特許 6643550 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6643550

(24)【登録日】2020年1月9日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/073 20100101AFI20200130BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/073ZNA

   C12N5/0735

【請求項の数】9

【全頁数】87

(21)【出願番号】特願2017-168632(P2017-168632)

(22)【出願日】2017年9月1日

(62)【分割の表示】特願2017-134828(P2017-134828)の分割

【原出願日】2005年6月23日

(65)【公開番号】特開2018-33458(P2018-33458A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2017年10月2日

(31)【優先権主張番号】60/586,566

(32)【優先日】2004年7月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/587,942

(32)【優先日】2004年7月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11/021,618

(32)【優先日】2004年12月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11/115,868

(32)【優先日】2005年4月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503431792

【氏名又は名称】ヴィアサイト，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(72)【発明者】

【氏名】ダムール，ケヴィン アレン

(72)【発明者】

【氏名】アグルニック，アラン ディー

(72)【発明者】

【氏名】エリアゼル，スーザン

(72)【発明者】

【氏名】ベートゲ，エマニュエル

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５０４８３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００３／０１８７６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol.97, No.21, pp.11307-11312

【文献】 Development, 2004.04, Vol.131, pp.1651-1662

【文献】 Nature, 2003, Vol.423, pp.448-452

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト胚体内胚葉細胞を製造するインビトロの方法であって、
ヒト多能性胚性幹細胞を含むヒト細胞集団を得る工程、並びに、
前記ヒト細胞集団に、アクチビンＡを供給することにより、ヒト胚体内胚葉細胞を製造する工程であって、前記ヒト細胞集団は、血清代替物を含まない培地に存在し、少なくとも３０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが前記ヒト細胞集団に供給される、工程
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記細胞集団からアクチビンＡを除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ヒト多能性胚性幹細胞の少なくとも１５％が胚体内胚葉細胞に分化する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞集団に、Ｗｎｔファミリー成員を供給することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｗｎｔファミリー成員がＷｎｔ３ａである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが前記細胞集団に供給される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記胚性幹細胞が、桑実胚及び胚の内部細胞塊からなる群から選ばれる組織に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

血清を前記細胞集団に供給することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

ヒト胚体内胚葉細胞を製造するインビトロの方法であって、
ヒト多能性胚性幹細胞を含むヒト細胞集団を得る工程、並びに、
前記ヒト細胞集団に、アクチビンＡ及びアクチビンＢを供給することにより、ヒト胚体内胚葉細胞を製造する工程であって、前記ヒト細胞集団は、血清代替物を含まない培地に存
在し、少なくとも３０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが前記ヒト細胞集団に供給される、工程を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に、本発明は、胚体内胚葉細胞を他の細胞型へ分化させるのに有用な因子の同定に関する。

【0002】

［関連出願］
本出願は、２００４年４月２７日に出願されたＰＤＸ １発現内胚葉(PDX 1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第６０／５６６，２９３号、２００４年７月１４日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号及び２００４年７月９日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第６０／５８６，５６６号の通常の出願として米国特許法第１１９条（ｅ）項のもと、優先権を主張する２００５年４月２６日に出願されたＰＤＸ １発現内胚葉(PDX 1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国特許出願第１１／１１５，８６８号の一部継続出願である。本出願はまた、２００４年７月１４日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第６０／５８７，９４２号及び２００４年７月９日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第６０／５８６，５６６号、並びに２００３年１２月２３日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米
国仮特許出願第６０／５３２，００４号に対する通常の出願として米国特許法第１１９条（ｅ）項のもと、優先権を主張する２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許出願第１１／０２１，６１８号の一部継続出願
である。

【背景技術】

【0003】

［背景］
ヒト多能性幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない（Bongso et al., 1994）そして線維芽細胞フィー
ダーを含有する（Hogan, 1997）培養物中でまず単離された。後に、Thomson、Reubinoff
及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞
の連続培養を確立した（Reubinoff et al., 2000；Shamblott et al., 1998；Thomson et
al., 1998）。

【0004】

ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発達の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独特の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する一般的細胞治療方法を上回る膨大な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための一般的細胞治療の処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。単一Ｉ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro et al., 2000；Shapiro et al., 2001a；Shapiro et al., 2001b）。したがって、少なく
とも２つの健常ドナー器官が、首尾よい移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発達させるた
めの出発物質の供給源を提供する。

【0005】

ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに長期間培養中にこれらの細胞を保持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により確定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、しかしこの特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特の好機も有する。ｈＥＳＣ培養物を分化するに際して生じ得る非常に種々の細胞型のために、膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。さらに、任意の所定の細胞型の産生を評価する場合の結果は、適切なマーカーの測定に応じて決定的に決まる。効率的な指示分化は、ｈＥＳＣの療法的用途のために大きな重要性を有する。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

細胞療法用途で有用である細胞を生成するための出発材料としてｈＥＳＣを使用するためには、上述の問題を克服することは好適である。さらに、細胞療法に有用な細胞型へのｈＥＳＣに由来する前駆細胞の分化を促進する因子を同定することは有益である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

［発明の概要］
本発明の実施形態は、胚体内胚葉細胞のようなＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１発現）内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陰性内胚葉細胞（ＰＤＸ１を有意に発現しない内胚葉細胞）を含む細胞集団における細胞を、細胞療法に有用である細胞へ分化させるのに有用である１つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。例えば、本明細書中に記載する方法のいくつかの実施形態は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱（これらに限定されない）を包含する組織及び／又は器官に関する前駆体である細胞への胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な因子を同定する方法に関する。いくつか実施形態では、かかる前駆体細胞はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞である。他の実施形態では、かかる前駆体細胞は、ＰＤＸ１を有意に発現しない内胚葉細胞である。

【0008】

本明細書中に記載する方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団は、候補（試験）分化因子と接触するか、或いはそうでなければ候補（試験）分化因子を供給される。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ヒト胚体内胚葉細胞である。より好ましい実施形態では、ヒト胚体内胚葉細胞は、腸管又はそれに由来する器官の細胞へ分化することができる多分化能細胞である。

【0009】

本明細書中に記載する方法の他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団は、候補分化因子と接触するか、或いはそうでなければ候補分化因子を供給される。好ましい実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞である。或る特定の実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞である。より好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である。他の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、前腸の後方部分のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞である。特に好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。

【0010】

本明細書中に記載する方法に関連する場合、候補分化因子は、細胞分化を引き起こすことが既知であるもの、或いは細胞分化を引き起こすことが未知であるものであり得る。或る特定の実施形態では、候補分化因子は、成長因子のようなポリペプチドであり得る。いく
つかの実施形態では、成長因子としては、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４、ＦＧＦ２、Ｗｎｔ３Ａ又はＷｎｔ３Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、候補分化因子は、小分子であり得る。特定の実施形態では、小分子は、レチノイン酸のようなレチノイド化合物である。或いは、いくつかの実施形態では、候補分化因子は、レチノイドでなく、前腸分化因子でなく、或いはＴＧＦβスーパーファミリーの成員ではない。他の実施形態では、候補分化因子は、レチノイド化合物、前腸分化因子又は成長因子であるＴＧＦβスーパーファミリーの成員（例えば、アクチビンＡ及びＢ）以外の任意の分子である。さらなる他の実施形態では、候補分化因子は、胚体内胚葉細胞の分化を引き起こすことがこれまでに知られていない因子である。

【0011】

本明細書中に記載する方法のさらなる実施形態は、複数の濃度で候補分化因子を試験することに関する。例えば、候補分化因子は、或る特定の閾値を越える濃度のみで、胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の分化を引き起こし得る。さらに、候補分化因子は、低濃度で供給される場合に第１の細胞型へ、また高濃度で供給される場合に第２の細胞型へ、同一細胞を分化させることができる。いくつかの実施形態では、候補分化因子は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の１つ又は複数の濃度で供給される。

【0012】

胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物或いは細胞集団を、候補分化因子と接触させるか、或いはそうでなければ候補分化因子を供給する前に、或いはそれとほぼ同時に、その発現を測定するために、少なくとも１つのマーカーが選択及び評価される。この工程は、第１のマーカー評価工程と称され得る。或いは、この工程は、第１の時点でのマーカーの発現測定と称され得る。マーカーは、細胞分化をモニタリングするのに有用ないずれのマーカーであり得るが、好ましいマーカーとしては、性決定領域Ｙ−ボックス１７（ＳＯＸ１７）、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）、アルブミン、肝細胞特異的抗原（ＨＡＳ）、プロスペロ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）、甲状腺転写因子１（ＴＩＴＦ１）、ビリン、αフェトプロテイン（ＡＦＴ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ（ＣＹＰ７Ａ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）
、肝細胞核因子４ａ（ＨＮＦ４ａ）、ＣＸＣ型ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）、血管細胞接着分子−１（ＶＡＣＭ１）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、グルコース輸送体−２（ＧＬＵＴ２）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、グルコキナーゼ（ＧＬＵＫＯ）並びにヒト造血発現ホメオボックス（ｈＨＥＸ）及びＣＤＸ２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0013】

胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ−１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を、候補分化因子と接触させるか、或いはそうでなければ候補分化因子を供給してから十分な時間が経過した後、細胞培養物又は細胞集団における少なくとも１つのマーカーの発現が再び評価される。この工程は、第２のマーカー評価工程と称され得る。或いは、この工程は、第２の時点でのマーカーの発現測定と称され得る。好ましい実施形態では、第１の時点及び第２の時点で評価されるマーカーは、同一マーカーである。

【0014】

本明細書中に記載する方法のいくつかの実施形態では、第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現が、第１の時点でのこのマーカーの発現と比較して増大又は減少されたかがさらに判定される。少なくとも１つのマーカーの発現の増大又は減少は、候補分化因子が、胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の分化を促進することが可能であることを示す。胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を、候補分化因子と接触させるか、或いはそうでなければ候補分化因子を供給することと、第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を測定することとの間の十分な時間は、約１時間程度と短いものから約１０日間程度と長いものまであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を、候補分化因子と接触させるか、或い
はそうでなければ候補分化因子を供給した後に複数回評価される。或る特定の実施形態では、マーカー発現は、Ｑ−ＰＣＲにより評価される。他の実施形態では、マーカー発現は、免疫細胞化学により評価される。

【0015】

本発明のさらなる実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、候補分化因子と接触させられて、候補分化因子との接触後の細胞集団におけるＰＤＸ１発現が、候補分化因子との接触前の細胞集団におけるＰＤＸ１発現と比較して増大されたかどうかが判定される。細胞集団におけるＰＤＸ１発現の増大は、候補分化因子が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能であることを示す。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１発現は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。上述の方法のいくつかの実施形態は、候補分化因子との接触前及び後で、細胞集団におけるＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６遺伝子の発現を測定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、候補分化因子は、小分子、例えばレチノイド（例えば、ＲＡ）である。他の実施形態では、候補分化因子は、ポリペプチド、例えば成長因子（例えば、ＦＧＦ−１０）である。

【0016】

本発明のさらなる他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能な分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞は、候補分化因子と接触させられて、細胞集団におけるマーカーの発現が、候補分化因子との接触後に、候補分化因子との接触前の細胞集団における同一マーカーの発現と比較して増大又は減少されているかが判定される。マーカーの発現の増大又は減少は、候補分化因子が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能であることを示す。いくつかの実施形態では、マーカー発現は、Ｑ−ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施形態では、候補分化因子は、小分子、例えばレチノイド（例えば、ＲＡ）である。他の実施形態では、候補分化因子は、ポリペプチド、例えば成長因子（例えば、ＦＧＦ−１０）である。

【0017】

本発明のさらに他の実施形態は、本明細書中に記載する方法により分化される細胞に関する。かかる細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は最終分化され得る。本明細書中に記載する他の実施形態は、上述の細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団に関する。

【0018】

或る特定の法域では、「を含む」という用語の任意の一般的に認められている定義が存在しない場合がある。本明細書中で使用する場合、「を含む」という用語は、任意のさらなる要素の包含を容認する「規制のない」文言を表すと意図される。このことを念頭におき、本発明のさらなる実施形態を以下の番号がふられた項目を参照して説明する。

【0019】

１．ヒト細胞を含む細胞集団におけるヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な分化因子を同定する方法であって、（ａ）ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程と、（ｂ）候補分化因子を上記細胞集団へ供給する工程と、（ｃ）第１の時点で上記細胞集団におけるマーカーの発現を測定する工程と、（ｄ）第２の時点で上記細胞集団における同一マーカーの発現を測定する工程と、（ｅ）上記第２の時点での上記細胞集団における上記マーカーの発現が、上記第１の時点での当該細胞集団における当該マーカーの発現と比較して増大又は減少されているかを判定する工程とを含み、当該第２の時点が上記第１の時点の後であり、また当該第２の時点が上記細胞集団に上記候補分化因子を供給することの後であり、当該細胞集団における当該マーカーの発現の増大又は減少は、上記候補分化因子が、上記ヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能であることを示す、前記方法。

【0020】

２．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記細胞集団におけるヒト細胞の少なくとも約１０％を構成する、項目１に記載の方法。

【0021】

３．ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、当該フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％が胚体内胚葉細胞である、項目１に記載の方法。

【0022】

４．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記細胞集団におけるヒト細胞の少なくとも約９０％を構成する、項目１に記載の方法。

【0023】

５．上記ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、上記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約９０％が胚体内胚葉細胞である、項目１に記載の方法。

【0024】

６．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、腸管に由来する細胞、組織又は器官へ分化する、項目１に記載の方法。

【0025】

７．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、膵臓前駆体細胞へ分化する、項目１に記載の方法。

【0026】

８．上記マーカーが、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）及びホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）から成る群から選択される、項目７に記載の方法。

【0027】

９．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、肝臓前駆体細胞へ分化する、項目１に記載の方法。

【0028】

１０．上記マーカーが、アルブミン、プロスペロ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）及び肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）から成る群から選択される、項目９に記載の方法。

【0029】

１１．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、肺前駆体細胞へ分化する、項目１に記載の方法。

【0030】

１２．上記マーカーが、甲状腺転写因子１（ＴＩＴＦ１）である、項目１１に記載の方法。

【0031】

１３．上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、腸前駆体細胞へ分化する、項目１に記載の方法。

【0032】

１４．上記マーカーが、ビリン及びコーダル型(caudal type)ホメオボックス転写因子２
（ＣＤＸ２）から成る群から選択される、項目１３に記載の方法。

【0033】

１５．上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団へ供給することより前である、項目１に記載の方法。

【0034】

１６．上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団へ供給するのとほぼ同時である、項目１に記載の方法。

【0035】

１７．上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団へ供給することの後である、項目１に記載の方法。

【0036】

１８．上記マーカーの発現が増大される、項目１に記載の方法。

【0037】

１９．上記マーカーの発現が減少される、項目１に記載の方法。

【0038】

２０．上記マーカーの発現が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される、項目１に記載の方法。

【0039】

２１．上記マーカーの発現が、免疫細胞化学により測定される、項目１に記載の方法。

【0040】

２２．上記マーカーが、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）及びホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）から成る群から選択される、項目１に記載の方法。

【0041】

２３．上記マーカーが、アルブミン、プロスペロ(prospero)関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）及び肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）から成る群から選択される、項目１に記載の方法。

【0042】

２４．上記マーカーが、ビリン及びコーダル型(caudal type)ホメオボックス転写因子２
（ＣＤＸ２）から成る群から選択される、項目１に記載の方法。

【0043】

２５．上記マーカーが、甲状腺転写因子１（ＴＩＴＦ１）である、項目１に記載の方法。

【0044】

２６．上記分化因子が前腸分化因子を含む、項目１に記載の方法。

【0045】

２７．上記分化因子が小分子を含む、項目１に記載の方法。

【0046】

２８．上記分化因子がレチノイドを含む、項目１に記載の方法。

【0047】

２９．上記分化因子がレチノイン酸を含む、項目１に記載の方法。

【0048】

３０．上記分化因子がポリペプチドを含む、項目１に記載の方法。

【0049】

３１．上記分化因子が成長因子を含む、項目１に記載の方法。

【0050】

３２．上記分化因子がＦＧＦ−１０を含む、項目１に記載の方法。

【0051】

３３．上記分化因子がＦＧＦ−２を含む、項目１に記載の方法。

【0052】

３４．上記分化因子がＷｎｔ３Ｂを含む、項目１に記載の方法。

【0053】

３５．上記分化因子が前腸分化因子ではない、項目１に記載の方法。

【0054】

３６．上記分化因子がレチノイドではない、項目１に記載の方法。

【0055】

３７．上記分化因子がレチノイン酸ではない、項目１に記載の方法。

【0056】

３８．上記分化因子が、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給される、項目１に記載の方法。

【0057】

３９．上記分化因子が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給さ
れる、項目１に記載の方法。

【0058】

４０．上記分化因子が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給される、項目１に記載の方法。

【0059】

４１．上記分化因子が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給される、項目１に記載の方法。

【0060】

４２．上記分化因子が、約１μｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給される、項目１に記載の方法。

【0061】

４３．上記分化因子が、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記細胞集団へ供給される、項目１に記載の方法。

【0062】

上記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関する、と理解される。
しかしながら上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途に用いられ得る。

【0063】

本発明の付加的な実施形態は、２００３年１２月２３日に出願された胚体内胚葉細胞（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５３２，００４号；２００４
年４月２７日に出願された内胚葉を発現するＰＤＸ１（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号；２００４年７月９日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号；２００４年７月１４日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号；２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）という表題の米国特許出
願第１１／０２１，６１８号；及び２００５年４月２６日に出願された内胚葉を発現するＰＤＸ１（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）という表題の米国特許出願第１１／１１５，８６８号にも見出され得る。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】図１は、ｈＥＳＣからのβ細胞の産生に関して提唱される分化経路の概略図である。経路における第１の工程は、ＥＳ細胞から胚体内胚葉系列へ委ね、また膵臓内胚葉、内分泌内胚葉又は膵臓島／β細胞へのさらなる分化事象に先立つ第１の工程を表す。経路における第２の工程は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＳＯＸ１７陽性／ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の変換を示す。これらの移行を媒介するのに有用ないくつかの因子は、イタリック体で表示している。標的細胞を規定するための関連マーカーには下線を付している。

【図2】図２は、保存モチーフの位置を表示し、且つＧＥＮＯＶＡＣによる免疫化手順に使用される領域を強調するヒトＳＯＸ１７ｃＤＮＡの図である。

【図3】図３は、ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に、また幾分劣るがＳＯＸ１８に最も密接に関連することを示す相関系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同種内のＳＯＸ Ｆ群サブファミリーの他の成員に対するよりも種相同体間でより密接に関連する。

