特許 6643902 超並列高速シークエンサーによる簡便なＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6643902

(24)【登録日】2020年1月9日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】超並列高速シークエンサーによる簡便なＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20200130BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20200130BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6876 ZZNA

   C12N15/09 Z

   G01N33/53 M

【請求項の数】5

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-550999(P2015-550999)

(86)(22)【出願日】2014年11月27日

(86)【国際出願番号】JP2014081464

(87)【国際公開番号】WO2015080226

(87)【国際公開日】20150604

【審査請求日】2017年10月12日

(31)【優先権主張番号】特願2013-244624(P2013-244624)

(32)【優先日】2013年11月27日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504383519

【氏名又は名称】ジェノダイブファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 直人

(72)【発明者】

【氏名】椎名 隆

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 進悟

(72)【発明者】

【氏名】和田 有紀

(72)【発明者】

【氏名】光永 滋樹

(72)【発明者】

【氏名】猪子 英俊

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２３８２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−２１７３３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PNAS，２０１２年，Vol.109, No.22，p.8676-8681

【文献】 MHC，２０１２年，Vol.19, No.2，p.211-222

【文献】 Human Immunology，２０１３年１１月１７日，Vol.74，p.160, 165-P

【文献】 第22回日本組織適合性学会大会抄録集，２０１３年 ８月３０日，p.64, A-4

【文献】 Tissue Antigens，２０１２年，Vol.80，p.305-316

【文献】 MHC，２０１２年，Vol.19, No.2，p.133

【文献】 MHC，２０１５年，Vol.22, No.2，p.84-94

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８７６

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１からなる群から選択される少なくとも１つの対象遺伝子のプライマーセットを準備するステップであって、当該プライマーセットがイントロン１領域およびエクソン４領域に各々特異的にアニールし、エクソン２、イントロン２、エクソン３、イントロン３およびエクソン４の一部を含む領域を増幅するものであり、
前記対象遺伝子がＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記対象遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：３および４のいずれか一方または両方および配列番号：５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記対象遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子である場合には、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：６および配列番号：７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、ステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅するステップ；
（３）増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；および
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ
を含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。

【請求項2】

６桁ないしは８桁レベルで行う、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

配列番号：１および配列番号：２に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。

【請求項4】

配列番号：３および４のいずれか一方または両方および配列番号：５に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。

【請求項5】

配列番号：６および配列番号：７に示す塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、超並列高速シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法およびキットに関する。

【0002】

ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は免疫学的自己、非自己の識別において中心的役割を果たしており、この識別はＨＬＡ上に自己または非自己由来のペプチドを提示したＨＬＡ・ペプチド複合体を、Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して認識することにより為される。自己のＨＬＡ上に非自己（ウイルス、細菌等の病原性微生物や花粉等の外来抗原）由来のペプチドを提示したＨＬＡ・ペプチド複合体を表面上に発現した細胞、あるいは移植や輸血により体内に入れられた自己とは異なるＨＬＡアリル（対立遺伝子）を表面に発現した細胞をＴ細胞が認識することにより、免疫細胞の活性化、あるいは提示した細胞の破壊が起こる。

【0003】

これらの免疫細胞の活性化や提示した細胞の破壊は、輸血、骨髄移植を初めとする移植医療、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を用いた再生医療において拒絶反応や移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）を引き起こす。血小板頻回輸血患者では、自己と異なるＨＬＡに対する抗体が産生され、血小板輸血効果の著しい低減をもたらす。投薬の一部においては、特定のＨＬＡに結合した医薬品（およびペプチド）が非自己と認識され、アレルギー反応を中心とした重篤な医薬品副作用をもたらす場合もある。

