特許 6643815 腸内状態の判定方法、および腸内状態の判定装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6643815

(24)【登録日】2020年1月9日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】腸内状態の判定方法、および腸内状態の判定装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20200130BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20200130BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/06ZNA

   C12N15/09 Z

   G01N33/48 Z

【請求項の数】7

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2015-100578(P2015-100578)

(22)【出願日】2015年5月15日

(65)【公開番号】特開2016-214111(P2016-214111A)

(43)【公開日】2016年12月22日

【審査請求日】2018年4月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000006127

【氏名又は名称】森永乳業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100149548

【弁理士】

【氏名又は名称】松沼 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100153763

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 広之

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(72)【発明者】

【氏名】小田巻 俊孝

(72)【発明者】

【氏名】菅原 宏祐

(72)【発明者】

【氏名】加藤 久美子

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１６５７１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５３１２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−０８９９１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２００１４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−１２６７４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１５４５１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nutrients, 2015.05.06, Vol.7, pp.3279-3299

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の被験者の各々を識別する識別子と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記複数の被験者の各々の属性を表す情報と、が対応付けられている腸内細菌叢データベースを用いて、クラスタ数を算出するクラスタ数算出工程と、
前記腸内細菌叢データベースが多次元尺度法によって分析された結果を、前記クラスタ数算出工程によって算出された前記クラスタ数のクラスタに分類し、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の年齢に基づいて、各クラスタに対してラベルを付与するラベル付与工程と、
前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、対象者から抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記腸内細菌叢データベースと、を多次元尺度法によって分析することで、前記対象者の腸内状態を年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれに属しているか判定する判定工程と、
を含み、
前記判定工程における前記２つ以上のタイプは、前記ラベル付与工程によって付与された前記ラベルである腸内状態の判定方法。

【請求項2】

前記対象者の糞便から抽出した腸内細菌叢の情報に、前記複数の被験者から抽出されかつ前記複数の被験者からのみ抽出された前記腸内細菌叢の情報を付加し、前記付加した前記腸内細菌叢の情報に０％の構成割合を挿入する対象者情報更新工程と、をさらに含み、
前記判定工程では、
前記腸内細菌叢データベースに格納されている複数の前記被験者の前記腸内細菌叢の情報と、更新された前記対象者の前記腸内細菌叢の情報が統合され、前記統合された腸内細菌叢の情報が、多次元尺度法によって分析されることで、前記対象者の腸内状態が前記年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれかに属しているか判定される、請求項１に記載の腸内状態の判定方法。

【請求項3】

前記腸内細菌叢データベースに含まれる前記複数の被験者の年齢を、複数の年齢グループに分類する年齢分類工程、をさらに含み、
前記ラベル付与工程は、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の前記年齢グループに基づいて、各クラスタに対してラベルを予め付与する、請求項１または請求項２に記載の腸内状態の判定方法。

【請求項4】

前記多次元尺度法は、主座標分析または主成分分析である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の腸内状態の判定方法。

【請求項5】

前記複数の被験者は、離乳前から１０４歳までの年齢グループの各々について複数の被験者を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の腸内状態の判定方法。

【請求項6】

前記腸内細菌叢データベースは、
前記被験者から抽出された全ての腸内細菌に対する前記被験者から抽出された腸内細菌の各々の比率を前記被験者毎に取得する取得工程と、
前記取得工程によって取得された前記被験者毎の腸内細菌の各々の比率を用いて、前記被験者の総数ｍ（ｍは２以上の整数）と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の種類の総数ｎ（ｎは２以上の整数）とを抽出する抽出工程と、
前記抽出工程によって抽出された前記被験者の総数ｍと、前記複数の腸内細菌の種類の総数ｎと、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、を用いて、ｍ行×ｎ行の構成データを構築する構成データ構築工程と、
前記複数の被験者の各々の年齢を示す情報を取得し、取得した前記被験者毎の年齢を示す情報を、前記構成データ構築工程で構築された前記構成データに対応付けて腸内細菌叢データベースを構築するデータベース構築工程、
によって構築されたデータベースである、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の腸内状態の判定方法。

【請求項7】

複数の被験者の各々を識別する識別子と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記複数の被験者の各々の属性を表す情報と、が対応付けられている腸内細菌叢データベースと、
前記腸内細菌叢データベースを用いて、クラスタ数を算出し、前記腸内細菌叢データベースが多次元尺度法によって分析された結果を、算出した前記クラスタ数のクラスタに分類し、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の年齢に基づいて、各クラスタに対してラベルを付与し、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、対象者から抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記腸内細菌叢データベースと、を多次元尺度法によって分析する解析部と、
前記解析部によって解析された結果に基づいて、前記対象者の腸内状態を年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれかに分類する判定部と、
を備える腸内状態の判定装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸内状態の判定方法、および腸内状態の判定装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、健康への関心が高まるなか、腸年齢に注目が集まっている。なお、腸年齢とは、腸内の状態に基づいて決定された年齢（または年代）である。ヒトや動物の腸管には、多数の細菌が存在し腸内細菌叢を形成している。腸内細菌叢を構成している細菌の種類は、生理、疾病、薬物、食物、生活習慣、ストレス、老化、腸内菌の相互作用等によって変動する。

【0003】

このような腸内状態を調べるため、平均３０歳の若年者群と、７０歳の高齢者群、および１００歳以上の高齢者群それぞれの糞便のサンプルに対して、系統発生マイクロアレイ(phylogenetic microarray＝16S rRNA gene ampliconを調べるHuman Intestinal Tract Chip, HITChip)を用いて主因子分析(Principal Component Analysis:PCA)を行い、腸内細菌叢について分析する。そして、１００歳以上の高齢者群と、その子孫の腸内細菌叢との組成分布を比較する。また、被験者の炎症性状態と腸内細菌叢について組成の関連についての分析が行われている（例えば、非特許文献１参照）。

【0004】

また、若年者と、高齢者それぞれの糞便に含まれる細菌の塩基配列を解析し、若年者と、高齢者それぞれの腸内細菌叢について組成分布を分析することが行われている（例えば、非特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】“Through Ageing, and Beyond: Gut Microbiota and Inflammatory Status in Seniors and Centenarians”、Elena Biagi,Lotta Nylund,他,PLoS ONE,May 2010 Volume 5 Isseu 5 e10667,2010

【非特許文献2】“Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly”,Marcus J. Claesson, Siobhan Cusack,他,PNAS,www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1000097107,2010

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、非特許文献１および非特許文献２に記載の技術では、対象者の腸内状態を判定することができなかった。

【0007】

本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、腸内状態を判定または推定することができる腸内状態の判定方法、および腸内状態の判定装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

（１）上記目的を達成するため、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法は、複数の被験者の各々を識別する識別子と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記複数の被験者の各々の属性を表す情報と、が対応付けられている腸内細菌叢データベースを用いて、クラスタ数を算出するクラスタ数算出工程と、前記腸内細菌叢データベースが多次元尺度法によって分析された結果を、前記クラスタ数算出工程によって算出された前記クラスタ数のクラスタに分類し、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の年齢に基づいて、各クラスタに対してラベルを付与するラベル付与工程と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、対象者から抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記腸内細菌叢データベースと、を多次元尺度法によって分析することで、前記対象者の腸内状態を年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれに属しているか判定する判定工程と、を含み、前記判定工程における前記２つ以上のタイプは、前記ラベル付与工程によって付与された前記ラベルである。

