視図（右）である。

【図2】本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは各々前記方法の各ステップを意味する。

【図3】本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置の製造方法及びこれを用いて標的遺伝子を検出する方法を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆは各々前記方法の各ステップを意味する。

【図4】炭疽菌（Bacillus anthracis）に対するテンプレート（Template_B_A）によるチューブ内でのライゲーションを確認した電気泳動結果を示す。

【図5】実験例２の（１）で炭疽菌（Bacillus anthracis）に対するテンプレート（Template_B_A）によるチューブ（tube）内でのＲＣＡ産物（Product）を確認したＳＥＭ写真である。

【図6】実験例２の（２）でエボラウイルスに対するテンプレート（Template_E）によるチューブ内でのＲＣＡ産物を確認したＳＥＭ写真である。

【図7a】図７ａはエボラウイルスに対するテンプレート（Template_E）によるハイドロゲル形成を確認したチューブ内での結果である。

【図7b】図７ｂは回転粘度計で測定した粘度に対するグラフを示す。

【図8a】図８ａは微細流動装置の第２流路をコーティングせず、プライマーを固定させた場合の回転環増幅結果のＡＦＭイメージである。

【図8b】図８ｂは５−ヒドロキシドーパミン塩酸で第２流路をコーティングし、プライマーを固定させた後、確認した回転環増幅結果のＡＦＭイメージを示す。

【図9a】図９ａは本発明の微細流動装置を用いたBacillus anthracis検出結果を示す写真である。

【図9b】図９ｂはこれをImager（Gel DocTM EZ（Bio- rad））で確認した結果を示す写真である。

【図10a】図１０ａは本発明の微細流動装置を用いたBacillus anthracis及びEbola virusの同時検出結果を示す写真である。

【図10b】図１０ｂはこれを Imager（Gel DocTM EZ（Bio-rad））で確認した結果を示す写真である。

【図11】本発明の微細流動装置を用いたBacillus anthracis及びEbola virusのstreptavidinを用いた検出結果を示す。

【図12】本発明の微細流動装置のプライマーに結合されたテンプレートでネッキ（nick）のライゲーション及びＲＣＡが起こる過程を具体的に示す模式図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）は各々前記方法の各ステップを意味する。

【図13】実験例５のように第２流路が３個（陰性対照群、試料群、及び陽性対照群）になるように製作した本発明の微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法を示す模式図である。

【図14】標的メルス遺伝子検出用微細流動装置を用いてメルスウイルスを検出した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0078】

以下、本発明の理解を助けるために図面を参照して実施例に対して詳細に説明する。但し、以下の実施例は本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が以下の実施例に限定されるものではなく、他の形態に具体化されることもできる。また、図面において、構成要素の幅、長さ、厚さなどは便宜をために誇張して表現されることもある。明細書の全体に亘って同一な参照番号は同一な構成要素を示す。また、一構成要素が他の構成要素の上にあるとする時、これは他の構成要素の真上にある場合だけでなく、その中間に更に他の構成要素がある場合も含む。

【実施例】

【0079】

＜製造例１＞テンプレート製造
（１）Template_BAの製造
Bacillus anthracisの病原菌遺伝子配列に基づいてBacillus anthracisに特異 的なテンプレート（Template_BA）、即ち、Bacillus anthracisに特異的に結合する テンプレート（Template_BA）（配列番号１０）を製造した（Integrated DNA Technology, San Jose,CA, USA）。Template_BAは次のように標的遺伝子（Bacillus anthracisの病原菌遺伝子）と相補的に結合する結合部位、即ち病原菌の相補的部位（Pathogen complementary site）（２０ｍｅｒ、白地に濃い字）、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位、即ち、テンプレート内の相補的な領域（２１ｍｅｒｘ２、総４２ｍｅｒ、イタリック体）、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、即ち、プライマー固定化領域（Primer immobilization region）（３７ｍｅｒ）で構成され、そのうち、プライマーに相補的に結合する結合部位をイタリック体にアンダーラインして示した。

【0080】

5’/5Phos/TTT GAA ATG GAG AAA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATTTGA GCG-3’

【0081】

（２）Template_Eの製造
エボラウイルスの病原菌遺伝子配列に基づいてエボラウイルスｓに特異的なテンプレート（Template_E）、即ち、Ebola virusに特異的に結合するテンプレート（Template_E）
（配列番号１１）を製造した。Template_Eは標的遺伝子（Ebola virusの病原菌遺伝子）と相補的に結合する結合部位、即ち病原菌の相補的部位（Pathogen complementary site）（２５ｍｅｒ、白地に濃い字）、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位、即ち、テンプレート内の相補的な領域（２１ｍｅｒｘ２、総４２ｍｅｒ、イタリック体）、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、即ち、プライマー固定化領域（Primer immobilization region）（３７ｍｅｒ）で構成され、そのうち、プライマーに相補的に結合する結合部位をイタリック体にアンダーラインして示した。

【0082】

5’/5Phos/GA CGC ACG CGA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG A GT ACT TCG ATT AAC GAG AAA TCG CAC-3’

【0083】

＜実施例１＞標的遺伝子検出用微細流動装置
本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置の構成の一具体例を図１乃至３を参照して説明する。

【0084】

図１を参照すると、本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置は、基板１００；基板の上に形成された試料溶液が外部から流入する流入口１０１；流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路１０２；第１流路と連結された第２流路１０３；第２流路と連結された排出口１０４を含む。前記第２流路１０３は第１流路と連結されて２つ以上（例えば、３個に）に分岐できる。図３を参照すると、本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置は、前記第２流路上に固定されたプライマー；及び前記プライマーに相補的に結合されたテンプレートを含む。図２を参照すると、前記テンプレートは標的遺伝子と相補的に結合する結合部位（例えば、complementary to pathogen）、前記プライマーに相補的に結合する 結合部位（Primer binding region）、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位（dumbbel shape template）を含む。また、前記標的遺伝子と相補的に結合する結合部位はテンプレートの両末端に分離されて形成され、前記プライマーに相補的に結合する結合部位は分離されて形成された前記ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位の間に形成される。即ち、図２のＡに示すように、前記テンプレートの線形構造は‘第１標的遺伝子結合部位’−‘第１テンプレート内の相補的な結合部位’−‘プライマー結合部’−‘第２テンプレート内の相補的な結合部位’−‘第２標的遺伝子結合部位’構造である。図１２のＡに示すように、前記第２流路上に固定されたプライマーに、前記テンプレートのプライマー結合部が相補的に結合した状態にあるようになる。