【図4】図４は、ラット抗ＳＯＸ１７抗体でプロービングしたウェスタンブロットである。このブロットは、線維芽細胞において過剰発現されるヒトＳＯＸ１７タンパク質に関するこの抗体の特異性（レーン１）及びＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）或いは最も密接に関連するＳＯＸファミリー成員であるＳＯＸ７（レーン３）を実証する。

【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、相当数のＡＦＰ+同時標識細胞を表示するＳＯＸ１７+細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ+細胞がほとんど又は全く観察されないＳＯＸ１７+クラスター（Ｂ）と著しく対照している。

【図6】図６Ａ〜図６Ｃは、壁側内胚葉及びＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞の無作為に分化された培養物における壁内胚葉細胞の細胞表面上に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に関する免疫細胞化学を示す。パネルＢは、ＴＭ及びＳＯＸ１７に関して二重標識されたＡで示されるのと同一野である。パネルＣは、ＤＡＰＩ標識された核を伴う同野の位相差画像である。ＤＡＰＩ標識された核とＳＯＸ１７ラベリングの完全な相関に注目されたい。

【図7】図７Ａ及び図７Ｂは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現及びＳＯＸ１７特異的抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞を示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）に対して、アクチビンＡがＳＯＸ１７遺伝子発現を増大させる一方で、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７遺伝子発現を強力に抑制することを示す。パネルＢは、これらの変化の同一パターン並びに類似した規模が、ＳＯＸ１７+細胞数に反映されることを示しており、ＳＯＸ１７遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ測定は、単一細胞レベルでの変化を大きく反映することを示す。

【図8】図８Ａは、アクチビンＡの存在下での分化ｈＥＳＣの培養は、低レベルのＡＦＰ遺伝子発現を維持するのに対して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で無作為に分化することが可能とされる細胞は、ＡＦＰの強力なアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。発現レベルの差異は、およそ７倍である。図８Ｂ及び図８Ｃは、１０％ＦＢＳ単独（上部）に対するアクチビンＡ処理状態（下部）で観察されるＡＦＰ+細胞の非常に希少且つ小さなクラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制もまた単一細胞レベルで明白であることを示す２つの顕微鏡写真の画像である。

【図9】図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡＦＰ+細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在（右パネル）及び非存在（左パネル）下でのＡＦＰ遺伝子発現の変化の規模（図８Ａ）がＡＦＰ+細胞の数に正確に対応することを実証し、さらに個々の細胞レベルで起こる変化を示すためのＱ−ＰＣＲ分析の有用性を支持する。

【図10】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ（ＮＡＡ）へのｈＥＳＣの暴露が、５日間にわたってＳＯＸ１７+細胞の数の著しい増大をもたらすことを示す顕微鏡写真である（Ａ〜Ｃ）。ＤＡＰＩ染色された核により示されるように（Ｄ〜Ｆ）、ＳＯＸ１７+細胞の相対存在量を、各野に存在する細胞の総数と比較することにより、すべての細胞のおよそ３０〜５０％が、ＮＡＡによる５日の処理後にＳＯＸ１７に対して免疫反応性であることを観察することができる。

【図11】図１１は、アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ｈＥＳＣにおけるＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増大させることを実証する棒グラフである。増大された発現は、接着培養上での３日間の処理後にすでに強健であり、同様に続く１、３及び５日の懸濁培養まで継続する。

【図12】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ（パネルＢ）及びＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増大はまた、胚体内胚葉の３つの他のマーカーであるＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂに関しても観察される。アクチビン用量に応答した増大された発現の規模は、ＳＯＸ１７に関して観察される規模と際立って類似しており、アクチビンＡが、４つすべての遺伝子を同時発現する細胞の集団（ＳＯＸ１７+、ＭＩＸＬ１+、ＧＡＴＡ４+及びＨＮＦ３ｂ+）を特定していることを強力に示している。

【図13】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）及びＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。臓側内胚葉マーカーＡＦＰの発現においてアクチビンＡ用量依存的減少が見られる。原始内胚葉（ＳＯＸ７）及び壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、依然として未変化のままであるか、或いはいくつかの時点で抑制を示し、アクチビンＡが、これらの胚体外内胚葉細胞型を特定するように作用しないことを示している。このことはさらに、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂの増大された発現が、アクチビンＡに応答した胚体内胚葉細胞の数の増大に起因し得るという事実を支持する。

【図14】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）及びブラキュリ発現（パネルＢ）に対するアクチビンＡの影響を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化に対するアクチビンＡの用量依存的影響が見られないことを実証する。ブラキュリの減少された発現により示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理により媒介される中胚葉分化の顕著な抑制が見られる。これは、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の増大された特定の結果である可能性が高い。より低レベルのアクチビンＡ処理（１０及び３０ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照培養物に対して分化のより後期の時点でブラキュリの発現を維持する。

【図15】図１５Ａ及び図１５Ｂは、アクチビンによる処理に応答した減少された壁側内胚葉分化を示す顕微鏡写真である。ＴＭhi壁側内胚葉の領域は、血清単独中で分化される場合、培養物の至るところで見られる（Ａ）のに対して、アクチビンが包含される場合、ＴＭ+細胞の分化は乏しく（Ｂ）、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。

【図16】図１６Ａ〜図１６Ｄは、アクチビンＡ及びアクチビンＢによる処理に応答したマーカー発現を示す顕微鏡写真である。ｈＥＳＣは、アクチビンＡ及びアクチビンＢにより連続４日間処理して、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡ−ＳＯＸ１７、パネルＢ−ＡＦＰ、パネルＣ−ＴＭ及びパネルＤ−相／ＤＡＰＩ。ＡＦＰ（Ｂ）及びＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な非存在と関連した無数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。

【図17】図１７は、ｈＥＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚体内胚葉及び臓側内胚葉の出現を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域はＡＦＰhi／ＳＯＸ１７lo/-により同定される一方で、胚体内胚葉は、完全に反対のプロファイルであるＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-を示す。この野は、これらの２つの領域の互いに対する近接性に起因して選択的に選択された。しかしながら、何度もＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-領域がＡＦＰhi細胞の任意の領域からの絶対的な単離で観察され、これは臓側内胚葉細胞とは別個の胚体内胚葉細胞の起点を示唆する。

【図18】図１８は、ＴＧＦβファミリーのリガンド及び受容体を表す図である。ＡＲ ｓｍａｄ及びＢＲ ｓｍａｄを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の産生に有用である（J Cell Physiol. 187: 265-76を参照）。

【図19】図１９は、個々のＴＧＦβ因子及びＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。

【図20】図２０は、ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増大を示す棒グラフである。

【図21】図２１は、ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。

【図22】図２２は、アクチビンＡが、ＳＯＸ１７+細胞数の用量依存的増大を誘導することを示す棒グラフである。

【図23】図２３は、アクチビンＡ及びアクチビンＢ処理培養物へのＷｎｔ３ａの添加が、アクチビンＡ及びアクチビンＢ単独により誘導されるレベルを上回ってＳＯＸ１７発現を増大させることを示す棒グラフである。

【図24】図２４Ａ〜図２４Ｃは、胚体内胚葉への分化が低ＦＢＳ状態で増強されることを示す棒グラフである。２％ＦＢＳを含有する培地中（２ＡＡ）でのアクチビンＡ及びＢによるｈＥＳＣの処理は、１０％ＦＢＳ培地（１０ＡＡ）中での同じ処理と比較して、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現をもたらす（パネルＡ）。胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１の誘導（パネルＢ）はまた、同じ方法で影響を及ぼされ、ＡＦＰ（臓側内胚葉）の抑制（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ状態よりも２％ＦＢＳにおいて高い。

【図25】図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＳＯＸ１７+細胞が培養中に分裂していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応性細胞は、ｈＥＳＣコロニーの分化中の縁に存在し（Ｃ、Ｄ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）で標識される（パネルＢ）が、ＯＣＴ４では今のところ標識されていない（パネルＣ）。さらに、明確な有糸分裂の外観が、ＳＯＸ１７+細胞（矢印）並びにＯＣＴ４+の未分化ｈＥＳＣ（矢じり）の両方において核のＤＡＰＩラベリングにより観察することができる（Ｄ）。

【図26】図２６は様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。

【図27】図２７Ａ〜図２７Ｄは、胚体内胚葉マーカーのパネルが、どのようにして図２６で示されるのと同じ分化処理にわたってＣＸＣＲ４と非常に類似した発現のパターンを共有するかを示す棒グラフである。

【図28】図２８Ａ〜図２８Ｅは、中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）に関するマーカーが、どのようにして図２６で示されるのと同じ処理にわたってＣＸＣＲ４発現に対する逆相関を表すかを示す棒グラフである。

【図29】図２９Ａ〜図２９Ｆは、図２６〜図２８で示される３つの培地条件にわたってＳＯＸ１７免疫反応性細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。

【図30】図３０Ａ〜図３０Ｃは、分化培地に添加されるアクチビンＡの増大濃度によるＣＸＣＲ４+細胞数の増大を実証するフローサイトメトリードットプロットである。

【図31】図３１Ａ〜図３１Ｄは、高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞（Ａ１００−ＣＸ＋）が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーに関してさらに一層富化されることを示す棒グラフである。

【図32】図３２は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して単離されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞からの遺伝子発現、並びに母集団における遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４+細胞が各母集団に存在する本質的にすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を含有し、またＣＸＣＲ４-集団がＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんど含有しないか、或いは全く含有しないことを実証する。

【図33】図３３Ａ〜図３３Ｄは、これらの非胚体内胚葉マーカーの発現においてすでに抑制されている高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞における中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）遺伝子発現の欠乏を実証する棒グラフである。

【図34-1】図３４Ａ〜図３４Ｆは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。前述した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＡ〜Ｆそれぞれに関して、ｈＥＳＣと分類した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加無し）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。

【図34-2】図３４Ｇ〜図３４Ｌは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。パネルＧ〜Ｌそれぞれに関して、ｈＥＳＣと分類した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加無し）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。

【図34-3】図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＭに関して、ｈＥＳＣと分類した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加無し）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。

【図35】図３５は、４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）及び線維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）の存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日及び６日後のｈＥＳＣの培養物におけるＰＤＸ１遺伝子の相対発現を示すグラフである。

【図36】図３６Ａ〜図３６Ｆは、４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）及び線維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）の存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日及び６日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＳＯＸ１７、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＳＯＸ１、（Ｅ）ＺＩＣ１及び（Ｆ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。

【図37】図３７Ａ〜図３７Ｃは、４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）の存在下又は非存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日及び８日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７及び（Ｃ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。

【図38】図３８Ａ〜図３８Ｇは、４日目に添加される１μＭ、０．２μＭ又は０．０４μＭのレチノイン酸（ＲＡ）と組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１０と接触させた胚体内胚葉細胞の培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＨＯＸＡ３、（Ｃ）ＨＯＸＣ６、（Ｄ）ＨＯＸＡ１３、（Ｅ）ＣＤＸ１、（Ｆ）ＳＯＸ１及び（Ｇ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。

【図39】図３９Ａ〜図３９Ｅは、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び以下の：血清代替物（ＳＲ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はＢ２７のうちの１つの組合せの存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日及び８日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＺＩＣ１及び（Ｅ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。

【図40】図４０Ａ〜図４０Ｂは、６日後（ＲＡの添加の直前）及び９日目（ＲＡへの暴露の３日後）のｈＥＳＣの培養物における膵臓（ＰＤＸ１、ＨＮＦ６）及び肝臓（ＨＮＦ６）に関するマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のいずれかのアクチビンＡの存在下で、１０ｎｇ／ｍｌ（ａ１０）、２５ｎｇ／ｍｌ（ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（ａ５０）の用量でアクチビンＢの添加を比較するために、様々な条件が包含された。そのアクチビンＡ又はアクチビンＢ無しの条件（ＮＦ）は、胚体内胚葉及びＰＤＸ１陽性内胚葉産生に関する陰性対照として作用する。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１及び（Ｂ）ＨＮＦ６の発現の相対レベルを示す。

【図41】図４１Ａ〜図４１Ｃは、５日目（レチノイン酸の添加の直前）並びにＲＡ暴露の２、４及び６日後（それぞれ７、９及び１１日目）の、１００ｎｇ／ｍｌ（Ａ１００）、５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）を有する、又はアクチビンＡ無し（ＮＦ）のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。各棒の真下のパーセント表示は、３〜５日の分化中のＦＢＳ用量を示す。７日目に開始して、ＲＡ（Ｒ）で処理した細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で成長させた。ＲＡ濃度は、７日目に２μＭ、９日目に１μＭ及び１１日目に０．２μＭであった。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＺＩＣ１、（Ｃ）ＳＯＸ７の発現の相対レベルを示す。

【図42】図４２Ａ、図４２Ｂは、まず胚体内胚葉を誘導させるために低ＦＢＳ中でアクチビンＡで（５日目）、続いてＰＤＸ１発現内胚葉を誘導させるために２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及びＲＡを含む新鮮な（Ａ２５Ｒ）培地、又は様々な条件培地（ＭＥＦＣＭ、ＣＭ＃２、ＣＭ＃３及びＣＭ＃４）及びＲＡで処理したｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。マーカー発現は、５、６、７、８及び９日目に測定された。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＣＤＸ１の発現の相対レベルを示す。

【図43】図４３は、まず胚体内胚葉を誘導させるために低ＦＢＳ中でアクチビンＡで、続いてアクチビンＡ及びレチノイン酸を含む新鮮な培地（Ａ２５Ｒ）、又は新鮮な培地中へ希釈される条件培地中の様々な量のＲＡで処理したｈＥＳＣの培養物におけるＰＤＸ１の相対発現を示すグラフである。培地の総容量は、すべての場合で５ｍｌである。

【図44】図４４は、ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡの添加の３日後（ｄ８）及び４日後（ｄ９）のＲＡ処理した胚体内胚葉細胞から免疫沈降されるＰＤＸ１を示すウェスタンブロットである。

【図45】図４５は、ＰＤＸ１プロモーターの制御下にあるＥＧＦＰレポーターで遺伝的にタグ付けしたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣ）の結果を表示する略式チャートである。

【図46】生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の分取された集団に関するハウスキーピング遺伝子に対して標準化した相対ＰＤＸ１発現レベルを示すグラフである。

【図47】生存細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）、最低のＥＧＦＰシグナル強度を有するＥＧＦＰ陽性細胞集団の半数（Ｌｏ）及び最高のＥＧＦＰシグナル強度を有するＥＧＦＰ陽性細胞集団の半数（Ｈｉ）の分取された集団に関するハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対ＰＤＸ１発現レベルを示すグラフである。

【図48】生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の分取された集団における５つの膵臓内胚葉マーカーのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対発現レベルを示すグラフである。パネル：Ａ−ＮＫＸ２．２、Ｂ−ＧＬＵＴ２、Ｃ−ＨＮＦ３β、Ｄ−ＫＲＴ１９及びＥ−ＨＮＦ４α。

【図49】図４９は、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の分取された集団における２つの非膵臓内胚葉マーカーのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対発現レベルを示すグラフである。パネル：Ａ−ＺＩＣ１及びＢ−ＧＦＡＰ。

【図50】図５０Ａ〜図５０Ｄは、免疫低下マウスの腎臓被膜下に移植される胚体内胚葉細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を示す。パネル：Ａ−腸管様構造を示すヘマトキシリン−エオシン染色、Ｂ−肝細胞特異的抗原に対する抗体免疫反応性（肝臓）、Ｃ−ビリンに対する抗体免疫反応性（腸）及びＤ−ＣＤＸ２に対する抗体免疫反応性（腸）。

【図51】図５１Ａ〜図５１Ｃは、５〜１０日目に２０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ｂ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２と接触させた細胞における肝臓（アルブミン及びＰＲＯＸ１）及び肺（ＴＩＴＦ１）組織に関するマーカーの正規化した相対発現レベルを示すグラフである。ＤＥは、胚体内胚葉を指す。パネル：Ａ−アルブミン、Ｂ−ＰＲＯＸ１及びＣ−ＴＩＴＦ１。

【図52-1】図５２Ａ〜図５２Ｌは、５〜１０日目に２０〜５０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ａ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２、並びに９日目及び１０日目にＢＭＰ４と接触させた細胞における肝臓（ＡＦＰ、ＡＡＴ、ｈＨＥＸ、ＧＬＵＴ２、ＡＰＯＡ１及びＶＣＡＭ１）及び肺（ＶＷＦ及びＣＸＲ４）組織に関するマーカーの正規化した相対発現レベルを示すグラフである。ＤＥは、胚体内胚葉を指す。パネル：Ａ−ＡＦＰ、Ｂ−ＡＡＴ、Ｃ−ＧＬＵＫＯ、Ｄ−ｈＨＥＸ、Ｅ−ＴＡＴ及びＦ−ｈＮＦ４ａ。

【図52-2】図５２Ａ〜図５２Ｌは、５〜１０日目に２０〜５０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ａ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２、並びに９日目及び１０日目にＢＭＰ４と接触させた細胞における肝臓（ＡＦＰ、ＡＡＴ、ｈＨＥＸ、ＧＬＵＴ２、ＡＰＯＡ１及びＶＣＡＭ１）及び肺（ＶＷＦ及びＣＸＲ４）組織に関するマーカーの正規化した相対発現レベルを示すグラフである。ＤＥは、胚体内胚葉を指す。パネル：Ｇ−ＣＹＰ７Ａ、Ｈ−ＧＬＵＴ２、Ｉ−ＡＰＯＡ１、Ｊ−ＶＣＡＭ１、Ｋ−ＶＷＦ及びＬ−ＣＸＣＲ４。

【発明を実施するための形態】

【0065】

［詳細な説明］
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸形成は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である（Lu et al., 2001；Schoenwolf and Smith, 2000）
。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay et al., 2000；Wells and Melton,
1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼
ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質である。

【0066】

原腸形成中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特殊化された構造）を通して移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に存在し、そして腸管の後端の形成に伴って終了する。

【0067】

胚体内胚葉細胞及びそれらに由来する内胚葉細胞は、胚体内胚葉系統に由来する最終分化された組織及び／又は器官を構成する細胞の派生に関する重要な多分化能開始点を表す。かかる細胞、組織及び／又は器官は、細胞療法において極めて有用である。したがって、胚体内胚葉細胞系統に由来する他の細胞型への胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１発現内胚葉細胞の分化を引き起こすことが可能な分化因子を同定するための本明細書中に記載する方法は、細胞療法の向上に有益である。