【0010】

（２）また、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法において、前記対象者の糞便から抽出した腸内細菌叢の情報に、前記複数の被験者から抽出されかつ前記複数の被験者からのみ抽出された前記腸内細菌叢の情報を付加し、前記付加した前記腸内細菌叢の情報に０％の構成割合を挿入する対象者情報更新工程と、をさらに含み、前記判定工程では、前記腸内細菌叢データベースに格納されている複数の前記被験者の前記腸内細菌叢の情報と、更新された前記対象者の前記腸内細菌叢の情報が統合され、前記統合された腸内細菌叢の情報が、多次元尺度法によって分析されることで、前記対象者の腸内状態が前記年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれかに属しているか判定されるようにしてもよい。

【0011】

（３）また、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法において、前記腸内細菌叢データベースに含まれる前記複数の被験者の年齢を、複数の年齢グループに分類する年齢分類工程、をさらに含み、前記ラベル付与工程は、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の前記年齢グループに基づいて、各クラスタに対してラベルを予め付与するようにしてもよい。

【0012】

（４）また、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法において、前記多次元尺度法は主座標分析または主成分分析であるようにしてもよい。
（５）また、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法において、前記複数の被験者は、離乳前から１０４歳までの年齢グループの各々について複数の被験者を含むようにしてもよい。

【0013】

（６）また、本発明の一態様に係る腸内状態の判定方法において、前記腸内細菌叢データベースは、前記被験者から抽出された全ての腸内細菌に対する前記被験者から抽出された腸内細菌の各々の比率を前記被験者毎に取得する取得工程と、前記取得工程によって取得された前記被験者毎の腸内細菌の各々の比率を用いて、前記被験者の総数ｍ（ｍは２以上の整数）と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の種類の総数ｎ（ｎは２以上の整数）とを抽出する抽出工程と、前記抽出工程によって抽出された前記被験者の総数ｍと、前記複数の腸内細菌の種類の総数ｎと、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、を用いて、ｍ行×ｎ行の構成データを構築する構成データ構築工程と、前記複数の被験者の各々の年齢を示す情報を取得し、取得した前記被験者毎の年齢を示す情報を、前記構成データ構築工程で構築された前記構成データに対応付けて腸内細菌叢データベースを構築するデータベース構築工程、によって構築されたものであるようにしてもよい。

【0014】

（７）上記目的を達成するため、本発明の一態様に係る腸内状態の判定装置は、複数の被験者の各々を識別する識別子と、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、前記複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記複数の被験者の各々の属性を表す情報と、が対応付けられている腸内細菌叢データベースと、前記腸内細菌叢データベースを用いて、クラスタ数を算出し、前記腸内細菌叢データベースが多次元尺度法によって分析された結果を、算出した前記クラスタ数のクラスタに分類し、前記クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の年齢に基づいて、各クラスタに対してラベルを付与し、前記複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、対象者から抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、前記腸内細菌叢データベースと、を多次元尺度法によって分析する解析部と、前記解析部によって解析された結果に基づいて、前記対象者の腸内状態を年齢に基づく２つ以上のタイプのいずれかに分類する判定部と、を備える。

【発明の効果】

【0015】

（１）および（７）によれば、腸内細菌叢データベースに格納されている複数の腸内細菌によって構成される腸内細菌叢情報を多次元尺度法によって分析した結果を用いて、対象者の腸内細菌叢の情報を、属性に基づくタイプに分類する。この結果、（１）によれば、対象者の腸内状態を２つ以上のタイプに分類することができる。なお、細菌の各分類レベルとは、門、綱、目、科、属、種等の分類レベルである。

【0016】

（１）および（７）によれば、予め算出したクラスタのいずれかのタイプに対象者の腸内状態を分類
することができる。
（２）によれば、複数の被験者の腸内細菌叢の構成割合によって構成される構成データと、対象者の腸内細菌叢の構成割合によって構成される構成データと、の列を揃えることができるので、２つの構成データを統合して多次元尺度法を行うことができる。この結果、（２）によれば、対象者の腸内細菌叢の構成割合である腸内状態を、複数の被験者の腸内細菌叢の構成割合に基づいて判定または推定することができる。

【0017】

（３）によれば、年齢グループに基づいて付与されたラベルを有するクラスタに、対象
者の腸内状態を分類することができる。これにより、（３）によれば、判定結果が年齢グ
ループに基づいた名称であるため、判定結果を受け取る対象者が判定結果を理解しやすく
なる。

【0018】

（４）または（５）によれば、対象者の腸内状態を、腸内細菌叢データベースに格納されている腸内細菌叢情報を主座標分析、主成分分析によって分析し、クラスタリングされたクラスタに含まれる年齢に基づいて、２つ以上のタイプのいずれかに分類することができる。この結果、（４）または（５）では、年齢に応じてラベルが付与されたいずれかのタイプに対象者の腸内状態を分類することができる。
（６）によれば、被験者または対象者以外から抽出された腸内細菌を用いて、腸内細菌叢データベースを構築することができる。この結果、本実施形態では、このように構築された腸内細菌叢データベースと、対象者の腸内細菌叢情報とを、多次元尺度法で分析することで、対象者の腸内状態を精度良く推定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】実施形態に係る腸内状態の判定装置のブロック図である。

【図2】実施形態に係る腸内状態の判定装置が行う処理のフローチャートである。

【図3】実施形態に係る腸内細菌叢データベースの構築手順の一例を表す図である。

【図4】実施形態に係る解析部が行うクラスタリング処理およびラベル処理手順の一例を表す図である。

【図5】実施形態に係る主座標分析を行い３つのクラスタに分類した結果を示す図である。

【図6】実施形態に係る主成分分析を行い３つのクラスタに分類した結果を示す図である。

【図7】図５および図６における各クラスタの年齢層の例を示す図である。

【図8】図５および図６に示した分析結果における、年齢層における各クラスタの割合を示す図である。

【図9】対象者の腸内状態の判定処理のフローチャートである。

【図10】実施形態に係る腸内細菌抽出装置が行う腸内細菌の抽出処理のフローチャートである。

【図11】第１の試験例における４０歳男性の対象者を含む３８０人分の腸内細菌叢を主座標分析した結果を示す図である。

【図12】第２の試験例における４０歳男性の対象者を含む３８０人分の腸内細菌叢を主成分分析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。なお、本明細書、特許請求の範囲に記載される「判定」および「推定」の語句は、本開示においてほぼ同義のものであるとして用いられるものである。

【0021】

＜腸内状態の判定装置１の構成＞
まず、腸内状態の判定装置１の構成について説明する。
図１は、本実施形態に係る腸内状態の判定装置１のブロック図である。図１に示すように、腸内状態の判定装置１は、腸内細菌抽出装置１１、データベース生成部１２、データベース１３、解析部１４、および判定部１５を備える。

【0022】

腸内細菌抽出装置１１は、被験者および対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）の試料から腸内細菌を抽出する。ここで、被験者とは、腸内細菌叢のデータベースを構築するために試料を提供した人である。また、対象者とは、腸内状態の推定が行われる人である。なお、データベース構築後、被験者が対象者であってもよい。抽出された抽出結果には、被験者または対象者を識別するための識別子と、抽出された細菌名と、各細菌の構成割合を示す情報とが含まれている。腸内細菌抽出装置１１は、抽出した被験者または対象者の抽出結果を、データベース生成部１２と解析部１４に出力する。なお、腸内細菌の抽出方法については後述する。また、腸内細菌抽出装置１１は、後述するように、複数の装置、および複数のアプリケーション等によって構成されていてもよい。