【0085】

第２流路上にプライマーの固定を容易にするために第２流路はプライマーと互いに結合できる官能基を有するようにコーティングできる。前記プライマーやはり第２流路上の官能基と結合できる官能基を有するように変形できる。

【0086】

＜実施例２＞標的遺伝子検出用微細流動装置（病原菌遺伝子検出用装置）の製造
実施例２−１．単一標的遺伝子検出用微細流動装置の製造方法｛単一病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子検出用微細流動装置の製造方法｝
ステップ１：微細流動装置を提供するステップ
本発明の一実施例に標的遺伝子検出用微細流動装置（病原菌遺伝子検出用装置を製造する微細流動装置｛１III３in１uncoated Microscopy Chamber（ibidi）｝を 準備した。本発明の微細流動装置は、基板１００；基板の上に形成された試料溶液が外部から流入する流入口１０１；流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路１０２；第１流路と連結された第２流路１０３；第２流路と連結された排出口１０４を含む（図１参照）。前記第２流路１０３は第１流路と連結されて２つ以上（例えば、３個に）に分岐できる。

【0087】

ステップ２：微細流動装置の第２流路をコーティングするステップ
５−ヒドロキシドーパミン塩酸（5-hydroxydopamine HCl）（Sigma Ald rich）を１ｍｇ／ｍｌで10mM Tris buffer（1M UltraPure 1M Tris-HCl pH 8.0/Invitrogen）に溶かした。その後、ｐＨを８に合せてコーティング用組成物を製造した。前記コーティング用組成物で装置（１III３in１uncoated Microscopy Cham ber（ibidi））の第２流路を詰めた。２時間後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）で洗浄（washing）した。

【0088】

ステップ３：前記コーティングされた第２流路上にテンプレートと結合できるプライマーを固定化する（結合させる）ステップ
プライマーにはPrimer-5SS-polyA9（BIONEER）（配列番号９）を使用した。
前記プライマー１００ｐｍｏｌと５Ｍ ＤＴＴ（DL-Dithiothreitol/Sigma Al drich）を準備した後、１００ｐｍｏｌプライマーに５Ｍ ＤＴＴ５μＬを加えた後、 総５０μＬになるようにＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）を追加 した。プライマーの二硫化結合（disulfide bond）を切るために（broken）ＤＴＴ 処理を４時間の間進行後、３Ｋアミコンチューブ（amicon tube）（Amicon Ultra Centrifugal Filters 3K / MILLIPORE）を用いて反応後に残っているＤＴＴを除去 した（eppendorf Centrifuge 5415R）（１３２，０００ｒｐｍ、４℃、２５分で１ 回遠心分離の以後４０μＬＤＤＷを入れて、また１３２，０００ｒｐｍ、４℃、２５分で遠心分離してＤＴＴをきれいに除去するために総２回遠心分離した）。ＤＴＴを除去して残った溶液を３個の分岐を有する各々の第２流路（channel）１０３に５μＬ（１番流路；図１の第２流路の左側分岐）、５μＬ（２番流路；図１の第２流路の中間の分岐）、５μＬ（３番流路；図１の第２流路の右側分岐）の順に入れて２時間待った後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄（washing） した。

【0089】

ステップ４：標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含むテンプレートを前記プライマーに結合させるステップ（プライマー−テンプレート結合ステップ）
図１を参照すると、各々の排出口１０４を通じて第２流路１０３にテンプレートを加えて分岐されている第２流路１０３上に固定されたプライマーと各々のテンプレートを結合させて固定できるようにした。対照群（Negative Control） はテンプレートを加えないものを使用した。具体的に、３個の分岐を有する第２流路のうち、２番流路（図１の第２流路の中間の分岐）にはBacillus anthracisに対するテンプレート（Template_B_A）（配列番号１０）を加え、１番流路及び３番流路は対照群（Negative Control）にした。具体的に、100Template _B_A ０．２μＬ（＝２０ｐｍｏｌｅ）に１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社による gibco）を詰めて５μＬになるようにした後、２番流路に入れて、１番流路及び３番流路は１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社によるgibco）６μＬで詰めた。２時間放置した 後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄した。

【0090】

実施例２−２．２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置の製造方法｛２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子検出用微細流動装置の製造 方法｝
ステップ１：微細流動装置を提供するステップ
本発明の一実施例に標的遺伝子検出用微細流動装置（病原菌遺伝子検出用装置を製造する微細流動装置｛１III３in１uncoated Microscopy Chamber（ibidi）｝を 準備した。本発明の微細流動装置は、基板１００；基板の上に形成された試料溶液が外部から流入する流入口１０１；流入口と連結されて流入した試料溶液を収容する第１流路１０２；第１流路と連結された第２流路１０３；第２流路と連結された排出口１０４を含む（図１参照）。前記第２流路１０３は第１流路と連結されて２つ以上（例えば、３個に）に分岐できる。

【0091】

ステップ２：微細流動装置の第２流路をコーティングするステップ
５−ヒドロキシドーパミン塩酸（5-hydroxydopamine HCl）（Sigma Ald rich）を１ｍｇ／ｍｌで10mM Tris buffer（1M UltraPure 1M Tris-HCl pH 8.0/Invitrogen）に溶かした。その後、ｐＨを８に合せてコーティング用組成物を製造した。前記コーティング用組成物で装置（１III３in１uncoated Microscopy Cham ber（ibidi））の第２流路を詰めた。２時間後、ＤＤＷ（Water Purification Syste m/LABOGENE）で洗浄（washing）した。