【0004】

よって移植医療や再生医療においては患者とドナー（提供者）のＨＬＡを一致させる必要がある。特定のアリルに対する抗ＨＬＡ抗体を産生した血小板輸血患者にも、ＨＬＡを合致させた「ＨＬＡ適合血小板」の輸血が必要になる。医薬品副作用においても、投与予定の医薬品と特定のＨＬＡアリルとの関連が報告されている場合は、投薬前にＨＬＡを調べることが重要である。実際に一部の医薬品添付文書にはＨＬＡを調べることを推奨することが明記されている。がんのペプチドワクチン療法においても、ペプチドワクチンが患者ＨＬＡに結合できるか否かを予測するために、ＨＬＡを調べる必要がある。

【0005】

ＨＬＡの主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ）である。

【0006】

ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖からなる。クラスＩ分子のα鎖はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。

【0007】

ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植および様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。

【0008】

ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型およびＤＲ１０型では、同一染色体上に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ６およびＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子と、ＨＬＡ−ＤＲＢ６およびＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、同一染色体上に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子と、ＨＬＡ−ＤＲＢ２およびＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、同一染色体上に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子と、ＨＬＡ−ＤＲＢ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ８およびＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１以外のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は位置しない（図１参照）。

【0009】

各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通していることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が複数のアリルに共通していることもある。

【0010】

ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、およびＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である（図２参照）。

【0011】

医療の様々な場合においてＨＬＡアリルを調べること（ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング）は重要である。しかし従来よく使われてきたＳＢＴ法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ）やＬｕｍｉｎｅｘ法（ＰＣＲ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ（ＳＳＯＰ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｅｔｈｏｄ）では、アリル間で異なる複数の多型領域が存在する場合に、その多型領域がシスの位置（同一の染色体上）にあるのか、トランスの位置（異なる染色体上）にあるのかを決めることが難しいために、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）とよばれる曖昧さが存在し、アリルを正確に決められない場合があった。

【0012】

そのため、我々は次世代シークエンサー（超並列高速シークエンサー）を用いてフェーズ・アンビギュイティがない方法を開発した。しかし、この方法ではプロモーター領域から３’ＵＴＲを含む長い領域を増幅するために、保存状態が悪く断片化したＤＮＡではタイピングが難しい場合があった。特にＨＬＡクラスＩＩ遺伝子ではイントロン１が長く、クラスＩ遺伝子の２倍程度の長さの領域を増幅することになるので断片化が進んだＤＮＡサンプルではタイピングが難しかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】特開平１１−２１６０００号公報

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｌｉｎｄ Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３−１０４２頁（２０１０年）

【非特許文献2】Ｓｈｉｉｎａ Ｔ．等、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、第８０巻、３０５−３１６頁（２０１２年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、保存状態が悪く断片化したＤＮＡサンプルを用いた場合であってもタイピングすることが可能であり、同一のＰＣＲ条件下で複数のプライマーセットを用いて各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲを同時に行うことができる、超並列高速シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのための方法、プライマーセットおよびキットを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、アリル間の違いをもたらす多型が多く、また抗体やＴ細胞受容体に認識される細胞外ドメインをコードしているＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のエクソン２からエクソン４の一部を含む領域を増幅し、次世代シークエンサーによりＤＮＡタイピングする系を開発した。

【0017】

具体的には、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、およびＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子を同時に増幅しうるＰＣＲプライマー、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅しうるＰＣＲプライマーをそれぞれ新たに設計し、好適なＰＣＲ条件を設定して、超並列高速シークエンシング技術を駆使するという新しい着想に基づき、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【0018】

即ち、本発明は、以下のステップを含むＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１からなる群から選択される少なくとも１つの対象遺伝子のエクソン２とエクソン３を含むイントロン１領域およびエクソン４領域に各々特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行うステップ；
（３）ＰＣＲ法により増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；および
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。

【0019】

ある実施形態では、前記対象遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群から選択される少なくとも１つが選択され、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、前記対象遺伝子がＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：３および４のいずれか一方または両方および配列番号：５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、前記対象遺伝子がＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子であり、前記プライマーセットがそれぞれ配列番号：６および配列番号：７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0020】