【0023】

データベース生成部１２は、腸内細菌抽出装置１１が出力した抽出結果に、入力された被験者の属性を対応付けて腸内細菌叢データベースを構築し、構築した腸内細菌叢データベースをデータベース１３に格納する。ここで被験者の属性とは、被験者の年齢、性別、体重、身長、居住地、出身地、国籍等である。なお、以下の例では、被験者の属性として年齢の場合を説明する。また、属性は、被験者の年齢層であってもよい。ここで、年齢層とは、例えば０〜１０歳、１０〜１９歳、・・・、９０〜９９歳、１００歳以上等、所定の年齢の集合のうちの１つであってもよい。例えば、被験者の年齢が４２歳の場合、属性は４０〜４９歳であってもよい。

【0024】

データベース１３には、表１に示すように、被験者の識別子に、年齢（属性）と、腸内細菌叢の構成割合とが関連付けられて格納されている。なお、腸内細菌叢の構成割合とは、ｍ（ｍは２以上の整数）人の被験者から抽出された全ての細菌の種類ｎ（ｎは２以上の整数）において、被験者それぞれから抽出された腸内細菌それぞれの保有数の占有割合である。このため、他の被験者からのみ抽出された腸内細菌に対する割合は、０％となる。

【0025】

【表1】

【0026】

なお、表１における細菌の分類レベルは、門、綱、目、科、属、種等のうちの少なくとも１つのレベルである。例えば、識別子が“１”には、年齢（属性）が“離乳中”、第１細菌の構成比率が“０．０５７（％）”、第２細菌の構成比率が“１．２３（％）”、・・・、第ｎ細菌の構成比率が“０（％）”が関連付けられている。なお、データベース１３に格納される被験者の年齢は、例えば離乳中（０歳）〜１０４歳において、年齢層毎に複数名の腸内細菌叢の情報（以下、腸内細菌叢情報という）が格納されている。なお、データベース１３には、細菌の分類レベル毎の腸内細菌叢情報に基づく腸内細菌叢データベースが格納されていてもよい。
また、データベース１３には、表２に示すように、クラスタ数としてＰが格納され、表３に示すように、クラスタ毎のラベル名として第１ラベル名、・・・、第Ｐラベル名が格納されている。

【0027】

【表2】

【0028】

【表3】

【0029】

また、各年齢層の被験者の腸内細菌叢情報が、例えば３０人分ずつデータベース１３に格納されている。なお、クラスタ数、ラベル名については、後述する。

【0030】

解析部１４は、データベース１３に格納されているｍ人分の腸内細菌叢情報を読み出し、読み出した腸内細菌叢情報に対して、最適なクラスタ数を算出する。解析部１４は、例えばＣａｌｉｎｓｋｉ−Ｈａｒａｂａｓｚ基準を使用してＣａｌｉｎｓｋｉ−Ｈａｒａｂａｓｚ （ＣＨ） Ｉｎｄｅｘを算出する。解析部１４は、算出した値のうち最も高い値をクラスタ数Ｐとして、データベース１３に格納する。なお、解析部１４は、Ｃｕｂｉｃ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、Ｄｕｎｎ’ｓ Ｉｎｄｅｘ、ＤＢ’ｓ Ｉｎｄｅｘ、Ｐｓｅｕｄｏ Ｔ−ｓｑｕａｒｅ等の他の手法を用いて、最適なクラスタ数を算出するようにしてもよい。

【0031】

解析部１４は、読み出した腸内細菌叢情報に対して、例えばＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．０．３）ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて、主座標分析による分析処理を行う。なお、解析部１４は、腸内細菌叢情報に対して、主成分分析、計量多次元尺度法、非計量多次元尺度法等の他の多次元尺度法によって分析を行うようにしてもよい。解析部１４は、主座標分析を行った結果に基づいて、算出したクラスタ数Ｐのいずれかにｍ人を、最短距離法、最長距離法群平均法、ウォード法、Ｋ−ｍｅａｎｓ法等を用いて分類する。解析部１４は、分類したクラスタ毎に含まれる年齢の構成に基づいて、クラスタ毎にクラスタ名を付与する。
解析部１４は、腸内細菌抽出装置１１が出力した対象者の腸内細菌叢情報と、データベース１３に格納されているｍ人の腸内細菌叢情報とを統合し、統合した（ｍ＋１）人の腸内細菌叢情報に対して主座標分析を行う。解析部１４は、解析した解析結果を判定部１５に出力する。

【0032】

判定部１５は、解析部１４が出力した解析結果において、対象者の腸内細菌叢情報が、分類されたクラスタのいずれに属しているか判定する。判定部１５は、判定した判定結果を、プリンタ、表示部（不図示）等に出力する。なお、腸内状態の判定装置１または外部装置は、判定結果に基づいて、対象者への健康に関するアドバイスや食事に関するアドバイス等を生成するようにしてもよい。この場合、腸内状態の判定装置１または外部装置には、実年齢と推定された年齢毎に、健康に関するアドバイスや食事に関するアドバイス等が対応付けられたデータベースが接続されていてもよい。

【0033】

＜腸内状態の判定装置１が行う処理手順の概略＞
次に、腸内状態の判定装置１が行う処理手順の概略について説明する。
図２は、本実施形態に係る腸内状態の判定装置１が行う処理のフローチャートである。
（ステップＳ１）腸内細菌抽出装置１１は、複数の年齢層の被験者の試料それぞれから、腸内細菌の抽出処理を行う。
（ステップＳ２）データベース生成部１２は、腸内細菌抽出装置１１が抽出した抽出結果に、入力された被験者の属性を対応付けてデータベースの構築処理を行う。

【0034】

（ステップＳ３）解析部１４は、データベース１３から読み出したｍ人分の腸内細菌叢情報に対して最適なクラスタ数Ｐを算出し、算出したクラスタ数Ｐをデータベース１３に格納する。

【0035】

（ステップＳ４）解析部１４は、ステップＳ３で読み出したｍ人分の腸内細菌叢情報に対して等の多次元尺度法分析による分析処理を行って、クラスタ数Ｐのいずれかにｍ人を分類する。続けて、解析部１４は、分類したクラスタ毎に含まれる年齢の構成または後述する年齢グループの割合に基づいて、クラスタ毎にクラスタ名を付与するラベリング処理を行う。続けて、解析部１４は、付与したラベル名を、データベース１３に格納する。

【0036】

（ステップＳ５）腸内細菌抽出装置１１は、対象者の腸内細菌の抽出処理を行う。
（ステップＳ６）解析部１４は、データベース１３から読み出したｍ人分の腸内細菌叢情報に、腸内細菌抽出装置１１が出力した対象者の細菌叢情報を統合する。続けて、解析部１４は、（ｍ＋１）人分の腸内細菌叢情報に対して、主座標分析等の多次元尺度法分析による分析処理を行う。