【0068】

特に、本発明のいくつかの実施形態は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱を包含する（これらに限定されない）組織及び／又は器官に関する前駆体である細胞への胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能である細胞へＰＤＸ１陽性内胚葉細胞及び／又は胚体内胚葉細胞を含む細胞集団における細胞を分化させるのに有用である１つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。

【0069】

胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性内胚葉の組成物、並びにかかる細胞を産生するのに有用な方法及び組成物に関するさらなる態様もまた本明細書中に記載される。

【0070】

定義
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する：

【0071】

本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一受精卵で開始し、発達した配偶子細胞以外の多能性又は全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発達段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移植により得られる胚を指す。

【0072】

本明細書中で用いる場合、「多分化能」又は「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定細胞型を生じ得る細胞型を指す。

【0073】

本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、並びに材料又は物質の産
生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の測定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、或いは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。

【0074】

本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写体、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子（例えば１０，０００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して用いられる場合、「部分」という用語は、単細胞から細胞培養物又は細胞集団全体の範囲である任意のゼロでない量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。

【0076】

細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という語句は、細胞培養物又は細胞集団を含有しない特殊化細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在する、ということを意味する。

【0077】

本明細書中で使用する場合、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、並びにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。

【0078】

「条件培地」とは、基本培地と比較して変更される培地を意味する。

【0079】

本明細書中で使用する場合、「前腸／中腸」は、腸管の前方部分の細胞並びに腸管の中間部分の細胞（前腸／中腸接合部を含む）を指す。

【0080】

胚体内胚葉細胞及びそれらに関連するプロセス
本明細書中に記載する実施形態は、幹細胞のような多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へ分化させることによる培養物中での胚体内胚葉細胞の産生のための新規規定プロセスに関する。上述したように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉又は中胚葉から産生される組織へ分化するのではなく、腸管並びに腸管に由来する器官へ分化する。或る特定の好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。かかるプロセスは、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺及び胸腺のような組織に由来するヒト内胚葉の効率的な産生に関する基盤を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の産生は、機能的なインスリン生産β細胞への幹細胞の分化における第１の工程であり得る。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島／β細胞最終結果物に到達する前に起きる分化工程それぞれに関して、高効率の分化が望まれる。胚体内胚葉細胞への幹細胞の分化は、機能的な膵臓島／β細胞の産生に対しておそらく一番初めの工程を表す（図１に示されるように）ため、この工程での高効率の分化が特に望まれる。

【0081】

胚体内胚葉細胞への多能性細胞の効率的な分化の望ましさに鑑みて、本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかの態様は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の転換が約５０〜８０％で生じるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。典型的には、このような方法は、限定的
及び一時的に特定された様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。胚体内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、胚体内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることにより、集団中の他の細胞からの胚体内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成され得る。

【0082】

細胞培養物又は細胞集団中の胚体内胚葉細胞の量を測定するため、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望まれる。したがって、本明細書中に記載される或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが胚体内胚葉に特
異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、測定するための方法に関する。

【0083】

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４，ＯＣＴ４、ＡＦＰ，ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３６、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ，ＣＡＬＣＲ、ＦＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、並びに本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写体の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的割合を同定すると共に測定するために用いられる。

【0084】

１つ又は複数の適切なマーカーの発現を測定するための上述に記載したような方法を使用することにより、胚体内胚葉細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団における胚体内胚葉細胞の比率を測定することが可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁大きいレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも２桁を超えるレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁以上大きいレベルでＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１を実質的に発現しない。

【0085】

本明細書中に記載される実施形態は、胚体内胚葉組成物にも関する。例えばいくつかの実施形態は胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するが、一方、他の実施形態は、胚体内胚葉細胞中に富化された細胞集団に関する。いくつかの好ましい実施形態は、細胞培養物中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。特に好ましい実施形態は、細胞培養物中のヒト細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞を含む細胞培養物に関する。分化手法の効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。他の好ましい実施形態では、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団への多能性細胞集団、例えば幹細胞集団の転換が意図される。

【0086】

本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば胚体内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発達の初期をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えば胚体内胚葉は限られた数の組織のためだけの供給源として役立つため、それは純粋組織又は細胞型の発達に用いられ得る。

【0087】

多能性細胞からの胚体内胚葉の産生
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化された細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に、そして２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉(DEF
INITIVE ENDODERM)という表題の米国特許第１１／０２１，６１８号に記載されている。
これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化された細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。かかる多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。かかる方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に記載されている。

【0088】

胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に保持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に保持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの保持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの保持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号に記載されている。

【0089】

本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に保持され得る。いくつかの胚性幹細胞保持手法では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号に記載される技法が用いられる。

【0090】

幹細胞は、それらが胚体内胚葉へ分化されることを望まれるまで、ルーチンの継代培養により多能性状態で培養物中で維持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物へ供給することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の成長因子のいずれかの組合せが使用され得る。

【0091】

胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するように、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。

【0092】

胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの付加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、それらの付加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約
１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの付加後約４日で除去される。

【0093】

胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清を含有する培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、又は約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いずに増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。

【0094】

胚体内胚葉への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を測定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより測定される。或いは或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより判定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法は、マーカー遺伝子発現を定量するためにも用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が判定される。

【0095】

以下の実施例でさらに記載するように、胚体内胚葉の信頼性の大きいマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞は、原始及び臓側内胚葉の特徴であるＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する（表１を参照）ため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣの特徴であるＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。

【0096】

胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、細胞表面ケモカイン受容体をコードし、そのリガンドは、化学誘引物質ＳＤＦ−１である。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主要な役割は、骨髄への造血細胞の遊走、リンパ球輸送並びに様々なＢ細胞及びマクロファージ血液細胞系統の分化であると考えられる［Kim,
C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体はま
た、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の進入のための共受容体として機能する［Feng, Y., et al. Science, 272, 872-877 (1996)］。［McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその特有のリガンドであるＳＤＦ−１［Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達に
おけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される［Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463-471 (1999)］場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、ＣＸＣＲ４は、ＲＮアーゼ保護及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸形成胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の遊走を誘導することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２−７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している［McGrath, K.E. et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。

【0097】

多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するために、ＣＸＣＲ４の発現をモニタリングすることができる。さらに、本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１を包含する（これらに限定されない）胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。

【0098】

内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＳＯＸ１７の発現を妨げないことが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を実質的に発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を実質的に発現するものではない。

【0099】

ＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、分化条件に応じて、胚体内胚葉細胞において多種多様なレベルにわたって誘導されることが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも、少なくとも約４倍高いか、少なくとも約６倍高いか、少なくとも約８倍高いか、少なくとも約１０倍高いか、少なくとも約１５倍高いか、少なくとも約２０倍高いか、少なくとも約４０倍高いか、少なくとも約８０倍高いか、少なくとも約１００倍高いか、少なくとも約１５０倍高いか、少なくとも約２００倍高いか、少なくとも約５００倍高いか、少なくとも約７５０倍高いか、少なくとも約１０００倍高いか、少なくとも約２５００倍高いか、少なくとも約５０００倍高いか、少なくとも約７５００倍高いか、或いは少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施
形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも飛躍的に高い。

【0100】

同様に、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現と比較して増大されていることが理解されよう。

【0101】

さらに、胚体内胚葉細胞中でのＳＯＸ７マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に一定の差が存在する、と理解される。同様に、胚体内胚葉細胞中でのＣＸＣＲ４マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に一定の差が存在する。このようなものとして、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ＳＯＸ７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルより少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、ＳＯＸ７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１０，０００倍高い。いくつかの実施形態では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーは、胚体内胚葉細胞中で有意に発現されない。

【0102】

同様に、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞におけるＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７の発現と比較して増大されていることが理解されよう。

【0103】

胚体内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、かかる細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び／又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。かかる分子としては、ＳＤＦ−１フラグメント、ＳＤＦ−１融合体又はＳＤＦ−１模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0104】

抗体を作製し、また細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、かかる方法は、本明細書中に記載する抗体及び胚体内胚葉細胞を用いた使用に実施することができる。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後
、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物において胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズ結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界中へ細胞／抗体／ビーズ複合体をさらす。いったん胚体内胚葉細胞が培養物において他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は崩壊されて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度平板培養される。

【0105】

富化、単離又は精製された胚体内胚葉細胞培養物又は集団を得るためのさらなる方法もまた使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体を、細胞間接着及び基材接着を低減させるように処理した胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能な二次抗体（例えば、ＦＩＴＣ接合化抗体）とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、緩衝液中に再懸濁させる。次に、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析及び選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞と分離して収集して、それによりかかる細胞型を単離する。望ましい場合、単離細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することにより、或いは胚体内胚葉に特異的な同じか、又は異なるマーカーを使用したさらなる一連の選別によりさらに精製することができる。

【0106】

さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンド又は他の分子を使用して、富化、単離及び／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子は「ＳＤＦ−１又はそれらのフラグメント、融合体又は模倣体である。

【0107】

好ましいプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統へと分化するように誘導された後、他の非胚体内胚葉細胞から富化、単離及び／又は精製される。上述の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階でかかる培養物を用いて使用することができると理解されよう。

【0108】

直前で記載された手法に加えて、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。

【0109】

本明細書中に記載する方法を使用して、胚体内胚葉細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製された集団は、少なくともいくつかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団（例えば、幹細胞培養物又は集団）からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。
いくつかの方法では、細胞は、無作為な分化を受ける。しかしながら、好ましい方法では、細胞は、主として胚体内胚葉へ分化するように指示される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に
関する。本明細書中に記載する方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約２〜約１０００倍、胚体内胚葉含有量が富化され得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約５〜約５００倍富化され得る。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約１０〜約２００倍富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約２０〜約１００倍富化され得る。さらなる他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約４０〜約８０倍富化され得る。或る特定の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約２〜約２０倍富化され得る。

【0110】

胚体内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉を富化された細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％以上の多能性細胞の胚体内胚葉への転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。

【0111】

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、胚体内胚葉細胞の両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個毎の多能性細胞に関して少なくとも約９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。さらに、他の割合の胚体内胚葉細胞対多能性細胞を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０，０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約２個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約２０個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約５０個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０００個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１０，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１００，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個毎の多能性細胞に関して少なくとも約１，０００，０００個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定のいくつかの実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発達した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。

【0112】

本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の胚体内胚葉細胞から少なくとも約９５％の胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えば或る特定の特異的な実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％から少なくとも約９５％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、又は９０％より多くが胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0113】

本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、又は９５％より多くのヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0114】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％から少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記パーセントは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0115】

本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％のヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回るヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記パーセントは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0116】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含
む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％から少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記パーセントは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0117】

本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。

【0118】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％から少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。

【0119】

本明細書中に記載するさらなる他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。

【0120】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細
胞集団のような組成物に関するが、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％から少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。

【0121】

本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される胚体内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１又はＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。

【0122】

一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた胚体内胚葉細胞の説明は、ＳＯＸ１７高、ＭＩＸＬ１高、ＡＦＰ低、ＳＰＡＲＣ低、トロンボモジュリン低、ＳＯＸ７低及びＣＸＣＲ４高である。

【0123】

発達中のＰＤＸ１遺伝子発現
ＰＤＸ１（ＳＴＦ−１、ＩＤＸ−１及びＩＰＦ−１とも呼ばれる）は、膵臓及び吻側十二指腸の発達に必要な転写因子である。ＰＤＸ１はまず、マウスにおけるＥ８．５に始まって、後方前腸内胚葉から生じ、且つ外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を産生する膵臓内胚葉で発現される。後に、ＰＤＸ１は、膵臓内分泌部のβ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成体において維持される。ＰＤＸ１はまた、発達初期に、形成中の膵臓に隣接している十二指腸内胚葉で、続いて十二指腸細胞及び腸内分泌細胞で、胃洞で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管で発現される。この発現領域もまた、膵臓での発現が制限されるようになる時点で、大部分が吻側十二指腸へ制限されるようになる。

【0124】

ＰＤＸ１陽性細胞及びそれに関連するプロセス
本明細書中に記載する他の分化プロセスの実施形態は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の産生のための新規に規定されたプロセスに関し、ここでＰＤＸ−１陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸／中腸領域に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞（ＰＤＸ−１陽性前腸／中腸内胚葉）である。いくつかの好ましい実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞（ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉）である。さらなる好ましい実施形態は、前腸の後方部分のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸領域の後方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。

【0125】

本明細書中に記載する方法により産生されるもののようなＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、完全に分化されたインスリン生産β細胞を産生するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するように、ＰＤＸ１を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、本明細書中で胚体内胚葉とも称される）を分化させることにより産生される。ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、本明細書中に記載するように、或いは任意の他の既知の方法により、胚性幹細胞のような多能性細胞を分化させることにより調製することができる。多能性細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉を産生する利便性の高く且つ非常に効率的な方法は、すでに本明細書中で、及び２００４年１２月２３日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許第１１／０２１，６１８号に記載されている。

【0126】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生するプロセスは、多能性細胞からの腺房細胞、導管細胞及び島細胞のような膵臓組織の効率的な産生に関する基盤を提供する。或る特定の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ヒトＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に由来し、またヒトＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣ細胞に由来する。続いて、これらのヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、機能的インスリン生産β細胞を産生するのに使用することができる。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島／β細胞最終形に到達する前に起きる分化工程それぞれに関して、高い効率の分化が望ましい。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化は、機能的膵臓島／β細胞の産生に対して初期工程を表す（図１に示されるように）ため、この工程での高効率の分化が特に望ましい。

【0127】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の効率的な分化の望ましさを考慮して、本明細書中に記載するプロセスのいくつかの態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞のおよそ２〜２５％の変換をもたらすｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ方法論に関する。通常、かかる方法は、規定され、且つ時間的に指定された形式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へ特異的に結合する試薬を使用することにより、集団における他の細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成することができる。代替法として、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１発現の検出を可能にするように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子で標識することができる。続いて、かかる蛍光標識された細胞は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により精製することができる。本発明のさらなる態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団、並びにＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への及びＰＤＸ１陽性前腸内胚葉からの分化に有用な因子を同定する方法に関する。

【0128】

細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の量を測定するためには、培養物又は集団においてこの細胞型を他の細胞と識別する方法が望ましい。したがって、本明細書中に記載する或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示す細胞マーカー、並びにかかるマーカーの発現を検出及び測定する方法に関する。

【0129】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現のレベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定される。例えば、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）及び／又は本明細書中に記載する他のマーカーのような或る特定の遺伝子マーカーにより産生される転写物の量は、Ｑ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態では、免疫組織化学は、上述の遺伝子により発現されるタンパク質を検出するのに使用される。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法がともに、かかるマーカーの量又は相対比率を同定及び測定するのに使用される。

【0130】

本明細書中に記載する分化方法及び検出方法を使用することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の比率を測定することが可能である。例えば、いくつかの実施形態では、産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞又は細胞集団よりも少なくとも約２桁大きいレベルでＰＤＸ１遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞又は細胞集団よりも約２桁を超えるレベルでＰＤＸ１遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁もしくは２桁以上大きいレベルでＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及
びＨＯＸＣ６から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。

【0131】

本明細書中に記載する組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば、ＰＤＸ１陽性内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにかかる細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発達における初期段階をモデル化するのに有用である。さらに、本明細書中に記載する組成物及び方法はまた、真性糖尿病のような疾患状態において治療的介入に役立ち得る。例えば、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は、限定数の組織のみで供給源として作用するため、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は、純粋な組織又は細胞型の発達に使用され得る。

【0132】

ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生
本明細書中に記載されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含むＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物及び集団は、上述されたような多能性細胞から生成されるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉から産生される。好ましい方法は、出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、ｈＥＳＣはまず、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞へ変換されて、続いてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へ変換される。しかしながら、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を使用して産生される胚体内胚葉細胞に限定されるものではないことが理解されよう。むしろ、任意のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載する方法で使用することができる。

【0133】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団へのさらなる分化に使用することができる。例えば、ヒトＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はまた、先の分化工程（すなわち、多能性細胞を胚体内胚葉細胞へ分化させる工程）から残存している分化因子（例えば、アクチビン、ノーダル及び／又はＢＭＰ）を含んでもよい。他の実施形態では、先の分化工程で利用される因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の分化に使用される因子の添加に先立って、細胞培養物又は細胞集団から除去される。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞に関して富化された細胞集団が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として使用される。

【0134】

培養物におけるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物へ、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への細胞の分化を促進する分化因子（前腸分化因子）を供給することにより、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へ分化される。本発明のいくつかの実施形態では、前腸分化因子は、レチノイン酸（ＲＡ）のようなレチノイドである。いくつかの実施形態では、レチノイドは、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０）と併用される。他の実施形態では、レチノイドは、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリー及び／又は条件培地と併用される。

【0135】

上記で定義するように、「条件培地」という語句は、基本培地と比較して変更された培地を指す。例えば、培地の条件付けは、栄養分及び／又は成長因子のような分子を、基本培地に見られる元のレベルに添加してもよく、或いは元のレベルから除去してもよい。いくつかの実施形態では、培地は、或る特定の型の細胞を、或る特定の期間、或る特定の条件下で培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。例えば、培地は、規定温度で規定時間、規定組成を有する培地中で拡張、分化又は維持させることにより条件付けすることができる。当業者に理解されるように、細胞、培地型、所要時間及び環境条件の無数の組合せを使用して、ほぼ無限の一連の条件培地を産生することができる。本発明のいくつかの実施形態では、培地は、分化された多能性細胞を、血清濃度約１％〜約２０％を含む培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。他の実施形態では、培地は
、分化された多能性細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。さらに他の実施形態では、培地は、分化された多能性細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。好ましい実施形態では、条件培地は、分化されたｈＥＳＣを、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び約２μＭのＲＡを含む培地（例えば、ＲＰＭＩ）中で２４時間、成長又は維持させることにより調製される。

【0136】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、培地を条件付けするのに使用され、且つＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化を増強するのに使用される細胞は、血清約０％〜約２０％及び／又は１つ又は複数のＴＧＦβスーパーファミリーの成長／分化因子を含むＲＰＭＩのような培地中で約５日間にわたって、ｈＥＳＣのような多能性細胞から分化される細胞である。アクチビンＡ及びＢＭＰ４のような分化因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される。本発明の特定の実施形態では、培地を条件付けするために使用される細胞は、低血清ＲＰＭＩで約５日間にわたってｈＥＳＣから分化される。いくつかの実施形態によれば、低血清ＲＰＭＩは、低血清含有培地を指し、ここでは血清濃度が規定期間にわたって徐々に増大される。例えば、一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞成長の１日目に約０．２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞成長の２日目に約０．５％ＦＢＳ、及び細胞成長の３日〜５日目に約２％ＦＢＳの濃度を含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、及び３日〜６日目に約２％の濃度を含む。或る特定の好ましい実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、アクチビンＡ及びＢＭＰ４のような１つ又は複数の分化因子が補充される。培地を条件付けするのに使用される細胞を調製する際の使用に加えて、低血清ＲＰＭＩは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化のための培地として使用することができる。