さらに、他の態様では、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のエクソン２とエクソン３を含む領域を同時にＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅することが可能なプライマーセットに関する。ある実施形態では、それぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセットが提供される。他の実施形態では、それぞれ配列番号：３および４のいずれか一方または両方および配列番号：５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセットが提供される。更なる実施形態では、それぞれ配列番号：６および配列番号：７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセットが提供される。

【発明の効果】

【0021】

本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係が不明なフェーズ・アンビギュイティが排除された究極のＤＮＡタイピング法である。これにより、多型が多く、また抗体やＴ細胞受容体に認識される細胞外ドメインをコードしているＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のエクソン２からエクソン４の一部を含む領域の増幅が可能となり、次世代シークエンサーによるＤＮＡタイピングが実現される。

【0022】

また、増幅領域を短くしたことから、保存状態が悪いＤＮＡサンプルを用いた場合でもＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングが比較的容易になった。さらに、増幅する領域の長さは既に発表しているクラスＩ遺伝子の増幅領域とほぼ同等であり、本発明のプライマーセットを用いることにより、同一のＰＣＲ条件で複数のＨＬＡ遺伝子を同時にＰＣＲを行うことが可能であるので、ＰＣＲに費やす時間を短縮することができた。さらに、データ量も少なくなるのでデータ解析の時間も短縮された。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫 監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。

【図2】ＨＬＡアリルの分類法を示す図である。ＩＭＧＴ−ＨＬＡデータベース（www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から引用した。

【図3】（ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫 監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。

【図4】各ＨＬＡ遺伝子の構造を示す模式図である。

【図5】ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子上の設計したプライマーの位置とリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さを示す。

【図6】新規に開発したプライマーを用いたアガロースゲル電気泳動像を示す。

【図7】マルチプレックスＰＣＲによるアガロースゲル電気泳動像を示す。

【図8】マルチプレックスＰＣＲによるアガロースゲル電気泳動像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１からなる群から選択される少なくとも１つの対象遺伝子のエクソン２とエクソン３を含むイントロン１およびエクソン４に各々特異的にアニールするプライマーセットであって、同一条件でのアニーリングが可能なプライマーセットを準備する。

【0025】

ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造および発現産物（ＨＬＡ抗原）の構造との関連も知られている（図３および４参照）。

【0026】

本発明では、古典的クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１）のエクソン２とエクソン３を含む領域を網羅的にＰＣＲできるプライマーセットを調製し（図５参照）、それを用いて増幅したＰＣＲ産物を後述するハイスループットシークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ヌル（ｎｕｌｌ）アリルの有無も正確に検知することができる。

【0027】

表１における配列番号１と２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子およびＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子それぞれのエクソン２とエクソン３を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0028】

配列番号１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２５５２６４３番目から第３２５５２６６７番目および第３２４９０４４６番目から第３２４９０４７０番目、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第４００３８６２番目から第４００３８８６番目および第３９３９８７０番目から第３９３９８９４番目、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第４０００１９７番目から第４０００２２１番目および第３８５１７８５番目から３８５１８０９番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２５４８６０９番目から第３２５４８６３１番目および３２４８６４１９番目から３２４８６４４１番目、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第３９９９８６１番目から第３９９９８８３番目および第３９３５８４０番目から３９３５８６２番目、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第３９９６２０３番目から第３９９６２２５番目および３８４７２６７番目から第３８４７２８９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約４，０００〜約４，５００塩基（ｂｐ）である。

【0029】

表１における配列番号３〜５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子のエクソン２とエクソン３を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0030】

配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２６３３１０３番目から第３２６３３１２８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２６３３１０３番目から第３２６３３１２７番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２６２９２１４番目から第３２６２９２３７番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約３，９００塩基（ｂｐ）である。

【0031】

表１における配列番号６と７は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２とエクソン３を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0032】

配列番号６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３０４８１８７番目から第３３０４８２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３０５３５６３番目から第３３０５３５９１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約５，４００塩基（ｂｐ）である。