【0092】

ステップ３：前記コーティングされた第２流路上にテンプレートと結合できるプライマーを固定化する（結合させる）ステップ
プライマーにはPrimer-5SS-polyA9（BIONEER）（配列番号９）を使用した。
前記プライマー１００ｐｍｏｌと５Ｍ ＤＴＴ（DL-Dithiothreitol/Sigma Aldrich）を準備した後、１００ｐｍｏｌプライマーに５Ｍ ＤＴＴ ５μＬを加えた後 、総５０μＬになるようにＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）を追加した。プライマーの二硫化結合（disulfide bond）を切るために（broken）ＤＴＴ処理を４時間の間進行後、３Ｋアミコンチューブ（amicon tube）（Amicon Ultra Centrifugal Filters 3K/MILLIPRORE）を用いて反応後に残っているＤＴＴを除去した（eppendorf Centrifuge 5415R）（１３２，０００ｒｐｍ、４℃、２５分で１ 回遠心分離の以後、４０μＬＤＤＷを入れて、また１３２，０００ｒｐｍ、４℃、２５分で遠心分離してＤＴＴをきれいに除去するために総２回遠心分離した）。ＤＴＴを除去して残った溶液を３個の分岐を有する各々の第２流路（channel）１０３に５μＬ（１番流路；図１の第２流路の左側分岐）、５μＬ（２番流路；図１の第２流路の中間の分岐）、５μＬ（３番流路；図１の第２流路の右側分岐）の順に入れて２時間待った後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄（washing） した。
これにより微細流動装置の第２流路上にはプライマーが固定化できる（図３のＡ参照）。

【0093】

ステップ４：標的遺伝子と相補的に結合する結合部位、前記プライマーに相補的に結合する結合部位、ダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位を含むテンプレートを前記プライマーに結合させるステップ（プライマー−テンプレート結合ステップ）
図１を参照すると、各々の排出口１０４を通じて第２流路１０３にテンプレートを加えて分岐されている第２流路１０３上に固定されたプライマーと各々のテンプレートを結合させて固定できるようにした。対照群（Negative Control）はテンプレートを加えないことを使用した。具体的に、３個の分岐を有する第２流路のうち、２番流路（図１の第２流路の中間の分岐）にはEbola virusに対 するテンプレート（Template_E）を加え、３番流路（図１の第２流路の左側分岐）にはBacillus anthracisに対するテンプレート（Template_B_A）を加え、１番流路 は対照群（Negative Control）にした。具体的に、１００Template_E（配列番号１１）０．２４μＬ（＝２４ｐｍｏｌｅ）に１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社によるgibco）を詰めて６μＬになるようにした後、３番流路に入れた。100Template_B_A（配列番号１０）０．２μＬ（＝２０ｐｍｏｌｅ）に１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社によるgibco）を詰めて５μＬになるようにした後、２番流路に入れて、３番流路は１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社によるgibco）６μＬで詰めた。１時間放置した後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄した。
これによって、前記第２流路上に固定化されたプライマーとテンプレートが結合できる（図３のＢ参照）。各々の第２流路の分岐上に固定化されたプライマーに特定の病原菌の遺伝子が認識できる互いに異なるテンプレートが結合されることができ、これを通じて一回に多数の標的遺伝子が検出できるようにする。

【0094】

＜実施例３＞標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法
標的遺伝子の検出原理 標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法の原理は、標的遺伝子（例えば、病原菌遺伝子）の存在時のみにネッキ（nick）が消えた閉じた型（closed form）のダンベル型（dumbbel shape）テンプレートがライゲーション（ligation）され、次いで回転環増幅（Rolling circle amplification）（ＲＣＡ）により増幅されて自家組立（self assembly）された精巧な構造体のパーティクルを形成することを基礎とする（図２参照）。

【0095】

図１２は、図３Ｂ〜図３Ｄの過程をより具体的な模式図で示したものである。即ち、図１２Ａは本発明の標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路上に固定されたプライマーにテンプレートが結合されている形態を示す。前記標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内に流れて入った試料に標的病原菌遺伝子が存在すれば、前記標的病原菌遺伝子は前記テンプレートの第１標的遺伝子結合部位と第２標的遺伝子結合部位に同時に結合するようになる（図１２Ｂ、図２Ｂ）。この際、第１標的遺伝子結合部位と第２標的遺伝子結合部位の両末端が互いに近くなって、その間に小さな隙間、即ちネッキ（nick）のみ存在するようになる。これと同時に、第１テンプレート内の相補的な結合部位と第２テンプレート内の相補的な結合部位やはり互いに近くなって、相補的な結合を形成するようになる。前記ネッキ（nick）は隣接した５´末端と３´末端とを連結する酵素であるリガーゼにより互いに連結されて、前記テンプレートは完全に閉じた形態（closed form）となってダンベル形態になる（図１２Ｃ、図２Ｃ）。

【0096】

等温核酸重合酵素は、前記閉じた形態の標的遺伝子検出用テンプレートを鋳型としてｄＮＴＰが消尽される前まで核酸を無限反復して複製する回転環増幅（（Rolling Circle Replication；ＲＣＡ）を行う（図１２Ｄ及び図２Ｄ参照）。複製された部分は標的遺伝子検出用テンプレートから落ちるため、標的遺伝子検出用テンプレートの配列が反復して存在する線形（linear）核酸が生成される。この線形核酸に存在する第１標的遺伝子結合部位と第２標的遺伝子結合部位の各々が標的遺伝子と結合し、回転環増幅反応が起こって、長くて、凝集した核酸塊りが生成され、これは第２流路のコーティングと共に凝集して大きいハイドロゲル塊りを形成する。形成されたハイドロゲル塊りが第２流路内に存在し、その第２流路に連結された排出口を塞ぐことを観察することができる。