【0037】

（ステップＳ７）判定部１５は、解析部１４によって解析された結果に基づいて、対象者の腸内細菌叢情報が、分類されたクラスタのいずれに属しているか判定することで、腸内状態の判定処理を行う。
なお、腸内状態の判定装置１は、対象者毎に、ステップＳ５〜Ｓ７の処理を繰り返す。

【0038】

以上のように、本実施形態では、特定の腸内細菌のみによって対象者の腸内状態を推定するのではなく、抽出された腸内細菌叢の構成割合に基づいて、対象者の腸内状態がいずれのクラスタに分類されるかを判定する。なお、本実施形態では、データベース１３の構築後、対象者の腸内状態の判定毎に、最適なクラスタ数の再計算を行わないことが好ましい。さらに、本実施形態では、データベース１３の構築後、対象者の腸内状態の判定毎に、各クラスタのラベル名を再付与しないことが好ましい。

【0039】

＜腸内細菌叢データベースの構築＞
次に、データベース生成部１２が図２のステップＳ２で行う腸内細菌叢データベースの構築方法の例について説明する。なお、データベース生成部１２は、門、綱、目、科、属等のうちの少なくとも１つのレベルについて腸内細菌叢データベースを構築する。
図３は、本実施形態に係る腸内細菌叢データベースの構築手順の一例を表す図である。
（ステップＳ１１）データベース生成部１２は、全ての被験者の腸内細菌叢の構成割合を取得する。図３の表ｈ１０１は、第１の被験者の腸内細菌叢の構成割合であり、図３の表ｈ１０２は、第２の被験者の腸内細菌叢の構成割合であり、図３の表ｈ１０３は、第ｍの被験者の腸内細菌叢の構成割合である。ここで、腸内細菌叢の構成割合とは、１人の被験者において、腸内細菌の全てに対する腸内細菌それぞれの割合である。なお、抽出される腸内細菌、および腸内細菌の種類数は、被験者間で異なる場合がある。例えば、第１の被験者から第１〜第１００の腸内細菌が検出され、第２の被験者から第１、３、・・、１００、１０１、１０２の腸内細菌が抽出される場合がある。

【0040】

（ステップＳ１２）データベース生成部１２は、ステップＳ１１で取得した全ての被験者の腸内細菌叢の構成割合の情報を用いて、被験者の総数ｍと、腸内細菌の種類の総数ｎとを抽出する。なお、抽出する細菌の種類の総数ｎは、細菌の各分類レベル（門、綱、目、科、属、種等）のうち少なくとも１つである。例えば、第１の被験者から抽出された腸内細菌の種類が、１００種類であり、他の被験者から当該１００種類とは異なる腸内細菌が８０種類抽出された場合、腸内細菌の種類の総数ｎは、１８０種類となる。データベース生成部１２は、抽出した被験者の総数ｍと、腸内細菌の種類の総数ｎとをデータベース１３に格納する。

【0041】

（ステップＳ１３）データベース生成部１２は、ステップＳ１２で抽出した被験者の総数、腸内細菌の種類の総数、およびステップＳ１１で取得した全ての被験者の腸内細菌叢の構成割合の情報を用いて、図３の表ｈ１１１に示すようにｍ×ｎの構成データを構築する。ｍ×ｎの構成データでは、図３の表ｈ１１１に示すように、他の被験者から抽出された腸内細菌の構成割合に０％をデータベース生成部１２が挿入する。

【0042】

（ステップＳ１４）データベース生成部１２は、各被験者の年齢（属性）情報を取得する。
（ステップＳ１５）データベース生成部１２は、ステップＳ１４で取得した年齢情報を、ステップＳ１３で構築したｍ×ｎの構成データに対応付けて、図３の表ｈ１２１に示すようにｍ行×（ｎ＋１）列の腸内細菌叢データベースを構築する。

【0043】

＜クラスタリング処理、ラベル処理＞
次に、解析部１４が、図２のステップＳ３、Ｓ４で行うクラスタリング処理およびラベル処理の例について説明する。
図４は、本実施形態に係る解析部１４が行うクラスタリング処理およびラベル処理手順の一例を表す図である。なお、データベース１３には、ｍ人分の腸内細菌叢情報（腸内細菌叢の細菌分類レベル（門、綱、目、科、属等のうちの少なくとも１つのレベル）での構成データ）が格納されているとする。

【0044】

（ステップＳ２１）解析部１４は、データベース１３からｍ人分の腸内細菌叢情報を読み出す。
（ステップＳ２２）解析部１４は、読み出したｍ人分の腸内細菌叢情報に対して、最適なクラスタ数を算出するために、例えばＣａｌｉｎｓｋｉ−Ｈａｒａｂａｓｚ基準を使用してＣＨ Ｉｎｄｅｘを算出する。続けて、解析部１４は、算出した値のうち、最も高い値をクラスタ数Ｐとして、データベース１３に格納する。なお、図４は、最適なクラスタ数Ｐが３として算出された例である。

【0045】

（ステップＳ２３）解析部１４は、読み出した腸内細菌叢情報に対して、例えばＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．０．３）ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて、主座標分析等の多次元尺度法で分析を行う。符号ｇ１が示す図は、主座標分析を行った結果の図である。主座標分析を行う場合は、まず第１主座標と第２主座標を求め、求めた第１主座標と第２主座標を用いて分析を行う。また、主成分分析を行う場合は、まず第１主成分と第２主成分を求め、求めた第１主成分と第２主成分を用いて分析を行う。

【0046】

（ステップＳ２４）解析部１４は、多次元尺度法分析を行った結果を、ステップＳ２２で算出したクラスタ数Ｐに、例えばウォード法によって分類する。符号ｇ２が示す図は、主座標分析を行った結果に対して、３つのクラスタに分類した図である。
（ステップＳ２５）解析部１４は、腸内細菌叢情報データベースに含まれる被験者それぞれの年齢を示す情報を読み出す。解析部１４は、読み出した年齢情報を、例えば表４に示したように、複数の年齢グループに分類する。続けて、解析部１４は、ステップＳ２４で分類されたクラスタ毎に含まれる被験者の年齢グループの割合を確認する。

【0047】

【表4】

【0048】

（ステップＳ２６）解析部１４は、クラスタ毎に含まれる年齢グループの割合に基づいて、クラスタ毎に、例えば表５（図４の符号ｇ６）に示すように、クラスタ名を付与する。なお、円グラフｇ３は、第１クラスタに分類された年齢グループぞれぞれの割合を表し、円グラフｇ４は、第２クラスタに分類された年齢グループぞれぞれの割合を表し、円グラフｇ５は、第３クラスタに分類された年齢グループぞれぞれの割合を表す。続けて、解析部１４は、付与したクラスタ名をデータベース１３に格納する。

【0049】

【表5】

【0050】

以上で、解析部１４が行うクラスタリング処理およびラベル処理を終了する。
すなわち、本実施形態では、多次元尺度法で分析された結果を、最適なクラスタ数Ｐに分類し、分類したクラスタ毎に含まれている被験者の年齢（属性）の割合に基づいて、クラスタにラベルを付与している。このラベルは、対象者の腸内状態の判定結果にも用いられる。