【0033】

これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子のエクソン２とエクソン３を上流側および下流側から挟み込む位置にアニーリング可能なセンス（Ｓｅｎｓｅ）側プライマーとアンチセンス（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）側プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。

【0034】

なお、この明細書においては、リファレンス配列の同一の位置に相当する塩基配列（又はそれに相補的な塩基配列）であっても、１〜数塩基が相違しているプライマーについては各々別個の配列番号を付与した。これらの１〜数塩基の相違は多型によるものである。

【0035】

【表1】

【0036】

また、本発明では、上記古典的クラスＩＩ抗原に特異的なプライマーセットに加え、古典的クラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの各遺伝子において多型性が高いことが知られているエクソン２および３を含む領域をＰＣＲするためのプライマーセットを組み合わせて用いることができる。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの各遺伝子に特異的なプライマーセットは以下のように例示することができる。

【0037】

表２における配列番号８〜１０は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソンおよびイントロンを含む）を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0038】

配列番号８と９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９９０９４８３番目から第２９９０９５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９９１４９２５番目から第２９９１４９５４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。

【0039】

表２における配列番号１１と１２は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソンおよびイントロンを含む）を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0040】

配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１３２５７９６番目から第３１３２５８２４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１３２１２１０番目から第３１３２１２３５番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約４，６００塩基（ｂｐ）である。

【0041】

表２における配列番号１３〜１５は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ−Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソンおよびイントロンを含む）を上流側および下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。

【0042】

配列番号１３と１４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１２４０８６８番目から第３１２４０８９６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号１５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１２３６０７５番目から第３１２３６１１４番目に相当する塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約４，８００塩基（ｂｐ）である。

【0043】

【表2】

【0044】

本明細書中に記載の一又は複数のプライマーセットは、例えばマルチプレックスＰＣＲ法などにおいて各ＨＬＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させるために同一容器内で用いられてよい。

【0045】

（２）ＰＣＲステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅を行う。
ＰＣＲは、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
３．反応条件を設定してＰＣＲを実施する。
例：熱変性ステップ（通常は９２〜９８℃）
アニーリングステップ（通常は５５〜７２℃）
伸長ステップ（通常は６５〜８０℃）
本発明の方法では、前記アニーリングおよび伸長ステップの温度を約６５〜７０℃とするのが好ましい。より好ましくは６５℃〜６８℃とする。約６５〜７０℃でアニーリングおよび伸長させることにより、ＨＬＡアリルを等比率で（均一に）生成させることができる。
４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。

【0046】

本発明で用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は特に限定されるものではないが、例えば、市販品を使用することもできる。例えば、タカラバイオ株式会社製のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（登録商標）等を挙げることができる。

【0047】

（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンス（あるいは超高速シークエンス、大量並列シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。

【0048】

超並列高速シークエンサーとしては、ロシュ社の４５４ ＧＳシステム、ライフテクノロジーズ社のゲノムシークエンサーＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ^ＴＭシステムおよびイルミナ社のＭｉＳｅｑシステムなどがあるが、本明細書では、ロシュ社の４５４ ＧＳシステムに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。
１．前記ステップ（２）で得られたＰＣＲ産物をネブライザーにより約５００塩基ほどに断片化する。
２．その断片化されたＤＮＡ断片の末端にＤＮＡアダプターを付加する。
３．ＤＮＡアダプターを付加したＤＮＡ断片を一本鎖にした後、アダプターを介してビーズに結合させ、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む。これにより、１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される。
４．エマルジョンＰＣＲを実施し、各ＤＮＡ断片を増幅させる。エマルジョンＰＣＲにより、各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片が結合したビーズを回収する。
５．ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする。ピコタイタープレートは、１ウェルに１個のビーズが入るサイズである。
６．各々のビーズについて、４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加え、添加した核酸がポリメラーゼによりＤＮＡ配列に取り込まれたときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応により検出し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。