【0097】

実施例３−１．単一標的遺伝子検出用微細流動装置を用いた標的遺伝子を検出する方法｛単一標的遺伝子検出用微細流動装置を用いた単一標的病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子を検出する方法｝
ステップ１：実施例２−１による単一標的遺伝子検出用微細流動装置｛単一病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子検出用微細流動装置｝を提供するステップ
単一標的遺伝子検出用微細流動装置を提供（準備）した。具体的に、実施例２−１により単一標的遺伝子検出用微細流動装置｛単一病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子検出用微細流動装置｝を提供した。

【0098】

ステップ２：第１流路に試料溶液を流入させるステップ
（１）試料溶液準備
Bacillus anthracisの病原菌遺伝子配列に基づいて試料（Pathogen_BA）（配列番号１２）をBioneer（HPLC Purification）から注文して準備した。１Ｘ ＰＢＳ内のPathogen_ B_A 100で試料溶液を準備した。

【0099】

以下の＜表４＞は実施例３で使用したBacillus anthracisのテンプレート及び病原菌配列を示す。

【0100】

【表4】

【0101】

（２）第１流路に（１）で準備した試料溶液を流入させるステップ
（１）で準備した試料溶液６０μＬを単一標的遺伝子検出用微細流動装置の流入口を通じて第１流路に流入させた。単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第１流路に流入した試料溶液は毛細管現象により第１流路を経て第２流路に移動した。２時間放置した後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄した。

【0102】

ステップ３：前記試料溶液に含まれた単一標的遺伝子｛単一病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子｝とテンプレートのライゲーションステップ；
第１流路に流入した試料溶液は毛細管現象により第２流路に流れた。
次に、単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路に２Ｘ Ｔ７リガーゼ （ligase）３０μＬ、Ｔ７リガーゼ５μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ ０．２μＬ、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）２４．８μＬで単一標的遺伝子検出用微細 流動装置の第２流路を詰めた。装置の中の水分が蒸発することを防止するために、パラフィルムで封入したプラスチック容器の中に入れて試料溶液と反応させた。プラスチックの中は水に浸したチリ紙と２５℃の水で詰めた。その後、撹拌培養器（shaking incubator）（ＶＳ−８４８０（VISION SCIENNTIFIC CO））無撹拌 （non-shaking）、２５℃で３時間の間反応させた。

【0103】

ステップ４：前記ライゲーションされた遺伝子産物の増幅ステップ（Rolling Circle Amplification）

【0104】

その後、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μＬ、１０Ｘ Ｔ７ ligase reaction buffer （Biolabs）６μＬ、ｐｈｉ２９ polymerase（１０ｕｎｉｔ／μＬ）５０μＬ、pyrophos phatase １μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ １μＬで単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内を詰めた。単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内の水分が蒸発することを防止するために、パラフィルムで封入したプラスチック容器中に入れて反応させた。プラスチックの中は水に浸したチリ紙と３０℃水で詰めた。その後、撹拌培養器（shaking incubator）（ＶＳ−８４８０（VISION SCIENNTIFIC CO））無撹拌（non-shaking）、３０℃、３時間条件で進行した。

【0105】

ステップ５：前記増幅された標的遺伝子産物の検出ステップ（標的遺伝子検出確認）
検出用組成物にGel red（GelRedTM／Biotium）１：１０００希釈水（ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）で希釈）５０μＬを流入口を通じて入れてあげた。Gel red（GelRedTM／Biotium）１：２００希釈水は第１流路を経て 第２流路に流れた。Gel red（GelRedTM／Biotium）の希釈倍数は普通１：１００００に希釈して使用するが、肉眼で色を見るために調節するものであり、これに制限されるものではない。
図９のａを参照すると、２番流路で赤く見えるものはDNA membraneであり、Gel redのような染色試薬を検出用組成物にして前記増幅された標的遺伝子産物の検出が可能であることが分かった。また、図９のｂのように、Imager（Gel DocTM EZ（Bio-rad））で見ると、単一標的遺伝子検出用微細流動装置内の２番流路で流れが塞がったことが容易に分かった。これを通じて本発明の単一標的遺伝子検出用微細流動装置を使用してThermo cyclerのような装置を使用せず、特別な温度変化を与えなくても温和な温度条件、例えば３０℃の温度条件で単一標的遺伝子、例えば、単一病原菌（Bacillus anthracis）遺伝子の検出が肉眼で可能であることを確認した。

【0106】

実施例３−２．２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いた標的遺伝子を検出する方法｛２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置を用いた単一標的病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子を検出する方法｝
ステップ１：実施例２−２による２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置｛２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子検出用微細流動装置｝を提供するステップ
２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置を提供（準備）した。具体的に、実施例２−２により２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置｛２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子検出用微細流動装置｝を提供した。

【0107】

ステップ２：第１流路に試料溶液を流入させるステップ
（１）試料溶液準備
Bacillus anthracisの病原菌遺伝子配列に基づいて試料（Pathogen_BA）（配列番号１２）をBioneer（HPLC Purification）から注文して準備した。１Ｘ ＰＢＳ内のPathogen_ B_A 100で試料溶液を準備した。

【0108】

（２）試料準備
Bacillus anthracis及びEbola virusの病原菌遺伝子配列に基づいて試料 ｛（Pathogen_BA）（配列番号１２）及びPathogen_E（配列番号１３）｝を各々Bioneer（HPLC Purification）から注文して準備した。１Ｘ ＰＢＳ内のPathogen_ B_A 100で試料溶液を準備した。また、１Ｘ ＰＢＳ内のPathogen_E 100で試料溶液 を準備した。

【0109】

以下の＜表５＞は実施例２で使用したBacillus anthracis及びEbola virus のテンプレート及び病原菌配列を示す。

【0110】

【表5】

【0111】

（２）第１流路に（１）で準備した試料溶液を流入させるステップ
（１）で準備した試料溶液６０μＬを単一標的遺伝子検出用微細流動装置の流入口を通じて第１流路に流入させた。単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第１流路に流入した試料溶液は第１流路を経て第２流路に移動した。第２流路の ２番流路及び３番流路はTemplate_Eの総２０μＬのうちの５μＬ及びTemplate_B_Aの総２０μＬのうちの５μＬを入れてあげた。２時間放置した後、ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）洗浄した。