【0051】

＜主座標分析を行いクラスタに分類した結果の例＞
次に、主座標分析を行いクラスタに分類した結果の一例を説明する。
図５は、本実施形態に係る主座標分析を行い３つのクラスタに分類した結果を示す図である。図５において、横軸は、第１主座標、縦軸は、第２主座標である。また、図５に示す例は、ｍ＝３７９人、年齢０歳〜１０４歳、細菌数が１８７種類の腸内細菌叢情報を主座標分析した結果である。また、図５に示す例は、表４に示したように、離乳前、離乳中、離乳後〜９歳、１０−１９歳、２０−２９歳、３０−３９歳、４０−４９歳、５０−５９歳、６０−６９歳、７０−７９歳、８０−８９歳、９０−９９歳、および１００歳以上の１３の年齢グループに分けた例である。さらに、算出されたＣＨ Ｉｎｄｅｘの値のうち、最も高い値が３の例である。

【0052】

図５において円ｇ１０１で囲んだ範囲は、第１クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示し、円ｇ１０２で囲んだ範囲は、第２クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示し、円ｇ１０３で囲んだ範囲は、第３クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示している。また、白抜きの四角１〜四角３それぞれは、各クラスタの重心を表している。また、重心から各被験者の腸内細菌叢情報に接続されている線分は、各腸内細菌叢情報が、第１クラスタ〜第３クラスタのいずれのクラスタに属しているかを示している。

【0053】

＜主成分分析結果の例＞
次に、主成分分析を行いクラスタに分類した結果の一例を説明する。
図６は、本実施形態に係る主成分分析を行い３つのクラスタに分類した結果を示す図である。図６において、横軸は、第１主成分、縦軸は、第２主成分である。分析に用いた腸内細菌叢情報は、図５に示した主座標分析と同じである。

【0054】

図６において円ｇ２０１で囲んだ範囲は、第１クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示し、円ｇ２０２で囲んだ範囲は、第２クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示し、円ｇ２０３で囲んだ範囲は、第３クラスタに分類される被験者による腸内細菌叢情報を示している。また、重心１〜重心３から各被験者の腸内細菌叢情報に接続されている線分は、図５と同様である。

【0055】

＜各クラスタに含まれる年齢層の例＞
次に、図５および図６における各クラスタの年齢層の例について説明する。
図７は、図５および図６における各クラスタの年齢層の例を示す図である。
図７の円グラフｇ３０１は、第１クラスタの年齢層の割合を示し、円グラフｇ３０２は、第２クラスタの年齢層の割合を示し、円グラフｇ３０３は、第３クラスタの年齢層の割合を示す。

【0056】

円グラフｇ３０１が示すように、第１クラスタは、離乳前と離乳中と離乳後〜９歳の年齢の被験者の割合の合計が５０％程度である。このため、解析部１４は、第１クラスタに対して、エンテロタイプ（ｅｎｔｅｒｏｔｙｐｅ）として、“乳児”のラベル名を付与する。なお、エンテロタイプとは、ヒト腸内共生細菌叢のパターンであり、本実施形態では、ヒト腸内共生細菌叢のパターンに基づいて分類された年齢のタイプである。

【0057】

また、円グラフｇ３０２が示すように、第２クラスタは、１０−１９歳と２０−２９歳と３０−３９歳の年齢の被験者の割合の合計が５０％程度である。このため、解析部１４は、第２クラスタに対して“成人”のラベル名を付与する。
また、円グラフｇ３０３が示すように、第３クラスタは、８０−８９歳と９０−９９歳と１００歳以上の年齢の被験者の割合の合計が２／３以上である。このため、解析部１４は、第２クラスタに対して“高齢者”のラベル名を付与する。
なお、上述したラベル名は一例であり、これに限られない。各クラスタに含まれる年齢層に応じた名前であればよい。

【0058】

＜年齢層における各クラスタの割合＞
次に、図５および図６に示した分析結果における、年齢層における各クラスタの割合を説明する。
図８は、図５および図６に示した分析結果における、年齢層における各クラスタの割合を示す図である。
図８において、横軸は年齢層、縦軸は割合を表している。また、図８において、長方形ｇ４０１は“乳児”（第１クラスタ）を表し、長方形ｇ４０２は“成人”（第２クラスタ）を表し、長方形ｇ４０３は“高齢者”（第３クラスタ）を表す。

【0059】

図８において、例えば離乳中の年齢層の被験者では、約７０％が“乳児”に分類され、約３０％が高齢者”に分類される。
また、例えば８０−８９歳の年齢層の被験者では、約８０％が“高齢者”に分類され、約１６％が“成人”に分類され、約４％が“乳児”に分類される。
このように、多くの被験者は年齢相応のエンテロタイプに属しているが、離乳前にも関わらず成人エンテロタイプに属していたり、８０歳代にも関わらず乳児エンテロタイプに属していたりする被験者がおり、必ずしも実年齢と腸内細菌叢の構成年齢が一致するわけではない。

【0060】

＜対象者の腸内状態の判定＞
次に、対象者の腸内状態の判定処理手順の例を説明する。
図９は、本実施形態に係る対象者の腸内状態の判定処理のフローチャートである。
（ステップＳ５１）解析部１４は、データベース１３からｍ人分の腸内細菌叢情報を読み出す。
（ステップＳ５２）解析部１４は、データベース１３からクラスタ数、クラスタ毎のラベル名を読み出す。

【0061】

（ステップＳ５３）腸内細菌抽出装置１１は、後述する処理（図１０のステップＳ１０１〜Ｓ１１６）によって対象者の糞便を解析して、対象者の腸内細菌叢情報を抽出する。続けて、解析部１４は、腸内細菌抽出装置１１が出力した対象者の腸内細菌叢情報を取得する。

【0062】

（ステップＳ５４）解析部１４は、取得した対象者の腸内細菌叢情報に対して、対象者から抽出されずに被験者からのみ抽出された腸内細菌の情報を追加し、対象者の腸内細菌叢情報を更新する。例えば、対象者から抽出された腸内細菌の種類数が、１００種類の場合、腸内細菌抽出装置１１が出力する対象者の腸内細菌叢情報は、図９の符号ｇ４５１のように、１行×１００列の情報である。解析部１４は、図９の符号ｇ４５２および符号ｇ４５３に示すように、列情報へ８７（＝１８７−１００）種類の腸内細菌の情報を追加する。さらに、解析部１４は、符号ｇ４５３に示すように、追加した腸内細菌の情報の構成割合（構成比率）それぞれに０％を挿入する。なお、解析部１４は、腸内細菌叢データベースに格納されている細菌の分類レベルと同じ分類レベルで、対象者の腸内細菌叢情報を更新する。

【0063】

（ステップＳ５５）解析部１４は、読み出したｍ人分の腸内細菌叢情報と、ステップＳ５４で更新した対象者の腸内細菌叢情報とを統合する。続けて、解析部１４は、統合した（ｍ＋１）人分の腸内細菌叢情報に対して、例えばＲ ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて、主座標分析等の多次元尺度法分析を行う。続けて、解析部１４は、読み出したクラスタ数に腸内細菌叢情報を、例えばウォード法によって分類する。

【0064】

（ステップＳ５６）判定部１５は、対象者の腸内細菌叢の構成割合が、分類されたクラスのうち、いずれのクラスタに属するかを判定する。
（ステップＳ５７）判定部１５は、対象者の腸内細菌叢の構成割合が、どのクラスタに属しているかを判別する。判定部１５は、対象者の腸内細菌叢の構成割合が、第１クラスタに属していると判別した場合（ステップＳ５７；第１クラスタ）ステップＳ５８に処理を進め、第２クラスタに属していると判別した場合（ステップＳ５７；第２クラスタ）ステップＳ５９に処理を進め、第３クラスタに属していると判別した場合（ステップＳ５７；第３クラスタ）ステップＳ６０に処理を進める。