【0049】

（４）ＤＮＡタイピングステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られるｓｆｆ ｆｉｌｅをＭＩＤタグ毎に分類した後、既知のＨＬＡアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡの第３区域レベルあるいは第４区域レベルのＨＬＡアリル（６桁あるいは８桁レベル）が決定される。

【0050】

本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスクラスＩＩの各遺伝子のエクソン２とエクソン３を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってアンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ヌルアリルに関する情報を得ることもできる。

【0051】

本発明では、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲの際のアニーリング温度が同一となるようなプライマーセットを新たに設定したことにより、１台のＰＣＲ装置で複数の遺伝子のＰＣＲ増幅を同時に行うことができる。

【0052】

また本発明では、上記の新たなプライマーセットを設定したことにより、複数のＨＬＡ遺伝子を１〜２チューブ内で同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行うことが可能になった。

【0053】

さらに、本発明で使用するプライマーセットおよび酵素の組み合わせは、高速ＰＣＲ装置にも適用可能であることを確認した。したがって、従来に比して迅速かつ高精度にＰＣＲを行うことができる。

【実施例】

【0054】

以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0055】

（実施例１）
［目的］
ＨＬＡクラスＩＩ各遺伝子における増幅状況を確認する。

【0056】

［方法］
酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１の配列番号１〜７）を用いたＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）２５ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ緩衝液、１．６μＬのｄＮＴＰ溶液、１μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．８μＬのＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）（１）の調製物を９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、７０℃で３分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返してＰＣＲを行った。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ライフテクノロジーズ社）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動法によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。

【0057】

［結果および考察］
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼによってＨＬＡ遺伝子のＰＣＲが可能であった。増幅されたＰＣＲ産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図６に示す。レーン１はＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５、レーン２はＨＬＡ−ＤＱＢ１、レーン３はＨＬＡ−ＤＰＢ１それぞれのエクソン２および３を含む領域に相当するＰＣＲ産物であることが示された。図６においてレーンＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。これらプライマーを用いることにより、ＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子について目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物を得ることができた。

【0058】

（実施例２）
［目的］
実施例１のＨＬＡクラスＩＩに加え、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを含めたＨＬＡ６座位におけるマルチプレックスＰＣＲ法の可能性を検証する。

【0059】

［方法］
１．既に抽出され、ＨＬＡ型が明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む６検体（表３のＳａｍｐｌｅ１〜６）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子に特異的なプライマーセット（表２の配列番号８〜１５および表１の配列番号１〜７）を用いたＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲは２本の０．２ｍｌチューブに分けて行った。すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを１本のチューブで増幅させ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１を１本のチューブで増幅させた。
（２）２５ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ緩衝液、１．６μＬのｄＮＴＰ溶液、３．２〜５μＬ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．８μＬのＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（３）（２）の調製物を９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、７０℃で３分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ライフテクノロジーズ社）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動法によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。

【0060】

２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰキット（ベックマン・コールター株式会社）の標準的なプロトコールに従って精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（インビトロジェン社）の標準的なプロトコールに従って濃度を測定した。
（３）精製したクラスＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物とクラスＩＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物を等量ずつ混合した。
（４）５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ（ロシュ社）の標準的なプロトコールに従って、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングを行い、１サンプルあたり１万５千リードの塩基配列を得た。
（５）それら配列をＩＭＧＴ ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（６）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｐｐｅｒ（ロシュ社）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。