【0137】

条件培地は、かかる培地がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の成長又は維持を妨害しなければ、ＲＰＭＩ以外の培地から調製することができることが当業者には理解されよう。同様に、培地を条件付けするのに使用される細胞は様々なタイプであり得ることが理解されよう。分化したばかりの細胞が、培地を条件付けするのに使用される実施形態では、培地がかかる細胞の成長又は維持を妨害しなければ、かかる細胞をＲＰＭＩ以外の培地中で分化させることができる。さらに、条件付けの所要期間も条件付けに使用される細胞の調製の所要期間も、他の期間であっても本明細書中に報告される効果を達成するのに十分であるため、それぞれ２４時間又は５日である必要がないことは当業者に理解されよう。

【0138】

概して、線維芽細胞成長因子、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーの成員、条件培地又はこれらの前腸分化因子のいずれかの組合せと併せたレチノイドの使用は、レチノイド単独の使用よりも、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉のより多くの分化を引き起こす。好ましい実施形態では、ＲＡ及びＦＧＦ−１０はともに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物へ供給される。別の好ましい実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、条件培地、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＲＡを含む培養物中で分化される。

【0139】

本明細書中に記載する分化プロセスの実施形態のいくつかに関して、上述の前腸分化因子は、これらの因子が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で、細胞培養物又は細胞集団中に存在するように、細胞へ供給される。先に定義したように、細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して使用される場合、「一部」という用語は、細胞培養物又は細胞集団の１つの細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの任意のゼロではない量を意味する。

【0140】

本明細書中に記載するプロセスのいくつかの実施形態では、レチノイドは、レチノイドが少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞へ供給される。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。

【0141】

本明細書中に記載するプロセスの他の実施形態では、線維芽細胞成長因子ファミリーの１つ又は複数の分化因子は、細胞培養物中に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ又は少なくも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在し得る。さらなる実施形態では、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ又は少なくも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０（しかし、両方ではない）は、ＲＡと共に細胞培養物へ供給される。好ましい実施形態では、ＲＡは、１μＭで細胞培養物中に存在し、ＦＧＦ−１０は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0142】

本明細書中に記載するプロセスのいくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子及び／又は条件培地は、細胞培養物中に存在する。これらの分化因子は、ＲＡ及び／又は他の中−前腸分化因子（ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０を包含するが、これらに限定されない）と併用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ又は少なくも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在し得る。さらなる実施形態では、条件培地は、総培地の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくも約１００％の濃度で細胞培養物中に存在する。いくつかの実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ及び条件培地は、ＲＡと共に細胞培養物へ供給される。好ましい実施形態では、ＰＤＸ−１陰性胚体内胚葉細胞は、約１μＭ ＲＡ、約２５ｎｇ／ｍｌのア
クチビンＡ及び分化されたｈＥＳＣにより約２４時間条件付けした低血清ＲＰＭＩ培地（ここで、分化されたｈＥＳＣは、約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む低血清ＲＰＭＩ中で約５日間分化させたものである）を含む培養物中で、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞
へ分化される。別の好ましい実施形態では、アクチビンＢ及び／又はＦＧＦ−１０もまた、それぞれ２５ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌで培養物中に存在する。

【0143】

本明細書中に記載するプロセスの或る特定の実施形態では、上述の前腸分化因子は、それの添加後に細胞培養物から除去される。例えば、前腸分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去され得る。

【0144】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の培養物は、低減された血清を含有する培地中で成長させることができる。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物を用いて成長させる。例えば、或る特定の実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清を用いずに成長させる。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物を用いて成長させる。

【0145】

さらに他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、Ｂ２７の存在下で成長させる。かかる実施形態では、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、或いは約２０％（ｖ／ｖ）を上回る濃度で、培養培地へ供給され得る。或る特定の実施形態では、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。或いは、添加されるＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液強度の倍数でもって測定され得る。例えば、Ｂ２７は、５０倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad, CA)から入手可能である。十分な容量の成長培地へこのストック溶液を十分量添加することにより、所望の量のＢ２７を補充した培地が生じる。例えば、成長培地９０ｍｌへ５０倍Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを添加することにより、５倍Ｂ２７を補充した成長培地が生じる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍及び約２０倍以上であり得る。

【0146】

ＰＤＸ１陽性内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化のモニタリング
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化と同様に、ＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への分化の進行は、これらの細胞型の特徴的なマーカー発現を測定することによりモニタリングすることができる。かかるモニタリングにより、様々な条件（例えば、１つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件）下での所望の量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生に十分な時間を判定することが可能となる。好ましい実施形態で
は、所望の量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生に十分な時間は、ＰＤＸ１の発現を検出することにより測定される。いくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより測定される。或いは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより判定することができる。かかる実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上述したように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量化する好ましい方法は、Ｑ−ＰＣＲの使用によるものである。特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量化することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉培養物の細胞の進行をモニタリングするのに使用される。同様に、当該技術分野で既知の他の方法を使用して、マーカー遺伝子発現を定量化することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、そのマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することにより検出することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにＰＤＸ１陰性胚体内胚葉であるｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が判定される。

【0147】

以下の実施例でさらに記載されるように、ＰＤＸ１は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に関連するマーカー遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスのいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１の発現が測定される。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉において発現される他のマーカー（ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６を包含するが、これらに限定されない）の発現もまた測定される。ＰＤＸ１はまた或る特定の他の細胞型（すなわち、臓側内胚葉及び或る特定の神経外胚葉）により発現され得るため、本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、臓側内胚葉及び／又は神経外胚葉に関連するマーカー遺伝子発現の非存在又は実質的な非存在を実証することに関する。例えば、いくつかの実施形態では、臓側内胚葉及び／又は神経細胞において発現されるマーカーの発現（ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭを包含するが、これらに限定されない）が測定される。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する方法により産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスにより産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉及び／又は神経細胞を実質的に含まない。

【0149】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の富化、単離及び／又は精製
本明細書中に記載されるプロセスのさらなる態様に関しては、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は富化され、単離され且つ／又は精製され得る。いくつかの実施形態では、このような細胞を細胞培養物から単離することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関して富化された細胞集団が産生される。

【0150】

本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は蛍光標識され、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いることにより標識されていない細胞から単離される。このような実施形態では、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸、又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、ＰＤＸＩ陽性細胞を標識する。例えばいくつかの実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片の少なくとも１つのコピーは、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的に活性な断片の発現がＰＤＸ１プロモーターの制御下にあるよう、ＰＤＸ１プロモーターの下流で、多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１をコードする核酸の全コード領域は、ＧＦＰをコードする核酸
又はその生物学的に活性な断片により置き換えられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片は、フレーム内で、ＰＤＸ１をコードする核酸の少なくとも一部分と融合され、それにより融合タンパク質を生成する。このような実施形態では、融合タンパク質は、ＧＦＰと類似の蛍光活性を保持する。

【0151】

蛍光標識される細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように胚体内胚葉に、次にＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に分化される。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現する一方、ＰＤＸ１陰性細胞は発現しないため、これら２つの細胞型が分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識ＰＤＸ１陽性細胞及び非標識ＰＤＸ１陰性細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて選別される。ＰＤＸ１陽性細胞は、ＰＤＸ１陰性細胞と別個に収集され、それによりこのような細胞型が単離される。所望により、単離細胞組成物はさらに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに数回選別することにより精製され得る。

【0152】

直前で記載された手法のほかに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらにＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、該ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。

【0153】

上記の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階で、このような培養物とともに用いられ得る、と理解される。

【0154】

本明細書中に記載される方法を用いて、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製集団が、少なくともいくらかの分化を受けたＳＯＸ１陽性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの実施形態
では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主としてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ産生に関する。

【0155】

本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約１０００倍、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞含有物を富化され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍〜約８０倍、富化され得る。或る特定のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、未処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍〜約２０倍、富化され得る。

【0156】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含む組成物
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）である。或る特定の実施形態によれば、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、これらの細胞はヒト細胞である。

【0157】

本明細書中に記載する他の実施形態は、ｈＥＳＣ、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ
１陽性前腸内胚葉細胞及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型の細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、培養物において総細胞の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、培養物において総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。さらなる他の実施形態では、中胚葉細胞は、培養物において総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。

【0158】

本明細書中に記載するさらなる実施形態は、主要細胞型としてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含む本明細書中に記載するプロセスにより産生される細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載するプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％又は少なくとも約５１％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。他の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも６％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％又は少なくとも約１％のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は集団におけるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のパーセントは、培養物中に存在するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0159】

本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及びＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の混合物を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。例えば、約９５のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態では、約５のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約９５のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対するＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の他の比を含む細胞培養物又は細胞集団も意図される。例えば、約１，０００，０００のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１００，０００のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０，０００のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０００のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約５００のＰＤ
Ｘ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１００のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約５のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約４のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約２のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約４のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２０のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５０のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０００のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０，０００のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００，０００のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び約１のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１，０００，０００のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。

【0160】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が産生されるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ヒト多能性幹細胞のようなヒト多能性細胞に由来する。或る特定の実施形態では、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、胚期を過ぎて発達した多細胞構造の生殖腺組織又は胚組織に由来する。

【0161】

本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を包含するヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＰＤＸ１マーカーの発現は、少なくとも約２％のヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、ＰＤＸ１マーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞において、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９８％のヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞のパーセント（ここで、ＰＤＸ１マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い）は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0162】

本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約２％〜少なくとも約９８％を上回るヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩ
Ｃ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多いことが理解されよう。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞において、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９８％のヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞のパーセント（ここで、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い）は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0163】

本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＰＤＸ１マーカーの発現は、少なくとも約２％の内胚葉細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、ＰＤＸ１マーカーの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞において、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９８％の内胚葉細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。

【0164】

本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約２％の内胚葉細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞において、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚
葉細胞において、或いは少なくとも約９８％の内胚葉細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。

【0165】

本明細書中に記載するプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まないＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載する方法により産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含まない。

【0166】

一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づくＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の記述は、ＰＤＸ１高、ＡＦＰ低、ＳＯＸ７低、ＳＯＸ１低、ＺＩＣ１低且つＮＦＭ低である。

【0167】

ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の発現の増大
本明細書中に記載するプロセスのいくつかの態様は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大させる方法に関する。かかる実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大させるのに十分な量で、分化因子と接触させる。分化因子と接触するＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性であってもＰＤＸ１陽性であってもよい。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドであり得る。或る特定の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を、約０．０１μＭ〜約５０μＭの範囲の濃度でレチノイドと接触させる。好ましい実施形態では、レチノイドはＲＡである。

【0168】

本明細書中に記載するプロセスの他の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞を、線維芽細胞成長因子ファミリーの分化因子と接触させることにより増大される。かかる分化因子は、単独で、或いはＲＡと併用して使用され得る。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で線維芽細胞成長因子と接触させる。好ましい実施形態では、ＦＧＦ成長因子は、ＦＧＦ−１０である。

【0169】

本明細書中に記載するプロセスのいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞をＢ２７と接触させることにより増大される。この分化因子は、単独で、或いはレチノイド及びＦＧＦファミリー分化因子の一方又は両方と併用して使用され得る。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度でＢ２７と接触させる。好ましい実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を、ＲＡ、ＦＧＦ−１０及びＢ２７と接触させる。

【0170】

ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大させる方法は、低減された血清を含有するか、或いは血清を含有しない成長培地中で実施され得る。いくつかの実施形態では、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性細胞は、血清代替物を用いて成長する。

【0171】

胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る因子の同定
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも１つの分化因子を同定する方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を提供される。候補分化因子の提供の前であるか又はほぼ同じである第１の時点で、マーカーの発現が測定される。或いはマーカーの発現は、候補分
化因子の提供後に測定され得る。第１の時点の後であり、候補分化因子を細胞集団に提供する工程の後である第２の時点で、同一マーカーの発現が再び測定される。候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第１の時点でのマーカーの発現を、第２の時点でのマーカーの発現と比較することにより測定される。第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は減少される場合には、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る。

【0172】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞集団又は細胞培養物を利用する。例えば細胞集団は、ヒト胚体内胚葉細胞の実質的に精製された集団であり得る。或いは細胞集団は、ヒト胚体内胚葉細胞の富化集団であるが、この場合、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９７％以上が、ヒト胚体内胚葉細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態では、細胞集団は、ヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも８５％以上がヒト胚体内胚葉細胞であるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態では、上記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９５％以上がヒト胚体内胚葉細胞である。本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、細胞集団は、いくつかのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む（これに限定されない）ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞をさらに含む。

【0173】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の実施形態では、細胞集団は、候補（試験）分化因子と接触されるか、そうでなければそれを提供される。候補分化因子は、ヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進する能力を有し得る任意の分子を含み得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の型の細胞に関する分化因
子であると知られている分子を含む。代替的な実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。

【0174】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子は、約１０，０００ａｍｕ以下の分子量を有する分子である。いくつかの実施形態では、小分子はレチノイドを含む。いくつかの実施形態では、小分子はレチノイン酸を含む。

【0175】

本明細書中に記載される他の実施形態では、候補分化因子はポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチド、例えば糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキン又は成長因子であり得るが、これらに限定されない。好ましいポリペプチドとしては、成長因子が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、候補分化因子は、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４、ＦＧＦ２及びＷｎｔ３Ｂから成る群から選択される1つ又は複数の成長因子を含む
。

【0176】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激剤、ＩＬ−１６、サイモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／アポ−２、プレＢ細胞コロニー増強因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞強化因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質８（骨原性タンパク質２）、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症タンパク質１−α）、グリアブラストーマ細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝細胞腫由来成長因子、ニューロメジンＵ−２５前駆体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ前駆体、胸腺樹状細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンＤ3、表皮成長因子（ＥＧＦ）、
脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ、β神経成長因子、アクチビンＡ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球系促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ2、インスリン増殖因子−１（ＩＧ
Ｆ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニュートロフィン増殖因子（ＮＧＦ）、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、グリア由来ネキシン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンフォテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、ヒト甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、性腺刺激ホルモン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン放出抑制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、上皮小体ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、レラキシン、アンギオテンシンＩＩ、カルシトリオール、心房性ナトリウム利尿ペプチド及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフェリン、アンドロスチエン（androstiene）、カル
シトリオール、コラーゲン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンフォテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン及びＴＷＳ１１９から成る群から選択される1つ又は複数の成長因子を含む。

【0177】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の濃度で、細胞集団に提供される。いくつかの実施形態では、候補分化因
子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であるよう、細胞集団に提供される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌであるか、又は約１０００μｇ／ｍｌより高い。

【0178】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定のいくつかの実施形態では、細胞集団は、前腸分化因子以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。例えばいくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイド、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーの一成員、ＦＧＦ１０又はＦＧＦ４以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイン酸以外の任意の分子を含む候補分化因子を提供される。

【0179】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるスクリーニング方法の工程は、第１の時点及び第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを包含する。これらの実施形態のいくつかでは、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供する前、又はそれとほぼ同時期であり得る。或いはいくつかの実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供した後である。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現は、第１の時点で測定される。

【0180】

第１の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することのほかに、本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、第１の時点の後であり且つ候補分化因子を細胞集団に提供した後である第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を測定することを意図する。このような実施形態では、同一マーカーの発現が、第１及び第２の時点の両方で測定される。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現が、第
１及び第２の時点の両方で測定される。そのような実施形態では、同一の複数のマーカーの発現が、第１及び第２の時点の両方で測定される。いくつかの実施形態では、その各々が第１の時点の後であり、且つその各々が候補分化因子を細胞集団に提供した後である複数の時点で、マーカー発現が測定される。或る特定のいくつかの実施形態では、マーカー発現はＱ−ＰＣＲにより測定される。他の実施形態では、マーカー発現は免疫細胞化学により測定される。

【0181】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定のいくつかの実施形態では、その発現が第１及び第２の時点で測定されるマーカーは、腸管由来である組織及び／又は器官を作り上げる細胞の前駆体である細胞へのヒト胚体内胚葉細胞の分化に関連するマーカーである。いくつかの実施形態では、腸管に由来する組織及び／又は器官は、最終分化細胞を含む。いくつかの実施形態では、マーカーは、膵臓細胞又は膵臓前駆体細胞を示す。好ましい実施形態では、マーカーは、膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）である。他の実施形態では、マーカーはホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）又はホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）である。さらに、他の実施形態では、マーカーは肝細胞又は肝臓前駆体細胞を示す。或る特定の好ましい実施形態では、マーカーは、アルブミン、肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）又はプロスペロ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）である。他の実施形態では、マーカーは、肺又は肺前駆体細胞を示す。いくつかの好ましい実施形態では、マーカーは、甲状腺転写因子１（ＴＩＴＦ１）である。さらに他の実施形態では、マーカーは、腸又は腸前駆体細胞を示す。付加的な好ましい実施形態では、マーカーは、ビリン、グルコース輸送体−２（ＧＬＵＴ２）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、血管細胞接着分子−１（ＶＡＣＭ１）、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）、ＣＸＣ型ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）又はコーダルタイプホメオボックス転写因子２（ＣＤＸ２）である。さらに他の実施形態では、マーカーは、胃又は胃前駆体細胞を示す。付加的な好ましい実施形態では、マーカーは、ＶＣＡＭ１、ＶＷＦ又はＣＸＣＲ４である。他の実施形態では、マーカーは甲状腺又は甲状腺前駆体細胞を示す。そのような実施形態では、マーカーはＴＩＴＦ１である。さらなる他の実施形態では、マーカーは、胸腺又は胸腺前駆体細胞を示す。

【0182】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供することと、第２の時点でのマーカー発現を測定することとの間に十分な時間を経過させる。候補分化因子を細胞集団に提供することと第２の時点でのマーカーの発現を測定することとの間の十分な時間は、約１時間という短い時間から、約１０日間という長い時間までであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に提供した後の複数の時点で測定される。いくつかの実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７８時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０２時間、少なくとも約１０８時間、少なくとも約１１４時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１２６時間、少なくとも約１３２時間、少なくとも約１３８時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１５０時間、少なくとも約１５６時間、少なくとも約１６２時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１７４時間、少なくとも約１８０時間、少なくとも約１８６時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約１９８時間、少なくとも約２０４時間、少なくとも約２１０時間、少なくとも約２１６時間、少なくとも約２２２時間、少なくとも約２２８時間、少なくとも約２３４時間又は少なくとも約２４０時間である。