【0065】

（ステップＳ５８）判定部１５は、対象者の腸内状態を、第１のラベル名、例えば“乳児”であると判定し、判定した判定結果を外部装置に出力する。判定部１５は、判定結果を出力後、処理を終了する。
（ステップＳ５９）判定部１５は、対象者の腸内状態を、第２のラベル名、例えば“成人”であると判定し、判定した判定結果を外部装置に出力する。判定部１５は、判定結果を出力後、処理を終了する。
（ステップＳ６０）判定部１５は、対象者の腸内状態を、第３のラベル名、例えば“高齢者”であると判定し、判定した判定結果を外部装置に出力する。判定部１５は、判定結果を出力後、処理を終了する。なお、ステップＳ５８〜Ｓ６０に基づいて、外部装置は、例えば『あなたの腸内状態は“成人の腸内細菌の構成割合”に分類されました』等を、対象者に報知する。
以上で、対象者の被験者における腸内状態の判定処理を終了する。

【0066】

なお、上述した例では、対象者について、腸内状態を判定する例を説明したが、これに限られない。データベース構築後に、ｍ人のうちの１人の被験者の腸内細菌叢情報を抽出し、抽出した被験者について腸内状態の判定を行ってもよい。

【0067】

また、データベース生成部１２は、データベース１３の構築後も対象者の腸内細菌叢情報と年齢とを対応付けてデータベース１３に逐次格納していく。そして、解析部１４は、データベース１３の格納されている被験者および対象者の腸内細菌叢情報が、所定の人数を超えたときに、最適なクラスタ数の再計算し、各クラスタのラベル名を再付与するようにしてもよい。

【0068】

＜腸内細菌の抽出方法＞
次に、腸内細菌抽出装置１１が行う腸内細菌の抽出方法の一例について説明する。
図１０は、本実施形態に係る腸内細菌抽出装置１１が行う腸内細菌の抽出処理のフローチャートである。

【0069】

（ステップＳ１０１）腸内細菌抽出装置１１は、被験者毎または対象者毎に、糞便２０ｍｇ程度を測りとり、４５０ｕｌの抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）に懸濁する。
（ステップＳ１０２）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０１で懸濁した抽出液に、１０％ＳＤＳ溶液５０ｕｌ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００ｕｌのＴＥ飽和フェノール（例えば和光純薬）を混合し、例えばＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ １００Ａ（フナコシ社製）にてパワーレベル５、３０秒の破砕処理を行う。

【0070】

（ステップＳ１０３）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０２で破砕処理を行った溶液に対して、１４，０００ｇで５分間遠心後４００ｕｌの上清を取得する。続けて、腸内細菌抽出装置１１は、取得した上清に、２５０ｕｌのフェノール・クロロホルム溶液（例えば和光純薬）を加えて混合し、１４，０００ｇで５分間遠心後２５０ｕｌの上清を取得した。

【0071】

（ステップＳ１０４）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０３で取得した上清に、２−プロパノールを２５０ｕｌ加え、イソプロパノール沈殿させたものを２００ｕｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）で溶解し、ＤＮＡ溶液を生成する。

【0072】

（ステップＳ１０５）腸内細菌抽出装置１１は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるための１ｓｔプライマーセットであるＴｒｕ３５７Ｆ［（５’−ＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＲＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１））とＴｒｕ８０６Ｒ［５’−ＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ−３’（配列番号２）］と、例えば次世代シーケンサーＭｉｓｅｑ（イルミナ社製）にて解析するために必要な２ｎｄプライマーセットであるＦｗｄ ［５’−Ｘ１ＮＮＮＮＮＮＮＮ−Ｘ２−３’］およびＲｅｖ ［５’−Ｘ３−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−Ｘ４−３’］を設計し、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスによりプライマーを合成する。
なお、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｎは以下の配列を表す。
Ｘ１： ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号３）
Ｘ２：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧ（配列番号４）
Ｘ３：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号５）
Ｘ４：ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣ（配列番号６）
Ｎは、任意の塩基からなるｎ人の被験者を識別するための塩基配列

【0073】

（ステップＳ１０６）腸内細菌抽出装置１１は、鋳型ＤＮＡ溶液および１ｓｔプライマーセットを含む総液量を２５μｌとした反応液を、例えばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ｋｉｔ （タカラバイオ社製）を用いて調製する。続けて、腸内細菌抽出装置１１は、例えばＶｅｒｉｔｉ ２００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、例えば９４℃３分の後、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒を２０回、７２℃１０分のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応処理を行う。

【0074】

（ステップＳ１０７）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０６によって得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認する。
（ステップＳ１０８）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０６によって得られたＰＣＲ産物１ｕｌを鋳型とし、２ｎｄプライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲ反応処理を行う。ただし、ＰＣＲのサイクル数は、２０回ではなく８回である。

【0075】

（ステップＳ１０９）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０８によって得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認する。
（ステップＳ１１０）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１０９の処理後、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製を行い、例えばＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて濃度を測定する。続けて、腸内細菌抽出装置１１は、同濃度のＤＮＡ溶液を混合したものを、例えばＭｉｓｅｑ ｖ３ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施する。

【0076】

（ステップＳ１１１）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１１０によって得られたｆａｓｔｑファイルからＰｈｉｘ（シークエンス時のコントロール配列）およびヒトゲノム配列を除去する。
（ステップＳ１１２）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１１１の処理後、塩基配列３’側からＱ１７以下の塩基を除去する。

【0077】

（ステップＳ１１３）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１１２の処理後、１５０ｂｐ以下になったリードを除去する。続けて、腸内細菌抽出装置１１は、全体でＱ２５以下のリード、ペアになっていないリードを除去する。
（ステップＳ１１４）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１１３の処理後、得られたペアエンド配列を、例えばｆａｓｔｑ−ｊｏｉｎ（ｖｅｒｓｉｏｎ．１．１．２−３０１）（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｐ／ｅａ−ｕｔｉｌｓ／ｗｉｋｉ／ＦａｓｔｑＪｏｉｎ）によって接続する。

【0078】

（ステップＳ１１５）腸内細菌抽出装置１１は、ステップＳ１１４の処理後、例えばＵＣＨＩＭＥにてキメラ配列を除去する。
（ステップＳ１１６）最終的に、例えばサンプル当たり４，９７９±１，８００の配列が得られ、腸内細菌抽出装置１１は、これらを例えばＱＩＩＭＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８．０）（ｈｔｔｐ：／／ｑｉｉｍｅ．ｏｒｇ／）にて９７％の相同性を有する配列ごとをＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ）とする。続けて、腸内細菌抽出装置１１は、各ＯＴＵの代表配列を例えばＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ １２＿１０（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ．ｓｅｃｏｎｄｇｅｎｏｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／１２＿１０）に対して、例えばブラスト（ＢＬＡＳＴ；Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて検索することで腸内細菌叢の細菌分類レベル（門、綱、目、科、属、種等）での構成データを生成する。なお、構成データは、ｍ人から検出された腸内細菌の種類がｏの場合、ｍ行×ｏ列のテーブルとなる。また、ＢＬＡＳＴとは、例えば所定の閾値以上のスコアで類似するシークエンス群を見つけるためのアルゴリズム、またそのアルゴリズムを実装したプログラムである。続けて、データベース生成部１２は、腸内細菌抽出装置１１によって生成された腸内細菌叢の細菌分類レベルでの構成データに、被験者の年齢を対応付けてデータベース１３に格納する。