【0061】

［結果および考察］
１．増幅されたＰＣＲ産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図７に示す。図７においてレーン１〜６は表３のＳａｍｐｌｅ ＩＤ１〜６を用いたＰＣＲ産物に相当する。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーである。図７から明らかなように、いずれの試料においても、表１および表２に示すプライマーを用いることによりＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子についてのＰＣＲ産物と、目的の分子量の位置に単一の増幅産物を得ることができた。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られた。よって、表１および表２に示すプライマーを用いたＰＣＲ系によりＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを行うことができる。
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む６検体を用いてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１のエクソン２とエクソン３を含む領域の各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧＳ ＪｕｎｉｏｒによりＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを行った。その結果、全ての遺伝子ともに６桁レベルにおけるＤＮＡタイピングが可能であった（表３）。よって本法により、フェーズ・アンビギュイティのない６桁レベル以上のＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを行うことができるとともに、イントロン内も含め、ヌルアリルの原因となり得る塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出することができる。

【0062】

【表3】

【0063】

（実施例３）
［目的］
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５のＨＬＡ７座、ならびにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１のＨＬＡ９座におけるマルチプレックスＰＣＲ法の可能性を検証する。

【0064】

［方法］
１．既に抽出され、ＨＬＡ型が明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体（表４のＳａｍｐｌｅ１〜４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表２の配列番号８〜１５および表１の配列番号１〜５）を用いたＰＣＲを行った。
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１については表２の配列番号８〜１５および表１の配列番号１〜５を用い、ＨＬＡ−ＤＰＢ１については、ＤＰＢ１−Ｆ２（5'- CTCAGTGCTCGCCCCTCCCTAGTGAT -3'：配列番号１６）およびＤＰＢ１−Ｒ２（5'- GCACAGTAGCTTTCGGGAATTGACCA -3'：配列番号１７）を用いた。ＤＰＢ１−Ｆ２（配列番号１６）とＤＰＢ１−Ｒ２（配列番号１７）は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。配列番号１６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３０４８１８２番目から第３３０４８２０７番目に相当する塩基配列を持つ。配列番号１７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３０５５４２８番目から第３３０５５４５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。これらのプライマーセットを用いた場合のリファレンス配列から予想されるＰＣＲ産物の長さは約７，３００塩基（ｂｐ）である。
ＰＣＲの具体的な手順は次の通りである。
（１）ＰＣＲは２本の０．２ｍｌチューブに分けて行った。すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５を１本のチューブで増幅させた。また、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１を１本のチューブで増幅させた。
（２）２５ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ緩衝液、１．６μＬのｄＮＴＰ溶液、３．２〜５μＬ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．８μＬのＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（３）（２）の調製物を９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、７０℃で３分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返してＰＣＲ増幅を行った。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ライフテクノロジーズ社）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動法によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。

【0065】

２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰキット（ベックマン・コールター株式会社）の標準的なプロトコールに従って精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（インビトロジェン社）の標準的なプロトコールに従って濃度を測定した。
（３）精製したクラスＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物とクラスＩＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物を等量ずつ混合した。
（４）５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｉｏｎ ＰＧＭ（ライフテクノロジーズ社）の標準的なプロトコールに従って、ライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングを行い、１サンプルあたり４０万リードの塩基配列を得た。
（５）それら配列をＩＭＧＴ ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（６）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｐｐｅｒ（ロシュ社）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。

【0066】

［結果および考察］
１．増幅されたＰＣＲ産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果を図８に示す。図８においてレーン１〜４は表３のＳａｍｐｌｅ ＩＤ１〜４を用いたＰＣＲ産物に相当する。最も左のレーンはＤＮＡサイズマーカーである。図８から明らかなように、上記のプライマーを用いることにより、ＨＬＡ７座およびＨＬＡ９座ともにいずれの試料においても各遺伝子についてのＰＣＲ産物と、目的の分子量の位置に単一の増幅産物を得ることができた。
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体を用いて各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＩｏｎ ＰＧＭによりＨＬＡタイピングを行った。その結果、全ての遺伝子ともに６桁レベルにおけるタイピングが可能であった（表４）。よって本法により、フェーズ・アンビギュイティのない６桁レベル以上のＨＬＡタイピングを行うことができるとともに、イントロン内も含め、ヌルアリルの原因となり得る塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出することができる。

【0067】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]