【0183】

本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、第２の時点でのマーカーの発現
が、第１の時点でのこのマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。少なくとも１つのマーカーの発現の増大又は減少は、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る、ということを示す。同様に、複数のマーカーの発現が測定される場合、第２の時点での複数のマーカーの発現が、第１の時点でのこの複数のマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。マーカー発現の増大又は減少は、第１及び第２の時点での細胞集団中のマーカーの量、レベル又は活性を測定するか又は評価することにより判定され得る。このような判定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現と相対的であるか、或いは絶対的であり得る。マーカー発現が第１の時点と比較して第２の時点で増大される或る特定のいくつかの実施形態では、増大の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であるか、又は少なくとも約１００倍より多い。いくつかの実施形態では、増大の量は、２倍未満である。マーカー発現が第１の時点と比較して第２の時点で減少される実施形態では、減少の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であるか、又は少なくとも約１００倍より多い。いくつかの実施形態では、減少の量は、２倍未満である。

【0184】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉系統の1つ又は複数の細胞型に分
化する。いくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト胚体内胚葉細胞は、腸管に由来する細胞に分化する。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの細胞は、より高度な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。

【0185】

上述の方法と類似したスクリーニング方法を使用して、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む細胞集団におけるヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の分化を促進することが可能な１つ又は複数の分化因子を同定することができることが理解されよう。或る特定の実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞である。好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である。他の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、前腸の後方部分のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞である。特に好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。

【0186】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な因子の同定
本明細書中に記載するスクリーニング方法の態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な１つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、細胞培養物又は細胞集団におけるＰＤＸ１の発現が測定される。ＰＤＸ１の発現を測定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞を、候補分化因子と接触させる。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１の発現は、細胞を候補分化因子と接触させる時点で、或いは接触させた直後に測定される。続いて、ＰＤＸ１発現は、細胞を候補分化因子と接触させた後の１つ又は複数の時点で測定される。ＰＤＸ１の発現が、候補分化因子との接触前のＰＤＸ１発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大されていれば、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進す
ることが可能であるとして同定される。

【0187】

いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な因子を同定する上述の方法はまた、細胞培養物又は細胞集団におけるＨＯＸＡ１３遺伝子及び／又はＨＯＸＣ６遺伝子の発現を測定することを包含する。かかる実施形態では、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６の発現は、細胞を候補分化因子と接触させる前及び接触させた後の両方で測定される。ＰＤＸ１及びＨＯＸＡ１３の発現が、候補分化因子との接触前のＰＤＸ１及びＨＯＸＡ１３発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大されていれば、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能であるとして同定される。同様に、ＰＤＸ１及びＨＯＸＣ６の発現が、候補分化因子との接触前のＰＤＸ１及びＨＯＸＣ６発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大されていれば、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能であるとして同定される。好ましい実施形態では、候補分化因子は、細胞培養物又は細胞集団の細胞を候補分化因子と接触させる前及び接触させた後の両方で、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の発現を測定することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能であるとして同定される。好ましい実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６の発現は、Ｑ−ＰＣＲにより測定される。

【0188】

いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の１つ又は複数の発現は、細胞を候補分化因子と接触させる前ではなく、細胞培養物又は細胞集団の細胞を候補分化因子と接触させる時点で、或いは接触させた直後に測定され得ることが理解されよう。かかる実施形態では、細胞を候補分化因子と接触させる時点での、或いは接触させた直後のＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の１つ又は複数の発現は、細胞を候補分化因子と接触させた後の１つ又は複数の時点でのＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の１つ又は複数の発現と比較される。

【0189】

上述の方法のいくつかの実施形態では、細胞を候補分化因子と接触させた後にＰＤＸ１発現が測定される１つ又は複数の時点は、約１時間〜約１０日の範囲である。例えば、ＰＤＸ１発現は、細胞を候補分化因子と接触させた約１時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約４時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約６時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約８時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１０時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１２時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１６時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２４時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約３日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約４日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約５日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約６日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約７日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約８日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約９日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１０日後に、或いは細胞を候補分化因子と接触させた約１０日後より後に測定され得る。

【0190】

本明細書中に記載する方法における使用のための候補分化因子は、ポリペプチド及び小分子のような化合物から選択され得る。例えば、候補ポリペプチドとしては、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスタンパク質及び合成ペプチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、成長因子は、ＦＧＦファミリー、例えばＦＧＦ−１０に由来する。候補小分子としては、コンビナトリアル化学合成から生成される化合物及び天然産物（例えば、ステロイド、イソプレノイド、テルペノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイド及びフラビノイド）が挙げられるが、これらに限定されない。何千もの天然及び合成小分子の種類が利用可能であり、本明細書中に記載する方
法における使用のために意図される小分子は、上記で例示した種類に限定されないことが当業者に理解されよう。通常、小分子は、１０，０００ａｍｕ未満の分子量である。好ましい実施形態では、小分子は、レチノイド、例えばＲＡである。

【0191】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能な因子の同定
本明細書中に記載するスクリーニング方法の他の態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能な１つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、細胞培養物又は細胞集団におけるマーカーの発現が測定される。マーカーの発現を測定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞を候補分化因子と接触させる。いくつかの実施形態では、マーカーの発現は、細胞を候補分化因子と接触させる時点で、或いは接触させた直後に測定される。続いて、同一マーカーの発現は、細胞を候補分化因子と接触させた後の１つ又は複数の時点で測定される。マーカーの発現が、候補分化因子との接触前のマーカー発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大又は減少された場合、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能であるとして同定される。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより測定される。

【0192】

上述した方法のいくつかの実施形態では、細胞を候補分化因子と接触させた後にマーカー発現が測定される１つ又は複数の時点は、約１時間〜約１０日の範囲であり得る。例えば、マーカー発現は、細胞を候補分化因子と接触させた約１時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約４時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約６時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約８時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１０時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１２時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１６時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２４時間後に、細胞を候補分化因子と接触させた約２日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約３日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約４日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約５日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約６日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約７日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約８日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約９日後に、細胞を候補分化因子と接触させた約１０日後に、或いは細胞を候補分化因子と接触させた約１０日後より後に測定され得る。

【0193】

上述のように、本明細書中に記載する方法における使用のための候補分化因子は、ポリペプチド及び小分子のような化合物から選択され得る。

【0194】

本明細書中に開示する方法それぞれを、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関して記載してきたが、或る特定の実施形態では、これらの方法は、本明細書中に記載されるＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞及び／又は本明細書中に記載される前腸の後方部分のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む組成物を産生するのに使用することができることが理解されよう。さらに、本明細書中に開示するＰＤＸ１陽性内胚葉細胞型のいずれかを本明細書中に記載するスクリーニング方法に利用することができる。

【0195】

本発明を一般的に記載してきたが、説明の目的のためにのみ本明細書中に提供される特定の実施例を参照することによりさらなる理解が得られるが、この実施例に限定されない。

【実施例】

【0196】

以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞を産生する方法は、当該技術分野で既知であり、多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号に記載されている。

【0197】

[実施例１]
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発達についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のための免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
受精サイクルからの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ＩＴＳサプリメント）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞をプレート化した。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、非分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再プレート化することにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。

【0198】

幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手法のための出発物質としても用いられ得る、と当業者により理解される。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖腺隆起から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。

【0199】

[実施例２]
ｈＥＳＣｙｔ−２５特徴づけ
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養中に１８ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、未分化ｈＥＳＣに特有である）に対する強い免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性性質の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三つの胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。

【0200】

[実施例３]
ＳＯＸ１７抗体の産生
ｈＥＳＣ培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して高められる抗体の産生に着手した。

【0201】

マーカーＳＯＸ１７は、それが原腸形成中に形成する際に胚体内胚葉全体にわたって発現
し、その発現は、器官形成の開始まで腸管で維持される（しかし、発現のレベルは、Ａ−Ｐ軸に沿って変化する）。ＳＯＸ１７はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現する。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。ＳＯＸ１７は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。

【0202】

本明細書中で詳述するように、ＳＯＸ１７抗体は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の産生を目的とした様々な処理及び分化手順の影響を具体的に検査するのに利用された。ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びトロンボモジュリンに対しての他の抗体との反応性もまた、臓側及び壁側内胚葉（胚体外内胚葉）の産生を除外するのに使用された。

【0203】

ＳＯＸ１７に対する抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端におけるアミノ酸１７２〜４１４（配列番号２）に相当するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡ（配列
番号１）の一部（図２）は、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手段は、米国特許第５，８３０，８７６号、同第５，８１７，６３７号、同第６，１６５，９９３号及び同第６，２６１，２８１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／２９４４２号及び同第ＷＯ９９／１３９１５号に見出すことができる。

【0204】

遺伝子免疫化に関する他の適切な方法はまた、非特許文献にも記載されている。例えば、Barry他は、Biotechniques 16: 616-620, 1994において遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の産生について記載している。特異的タンパク質に対する抗体を産生するための遺伝子免疫化方法の具体例は、例えば、Costaglia et al., (1998) ヒト甲状腺刺激ホルモ
ン受容体に対する遺伝子免疫化は、甲状腺炎を引き起こし、且つ自然受容体を認識するモノクローナル抗体の産生を可能にする(Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies
recognizing the native receptor), J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick et al (1998) 遺伝子銃送達されるＤＮＡベースの免疫化は、Ｆｌｔ−３受容体に対するマウス
モノクローナル抗体の迅速な産生を媒介する(Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor), Hybridoma 17: 569-576、Schmolke et al., (1998) ＤＮＡ免疫化により産生されるＥ２特異的モノクローナル抗体によるヒト血清におけるＧ型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodidesgenerated by DNA immunization), J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann et al., (1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いたタンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy), J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri et al, (1996) ＤＮＡ免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacterpylori vacuolating cytotoxinby DNA immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194に見出すことができる。

【0205】

ＳＯＸ７及びＳＯＸ１８は、図３に示される相関系統樹に表されるようにＳＯＸ１７に対する最も密接なＳｏｘファミリー類縁体である。本発明者等は、遺伝子免疫化により産生されるＳＯＸ１７抗体がＳＯＸ１７に特異的であり、またその最も密接なファミリー成員と反応しないことを実証するために、陰性対照としてヒトＳＯＸ７ポリペプチドを用いた。特に、ＳＯＸ７及び他のタンパク質は、ヒト線維芽細胞において発現させ、続いてウェスタンブロット及びＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応性に関して分析した。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰ発現ベクターの産生、ヒト線維芽細胞へのそれらのトランスフェクション、並びにウェスタンブロットによる分析に関して以下の方法を利
用した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６(OriGeneTechnologies, Inc., Rockville, MD)、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過的にト
ランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの３６時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有す
る５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０
．５％デオキシコール酸中に収集した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％ポリアクリルアミド勾配、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、且つＰＤＶＦ
膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(Sigma, St. Louis, MO)中の
ラットＳＯＸ１７抗血清の１／１０００希釈で、アルカリホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearchLaboratories, West Grove, PA)によりプロービングして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)
により明らかにした。使用される標準サイズのタンパク質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。

【0206】

図４では、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトさ
れたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、ＳＯＸ１７抗体によりウェスタンブロットでプロービングした。ｈＳＯＸ１７トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトＳＯＸ１７タンパク質の予測された４６Ｋｄａ分子量に近い約５１Ｋｄａのバンドを生じた。ヒトＳＯＸ７又はＥＧＦＰトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してＳＯＸ１７抗体の反応性は見られなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ発現構築でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、ＥＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣによる特異性を示す。

【0207】

[実施例４]
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の確認
部分的に分化させたｈＥＳＣをＳＯＸ１７及びＡＦＰ抗体で同時標識して、ＳＯＸ１７抗体がヒトＳＯＸ１７タンパク質に特異的であること、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７（これは、ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦの密接に関連する成員である（図３））及びＡＦＰはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、ＡＦＰ及びＳＯＸ７は、ＩＣＣにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞がＡＦＰで同時標識されることを示すが、ＳＯＸ１７+細胞の区域においてＡＦＰ+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉は、ＳＯＸ１７を発現することが報告されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣ及び／又はトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７による抗体同時標識を使用して、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７+細胞を同定
することができる。図６Ａ〜図６Ｃに示されるように、トロンボモジュリン及びＳＯＸ１７同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞の無作為分化により産生された。

【0208】

上記細胞標識実験を考慮して、胚体内胚葉細胞の独自性は、マーカープロフィールＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／［ＴＭlo又はＳＰＡＲＣlo］により確立され得る。換言すると、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉の特徴であるＡＦＰマーカー、及び壁側内胚葉の特
徴であるＴＭ又はＳＰＡＲＣマーカーの発現よりも多い。したがって、ＳＯＸ１７に関して陽性であるが、ＡＦＰに対して陰性であり、且つＴＭ又はＳＰＡＲＣに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。

【0209】

胚体内胚葉の予測となるようなＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＴＭlo／ＳＰＡＲＣloマーカープロフィールの特異性のさらなる徴候として、ＳＯＸ１７及びＡＦＰ遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図７Ａに示されるように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）又はアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて１０倍の差をもたらした。この結果は、ＳＯＸ１
７抗体標識細胞数における１０倍の差に反映している（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されるように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理は、処理無しと比較して６．８倍分ＡＦＰ遺伝子発現を抑制した。これは、図８Ｂ及び図８Ｃに示されるように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこのおよそ７倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のＡＦＰ抗体標識細胞数における同様の７倍の減少の結果であることが実証された（図９Ａ及び図９Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて有意である。

【0210】

ノーダルファミリー成員（ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下でのｈＥＳＣのインキュベーションは、経時的にＳＯＸ１７抗体標識細胞の有意な増大をもたらした。連続的なアクチビン処理の５日目までには、５０％を超える細胞がＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。アクチビン処理の５日後にはＡＦＰで標識された細胞はほとんど存在しなかったか、或いは全く存在しなかった。

【0211】

要約すると、ヒトＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端の２４２個のアミノ酸に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットでヒトＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も密接なＳｏｘファミリー類縁体であるＳＯＸ７を認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７+／ＡＦＰlo/-である分化ｈＥＳＣ培養物における細胞のサブセッ
ト（９５％を超える標識細胞）並びにＳＯＸ１７及びＡＦＰ（臓側内胚葉）に関して同時標識する少量パーセント（５％未満）の細胞を認識した。アクチビンによるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＳＯＸ１７遺伝子発現並びにＳＯＸ１７標識細胞の顕著な増大をもたらし、ＡＦＰ ｍＲＮＡの発現及びＡＦＰ抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。

【0212】

[実施例５]
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）が、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Ｑ−ＰＣＲにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感受性及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感受性により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することができない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量
的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。

【0213】

本実施例で採用するアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００機器(Corbett Research)上でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学及び２段階ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用して相対定量を実
施することであった。かかるアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のｃＤＮＡサンプルの積上げが可能となり、したがって、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。

【0214】

プライマーは、これが混入ゲノムＤＮＡからの増幅を排除すると実験的に確定されているため、エクソン間境界にわたって存在するか、又は可能であれば少なくとも８００ｂｐの長さのイントロンにまたがるように設計された。イントロンを含有しないマーカー遺伝子を使用したか、又はマーカー遺伝子がシュードジーンを保有した場合、ＲＮＡサンプルのＤＮアーゼＩ処理が実施された。

【0215】

本発明者等は、細胞サンプルにおける遺伝子発現の広範囲のプロファイル記述を提供するために、日常的にＱ−ＰＣＲを使用して、標的及び非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現を測定した。ｈＥＳＣ分化の初期（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉）に関連し、且つ確証されたプライマーセットが利用可能であるマーカーを以下の表１に提供する。これらのプライマーセットのヒト特異性もまた実証されている。ｈＥＳＣが多くの場合マウスフィーダー層上で成長するため、このことは重要な事実である。最も典型的には、三重反復サンプルが各条件に関して採取され、各定量的測定に関連した生物学的可変性を評価するために二重反復で個別に分析された。

【0216】

ＰＣＲ鋳型を生成するために、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して単離されて、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(Molecular Probes)を用いて定量化された。総ＲＮＡ ３５０〜５
００ｎｇからの逆転写は、オリゴｄＴ及び無作為なプライマーのミックスを含有するｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ２０μＬを総容量１００μＬにまで希釈して、３μｌをそれぞれ４００ｎＭ順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス(Qiagen) ５μＬを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬにおいて使用した。２段階サイクリングパラメータは、８５〜９４℃（具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される）で５秒の変性、続く６０℃での４５秒のアニール／伸長を用いて使用された。各伸長段階の最後の１５秒の間に、蛍光データを収集した。３点の１０倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して標準化され、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出された。ＰＣＲサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのＰＣＲアンプリコンに適したＴmでの単一ピークにより示
された。さらに、逆転写酵素無しで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増幅しない。

【0217】

Ｑ−ＰＣＲ方法論を確立する際の第１の工程は、実験系における適切なハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）の検証であった。ＨＧは、ＲＮＡインプット、ＲＮＡ完全性及びＲＴ効率に関してサンプル全域で標準化するのに使用されるため、標準化が意味のあるものであるためには、ＨＧがすべてのサンプル型において経時的に一定レベルの発現を示すことに重要性があった。本発明者等は、分化ｈＥＳＣにおけるサイクロフィリンＧ (cyclophilin G)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１(hypoxanthine phosphoribosyl
transferase 1)（ＨＰＲＴ）、β−２−ミクログロブリン(beta-2-microglobulin)、ヒ
ドロキシメチルビランシンターゼ(hydroxymethylbiane synthase)（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴ
Ａ結合タンパク質(TATA-binding protein)（ＴＢＰ）及びグルクロニダーゼβ(glucoroni
dase beta)（ＧＵＳ）の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−２−ミクログロブリン(bata-2-microglobulin)発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、標準化に関してこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって不変的な発現レベルを示した。本発明者等は日常的に、サイクロフィリンＧ及びＧＵＳの両方を使用して、すべてのサンプルに関して標準化因子を算出した。多数のＨＧの使用は、同時に標準化プロセスに固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。