【0112】

ステップ３：前記試料溶液に含まれた２以上の標的遺伝子｛２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus遺伝子）とテンプレートライゲーションステップ；
単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路に２Ｘ Ｔ７リガーゼ（ligase） ３０μＬ、Ｔ７ ligase ５μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ ０．２μＬ、ＤＤＷ（Water Purifica tion System/LABOGENE）２４．８μＬで単一標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路を詰めた。装置内の水分が蒸発することを防止するためにパラフィルムで封入したプラスチック容器内に入れて反応させた。プラスチックの中は水に浸したチリ紙と２５℃の水で詰めた。その後、撹拌培養器（shaking incubator）（ＶＳ−８４ ８０（VISION SCIENNTIFIC CO））無撹拌（non-shaking）、２５℃で３時間の間反応させた。
これによって試料に存在する標的遺伝子（病原菌の遺伝子）が特定テンプレートと相補的結合して環形テンプレートを形成することができる（図３のＣ参照）。

【0113】

ステップ４：前記ライゲーションされた遺伝子産物の増幅ステップ（Rolling Circle Amplification）
＜方法１＞
その後、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μＬ、１０Ｘ Ｔ７ ligase reaction buffer （Biolabs）６μＬ、ｐｈｉ２９ polymerase（１０ｕｎｉｔ／μＬ）５０μＬ、 pyro phosphatase １μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ １μＬで２以上の標的遺伝子検出用微細流動 装置の第２流路内のを詰めた。２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内の水分が蒸発することを防止するためにパラフィルムで封入したプラスチック容器内に入れて反応させた。プラスチックの中は水に浸したチリ紙と３０℃の水で詰めた。その後、撹拌培養器（shaking incubator）（ＶＳ−８４８０（VISION SCIE NNTIFIC CO））無撹拌（non-shaking）、３０℃、３時間条件で進行した。

【0114】

＜方法２＞
その後、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μＬ、０．４ｍＭ Biotin-14-dCPT １μＬ、１０ Ｘ Ｔ７ ligase reaction buffer（Biolabs）２μＬ、Ｐｈｉ２９ polymerase（５００ ｕｎｉｔ／μＬ）５μＬ、Pyrophosphatase １μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴ ０．８μＬ、ＤＤＷ ６．２μＬで２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内を詰めた。２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路内の水分が蒸発することを防止するためにパラフィルムで封入したプラスチック容器内に入れて反応させた。プラスチックの中は水に浸したチリ紙と３０℃の水で詰めた。その後、shaking incubator（ＶＳ−８４８０（VISION SCIENNTIFIC CO））non-shaking、３０℃、３時間反応条件で反応させた。

【0115】

前記方法１または方法２により回転環増幅（rolling circle amplification）を通じて標的遺伝子（核酸）が増幅できる（図３のＤ参照）。

【0116】

ステップ５：前記増幅された標的遺伝子産物の検出ステップ（標的遺伝子検出確認）
凝集した単一鎖形態の回転環増幅された遺伝子産物（図３のＥ参照）が微細流動装置の第２流路の各々の分岐を選択的に塞ぐことができ、これによって遺伝子の検出が可能である。微細流動装置の第２流路に検出用組成物を入れてあげる場合、検出をより容易にすることもできる（図３のＦ参照）。

【0117】

＜ステップ４の方法１と関連した検出方法＞
検出用組成物にGel red（GelRedTM／Biotium）１：１０００希釈水（ＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）で希釈）５０μＬを流入口を通じて入れてあげた。Gel red（Gel RedTM／Biotium）１：８０希釈水は第１流路を経て第２流路に流れた。
図１０のｂのようにImager（Gel DocTM EZ（Bio-rad））で見ると、２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置内の２番流路及び３番流路で流れが塞がったことが容易に分かった。これを通じて本発明の２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置を使用してThermo cyclerのような装置を使用せず、特別な温度変化を与えなくても温和な温度条件、例えば３０℃の温度条件で２以上の標的遺伝子、例えば、２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子の同時検出が肉眼で可能であることを確認した。

【0118】

＜ステップ４の方法２と関連した検出方法＞
検出用組成物にStreptavidinビードを使用した。具体的に、Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres 2.0 Micro １：２０希釈水（ＤＤＷ（Water Puri fication System/LABOGENE）で希釈）５０μＬを流入口を通じて入れてあげた。
図１１のように、ＲＣＡ産物による空気層により塞がるか、またはＲＣＡ産物のビオチンとストレプタビジン（streptavidin）が反応して、さらに凝集したＲＣＡ産物により２以上の標的遺伝子検出用微細流動装置内の２番、３番流路で流れが塞がったことが容易に分かった。これを通じて本発明の２以上の標的遺伝子検出用 微細流動装置を使用してThermo cyclerのような装置を使用せず、特別な温度変化を与えなくても温和な温度条件、例えば３０℃の温度条件で２以上の標的遺伝子、例えば、２以上の病原菌（Bacillus anthracis及びEbola virus）遺伝子の同時検出が肉眼で可能であることを確認した。

【0119】

＜実験例１＞各ステップの電気泳動（electrophoresis）結果確認
前記製造例１で製造したTemplate_BAと病原菌（Pathogen）との結合及びライゲーションを電気泳動結果で確認するための実験を進行した。前記実験例１では製造例１のテンプレートと病原菌に対する反応の有無を確認するためにチューブ（tube）で簡易に実験した。また、さまざまな反応条件をテストするために熱循環 器（Thermo cycler）を使用した。これと共に、前記製造例１で製造したTemplate_Eと 病原菌（Pathogen）との結合及びライゲーションを電気泳動結果で確認するための実験を進行した。チューブでの実験では、テンプレートをプライマーに固定させ ないので、各々のPathogen 3’ 末端、即ち、病原菌遺伝子３'の末端にPhosphateを付けなかった。