【0079】

以上で、腸内細菌の抽出処理手順を終了する。なお、上述した腸内細菌の抽出処理の手順、用いる溶液、用いる溶液の容量、用いるアプリケーション等は一例であり、これに限られない。

【0080】

［第１の試験例］
次に、第１の試験例について説明する。
（手順１）腸内細菌抽出装置１１は、データベース用の３７９人の被験者の糞便を用いて、図１０に示したステップＳ１０１〜Ｓ１１６の処理によって腸内細菌叢の細菌分類レベルでの構成データを生成する。続けて、データベース生成部１２は、腸内細菌抽出装置１１によって生成された腸内細菌叢の細菌分類レベルでの構成データに、３７９人の被験者それぞれの年齢を対応付けてデータベース１３に格納する。すなわち、データベース１３には、３７９（被験者数）行×１８７（細菌の種類数）列の構成データに、識別子と年齢とが対応つけられて格納されている。なお、３７９人の被験者から抽出された腸内細菌は、表６〜表１５の第１列に示す細菌であった。表６〜表１５に示すように、抽出された腸内細菌のレベルは、属レベルである。なお、表６〜表１５において、“［…］”は、現在は分類が不明瞭のため、かつて使われていた名称を表している。また、“ｇｅｎ．”は、属レベルの分類が不明または未同定であることを表し、“ｆａｎ．”は、科レベルの分類が不明または未同定であることを表し、“ｏｒｄ．”は、目レベルの分類が不明または未同定であることを表している。

【0081】

【表6】

【0082】

【表7】

【0083】

【表8】

【0084】

【表9】

【0085】

【表10】

【0086】

【表11】

【0087】

【表12】

【0088】

【表13】

【0089】

【表14】

【0090】

【表15】

【0091】

（手順２）解析部１４は、手順１によって構築された腸内細菌叢データベースに対して、ＣＨ Ｉｎｄｅｘを算出することで最適なクラスタ数が３であると算出する。続けて、解析部１４は、手順１によって構築された腸内細菌叢データベースに対して、Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて主座標分析を行い、３つのクラスタに分類する。続けて、解析部１４は、３つのクラスタに含まれる被験者の年齢に基づいて、３つのクラスタそれぞれに、“乳児”、“成人”、および“高齢者”のラベル名を付与する。

【0092】

（手順３）腸内細菌抽出装置１１は、４０歳男性の対象者の糞便を用いて、図１０に示したステップＳ１０１〜Ｓ１１６の処理によって腸内細菌叢を抽出する。次に、解析部１４は、取得した対象者の腸内細菌叢情報に対して、対象者から抽出されずに被験者からのみ抽出された腸内細菌の情報を追加し、対象者の腸内細菌叢情報を更新する。さらに、解析部１４は、図９の符号ｇ４５３に示すように、追加した腸内細菌の情報の構成割合（構成比率）それぞれに０％を挿入する。表６〜表１５の第２列に、抽出された腸内細菌および被験者のみから抽出された腸内細菌の構成割合を示す。更新後に得られるデータは、１行×１８７列の構築データである。

【0093】

（手順４）解析部１４は、手順３によって得られた１行×１８７列の構築データと、手順１によって構築された３７９行×１８７列の構成データとを統合して、３８０行×１８７列の構成データを生成する。続けて、解析部１４は、生成した３８０行×１８７列の構成データに対して、Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて主座標分析を行う。このとき、解析部１４は、最適なクラスタ数の再計算を行わないことが好ましい。すなわち、クラスタ数は３のままで良いものである。

【0094】

（手順５）判定部１５は、手順４によって解析された結果、４０歳男性の対象者が、図１１に示すように、“成人”のエンテロタイプに属していると判定する。なお、どのクラスタに属しているかの判定は、解析部１４による主座標分析後、クラスタ分類への処理によって行われる。図１１は、第１の試験例における４０歳男性の対象者を含む３８０人分の腸内細菌叢を主座標分析した結果を示す図である。図１１において、横軸と縦軸は、図５と同じである。また、円ｇ５０１は“乳児”のクラスタ（エンテロタイプ）であり、円ｇ５０２は“成人”のクラスタ（エンテロタイプ）であり、円ｇ５０３は“高齢者”のクラスタ（エンテロタイプ）である。また、×印ｇ５１１は、４０歳男性の対象者の腸内細菌叢を表している。

【0095】

［第２の試験例］
次に、第２の試験例について説明する。
なお、第１の試験例の手順１によって、データベースの構築が終了、すなわち、３７９行×１８７列の構成データに、識別子と年齢とが対応つけられてデータベース１３に格納されている。また、第１の試験例の手順２によって、最適なクラスタ数が３として算出されている。

【0096】

（手順２’）解析部１４は、手順１によって構築されたデータベースに対して、Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて主成分分析を行い、３つのクラスタに分類する。続けて、解析部１４は、３つのクラスタに含まれる被験者の年齢に基づいて、３つのクラスタそれぞれに、“乳児”、“成人”、および“高齢者”のラベル名を付与する。

【0097】

（手順３’）腸内細菌抽出装置１１は、第１の試験例の手順３と同様の処理を行い、対象者の１行×１８７列の構成データを生成する。

【0098】

（手順４’）解析部１４は、手順３’によって得られた対象者の１行×１８７列の構築データと、第１の試験例の手順１によって構築された被験者の３７９行×１８７列の構成データとを統合して、３８０行×１８７列の構成データを生成する。続けて、解析部１４は、生成した３８０行×１８７列の構成データに対して、Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅのクラスターパッケージを用いて主成分分析を行う。このとき、解析部１４は、最適なクラスタ数の再計算を行わないことが好ましい。すなわち、クラスタ数は３のままで良いものである。

【0099】

（手順５’）判定部１５は、手順４’によって解析された結果、４０歳男性の対象者が、図１２に示すように、“成人”のエンテロタイプに属していると判定する。図１２は、第２の試験例における４０歳男性の対象者を含む３８０人分の腸内細菌叢を主成分分析した結果を示す図である。図１２において、横軸と縦軸は、図６と同じである。また、円ｇ６０１は“乳児”のクラスタ（エンテロタイプ）であり、円ｇ６０２は“成人”のクラスタ（エンテロタイプ）であり、円ｇ６０３は“高齢者”のクラスタ（エンテロタイプ）である。また、星印ｇ６１１は、４０歳男性の対象者の腸内細菌叢を表している。

【0100】

図１１および図１２に示したように、４０歳男性の被験者の腸内状態は、主座標分析であっても主成分分析であっても、“成人”のエンテロタイプに属していると判定された。

【0101】

なお、上述した例において、属性として年齢の例を用いた例を説明したが、これに限られない。属性は、性別、体重、身長、居住地、出身地、国籍等であってもよい。また、腸内細菌叢に対応付けられている属性は、複数（例えば、年齢と国籍）であってもよい。例えば、属性が体重の場合、体重をいくつかのグループ（例えば１０ｋｇ未満、１０−１９ｋｇ、２０−２９ｋｇ、・・・、９０−９９ｋｇ、１００ｋｇ以上）に分類し、クラスタリングした結果に含まれる体重のグループに基づいてラベリングを行うようにしてもよい。
また、データベース１３に格納される情報は、例えば国籍毎、地域毎等の複数のデータであってもよい。