【0218】

標準化において使用するための遺伝子を獲得した後、続いてＱ−ＰＣＲを利用して、種々の実験処理を施したサンプルにわたる多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを測定した。用いたマーカー遺伝子は、それらが初期胚葉の代表的な特異的集団において富化を示すことから選択されており、特に胚体内胚葉及び胚体外内胚葉で差次的に発現される遺伝子の組に焦点を当てている。これらの遺伝子並びにそれらの関連富化プロファイルを表１に強調している。

【0219】

【表1】

【0220】

多くの遺伝子が、１つよりも多い胚葉で発現されるため、同じ実験内で多くの遺伝子の発現レベルを定量的に比較することが有用である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉で、またより程度は低いが、臓側及び壁側内胚葉で発現される。ＳＯＸ７及びＡＦＰは、この初期発達時点で、臓側内胚葉で発現される。ＳＰＡＲＣ及びＴＭは、壁側内胚葉で発現され、ブラキュリは、初期中胚葉で発現される。

【0221】

胚体内胚葉細胞は、高レベルのＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ並びに低レベルのＡＦＰ及びＳＯＸ
７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）を発現すると予測された。さらに、ＺＩＣ１は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用された。最後に、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂは、胚体及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７発現と相関する（表１）。表１に記載するマーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを強調する代表的な実験を図１１〜図１４に示している。

【0222】

上記データを考慮すると、アクチビン用量の増大が、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増大をもたらしたことが明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。

【0223】

[実施例６]
胚体内胚葉へのヒトＥＳ細胞の指示された分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化状態を活性で維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７発現）並びにＺＩＣ１及びネスチン（外胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して実験又は特定されていない。それ自体で、またデフォルトで、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特徴づけの大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたＥＳ細胞培養物においてＳＯＸ１７hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意な多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。

【0224】

未分化ｈＥＳＣコロニーは線維芽細胞フィーダーの床上で拡大するため、コロニーの縁にある細胞は、コロニーの内部に存在する細胞とは異なった別の形態を呈する。これらの外側の縁細胞の多くが、それらのあまり一様ではない、より大きな細胞体の形態により、またより高いレベルのＯＣＴ４の発現により識別され得る。ＥＳ細胞が分化し始めると、ＥＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞に関してのＯＣＴ４発現のレベルを上方又は下方へ変更させることが記載されている。未分化閾値を上回るか、又は下回るＯＣＴ４レベルの変更は、多能性状態から離れた分化の初期状態の表れであり得る。

【0225】

未分化コロニーがＳＯＸ１７免疫細胞化学により検査される場合、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞クラスターが、外縁上の無作為な位置で、また未分化ｈＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述したように、外側コロニー縁のこれらの散在ポケットは、コロニーのサイズが拡大し、且つより混雑してくるため、古典的なＥＳ細胞形態から離れて分化するための第１の細胞のいくつかであるようであった。より若くてより小さな完全未分化コロニー（１ｍｍ未満、４〜５日齢）は、コロニー内で又はコロニーの縁でＳＯＸ１７陽性細胞を示さなかったのに対して、より時間の経過したより大きなコロニー（直径１〜２ｍｍ、５日齢超）は、いくつかのコロニーの外縁で、或いは上述の古典的なｈＥＳＣ形態を示さない縁に対して内部の領域で、ＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の散発的な単離パッチを有していた。これが有効なＳＯＸ１７抗体の第１の発達であると考えると、かかる初期「未分化」ＥＳ細胞培養物で発達する胚体内胚葉細胞は、これまでに実証されていない。

【0226】

Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現レベルの逆相関に基づくと、これらのＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の大部分が、抗体同時標識による壁側内胚葉マーカーに関して陰性であろう。これは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、ＴＭ発現壁側内胚葉細胞に関して具体的に実証された。ノーダル因子であるアクチビンＡ及びＢへの暴露は、ＴＭ発現の強度及びＴＭ陽性細胞の数の劇的な減少をもたらした。アクチビン処理培養物に関するＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体を使用した三重標識により、ＡＦＰ及びＴＭに関しても陰性であるＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。これらは、分化ｈＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の第１の細胞の実証である（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７）。

【0227】

上述のＳＯＸ１７抗体及びＱ−ＰＣＲツールを用いて、本発明者等は、ＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＳＰＡＲＣ／ＴＭlo胚体内胚葉細胞となるようにｈＥＳＣを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関してＱ−ＰＣＲにより集団レベルで、及びＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。

【0228】

本発明者等はまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞
を創出するのに使用するためのノーダル／アクチビン／ＢＭＰのようなＴＧＦβファミリー成長因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ又はこれらの成長因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。

【0229】

図１９に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡの添加は、分化の４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対して、ＳＯＸ１７遺伝子発現の１９倍の誘導をもたらした。アクチビンＡと共に、アクチビンファミリーの第２の成員であるアクチビンＢを添加することにより、併用アクチビン処理の４日目までに、未分化ｈＥＳＣを上回る３７倍の誘導がもたらされた。最後に、アクチビンＡ及びアクチビンＢと共に、ノーダル／アクチビン由来のＴＧＦβファミリーの第３の成員、並びにＢＭＰサブグループであるＢＭＰ４を添加することにより、未分化ｈＥＳＣの誘導の５７倍に誘導を増大させた（図１９）。アクチビン及びＢＭＰによるＳＯＸ１７誘導を、因子無しの培地対照と比較した場合、５倍、１０倍及び１５倍の誘導が４日目の時点で生じた。アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰによる三重処理の５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣの７０倍より高く誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビン ＴＧＦβファミリー成員のより高い用量及びより長い処
理時間がＳＯＸ１７の増大された発現をもたらすことを示している。

【0230】

ノーダル並びに関連分子アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＯＸ１７の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、ＢＭＰの添加は、おそらくノーダル補助受容体であるＣｒｉｐｔｏのさらなる誘導により、改善されたＳＯＸ１７の誘導をもたらす。

【0231】

本発明者等は、ＢＭＰ４と一緒のアクチビンＡ及びＢの組合せが、ＳＯＸ１７誘導、したがって胚体内胚葉形成の相加的増大をもたらすことを実証している。アクチビンＡ及びＢと組み合わせた長期間（４日を超える）のＢＭＰ４添加は、壁側及び臓側内胚葉並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７を誘導し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、添加の４日以内に処理からＢＭＰ４を除去することは有益である。

【0232】

個々の細胞レベルでのＴＧＦβ因子処理の影響を測定するために、経時的なＴＧＦβ添加を、ＳＯＸ１７抗体標識を使用して検査した。すでに図１０Ａ〜図１０Ｆで示したように、経時的にＳＯＸ１７標識細胞の相対数の劇的な増大が見られた。相対定量化（図２０）は、ＳＯＸ１７標識細胞の２０倍を超える増大を示す。この結果は、細胞の数並びにＳＯＸ１７遺伝子発現レベルの両方が、ＴＧＦβ因子暴露の時間とともに増大していることを示す。図２１に示されるように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４への暴露の４日後に、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣに対して１６８倍に到達した。図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上のアクチビンＡ用量は、ＳＯＸ１７遺伝子発現及び細胞数を強力に誘導することが可能であった。

【0233】

ＴＧＦβファミリー成員のほかに、Ｗｎｔファミリーの分子が、胚体内胚葉の特定化及び／又は維持において役割を果たし得る。Ｗｎｔ分子の使用もまた、アクチビン単独を上回
るアクチビン＋Ｗｎｔ３ａで処理したサンプルにおける増大したＳＯＸ１７遺伝子発現により示されるように、胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化に有益であった（図２３）。

【0234】

上述の実験はすべて、添加因子を伴って１０％血清を含有する組織培養培地を使用して実施した。驚くべきことに、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されるように、血清の濃度が、添加アクチビンの存在下でＳＯＸ１７発現のレベルに対して影響することを本発明者等は発見した。血清レベルが１０％から２％へ低減すると、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡ及びＢの存在下で３倍になった。

【0235】

最後に、本発明者等は、アクチビン誘導ＳＯＸ１７+細胞が、図２５Ａ〜図２５Ｄに表さ
れるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩ標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロフィールにより明らかなように有糸分裂中であるＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。

【0236】

[実施例７]
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、ｈＥＳＣは、ＴＧＦβファミリー、より具体的にはアクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の比率が、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンＡの所定濃度で、より高いレベルのＦＢＳが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンＡの非存在下では、胚体内胚葉系統へのｈＥＳＣの分化は、非常に非効率であり、ＦＢＳ濃度は、ｈＥＳＣの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。

【0237】

これらの実験では、０．５％、２．０％又は１０％ＦＢＳを補充し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを伴うか、又は伴わないＲＰＭＩ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA；ｃａｔ＃６１８７０−０３６）中で６日間成長させることにより、ｈＥＳＣを分化させた。さらに、分化の最初の３日間にわたる０．５％〜２．０％に及ぶＦＢＳのグラジエントもまた、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと併用した。６日後に、反復サンプルを各培養条件から収集して、リアルタイム定量的ＰＣＲにより相対遺伝子発現に関して分析した。残存細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に固定した。

【0238】

ＣＸＣＲ４の発現レベルは、使用した７つの培養条件にわたって劇的に変化した（図２６）。概して、ＣＸＣＲ４発現は、アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）では高く、外因性アクチビンＡを施さない培養物（ＮＦ）では低かった。さらに、Ａ１００処理培養物の中でも、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低かった場合に最も高かった。相対発現が、アクチビンＡを施さない条件（ＮＦ）により一致するように、１０％ＦＢＳ条件におけるＣＸＣＲ４レベルの顕著な低減が見られた。

【0239】

上述したように、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特性化と一致する。７つの分化条件に関するこれらの４つの遺伝子の相対発現は、ＣＸＣＲ４の相対発現を反映する（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。このことは、ＣＸＣＲ４もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。

【0240】

外胚葉及び中胚葉系統は、各種マーカーのそれらの発現により胚体内胚葉と識別することができる。初期中胚葉は、遺伝子ブラキュリ及びＭＯＸ１を発現する一方で、新生神経外胚葉は、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜図２８Ｄは、外因性アクチビンＡを施さない培養物が、中胚葉及び外胚葉遺伝子発現に関して優先的に富化されたこと、及
びアクチビンＡ処理培養物の中でも、１０％ＦＢＳ条件がまた、中胚葉及び外胚葉マーカー発現の増大レベルを有したことを実証している。発現のこれらのパターンはＣＸＣＲ４のパターンと反比例し、ＣＸＣＲ４が、この発達期間にｈＥＳＣに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。

【0241】

哺乳類発達中の初期に、胚体外系統への分化もまた起こる。ここでは、ＳＯＸ１７を包含する胚体内胚葉と共通して多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化が特に関連している。胚体内胚葉を胚体外臓側内胚葉と識別するためには、これらの２つの間を識別できるマーカーを検査するべきである。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現されるが、胚体内胚葉系統では発現されないマーカーを表す。したがって、ＳＯＸ７発現の非存在下での強健なＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。ＳＯＸ７が、アクチビンＡを施さない培養において高度に発現され、ＳＯＸ７はまた、ＦＢＳが１０％で包含される場合に、アクチビンＡの存在下でさえ増大された発現を示したことが図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４発現パターンの逆であり、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。

【0242】

上述の分化条件それぞれに存在するＳＯＸ１７免疫反応性（ＳＯＸ１７+）細胞の相対数
もまた測定した。ｈＥＳＣは、高用量アクチビンＡ及び低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）の存在下で分化させた場合、ＳＯＸ１７+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分
布した。高用量アクチビンＡを使用したが、ＦＢＳは１０％（ｖ／ｖ）で包含された場合、ＳＯＸ１７+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布される
のではなく、常に単離クラスターに出現した（図２９Ａ及び図２９Ｃ、並びに図２９Ｂ及び図２９Ｅ）。外因性アクチビンＡが使用されなかった場合に、ＳＯＸ１７+細胞のさら
なる減少が観察された。これらの条件下では、ＳＯＸ１７+細胞はまたクラスターに出現
し、これらのクラスターは、高アクチビンＡ低ＦＢＳ処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった（図２９Ｃ及び図２９Ｆ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。

【0243】

[実施例８]
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンＡの用量はまた、胚体内胚葉がｈＥＳＣから得られ得る効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンＡの用量を増大させることにより培養物におけるＣＸＣＲ４+
細胞の比率が増大することを実証する。

【0244】

ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日にわたって０．５％から１．０％、そして２．０％へ増大される）及び０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＲＰＭＩ培地中で分化させた。分化の７日後に、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含有するＣａ2+／Ｍｇ2+を伴わないＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を解離させた。細胞は、３５μｍナイロンフィルタに通して濾過して、計数して、ペレット化した。ペレットは、少容量の５０％ヒト血清／５０％正常ロバ血清中に再懸濁させて、氷上で２分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。これに、５０μｌ（およそ１０5個の細胞を含有する）当たりマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（Abcam、ｃａｔ＃ ａｂ１０
４０３−１００）１μｌを添加して、氷上で４５分間ラベリングした。細胞は、２％ヒト血清を含有するＰＢＳ（緩衝液）５ｍｌを添加することにより洗浄して、ペレット化した。緩衝液５ｍｌによる第２の洗浄を完了させた後、細胞は、１０5個の細胞当たり緩衝液
５０μｌ中に再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、ｃａｔ＃ ７１５−０９６−１５１）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加して、３０分
間標識させた後、上述のように緩衝液中で２回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に５×１
０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(Beckton Dicklenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現分析用の総ＲＮＡの単離のために、ＲＬＴ溶解緩衝液(Qiagen)へ直接収集した。

【0245】

フローサイトメトリーにより測定される場合のＣＸＣＲ４+細胞の数は、アクチビンＡの
容量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増大することが観察された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。ＣＸＣＲ４+細胞は、Ｒ４ゲート内に納まり、このゲートは、事象の０．２％
がＲ４ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。ＣＸＣＲ４+細胞
の劇的に増大する数は、アクチビンＡ用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強健な増大と相関する（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。

【0246】

[実施例９]
ＣＸＣＲ４陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例８で同定されるＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-細胞を収集して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に測定した。

【0247】

ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対レベルは、アクチビンＡの用量の増大に伴って劇的に増大した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４+細胞のアクチビンＡ用量依存的増大と極めて強く相
関した（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。また、各集団からのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、この集
団におけるほぼすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を収集するためのＦＡＣＳ方法の効率を実証している。

【0248】

遺伝子発現分析により、ＣＸＣＲ４+細胞は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分を含有する
だけでなく、ＣＸＣＲ４+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も
含有することが明らかとなった。図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、ＣＸＣＲ４+細
胞はさらに、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３Ｂ及びＭＩＸＬ１に関して母Ａ１００集団を上回って富化した。さらに、ＣＸＣＲ４-分画は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して
非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、ＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜図３３Ｄは、ＣＸＣＲ４+細胞が、Ａ１００母集団に対してブラキュリ、ＭＯＸ１
、ＺＩＣ１及びＳＯＸ７の遺伝子発現に関して激減したことを示す。このＡ１００母集団は、低用量条件又はアクチビンＡ無しの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンＡの存在下で分化されるｈＥＳＣからのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚
葉である集団を生じることを示す。

【0249】

[実施例１０]
ＣＸＣＲ４を使用した細胞集団における胚体内胚葉細胞の定量化
本明細書中ですでに確定されるような、及び２００３年１２月２３日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第６０／５３２，００４号で測
定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量化を確認するために、ＣＸＣＲ４及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をＦＡＣＳにより分析した。

【0250】

上記実施例に記載されるような方法を使用して、ｈＥＳＣを分化させて、胚体内胚葉を産生した。特に、分化細胞培養物における収率及び純度を増大させるために、培地の血清濃度を以下の通りに制御した：１日目には０．２％ＦＢＳ、２日目には１．０％ＦＢＳ及び３〜６日目には２．０％ＦＢＳ。分化培養物は、３つの細胞表面エピトープであるＥ−カ
ドヘリン、ＣＸＣＲ４及びトロンボモジュリンを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。続いて、選別した細胞集団をＱ−ＰＣＲにより分析して、胚体及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを測定した。最適に分化させた培地から採取されるＣＸＣＲ４選別した細胞は、９８％を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。

【0251】

表２は、本明細書中に記載する方法を使用してｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果を示す。

【0252】

【表2】

【0253】

特に、表２は、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が細胞培養物における細胞の７０〜８０％を構成したことを示す。これらのＳＯＸ１７発現細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＴＭ陽性細胞及びＡＦＰ陽性細胞の比率（組み合わせた壁側内胚葉及び臓側内胚葉、総計３％）をＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から差し引きした後、細胞培養物の約６７％〜約７７％が胚体内胚葉であったことが観察され得る。およそ１０％の細胞が、ｈＥＳＣに関するマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に関して陽性であり、細胞の約１０〜２０％が他の細胞型であった。

【0254】

ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物における胚体内胚葉の純度は、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下でＦＢＳ濃度を維持することにより、上述の低血清手順と比較して改善させることができることを本発明者等は発見している。しかしながら、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下で細胞培養物を維持することはまた、産生される総胚体内胚葉細胞の数の低減をもたらす。

【0255】

本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも長い間、アクチビンの存在下で培養において維持及び拡大されている。かかる場合では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β発現は、培養期間にわたって維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１及びＢＲＡＣＨは、これらの培養物では検出されなかった。かかる細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも実質的に長い間、培養において維持及び拡大させることができる可能性が高い。

【0256】

[実施例１１]
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製された胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製された集団からのＲＮＡの遺伝子チップ分析により分析した。Ｑ−ＰＣＲも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現さ
れるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。

【0257】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持された。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で５日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。ＦＢＳの濃度は、毎日以下の通りに変化させた：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。

【0258】

遺伝子発現分析のためにｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製集団を得るために、細胞を蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により単離した。免疫精製は、ｈＥＳＣに関してはＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、また胚体内胚葉に関し
てはＣＸＣＲ４（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して達成された。細胞
は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、ｃａｔ＃２５３００−０５４）を使用して解離させて、２％ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、氷上で１０分間１００％ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清８００μｌ中で５×１０6個の細胞にフィコエリトリン結合抗体２００μｌを添加
することにより氷上で３０分間実施した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２度洗浄して、同１ｍｌ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ単離は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(BD Biosciences)
を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、ＲＬＴ溶解緩衝液へ直接収集して、ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ(Qiagen)により単離した。

【0259】

精製されたＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム及びＵ１３３ Ｐｌｕｓ２
．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロフィールデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)へ正副２通提出した。提示されたデータは、２つの
集団、すなわちｈＥＳＣと胚体内胚葉の間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。ｈＥＳＣに見出される発現レベルを上回る発現レベルの頑強な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉の高度に特性化される新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにＱ−ＰＣＲによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、またｈＥＳＣ分化の経時変化中のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。