【0120】

（１）アニーリング（Annealing）ステップの確認
１００ Bacillus anthracisに対するテンプレート（Template_BA）（配列 番号１０）をＤＥＰＣ（Sigma-Aldrich）を溶媒に使用して１Template_BAで希釈した。チューブ（Tube）にＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE） ３．２μＬ、１０Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４（lifetechnoligies社によるgibco）１μＬ、 ４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Sigma-Aldrich）５μＬを順次に入れて１Template_BA ０．８μＬ（即ち、０．８ｐｍｏｌe）を入れた。その後、Thermo cycler（Bio-rad T100TM）で９５℃→４℃に１時間の間温度を低めた。
その後、ローディング染料（loading dye）（Gel Loading Dye Blue 6X / Biolabs）２μＬを入れて１５％PAGE in IX Tris-borate-EDTA（ＴＢＥ）バッファに 電気泳動した後（１５０V、４５分）、ゲルレッド（Gel red）（GelRedTM／Biotiu m）で染色し、Gel DocTM EZ（Bio-rad）で電気泳動結果を確認した。
前記Template_BAの代わりにTemplate_E（配列番号１１）を使用するのを除いて同一な方式によりアニーリング（Annealing）ステップの確認実験を遂行した。

【0121】

（２）混成化（Hybridization）ステップの確認
試料のBacillus anthracis（Pathogen_BA Not PhosP）（配列番号１４）と テンプレートの混成化を確認するために次の実験を行った。まず、チューブ（Tube）にＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE）２μＬ、１０Ｘ ＰＢＳ pＨ７．４（lifetechnoligies社によるgibco）１μＬ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Sigma-Al drich）５μＬを順次に入れて１０Pathogen_BA_Not Phospと１０Template_B_Aを各 々１μＬずつ入れた。その後、Thermo cycler（Bio-rad T100TM）で９５℃→４℃に１ 時間の間温度を低めた。
その後、総１０μＬのうち、１μＬ（即ち、０．８ｐｍｏｌｅ）を１Ｘ ＰＢ Ｓ ９μＬで詰めた後、ローディング染料（loading dye）（Gel Loading Dye Blue 6X/ Biolabs）２μＬを入れて１５％ PAGE in IX Tris-borate-EDTA（ＴＢＥ）バッファに 電気泳動した後（１５０Ｖ、４５分）、Gel red（GelRedTM／Biotium）で染色し、 Gel DocTM EZ（Bio-rad）で電気泳動結果を確認した。
前記Template_BA（配列番号１０）の代わりにTemplate_E（配列番号１１）を使用し、Pathogen_BA_Not PhosP（配列番号１４）の代わりにTemplate_E_ Not PhosP（配列番号１５）を使用することを除いて、同一な方式により混成化 （Hybridization）ステップの確認を遂行した。

【0122】

（３）ライゲーション（Ligation）ステップの確認
チューブ（Tube）にＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE） ２．４μＬ、２Ｘ Ｔ７ligase reaction buffer（Biolabs）１０μＬ、１００Pathogen_ BA_Not PhosP（配列番号１４）１．６μＬ、１００Template_BA（配列番号１０） ０．８μＬを順次に入れて、Thermo cycler（Bio-rad T100TM）で９５℃→４℃に５ 分間温度を低めた。その後、１００ｍＭ ＤＴＴ｛Epicenter RepliPHI Phi29試薬セ ット（０．１μＬ／μＬ）｝０．２μＬとＴ７リガーゼ（Biolabs）５μＬを入れてあげた。その後、Thermo cycler（Bio-rad T100TM）で２５℃１３時間→６５℃２０分→ １０℃に維持した。結果的に、４ライゲーション生成物（ligation product）２０μＬが作られた。ライゲーション生成物０．８ｐｍｏｌeにローディング染料（loading dye）（Gel Loading Dye Blue 6X / Biolabs）２μＬを入れて、１５％PAGE in 1X Tris-borate-EDTA（ＴＢＥ）バッファに電気泳動した後（１５０Ｖ、４５分）、Gel red（GelRedTM／Biotium）で染色し、Gel DocTM EZ（Bio-rad）で電気泳動結果 を確認した。
前記Template_BA（配列番号１０）の代わりにTemplate_E（配列番号１１）を使用し、Pathogen_BA_Not PhosP（配列番号１４）の代わりにTemplate_E_ Not PhosP（配列番号１５）を使用することを除いて、同一な方式により混成化 （Hybridization）ステップの確認を遂行した。

【0123】

（４）回転環増幅（Rolling circle amplification）
チューブ（Tube）にＤＤＷ（Water Purification System/LABOGENE） ７．２μＬ、１０Ｘ Ｔ７ ligase reaction buffer（Biolabs）２μＬ｛Epicenter Repli PHI Phi29試薬セット（０．１μＬ／μＬ）｝の順に入れてライゲーションステップで 作った４ライゲーション生成物（ligation product）２μＬ（８ｐｍｏｌｅ）を入れ た。その後、２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｛Epicenter RepliPHI Phi29試薬セット（０．１μＬ／μＬ）｝２μＬ入れて１００ｍＭ ＤＴＴ｛Epicenter RepliPHI Phi29試薬セット （０．１μＬ／μＬ）｝０．８μＬ、Pyrophosphatase（１００Ｕ／ｍｌ Biolabs）１μＬ、Phi29 polymerase{Epicenter RepliPHI Phi29試薬セット（０．１μＬ／μＬ）｝５μＬを順次に入れた。その後、Thermo cycler（Bio-rad T100TM）で３０℃１５時間→ ６５℃１０分→４℃に維持した。