【0102】

以上のように、本実施形態の腸内状態の判定方法は、腸内状態の判定装置１が、複数の被験者の各々を識別する識別子と、複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベル（例えば、門、綱、目、科、属、種等）における複数の腸内細菌の各々について、複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌（分類レベルが属レベルの場合、例えば、メタノブレウィバクテル属、アクチノマイセス属、・・・）に対する比率を表す値と、複数の被験者の各々の属性（例えば、年齢、性別、体重、身長、居住地、出身地、国籍等）を表す情報と、が対応付けられている腸内細菌叢データベース（データベース１３）と、複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の各々について、対象者から抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値（例えば、１行×１８７列の構成データ）と、を多次元尺度法（例えば、主座標分析、主成分分析）によって分析する（図２のステップＳ６）ことで、対象者の腸内状態を属性に基づく２つ以上のタイプ（例えば、乳児、成人、高齢者）のいずれに属しているか判定する判定工程（図２のステップＳ７）、を含む。

【0103】

これにより、本実施形態では、データベース１３に格納されている複数の腸内細菌によって構成される腸内細菌叢情報を多次元尺度法によって分析した結果を用いて、対象者の腸内細菌叢の情報を、属性に基づくタイプに分類する。この結果、本実施形態によれば、対象者の腸内状態を２つ以上のタイプに分類することができる。

【0104】

また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、腸内状態の判定装置１が、腸内細菌叢データベース（データベース１３）を用いて、クラスタ数を算出するクラスタ数算出工程（図２のステップＳ３）と、腸内細菌叢データベースが多次元尺度法（例えば、主座標分析、主成分分析）によって分析された結果を、クラスタ数算出工程によって算出されたクラスタ数のクラスタに分類し、クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の属性（例えば、年齢、性別、体重、身長、居住地、出身地、国籍等）に基づいて、各クラスタに対してラベル（例えば、乳児、成人、高齢者）を付与するラベル付与工程（図２のステップＳ４）と、をさらに含み、判定工程における２つ以上のタイプは、ラベル付与工程によって付与されたラベルである。
なお、腸内細菌叢とは、細菌分類レベルにおける腸内細菌（例えば、メタノブレウィバクテル属、アクチノマイセス属、・・・）の集合である。

【0105】

これにより、本実施形態では、予め算出したクラスタのいずれかのタイプに対象者の腸内状態を分類することができる。

【0106】

また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、対象者の糞便から抽出した腸内細菌叢の情報に、前記複数の被験者から抽出されかつ前記複数の被験者からのみ抽出された前記腸内細菌叢の情報を付加し、前記付加した前記腸内細菌叢の情報に０％の構成割合を挿入する対象者情報更新工程（図９のステップＳ５４）と、をさらに含み、判定工程では、腸内細菌叢データベース（データベース１３）に格納されている複数の被験者の腸内細菌叢の情報と、更新された対象者の腸内細菌叢の情報が統合され、統合された腸内細菌叢の情報が、多次元尺度法（例えば、主座標分析、主成分分析）によって分析されることで、対象者の腸内状態が属性に基づく２つ以上のタイプ（例えば、乳児、成人、高齢者）のいずれかに属しているか判定される。

【0107】

これにより、本実施形態では、複数の被験者の腸内細菌叢の構成割合によって構成される構成データと、対象者の腸内細菌叢の構成割合によって構成される構成データと、の列を揃えることができるので、２つの構成データを統合して多次元尺度法を行うことができる。この結果、本実施形態によれば、対象者の腸内細菌叢の構成割合である腸内状態を、複数の被験者の腸内細菌叢の構成割合に基づいて判定することができる。

【0108】

また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、属性は年齢であり、腸内細菌叢データベース（データベース１３）に含まれる複数（ｍ人）の被験者の年齢を、複数の年齢グループに分類する年齢分類工程（図４のステップＳ２５）、をさらに含み、ラベル付与工程は、クラスタ毎に含まれる腸内細菌叢の情報を有する被験者の年齢グループに基づいて、各クラスタに対してラベルを予め付与する。

【0109】

これにより、本実施形態では、年齢グループに基づいて付与されたラベルを有するクラスタに、対象者の腸内状態を分類することができる。これにより、判定結果が年齢グループに基づいた名称であるため、判定結果を受け取る対象者が判定結果を理解しやすくなる。

【0110】

また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、多次元尺度法は、主座標分析または主成分分析である。
また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、複数の被験者は、離乳前から１０４歳までの年齢グループの各々について複数の被験者を含む。

【0111】

これにより、本実施形態では、対象者の腸内状態を、データベース１３に格納されている腸内細菌叢情報を主座標分析、主成分分析によって分析し、クラスタリングされたクラスタに含まれる年齢に基づいて、２つ以上のタイプのいずれかに分類することができる。この結果、本実施形態では、年齢に応じてラベルが付与されたいずれかのタイプに対象者の腸内状態を分類することができる。

【0112】

また、本実施形態の腸内状態の判定方法において、腸内細菌叢データベースは、被験者から抽出された全ての腸内細菌に対する被験者から抽出された腸内細菌の各々の比率を被験者毎に取得する取得工程と、取得工程によって取得された被験者毎の腸内細菌の各々の比率を用いて、被験者の総数ｍ（ｍは２以上の整数）と、複数の被験者から抽出された全ての種類を含む細菌分類レベルにおける複数の腸内細菌の種類の総数ｎ（ｎは２以上の整数）とを抽出する抽出工程と、抽出工程によって抽出された被験者の総数ｍと、複数の腸内細菌の種類の総数ｎと、複数の被験者の各々毎に抽出された細菌分類レベルにおける全ての腸内細菌に対する比率を表す値と、を用いて、ｍ行×ｎ行の構成データを構築する構成データ構築工程と、複数の被験者の各々の年齢を示す情報を取得し、取得した被験者毎の年齢を示す情報を、構成データ構築工程で構築された構成データに対応付けて腸内細菌叢データベースを構築するデータベース構築工程、によって構築されたものである。

【0113】

これにより、本実施形態では、被験者または対象者以外から抽出された腸内細菌を用いて、腸内細菌叢データベースを構築することができる。この結果、本実施形態では、このように構築された腸内細菌叢データベースと、対象者の腸内細菌叢情報とを、多次元尺度法で分析することで、対象者の腸内状態を精度良く推定することができる。

【0114】

なお、上述した例では、腸内状態の判定装置１が、ヒトの腸内状態を腸内年齢として推定する例を説明するがこれに限られない。腸内状態の判定装置１は、動物の腸内状態を腸内年齢として推定するようにしてもよい。

【0115】

また、本実施形態の腸内状態の判定装置１の一部または全てを、ＣＰＵ（中央演算装置）、ＤＳＰ（デジタルシグナルプロセッサ）、コンピュータが、インストールされたアプリケーションによって行うようにしてもよい。

【符号の説明】

【0116】

１…腸内状態の判定装置、１１…腸内細菌抽出装置、１２…データベース生成部、１３…データベース、１４…解析部、１５…判定部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]