【0260】

図３４Ａ〜図３４Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現の結果を示す。結果は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加の１日後、３日後及び５日後に分析した細胞培養物、５日目の分化手順の終わりに精製されたＣＸＣＲ４発現性胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関して、及び精製ｈＥＳＣにおいて表示される。図３４Ｃ及び図３４Ｇ〜図３４Ｍの比較により、６つのマーカー遺伝子、すなわちＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほぼ一致し、且つまたＣＸＣＲ４の発現のパターン及びＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比と同一である発現パターンを示す。上述したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方において発現される。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現されないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体として集団において証明されるＳＯＸ１７発現への胚体内胚葉の寄与の信頼性高い推定を提供する。パネルＣに対するパネルＧ〜Ｌ及びＭの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。

【0261】

本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができることが理解されよう。

【0262】

[実施例１２]
レチノイン酸及びＦＧＦ−１０は、胚体内胚葉培養物において特異的にＰＤＸ１を誘導する
以下の実験は、ＲＡ及びＦＧＦ−１０が胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を誘導することを実証する。

【0263】

ヒト胚性幹細胞をアクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、１μＭ ＲＡ及
び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１０を細胞培養物へ添加した。ＲＡ／ＦＧＦ−１０添加の４
８時間後に、ＰＤＸ１マーカー遺伝子及び前腸内胚葉に特異的でない他のマーカー遺伝子の発現をＱ−ＰＣＲにより定量した。

【0264】

胚体内胚葉細胞へのＲＡの適用は、臓側内胚葉（ＳＯＸ７、ＡＦＰ）、神経（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）又はニューロン（ＮＦＭ）遺伝子発現マーカーの発現を増大させずに（図３６Ａ〜図３６Ｆ）、ＰＤＸ１遺伝子発現の頑強な増大を引き起こした（図３５を参照）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、１μＭ ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１０への暴露の４８時間後に、胚体内胚葉において観察されるものよりもおよそ５００倍高いレベルまで誘導された。さらに、これらの結果は、実質的なＰＤＸ１誘導が、ＲＡ適用に先立ってアクチビンを施さない培養物に比べてアクチビン処理細胞培養物に見出される１６０倍高いＰＤＸ１発現により示されるように、胚体内胚葉（ＳＯＸ１７）に予め分化させた細胞培養物においてのみ起こったことを示す。

【0265】

[実施例１３]
ＦＧＦ−１０は、ＲＡ単独を上回るＰＤＸ１発現のさらなる増大を提供する
この実施例は、ＲＡ及びＦＧＦ−１０の組合せが、ＲＡ単独よりも大いにＰＤＸ１発現を誘導することを示す。

【0266】

これまでの実施例と同様に、ｈＥＳＣは、アクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、細胞を以下のうちの１つで処理した：１μＭ ＲＡ単独、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ
−１０のいずれかと併用した１μＭ ＲＡ、或いはＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０の両方と
併用した１μＭ ＲＡ。ＰＤＸ１、ＳＯＸ７及びＮＦＭの発現は、ＲＡ又はＲＡ／ＦＧＦ
の９６時間後に、Ｑ−ＰＣＲにより定量された。

【0267】

アクチビン、これに続くレチノイン酸によるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＰＤＸ１遺伝子発現の６０倍の増大を誘導した。ＲＡ処理へのＦＧＦ−４の添加は、わずかに多いＰＤＸ１を誘導した（ＲＡ単独に対しておよそ３倍）。しかしながら、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸を共に添加することにより、ＰＤＸ１の誘導はさらに、ＲＡ単独に対して６０倍増強された（図３７Ａを参照）。この非常に頑強なＰＤＸ１誘導は、アクチビン無し又はＲＡ／ＦＧＦ処理を用いた場合よりも１４００倍超高かった。興味深いことに、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０の添加は、ＦＧＦ−１０の有益な効果を同時に根絶させて、ＦＧＦ−４添加に起因して少量のＰＤＸ１の増大のみをもたらした。

【0268】

ＲＡ／ＦＧＦ−４又はＲＡ／ＦＧＦ−１０の組合せの添加は、ＲＡ／ＦＧＦの組合せに暴露させない細胞と比較した場合、前腸内胚葉に関連しないマーカー遺伝子の発現を増大させなかった（図３７Ｂ及び図３７Ｃを参照）。

【0269】

[実施例１４]
レチノイン酸用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前方−後方（Ａ−Ｐ）位置に影響を及ぼす
ＲＡの用量がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物のＡ−Ｐ位置に影響を及ぼすかどうかを判定す
るために、以下の実験を実施した。

【0270】

ヒト胚性幹細胞は、アクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、５０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ−１０は、０．０４μＭ、０．２μＭ又は１．０μＭで、ＲＡを併用して培養物へ添加された。ＰＤＸ１マーカー遺伝子の発現並びに前腸内胚葉に特異的でない他のマーカーの発現をＱ−ＰＣＲにより定量化した。

【0271】

５０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ−１０と併用した様々な用量でのレチノイン酸の添加は、特異的な前方−後方位置的パターンと相関する差次的遺伝子発現パターンを誘導した。ＲＡの最高用量（１μＭ）は、前方の内胚葉マーカー（ＨＯＸＡ３）の発現を優先的に誘導し
、またＰＤＸ１の最も頑強な増大をもたらした（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。ＲＡの中間的な用量（０．２μＭ）は、中腸内胚葉マーカー（ＣＤＸ１、ＨＯＸＣ６）を誘導した（図３８Ｃ及び図４１Ｅを参照）のに対して、ＲＡの最小用量（０．０４μＭ）は、後腸内胚葉のマーカー（ＨＯＸＡ１３）を優先的に誘導した（図３８Ｄを参照）。ＲＡ用量は、神経（ＳＯＸ１）又はニューロン（ＮＦＭ）マーカーのいずれかの相対発現に対して実質的に影響しなかった（図３８Ｆ及び図３８Ｇを参照）。この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
モルフォゲンとしての、特に分化ｈＥＳＣの内胚葉誘導体のモルフォゲンとしてのＲＡの使用を強調する。

【0272】

[実施例１５]
Ｂ２７サプリメントの使用は、ＰＤＸ１の発現を増強する
胚体内胚葉におけるＰＤＸ１発現は、多数の因子の使用及び細胞成長／分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、Ｂ２７サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を増強することを示す。

【0273】

ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させた未分化ｈＥＳ細胞を高用量のアクチビンＡ（０．５〜２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）で４日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。アクチビンＡ無しの対照に、アクチビンＡを添加せずに０．５〜２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２を施した。４日目に、培養物に、２％ＦＢＳ中のアクチビンＡ無し（無し）及び２％血清代替物中のアクチビンＡ無し（ＳＲ）、又は２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中の２μＭ ＲＡ及
び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１０と共に５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（無し、＋ＦＢＳ
、＋Ｂ２７）、並びに同様に２％血清代替物（ＳＲ）の２μＭ ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−１０と共に５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかを施した。Ｂ２７サプリメント(Gibco/BRL)は、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２へ直接１／５０希釈として添加した
（＋Ｂ２７）。二重反復細胞サンプルを各点に関して採取して、総ＲＮＡを単離して、上述のようにＱ−ＰＣＲへ付した。

【0274】

図３９Ａ〜図３９Ｅは、無血清サプリメントＢ２７が、血清無しで成長させた細胞におけるかかるマーカー遺伝子発現と比較した場合、前腸内胚葉に特異的でないマーカー遺伝子の発現の増大を誘導することなく、ＰＤＸ１遺伝子発現の誘導にさらなる有益性を提供することを示す。

【0275】

[実施例１６]
ＰＤＸ１の誘導を増強するためのアクチビンＢの使用
この実施例は、アクチビンＢの使用が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物においてＰＤＸ１陽
性細胞へのＰＤＸ１陰性細胞の分化を増強することを示す。

【0276】

ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させた未分化ｈＥＳ細胞を低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で６日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０％、２日目に０．
２％、及び３〜６日目に２％であった。胚体内胚葉産生に関する陰性対照（ＮＦ）には、アクチビンＡを添加せずに２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを施した。ＰＤＸ１発現を誘導するために、培養物それぞれに、６日目に２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で２μＭにてレチノイン酸を施した。１日目〜５日目にアクチビンＡで処置した培養物に、種々の投与組合せのアクチビンＡ及びアクチビンＢを供給したか、或いは５０ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡ単独中の状態のままであった。アクチビンＡ無しの対照培養物（ＮＦ）にはアクチビンＡもアクチビンＢも供給しなかった。このＲＡ／アクチビン処理は３日間実施して、３日目にＰＤＸ１遺伝子発現を二重反復細胞サンプルからのＱ−ＰＣＲにより測定した。

【0277】

図４０Ａは、２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のアクチビンＡの存在下での１０〜５０ｎｇ／ｍｌ（ａ１０、ａ２５及びａ５０）の範囲の用量でのアクチビンＢの添加が、５０ｎｇ／ｍｌでアクチビンＡのみを施した培養物を少なくとも２倍越えてＰＤＸ１発現を増大させたことを示す。アクチビンＢの添加の結果としてのＰＤＸ１の増大は、発達におけるこの時点で肝臓並びに膵臓に関するマーカーであるＨＮＦ６発現の増大を伴わなかった（図４０Ｂを参照）。この結果は、膵臓へ分化している細胞の比率が肝臓に比べて増大していることを示唆する。

【0278】

[実施例１７]
ＰＤＸ１の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化中の培養物における血清のレベルが、ＰＤＸ１陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のＰＤＸ１の発現に影響したことを示す。

【0279】

ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させた未分化ｈＥＳＣを、低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０．１％、２日目に０．５％、及び３〜５日目に０．５％、２％又は１０％のいずれかであった。アクチビンＡ無しの対照（ＮＦ）には、毎日同じＦＢＳ／ＲＰＭＩ投与を施したが、アクチビンＡは添加しなかった。ＰＤＸ１発現は、ＲＡの添加により６日目に開始して誘導した。６〜７日目中に、培養物に、０．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で２μＭにて、８日目に１μＭにて、及び９〜１１日目に０．２μＭにてレチノイン酸を施した。アクチビンＡは、レチノイン酸処理中５０ｎｇ／ｍｌへ低減させて、アクチビンＡ無しの対照（ＮＦ）から取り去った。

【0280】

図４１Ａは、３日間の胚体内胚葉誘導（３日目、４日目及び５日目）中のＦＢＳ投与は、レチノイン酸処理中にＰＤＸ１遺伝子発現の誘導を変化させる持続的な能力を有したことを示す。これは、ＺＩＣ１（図４１Ｂ）又はＳＯＸ７（図４１Ｃ）遺伝子発現の発現パターンの有意な変更を伴わなかった。

【0281】

[実施例１８]
ＰＤＸ１の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。

【0282】

ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させた未分化ｈＥＳ細胞を、低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０．２％、２日目に０．５％、及び３〜５日目に２％であった。

【0283】

続いて、５日間のアクチビンＡ処理により生成された胚体内胚葉培養物は、２５ｎｇ／ｍｌでアクチビンＡを含有する２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中でのＲＡの添加により、ＰＤＸ１発現内胚葉へ分化するように４日間誘導させた。ＲＡは、添加の最初の２日間に関しては２μＭ、３日目には１μＭ、及び４日目には０．５μＭであった。ＰＤＸ１誘導に関するこの基本培地は、新鮮な状態で（２Ａ２５Ｒ）或いは４つの異なる細胞集団のうちの１つにより２４時間条件付けした後に供給された。条件培地（ＣＭ）は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦＣＭ）から、或いは３つの条件；ｉ）３％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ（ＣＭ２）又はｉｉ）アクチビンＡ（ＣＭ３）又はｉｉｉ）骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（ＣＭ４）のうちの１つによりまず５日間分化させたｈＥＳＣから生成した。アクチビンＡ又はＢＭＰ４因子は、上述したものと同じＦＢＳ投与レジメン（０．２％、０．５％、２％）下で１００ｎｇ／ｍｌで供給された。これらの３つの異なる分化パラダイムは、ＰＤＸ１誘導培地が条件付けられ得るヒト細胞の３つの非常に異なる集団を生じる。成長因子を添加しない３％ＦＢＳ（ＮＦ）は、大部分が胚体外内胚葉、外胚葉及び中胚葉細胞で構成される不均一集団を生じる。アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）は、大部分の胚体内胚葉をもたらし、ＢＭＰ４処理培養物（Ｂ１００）は、主として栄養外胚葉及び幾らかの胚体外内胚葉をもたらす。

【0284】

図４２Ａは、ＰＤＸ１が最初の２日間のＲＡ処理にわたって新鮮な培地及び条件培地において同等に誘導されたことを示す。しかしながら、３日目までには、ＰＤＸ１発現は、新鮮な培地及びＭＥＦ条件培地処理において減少し始めた。分化されたｈＥＳＣは、維持、或いは新鮮な培地よりも３〜４倍高いレベルでＰＤＸ１遺伝子発現のさらなる増大をもたらす条件培地を生じた。ｈＥＳＣ条件培地において高ＰＤＸ１発現を維持する効果はさらに、ＲＡ処理の４日目に増幅されて、新鮮な培地よりも６〜７倍高いレベルを達成した。図４２Ｂは、条件培地処理が、ＣＤＸ１遺伝子発現の相当低いレベルをもたらし、遺伝子は、ＰＤＸ１発現内胚葉の領域では発現されなかったことを示す。これは、ＰＤＸ１発現内胚葉の全体的な純度が、分化されたｈＥＳＣ培養物から生成される条件培地で胚体内胚葉を処理することによりかなり増強されたことを示している。

【0285】

図４３は、ＰＤＸ１遺伝子発現が、胚体内胚葉細胞へ適用させる条件培地の量に対する明白な用量応答を示したことを示す。各プレートへ添加される培地の総容量は５ｍｌであり、条件培地の指示容量（図４３を参照）は、新鮮な培地（Ａ２５Ｒ）へ希釈した。新鮮な培地４ｍｌへ添加される条件培地ちょうど１ｍｌは、依然として新鮮な培地単独５ｍｌよりも高いＰＤＸ１発現レベルを誘導及び維持することが可能であったことに注目されたい。これは、ＰＤＸ１発現内胚葉の誘導に関する条件培地の有益な影響が、細胞から条件培地への幾らかの物質（単数又は複数）の放出に依存的であること、及びこの物質（単数又は複数）が、ＰＤＸ１発現内胚葉の産生を用量依存的に増強することを示唆する。

【0286】

[実施例１９]
ＰＤＸ１へ結合する抗体の確証
ＰＤＸ１へ結合する抗体は、細胞集団におけるＰＤＸ１発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。この実施例は、ＰＤＸ１に対するウサギポリクローナル抗体及びＩｇＹ抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。

【0287】

第１の実験では、細胞可溶化物におけるＰＤＸ１と結合するＩｇＹ抗ＰＤＸ１（ＩｇＹ α−ＰＤＸ１）抗体をウェスタンブロット分析により確証した。この分析で、ＭＤＸ１２ヒト線維芽細胞又はＰＤＸ１発現ベクターで予め２４時間トランスフェクトしたＭＤＸ１２細胞由来の総細胞可溶化物５０μｇへのＩｇＹ α−ＰＤＸ１抗体の結合を比較した。
細胞可溶化物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、エレクトロブロッティングにより膜へ転写して、その後ＩｇＹ α−ＰＤＸ１一次抗血清で、それに続いてアルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗ＩｇＹ（Ｒｂ α−ＩｇＹ）二次抗体でプロービングした。一次抗体
及び二次抗体の種々の希釈は、細長い膜を分離するために以下の組合せで適用した：Ａ（５００倍一次希釈、１０，０００倍二次希釈）、Ｂ（２，０００倍、１０，０００倍）、Ｃ（５００倍、４０，０００倍）、Ｄ（２，０００倍、４０，０００倍）、Ｅ（８，０００倍、４０，０００倍）。

【0288】

結合は、試験した抗体の組合せすべてにてＰＤＸ１発現ベクター（ＰＤＸ１陽性）でトランスフェクトした細胞中で検出された。最高濃度の一次抗体及び二次抗体の両方を共に使用する場合（組合せＡ）で、結合は、トランスフェクトしていない（ＰＤＸ１陰性）線維芽細胞において観察されるのみであった。かかる非特異的結合は、トランスフェクトした線維芽細胞及びトランスフェクトしていない線維芽細胞の両方においてＰＤＸ１よりもわずかに高い分子量でのさらなるバンドの検出を特徴とした。

【0289】

第２の実験では、ＰＤＸ１へのポリクローナルウサギ抗ＰＤＸ１（Ｒｂ α−ＰＤＸ１）
抗体の結合を免疫組織化学により試験した。かかる実験用のＰＤＸ１発現細胞を産生するために、ＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４６０）をＰＤＸ１−ＥＧＦＰの発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech)を用いて構築した）で一過的にトランスフェクトした。続いて、トランスフェクトした細胞をＲｂ α−ＰＤＸ１及びα−ＥＧＦＰ抗血清で
標識した。トランスフェクトした細胞は、Ｃｙ５結合二次抗体の使用によるＥＧＦＰ蛍光並びにα−ＥＧＦＰ免疫組織化学の両方により可視化した。ＰＤＸ１免疫蛍光は、α−Ｒｂ Ｃｙ３結合二次抗体の使用により可視化した。

【0290】

Ｒｂ α−ＰＤＸ１及びα−ＥＧＦＰ抗体の結合は、ＧＰＦ発現と共局在化した。

【0291】

[実施例２０]
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
この実施例は、ＰＤＸ１に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトＰＤＸ１陽性細胞を同定することができることを示す。

【0292】

第１の実験では、ヒト膵臓のパラフィン包埋切片を、１／２００希釈でのモルモット抗インスリン（Ｇｐ α−Ｉｎｓ）一次抗体で、これに続いて１／１００希釈でのＣｙ２へ結
合されたイヌ抗モルモット（Ｄ α−ＧＰ）二次抗体でインスリンに関して染色した。第
２の実験では、ヒト膵臓の同じパラフィン包埋切片を、１／４０００希釈でのＩｇＹ α
−ＰＤＸ１一次抗体で、これに続いて１／３００希釈でのＡＦ５５５へ結合されたＲｂα−ＩｇＹ二次抗体でＰＤＸ１に関して染色した。第１の実験及び第２の実験から収集した画像を併せた。第３の実験では、また、ＩｇＹ α−ＰＤＸ１抗体で染色した細胞をＤＡ
ＰＩでも染色した。