【0124】

（５）電気泳動結果確認
ＤＮＡラダー（Quick-Load LMW Ladder/Biolabs）を基準とし、前記 テンプレート（Template_BA）（配列番号１０）、病原菌（Pathogen_BA_Not PhosP）（配列番号１４）、及び前記（１）〜（３）ステップで得た生成物を各々０．８ｐｍｏｌｅずつローディングして電気泳動した結果を図４に示した。
図４を参照すると、テンプレート（Template）は、普通、線形（linear form）、即ち、線形テンプレート（Linear template）として存在するが（図４のａ参照）、前記テンプレートは自家組立できる条件下でダンベル形態を形成するためのテンプレート内の相補的な結合部位間の相補的な結合することによって、アニーリング（annealing）されて自家組立された形態（Self-assembled form）、自家組立されたテンプレート（Self-assembled template）が作られることを確認することができた（図４のｂ参照）。自家組立された形態のテンプレート内の標的遺伝子と相補的に結合する結合部位と標的遺伝子、例えば病原菌（Pathogen）遺伝子が結合すれば、ネッキ（nick）が消えた閉じた型（closed form）のダンベル形態のテンプレート（Dumbbell-sahped template）が形成されてライゲーション（ligation）されることを確認することができた（図４のｃ参照）。次に、ライゲーション生成物の回転環増幅（Rolling circle amplification）（ＲＣＡ）が起こることを確認することができた。

【0125】

＜実験例２＞ＲＣＡ生成物のＳＥＭイメージ確認
（１）Bacillus anthracis確認
前記製造例１で製造したTemplate_B_Aを使用して実験例１の（４）の方法により収得したＲＣＡ生成物２０μＬに２Ｍ ＭｇＣｌ_２２μＬを入れて徐冷（Slow cooling）（１時間に亘って９５℃→４℃）したところ、約１ｍｍ程度の白いＤＮＡ球（DNA ball）が生じた。ガラスウェア（glassware）（MARIENFELD）にＤＮＡ球（DNA ball）を載置し、２４時間乾燥した後、ｍｉｃａ（Pelco Mica sheets、Ted Pella Corp.）に結合させてＳＥＭ（Tm3030 tabletop microscope/Hitachi High-Tech）写真を撮った。図５のように精巧な単一鎖のＤＮＡ塊りが形成されることを確認することができる。

【0126】

（２）Ebola virus確認
前記製造例１で製造したTemplate_Eを使用して実験例１の（３）の方法により収得したＲＣＡ生成物２０μＬに５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ ４０（SIGMA-Aldrich）を入れて１００％のＥｔＯＨ ５００で詰めた後、２０分間冷凍した。その後、遠心分離 （１０，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）し、上層液を取って４０残して、３０分間超音波処理（BRANSON5510）した。ガラスに載置し、２４時間乾燥させた後、ｍｉｃａ （Pelco Mica sheets、Ted Pella Corp.）に結合させてＳ ＥＭ（Tm3030 tabletop microscope/Hitachi High-Tech）写真を撮った。図６のように増幅された遺伝子産物の凝集した鎖の塊りが形成されることを確認することができた。

【0127】

＜実験例３＞ 回転環増幅された遺伝子産物のハイドロゲル形成確認
実験例１の回転環増幅（Rolling circle amplification；ＲＣＡ）反応により得た増幅された遺伝子産物がハイドロゲルを形成するかを確認するための実験を遂行した。病原菌にはBacillus anthracis（Pathogen_BA Not Phosp、配列番号１４）及びEbola virus（Pathogen_E Not Phosp、配列番号１５）を使用した。
前記実験例３では製造例１のテンプレートと病原菌に対する反応有無を確認するためにチューブ（tube）で簡易に実験した。また、さまざまな反応条件をテストするために熱循環器（Thermo cycler）を使用した。
ハイドロゲル形成による粘度測定のためにチューブ（tube）とピペットチップ（pipette tip）を用いて粘度測定及び回転粘度計測定を遂行した。

【0128】

（１）チューブ（tube）及びピペットチップ（pipette tip）を用いた粘度測定
チューブをチューブの長軸を中心に９０度角度に傾けた後、反応液体（実験例１の（４）回転環増幅の産物を含んだ溶液）の流れ性を測定した。６０秒間流れ性が確認されない場合、標的遺伝子、例えば、Pathogen遺伝子（Template_BAまたはTemplate_E）検出が確認されることを示す。
また、ピペットチップ（pipette tip）を用いて反応液体（実験例１の（４）回転環増幅の産物を含んだ溶液）を持ち上げる時（吸い上げる時）の粘性変化によって反応液体（実験例１の（４）回転環増幅の産物を含んだ溶液）がピペットチップの表面に沿って吸い上げるようになることで、水のような粘性の場合にはチップに沿って吸い上げるものがないが、粘度が増加するほどチップの内に物質が吸い上げて、戻る性質が増加することを確認した（図７のａ参照）。
前記製造例１で製造したTemplate_BAまたはTemplate_Eを用いた回転環増幅反応で全て６０秒間ほとんど流れ性を表さない粘性を有するようになって、標的遺伝子、例えば、Pathogen遺伝子（Template_BAまたはTemplate_E）の検出が可能であることが分かった。また、Template_BAより病原菌に相補的な長さがより長いTemplate_Eを用いた時、より粘度があるハイドロゲルが形成されることを確認した。

【0129】

（２）回転粘度計測定
前記製造例１で製造したTemplate_Eを用いて実験例１に開示された回転環増幅（Rolling circle amplification；ＲＣＡ）反応により得た増幅された遺伝子産物 に対する粘度変化を回転粘度計を用いて測定した。反応液体（実験例１の（４）回転環増幅の産物を含んだ溶液）の粘性変化増加及びstorage modulus（G’）値とloss modulus（G’’）値の割合を測定し、これを図７のｂに示した（ｘ軸：Frequence（Ｈｚ）、ｙ軸：Pascal（Ｐａ））。ハイドロゲル形成による粘性変化増加から標的遺伝子、例えば、Ebola virusの検出が可能であることが分かった。