【0293】

ヒト膵臓切片の分析により、ランゲルハンス島の強力な染色の存在が明らかとなった。最強のＰＤＸ１シグナルは島（インスリン陽性）に出現したが、弱い染色は腺房組織（インスリン陰性）でも観察された。ＤＡＰＩ及びＰＤＸ１共染色は、ＰＤＸ１が、大部分（しかし、排他的ではない）核へ局在化したことを示す。

【0294】

[実施例２１]
レチノイン酸処理細胞からのＰＤＸ１の免疫沈降
ＲＡの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１発現、及びＲＡを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗ＰＤＸ１（Ｒｂ α−ＰＤＸ１）抗体を使用して、ＲＡ分化させた胚体内胚葉細胞及びＲ
Ａ分化させていない胚体内胚葉細胞の両方からＰＤＸ１を免疫沈降させた。免疫沈降させたＲＡは、ＩｇＹ α−ＰＤＸ１抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した
。

【0295】

免疫沈降用の未分化の胚体内胚葉細胞可溶化物及び分化した胚体内胚葉細胞可溶化物を得るために、ｈＥＳＣを低血清中で１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡで５日間処理した（胚体内胚葉）後、５０ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡ及び２μＭのオールトランスＲＡで２日間（１μＭで１日間、及び０．２μＭで１日間）処理した（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）。陽性対照として、細胞可溶化物はまた、ＰＤＸ１発現ベクターでトランスフェクトしたＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４６０）からも調製した。ＰＤＸ１は、Ｒｂ α
−ＰＤＸ１及びウサギ特異的二次抗体を各可溶化液へ添加することにより免疫沈降させた。沈降物を遠心分離により収集した。免疫沈降物をＳＤＳ含有緩衝液中に溶解させた後、ポリアクリルアミドゲル上へ負荷した。分離後、タンパク質をエレクトロブロッティングにより膜へ転写し、その後ＩｇＹ α−ＰＤＸ１一次抗体、これに続いて標識Ｒｂ α−ＩｇＹ二次抗体でプロービングした。

【0296】

ＭＳ１−Ｖ陽性対照細胞から収集した免疫沈降物並びに８日目（レーンｄ８、ＲＡ処理の開始の３日後）及び９日目（レーンｄ９、ＲＡの開始の４日後）の細胞からの免疫沈降物は、ＰＤＸ１タンパク質に関して陽性であった（図４４）。未分化の胚体内胚葉細胞（すなわち、アクチビンＡで処理した５日目の細胞−図４４において（Ａ）で示す）及び未分化のｈＥＳＣ（すなわち、未処理の５日目の細胞−図４４において（ＮＦ）で示す）から得られた沈降物はＰＤＸ１に関して陰性であった。

【0297】

[実施例２２]
ＰＤＸ１プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系の生成
細胞単離に関してＰＤＸ１マーカーを使用するために、本発明者等は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。この実施例は、ＰＤＸ１調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。この実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。

【0298】

レポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けしたＰＤＸ１発現胚体内胚葉細胞系は、ＰＤＸ１遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を配置させることにより構築された。まず、ＥＧＦＰ発現がヒトＰＤＸ１遺伝子プロモーターにより駆動されるプラスミド構築物は、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech)のＣＭＶプロモーターをＰＤＸ１転写開始部位の上流約４．４キロ塩基対（ｋｂ）から下流約８５塩基対（ｂｐ）に及ぶヌクレオチド配列を含むヒトＰＤＸ１制御領域（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９２４９６）で置き換えることにより生成された。この領域は、ＰＤＸ１遺伝子の特徴とされる調節要素を含有し、トランスジェニックマウスにおいて正常なＰＤＸ１発現パターンを付与するのに十分である。得られたベクターにおいて、ＥＧＦＰの発現は、ＰＤＸ１プロモーターにより駆動される。いくつかの実験では、このベクターは、ｈＥＳＣへトランスフェクトすることができる。

【0299】

ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記ベクターから切除して、続いてホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクターへサブクローニングした。選択カセットは、カセットの除去を可能にするためにｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接された。この選択ベクターを線状化した後、標準的なリポフェクション方法を使用してｈＥＳＣへ導入した。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後に、未分化のトランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離及び拡大させた。

【0300】

[実施例２３]
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣがＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へ分化され得て、これに続いて蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により単離され得ることを実証する。

【0301】

ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣは、アクチビンＡ含有培地中で５日間、これに続いてアクチビンＡ及びＲＡを含む培地中で２日間分化させた。続いて、分化細胞は、トリプシン消化により収集して、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ上でＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳへ直接選別した。単一の生細胞のサン
プルが、ＥＧＦＰに関してゲーティングすることなく採取され（Ｌｉｖｅ）、単一の生細胞は、ＥＧＦＰ陽性（ＧＦＰ）及びＧＦＰ陰性（Ｎｅｇ）集団へゲーティングされた。一実験では、ＥＧＦＰ陽性分画は、蛍光強度に従って２つの同様のサイズの集団に分離された（Ｈｉ及びＬｏ）。

【0302】

選別後、細胞集団は、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学の両方により分析した。Ｑ−ＰＣＲに関して、ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカラムを使用して調製されて、その後ｃ
ＤＮＡへ変換された。Ｑ−ＰＣＲは、上述したように実施した。免疫組織化学分析に関して、細胞をＰＢＳ中に選別して、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定して、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機を使用してスライドガラス上へ接着させた。サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９）に対する一次抗体はChemicon製であり、肝細胞核因子３β（ＨＮＦ３β）に対する一次抗体はSanta Cruz製であり、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）に対する一次抗体はR&D systems製であった。ＦＩＴＣ(緑色）又はローダミン（赤色）に結合させた適切な二次抗体を使用して、一次抗体の結合を検出した。

【0303】

分化細胞の典型的なＦＡＣＳ選別を図４５に示す。この実施例における単離ＰＤＸ１陽性細胞パーセントはおよそ７％であり、約１％〜約２０％まで分化効率に応じて変化した。

【0304】

選別した細胞はさらに、Ｑ−ＰＣＲ分析に付した。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＰＤＸ１遺伝子発現との相関を示した。非蛍光性細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＰＤＸ１発現レベルの２０倍を超える増大を示した（図４６）。高及び低ＥＧＦＰ強度の細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＰＤＸ１発現レベルと相関することを示した（図４７）。ＰＤＸ１マーカー分析に加えて、選別した細胞は、膵臓内胚葉において発現されるいくつかの遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析に付した。これらのマーカー遺伝子（ＮＫＸ２．２、ＧＬＵＴ２、ＫＲＴ１９、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ３β）のそれぞれの産物はすべて、ＥＧＦＰ陽性分画で富化された（図４８Ａ〜図４８Ｅ）。対照的に、神経マーカーＺＩＣ１及びＧＦＡＰは、選別されたＥＧＦＰ発現細胞において富化されなかった（図４９Ａ及び図４９Ｂ）。

【0305】

免疫組織化学により、事実上すべての単離ＰＤＸ１陽性細胞が、ＫＲＴ１９及びＧＬＵＴ２を発現するとみなされた。この結果は、膵臓内胚葉系統の細胞に関して予測される。これらの細胞の多くはまた、抗体染色によりＨＮＦ３β陽性であった。

【0306】

[実施例２４]
マウス腎臓被膜下のヒト胚体内胚葉細胞の移植
本明細書中に記載される方法を用いて産生されたヒト胚体内胚葉細胞が、腸管由来の細胞を産生するよう分化因子に応答し得ることを実証するために、このようなヒト胚体内胚葉細胞をｉｎ ｖｉｖｏ分化プロトコールに付した。

【0307】

ヒト胚体内胚葉細胞を、上記実施例に記載されたように産生した。このような細胞を収穫
し、標準手法を用いて免疫無防備状態マウスの腎臓被膜下に移植した。３週間後、マウスを屠殺し、移植組織を取り出して、切片にして、組織学的及び免疫細胞化学的分析に付した。

【0308】

図５０〜図５０Ｄは、移植後３週間目に、ヒト胚体内胚葉細胞は腸管由来の細胞及び細胞構造物に分化した、ということを示す。特に図５０Ａは、腸管様構造物に分化した移植ヒト胚体内胚葉組織のヘマトキシリン及びエオシン染色切片を示す。図５０Ｂは、肝細胞特異的抗原（ＨＳＡ）に対する抗体で免疫染色した移植ヒト胚体内胚葉切片を示す。この結果は、ヒト胚体内胚葉細胞が肝臓又は肝臓前駆体細胞に分化し得る、ということを示す。図５０Ｃ及び図５０Ｄはそれぞれ、ビリンに対する抗体及び尾型ホメオボックス転写因子２（ＣＤＸ２）に対する抗体で免疫染色した移植ヒト胚体内胚葉切片を示す。これらの結果は、ヒト胚体内胚葉細胞が腸細胞又は腸細胞前駆体に分化し得る、ということを示す。

【0309】

[実施例２５]
ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な分化因子の同定
本明細書中に記載する分化因子のスクリーニング方法を例証するために、様々な時点で或る特定のマーカー遺伝子産物の標準化した発現レベルを測定しながら、本明細書中に記載する方法を使用して産生されるヒト胚体内胚葉細胞の集団に、いくつかの候補分化因子を別個に供給した。

【0310】

ヒト胚体内胚葉細胞は、上述の実施例に記載されるように産生した。簡潔に述べると、ｈＥＳＣ細胞は、低血清ＲＰＭＩ培地中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で４日間成長させ、ここで１日目のウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度は０％であり、２日目のＦＢＳ濃度は０．２％であり、３〜４日のＦＢＳ濃度は２％であった。５日目に始まり、１０日目に終了する胚体内胚葉の形成後に、０．２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中での個々のプレートにおいて維持される細胞集団を、２０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ｂ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２のうちの１つで処理した。アルブミン、ＰＲＯＸ１及びＴＩＴＦ１に関するマーカー遺伝子産物の発現を、Ｑ−ＰＣＲを使用して定量した。

【0311】

図５１Ａは、アルブミン遺伝子産物（肝臓前駆体及び肝細胞に関するマーカー）の発現が、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２に応答して、この分化因子で処理する前の４日目の胚体内胚葉細胞における発現と比較して９日目及び１０日目で実質的に増大したことを示す。アルブミン遺伝子産物の発現はまた、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ｂに応答して、未処理の胚体内胚葉細胞における発現と比較して９日目及び１０日目で増大されたが、増大は、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２処理で観察される増大ほど大きくなかった。アルブミン遺伝子産物の発現が、１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２に応答して、４日目の胚体内胚葉細胞の発現と比較して９日目及び１０日目で増大されなかったという観察は特に重要である。同様の結果が、図５１Ｂに示されるように、ＰＲＯＸ１マーカー（肝臓前駆体及び肝細胞に関する第２のマーカー）で観察された。図５１Ｃは、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を供給した細胞集団では、ＴＩＴＦ１マーカー遺伝子の発現が、この分化因子で処理する前の４日目の胚体内胚葉細胞における発現と比較して、７日目、９日目及び１０日目に実質的に増大したが、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２は、未処理の胚体内胚葉と比較して、この遺伝子産物の発現に対してほとんど影響しなかったことを示す。総括すると、図５１Ａ〜図５１Ｃに示される結果は、候補分化因子が細胞集団に供給される濃度が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚体内胚
葉細胞の分化最終形に影響を及ぼし得ることを示す。

【0312】

[実施例２６]
候補分化因子に応答したマーカーアップレギュレーション及びダウンレギュレーション
本明細書中に記載する分化因子スクリーニング方法をさらに例証するために、ヒト胚体内
胚葉細胞の集団を、実施例２５に記載される手順に類似した手順を使用して候補分化因子を用いてスクリーニングした。

【0313】

ヒト胚体内胚葉細胞は、上述の実施例に記載されるように産生した。簡潔に述べると、ｈＥＳＣ細胞は、低血清ＲＰＭＩ培地中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で４日間成長させ、ここで１日目のウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度は０％であり、２日目のＦＢＳ濃度は０．２％であり、３〜４日のＦＢＳ濃度は２％であった。５日目に始まり、１０日目に終了する胚体内胚葉の形成後に、０．２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中での個々のプレートにおいて維持される細胞集団を、２０〜５０ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３Ａ、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２又は１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２のうちの１つで処理した。胚体内胚葉形成後の５日目に（ｈＥＳＣからの分化の開始の９日後）、ＢＭＰ４を５０ｎｇ／ｍｌで培養物すべてに添加した。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、シトクロムＰ４５０ ７Ａ（ＣＹ
Ｐ７Ａ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、肝細胞核因子４ａ（ＨＮＦ４ａ）、ＣＸＣ型ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）、血管細胞接着分子−１（ＶＡＣＭ１）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）、グルコーストランスポーター−２（ＧＬＵＴ２）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、グルコキナーゼ（ＧＬＵＫＯ）及びヒト造血発現ホメオボックス（ｈＨＥＸ）に関するマーカー遺伝子産物（ｍＲＮＡ）の発現を、Ｑ−ＰＣＲを使用して定量した。

【0314】

図５２Ａ及び図５２Ｂは、ＡＦＰ遺伝子産物（肝前駆体及び肝細胞に関するマーカー）及びＡＡＴの発現が、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２及び５０ｎｇ／ｍｌでのＢＭＰ４に応答して、４日目の胚体内胚葉細胞の発現と比較して、９日目及び１０日目で実質的に増大したことを示す。ＡＦＰ及びＡＡＴのｍＲＮＡの発現は、ＢＭＰ４の存在下でさえ、より高濃度のＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）により実質的に増大されなかった（図５１Ａ及び図５１Ｂの９日目及び１０日目）。上記の結果と対照的に、ＧＬＵＫＯ、ｈＨＥＸ及びＴＡＴのｍＲＮＡの発現は、４日目の胚体内胚葉細胞の発現と比較して、９日目及び１０日目に１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２及び５０ｎｇ／ｍｌでのＢＭＰ４の存在下で実質的にアップレギュレートされた。ＧＬＵＫＯの場合、ＢＭＰ４有り又は無しで、５ｎｇ／ｍｌでのＷｎｔ３ＡもＦＧＦ２も、このマーカーの発現の増大を引き起こさなかった（図５２Ｃ）。しかしながら、５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２は、ＢＭＰの存在下での１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２により引き起こされる増大を上回るか、或いはそれに等しい程度に、ＢＭＰの存在下でｈＨＥＸの発現の増大を引き起こした（図５２Ｄ）。胚体内胚葉細胞における発現と比較する場合の９日目及び１０日目のＴＡＴの発現は、試験される因子それぞれにより増大された（図５２Ｅ）。さらに、或る特定の細胞マーカーは、Ｗｎｔ３Ａの存在下では胚体内胚葉細胞と比較して増大レベルで発現されたが、ＦＧＦ／ＢＭＰの組合せに応答して発現されなかった。特に、ｈＮＦ４ａのｍＲＮＡの発現は、Ｗｎｔ３Ａ及びＢＭＰ４の組合せに応答して９日目及び１０日目で有意に増大された（図５２Ｆ）。さらに、ＣＹＰ７Ａは、１０日目にＷｎｔ３Ａ／ＢＭＰ４に応答してわずかな増大を示した（図５２Ｇ）。

【0315】

多数の異なる細胞型で発現されることが既知であるいくつかのマーカーも観察した。具体的には、マーカーＡＰＯＡ１、ＧＬＵＴ２、ＶＣＡＭ１、ＶＷＦ及びＣＸＣＲ４を検査した。すでに、これらのマーカーそれぞれの発現が、以下に記載するように特定の細胞型と相関している：マーカーＡＰＯＡ１及びＧＬＵＴ２は、肝臓では高度に発現されて、十二指腸及び小腸では中程度に発現される。マーカーＶＣＡＭ１は、肝臓では高レベルで発現され、胃、十二指腸及び小腸では中程度のレベルで発現され、肺及び膵臓ではより低レベルであるが、有意なレベルで発現される。対比して、マーカーＶＷＦ及びＣＸＣＲ４は、肺では高レベルで発現されるが、肝臓ではほんの低レベルで発現される。ＶＷＦ及びＣＸＣＲ４の両方はまた、胃、膵臓、十二指腸及び小腸では中程度〜高レベルで発現される。

【0316】

上述のマーカーそれぞれの発現は、Ｗｎｔ３、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４の組合せと接触させた胚体内胚葉細胞培養物においてモニタリングされた。上記の結果と一致して、図５２Ｈ〜図５２Ｊは、ＧＬＵＴ２、ＡＰＯＡ１及びＶＣＡＭ１ ｍＲＮＡ発現が、胚体内胚葉に
おける発現と比較して、９日目及び１０日目に５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２及びＢＭＰ４の組合せに応答して増大されたことを示す。これらのマーカーに関するｍＲＮＡ発現は、１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２及びＢＭＰ４の組合せに応答して実質的に増大されなかった。ＡＰＯＡ１及びＶＣＡＭ１マーカーｍＲＮＡの場合、９日目及び１０日目の発現の最大の増大は、Ｗｎｔ３Ａ及びＢＭＰ４の組合せにより媒介された（図５２Ｉ及び図５２Ｊ）。

【0317】

上述の事項に加えて、或る特定のｍＲＮＡの発現は、胚体内胚葉における発現と比較して減少された。例えば、胚体内胚葉における発現と比較した場合、ＶＷＦ及びＣＸＣＲ４ｍＲＮＡ発現はともに、ＢＭＰ４の存在下及び非存在下でのＷｎｔ３Ａとの接触後に、並びにＢＭＰ４の存在下及び非存在下での５ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２との接触後に減少された（図５２Ｋ及び図５２Ｌ）。ＢＭＰ４の非存在下及び存在下の両方における１００ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ２との接触は、これらの２つのマーカーの減少速度を大きく低減させた（図５２Ｋ及び図５２Ｌ）。実際に、ＣＸＣＲ４の発現は、１０日目であっても実質的に維持された（図５２Ｌ）。

【0318】

本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用は当業者に思い付かれ、これらは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により明確にされる。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。

【0319】

特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は関与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、しかし他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かによって、存在することもあり、しないこともあり得る、ということを示す。

【0320】

［参考文献］
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。

【0321】

いくつかの参考文献に関しては、全引用が文書の本文中に存在する。他の参考文献に関しては、文書の本文中における引用は著者及び年で示しているが、全引用を以下に示す：

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52-1】

【図52-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]