【0130】

＜実験例４＞標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路をコーティングすることに伴う効果確認
実施例３−１の方法による標的遺伝子検出用微細流動装置を用いて標的遺伝子を検出する方法を遂行した後、第２流路の形態を原子探針顕微鏡（ＡＦＭ）（ＮＸ−１０、Park System）で調べた。ステップ２の工程を遂行しないこと（５−ヒドロキシドーパミン塩酸で第２流路をコーティングする過程無しで）を除外し、実施例２−１の単一標的遺伝子検出用微細流動装置の製造方法により製造した単一標的遺伝子検出用微細流動装置を使用して標的遺伝子を検出する方法（実施例３−１の方法）を遂行した後、第２流路の形態を原子探針顕微鏡（ＡＦＭ）（ＮＸ−１０、Park System）で調べた。
その結果、５−ヒドロキシドーパミン塩酸を用いたコーティングするステップ（５−ヒドロキシドーパミン塩酸で前処理するステップ）無しでプライマーを固定させた場合（図８のａ）は、基板の表面に付着されたプライマーがほとんど存在しなくて標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路上で増幅が起こらなかった。一方、５−ヒドロキシドーパミン塩酸を用いたコーティングするステップ（５−ヒドロキシドーパミン塩酸で前処理するステップ）を遂行し、プライマーを固定させた後、標的遺伝子（核酸）を増幅させた場合（図８のｂ）には、標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路上で核酸の増幅が優れるに起こることが分かった。これを通じて５−ヒドロキシドーパミン塩酸がＤＮＡプライマーを標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路に効果的に固定化できることが分かった。
これを通じて５−ヒドロキシドーパミン塩酸で標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路をコーティングする場合、チオール（thiol）基を含有しているプライマーと反応してプライマーが標的遺伝子検出用微細流動装置の第２流路上に効果的に固定されるので、以後の工程により核酸の増幅が増加できることが分かる。

【0131】

＜実験例５＞標的遺伝子検出用微細流動装置を用いたメルス（ＭＥＲＳ）ウイルス検出
（１）標的メルス（ＭＥＲＳ）遺伝子検出用微細流動装置の製造
実施例２のステップ１及びステップ２で記述したように、図１のように基板上に流入口、第１流路、３個の第２流路、及び各々の第２流路の端部に排出口が形成された装置を準備した。実施例２では、５−ヒドロキシドーパミン塩酸を第２流路内に注入して第２流路内をコーティングしたが、本実験例ではビニル基を蒸気蒸着方式によりプラスチック材質の第２流路にコーティングした。実施例２と同一な方法によりコーティングすることも可能である。その後、ＤＤＷで洗浄した。
次に、実施例２のステップ３のように、Primer-5SS-polyA9（BIONEER）（配列番号９）プライマーとＤＴＴの混合液を流入口に注入した。ＤＴＴによってプライマーに存在するチオール基が露出し、露出したチオール基が第２流路上のビニルコーティング（または、５−ヒドロキシドーパミン塩酸コーティング）に結合された。その後、ＤＤＷで洗浄した。
次に、前記３個の第２流路上に固定されたプライマーに互いに異なるテンプレート１００を０．２μＬ（＝２０ｐｍｏｌｅ）が１Ｘ ＰＢＳ（lifetechnoligies社の gibco）に希釈した溶液を注入して、プライマーに各テンプレートが結合されるようにした。
具体的に、上面視して、左側の第２流路には製造例１（１）のTemplate_BA（Bacillus anthracisに対するテンプレート、配列番号１０）を結合させた。前記第２流路は陰性対照群（Negative Control；ＮＣ）であって、微細流動装置に注入された試料内にメルスウイルスが含まれていても前記テンプレートと何らの反応を起こさないので、回転環増幅反応が起こらない。
中央の第２流路にはメルスウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に対するテンプレートを結合させた。中央の第２流路は試料群（Sample）であって、微細流動装置に 注入された試料内にメルス遺伝子が存在する場合のみに回転環増幅が起こるようになる。一方、前記メルスウイルスに対するテンプレートの配列は、次の通りである。

【0132】

テンプレートＭＥＲＳ
5’/5Phos/AGG GCA CAT CTC CGA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC
TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT ATA CCC-3’

【0133】

前記テンプレートＭＥＲＳ配列で、標的メルスコロナウイルス遺伝子に相補的な部分を白地に濃い字で、テンプレート内の互いに相補的な部分をイタリック体で、プライマーに相補的に結合する部分をイタリック体にアンダーラインして表示した。
上面視して、右側の第２流路には第２流路上に固定されたプライマーに前記のようなメルスウイルスに対するテンプレートを結合させ、前記テンプレートに結合する標的メルス遺伝子を添加して、常に回転環増幅が起こるようにした。左側の第２流路を陽性対照群（Positive Control；ＰＣ）とした。

【0134】

（２）標的メルス（ＭＥＲＳ）遺伝子の検出
次に、前記メルスウイルスに対するテンプレートに結合するメルスウイルス遺伝子を含む試料を前記（１）で製造された微細流動装置の流入口に注入した。その後、ライゲーションが２５℃で夜通し起こるようにし、回転環増幅は２５℃で４時間の間起こるようにした。一方、ライゲーション時間及び回転環増幅時間は状況によって調節できる。例えば、結果を蛍光で確認する場合、ライゲーション時間及び回転環増幅時間が遥かに縮めることも可能であり、例えば２時間の間ライゲーションが起こるようにし、２時間の間回転環増幅が起こるようにした後、観察することができる。
実験例５のように、陰性対照群、試料群、陽性対照群の３個の第２流路を有する微細流動装置で起こる過程の模式図を図１３に示した。

【0135】

結果は図１４に示した。図１４で、右側の陰性対照群の第２流路では排出口が塞がらなくて試料が流れて出て、中央の試料群の第２流路及び左側の陽性対照群の第２流路では回転環増幅が起こって、ハイドロゲル塊りが形成され、排出口を塞ぐことが観察される。

【符号の説明】

【0136】

１００ 基板
１０１ 流入口
１０２ 第１流路
１０３ 第２流路
１０４ 排出口

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]